[0001] 本申请中引用的所有专利和非专利文献都以引用方式整体并入本文。

[0002] 本发明涉及用于制备基于大麦的饮料(例如基于麦芽的饮料，如啤酒)的节能方法。本发明还涉及用于所公开的方法中的大麦植物。特别地，本发明描述了在一植株中具有无效脂肪氧化酶-1 (无效L0X-1)、无效脂肪氧化酶-2 (无效L0X-2)和无效S-腺苷甲硫氨酸:甲硫氨酸S-甲基转移酶(也称作无效S-甲硫氨酸(Met)-S-甲基转移酶或无效MMT)的组合特征的大麦植株，即无效L0X-1-无效L0X-2-无效MMT (本文中也可互换地称为双无效LOX-无效MMT)大麦植株，其特别用于本文所述的制备基于大麦的饮料的节能方法。

[0003] 制麦厂和酿酒厂

[0004] 大麦(Hordeum vulgare, L.)是广泛种植于不同气候下用于生产食品和饮料的二倍体谷类。使用高能耗方法，例如麦芽厂和酿酒厂分别用于烘干和麦芽汁煮沸的操作，大量产生基于所述植物的饮料。

[0005] 制麦(malting) —般包括浸泡大麦粒以促进萌芽，随后在高温下进行烘干，这使得该过程特别耗能。烘干的主要目的包括:(i)终止萌芽；(ii)干燥萌芽的大麦粒；(iii)使酶变性，特别是野生型大麦中的脂肪酶和LOX酶；和(iv)将主要由S-甲基-Met (SMM)组成的二甲基硫化物(DMS)前体(DMSP)转化成挥发性的DMS[正常浅色麦芽烘干后，干重中的 DMSP 含量平均为 4ppm(参见 Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLBBerlin,第158-162页)]。在烘干过程中保留了某些酶的活性(例如淀粉酶、蛋白酶等)。

[0006] 在酿酒厂中，一般大约一半的能量消耗在酿造过程中，对应于范围为48, 000-83, 000kJ/hL 的能量负荷(Modern brewhouse technology, BrauweltInternational2004,第410-412页)。绝大多数能量消耗在麦芽汁煮沸过程中，其目的一般是实现:⑴蛋白质凝聚；(ii)酶失活；(iii)麦芽汁灭菌；(iv)酒花化合物的提取；(V)α-酸的异构化；和(vi)无用的挥发性化合物的蒸发，例如分别具有硫和陈化异味的DMS和反式-2-壬烯醛(Τ2Ν)的蒸发。

[0007] 通常将麦芽汁煮沸至少50-60分钟，以实现至少10-15%的总蒸发量(见Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin,第 11 章)，但目前常常通过技术手段改善至6-8%。另外，已经尝试例如通过将蒸发量降低至3-4%之少并结合将无用的挥发性化合物蒸馏至注入的蒸汽中的提馏工序(例如见Bonacchelli等人，2007)来进一步降低能量消耗。一般认为，麦芽汁中无用的挥发性化合物的水平使得难以进一步减少蒸发量或者甚至去除蒸发。

[0008] T2N

[0009] 1970年将T2N(沸点 为88° C的挥发性C9烯醛)认定为赋予啤酒纸板样异味的分子(Jamieson和Gheluwe, 1970)。因为人对T2N的味觉阈值水平极其低，之前测定约为0.7nM或0.1ppb (Meilgaard, 1975)，所以即使具有微量水平醛的产品也会具有陈化感。然而，T2N的水平在新鲜啤酒中一般非常低(Lermusieau等人，1999)，这表明陈化过程促进了游离T2N从相应加合物中的释放(Nyborg等人，1999)。随后的观察揭示了产品储存后麦芽汁的T2N潜能与所形成的游离T2N之间的关联(KuiOda等人，2005)。

[0010] 烘干和麦芽汁煮沸代表了可作为为降低基于大麦的饮料中的T2N水平而进行的操作的靶标的独立加工工序。尽管高温下的烘干使参与T2N形成的酶如脂肪酶和LOX失活(参见例如 Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin,第 162 页)，但也可通过麦芽汁煮沸将游离T2N去除。

[0011] 大麦粒含有三种LOX酶，已知为L0X-1、L0X-2和L0X-3 (van Mechelen等人，1999)。L0X-1的主要活性催化由亚油酸形成9-过氧氢十八碳二烯酸(9-HP0DE;参见图1A对LOX途径的部分综述)，所述9-过氧氢十八碳二烯酸是T2N和三羟基十八碳烯酸(THA)的前体。L0X-2主要催化亚油酸转化成13-HP0DE，其进一步代谢成己醛，即具有〜0.4-ppm高味觉阈值的C6醛(Meilgaard,上文)。由于L0X-2非常低的9-HP0DE形成活性，几则报道已经注意到T2N通过以下生物化学途径产生，所述生物化学途径包括最初通过L0X-1催化亚油酸转化成9-HP0DE，随后通过9-氢过氧化物裂解酶作用裂解9-HP0DE (参见例如 Kuroda 等人,2003, 2005; Noodermeer 等人,2001)。

[0012] 对于L0X-1的上述性质，实际上通过以下两份观察结果证实了所述酶为尽量降低基于大麦的产品中的T2N水平的有用的失活目标:(i)Kuroda等人(2005)提出L0X-1活性与麦芽汁T2N潜能之间具有关联，原因主要是由于已经认为L0X-2在所述麦芽汁中形成T2N潜能方面的能力较低。然而，麦芽中总LOX活性与麦芽汁T2N潜能之间似乎并没有关联；(ii)已经描述了能降低大麦中L0X-1活性的方法。

[0013] 已经开发了几种不同的大麦植株，其共同性质是L0X-1活性部分降低或完全降低。例如，具有低L0X-1活性的大麦粒和大麦植株公开于Douma，A.C.等人的PCT申请W002/053721中，而Breddam, K.等人的W02005/087934则集中于L0X-1活性有缺失的两种不同的大麦突变体:剪接位点突变体和具有提前终止密码子的突变体。此外，Hirota，N.等人的EP1609866描述了通过筛选收集的大麦地方品种而鉴定到的没有L0X-1活性的大麦植株。

[0014] DMS

[0015] 在基于大麦的饮料中，同时也在许多蔬菜和食品，包括茶、可可、奶、酒、酒精饮料(如甜酒)、甜玉米和许多烹饪后的蔬菜中，DMS为产品添加了显著的气味和风味特征。根据啤酒的类型，DMS水平通常可达到150ppb(150yg/L)，其中所述化合物经常促成不期望的“烹饪后的蔬菜”或“卷心菜样”的风味。因此，不仅感觉阈值约为30-45 μ g/L(Meilgaard, 1982)是重要的，而且以〈lOppb的水平使DMS衍生的风味保持不被察觉也是重要的。

[0016] 啤酒生产中的上述烘干和麦芽汁煮沸加工步骤影响了基于大麦的饮料中的DMS水平，主要是因为两个所述过程均可以诱导SMM化学转化成DMS (参见例如TechnologyBrewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin,第 160 页)。由于化合物 DMS 的沸点仅为37-38° C，因此其大部分将直接蒸发到大气中。然而，当麦芽汁煮沸的持续时间或活力不足以转化残留的SMM时，随着麦芽汁冷却，DMS可以持续形成，并且很可能转移到啤酒中。[0017] SMM代表了大麦粒萌芽中几乎所有(可能所有)的由SMM循环的功能性组分的作用而合成的DMSP库(图1B)。在此，MMT催化甲基基团从S-腺苷-Met (AdoMet)转移到Met上，形成SMM。化合物SMM可反过来作为由高半胱氨酸(Hcy)合成Met的甲基供体，该反应由Hcy-S-甲基转移酶(HMT)催化。

[0018] 在科学文献中，已经认为通过使用例如反义技术(McElroy和Jacobsen, 1995)可调节SMM合成。然而，没有提供反义相关靶基因的指导。尽管如此，曾经预期阳性结果的可能性是可疑的，原因是SMM水平的大量降低可能对大麦生长和发育有害。McElroy和Jacobsen (上文)并没有讨论用于获得较低水平的SMM的备选解决方案。同样，如下文详细讨论的，反义技术未曾成功应用到大麦中来完全消除基因表达。

[0019] 已经开发了用于降低啤酒中DMS水平的技术方法。因此，AU38578/93描述了降低麦芽中DMS水平的方法,该方法包括蒸汽处理所述麦芽。在Bisgaard-Frantzen, H.等人的专利申请US2006/0057684中描述了包括在> 70° C热处理醪液(mash)的酿造方法。并且，在Reuther，H的美国专利号5，242，694中提到了用于制备低碳水化合物啤酒的方法，其中所述方法包括广泛煮沸麦芽汁，然后用二氧化碳(CO2)冲洗所述麦芽汁。然而，已知上述所有处理均消耗高水平的能量，可能改变麦芽或麦芽汁的特性。

[0020] 突变的大麦植株(植物)

[0021] 遗憾的是，还没有用于制备完全缺乏给定蛋白质的表达的转基因大麦植物的方法。通常，对于大麦，应用反义技术产生仍然表达一些正在讨论的蛋白质的转基因植株(参见，例如Robbins等人，1998; Stahl等人,2004; Hansen等人,2007)。此外，还没有开发出使用嵌合RNA/DNA或定点突变法制备特定突变体的有效方法用于大麦植物。因此，尽管做了大量努力，本申请的发明人并未找到在大麦中成功实现寡核苷酸引导的基因靶向的任何已发表的实例。尽管没有在大麦中进行，Iida和Terada(2005)指出已经在玉米、烟草和水稻中测试了由寡核苷酸引导的基因靶向，但所有这些情况均使用抗除草剂基因乙酰乳酸合成酶(ALS)作为靶标。 根据Iida和Terada (上文)的结论，上述策略经适当改进是否可用于直接选择性基因(例如ALS基因)以外的其它基因中还有待确定。尽管还未证实，但利用锌指核酶的靶向诱变法代表了可能实现基础植物生物学的未来研究或农作物的修饰的另一工具(Durai等人，2005; Tzfira和White, 2005; Kumar等人，2006)。然而在这种情况下，诱变也没有在大麦中实施或者成功地应用于大麦。

[0022] 尽管如此，可以通过利用辐射或化学处理，例如利用叠氮化钠(NaN3)溶液温育麦粒12小时至过夜的随机诱变法制备大麦突变体。一个实例是为了筛选低肌醇六磷酸(phytate)突变体而用NaN3诱变大麦粒并随后筛选高水平游离磷酸(Rasmussen和Hatzack, 1998);从2，000个筛选的麦粒中总共鉴定出10个突变体。尽管还不是总有可能，但在NaN3处理后找出特定突变体依靠持久不懈的努力和有效的筛选方法。

[0023] 可持续性

[0024] 在寻求解决其能量、环境和食物挑战的世界中，社会的一个焦点是限制或减少大气CO2浓度，尤其集中于工业系统的CO2排放。主要的原因在于，温室气体浓度的增加引起地球能量平衡的改变，而其中CO2是最大的一个促成因素。作为对气候变化普遍关注的结果，并也基于经济理论和约束，啤酒厂可通过尽可能有效地使用能量，并通过更有效地减少操作中的温室气体排放而起到积极作用。截至目前，焦点已集中在解决上述可持续性问题的技术手段上。

[0025] 发明概述

[0026] 现已经描述了热处理方法用于降低LOX活性和DMS的DMS水平。所述热处理通常在制麦和/或麦芽汁制备的过程中进行，这表示可以使具有LOX活性的产物聚集在大麦中直至进行热处理。大麦的分析表明，大麦中存在显著量的具有LOX活性的产物，甚至在制麦前便是如此(Wackerbauer和Meyna, 2002)。显然,热处理方法是高度耗能的。

[0027] 本发明提供了用于制备基于谷类的饮料的方法，所述饮料具有低水平的一种或多种异味物及其前体(非常低水平的DMS和T2N及其前体)，其中所述方法包括低能量输入，所述方法包括以下步骤:

[0028] (i)提供谷类 植株或其部分，其中所述谷类植株物包含:

[0029] (a)导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变；和

[0030] (b)导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变；和

[0031] (c)导致功能性MMT完全丧失的第三突变；

[0032] (ii)任选地对所述谷类的至少一部分进行制麦，由此获得发芽的谷类；

[0033] (iii)糖化所述谷类和/或发芽的谷类和任选的额外辅料，由此获得麦芽汁；

[0034] (iv)任选地在存在额外成分时加热所述麦芽汁，其中使最多4%的麦芽汁体积被蒸发掉，由此获得加热的麦芽汁；

[0035] (V)将所述加热的麦芽汁加工成饮料；

[0036] 由此制得具有低水平的一种或多种异味物及其前体的来源于谷类的饮料。

[0037] 特别地，本发明提供了用于制备具有低水平的一种或多种异味物及其前体(非常低水平的DMS和T2N及其前体)的基于大麦的饮料的方法，其中所述方法包括减少能量输入，所述方法包括以下步骤:

[0038] (i)提供大麦植株或其部分，其中所述大麦植株包含:

[0039] (a)导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变；和

[0040] (b)导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变；和

[0041] (c)导致功能性MMT完全丧失的第三突变；

[0042] (ii)任选地对至少部分所述大麦进行制麦，由此获得发芽的大麦；

[0043] (iii)糖化所述大麦和/或发芽的大麦和任选的额外辅料，由此获得麦芽汁；

[0044] (iv)任选地在存在额外成分时加热所述麦芽汁，其中使最多4%的麦芽汁体积被蒸发掉，由此获得加热的麦芽汁；

[0045] (V)将所述加热的麦芽汁加工成饮料；

[0046] 由此制得具有低水平的一种或多种异味物及其前体的来源于大麦的饮料。

[0047] 本发明的目的还有提供适合用于所公开的方法的大麦植物(植株)。因此，本发明的目的是提供农艺学上有用的大麦植株，其同时包含所述三种不同的特征，即无效L0X-1-无效L0X-2-无效MMT (本文也称为“双无效LOX-无效MMT ”)大麦植株。利用下文详细描述的生物化学试验，有用大麦植株的选择不仅涉及植株活力，还涉及L0X-1、L0X-2和MMT酶活性的组合缺失。本发明的大麦植株可被引入至任何合适的育种程序，如自交、回交、群体杂交等。

[0048] 加快植物育种过程的方法包括通过应用组织培养和再生技术对所产生的突变体进行初始扩繁。如实施例3中描述的和图3中图示的，使用常规大麦育种方案由双无效LOX大麦植株和无效MMT植株产生具有双无效LOX-无效MMT特征的大麦植株。因此，本发明另一个方面提供了生长和分化后产生具有双无效LOX-无效MMT特征的大麦植株的细胞。例如，育种可以包括传统杂交、使用如花药培养或小孢子培养的组织培养制备源自可育花药的双单倍体植株。

[0049] 本发明公开了通过使用无效LOX谷粒可实现烘干用能量输入的减少，这是由于不需要失活内源的LOX酶。可利用本发明描述的双无效LOX-无效MMT产生缺少相应酶活性的原材料，使目的突变体在制麦厂的烘干过程中实现较低的能量消耗，但由于减少在麦芽汁煮沸过程中的热量输入，因此也可用于酿酒厂。

[0050] 从啤酒或饮料质量观点上看，为了从功能上消除或显著降低产品中的T2N和DMS水平，也需要双无效LOX-无效MMT原材料。[0051 ] 除了双无效LOX-无效MMT麦芽的上述潜在性质外，相应的大麦也可以用于产生低异味的大麦啤酒，低异味的大麦啤酒在本文中定义为通过省略制麦步骤但提供了由许多外加酶(例如Ondea Pro，其为Novozymes生产的酶混合物)组成的醪液生产的啤酒。如下文实施例7中所解决的，本发明人惊喜地发现通过糖化未发芽的双无效LOX-无效MMT大麦原材料产生的麦芽汁含有非常低水平的T2N和DMS异味物，而尽管大麦粒未经过萌芽，来自野生型大麦的麦芽汁的DMS水平却令人惊奇地高。因此，在干燥成熟的大麦粒中一定存在一些DMS前体(DMSP)，这是一种新的尚未描述的性质，且在本申请的啤酒产品中得到了探究。因此，为了使新鲜和陈化啤酒产品中的T2N和DMS水平降至最低，可使用双无效LOX-无效MMT谷粒生产大麦酿造的麦芽汁和啤酒。
附图说明[0052] 图1显示了导致T2N㈧和SMM⑶形成的大麦生物化学途径的简化图。用黑色框突显三无效大麦中缺失的酶。酶缩写如本申请中的定义。图1B显示了 SMM循环的所选组分，在该循环中Met-S-甲基转移酶(MMT)催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转移到甲硫氨酸(Met)上从而合成SMM。SMM可反过来作为甲基供体，在Hcy-S-甲基转移酶(HMT)催化的反应中由高半胱氨酸(Hcy)合成Met。图解显示了本质上可逆的反应是如何连接的。由于将ATP转化成腺苷酸PPi和Pi (未显示)的同时消耗并随后再生了两个Met，因此每轮循环都是无效的。

[0053] 图2显示了证明突变体8063和突变体14018的无效MMT表型的HPLC实验的结果。(A)来自cv.Prestige苗的提取物的基于HPLC分离的实例,显示了天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)和SMM的洗脱。在340nm激发大麦苗衍生自OPA的提取物的荧光并在450nm测定发射。(B)来自所示突变体和野生型cv.Sebastian的提取物的基于HPLC的分离。突变体提取物中组分的分离产生了无SMM特异峰的色谱图。

[0054] 图3显示了无效L0X-1-无效L0X-2 (双无效L0X)和无效MMT大麦植株杂交产生三无效大麦的流程图。

[0055] 图4突显了来自所示植株的样品的LOX活性。成熟大麦粒中总LOX活性测定结果用灰色柱显示，萌芽胚的L0X-2活性则用黑色柱表示。在无效L0X-1-无效L0X-2和三无效植株中均观察到了非常低的LOX活性。[0056] 图5显示了萌芽的三无效植株不能合成SMM(上图，其中在UPLC色谱图中缺失相应的峰)，而在萌芽的野生型大麦cv.Quench的提取物中可容易地以相应的色谱峰而检测到所述化合物(下图)。所选氨基酸的洗脱位置如图所示。

[0057] 图6详细图示了微制麦和微糖化(A)的流程图，以及来自野生型大麦(B)和三无效突变体(C)的麦粒的中试制麦、中试糖化和中试酿造的流程。利用箭头图示了各样品(灰色框标记)的流程图。在列表的上部用粗体字标识了初始、中间和最终产物；过程是斜体字型。在(A)中，流程图下的斜体数字表示用于测定游离T2N及其前体(2和4)和DMSP和DMS(1、2、3)的水平的取样点,其中测定点4代表了冷却后的热麦芽汁。对于大麦面粉的微糖化，在取样点2、3和4上测定样品。在⑶和(C)中，在所有取样点上测定DMSP、DMS、T2N前体和游离T2N的水平。

[0058] 图7显示了无论是加压或正常的麦芽汁煮沸，三无效麦芽制备的啤酒产生的啤酒泡沫均为由野生型cv.Quench的麦芽酿造的啤酒的大约四倍。

[0059] 图8提供了可以如何繁殖NaN3诱变的大麦粒的一个实例。MO代的麦粒长成发育Ml代麦粒的植株。可以播种这些麦粒用于发育成Ml植株，该Ml植株产生M2代的新麦粒。然后，M2植株生长并产生M3代的麦粒。可允许M3代的麦粒萌芽，例如用于分析萌芽的M3植株的胚芽鞘。此外，来自M3植株的麦粒的花可用于与大麦系或栽培品种杂交，以获得M4代的植株。类似的图在Breddam, K.等人的PCT专利申请W02005/087934中以图1A显示。

[0060] 图9显示了优选的啤酒生产工艺的简化图示概要，其包括浸泡大麦谷粒(I)、制麦(2)、烘干(3)、研磨干燥的麦芽(4)、糖化(5)、过滤¢)、在添加酒花的情况下煮沸麦芽汁(7)、在存在酵母的情况下发酵(8)、啤酒熟化(9)、啤酒过滤(10)、包装如包装到瓶和罐等中(11)和贴标签(12)。这些独立的步骤可以分组成包括生产麦芽(1-3)、生产麦芽汁(4-7)、发酵(8-9)和制备成品啤酒(10-12)的部分。虽然图示的是优选的方法，但也可以预期省略一些所述步骤(例如可以省略过滤或者可以不加入酒花，或者可以加入额外步骤例如添加辅料、糖、糖浆或碳酸盐)的其它方法。`[0061] 图10显示了如何在使用无效L0X-1原材料产生的啤酒(包含50%无效L0X-1的混合物)和麦芽汁样品(三无效)中鉴定到衍生自无效L0X-1的DNA片段，而在使用普通麦芽和野生型大麦(Tuborg)的混合物的面粉生产的啤酒中则没有鉴定到。最终PCR扩增的模板体积如图所示。

[0062] 发明详述

[0063] 定义

[0064] 在随后的说明书、附图和表格中使用了许多术语。为了提供包括给出这些术语的范围的说明书和权利要求书，提供了下列定义:

[0065] 本文使用的“a”可以指一个或多个，这取决于其使用的上下文。

[0066] 术语“农学特征”描述了有助于形成所述植物(植株)的性能或经济价值的植物表型或遗传学特征。这种特征包括抗病性、抗虫性、抗病毒性、抗线虫性、耐旱性、高盐度耐受性、产量、株高、成熟天数、麦粒分级(即麦粒的大小分级)和麦粒的含氮量等。

[0067] 与基于大麦的饮料，如啤酒的制造工艺相关，特别是用于描述制麦过程时，术语“大麦”是指大麦粒。在其它所有情况下，除非另有说明，否则“大麦”是指包括任何培育品系或栽培品种或变种(variety)在内的大麦植物(Hordeum vulgare, L.),而大麦植物的部分可以是大麦植物的任何部分，例如任何组织或细胞。

[0068] 在“大麦酿造”的过程中，麦芽汁可以通过将未发芽大麦的提取物与水解大麦成份的酶混合物一起温育而制备。通过大麦酿造生产的麦芽汁可称为“大麦麦芽汁”或“大麦酿造的”麦芽汁。

[0069] “抗病性”指植物避免出现作为植物-病原体相互作用的结果的疾病症状。这样阻止了病原体引起植物疾病和相关的疾病症状。或者，由病原体引起的疾病症状被减到最小，或降低，甚至得到预防。

[0070] 本文使用的“DMSP”是DMS前体或DMS潜能的缩写，即可在饮料生产过程中转化成DMS的分子。SMM即使不代表所有也代表了大部分的DMSP。本文将DMSP的水平定义为DMS的量，所述DMS可通过在碱性条件下煮沸I小时在特定植物材料或其产物中由DMSP产生。如本文所定义，IppbDMSP可转化成Ippb DMS。

[0071] 本文使用的术语“双无效LOX”是指导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变和导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变。因此，“双无效LOX大麦植株”是包含导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变和导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变的大麦植株。类似地，“双无效LOX麦粒”是具有导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变和导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变的麦粒。

[0072] 术语“双无效LOX-无效MMT”指导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变和导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变以及导致功能性MMT完全丧失的第三突变。因此，“双无效LOX-无效MMT大麦植株”是包含导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变和导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变以及导致功能性MMT完全丧失的第三突变的大麦植株。类似地，“双无效LOX-无效MMT麦粒”是具有导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变和导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变以及导致功能性MMT完全丧失的第三突变的麦粒。有用的双无效LOX-无效MMT的实例称为“三无效”并描述于下文实施例中。

[0073] 在本文中定义的“谷类”植物是禾本科(Graminae)植物家族的成员，其中种植禾本科植物主要是为了获取其含淀粉的种子或麦粒。谷类植物包括，但不限于大麦(Hordeum)、小麦(Triticum)、稻(Oryza)、玉米(Zea)、黑麦(Secale)、燕麦(Avena)、高粱(Sorghum)和黑小麦(Triticale,黑麦-小麦杂交种)。

[0074] 在有关特定核酸的上下文中，“编码”或“编码的”表示包含用于翻译成特定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸或多核苷酸可以包含位于核酸翻译区中的非翻译序列(例如内含子)，或者可以缺乏这种插入的非翻译序列(例如在cDNA中)。利用密码子对编码蛋白质的信息进行说明。

[0075] 本文在有关核酸的上下文中使用的“表达”应理解为来源于核酸片段的正义mRNA或者反义RNA的转录和累积。在有关蛋白质的上下文中使用的“表达”指将mRNA翻译成多肽。[0076] 术语“基因”指参与产生多肽链的DNA片段；其包括在编码区之前和之后的区域(启动子和终止子)。此外，植物基因通常由被内含子中断的外显子组成。在转录成RNA之后，通过剪接除去内含子以产生成熟的信使RNA(mRNA)。通常通过充当剪接过程的剪接信号的共有序列确定外显子和内含子之间的“剪接位点”，剪接过程由从初级RNA转录本删除内含子和在切去内含子的任一侧连接或融合剩余RNA的末端而组成。在一些情况下，交互的或不同的剪接模式可以从同一单个DNA延伸段产生不同的蛋白质。天然基因被可以称为“内源基因”。

[0077] 本文使用的“异源”在指核酸时表示来源于外来物种的核酸，或者如果源于相同物种，则是通过目的性人为干预在组成和/或基因座方面对其天然形式进行实质上的修饰的核酸。

[0078] 本文使用的术语“萌芽(germination) ”表示大麦粒在各种组合物中，例如在见于自然界的普通土壤中开始或恢复生长。因此，萌芽胚是正在萌芽的胚。萌芽也可以在置于培养室等的盆内土壤中进行，或者，例如可以在置于标准实验室皮氏培养皿的湿滤纸上进行，或者在制麦的过程中进行(例如制麦厂的浸泡罐或萌芽盒内进行)。按照一般理解，萌芽包括麦粒的水合作用、麦粒的膨胀和诱导胚生长。影响萌芽的环境因素包括湿度、温度和氧水平。观察根和芽的发育。

[0079] 术语“麦粒”被定义为包括谷类颖果，也称为内部种子(internal seed)、外稃和内稃。在大多数大麦品种中，外稃和内稃附着于颖果上，而且是脱粒后的麦粒的一部分。但是，还存在裸麦(naked barley)品种。在这些品种中，颖果没有外稃和内稃，因此像小麦一样脱粒。术语“麦粒”和“谷粒”在本文中可以互用。

[0080] “谷粒发育”是指开始于花粉细胞对卵细胞受精的过程。在受精过程中，借助或不借助液泡寻IE (vacuole targeting)而将代谢储物(例如糖、寡糖、淀粉、酹类、氨基酸和蛋白质)储藏至麦粒(谷粒)的各种组织，例如胚乳、外种皮、糊粉和角质鳞片，由此导致麦粒(谷粒)膨胀，麦粒(谷粒)灌浆，并且结束于麦粒(谷粒)脱水。

[0081] 术语“功能完全丧失”是指缺乏给定酶活性。因此，“功能性L0X-1和L0X-2完全丧失”的大麦植株是 没有可检测到的L0X-1和L0X-2活性的大麦植株。虽然L0X-1和L0X-2酶可具有其它活性，但在本发明中，L0X-1和L0X-2活性是通过测定由亚油酸形成9-HP0DE和13-HP0DE的试验过程确定的。优选地，按照国际专利PCT/DK2009/050355实施例4的描述测定由亚油酸形成9-HP0DE和13-HP0DE。应该利用萌芽胚的蛋白提取物测定所述活性。在本发明中，当利用亚油酸作为底物，产生出的色谱峰对应于小于5%、优选小于3%的国际专利PCT/DK2009/050355图5A所示的标准品9-HP0DE峰，和/或产生出的色谱峰对应于小于5%，优选小于3%的国际专利PCT/DK2009/050355图5A所示的标准品13-HP0DE峰时，则认为在使用国际专利PCT/DK2009/050355实施例4所述的试验时，没有可检测到的L0X-1和L0X-2活性。实现功能性LOX完全丧失的分子方法包括产生引起所述酶的转录本完全缺失或相应的编码酶完全缺失的突变，或者产生使所编码的酶完全失活的突变。类似地，“功能性MMT完全丧失”的大麦植株指当使用下文实施例2中描述的试验时缺乏MMT酶活性，即没有可检测到的MMT活性的大麦植物。或者，通过分离所述大麦的MMT cDNA并测定所述cDNA编码的蛋白质是否能够催化SAM向Met转移甲基基团并形成SMM来测定大麦植物的MMT活性。

[0082] 术语“L0X-1活性”是指大麦L0X-1酶的酶活性。特别地，在本发明中，“L0X-1活性”是由亚油酸至9-HP0DE且较小程度地至13-HP0DE的酶促双加氧作用。尽管L0X-1能够催化其它反应，但为了确定本发明的L0X-1的活性，仅应考虑形成9-HP0DE和13-HP0DE的活性。图1A概述了亚油酸被转化为9-HP0DE的生化途径。

[0083] 术语“L0X-2活性”是指大麦L0X-2酶的酶活性。特别地，在本发明中，“L0X-2活性”是由亚油酸至13-HP0DE且较小程度至9-HP0DE的酶促双加氧作用。尽管L0X-2能够催化其它反应，但为了测定本发明的L0X-2的活性，仅应考虑形成13-HP0DE和9-HP0DE的活性。图1A概述了亚油酸被转化为13-HP0DE的生化途径。

[0084] 术语“麦芽饮料”和术语“基于麦芽的饮料”是指利用麦芽制备的饮料，优选通过包括用热水温育麦芽的步骤的方法制备的饮料。所述术语在本文中可互换使用。麦芽饮料可以是例如啤酒或无酒精麦芽饮料(maltinas)。也可以使用“大麦酿造”(参考上述定义)来生产本申请的啤酒。

[0085] 术语“发酵的麦芽饮料”是指已经发酵的，即与酵母温育的麦芽饮料。

[0086] “制麦”是在包括但不限于制麦厂的浸泡池和萌芽箱内的受控环境条件下进行的大麦粒的特殊萌芽形式。根据本发明的方法，制麦在浸泡大麦粒期间和/或已经浸泡大麦粒之后开始发生。可以通过干燥大麦粒，例如在烘干过程中终止制麦过程。通常烘干在高温下进行，但是本发明的优势是烘干可以在较低的温度下进行。在还没有烘干的情况下，麦芽被称为“绿麦芽”。应理解，由双无效LOX-无效MMT大麦制备的麦芽组合物包含双无效LOX-无效MMT麦芽，例如纯的双无效LOX-无效MMT麦芽或者包含双无效LOX-无效MMT麦芽的任何麦芽混合物。优选地，所述组合物仅由双无效LOX-无效MMT大麦制备。可以对麦芽进行加工，例如通过碾磨而加工，并由此被称为“经碾磨的麦芽”或“面粉”。

[0087] “糖化”是经碾磨的麦芽在水中的温育。优选在特定温度和特定体积的水中进行糖化。水的温度和体积是重要的，因为其影响来源于麦芽的酶活性的下降速率，并由此特别影响能够发生的淀粉水解的量；蛋白 酶作用也可具有重要性。糖化可以在辅料存在下发生，应该理解辅料包含除麦芽以外的任何碳水化合物源，例如但不限于作为完整麦粒或者经加工的产品(例如粗面粉、糖浆或淀粉)的大麦(包括例如，双无效LOX-无效MMT大麦)、大麦糖浆或玉米或稻。上文提及的所有辅料都主要用作提取物的其它来源(在麦芽汁加热的过程中常添加糖浆)。酿酒厂内辅料的加工要求取决于使用的辅料的状态和类型，并且特别是淀粉胶化或液化的温度。如果胶化温度超过正常的麦芽糖化温度，则淀粉在添加至醪液中之前就被胶化和液化。

[0088] 术语“MMT活性”指大麦甲硫氨酸S-甲基转移酶的酶活性。在本发明中，“MMT活性”是由MMT催化在Met的硫原子上的甲基化作用以产生SMM。即使MMT酶能够催化其它反应，但为了确定本发明的MMT的活性，仅应考虑SMM形成活性。图1B描述了通过甲基化将Met转化成SMM的生物化学反应。

[0089] “突变”包括基因的编码和非编码区的缺失、插入、取代、易位和点突变。缺失可以是整个基因或者仅基因的一部分的缺失，其中，非编码区优选为启动子区或者终止区或者内含子。点突变可涉及一个碱基或者一个碱基对的变化，并且可产生终止密码子、移框突变或氨基酸取代。参考本文的图8，其显示了在育种程序中如何繁殖突变大麦谷粒的概述，M3代的谷粒和其直接繁殖的谷粒或者包括其植物在内的任意子代可以称为“原始突变体(rawmutant)”。此外，仍然参照本文图8，术语“育种系”是指M4代的谷粒和包括其植物在内的任意子代，其可能是与栽培品种植株的杂交结果，或者是与具有单独的特定特征的另一育种系杂交的结果。

[0090] 术语“无效LOX (或LOX无效)”是指LOX编码基因中存在引起所编码的LOX酶(L0X-1或L0X-2或L0X-1和L0X-2)的功能完全丧失的突变。在LOX编码基因中产生提前终止(无义)密码子的突变仅代表能够实现功能性LOX的完全丧失的一种机制。实现功能性LOX的完全丧失的分子方法包括产生引起所述酶的转录本完全缺失的突变，或者产生引起所编码的酶完全失活的突变。与植物(植株)有关的“无效LOX (或LOX无效)”是指具有导致功能性LOX酶完全丧失的突变的植物(植株)。

[0091] 本文所用的术语“无效MMT (或MMT无效)”指功能性S-腺苷甲硫氨酸:甲硫氨酸S-甲基转移酶(也称为甲硫氨酸S-甲基转移酶)的完全丧失。因此，“无效MMT大麦植株”是在编码丽T的基因中包含导致功能性MMT完全丧失的突变的大麦植株。类似地，“无效MMT麦粒”是在编码MMT的基因中包含导致功能性MMT完全丧失的突变的麦粒。

[0092] 术语“可操作地连接”是用于指两个或更多个核酸片段连接在单个多核苷酸上，从而使一个片段的功能受另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达，即编码序列处于启动子的转录控制下时，启动子与编码序列可操作地连接。可以以正义或反义方向将编码序列与调控序列可操作地连接。

[0093] “PCR”或“聚合酶链式反应”是本领域技术人员熟知的用于扩增特定DNA片段的技术(Mul I is, K.B.等人的美国专利第4，683，195和4，800，159号)。

[0094] “植物”或“植物材料”包括可以再生出大麦植株的植物细胞、植物原生质体和植物细胞组织培养物，包括植物愈伤组织和在植物中的完整植物细胞，或植物部分，例如胚、花粉、胚珠、花、麦粒、叶、根、根尖、花药，或植物的任何部分或产品。在一个实施方案中，植物材料可以是无法再生出大麦植株的植物细胞。

[0095] 术语“植物(植株)产品”表示通过加工植物或植物材料生产的产品。因此，所述植物产品例如可以是，例如麦芽、麦芽汁、发酵的或未发酵的饮料、食品，或饲料产品。

[0096] 本文使用“重组体”涉及蛋白质时表示源于外来物种的蛋白质，或者如果来源于相同物种，则表示通过目的性人为干预在组成上对其天然形式进行实质上的修饰的蛋白质。

[0097] 本申请含义内的“啤酒品尝专家小组”是在品尝和表述啤酒风味(主要集中于醛、纸样味道、陈化(old)味道、酯、高级醇、脂肪酸和硫组分)方面受过全面训练的专家小组。虽然存在许多用于评价风味成分的分析工具，但难以通过分析来评价风味活性组分的相对显著性。但是，此类复杂的性质可以由品尝专家进行评价。品尝专家的持续训练包括品尝并评价标准啤酒样品。

[0098] 术语“剪接位点”表示基因的外显子和内含子之间的界限。因此，剪接位点可以是从外显子至内含子的边界(被称为“供体位点”)，或者是从外显子分隔内含子的边界(被称为“受体位点”)。植物的剪接位点通常包括共有序列。内含子的5’末端通常由保守性GT 二核苷酸(mRNA中为⑶)组成，内含子的3’末端通常由保守性二核苷酸AG组成。因此，内含子的5’剪接位点包含内含子的5’末端，而3’剪接位点包含内含子的3’末端。优选地，在本发明中，内含子的剪接位点是由内含子的最5’端的二核苷酸(通常为GT)组成的5’剪接位点，或者由内含子的最3’端的二核苷酸(通常为AG)组成的3’剪接位点。

[0099] 除非另有指明，否则“T2N”表示游离形式的反式-2-壬烯醛(T2N)。T2N有时还指2-E-壬烯醛。

[0100] 术语“T2N潜能(T2N potential) ”描述的是能够在一个或多个反应中释放T2N，或者被转化成T2N的化学物质。在本发明中，T2N潜能被定义为在100°C、pH4.0温育2小时的过程中释放至溶液，例如麦芽汁或者啤酒中的T2N的浓度。实际上，测定起始T2N浓度，之后使溶液在100°C、pH4温育2小时，然后测定T2N浓度。起始T2N浓度和最终T2N浓度之间的差异被称为T2N潜能。酸性下的热处理引起T2N潜能例如“T2N加合物”释放T2N，其中T2N加合物用以描述与一种或多种物质，包括但不限于蛋白质、亚硫酸盐、细胞碎片或细胞壁等结合的T2N。T2N加合物本身通常不会被人感觉为异味。但是，从所述T2N加合物释放的T2N可以产生异味。

[0101] “组织培养物”表示包含相同或不同类型的分离细胞的组合物，或组织成为植物的部分(包括例如原生质体、愈伤组织、胚、花粉和花药等)中的那些细胞的集合。

[0102] 本文使用的“转基因”包括是指已经通过引入异源核酸而被修饰的细胞，或由如此修饰的细胞衍生而来的细胞。因此，例如，转基因细胞表达未以相同形式见于天然形式的细胞中的基因，或者表达由于目的性人为干预而异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。本文使用的与植物，特别是大麦植物有关的术语“转基因”不包括通过传统植物育种方法，例如基于NaN3的诱变法，以及不是通过目的性人工干预的天然发生事件产生的细胞改变。

[0103] “野生大麦”,即Hordeum vulgare ssp.spontaneum被认为是大麦当今栽培形式的祖先。认为大麦从野生至栽培状态的转变与该植物向“大麦当地品种”的驯化同时发生。这些大麦当地品种在遗传上比野生大麦更接近于现代栽培品种。

[0104] 术语“野生型”大麦是指按照传统方式产生的大麦植株。优选地，该术语是指已经衍生出本发明大麦植株的大麦植株，即亲本植株。野生型大麦粒通常可作为“栽培品种”或“变种/品种”(即那些由国家植物育种组织列出的在遗传上相似的麦粒)而获自例如种子公司。尽管可以获得几个无效L0X-1大麦栽培品种(例如cv.Chamonix和cv.Charmay),但为了更好地理解本发明，所有的无效L0X-1、无效L0X-2、双无效LOX和双无效LOX-无效MMT植株在本文中都被认为是突变植株而非野生型植株。术语“栽培品种”和“变种”在本文中可互换使用。

[0105] 术语“麦芽汁”表示麦芽，例如碾磨过的麦芽或绿麦芽或者碾磨过的绿麦芽的液体提取物。在大麦酿造中，麦芽汁还可以通过将未发芽大麦的提取物与水解大麦成分的酶混合物一起温育而制备。除所述麦芽或源自大麦的提取物外，还可以由麦芽和额外的成分，例如部分转化为可发酵糖的额外含淀粉物质制备所述液体提取物。麦芽汁通常通过糖化，随后任选的“喷射提取(sparging)”(即在用热水糖化后从用过的谷粒提取残留糖和其它化合物的过程)而获得。喷射提取通常在滤桶、麦芽浆过滤器或可以从用过的谷粒分离提取水的另一种设备内进行。糖化后获得的麦芽汁通常被称为“第一麦芽汁”，而喷射提取后获得的麦芽汁通常被称为“第二麦芽汁”。如非特别指明，术语麦芽汁可以是第一麦芽汁、第二麦芽汁或者二者的组合。在传统的啤酒生产过程中，麦芽汁与酒花一起煮沸，然而本发明提供了用于减少麦芽汁煮沸或避免麦芽汁煮沸的方法。没有酒花的麦芽汁还可以称为“甜麦芽汁”，而与酒花一起煮沸/加热的麦芽汁可被称为“煮沸的麦芽汁”。

[0106] 制备基于大麦的饮料的方法

[0107] 本发明涉及用于制备具有低水平异味物及其前体的基于大麦的饮料的方法，其中所述方法涉及减少能量输入。所述异味物为下文所述，但该异味物优选为T2N和DMS。所述方法包括使用大麦植物，其优选为双无效LOX-无效MMT大麦植物。此类大麦植株将在下文作更详细地描述。

[0108] 尽管在本发明的一些实施方案中，使用未发芽的大麦制备基于大麦的饮料，但根据本发明，所述方法一般包括使所述双无效LOX-无效MMT大麦植株发芽的步骤。发芽将在下文“制麦”部分作更详细地描述。

[0109] 所述方法还包括在任选存在额外的辅料的情况下，通过糖化双无效LOX-无效MMT大麦或双无效LOX-无效MMT麦芽或其混合物制备麦芽汁的步骤。糖化将在下文“糖化”部分作更详细地描述。

[0110] 所述方法还包括在任选地存在额外成分的情况下加热所述麦芽汁的步骤，其中最多4%，例如最多2%的麦芽汁体积被蒸发掉，由此获得加热后的麦芽汁。该步骤将在“加热麦芽汁”部分作更详细地描述。

[0111] 最后，所述方法包括将加热后的麦芽汁加工成饮料。该部分将在下文“饮料制备”部分作更详细地描述。

[0112]制麦(malting)

[0113] 术语“制麦”应理解为浸泡后的大麦粒在受控环境条件下发生的萌芽过程，例如在图9中步骤2和步骤3所示的过程，以及其后的干燥步骤。所述干燥步骤可优选为萌芽麦粒在高温下的烘干。

[0114] 干燥前，浸泡并萌芽的大麦谷粒被称为“绿麦芽”，其也可以代表本发明的植物产品。该制麦事件的上述顺序对于引起谷粒改变的多种酶的合成都很重要，而谷粒改变主要是解聚死亡胚乳细胞的细胞壁以动员谷粒养分并激活其它解聚酶的过程。在随后的干燥过程中，由于化学褐变反应而产生风味和颜色。

[0115] 制麦是高度耗能的过程。由于需要高温，烘干也尤其是一个耗能过程。烘干有几个目的，具体包括:(i)干燥萌芽后的大麦粒；(ii)终止萌芽；(iii)变性脂肪氧化酶以降低T2N和T2N潜能的水平；和(iv)从前体产生DMS并去除DMS以降低DMS潜能和DMS的水 平。

[0116] 根据本发明，烘干可以在低温下进行，并且仍然能实现上述目的。通过使用功能性L0X-1和L0X-2丧失的大麦植株，不需要使脂肪氧化酶变性。通过使用功能性MMT丧失的大麦植株，不需要降低DMS和DMS潜能的水平，这是由于所述水平在该大麦植株中极低。因此，可干燥大麦谷粒并且甚至可在低温下终止萌芽。

[0117] 因此，本发明的制麦优选包括步骤:

[0118] (a)浸泡双无效LOX-无效MMT大麦；

[0119] (b)使所述大麦萌芽；和

[0120] (c)干燥，优选烘干所述大麦。

[0121] 可通过技术人员已知的任何常规方法进行浸泡。一个非限制性实例包括在交替的干燥和润湿条件下于10到25° C温度范围内浸泡。在浸泡过程中，例如，大麦可润湿温育30分钟到3小时，随后干燥温育30分钟到3小时，并任选重复所述温育方案2到5次。浸泡后的最终水含量可以为，例如在40%到50%范围内。

[0122] 可通过本领域技术人员已知的任何常规方法进行萌芽。一个非限制性实例包括在10° C到25° C的温度下萌芽，任选以变化的温度萌芽I到4小时。

[0123] 在下文实施例9中概述了合适的浸泡和萌芽方案的非限制性实例。

[0124] 可在常规温度，如至少75° C，例如80° C到90° C范围内，如80° C到85° C范围内进行烘干。因此，可以通过例如Briggs等人(1981)和Hough等人(1982)描述的任何方法产生麦芽。然而，本发明还可以使用产生麦芽的任何其它合适的方法，例如用于产生特色麦芽的方法，包括但不限于焙烧(roasting)麦芽的方法。在实施例6、8和9中描述了非限制性实例。

[0125] 然而，优选地，所述烘干的进行在低温，更优选在低于80° C的温度下，还更优选在低于75° C的温度下，如在低于70° C的温度下，例如在低于65° C的温度下，如在低于60° C的温度下，例如在低于55° C的温度下，如在低于50° C的温度下，例如在低于45° C的温度下，如在低于41° C的温度下。因此，优选所述温度在烘干过程中任何时间里均不升高超过80° C，优选不升高超过75° C。

[0126] 为了充分干燥萌芽的大麦粒，如果在低温下进行烘干，则可增加所述干燥时间。优选地，烘干进行的时间足以将萌芽麦粒的水含量减少至低于10%，优选低于8%，更优选低于6%。因此，在85° C的常规烘干温度下，烘干时间可以在I到3小时范围内，而70° C到80° C范围内的温度下烘干可能需要I到10小时的烘干时间；50° C到70° C范围内温度下烘干可能需要3到50小时的烘干时间，而低于50° C温度上，例如40° C到50° C范围内的烘干可能需要超过40小时的烘干时间，如40到60小时，例如45到52小时，如48小时的烘干时间。

[0127] 一方面，本发明还涉及通过制麦，优选通过上文明确描述的制麦由双无效LOX-无效MMT大麦粒制备的麦芽组合物。

[0128] 即使在上文描述的低烘干温度下制备时，所述麦芽组合物也包含低水平的T2N和T2N潜能。特别地，所述麦芽组合物包含低水平的T2N潜能(和T2N前体)。

[0129] 已经有描述称，通过浸泡工序(其中可以对大麦进行高温和/或乳酸处理)可降低大麦粒中的LOX活性。然而，此类浸泡工序也是耗能的。此外，这种处理可具有其它的不利作用，例如降低所需的酶活性，例如植酸酶活性。此外，这种处理仅从进行热处理的时间点开始降低LOX活性，因此不影响来自LOX活性的产物在此前的积累。

[0130] 在本发明的一个实施方案中，使用不在至少70°C的温度浸泡大麦粒的方法制备植物产品。还优选使用不在至少57°C的温度下在乳酸存在的情况下浸泡大麦粒的方法制备本发明的植物产品。

[0131] 与以相同方式由野生型大麦(优选cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina)制备的麦芽组合物相比，优选所述麦芽组合物包含少于60%，优选少于50%，更优选少于40%，甚至更优选少于30%，例如少于20%的T2N。

[0132] 与以相同方式由野生型大麦(优选cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina)制备的麦芽组合物相比，进一步优选所述麦芽组合物甚至当在70° C到80° C范围内的温度下烘干时还包含少于60%，优选少于50%，更优选少于40%，甚至更优选少于30%，更优选少于20% 的 T2N。

[0133] 与以相同方式由野生型大麦(优选cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina)制备的麦芽组合物相比，进一步优选所述麦芽组合物甚至当在50° C到70° C范围内的温度下烘干时还包含少于60%，优选少于50%，更优选少于40%，甚至更优选少于30%，更优选少于20% 的 T2N。

[0134] 与以相同方式由野生型大麦(优选cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina)制备的麦芽组合物相比，进一步优选所述麦芽组合物甚至当在40° C到50° C范围内的温度下烘干时还包含少于60%，优选少于50%，更优选少于40%，甚至更优选少于30%，更优选少于20% 的 T2N。

[0135] 除了低水平的T2N和T2N潜能，本发明的麦芽甚至当在上述的低烘干温度下制备时也包含低水平的DMS和DMS前体。

[0136] 有趣的是，DMS是沸点为37° C_38° C的易挥发性化合物(Imashuku，上文)，并且在麦芽制备过程，例如在烘干过程中，组合物一般进行热处理，以便蒸发掉大量的DMS。然而，在普通麦芽组合物的冷却过程中，可从DMS前体(DMSP)产生更多的DMS。本发明的一个主要优点是在麦芽组合物中没有产生或仅产生很少的DMSP(特别是SMM)。

[0137] 降低麦芽中DMS浓度的方法已有描述。这些方法中的许多都依赖于高度耗能的麦芽加热处理。所述加热处理可简单地是例如在烘干过程中加热麦芽，或其可包括通过使用蒸汽挥发和/或去除游离的DMS。因此，麦芽的蒸汽处理可降低麦芽中游离DMS的水平，但也是高能耗过程。此外，这些方法主要降低了麦芽中游离DMS的水平，对SMM的水平仅有很小的影响。在本发明的一个实施方案中，本发明的麦芽组合物仅已经进行了包括通过蒸汽挥发并去除游离DMS的有限处理，或者还未进行在烘干过程中使用蒸汽挥发并去除游离DMS的处理。

[0138] 在本发明的一个实施方案中，优选不曾利用溴酸盐，如溴酸钾或溴酸钙处理本发明的麦芽。

[0139] 本发明的麦芽组合物优选包含最多3，优选最多2，更优选最多1，甚至更优选最多0.5，如最多0.2 μ g/g的游离DMS。此外，优选本发明的麦芽组合物包含最多2，优选最多1，更优选最多0.5 μ g/g,甚至更优选最多0.2 μ g/g的DMSP。此处和本文其它地方的DMSP (优选为SMM)的浓度表示为可从所述DMSP中释放的DMS的浓度。

[0140] 进一步优选即使在70° C到80° C范围内的温度下烘干时，所述麦芽组合物还包含最多2,优选最多I,更优选最多0.5 μ g/g,甚至更优选最多0.2 μ g/g的DMSP (优选为SMM)。

[0141] 进一步优选即使在50° C到70° C范围内的温度下烘干时，所述麦芽组合物还包含最多2,优选最多I,更优选最多0.5 μ g/g,甚至更优选最多0.2 μ g/g的DMSP (优选为SMM)。

[0142] 进一步优选即使在40° C到50° C范围内的温度下烘干时，所述麦芽组合物还包含最多2,优选最多I,更优选最多0.5 μ g/g,甚至更优选最多0.2 μ g/g的DMSP (优选为SMM)。

[0143] 本发明的另一方面涉及绿麦芽组合物，其包含最多5000，更优选最多2500，还更优选最多1000，甚至更优选最多500，还更优选最多250，例如最多150ppb DMSP。还优选所述绿麦芽组合物包含最多200，优选最多150，更优选最多100，甚至更优选最多50，如最多25ppb的游离DMS。[0144] 虽然麦芽的主要用途用于饮料生产，但是也可将其用在其它工业工艺中，例如以麦芽或麦芽粉的形式或间接作为麦芽糖浆等用在烘烤业中作为酶源，或者用在食品工业中作为调味剂和着色剂。因此，本发明的植物产品可以是任何上述产品。

[0145] 另一方面，本发明的植物产品包含或甚至由糖浆(例如大麦糖浆或大麦麦芽糖浆)组成。所述植物产品还可以是大麦或麦芽的提取物。[0146] 可以通过，例如碾磨，对麦芽进行进一步加工。因此，本发明的植物产品可以是任何种类的麦芽，例如未加工的麦芽，或者经碾磨的麦芽，如面粉。经碾磨的麦芽及其面粉包含麦芽的化学成分和缺乏再萌芽能力的死细胞。

[0147] 优选在干燥状态下进行碾磨，即干燥的同时碾磨麦芽。因此，所述麦芽优选不在水中碾磨。

[0148] 糖化

[0149] 本发明的方法包括通过糖化双无效LOX-无效MMT大麦和/或麦芽和任选的额外辅料产生麦芽汁的步骤。所述糖化步骤还任选地包括喷射提取，因此所述糖化步骤可以是包括喷射提取步骤的糖化步骤或不包括喷射提取步骤的糖化步骤。

[0150] 通常，通过碾磨双无效LOX-无效MMT麦芽和/或双无效LOX-无效MMT大麦开始麦芽汁的生产。如果添加额外的辅料， 也可以根据其性质对其进行碾磨。如果辅料是谷类，例如可以进行碾磨，然而通常不碾磨糖浆、糖等。碾磨促进水分在糖化阶段进入谷粒颗粒中。在糖化过程中，制麦过程中起始的底物的酶解聚可持续进行。

[0151] 在图9中，步骤4到6显示了由麦芽制备麦芽汁的通用方法。通常，通过合并并温育经研磨的麦芽和水，即在糖化工艺中制备麦芽汁。在糖化过程中，可以向所述麦芽/液体组合物补充额外的富含碳水化合物的辅料组合物，例如经碾磨的大麦、玉米或水稻辅料。未发芽的谷类辅料通常含有非常少或者不含活性酶，这使得补充麦芽或外源酶以提供多糖解聚等所必需的酶至关重要。

[0152] 在糖化过程中，经碾磨的双无效LOX-无效MMT麦芽和/或经碾磨的双无效LOX-无效MMT大麦和任选额外的辅料与液体部分，例如水一起温育。温育温度通常保持恒定(恒温糖化)或者逐渐升高，例如以连续方式升高。在任何一种情况下，在麦芽/大麦/辅料中的可溶物质均被释放至所述液体部分中。随后的过滤将麦芽汁和残留的固体颗粒分离，后者还被称为“用过的谷粒”。因此获得的麦芽汁还可以被称为“第一麦芽汁”。可在也称为喷射提取的过程中向用过的谷粒中添加额外的液体，如水。在喷射提取和过滤后，可以获得“第二麦芽汁”。通过重复所述过程可以制备进一步的麦芽汁。Briggs等人(上文)和Hough等人(上文)描述了制备麦芽汁的合适方法的非限制性实例。

[0153] 已有描述通过酶的热处理可以降低LOX活性并且可以通过热处理降低DMS水平。同样，已有描述可以热处理麦芽汁以降低LOX活性并降低DMS水平和/或在高温下进行糖化以实现相同的目的。然而，热处理具有其它不利影响，例如降低其它酶活性并且热处理也是耗能的。此外，热处理仅从进行热处理的时间点开始降低脂肪氧化酶活性和DMS水平，因此不影响LOX活性衍生产物和DMS前体在此前的积累。

[0154] 因此，在本发明的一个实施方案中，利用以下方法制备麦芽汁，其中初始糖化温度不超过70°C，优选不超过69°C，因此，例如初始糖化温度可以在30° C到69° C的范围内，如在35° C到69° C的范围内，例如在35° C到65° C的范围内，如在35° C到55° C的范围内，例如在35° C到45° C的范围内，如大约40° C。还优选在糖化过程中，本发明的麦芽汁没有在70°C或更高温度下持续大于25分钟，优选不大于20分钟，并且所述麦芽汁没有在78°C或更高温度下持续大于20分钟，优选不大于15分钟，更优选不大于10分钟。如果糖化温度过高，该性质将影响醪液中的酶活性并可以降低，乃至消除所需酶活性，这将导致麦芽汁品质改变。还优选在糖化过程中，本发明的麦芽汁没有在65° C或更高温度下持续大于100分钟，优选不大于90分钟，更优选不超过80分钟，还更优选不超过70分钟。

[0155] 在本发明的优选实施方案中，糖化过程中的温度不超过80 ° C，优选不超过78。Co

[0156] 合适的糖化的一个非限制性实例是:

[0157] (I)在35-45 ° C的温度范围内，如大约40 ° C的温度下初始糖化(marshing-1n) 10到30分钟，如大约20分钟；

[0158] (2)在30到90分钟范围，优选在45到75分钟范围，如大约60分钟内，加热至60° C到70° C范围，优选60° C到65° C范围，如大约65° C的温度；

[0159] (3)在5到15分钟范围，如大约10分钟内，加热至70° C到80° C范围，优选在75° C到78° C范围，如大约78° C的温度。

[0160] 合适的糖化的另一非限制性实例是:

[0161] (4)在55-65° C范围内，如大约60° C的温度下初始糖化10到30分钟，如大约20分钟；

[0162] (5)在30到90分钟范围，优选在45到75分钟范围，如大约60分钟内，加热至60° C到70° C范围，优选60° C到65° C范围，如大约65° C的温度；

[0163] (6)在5到15分钟范围，如大约10分钟内，加热至70° C到80° C范围，优选在75° C到78° C范围，如大约78° C的温度。

[0164] 如上提及，可通过糖化双无效LOX-无效MMT大麦植株或其部分，如未发芽的双无效LOX-无效MMT麦粒，特别是经碾磨`的未发芽的双无效LOX-无效MMT麦粒或其部分制备麦芽汁组合物。未发芽的大麦粒缺少或仅含有有限量的益于麦芽汁生产的酶，如能够降解细胞壁的酶或将淀粉解聚成糖的酶。因此，在使用未发芽的双无效LOX-无效MMT糖化的本发明的实施方案中，优选向醪液中加入一种或多种合适的外加酿造酶。合适的酶可以是脂肪酶、淀粉降解酶(例如淀粉酶)、葡聚糖酶[优选(1-4)-和/或(1-3，1-4)-β-葡聚糖酶]，和/或木聚糖酶(如阿拉伯木聚糖酶)，和/或蛋白酶，或包含一种或多种上述酶的酶混合物，例如Cereflo、Ultraflo或Ondea Pro (Novozymes)。用于从未发芽的大麦制备的麦芽汁生产饮料的方法也可称为“大麦酿造”，并且其麦芽汁组合物称为“大麦麦芽汁”或“大麦酿造的”麦芽汁。

[0165] 也可以通过使用发芽的和未发芽的双无效LOX-无效MMT大麦植株或其部分的混合物制备麦芽汁组合物，在所述情况下制备过程中可加入一种或多种合适的酶。更具体而言，本发明的大麦可与麦芽以任何组合一起用于糖化(有或没有外加酿造酶)，如，但不限于大麦:麦芽的比例=大约100:0，或大约75:25，或大约50:50，或大约25:75。

[0166] 在本发明的其它实施方案中，优选在糖化之前或糖化过程中不加入外加酶，特别是外加蛋白酶，和/或外加纤维素酶和/或外加α-淀粉酶和/或外加β_淀粉酶和/或外加产麦芽α-淀粉酶。

[0167] 糖化后获得的麦芽汁也称为“甜麦芽汁”。在常规方法中，在有酒花或没有酒花的情况下煮沸甜麦芽汁，煮沸之后将其称为煮沸的麦芽汁。

[0168] 本文所用的术语“大约”表示土 10%，优选土 5%，还更优选土 2%。

[0169] 加热麦芽汁

[0170] 用于制备本发明基于大麦的饮料的方法包括经在“糖化”部分中的上述糖化步骤后获得的麦芽汁的加热步骤。

[0171] 本发明的优势在于在不需要广泛加热麦芽汁的情况下可以制备具有低水平异味物及其前体，特别是T2N和DMS及其前体的基于大麦的饮料。

[0172] 在常规酿造中，通常将麦芽汁长时间煮沸。麦芽汁煮沸有几个目的，具体是:(i)酶失活；(ii)蛋白质凝聚；(iii)麦芽汁灭菌；(iv)酒花化合物的提取；(V) α-酸的异构化；(vi)DMSP转化成DMS ;和(vii)DMS和T2N的蒸发。

[0173] 可在不进行广泛煮沸的情况下实现这些目的中的几个。因此，灭菌仅需要短暂的煮沸或加热。提取酒花化合物也可以在短暂的煮沸或加热过程中完成。预异构化的α-酸可通过商业途径获得，并可加入到麦芽汁中。

[0174] 通过使用功能性L0X-1和L0X-2丧失的大麦植株，不需要使LOX变性。此外，通过使用功能性L0X-1和LOX-丧失的大麦植株也可以消除降低Τ2Ν水平的需要。通过使用功能性MMT丧失的大麦植株，不需要降低DMS和DMS潜能的水平，因为所述水平在此类大麦植株中均是极低的。此外，可干燥大麦谷粒并且可以甚至在低温下终止萌芽。

[0175] 已经尝试通过多种手段，例如通过减少蒸发少至3%与将无用的挥发性化合物蒸馏入蒸汽的提馏方法组合，减少麦芽汁煮沸过程中的能量消耗。然而，产生蒸汽也是耗能过程。

[0176] 也已经尝试了在不进行典型的麦芽汁煮沸的情况下制备麦芽汁。然而，这些方法通常在糖化和利用蒸汽提馏麦芽汁的过程中使用高达95° C的高温，因此被认为是高耗能过程。

[0177] 本发明方法提供了优选甚至在缺少提馏过程的情况下减少蒸发的可能性。因此，根据本发明的方法，加热麦芽汁的方式使得优选最多4%，还优选最多3%，甚至更优选最多2%，甚至更优选最多1 .5%，还更优选最多1%，甚至更优选最多0.5%，甚至更优选最多0.1%，如最多0.01%的麦芽汁体积被蒸发。甚至更优选在缺少蒸汽处理麦芽汁的情况下进行上述少量蒸发。还优选在例如不利用蒸汽提馏麦芽汁的情况下进行上述少量蒸发。

[0178] 所述少量蒸发可在基本上密闭的容器或优选在密闭的容器中通过加热麦芽汁而实现。

[0179] 还优选在所述方法的任何其它步骤中不进行液体的广泛蒸发。因此，本发明的优选实施方案涉及用于制备具有低水平的一种或多种异味物及其前体(优选Τ2Ν和DMS及其前体)的基于大麦的饮料的方法，其中所述方法包括低能量输入，并且包括以下步骤:

[0180] (i)提供大麦植株或其部分，其中所述大麦植株包含:

[0181] (a)导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变；和

[0182] (b)导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变；和

[0183] (c)导致功能性MMT完全丧失的第三突变；

[0184] (ii)任选地对所述大麦的至少部分进行制麦，由此获得发芽的大麦；

[0185] (iii)糖化所述大麦和/或发芽的大麦和任选的额外辅料，由此获得麦芽汁；

[0186] (iv)任选地在存在额外成分下加热所述麦芽汁；

[0187] (V)将所述加热的麦芽汁加工成饮料；

[0188] 其中在方法过程中完成步骤(ii)后，或甚至在完成上述步骤(iv)后蒸发掉最多4%，例如最多3%，如最多2%，例如最多1.5%，如最多1%的液体体积，由此制得具有低水平的一种或多种异味物及其前体的来自大麦的饮料。

[0189] 优选在基本上密闭的容器，如在密闭容器中利用麦芽汁进行上文的步骤(iv)。

[0190] 在其它优选实施方案中，本发明提供了用于制备具有低水平的一种或多种异味物及其前体(优选T2N和DMS及其前体)的基于大麦的饮料的方法，其中所述方法包括低能量输入，且包括以下步骤:

[0191] (i)提供大麦植株或其部分，其中所述大麦植株包含:

[0192] (a)导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变；和

[0193] (b)导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变；和

[0194] (c)导致功能性MMT完全丧失的第三突变；

[0195] (ii)任选地对所述大麦的至少部分进行制麦，由此获得发芽的大麦；

[0196] (iii)糖化所述大麦和/或发芽的大麦和任选的额外辅料，由此获得麦芽汁；

[0197] (iv)任选地在存在额外成分下加热所述麦芽汁；

[0198] (V)将所述加热的麦芽汁加工成饮料；

[0199] 其中将所述液体/麦芽汁/饮料加热至高于80° C的温度持续最多30分钟，更优选最多20分钟，由此制备具有低水平的一种或多种异味物及其前体的来自大麦的饮料。

[0200] 优选地，在所述方法中将所述液体/麦芽汁/饮料加热至80° C到99.8° C范围内的温度，优选80° C到99.5° C范围内的温度，如80° C到99° C的温度，还更优选90° C到99 ° C范围内的温度，持续最多30分钟，优选最多20分钟，如10到30分钟，例如10到20分钟。

[0201] 可以将第一麦芽汁、第二麦芽汁和进一步的麦芽汁合并，随后将其进行加热或者可以加热每一种麦芽汁。根据本发明的方法，麦芽汁不需要必须煮沸。未煮沸的麦芽汁，无论是纯的第一麦芽汁还是合并的麦芽汁，都还被称为“甜麦芽汁”;而煮沸之后，可将其称为“煮沸的麦芽汁”。如果麦芽汁待用于生产啤酒，则通常在煮沸前加入酒花。

[0202] 在常规酿造方法中，将麦芽汁长时间煮沸，通常在60分钟到120分钟范围内，以蒸发掉至少5%，有时候甚至高达25%的麦芽汁体积。然而，因为许多其它原因，例如因为延长煮沸需要大量能量供应，因此不希望延长煮沸。

[0203] 根据本发明，甚至在不延长煮沸的情况下也可以从双无效LOX-无效MMT大麦生产具有低水平T2N、T2N潜能、DMS和DMSP的麦芽汁。因此，将本发明优选实施方案的麦芽汁煮沸最多30分钟，更优选最多15分钟，甚至更优选最多10分钟，还更优选最多5分钟，甚至更优选最多I分钟，还更优选根本不煮沸麦芽汁。还优选在完成本发明方法的步骤ii)后将所述液体/麦芽汁/饮料煮沸最多30分钟，更优选最多15分钟，甚至更优选最多10分钟，还更优选最多5分钟，甚至更优选最多I分钟，还更优选根本不煮沸所述液体/麦芽汁/饮料。优选地，在基本上密闭的容器中，优选在密闭容器中进行麦芽汁的加热。

[0204] 在本文中，术语“煮沸”表示使液体或麦芽汁或饮料达到蒸发水分的温度。因此，在常压下，煮沸表示使水性液体，如麦芽汁达到100° C或稍微高于100° C。

[0205] 因此还优选本发明实施方案的麦芽汁在至少100° C的温度下保持最多30分钟，更优选最多15分钟，甚至更优选最多10分钟，还更优选最多5分钟，甚至更优选最多I分钟，还更优选根本不将所述麦芽汁加热至至少100° C的温度。此外，优选在完成本发明方法的步骤(ii)后将所述液体/麦芽汁/饮料在至少100° C的温度下保持最多30分钟，更优选最多15分钟，甚至更优选最多10分钟，还更优选最多5分钟，甚至更优选最多I分钟，还更优选根本不将所述液体/麦芽汁/饮料加热至至少100° C的温度。

[0206] 还优选制备本发明基于大麦的饮料的整个方法在任何时候都不涉及加热至高于99.8° C，优选99.5° C，还更优选99° C的温度。

[0207] 然而，所述方法可包括将麦芽汁加热至最多99.8° C，如最多99.5° C，例如最多99° C，如最多98° C的温度持续有限量的时间的步骤。所述有限量的时间优选为最多30分钟，更优选最多15分钟，甚至更优选最多10分钟。

[0208] 因此，优选将麦芽汁加热至高于80° C，优选80° C到99.8° C的范围，如80° C到99.5° C的范围，例如80° C到99° C的范围，还更优选90° C到99° C范围内的温度，还更优选95° C到99° C范围内的温度持续最多30分钟，优选最多20分钟，如10到30分钟范围，例如10到20分钟范围内。

[0209] 在本发明额外的实施方案中，优选在发酵前不将麦芽汁进行(例如用CO2冲洗)随后的麦芽汁煮沸过程。

[0210] 麦芽汁

[0211] 另一方面，本发明涉及的植物产品类型是麦芽汁组合物。所述麦芽汁组合物优选由来自双无效LOX-无效MMT麦粒的麦芽组合物制备。所述麦芽汁可仅由双无效LOX-无效MMT麦粒，或还包含其它麦粒的混合物制备。本发明还涉及单独使用双无效LOX-无效MMT大麦，或其部分，如绿麦芽或与其它组分混合制备的麦芽汁组合物。

[0212] 本发明的麦芽汁组合物优选通过上文“糖化”部分中描述的糖化制备。此外，已经按上文“加热麦 芽汁”部分中描述加热了所述麦芽汁组合物。

[0213] 优选的是,与以相同方式由野生型大麦,优选cv.Power或cv.Rosalina制备的麦芽汁组合物相比，所述麦芽汁组合物优选包含少于60%，更优选少于50%，甚至更优选少于40%的T2N潜能。

[0214] 所述麦芽汁可以为第一麦芽汁和/或第二麦芽汁和/或进一步的麦芽汁和/或其混合物。所述麦芽汁组合物可以为甜麦芽汁、加热的麦芽汁或其混合物。加热的麦芽汁优选按上文“加热麦芽汁”步骤中所述进行加热。所述麦芽汁组合物还可以是大麦麦芽汁。通常，麦芽汁组合物包含高含量的氨基氮和可发酵的碳水化合物，后者主要是麦芽糖。

[0215] 在一个实施方案中，麦芽汁可以是甜麦芽汁，即没有进行热处理的麦芽汁。与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power或cv.Rosalina制备的麦芽汁组合物相比,所述甜麦芽汁优选包含少于60%，更优选少于50%的T2N潜能。如果已经由在低温下进行了烘干的麦芽制备了该麦芽汁，所述麦芽汁甚至可包含更少的T2N潜能。因此，在已经由麦芽(其已经在50° C到70° C范围内的温度下进行了烘干)制备了所述甜麦芽汁的本发明实施方案中，与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power制备的麦芽汁组合物相比,该甜麦芽汁可优选包含少于50%，甚至更优选少于45%，如少于40%的T2N潜能。在已经由麦芽(其已经在40° C到50° C范围内的温度下进行了烘干)制备了所述甜麦芽汁的本发明实施方案中，与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Quench或cv.Rosalina制备的麦芽汁组合物相比，所述甜麦芽汁可优选包含少于50%，甚至更优选少于40%，还更优选少于30%的T2N潜倉泛。

[0216] 所述甜麦芽汁优选地还包含低水平DMSP，优选低于150yg/L，更优选低于100 μ g/L,甚至更优选低于50 μ g/L,还更优选低于30 μ g/L,甚至更优选低于20 μ g/L,还更优选低于15 μ g/L的DMSP(优选SMM)。即使如果已经由在低温下进行了烘干的麦芽制备了所述麦芽汁，其仍然包含低水平的DMSP。因此，在已经由麦芽(其已经在50° C到70° C范围内的温度下进行了烘干)制备了所述甜麦芽汁的本发明实施方案中，所述甜麦芽汁可优选包含低于150 μ g/L,更优选低于100 μ g/L,甚至更优选低于50 μ g/L,还更优选低于30 μ g/L，甚至更优选低于20 μ g/L，还更优选低于15 μ g/L的DMSP。在已经由麦芽(其已经在40° C到50° C范围内的温度下进行了烘干)制备了所述甜麦芽汁的本发明实施方案中，所述甜麦芽汁可优选包含低于150 μ g/L,更优选低于100 μ g/L,甚至更优选低于50 μ g/L,还更优选低于 30 μ g/L,甚至更优选低于20 μ g/L,还更优选低于15 μ g/L的DMSP。

[0217] 优选地，所述甜麦芽汁还包含低水平的DMS，优选低于90 μ g/L,甚至更优选低于50 μ g/L,还更优选低于30 μ g/L,甚至更优选低于20 μ g/L的DMS。

[0218] 麦芽汁可以是这样的麦芽汁，其仅已经进行了短时间的热处理，如在95° C到99.8° C范围或95° C到99° C范围内的温度下热处理10到30分钟。在该情况下，与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power或cv.Rosalina制备的麦芽汁组合物相比,所述麦芽汁优选包含最多60%，更优选最多50%，甚至更优选最多45%，更优选地最多40%的T2N潜能。所述麦芽汁还优选包含最多150 μ g/L,更优选低于100 μ g/L,甚至更优选低于50 μ g/L，还更优选低于30 μ g/L,甚至更优选低于20 μ g/L,还更优选低于15 μ g/L的DMSP。所述麦芽汁还优选包含最多150 μ g/L,更优选低于100 μ g/L,甚至更优选低于50 μ g/L,还更优选低于30 μ g/L,甚至更优选低于20 μ g/L的DMS。

[0219] 麦芽汁也可以是加热的麦芽汁(优选按上文“加热麦芽汁”部分中所述进行加热)，在所述情况下与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power制备的麦芽汁组合物相比，所述麦芽汁优选包含最多60%，更优选最多50%，还更优选最多40%的T2N潜能。

[0220] 所述加热的麦芽汁优选地还包含低水平的DMSP，优选低于150 μ g/L,更优选低于100 μ g/L,甚至更优选低于50 μ g/L,还更优选低于30 μ g/L,甚至更优选低于20 μ g/L,还更优选低于15 μ g/L的DMSP。在已经由麦芽(其已经在50° C到70° C范围内的温度下进行了烘干)制备了所述冷却的麦芽汁的本发明实施方案中，所述甜麦芽汁可优选包含低于150 μ g/L,更优选低于100 μ g/L,甚至更优选低于50 μ g/L,还更优选低于30 μ g/L,甚至更优选低于20 μ g/L，还更优选低于15 μ g/L的DMSP。甚至在已经由麦芽(其已经在40° C到50° C范围内的温度下进行了烘干)制备了所述冷却的麦芽汁的本发明实施方案中，所述甜麦芽汁可优选包含低于150 μ g/L,更优选低于100 μ g/L,甚至更优选低于50 μ g/L,还更优选低于30 μ g/L,甚至更优选低于20 μ g/L,还更优选低于15 μ g/L的DMSP。所述加热的麦芽汁优选地还包含低水平的DMS，优选低于30 μ g/L,更优选低于20 μ g/L的DMSP。

[0221] 麦芽汁也可以是加热的麦芽汁(优选按上文“加热麦芽汁”部分中所述进行加热)，其随后已经进行了冷却(本文还称为冷却的麦芽汁)，在所述情况下与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power或cv.Rosalina制备的麦芽汁组合物相比,所述麦芽汁优选包含最多60%，更优选最多50%，还更优选最多40%的T2N潜能。在已经由麦芽(其已经在40° C到50° C范围内的温度下进行了烘干)制备了所述冷却的麦芽汁的本发明实施方案中，与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power或cv.Rosalina制备的麦芽汁组合物相比，所述甜麦芽汁可优选包含少于50%，更优选少于40%，还更优选少于30%的T2N潜能。

[0222] 所述冷却的麦芽汁优选地还包含低水平的DMSP，优选低于90 μ g/L,甚至更优选低于50 μ g/L,还更优选低于30 μ g/L,甚至更优选低于20 μ g/L,还更优选低于15 μ g/L的DMSP。所述冷却的麦芽汁优选地还包含低水平的DMS，优选低于90 μ g/L,甚至更优选低于50 μ g/L,还更优选低于30 μ g/L,甚至更优选低于20 μ g/L的DMS。

[0223] 在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的麦芽汁组合物是大麦麦芽汁，如加热的大麦麦芽汁，即通过未发芽的(并优选经碾磨的)双无效LOX-无效MMT麦粒与水温育，优选通过糖化和喷射提取来制备的麦芽汁。该大麦麦芽汁的特征在于具有极其低水平的T2N和T2N潜能。与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power制备的大麦麦芽汁组合物相比，优选所述大麦麦芽汁包含少于50%，更优选少于40%，还更优选少于30%的T2N潜能。还优选的是，与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power或Quench或cv.Rosalina制备的大麦麦芽汁组合物相比，所述大麦麦芽汁优选包含少于50%，更优选少于40%，还更优选少于30%的T2N前体。

[0224] 饮料

[0225] 在优选方面,本发明涉及饮料,更优选由双无效LOX-无效MMT大麦制备的基于大麦的饮料。所述饮料在一个优选实施方案中可以是麦芽饮料，甚至更优选为发酵的饮料，如发酵的麦芽饮料，优选醇饮料，如啤酒，其中所述饮料是使用双无效LOX-无效MMT大麦或其部分制备的。因此，在本发明的一个优选的实施方案中，优选通过单独或与其它成分组合发酵双无效LOX-无效MMT大麦或其部分或其提取物，例如通过发酵来自双无效LOX-无效MMT麦芽的麦芽汁，来制备所述饮料。

[0226] 在本发明的优 选实施方案中，通过包括以下步骤的方法制备上述饮料:

[0227] (i)提供大麦植株或其部分，其中所述大麦植株包含:

[0228] (a)导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变；和

[0229] (b)导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变；和

[0230] (c)导致功能性MMT完全丧失的第三突变；

[0231] (ii)任选地对所述大麦的至少部分进行制麦，由此获得发芽的大麦；

[0232] (iii)糖化所述大麦和/或发芽的大麦和任选地额外辅料，由此获得麦芽汁；

[0233] (iv)任选地在存在额外成分时加热所述麦芽汁，其中蒸发掉最多4%的麦芽汁体积，由此获得加热的麦芽汁；

[0234] (V)将所述加热的麦芽汁加工成饮料。

[0235] 然而，在其它实施方案中，本发明涉及由双无效LOX-无效MMT大麦制备的任何基于大麦的饮料。因此，本发明还涉及使用常规方法，如常规酿造方法由双无效LOX-无效MMT大麦制备的基于大麦的饮料。

[0236] 在本发明的一些实施方案中，所述饮料是非发酵的饮料，例如麦芽汁，优选由双无效LOX-无效MMT麦芽制备的麦芽汁。

[0237] 还包含在本发明内的是可通过例如大麦酿造由未发芽的大麦植物，优选未发芽的双无效LOX-无效MMT大麦植株，或其部分，制备所述饮料。

[0238] 所述饮料可以是无醇饮料，如无醇啤酒或其它种类的无醇饮料，如无醇麦芽饮料，例如无酒精麦芽饮料(maltina)。[0239] 然而，优选所述饮料由双无效LOX-无效MMT大麦粒制备的麦芽组合物制备。更优选地，所述饮料是啤酒。这可以是本领域技术人员已知的任何种类的啤酒。在一个实施方案中，所述啤酒是，例如贮藏啤酒。优选使用包含萌芽的双无效LOX-无效MMT大麦的麦芽组合物酿造啤酒，更优选所述啤酒是利用仅由萌芽的双无效LOX-无效MMT大麦制备的麦芽组合物酿造的。然而，所述麦芽组合物还可以包含其它成分，例如其它萌芽或未萌芽的谷类，例如野生型大麦、双无效LOX-无效MMT大麦、小麦和/或黑麦，或者包含糖的未萌芽原材料或源自发芽或未发芽原材料的组合物，包括糖浆组合物。然而，优选地，用于制备所述啤酒的所有大麦，如所有发芽和/或未发芽的大麦和/或萌芽和/或未萌芽大麦优选是双无效LOX-无效MMT大麦。

[0240] 因此，本发明还涉及生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤:

[0241] (i)提供包含萌芽的双无效LOX-无效MMT麦粒的麦芽组合物；

[0242] (ii)将所述麦芽组合物加工成饮料；

[0243] 在优选的实施方案中，本发明的饮料是从由烘干的麦芽(优选按上文“发芽”部分中所述进行制备)，更优选通过糖化所述烘干的麦芽(优选按上文“糖化”部分中所述)而制备的麦芽汁生产的啤酒，其中所述糖化也可任选地包括喷射提取步骤。此外，尽管在本发明的某些实施方案中，以常规方式通过煮沸加热所述麦芽汁，但优选按上文“加热麦芽汁”部分中所述，已经优选加热了所述麦芽汁。由此产生的啤酒在本文中也称为“发芽的”。然而，本发明的饮料也可以是由大麦麦芽汁制备的啤酒。这种啤酒也称为“大麦啤酒”。

[0244] —般来说，可以从发芽和/或未发芽的大麦谷粒制造醇饮料，例如啤酒。除了酒花和酵母外，麦芽也促成了啤酒的风味和颜色。此外，麦芽还充当了可发酵糖和酶的来源。啤酒生产的一般工艺的示意图示于图9，而适合发芽和酿酒的方法的实例的详细描述可见于，例如Briggs等人(1981)和Hough等人(1982)的文献。可获得多种用于分析大麦、麦芽和啤酒产物的定时更新的方法,所述方法包括，例如但不限于American Associationof Cereal Chemists (199 5)、American Society of Brewing Chemists(1992)、EuropeanBrewery Convention (1998)和 Institute of Brewing(1997)。已经认识到特定的酿酒厂使用了许多带有显著差异的具体工序，这些差异与当地消费者的喜好有关。本发明可以使用任何此类制造啤酒的方法。

[0245] 由麦芽汁生产啤酒的第一步优选包括如上所述加热所述麦芽汁，随后是麦芽汁冷却和任选地涡旋静止(rest)的后续阶段。冷却后，麦芽汁被转移到含酵母的发酵罐中。优选地，所述酵母是酿酒酵母卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)。可以将麦芽汁发酵任何适当时间，通常在1-100天的范围。在持续数天的发酵过程中，糖被转化成醇和C02，同时伴随产生一些风味物质。

[0246] 随后可以对啤酒进行进一步加工，例如冷藏啤酒。也可以过滤和/或储藏啤酒，储藏是产生令人愉快的芳香以及较少酵母(yeasty)味的过程。也可以加入添加剂。此夕卜，还可以加入C02。最后可以在封装(例如装瓶或装罐)前，对啤酒进行巴氏灭菌和/或过滤。在优选的实施方案中，与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制备的饮料的T2N潜能相比，本发明的饮料包含少于70%，优选少于60%，更优选少于50%的T2N潜能。还优选，如果饮料所基于的原始提取物的。P被调整至10° P到12° P的范围，更优选11° P，那么本发明的饮料包含最多2ppb，更优选最多1.5ppb的T2N潜能。

[0247] 在优选的实施方案中，与以相同方式由野生型大麦,优选cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制备的饮料的T2N前体相比，本发明的饮料包含少于70%，优选少于60%，更优选少于50%的T2N前体。还优选，如果饮料所基于的原始提取物的。P被调整至10° P到12° P的范围，更优选11° P，那么本发明的饮料包含最多2ppb,更优选最多1.5ppb的T2N前体。

[0248] 所述饮料,优选啤酒，也优选包含最多60ppb,更优选低于50ppb,甚至更优选低于40ppb,还更优选低于30ppb,甚至更优选低于20ppb,还更优选低于IOppb的DMS。

[0249] 在本发明的一个具体的实施方案中，饮料是大麦啤酒，与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power或cv.Quench制备的大麦啤酒的T2N潜能相比,其包含少于60%,优选少于50%的T2N潜能。

[0250] 在本发明的另一具体的实施方案中，所述饮料，优选啤酒由加热的麦芽汁制得，所述加热的麦芽汁仅进行了短时间的加热处理，如在95° C到99.8° C范围或95° C到99° C范围的温度下加热了 10到30分钟。优选地，所述加热的麦芽汁已经按上文“加热麦芽汁”部分中所述进行了加热。在由此类加热的麦芽汁中制备饮料，优选啤酒的本发明的实施方案中，与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制备的啤酒的T2N潜能相比，所述饮料，优选啤酒包含少于60%，优选少于50%，更优选少于45%的T2N潜能。在该实施方案中，还优选与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制备的饮料,优选啤酒的T2N前体相比,所述饮料,优选啤酒包含少于60%，优选少于50%，更优选少于45%的T2N前体。在该实施方案中，还优选本发明的啤酒包含最多2ppb，更优选最多1.5ppb的T2N潜能。在该实施方案中，如果饮料所基于的原始提取物的。P被调整至10° P到12° P的范围，更优选11° P，那么还优选本发明的啤酒包含最多2ppb，更优选最多1.5ppb的T2N前体。所述饮料，优选啤酒还优选包含最多60ppb,更优选低于50ppb,甚至更优选低于40ppb,还更优选低于30ppb,甚至更优选低于20ppb,还更优选低于IOppb的DMS。

[0251] “感官品质”表示吸引人嗅觉和味觉的性质。通过例如啤酒品尝专家小组对这些品质进行分析。优选地，所述小组在品尝并描述啤酒风味方面经过了训练，尤其特别关注醛、纸样味道、陈化味道、酯、高级醇、脂肪酸和硫(sulphury)成分。

[0252] 通常，所述品尝小组由3到30位成员组成，例如5到15位，优选8到12位成员组成。所述品尝小组可以评价各种风味的存在，例如纸样、氧化、陈化和面包样(bready)异味以及酯、高级醇、硫成分和啤酒体的风味。与本发明有关，优选特别降低了纸样和/或陈化异味，然而与使用相同方法由野生型大麦制备的饮料相比，芳香的、酯的、醇/溶剂、花香的和/或酒花的风味优选增加。测定饮料的“感官品质”的方法描述于国际专利申请WO2005/087934的实施例6中。测定饮料的“感官品质”的另一个方法描述于国际专利申请PCT/DK2009/050355的实施例8和9中。在下文实施例9中描述了又一实例。在优选的实施方案中，稳定的感官品质至少部分是低水平的T2N或T2N潜能的结果。优选按国际专利申请PCT/DK2009/050315的实施例7中所述测 定芳香的、酯的、醇/溶剂、花香的和/或酒花的味道。在一个优选的实施方案中，本发明的饮料已按国际专利申请PCT/DK2009/050315在第41页第15行，到第44页第9行中所述评价了芳香的、酯的、醇/溶剂、花香的和/或酒花的味道。

[0253] 优选地，本发明的饮料的特征在于，与以相同方式由野生型大麦植株(优选cv.Quench或cv.Rosalina)制备的类似饮料相比,在30° C到40° C范围内，如约37° C储藏至少I周后，其具有更少的纸样味道。优选地，通过经过培训的品尝小组评价，所述纸样味道少于90%，更优选少于80%，如少于70%。

[0254] 还优选与由野生型大麦制备的类似饮料相比，本发明的饮料在高温储藏后具有较少的纸样味道。当由受过培训的专家品尝小组确定“纸样味道”性质(如上文所述)并以O到5分(其中O为无，5为极大)等级进行评分时，优选本发明的饮料具有一个或优选两个以下所有对纸味道的分值:

[0255] (i)在37°C温育I周后，纸样味道分值比以相同方式由野生型大麦，优选cv.Quench或cv.Rosalina制备的饮料的纸样味道分值低至少0.5,优选低至少0.7 ；

[0256] (ii)在37 °C温育2周后，纸样味道分值比以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power或cv.Rosalina制备的饮料的纸样味道分值低至少0.5,优选低至少0.7,更优选低至少0.8，低至少1 ;

[0257] 有趣的是，本发明公开了根据本发明制备的饮料的总风味分值与由野生型大麦制备的饮料相比有所提高。这可能部分由于DMS可掩盖某些期望味道的发现。

[0258] 因此，当在优选使用增压加热而不煮沸相应的麦芽汁的情况下已制备所述饮料时，优选本发明的饮料具有这样的总风味分值，其比以相同方式由野生型大麦，优选由cv.Quench或cv.Rosalina制备的饮料的风味分值高至少I,优选至少1.5,更优选至少2。所述风味分值应该在I到9分的等级上评分，其中9代表了啤酒品尝专家小组给出的最高分值。

[0259] 当饮料甚至在储藏后也包含非常低水平的游离T2N时，所述饮料被称为具有“稳定的感官品质”。因此，本发明的目的是提供使用双无效LOX-无效MMT大麦植株制造的饮料(如具有稳定的感官品质的啤酒)。

[0260] 因此，优选在30° C到40° C范围，优选37° C的温度下储藏至少I周，优选至少2周，更优选至少3周，甚至更优选至少4周后，与以相同方式由野生型大麦，优选由cv.Quench或cv.Rosalina制备的饮料相比,本发明的饮料包含少于80%,优选少于70%,更优选少于65%，甚至更优选少于60%，甚至更优选少于55%的游离T2N。还优选在37° C储藏2周后，本发明的饮料包含少于0.025ppb的游离T2N。

[0261] 在本发明的另一具体的实施方案中，饮料，优选啤酒由仅经过短时间热处理，如在95到99° C范围内的温度下处理10到30分钟的加热麦芽汁制备。优选地，所述加热麦芽汁已经按上文“加热麦芽汁”部分中所述进行了加热。在其中由这种加热的麦芽汁制备饮料(优选啤酒)的本发明的实施方案中，在30到40°C的范围，优选37°C的温度下储藏至少I周，优选至少2周，更优选至少3周，甚至更优选至少4周后，与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Quench或cv.Rosalina制备的饮料相比,本发明的饮料(优选啤酒)包含少于80%，优选少于70%，更优选少于65%的游离T2N。

[0262] 特别地,优选在存在不超过IOppm的亚硫酸盐水平,优选I到IOppm范围的亚硫酸盐水平，更优选I到8ppm范围，更优选2到6ppm范围,还更优选3到6ppm范围的亚硫酸盐水平的情况下，在30到40°C的范围，优选37°C的温度下储藏2周后，与以相同方式由野生型大麦，优选CV.Quench或cv.Rosalina制备的饮料相比，由所述加热的麦芽汁制备的此类饮料(优选啤酒)包含非常低水平的T2N，优选少于80%，优选少于70%，更优选少于65%的游离T2N。

[0263] 还特别优选在37°C储藏8周后，与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Quench或cv.Rosalina制备的饮料相比，本发明的饮料(如啤酒,例如大麦啤酒)包含非常低水平的T2N，优选少于80%，优选少于70%，更优选少于60%，甚至更优选少于5%的游离T2N。

[0264] 在一个实施方案中，本发明涉及具有低水平的某些三羟基十八碳烯酸(也被称为THA)的饮料，如啤酒，特别是具有低水平9，12，13-THA和9，10，13-THA的饮料。THA的特征在于苦味(Baur和Grosch, 1977 ;Baur等人，1977),使得不希望所述化合物存在于饮料中。

[0265] 因此，期望9，12，13-THA和9，10, 13-THA的水平尽可能低，例如低于1.3ppm，如低于lppm。因此,优选9，12, 13-THA的水平尽可能低,例如低于1.3ppm,如低于lppm。还优选9，10, 13-THA水平也尽可能低，例如低于1.3ppm，如低于lppm。然而，源自麦芽的饮料(如啤酒)中9，12，13-THA和9，10，13-THA的总浓度还依赖于用于制备所述特定饮料的麦芽量。因此，通常高浓度啤酒将包含比淡啤酒多的9，12，13-THA和9，10，13-THA，从而使高浓度啤酒中能接受整体水平较高的9，12，13-THA和9，10，13-THA。因此，与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制备的饮料相比,优选本发明的饮料包含较低水平的9，12，13-THA和9，10, 13-THA。特别地，优选与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power或cv.Rosalina制备的饮料中的水平相比,本发明的饮料中9，12, 13-THA的水平最多为50%，优选最多为40%，更优选最多为30%。还优选与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制备的饮料中的水平相比，本发明的饮料中9，10, 13-THA的水平优选最多为70%，优选最多为60%，如最多50%，例如最多40%。可通过使用双无效LOX-无效MMT大麦制备此类饮料。

[0266] 在本发明的一个实施方案中，由双无效LOX-无效MMT大麦制备的饮料具有改良的泡沫性质。当所述饮料是啤酒时，这具有特别重大的意义。因此，本发明的目的是提供具有优异泡沫性质的饮料，如啤酒。优选地，与以相同方式由野生型大麦，优选cv.Quench制备的饮料相比，本发明的饮料在60到80分钟内，优选80分钟内产生的泡沫多至少1.5倍，优选至少2倍，还更优选至少3倍。所述泡沫的产生按下文实施例8中所述进行测定。

[0267] 植物产品

[0268] 本发明的目的是提供植物产品，优选大麦植物产品，其特征在于具有低水平的一种或多种异味物。特别地，本发明的目的是提供植物产品，优选大麦植物产品，其具有低水平的T2N、DMS及其相应的前体。如本发明所述，可由双无效LOX-无效MMT大麦有利地制备此类植物产品。所述植物产品可以是麦芽，优选上文“制麦”部分中描述的任何麦芽。所述产品可以是麦芽汁，优选上文“麦芽汁”部分中描述的任何麦芽汁；其还可以是饮料，优选上文“饮料”部分中描述的任何饮料。然而，所述植物产品也可以是由双无效LOX-无效MMT大麦植株或其部分制备的其它植物产品，其特征在于低水平的T2N、T2N潜能、DMS和DMSP。[0269]因此，本发明涉及植物产品，所述植物产品可以是包含下文所述的大麦植株或其部分的组合物，或者是由所述大麦植株或其部分制备的组合物，如由所述大麦植株或其部分制备的植物产品。由于所述大麦植株缺乏L0X-1、L0X-2和MMT活性，所述组合物通常包含非常低水平的异味物及其前体分子，特别是T2N、T2N潜能、DMS和DMSP。本文描述了包含具有导致功能性LOX-1完全丧失的第一突变、导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变和导致功能性MMT完全丧失的第三突变的大麦植株或由其制备的有用植物产品的实例。[0270] 与以相同方式由野生型大麦植物,优选cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制备的类似植物产品相比，优选所述植物产品包含以下一种或多种，优选以下至少两种，甚至更优选以下全部:

[0271] (i)少于60%，甚至更优选少于50%，还更优选少于40%，如少于30%，优选少于20%，更优选少于10%的游离T2N ；

[0272] (ii)少于60%，甚至更优选少于50%，还更优选少于40%，如少于30%，优选少于25%的T2N潜能；

[0273] (iii)少于30%，优选少于20%，更优选少于15%，甚至更优选少于10%的DMS ；

[0274] (iv)少于30%，优选少于20%，更优选少于15%，甚至更优选少于10%，如少于5%，例如少于2%的SMM ；

[0275] (V)少于30%，优选少于20%，更优选少于15%，甚至更优选少于10%的DMSP。

[0276] 本发明一方面涉及具有导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变、导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变和导致功能性MMT完全丧失的第三突变的大麦粒。本发明还涉及包含所述麦粒的组合物和由所述麦粒制备的组合物，以及由所述麦粒制备的植物产品。

[0277] 在其它方面，本发明涉及植物产品，其可以是包含双无效LOX-无效MMT大麦植物或其部分的食物组合物、饲料组合物以及香料组合物(fragrance raw materialcomposition)。食物组合物可以是,例如但不限于发芽或未发芽的大麦粒、碾磨的大麦、大麦粗粉、面包、粥、包含大麦的谷类混合物、保健品如包含大麦的饮料、大麦糖浆，以及薄片状、碾碎的、微粉化的或挤出的大麦组合物。饲料组合物包括例如，包含大麦粒和/或粗粉的组合物。饲料组合物可以是例如醪液。下文将对香料组合物进行描述。

[0278] 本发明还涉及本发明多种植物产品的混合物。例如，本发明一方面涉及通过以下物质的混合物制备的组合物:

[0279] (i)包含大麦植株(植物)或其部分的组合物，其中所述大麦植株(植物)或其部分包含导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变、导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变和导致功能性MMT完全丧失的第三突变；和

[0280] (ii)由双无效LOX-无效MMT麦粒制备的麦芽组合物。

[0281] 可获得多种方法用于确定大麦植物(植物)或植物产品是否分别由L0X-l、L0X-2和MMT基因携带引起功能性L0X-1完全丧失、功能性L0X-2完全丧失和功能性MMT完全丧失的突变的大麦植株制备。植物产品通常会包含至少一些来自用于生产该植物产品的植物的基因组DNA。因此，麦芽将包含大量的基因组DNA，但即便是大麦或麦芽提取物(如麦芽汁)也可以包含来自所述大麦或麦芽的基因组DNA或其片段。同样,基于大麦的饮料(如啤酒)也可包含来自所述植物的基因组DNA或其片段。通过分析植物产品中的DNA，可以确定用于制备植物产品的植物是否携带引起功能性L0X-1完全丧失、功能性L0X-2完全丧失和功能性MMT完全丧失的L0X-1、L0X-2和MMT基因突变。所述突变可以是，例如在下文“功能性LOX的丧失”部分中描述的L0X-1和L0X-2基因的任何突变。MMT基因中的所述突变可以是例如在下文“功能性MMT的丧失”部分中描述的MMT基因的任何突变。可以通过任何有用的方法，如通过测序或者通过基于扩增的方法(包括基于PCR的方法)分析所述基因组DNA。如果认为LOX-1基因和/或L0X-2基因和/或MMT基因具有特定突变，则可以采用多态性分析，例如SNP分析。对于确定L0X-1基因和/或L0X-2基因中的突变，在国际专利申请PCT/DK2009/050355实施例10中描述了有用的SNP分析的非限制性实例。对于确定MMT基因中的突变，国际专利申请PCT/DK2009/050315在实施例13和17中描述了有用的SNP分析的非限制性实例。本领域技术人员能够对这些实施例中描述的特定SNP分析进行适应性改进以用于其它突变或者其它起始材料。

[0282] 如果上述植物产品仅由双无效LOX无效-MMT的大麦植株制备，则大麦L0X_lmRNA、L0X-2mRNA和MMT mRNA和/或大麦L0X-1蛋白、L0X-2蛋白和MMT蛋白的存在与否也可以作为表明所述植物产品是否由双无效LOX-无效MMT大麦植物制备的指标。可以利用Western印迹分析，或者其它蛋白质分析，或者 利用RT-PCR,或者利用Northern印迹分析,或者利用其它mRNA分析完成植物产品的检测。当所述植物产品为麦芽时，此类分析特别有用。

[0283] 大麦植物(植株)

[0284] 本发明涉及基于谷类的饮料。谷类可以选自例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻、高粱、小米、黑小麦、荞麦、fonio和quinona。更优选地,所述谷类选自大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米和稻，更优选地所述谷类是大麦。

[0285] 因此，本发明优选涉及基于大麦的饮料和用于制备本发明饮料的大麦植植株。

[0286] 大麦是一类植物。“野生大麦”(Hordeum vulgare ssp.Spontaneum)被认为是当今大麦栽培形式的祖先。认为大麦从野生态至栽培态的转变与多个基因座的等位基因频率的重要变化同时发生。农场主积极选择稀少的等位基因和新突变事件，并很快在称作“大麦当地品种”的驯化植物群体中确立新特征。与野生大麦相比，这些大麦在遗传上与现代栽培品种更密切相关。直至十九世纪晚期，大麦当地品种才作为近交系和杂种分离子的高度异源混合物出现，其包括由较早世代的随机杂交而来的少数植株。在现代农业中，大多数当地品种已经被纯系栽培品种取代。剩余当地品种的特征在于中等水平或高水平的遗传多样性。最初，“现代大麦”栽培品种代表了自当地品种的选择。后来，这些栽培品种来源于确定的纯系，例如不同地理来源的纯系之间连续多轮的杂交。最后，导致在许多，也可能是所有现代农作物的遗传基础显著缩小。与当地品种相比，现代大麦栽培品种有多个改良的性质(Nevo, 1992; von Bothmer等人,1992)，例如但不限于以下以下一个或多个:(i)隐藏和裸露的麦粒；Qi)种子休眠；(iii)抗病性；Qv)环境耐受性(例如对干旱或土壤pH的耐受性)；(v)赖氨酸和其它氨基酸的量；(vi)蛋白含量；(vii)氮含量；(viii)碳水化合物组成；Qx)大麦醇溶蛋白(hordein)的含量和组成；(x) (1-3, 1_4)-β -葡聚糖和阿拉伯糖基木聚糖的含量；(xi)产率；(xii)麦杆硬度；和(xiii)株高。

[0287] 在本发明中，术语“大麦植物(植株)”包括任何大麦植物(植株)，如大麦当地品种或现代大麦栽培品种。因此，本发明涉及包含导致功能性L0X-1完全丧失的第一突变、导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变和导致功能性MMT完全丧失的第三突变的任何大麦植株。该大麦植株的实例描述于下文实施例中并称作“三无效”或“三无效大麦”。

[0288] 然而，优选用于本发明的大麦植物是现代大麦栽培品种或纯系。待根据本发明使用的大麦栽培品种可以选自例如Sebastian、Quench、Celeste、Lux、Prestige、Saloon、Neruda、Harrington、Klages、Manley、Schooner、Stirling、Clipper、Franklin、Alexis、Blenheim、Ariel、Lenka、MaresiΛ Steff1、GimpeK CheriΛ Krona、CamargueΛ Chariot、Derkado、Prisma、Union、Beka、Kym、Asahi5、K0U AΛSwan Hals、Kanto Nakate Gold、HakataN0.2、Kirin - choku N0.1、Kanto late Variety Gold、Fuji Nijo、New Golden、SatukioNijo、Seijo N0.17、Akagi Nijo、Azuma Golden、Amagi Nijpo、Nishino Gold、Misatogolden、Haruna Ni jo、Scarlett、Rosalina 和 Jersey，优选选自 Haruna Ni jo、Sebastian、Quench、Celeste、Lux、Prestige、Saloon、Neruda 和 Power，优选选自 Harrington、Klages、Manley、Schooner、Stirling、Clipper、Frankl in、Alexis、Blenheim、Ariel、Lenka、Mares1、Steff1、GimpeK CheriΛ Krona、CamargueΛ Chariot、DerkadoΛ Prisma、Union、Beka、KymΛAsahi5、KOUAΛ Swan Hals、Kanto Nakate Gold、Hakata N0.2、Kirin-choku N0.1、Kantolate Variety Gold、FujiNijo、New Golden、Satukio Nijo、Seijo N0.17、Akagi Nijo、Azuma Golden、Amagi Nijpo、Nishino Gold、Misato golden、Haruna Ni jo、Scarlett 和Jersey,优选选自 Haruna Nijo、Sebastian、Tangent、Lux、Prestige、Saloon、Neruda、Power λ Quench、NFC Tipple、Barke Λ Class 和 Vintage。

[0289] 因此，在本发明的一个实施方案中，所述大麦植物是包含导致功能性LOX-1完全丧失的第一突变、导致功能性L0X-2完全丧失的第二突变和导致功能性MMT完全丧失的第三突变的现代大麦栽培品种(优选选自上文列出的大麦栽培品种的栽培品种)。因此，在该实施方案中，优选所述大麦植物不是大麦当地品种。

[0290] 所述大麦植株可以是任何适合的形式。例如，本发明的大麦植株可以是能活的大麦植株、干燥的植株、均质化的植株或者经碾磨的大麦粒。所述植株可以是成熟的植株、胚、萌芽的麦粒、发芽的麦粒或经碾磨的发芽麦粒或经碾磨的麦粒等。

[0291] 大麦植株的部分可以是所述植株的任何合适的部分，例如麦粒、胚、叶、茎、根、花或其小部分(fraction)。所述小部分可以是,例如麦粒、胚、叶、莖、根或花的部分。大麦植株的部分还可以是匀浆的小部分或者经碾磨的大麦植物或麦粒的小部分。

[0292] 在本发明的一个实施方案中`，大麦植株的部分可以是所述大麦植株的细胞，如可以在体外组织培养物中繁殖的活细胞。然而，在另一实施方案中，大麦植株的部分可以是不能成熟为完整大麦植物的活细胞，即不是生殖物质的细胞。

[0293] 功能性LOX的丧失

[0294] 本发明涉及具有第一突变、第二突变和第三突变的大麦植株或其部分或其植株产品，其中所述第一突变导致功能性LOX-1的完全丧失，并且所述第二突变导致功能性L0X-2的完全丧失。如在下文“功能性MMT丧失”部分中更详细的描述，所述第三突变导致功能性MMT的完全丧失。

[0295] 功能性LOX-1的完全丧失和功能性L0X-2的完全丧失可独立地基于不同的机制。例如，LOX-1和L0X-2活性中的一个或两个的功能完全丧失可以由大麦植株中的异常蛋白质，即异常LOX-1和/或L0X-2蛋白引起，如由没有可检测到的9-HP0DE形成活性的突变LOX-1蛋白(其中优选按照国际专利申请PCT/DK2009/050355实施例4中描述来测定9-HP0DE)引起，和/或由没有可检测到的13-HP0DE形成活性的突变L0X-2蛋白质(其中优选按照国际专利申请PCT/DK2009/050355实施例4中描述来测定13-HP0DE)弓丨起。

[0296] 功能性LOX-1和/或L0X-2的完全丧失可以由L0X-1和/或L0X-2蛋白的缺乏引起。明显地，LOX-1蛋白质的缺乏将导致功能性LOX-1丧失，而L0X-2蛋白质的缺乏将导致功能性L0X-2完全丧失。因此，所述大麦植株可优选不包含，或仅包含非常少的LOX-1和/或L0X-2蛋白，更优选没有可检测到的L0X-1和/或L0X-2蛋白。L0X-1和/或L0X-2蛋白可以由本领域技术人员已知的任何合适的方式进行检测。然而，优选通过其中利用特异性的L0X-1和L0X-2抗体(例如L0X-1和L0X-2的多克隆抗体)检测L0X-1蛋白的技术对所述蛋白进行检测。所述技术可以是，例如Western印迹或ELISA。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。然而，优选所述抗体为分别识别L0X-1和L0X-2蛋白中的数个不同表位的多克隆抗体。还可以间接检测L0X-1和/或L0X-2蛋白质，例如通过测定L0X-1活性的方法，或者通过测定L0X-2活性的方法。在本发明的一个优选实施方案中，利用国际专利申请TO 2005/087934的实施例4中列出的方法检测L0X-1蛋白。可以利用与大麦L0X-2结合的抗体以类似的方式检测L0X-2蛋白。

[0297] L0X-1和L0X-2活性中的一个或两个的功能完全丧失还可以是没有或几乎没有表达L0X-1转录本和/或L0X-2转录本的结果，优选是没有表达L0X-1转录本和/或L0X-2转录本的结果。本领域技术人员理解L0X-1和/或L0X-2转录本的缺失也将分别导致L0X-1或L0X-2翻译蛋白的缺失。或者，功能性L0X-1和功能性L0X-2的完全丧失也可以是表达异常的L0X-1转录本和/或异常的L0X-2转录本的结果。异常的L0X-1和/或L0X-2转录本可能是由转录本的异常剪接导致的，例如由于剪接位点的突变。因此，本发明的大麦植株可以具有位于剪接位点中的突变，例如位于5’剪接位点或3’剪接位点中，例如在内含子最5’端的一个或两个核苷酸中，或者在内含子最3’端的核苷酸之一中。L0X-1转录本具有异常剪接的突变的实例为W02005/087934中描述的突变体A618。编码L0X-1或L0X-2的转录本的表达可以通过，例如Northern印迹或RT-PCR实验检测。

[0298] 突变已经引起了 本发明的大麦植株的功能性L0X-1和L0X-2酶的完全丧失。因此，本发明的大麦植株通常在L0X-1基因中携带突变。所述突变可以在调节区内，例如在启动子或内含子内，或者所述突变可以在编码区内。所述突变也可以是L0X-1基因或其部分的缺失，如完整编码区的缺失。类似地，本发明的大麦植株通常在L0X-2基因中携带突变。所述突变可以在调节区内，例如在启动子或内含子内，或者所述突变可以在编码区内。所述突变也可以是L0X-2基因或其部分的缺失，如完整编码区的缺失。因此，还可以通过鉴定L0X-1编码基因中或者L0X-2编码基因中的突变而检测功能性L0X-1和/或L0X-2酶完全丧失的原因。L0X-1和L0X-2编码基因中的突变可以通过，例如对所述基因进行测序而检测。优选地，在鉴定所述突变后，通过测定L0X-1和/或L0X-2活性而验证功能的完全丧失。

[0299]术语 “L0X-1 蛋白质”是指涵盖 SEQ ID NO: 3 (对应于 TO2005/087934 的 SEQ IDNO:3)或 SEQ ID N0:7(对应于W02005/087934 的SEQ ID NO:7)所示的大麦全长 L0X-1 蛋白或其功能同源物。L0X-1的活性位点位于所述酶的C末端部分。特别地，认为跨越氨基酸残基520-862的区域或其部分(优选氨基酸号520-862的整个区)与L0X-1活性有关。因此，在一个实施方案中，L0X-1无效大麦优选包含编码缺失L0X-1氨基酸520-862中的部分或全部氨基酸的突变形式L0X-1的基因。所述突变L0X-1还可以缺失存在于野生型L0X-1中的其它氨基酸残基。

[0300] 因此，本发明的双无效LOX大麦可以包含非功能性的截短形式的L0X-1，例如N-末端或C-末端被截短的形式。优选地，所述截短形式包含SEQ ID NO: 3 (对应于W02005/087934的SEQ ID NO: 3)所示L0X-1的不超过800个，更优选不超过750个，甚至更优选不超过700个，还更优选不超过690个，甚至更优选不超过680个，还更优选不超过670个LOX-1的连续氨基酸，例如不超过665个，例如不超过650个，如不超过600个，例如不超过550个，如不超过500个，例如不超过450个，如不超过425个，例如不超过399个连续氨基酸。优选地，所述截短形式仅包含L0X-1的N末端片段，优选SEQ ID NO: 3 (对应于W02005/087934的SEQ ID NO: 3)的N-末端的最多800个，更优选最多750个，甚至更优选最多700个，还更优选最多690个，甚至更优选最多680个，还更优选最多670个，甚至更优选最多665个氨基酸，如包含SEQ ID NO: 3 (对应于W02005/087934的SEQ ID NO: 3)的N-末端的不超过665个，例如不超过650个，如不超过600个，例如最多550个，如最多500个，例如最多450个，如最多425，例如最多399个氨基酸。除了 L0X-1的片段，所述截短形式还可任选地包含野生型L0X-1中不存在的额外C末端序列。如果所述截短形式由异常剪接引起，这可能尤其如此。优选地，所述额外的C末端序列由最多50个，更优选最多30个，甚至更优选最多10个，还更优选最多4个，或最多I个氨基酸组成。

[0301] 在一个非常优选的实施方案中，所述截短形式可以由SEQ ID N0:3(对应于W02005/087934 的 SEQ ID NO:3)的氨基酸 1-665 组成。

[0302] 在本发明的一个优选实施方案中，大麦植株包含被转录成mRNA的L0X-1编码基因，其中所述mRNA在野生型LOX-1mRNA的终止密码子的上游包含无义密码子或者终止密码子。这种无义密码子在本文中被命名为提前终止的无义密码子。优选地，所述植株的所有转录成mRNA的L0X-1编码基因都包含提前终止的无义密码子或终止密码子。所述无义密码子或终止密码子优选位于起始密码子下游的最多800个，更优选最多750个，甚至更优选最多700个，还更优选最多690个，甚至更优选最多680个，还更优选最多670个，甚至更优选最多665个密码子处。编码L0X-1的野生型基因组DNA的序列示于SEQ ID NO:1 (对应于 TO2005/087934 的 SEQ ID NO:1)或者 TO2005/087934 的 SEQ ID NO: 5。

[0303] 在一个优选的实施方案中，本发明的大麦植物包含编码L0X-1的基因，其中由所述基因转录的相应的前mRNA包含对应于W02005/087934的SEQID NO: 2的序列。

[0304] 在本发明的非常 优选的实施方案中，本发明的双无效LOX大麦植株的突变L0X-1的编码基因包含无义突变，所述突变对应于W02005/087934的SEQ ID N0:1的第3574位的G — A取代。

[0305] 术语“L0X-2蛋白质”表示涵盖本申请SEQ ID NO: 7 (对应于国际专利申请PCT/DK2009/050355的SEQ ID NO: 5)所示的大麦全长L0X-2蛋白或其功能同源物。L0X-2的活性位点位于L0X-2的C末端部分。特别地，认为跨越氨基酸残基515-717的区域或其部分与L0X-2的活性有关。根据大豆L0X-1晶体结构的检测，认为氨基酸残基515-525和707-717代表了大麦L0X-2酶的活性位点裂隙的序列延伸段。所翻译的突变L0X-2蛋白，即大麦双无效LOX突变体A689的C-末端截短形式，最多包含684个残基，并且因此缺失活性位点裂隙的第二序列延伸段，从而导致其失活。根据本发明的一个实施方案，本发明的双无效LOX大麦优选包含编码L0X-2的突变形式的基因，其中所述突变形式缺失L0X-2的氨基酸515-717中的一些或者全部氨基酸，优选缺失氨基酸707-717中的一些或全部氨基酸，甚至更优选缺失氨基酸707-717中的全部氨基酸。所述突变L0X-2还可以缺乏野生型L0X-2中存在的其它氨基酸残基。

[0306] 因此，双无效LOX大麦可包含非功能性的截短形式的L0X-2，例如N-末端或C-末端被截短的形式。优选地，所述截短形式包含本申请的SEQ IDN0:7(对应于国际专利申请PCT/DK2009/050355的SEQ ID NO: 5)的L0X-2的不超过800个，更优选不超过750个，甚至更优选不超过725，还更优选不超过700个，甚至更优选不超过690个，还更优选不超过684个连续氨基酸。优选地，所述截短形式仅包含LOX-2的N-末端片段。因此，优选所述截短形式包含本申请SEQ ID N0:7(对应于国际专利申请PCT/DK2009/050355 的SEQ ID NO:5)的N-末端的最多800个，更优选最多750个，甚至更优选最多725个，还更优选最多700个，甚至更优选最多690个，还更优选最多684个氨基酸。除了 LOX-12的片段，所述截短形式还可任选地包含野生型LOX-2中不存在的额外C末端序列。如果所述截短形式由异常剪接引起，则尤其如此。优选地，所述额外的C末端序列由最多50个，更优选最多30个，甚至更优选最多10个，还更优选最多4个,或最多I个氨基酸组成。

[0307] 在一个非常优选的实施方案中，所述截短形式可以由本申请的SEQ IDN0:7(对应于国际专利申请PCT/DK2009/050355的SEQ ID NO:5)的氨基酸1-684组成。

[0308] 在本发明的优选实施方案中，所述大麦植株包含被转录成L0X-2的mRNA的基因，其中所述mRNA在野生型L0X-2mRNA的终止密码子的上游包含无义密码子或者终止密码子。这种无义密码子在本文中被命名为提前终止的无义密码子。优选地，所述植物的转录成编码L0X-2的mRNA的所有基因都包含提前终止的无义密码子或终止密码子。所述无义密码子或终止密码子优选位于起始密码子下游的最多800个，更优选最多750个，甚至更优选最多725个，还更优选最多700个，甚至更优选最多690个，还更优选最多684个密码子处。编码L0X-2的野生型基因组DNA的序列示于SEQ ID NO: 5 (对应于国际专利申请PCT/DK2009/050355 的 SEQ ID NO:1)„

[0309] 在本发明的非常优选的实施方案中，所述双无效LOX大麦植株的突变L0X-2的编码基因包含无义突变，所述突变对应于SEQ ID N0:5(对应于国际专利申请PCT/DK2009/050355 的 SEQ ID NO:1)在第 2689 位的 G — A 取代。

[0310] 本发明的大 麦植物可以由本领域技术人员熟知的任何合适的方法制备，优选通过下文“双无效LOX-无效MMT大麦的制备”部分列出的方法之一制备。

[0311] 功能性MMT的丧失

[0312] 本发明涉及具有第一突变、第二突变和第三突变的大麦植株或其部分或其植物产品，其中所述第一突变导致功能性L0X-1的完全丧失，并且所述第二突变导致功能性L0X-2的完全丧失，两者均更详细地描述于“功能性LOX的丧失”部分中。所述第三突变导致功能性MMT的完全丧失。

[0313] 功能性MMT的完全丧失可基于不同的机制。例如，功能性MMT的完全丧失可以由所述植株中的异常蛋白质，即异常MMT酶，如没有可检测到的活性的突变MMT蛋白引起。例如，突变体的MMT蛋白可以是截短的蛋白。MMT活性的丧失可类似地基于不同的机制，例如由异常MMT蛋白引起。

[0314] 优选地，突变MMT蛋白的活性通过其催化甲基基团从SAM转移到Met上由此形成SMM的能力来测定。该测定可按照例如国际专利申请PCT/DK2009/050315的实施例4中的描述进行。优选地，通过测定相应的分离大麦cDNA的翻译序列来获得突变MMT的氨基酸序列。该过程可基本上按照国际专利申请PCT/DK2009/050315的实施例8中的描述进行。或者，按照国际专利申请PCT/DK2009/050315的实例11和实施例12中的描述，通过在细菌细胞培养物中的异源表达，随后验证重组蛋白质作为MMT酶是失活的，来获得本发明的大麦植株的突变MMT。

[0315] 可通过缺失MMT蛋白实现功能性MMT的完全丧失。MMT蛋白的缺失会导致MMT功能的丧失。因此，大麦植株可不包含或仅包含很少的，优选没有可检测到的MMT蛋白。MMT蛋白的存在与否可通过本领域技术人员已知的任何合适方法检测。然而，优选通过其中通过识别MMT的特异性抗体检测MMT蛋白的技术来分析蛋白质。所述技术例如可以是蛋白印迹或酶联免疫吸附测定，并且所述特异性抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。然而，优选所述抗体是识别MMT蛋白内若干不同表位的多克隆抗体。还可以通过例如MMT活性测定法，间接检测MMT蛋白。因此，在本发明的一个优选实施方案中，当在植株中没有可检测的MMT蛋白时，认为所述大麦植株在编码MMT的基因中携带了突变，由此引起MMT活性的完全丧失。特别地，当通过蛋白印迹分析在所述大麦植株，优选在所述大麦植株的麦粒中没有可检测到的具有约120kDa，±10%质量的MMT蛋白时，即是如此。

[0316] 功能性MMT的完全丧失也可以是没有，或非常少，优选没有MMTmRNA转录的结果。本领域技术人员理解，MMT转录本的缺失也会导致MMT蛋白的缺失。

[0317] 然而，优选地，功能性MMT的完全丧失是异常MMT转录本表达的结果。所述转录本可优选由初级转录本的异常剪接事件(例如由于剪接位点的突变)引起的。例如可通过Northern印迹或通过RT-PCR方法检测编码MMT的转录本的表达。

[0318] 本发明大麦植株中功能性MMT的完全丧失是由一个或多个突变引起的。因此，本发明的大麦植物通常在MMT基因中携带至少一个突变。所述突变可以在调节区内，例如在启动子或内含子内，或所述突变在蛋白质编码区内。所述突变也可以是MMT基因或其部分的缺失，例如MMT基因编码区的缺失。因此，也可通过分析MMT编码基因中的突变来检测功能性MMT的丧失。例如可通过对所述基因进行测序，随后将其与野生型序列，优选SEQ IDNO:9所示的cv.Prestige的野生型序列(对应于国际专利申请PCT/DK2009/050315中作为SEQ ID N0:3给出的序列)或cv.Sebastian的野生型序列(SEQ ID NO: 11，其对应于国际专利申请PCT/DK2009/050315的SEQID NO: 16)进行比较来检测MMT编码基因中的突变。优选地，鉴定完突变后，按照例如国际专利申请PCT/DK2009/050315的实例2或实施例4中描述，通过检测MMT活性来验证功能的丧失。

[0319] 术语MMT蛋白表示涵盖SEQ ID NO: 13 (对应于国际专利申请PCT/DK2009/050315的SEQ ID NO:6)所示的大麦全长MMT蛋白或其功能同源物。在该上下文中，功能同源物是与SEQ ID NO: 13所示的大麦MMT蛋白具有相同水平MMT活性，±25%的MMT蛋白质，其中按照国际专利申请PCT/DK2009/050315的实例2或实施例4中描述来测定MMT活性。[0320] 携带引起MMT活性完全丧失的第三突变的大麦植株可包含MMT的无功能截短形式，如N末端或C末端截短形式。大麦植株可包含多于一个MMT截短形式，如2个,或例如3个，或如多于3个不同的MMT截短形式，其可由异常剪接的转录本引起。所述截短形式仅包含MMT的N末端片段。除了野生型MMT的N末端片段外，所述MMT截短形式可包含野生型MMT中未发现的额外的C末端序列。所述额外的C末端序列可例如翻译成内含子序列，如由于异常剪接而包含在突变体mRNA中的那些内含子序列。优选地，所述截短MMT形式包含SEQ ID N0:13(对应于国际专利申请PCT/DK2009/050315 的SEQ ID NO:6)的N末端的最多500个，更优选最多450个，甚至更优选最多400个，还更优选最多350个，甚至更优选最多320个，还更优选最多311个，或最多288个氨基酸残基。当所述大麦植株MMT活性完全丧失时，尤其如此。然而，所述MMT也可包含SEQ ID NO: 13 (对应于国际专利申请PCT/DK2009/050315的SEQ ID NO: 6)的N末端的更少个，如不多于300个，例如不多于250个，如不多于200个，例如最多150个，例如不多于147个或不多于133个氨基酸残基。

[0321] 在一个非常优选的实施方案中，截短形式的MMT可由SEQ ID N0:13(对应于国际专利申请PCT/DK2009/050315的SEQ ID NO:6)的氨基酸1-311或氨基酸1-288和野生型MMT中不存在的任选地额外C末端序列组成。优选地，所述额外的C末端序列由最多50个，更优选最多30个，甚至更优选最多10个，还更优选最多4个，或最多I个氨基酸组成。在非常优选的实施方案中，MMT截短形式可以是国际专利申请PCT/DK2009/050315的SEQ IDN0:11，或国际专利申请PCT/DK2009/050315的SEQ ID NO: 13，或国际专利申请PCT/DK2009/050315 的 SEQ ID N0:15 的蛋白质。国际专利申请 PCT/DK2009/050315 的 SEQ IDNO: 11或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15的蛋白均不代表功能性MMT酶。

[0322] 在另一非常优选的实施方案中，截短形式的MMT可由SEQ ID N0:14(对应于国际专利申请PCT/DK2009/050315的SEQ ID NO: 18)的氨基酸1-147或氨基酸1-133和野生型MMT中不存在的任选地额外C末端序列组成。优选地，所述额外的C末端序列由最多50个，更优选最多40个，甚至更优选最多39个，或最多33个，或最多30个氨基酸组成。在非常优选的实施方案中，MMT的截短形式可以是SEQ ID NO: 15,SEQ ID N0:16或SEQ ID N0:17(分别对应于国际专利申请 PCT/DK2009/050315 的 SEQ ID N0:22 或 SEQ ID N0:24 或 SEQ IDNO: 26)的蛋白质。SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17 (分别对应于国际专利申请 PCT/DK2009/050315 的 SEQ ID N0:22 或 SEQ ID N0:24 或 SEQ ID NO:26)的蛋白质均不是功能性MMT酶。

[0323] MMT的上述截短形式可以例如存在于在MMT基因中携带突变的大麦植株中，其中所述突变引入提前成熟的终止密码子，其形成编码MMT上述截短形式的基因。

[0324] 在本发明的优选实施方案中，大麦植株包含被转录成mRNA的MMT基因，所述mRNA包含一些，但不是全部剪接在一起且没有干扰的野生型MMT基因(大麦野生型MMT基因的内含子-外显子结构示于国际专利申请PCT/DK2009/050315的图9中)。在本发明的一个实施方案中，因此优选本发明大麦植株的MMT mRNA包含剪接在一起而没有干扰的最多1、2、3、4和5号外显子，或例如剪接在一起而没有干扰的最多I号和2号外显子。除了所述剪接在一起的外显子外，本发明大麦植株的MMT mRNA还可包含衍生自野生型内含子和/或外显子的额外的3’末端序列，其中内含子将外显子序列隔开。在通过RT-PCR确定并因此以bp表示片段长度时，本发明大麦植株的异常MMT mRNA的优选实例例示于国际专利申请PCT/DK2009/050315的图12和图16中。更优选地，本发明大麦植株的异常mRNA是示于国际专利申请PCT/DK2009/050315的图12中的那些mRNA (其在5’末端还包含I号和2号外显子)，或示于国际专利申请PCT/DK2009/050315的图16中的mRNA(其在5’末端还包含I号外显子)。

[0325] 在本发明非常优选的实施方案中，在MMT基因中携带引起功能性MMT完全丧失的第三突变的大麦植株在MMT基因内的剪接位点上包含突变，其导致异常剪接的mRNA。更优选地，所述突变定位于MMT基因的内含子中，甚至更优选定位于内含子的5’剪接位点上，如I号内含子(分隔I号和2号外显子的内含子)的5’剪接位点上，如2号内含子(分隔2号和3号外显子的内含子)的5’剪接位点上，如3号内含子(分隔3号和4号外显子的内含子)的5’剪接位点上，如4号内含子(分隔4号和5号外显子的内含子)的5’剪接位点上，如5号内含子(分隔5号和6号外显子的内含子)的5’剪接位点上，如6号内含子(分隔6号和7号外显子的内含子)的5’剪接位点上,最优选定位于2号内含子或5号内含子的5’剪接位点上。

[0326] 优选所述突变是上述内含子5’末端碱基的G —A突变。因此，非常优选的突变是2号内含子末端5’碱基的G —A突变，或5号内含子最5’碱基的G —A突变。

[0327] 本发明的大麦植株可通过本领域技术人员已知的任何合适方法，优选通过下文“制备双无效LOX-无效MMT大麦”部分中列出的方法制备。

[0328] 制备双无效LOX-无效MMT大麦

[0329] 本发明的大麦植株可通过本领域技术人员已知的任何合适方法制备。优选地，本发明的大麦植株通过包括以下步骤的方法制备:诱变大麦植株或其部分(例如大麦粒)，然后筛选和选出特征在于功能性L0X-1完全丧失、功能性L0X-2完全丧失和/或功能性MMT完全丧失的大麦植株。

[0330] 本发明的大麦植株包含至少3个突变。因此，可通过以下来制备所述植株:制备仅包含一个所述突变的单独大麦植株，然后杂交所述大麦植株或通过向大麦植株中连续引入所述突变或通过这些方法的组合来获得具有所有3个突变的大麦植株。

[0331] 因此，本发明的大麦植物可通过以下来制备:诱变大麦植株或其部分(例如大麦粒)，然后筛选和选出特征在于功能性L0X-1完全丧失的大麦植株，并诱变另一大麦植株或其部分(例如大麦粒)，然后筛选和选出特征在于功能性L0X-2完全丧失的大麦植株，并诱变又一大麦植株或其部分(例如大麦粒)，然后筛选和选出特征在于功能性MMT完全丧失的大麦植株。所选出的大麦植株可最后进行几轮杂交，以获得携带所有三个突变的大麦植株。

[0332] 或者，本发明的大麦植株可以通过以下来制备:诱变大麦植株或其部分(例如大麦粒)，然后筛选和选出特征在于功能性XX完全丧失的大麦植株。可任选地繁殖所选出的大麦植株并且然后可诱变这些大麦植株或其部分(例如大麦粒)，然后筛选并选出特征在于功能性YY完全丧失的大麦植株。可任选地繁殖所选出的大麦植株或其部分，然后:

[0333] (i)可诱变这些大麦植株或其部分(例如大麦粒)，然后筛选并选出特征在于功能性ZZ完全丧失的大麦植株；或

[0334] (ii)这些大麦植株可与特征在于功能性ZZ完全丧失的大麦植株杂交。

[0335] 在上述杂交中，XX、YY和ZZ各自表示L0X-1、L0X-2或MMT，其中XX不同于YY，YY不同于ZZ。

[0336] 在一个优选实施方案中，可通过以下方法制备所述大麦植株，所述方法包括诱变大麦植株或其部分(例如大麦粒)，然后筛选并选出还携带引起功能性L0X-2完全丧失的突变的大麦植株(即无效L0X-1-无效L0X-2或双无效LOX植株)，其中所述大麦植株已经携带了引起功能性L0X-1酶完全丧失的突变。该方法还涉及诱变其它大麦植株或其部分，筛选并选出功能性MMT完全丧失的大麦植株，最终将这些大麦植株与无效L0X-1-无效L0X-2大麦植株进行杂交。

[0337] 合适地，无效L0X-1大麦植株为，例 如描述于国际专利申请W02005/087934中。[0338] 优选筛选方法利用萌芽胚作为鉴定特征在于功能性L0X-2完全丧失的大麦植株的初始材料。有趣的是，根据多达21，000个成熟胚的筛选(其不揭示单个无效L0X-2大麦突变体)，本发明人已经发现较不优选将成熟胚作为筛选L0X-2活性的初始材料。

[0339] 本发明的目的是提供用于制备双无效LOX-无效MMT大麦植株的方法，所述方法包括以下步骤:(i)制备双无效LOX大麦植株；和(ii)制备无效MMT大麦植株；(iii)将所述双无效LOX大麦植株与所述无效MMT大麦植株杂交；(iv)选出双无效LOX-无效MMT大麦植株。

[0340] 优选通过包括以下步骤的方法制备所述双无效LOX大麦植株:

[0341] (i)提供L0X-1活性功能完全丧失，例如功能性L0X-1酶完全丧失的大麦植株或其部分；和

[0342] (ii)诱变所述大麦植株,和/或来自所述大麦植株的大麦细胞,和/或大麦组织，和/或大麦粒，和/或大麦胚，由此获得MO代大麦；和

[0343] (iii)培育所述诱变后的大麦植株、麦粒和/或胚至少2代，由此获得Mx代的大麦植株，其中X为≥2的整数；和

[0344] (iv)获得所述Mx大麦植株的胚；和

[0345] (V)使所述胚萌芽；和

[0346] (vi)测定所述萌芽胚或其部分中的L0X-1和L0X-2活性；和

[0347] (vii)选 出所述萌芽胚中L0X-1活性和L0X-2活性完全丧失的植株；和

[0348] (viii)分析L0X-1基因和L0X-2基因中的突变；和

[0349] (ix)选出在L0X-1基因和L0X-2基因中携带突变的植株，即双无效LOX植株；

[0350] 由此获得在L0X-1和L0X-2基因中携带引起功能性L0X-1和功能性L0X-2完全丧失的突变的大麦植株。

[0351] 优选使用包括以下步骤的方法制备所述无效MMT大麦植株:

[0352] (i)诱变大麦植株,和/或大麦细胞,和/或大麦组织,和/或大麦粒,和/或大麦胚，由此获得MO代大麦；和

[0353] (ii)繁殖(例如通过培育)所述诱变后的大麦植株、麦粒和/或胚>2代，由此获得Mx代的大麦植株，其中X为彡2的整数；和

[0354] (iii)获得所述Mx大麦植株的样品；和

[0355] (iv)测定所述样品中SMM的水平；和

[0356] (V)选出这样的植株:其中所述样品包含低于IOppb SMM，优选低于5ppb SMM，更优选没有可检测到的SMM ;和

[0357] (vi)对MMT基因的至少部分进彳丁测序；和

[0358] (vii)选出在MMT基因中携带突变的植株。

[0359] L0X-1活性完全丧失的上述大麦植株可以是例如W02005/087934中描述的L0X-1活性完全丧失的任何大麦植株，优选突变体D112或其子代植株。

[0360] 上述方法中的诱变步骤可以包括诱变选自以下的活材料:大麦植株、大麦细胞、大麦组织、大麦粒和大麦胚，优选选自大麦植株、大麦粒和大麦胚，更优选大麦粒。

[0361] 诱变可以通过任何合适的方法而进行。在一个实施方案中，通过将诱变剂和大麦植株或其部分一起温育，例如和来自大麦的大麦粒或单独细胞一起温育而进行诱变。所述诱变剂是本领域技术人员已知的，包括例如但不限于叠氮化钠(NaN3)、甲磺酸乙酯(EMS)、叠氮丙三醇(AG，3-叠氮-1，2-丙烷-二醇)、甲基亚硝基脲(MNU)和马来酰肼(MH)。

[0362] 在另一个实施方案中，通过照射，例如通过紫外线照射大麦植株或其部分，例如麦粒来进行诱变。在本发明的优选实施方案中，根据下文“化学诱变”部分中列出的任何方法进行诱变。合适的诱变方案的非限制性实例公开于国际专利申请PCT/DK2009/050355的实施例2中。

[0363] 优选进行诱变的方式使得在筛选M3代的大麦时，期望突变体的预期频率为每10, 000个谷粒至少0.5个，例如0.5-5个，例如0.9-2.3个。在优选的实施方案中，对大麦粒进行诱变。用于诱变物的麦粒命名为MO代(另见图8)。

[0364] 可以在由萌芽大麦胚组成的样品中，优选在萌芽大麦胚的液体提取物中测定LOX活性。所述样品，例如所述提取物可以由所述萌芽胚的任何合适的部分制备。通常，在制备大麦样品的提取物和测定L0X-2活性前，必须利用任何合适的方法对所述样品进行匀质。特别地，优选蛋白提取物由萌芽胚或其部分制备，并且利用所述提取物测定LOX活性。可以利用，例如机械力，例如通过振荡或搅拌，如通过在存在珠(例如玻璃珠或沙珠)的情况下振荡而进行匀质。

[0365] 在优选的实施方案中，所述萌芽胚为Mx代的，其中X是> 2整数，优选X是2-10的整数，更优选是3-8的整数。在非常优选的实施方案中，在M3代的萌芽胚中或者在源自此胚的样品中测定LOX活性。在该实施方案中，优选培育MO代的诱变大麦粒以获得大麦植株，将所述大麦植株进行杂交以得到Ml代的麦粒。重复该过程直至获得M3代的麦粒(另见图8)。

[0366] LOX活性的测定可以利用任何合适的试验进行，优选使用下文所列的方法之一而进行。特别地，优选所述试验提供关于通过L0X-1和L0X-2的双加氧作用将亚油酸转化成9-HP0DE和13-HP0DE的数据 。因此，所述试验通常包括以下步骤:

[0367] (i)提供由萌芽大麦胚或其部分制备的蛋白提取物；和

[0368] (ii)提供亚油酸；和

[0369] (iii)将所述蛋白提取物和所述亚油酸一起温育；并

[0370] (iv)测定亚油酸至9-HP0DE和13-HP0DE的双加氧作用。

[0371] 所述方法的步骤(iv)优选包括测定所述萌芽胚中，优选由所述萌芽胚制备的蛋白提取物中的9-HP0DE和13-HP0DE的水平。所述步骤可以包括直接或间接测定9-HP0DE和13-HP0DE的水平。可以测定所有HPODE的总水平，在此情况下优选为了验证而进行9-HP0DE和13-HP0DE的专门测定。一个方法可以是，例如其中使来自萌芽胚的蛋白提取物与作为底物的亚油酸一起温育用以形成9-HP0DE和13-HP0DE的方法。然后可以通过多种方法检测所述HP0DE。一个方法可以包括产生可检测的化合物，例如染料。例如,所述方法可以是在血红素存在下由所形成的HPODE催化的3- 二甲基氨基苯甲酸和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙的氧化偶联，以形成可以利用分光光度计在A595测定的吲达胺染料。此方法的实例描述于国际专利申请PCT/DK2009/050355的实施例1和2中。利用该试验，认为小于0.2A595单位的吸光读数表示不存在L0X-1和不存在L0X-2活性。然而，用于测定L0X-1和L0X-2活性的更精确的方法是使来自萌芽胚的蛋白提取物和亚油酸一起温育，然后测定9-HP0DE和13-HP0DE的含量。9-HP0DE和13-HP0DE的含量可以通过，例如利用基于HPLC的分析而测定。

[0372] 亚油酸至9-HP0DE和13-HP0DE的双加氧作用可以直接或间接测定。本发明可以使用任何合适的测定方法。在本发明的一个实施方案中，检测到了亚油酸氢过氧化物。例如，可以通过例如色谱法，如国际专利申请PCT/DK2009/050355实施例4描述的HPLC直接测定 9-HP0DE 和 13-HP0DE。

[0373] 本发明公开了用于为测定LOX活性而从萌芽胚提取蛋白质的方法的某些方面是非常重要。因此，优选利用酸性缓冲液，优选PH为2到6的范围，更优选pH为3到5的范围，甚至更优选pH为3.5到5的范围，还更优选pH为4到5的范围，甚至更优选pH为4.5的酸性缓冲液提取所述蛋白质。用于提取的缓冲液优选基于有机酸，更优选乳酸缓冲液。最优选地，利用IOOmM乳酸缓冲液(pH4.5)制备蛋白提取物。

[0374] 本发明的某些实施方案公开了用于检测无效-L0X-1和无效-L0X-2植株的方法，所述方法包括9-HP0DE和13-HP0DE与染料(例如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)的反应。优选地，在加入亚油酸之后将所述染料(例如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)加入到蛋白提取物中。优选地，在使所述蛋白提取物与亚油酸接触至少I分钟，更优选至少5分钟，甚至更优选至少10分钟，例如I到 60分钟，例如5到30分钟，例如10到20分钟后加入所述染料。

[0375] 用于选出本发明的大麦植株的优选方法详述于国际专利申请PCT/DK2009/050355的实施例2中。

[0376] 所述选择方法可经调整用于基于微滴定板的实验方案或允许快速筛选许多样品的其它已知的高通量重复测定方式。优选分析至少5000株，例如至少7500株，例如至少10，000株，例如至少15，000，例如至少20，000，例如至少25，000诱变后的大麦植物的L0X-1活性和L0X-2活性。

[0377] 可以通过数个不同的方法测定L0X-1编码基因中的突变。例如，可以对L0X-1基因进行完全或部分测序，并且将其序列与SEQ ID NO:1 (对应于W02005/087934的SEQ IDNO:1)或者W02005/087934的SEQ ID NO: 5比较。如果寻找特异突变，可以采用SNP分析。本领域技术人员将能够设计可用于检测给定的特异突变的引物，例如用于检测在L0X-1的编码序列内产生提前终止密码子的突变(例如上文描述的任意提前终止密码子)的引物。如何进行SNP分析的一个实例描述在国际专利申请PCT/DK2009/050355的实施例10中，其中的引物可用于检测在L0X-1基因的第3474位核苷酸的G — A突变。

[0378] 可以通过几种不同的方法测定L0X-2编码基因中的突变。例如，可以对L0X-2基因进行完全或部分测序，并将所述序列与SEQ ID N0:5(对应于国际专利申请PCT/DK2009/050355的SEQ ID NO:1)比较。如果寻找特定突变，可以采用SNP分析。本领域技术人员将能够设计可用于检测给定的特定突变的引物，例如用于检测在L0X-2的编码序列内产生提前终止密码子的突变(例如上文描述的任意提前终止密码子)的引物。如何进行SNP分析的一个实例描述于国际专利申请PCT/DK2009/050355的实施例10中，其中的引物可用于检测在L0X-2基因的第2689位核苷酸的G — A突变。

[0379] 如上文该部分详述的双无效LOX大麦植株的制备方法中的步骤(viii)和(ix)可以在步骤(vi)和(vii)之前进行，在这种情况下，所述方法将包括顺序依次为(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(viii)、(ix)、(vi)和(vii)的步骤,这种方法也包含在本发明的范围之内。特别地，当寻找特异突变时，例如在已经鉴定的双无效LOX大麦植株的子代植株中寻找特异突变时就是这种情况。

[0380] 优选地，选出功能性MMT完全丧失的大麦植株包括从诱变的大麦植株，优选萌芽的诱变大麦植株中获得样品，甚至更优选从已经萌芽了 4天的诱变的大麦植株获得样品。优选所述样品来自胚芽鞘和/或初生叶，优选来自叶。因此，所述样品可以是例如Icm到3cm的叶组织。

[0381] 如本文所述，可根据新开发的多步骤方案提取并分析样品，所述方案包括连续使用不同溶剂和结合物质。通常，可以利用例如溶剂或溶剂混合物，优选水和/或有机溶剂提取样品。所述有机溶剂可以是例如醇，优选甲醇，或者所述有机溶剂例如可以是卤代烷，优选氯仿。在一个优选实施方案中，所述溶剂是水、甲醇和氯仿的混合物。有利地，可在例如使用振荡器或混合器混合的同时进行所述提取。可向溶剂/样品混合物中加入固体支持物，例如珠，如玻璃珠。

[0382] 在优选的实施方案中，用于测定MMT活性的上述叶样品从Mx代麦粒中获得，其中X是> 2整数，优选2到10，更优选3到8的整数。在非常优选的实施方案中，在M3代的萌芽植株中或其样品(如叶)中测定MMT的水平。在所述实施方案中，优选培育MO代的诱变大麦粒以获得大麦植株，并随后进行杂交以得到Ml代的麦粒。重复该过程直至获得M3代的麦粒(见图8)。

[0383] SMM水平的测定优选基于下文所述的新方法。有趣的是，该方法可以进行高通量筛选，使其可以鉴定特征在于功能性MMT完全丧失的大麦植物。

[0384] 一般来说，所述方法优选包括使如上所述制备的样品，或优选所述样品的提取物与能够结合SMM的化合物进行反应。发现OPA试剂(Sigma，目录号P7914;参考国际专利申请PCT/DK2009/050315的图2，下文中仅称为0ΡΑ)尤其可用于测定SMM水平。OPA与除其他的SMM反应，形成被称为SMM-OPA的分子(参考国际专利申请PCT/DK2009/050315的图2)。所述反应优选包括将OPA与如上所述制备的样品的提取物温育。此外，还优选向反应混合物中加入3-巯基丙酸。所述混合物优选维持在碱性pH，优选pH8到pHll的范围，更优选pH9到pHll的范围，甚至更优选ρΗ9.5到ρΗΙΟ.5的范围，如pHIO。优选在0° C到10° C范围，优选1° C到8° C，甚至更优选2° C到6° C，还更优选3° C到5° C，如4° C温度下进行温育。温育时间优选彡10分钟。

[0385] 基于SMM-OPA分别在340nm和450nm吸收并发射光的观察结果，可以通过使用荧光光谱进行检测。检测的初始过程优选包括在柱，优选在30X2mm Gemini3yC18柱(Phenomenex,目录号00A-4439-80;Phenomenex, 2006)上提取分离，随后使用高通量液相色谱系统，优选设计用来鉴定并测量在340nm激发并在450nm发射的分子的荧光水平的超高效液相色谱(UPLC系统，Waters)进行荧光检测。当使用该方法时，“没有可检测到的SMM”表示没有与SMM共洗脱的可检测到的化合物。在该上下文中，认为色谱峰上的小“肩”是假峰。参考图2,因此不认为Asn/Ser右手边上的小肩代表SMM峰。因此,作为示例,认为图2B中显示的上边两个色谱图描述了 “没有可检测的SMM”，然而所述图中下边的色谱图则代表包含SMM的样品的分离。[0386] 优选按实施例2或实施例4中所述进行SMM的检测。在下文实施例2中描述了用于选出本发明的大麦植株的优选方法。用于分析的组织优选取样自萌芽的大麦植株，甚至更优选已经萌芽了 4天的大麦植株。应注意的是，上述筛选方法特别有用。首先，所述分析方法是新的。此外，上述方法的显著优势是建立了所述方法，其用于测定萌芽的大麦植株(如萌芽的大麦植株的叶)中的SMM水平。从萌芽大麦中取样的时机获得了意想不到干净的制备物，用于基于UPLC检测SMM。其它样品(例如上述类似谷类的麦芽汁样品)在组成上太复杂，通常不能用于测定SMM水平的所述色谱方法中。[0387] 在具有低于IOppb SMM，优选没有可检测到的SMM的大麦植株的鉴定之后，通常将相应的MMT基因或其部分进行测序，以确定正在讨论的大麦植株是否可以定义为在MMT基因中具有突变。然后选出特征在于没有可检测的SMM，并且其中MMT编码基因的一个或多个碱基与野生型序列相比不同的大麦植株。在该上下文中，所述野生型序列优选为在相应的野生型大麦栽培品种中发现的序列，优选SEQ ID N0:9(对应于国际专利申请PCT/DK2009/050315中的SEQ ID NO:3)给出的序列。上文描述了优选突变。

[0388] 可进一步繁殖所选出的大麦突变体，并根据SMM含量重新筛选后代植株。选出有用的大麦植株后，可将这些植株包括在这样的育种方案中，所述育种方案利用在下文“植物培育”部分中描述的那些传统方法。

[0389] 一旦鉴定出在L0X-1基因中包含特定突变且在L0X-2基因中包含特定突变且在MMT基因中包含特定突变(如上述任何突变)的双无效LOX-无效MMT大麦植株，即可以通过传统的育种方法，如通过本领域技术人员熟知的那些方法产生具有相同突变的其它大麦植株。例如，所述双无效LOX大麦植株可以与另一大麦栽培品种回交。

[0390] 在选出功能性L0X-1、L0X-2和MMT完全丧失的有用大麦植物后，可以任选进行一次或多次额外的筛选。例如，可以进一步繁殖所选出的突变体，并且可以针对功能性L0X-1、L0X-2和MMT的完全丧失对新一代的植株进行检测。[0391 ] 在本发明的一个实施方案中，优选本发明的双无效LOX-无效MMT大麦植株具有类似于野生型大麦的植物生长生理学和谷粒发育。因此，优选双无效LOX-无效MMT大麦植株在株高、每株的分蘖数、开始开花和/或每穗的谷粒数方面类似于野生型大麦(优选cv.Power 或 cv.Quench 或 cv.Rosalina)。

[0392] 同样，优选本发明的双无效LOX-无效MMT大麦植株在株高、抽穗期、抗病性、抗倒伏、穗破损、成熟时间和产量方面类似于野生型大麦，特别是类似于cv.Power或cv.Quench。在本发明上下文中，在表述数目的情况下，将“类似”理解为相同± 10%。这些参数可以按照下文实施例5中所述进行测定。

[0393] 在本发明非常优选的实施方案中，通过将大麦系A689 (ATCC专利保藏名称:PTA-9640)与大麦系8063 (ATCC专利保藏名称:PTA_9543)杂交来制备大麦植物，随后任选地进行进一步培育。

[0394] 大麦系A689的种子已经在2008年12月4日以〃大麦，Hordeum vu IgareL.;A689系〃的名称保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，地址为美国弗吉尼亚洲(VA20110)马纳萨斯市大学街(10801)专利存放处(Patent Depository, 10801UniversityBlvd., Manassas, VA20110, United States)(保藏号 PTA-9640)。

[0395] 大麦系8063的种子已经在2008年10月10日以〃大麦，Hordeum vulgare; 8063系〃的名称保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，地址为美国弗吉尼亚洲(VA20110)马纳萨斯市大学街(10801)专利存放处(ATCC专利保藏号:PTA-9543)。[0396] 化学诱变

[0397] 为了产生本发明的双无效LOX-无效MMT大麦植株，可以通过任何合适的诱变方法，例如通过使用大麦粒的化学诱变法，通常通过多轮制备非常大量的大麦突变体。已知该方法随机引入突变。可以利用任何化学诱变物质进行大麦的诱变。然而，优选利用NaN3*理谷粒，使存活的谷粒萌芽，然后分析子代植株。由诱变的谷粒长成的植株世代(称为MO)包含任何给定突变的杂合嵌合体。在自花传粉之后收集的子代植株称为Ml代，在Ml代中，给定突变分离至相应的杂合子和纯合子中(参见图8)。

[0398] 利用NaN3处理麦粒不等同于处理单个细胞，原因是处理之后的谷粒可包含一些未突变的细胞和多个具有DNA突变的细胞。由于在不形成种系细胞的细胞谱系中的突变会丢失，因此，目标就是将诱变剂靶向发育为生殖性组织的少数细胞，其促成Ml代的产生。

[0399] 为了评价整体突变效率，可计数MO和Ml代中的白化(albino)嵌合体和白化植株。由作为存活植株的函数的突变体计数(scoring mutant number)可得出估计的突变效率，而作为已处理种子的函数的突变体计数测定了突变效率和谷粒死亡二者。

[0400] 应注意的是，在基因表达的几乎每个步骤，细胞都具有可缓和损害突变的影响的质量保证机制。真核生物中的一个经过深入研究的实例是无义介导的mRNA降解(称为NMD)，其阻止合成潜在有害的提前截短蛋白质(Maquat和Carmichael，2001; Wu等人，2007)。在NMD中，通过终止密码子相对于下游脱稳定元件的位置将其鉴定为翻译提前终止密码子。产生翻译提前终止(无义)密码子(PTC)的突变有时提高了选择性剪接的转录本的水平，由此跳过有害突变，从而可能挽救了蛋白质的功能(Mendell和Dietz, 2001)。

[0401] 植物育种

[0402] 在本发明的一个实施方案中，目的是提供包含双无效LOX-无效MMT特征的在农业上有用的大麦植株。农作物发育常为始于引入新特征的长期且困难的过程。然而，从植物育种家的观点看，这一步骤几乎总是产生与现在的市场品种相比，农业性状总体谱图不甚理想的植株。

[0403] 除了双无效LOX-无效MMT特性之外，在产生用于制麦和/或酿造和/或作为饮料基础的商业大麦品种的领域还要考虑其它因素，例如麦粒产量和大小以及与制麦性能或酿造性能相关的其它参数。因为已经显示许多(即便不是所有)相关特性都处于遗传控制之下，本发明还提供了现代的纯合且高产量的制麦栽培品种，其可以通过与本申请公开的双无效LOX-无效MMT大麦植株杂交而制备。专业大麦育种者将能够选出并培育大麦植株，该大麦植株在与双无效LOX大麦-无效 MMT大麦杂交后将产生更好的栽培品种。或者，大麦育种者可以利用本发明植株用于进一步的诱变，以产生源自双无效LOX-无效MMT大麦的新栽培品种。

[0404] 确保在子代中维持双无效LOX-无效MMT特征的一个方法涉及L0X-1基因、L0X-2基因和MMT基因的SNP分析。优选地，还对L0X-1、L0X-2和MMT活性进行测定。

[0405] 可以将本发明的大麦植株引入到任何合适的育种方案中。

[0406] 本发明的另一目的是提供包含双无效LOX-无效MMT特征的在农艺上优良的大麦植株。因此，本发明还涉及通过使第一亲本大麦植株与第二亲本大麦植株杂交而产生新的双无效LOX-无效MMT大麦植株的方法，其中所述第一植株或第二植株是双无效LOX-无效MMT大麦。此外，第一亲本大麦植株和第二亲本大麦植株均可来自双无效LOX-无效MMT大麦品种。因此，利用双无效LOX-无效MMT大麦品种的任何此类方法都是本发明的一部分:自花授粉、回交和群体杂交等。利用双无效LOX-无效MMT大麦品种作为亲本产生的所有植株都在本发明的范围内，包括由衍生自双无效LOX-无效MMT大麦品种的品种形成的那些植株。在将外源DNA引入至双无效LOX-无效MMT植株或植株组织并在其中表达的情况下，双无效LOX无-效MMT大麦还可以用于遗传转化。

[0407] 本发明可以使用回交方法以将突变大麦植株的双无效LOX-无效MMT特征引入至另一个栽培品种中，例如都是当代高产麦芽的大麦栽培品种的cv.Scarlett或cv.Jersey或cv.Quench或cv.Rosalina中。在标准的回交操作中，将原始目标品种(即轮回亲本植株)与携带有待转移的目标突变LOX基因的第二品种(非轮回亲本植株)杂交。随后，将这次杂交产生的双无效LOX子代植株与轮回亲本植株杂交，重复这一过程直至获得这样的大麦植株，即其中除了非轮回亲本植株的双无效LOX-无效MMT特征外，轮回亲本特有的几乎所有特征也都被恢复在所产生的植物中。最后，将最后产生的回交植株自交以产生纯的双无效LOX-无效MMT育种子代植株。

[0408] 加快植物育种过程的方法包括通过应用组织培养和再生技术对所产生的突变体进行初始增殖。因此，本发明另一个方面是提供生长和分化后产生具有双无效LOX-无效MMT特征的大麦植株的细胞。例如，育种可以包括传统杂交、制备源自可育花药的植物或利用小孢子培养。

[0409] LOX通路产物

[0410] 在多种实施方案中，本发明均涉及包含低水平的T2N和T2N潜能的大麦植株和其产品。LOX酶催化带有顺式-1，顺式-4戊二烯系统的多不饱和脂肪酸的二加氧作用。在大麦中，C18多不饱和脂肪酸亚油酸(18:2Δ9’12)和α -亚麻酸(18:3Δ9’12’15)是主要的LOX底物。通过在酰基链的C-9位(多由L0X-1催化)或C-13位(多由L0X-2催化)加入分子氧而启动脂肪酸代谢的脂肪氧化酶通路，产生相应的9-HP0DE和13-HP0DE[当底物为α -亚麻酸时产物是9-氢过氧化十八碳三烯酸和13-氢过氧化十八碳三烯酸(HPOTE)，但HPOTE不发挥Τ2Ν前体的功能]。在LOX通路的氢过氧化物裂解酶支路中，9-HP0DE和13-HP0DE均可以被裂解成短链含氧酸和醛(参见图1Α)。特别地，9-HP0DE可以被裂解成被转化成Τ2Ν的顺-壬烯醒，而13-HP0DE是2-Ε-己烯醛的前体。因此，预期作为L0X-2催化的亚油酸的双加氧作用的主要产物的13-HP0DE不是导致形成陈化味Τ2Ν的通路的上游成分。

[0411] 认为本发明涵盖了影响L0X-1和L0X-2催化作用的下游代谢物的产生，其不作为L0X-1或L0X-2催化反应的直接产物而产生，但是随后的系列反应的结果。这些反应包括自然发生的、因素诱导的或者酶催化的异构化和转化。因此，可能通过调节该通路中其它成分(例如氢过氧化物裂解酶HPL)的表达而影响这些下游代谢物的产生。

[0412] Τ2Ν和DMS及其前体

[0413] 本发明涉及用于制备具有低水平的一种或多种异味物及其前体的饮料的方法。优选地，所述异味物是Τ2Ν和DMS，并且其所述前体分别是Τ2Ν潜能和DMSP。

[0414] 因此，本发明的一个目的是降低或消除Τ2Ν潜能。因此，本发明的目的是减少Τ2Ν前体和醛加合物的形成。虽然与啤酒老化(陈化)有关的数个化学反应仍不清楚，但由Τ2Ν潜能产生游离Τ2Ν被认为是啤酒产品中形成陈化风味的主要原因(KuiOda等人，见上文)。因此，本发明的目的是提供具有低水平的Τ2Ν潜能的饮料和具有低水平的Τ2Ν前体的饮料。

[0415] 多数T2N潜能从麦芽汁转移至成品啤酒，在成品啤酒中可以释放出游离T2N(Li6ge0is等人，2002)，并且酸度和温度都是该过程中的重要因素。根据本发明，T2N潜能的定义如上文在定义部分中的描述。也可以使用其它测定T2N潜能的水平的方法。为了避免混淆，在本申请中“T2N潜能”的含义如上文在定义部分中的描述。具有释放T2N或者转化成T2N的能力的化学物质在本文中都被称为“T2N前体”，并且通过除测定T2N潜能的方法外的其它方法确定或测定的T2N前体被称为“T2N前体”。特别可以通过首先处理样品从而使具有释放T2N或转化成T2N能力的基本上所有(优选所有)或其化学物质都实际上确实分别释放T2N和/或转化成T2N。此后，测定T2N的水平。

[0416] 本发明的大麦粒除了不含MMT活性外，还不含L0X-1和L0X-2活性。有趣的是，这种大麦粒包含非常少的T2N潜能。

[0417] 因此，利用双无效LOX-无效MMT大麦粒产生的啤酒将不仅具有非常低水平的T2N，还具有非常低水平的T2N潜能。双无效LOX-无效MTT大麦粒在本发明的范围内，其中所述大麦粒产生的啤酒产品包含非常低水平的T2N潜能，优选为以相同方式由野生型大麦(优选cv.Power)生产的类似啤酒产品的T2N潜能的水平的少于60%，更优选少于50%。

[0418] 并且，还优选源自双无效LOX-无效MMT大麦粒的植物产品具有非常低的T2N前体水平。由双无效LOX-无效MMT大麦粒制备的植物产品在本发明的范围内，其中所述植物产品包含的T2N前体的水平为以相同方式由野生型大麦(优选cv.Power)生产的类似植物产品的T2N前体的水平的少于60%，更优选少于50%。

[0419] 应注意的是，在小试发芽原料的样品中或在来自小试发芽原料的产品中测定的T2N值常高于在来自较大规模生产的原材料，例如30-kg规模的中试发芽样品测定的T2N值。然而，大规模和小规模实验之间，T2N潜能的相对实验值通常是相似的。

[0420] 类似地还应注意的是，在小试发芽原料的样品中和在来自小试发芽原料的产品中测定的T2N潜能和T2N前体常常高于在来自较大规模生产的原材料，例如30-kg规模的中试发芽样品中测定的T2N潜能和T2N前体。然而，大规模和小规模实验之间，T2N潜能的相对实验值通常是相似的。

[0421] 本发明的另一目的是减少或消除DMS和DMSP，其中DMSP优选为SMM。

[0422] 可通过任何合适的方法测定植物产品中SMM和DMS的量。可基本按上文“制备双无效LOX-无效MMT大麦植株”部分中所述(在该部分中描述了在大麦样品中测定SMM水平)，测定SMM。因此，可通过将SMM偶联到化合物(如0ΡΑ)上，并例如通过使用UPLC系统测定荧光来测定SMM。对于定量测定，可确定对应于SMM峰的色谱图面积。

[0423] 对于更精确的测定，优选使用高分辨率的毛细管气相色谱测定DMS和DMSP (如SMM)两者的量，后一化合物在激活后以DMS进行测定。麦芽汁或啤酒样品中的总DMS在本文中定义为游离DMS及其前体形式(称为DMSP)的数量总和。使用该定义，麦芽汁或啤酒样品中DMSP的量可确定为总DMS(在煮沸的样品，优选在碱性条件下煮沸I小时的样品中进行测定)和游离DMS(在非煮沸样品中测定)之间的差异。实施例4详细描述了测定总DMS和游离DMS水平的优选方法。

[0424] 将DMSP还有SMM的量以DMS的浓度给出，所述DMS可通过在碱性条件下煮沸I小时从所述DMSP或所述SMM中释放。实施例

[0425] 本文的实施例例示说明了本发明的优选实施方案，并且不应认为这些实施例是对本发明的限制。

[0426] 除非另有说明，否则用于操作核酸和细菌的基本分子生物学技术均按照SambiOOk和Russel (2001)中的描述进行。

[0427] 实施例1

[0428] 在萌芽的大麦胚中筛选低L0X-2活性

[0429] 改良的筛诜材料。根据Kleinhofs等人(1978)提供的详述，将从通过(无效L0X-1突变体D112X Jer sey) XSebastian杂交产生的无效L0X-1系Ca211901的大麦植株中收集的麦粒与诱变剂NaN3温育。大麦无效L0X-1突变体Dl 12描述于W02005/087934中并于2003年9月11日以PTA-5487的保藏号保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，地址为美国弗吉尼亚洲(VA20110)马纳萨斯市大学街(10801)。

[0430] 选择该方法的原因是已知其在大麦基因组DNA中诱导点突变，最终导致诱变后的DNA所编码的蛋白的氨基酸残基的取代或截短。在本申请的诱变实验中，选择使Ml代的突变谷粒在田间土地经历随后两代繁殖，最终产生高比例的纯合植株用于筛选(参考图8)。尽管没有筛选M2代的谷粒(主要原因是预期这些谷粒包含有相对高比例的杂合点突变)，但使用M3代的突变谷粒作为筛选材料，预期每10，000个谷粒具有0.9-2.3个突变(Kleinhofs 等人,上文)。

[0431] 意外地，本发明人发现，与分析成熟胚的提取物(如国际申请PCT/DK2009/050355的实施例1所述)相比，萌芽胚的分析产生的试验结果明显改进。因此，建立高通量筛选方法以测定包括子叶盘组织在内的萌芽胚中的L0X-2活性。

[0432] 从35，125个大麦穗的成熟麦粒分离出两个胚(无效L0X-1突变体Dl 12的M4代的20，977个系，和无效L0X-1系Ca21190系的M3代的14，148个系)，并转移至96孔储藏板(ABgene)。在向各个孔中加入20 μ L水后开始胚萌芽,其中用湿的Kimnett薄纸和塑料盖覆盖所述孔。将平板在塑料袋中于20°C温育48小时。温育后，提取L0X-2酶；首先向各孔中加入5-mm玻璃珠和200 μ L提取缓冲液(IOOmM乳酸溶液，ρΗ4.5)，然后在丽300实验室磨(Retsch)中以27sec4的频率碾磨35秒。随后，将平板在Allegra6R离心机(Beckman-Coulter)中在4°C以4，OOOrpm离心10分钟，以沉淀不溶物质。基本按照用于成熟胚提取物的L0X-2活性分析(参考国际申请PCT/DK2009/050355的实施例1)的描述测定L0X-2活性，区别仅在于每个试验仅使用30 μ L提取物而非40 μ L。

[0433] 潜在突变体的鉴定。如上文所述，分析上述35，125个大麦系的两个谷粒中每个谷粒的L0X-2活性，目的在于鉴定当与L0X-1无效和野生型谷粒相比时，所述活性高度降低的谷粒。在Ca211901系的M3代中，共鉴定出7个潜在原始突变体。在温室中进一步繁殖这些突变体，收获，并再筛选与非常低的LOX活性相关的特征。最后，仅Ca211901系的一个突变体(命名为突变体A689)显示基本没有L0X-2活性。利用LOX活性几乎完全由L0X-2产生的萌芽胚的提取物进行总LOX活性的详细测定(Schmitt和van Mechelen, 1997)。对于突变体A689的M3谷粒的萌芽胚，由LOX比色试验测定的总LOX活性为0.163±5.5%A595U/萌芽胚，而对于无效L0X-1母本品种Ca211901则为1.224±3.8%A595U/萌芽胚(无效L0X-1原始突变体D112的相应值为1.215±6.0%A595U/萌芽胚)。大麦A689系的种子已于2008年12月4日以“大麦，Hordeum vulgare L.;A689系”的名称保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，地址为美国弗吉尼亚洲(VA20110)马纳萨斯市大学街(10801)专利存放处(American Type Culture Collection(ATCC), Patent Depository,10801UniversityBlvd.，Manassas, VA20110，United States)(保藏号为 PTA-9640)。

[0434] 突变体A689中的HPODE分析描述于国际专利申请PCT/DK2009/050355的实施例4中。

[0435] 突变体A689的特征描述于国际专利申请PCT/DK2009/050355的实施例5中。

[0436] 大麦突变体A689中L0X-2基因的测序描述于国际专利申请PCT/DK2009/050355的实施例10中，并且其中表7概述了突变体A689的L0X-1和L0X-2基因中的突变。

[0437] 检测双无效LOX突变体A689的方法描述于国际专利申请PCT/DK2009/050355的实施例11中。所述方法为用于检测L0X-1中的突变和L0X-2中的突变的基于SNP的方法。

[0438] 实施例2

[0439] 筛选无效MMT大麦突变体

[0440]根据 Kleinhofs 等人(1978)提供的详细实验，将从 cv.Prestige 和 cv.Sebastian的大麦植株中收集的麦粒分别与诱变剂NaN3温育。选择该方法的原因是由于已知其在大麦基因组DNA中诱导点突变的潜力。

[0441] 在本实验中，使Ml代的突变谷粒在田间土地繁殖经历随后两代，最后产生高比例的M3代的纯合植物用于筛选目。预期M3代的突变谷粒具有每10，000个谷粒包含0.9-2.3个基因突变的频率(Kleinhofs等人，上文)。应注意的是不筛选M2代谷粒。

[0442] 有趣的是，本发明描述了用于检测丧失MMT活性的M3代突变体大麦谷粒(在制麦过程中缺乏可检测到的SMM合成)的快速高通量筛选方法。因此，本发明人发现SMM主要在萌芽大麦的胚芽鞘和初生叶中积累，并且可以通过从磨碎的4天龄萌芽谷粒的叶组织中提取氨基酸并随后将所提取的氨基酸与OPA反应以产生强荧光产物来进行SMM的检测(参考图2) ο

[0443] 实际上，通过将来自94个潜在突变体和两个野生型植株各自的两粒谷粒在带有一张Whatman#l滤纸(296X20.9mm)的密闭塑料盒中萌芽来进行每一试验。对于多个潜在的突变谷粒进行重复试验(见下文)。在开始萌芽时，向所述塑料盒中加入25mL自来水，随后在萌芽两天时再加入15mL自来水。在萌芽4天时，将l-3cm的叶组织转移到储藏板(ABgene)中，其中96个1.2-mL孔的各个孔均含有5-_直径的玻璃珠和500 μ L的水:甲醇:氯仿的12:5:6(v/v/v)混合物。随后将板在MM300实验室磨(Retsch)中以30Hz的频率振动45秒。随后，将板转移到离心机(Rotanta460R，Hettich)中，并在室温以4，OOOrpm离心15分钟以沉淀不溶性物质。将10 μ L的上清液转移到96孔储藏板(Waters，目录号186002481)中并与 200yL H2O 和 60 μ L 含比例为 15，000:45 (v/v)的 OPA 试剂(Sigma,目录号P7914):3_巯基丙酸(Aldrich,目录号M5801)混合物的反应溶液混合。将该混合物在4° C至少温育10分钟以获得用OPA的定量衍生的样品氨基酸。使用装配有荧光检测器的基于 Waters 的 UPLC 系统，在 3-μ m 颗粒的 2.1 X 30-mm C18Gemini 柱(Phenomenex,目录号00A-4439-80)上使用通过将流动相A (40-mM NaH2PO4缓冲液，调整pH值至7.8)和流动相B[如描述(Phenomenex, 2006)的比例为45:45:10 (v: v: v)的乙腈:甲醇:水溶液]混合的梯度洗脱对2 μ L的衍生化混合物进行分离。洗脱的OPA衍生物的激发在340nm处，并在450nm处测定光发射。色谱图的实例显示于图2中，其显示了天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)和SMM的洗脱谱。由于项目总体目的是鉴定出丧失合成SMM能力的大麦植株，即其相应的色谱图峰非常小或优选不存在的植株，因此包括后一化合物SMM。

[0444]分别筛选大麦 cv.Prestige 和 cv.Sebastian 的总计 10，248 粒和 3，858 粒 NaN3 突变的麦粒的SMM含量，目的为鉴定出与野生型谷粒相比所述含量高度降低的麦粒。仅鉴定出M3代的2个潜在突变体，称为样品8，063号的谷粒(来自cv.Prestige,并在下文中表示为突变体8063，该命名也用于后代谷粒)，和样品14，018号的谷粒(来自cv.Sebastian,并在下文中表示为突变体14018，该命名也用于后代谷粒)。将各突变体的谷粒繁殖到M4代，随后收获，并最终再次分析。结果证实了突变体8063和突变体14018的谷粒具有极低的SMM含量，其可能完全缺乏SMM。

[0445] 蛋白印迹分析已证实，突变体8063和突变体14018缺少MMT酶(见国际专利申请PCT/DK2009/050315 的实施例 3)。

[0446] MMT活性测定也已证实，突变体8063缺乏MMT活性(见国际专利申请PCT/DK2009/050315 的实施例 4)。

[0447] 按国际专利申请PCT/DK2009/050315的实施例9中所述对大麦突变体8063中MMT基因进行的测序显不，在5号内含子的第一个碱基(SEQ ID NO: 10的第3076位核苷酸,而SEQ ID N0:10则对应于国际专利申请PCT/DK2009/050315的SEQ ID NO:8)处具有G — A的碱基转换。按国际专利申请PCT/DK2009/050315的实施例14中所述对大麦突变体14018中MMT基因的测序显示，在2号内含子的第一个碱基处、2号外显子紧下游的剪接供体位点处，更具体为在第1462位核 苷酸处,具有G — A的碱基转换。

[0448] 此外已证实，突变体8063中MMT mRNA是截短的(见国际专利申请PCT/DK2009/050315的实施例11)并且由所述截短的mRNA编码的突变体MMT蛋白不具有MMT活性(见国际专利申请PCT/DK2009/050315的实施例12)。还已经证实，在突变体14018中MMT mRNA是截短的(见国际专利申请PCT/DK2009/050315的实施例15)并且由所述截短的mRNA编码的突变MMT蛋白不具有MMT活性(见国际专利申请PCT/DK2009/050315的实施例16)。

[0449] 在国际专利申请PCT/DK2009/050315的实施例11中描述了用于检测突变体8063的MMT基因中突变的方法，并且在国际专利申请PCT/DK2009/050315的实施例17中描述了用于检测突变体14018的MMT基因中突变的方法。

[0450] 实施例3

[0451] 大麦杂交

[0452] 图3概述了如何通过大麦A689系[双无效L0X，参考PCT专利申请号PCT/DK2009/050355]与 8063 系[无效MMT，参考 PCT 专利申请号 PCT/DK2009/050315]的第一次杂交来培育本发明的双无效LOX-无效MMT大麦系。使用标准育种技术培育出双单倍体系，并在温室中进行了繁殖。在这些株系中，选择在农学性能方面具有最佳性状并缺乏L0X-1活性(参考Breddam, K.等人的美国专利第7，420，105号中的实施例2)、缺乏L0X-2活性(参考PCT申请第PCT/DK2009/050355号中的实施例2和本文的实施例1)、以及缺乏SMM和MMT活性(PCT申请第PCT/DK2009/050315号中的实施例2和实施例4，以及本文的实施例2)的株系进行进一步的繁殖和分析。本文将这些株系表示为“三无效”。通常对于LOX活性的测定，收获双单倍体系的种子并随后分析各株系和对照品种的12粒谷粒，测定值的标准差为<5%(图4) ο

[0453] 实施例4

[0454] SMM水平的测定

[0455] 基本上按PCT申请PCT/DK2009/050315中所述进行SMM测定。首先，从l_3cm长的部分大麦叶片中提取SMM，即将所述叶片置于1.2-mL孔的微滴定板中，其中各孔均含有5-mm直径的玻璃珠和500μ L的水:甲醇:氯仿的12:5:6 (ν/ν/ν)混合物。随后将所述板在ΜΜ300实验室磨(Retsch)中温育45秒，电学调整至以30Hz的频率振动。离心后，将10 μ L的上清液转移到96孔储藏板(Waters,目录号186002481)中，并与200 μ L水和60 μ L含OPA 试剂(Sigma,目录号 P7914):3-巯基丙酸(Aldrich,目录号 M5801)的 15，000:45 (v/v)混合物的反应溶液混合。将混合物在4° C温育至少10分钟以用OPA定量衍生的样品氨基酸。使用装配有荧光计的UPLC系统(Waters)，在3- μ m颗粒的2.1 X 30-mm C18Gemini柱(Phenomenex,目录号00A-4439-80)中，使用含有乙腈:甲醇:水的45:45:10 (v:v:v)溶液且pH值调至7.8的40-mM磷酸钠缓冲液作为流动相(Phenomenex2006)来分离2 μ L的衍生混合物。OPA衍生物的激发在340nm处，且在450nm处测定光发射。色谱图实例显示于图5中，其显示了来自野生型和三无效突变体的天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)和SMM的洗脱谱。观察到了三无效突变体明显缺乏合成SMM的能力。

[0456] 实施例5

[0457] 农学性能

[0458] 在田间试验中检测了商品化大麦CVS.Quench和Power以及无效LOX-1、无效MMT、无效L0X-1-无效L0X-2 ( 双无效L0X)、无效L0X-1-无效MMT和三无效植株，从而对它们的农学性能进行比较。定期获取株高、抽穗期、抗病性、抗倒伏、成熟时间和产量的数据(见表I)。

[0459] 根据用于田间试验的标准方法进行试验。因此，将商品化品种和突变体系的等量麦粒播种于两处7.88-m2的土地中，每一处含3个重复。根据观察突变体和商品化品种的农学性状没有大的差别。不同突变体系和品种的大麦质量分析证明，所有收获的谷粒均具有优良且可接受的制麦和酿造特性。

[0460] 实施例6

[0461] 小试制麦和小试糖化

[0462] 实验设计

[0463] 用以下六种不同的大麦系和栽培品种进行小试制麦和小试糖化实验(图6A)，其还显示了下文描述的实验流程:⑴三无效；⑵无效L0X-1-无效MMT ； (3)无效L0X-1-无效L0X-2 (大麦A689系)；(4)无效MMT (大麦8063系)；(5)无效L0X-1 (大麦Dl 12系)；(6) cv.Power。

[0464]用来自上文提及的各株系或栽培品种的三份225-g大麦样品进行小试制麦实验。如下进行浸泡和萌芽:

[0465] ⑴在16 ° C浸泡:润湿3小时，干燥21小时，润湿3小时，干燥21小时，润湿3小时，干燥21小时，最终水含量为45% ；

[0466] (ii)萌芽:在16。C下萌芽48-72小时直至>95%的修饰。

[0467] 萌芽后，用不同的干燥方案对所述三份样品进行干燥(图6A中称为烘干):

[0468] (i)85° C干燥:12.5小时由开始的30° C至55° C的斜坡(ramping)升温，随后是7.5小时至85° C的斜坡升温，在85° C保持1.5小时；

[0469] (ii)75° C干燥:12.5小时由开始的30° C至55° C的斜坡升温，随后是7.5小时至75° C的斜坡升温，在75° C保持1.5小时；

[0470] (iii)40。C 干燥:40° C 保持 48 小时。

[0471] 在萌芽后立即处理在85° C和40° C干燥的样品，而将剩余样品冷冻2天，解冻，并随后进行如上文概述的75° C干燥。

[0472] 通过将90-g碾磨的麦芽样品与270mL自来水混合，随后在500_mL瓶中进行小试糖化。在40° C温育20分钟。温度在25分钟内斜坡升温至65° C，随后为在65° C60分钟时长的糖化停止(saccharification pause)。随后,在78° C、10分钟时长的糖化终止阶段前在13分钟内将温度斜坡升温至78° C。然后将所获得的麦芽汁在冰上冷却，用700mL冰冷的自来水稀释,并经折叠的MN_616V4滤纸(Macherey-Nagel)过滤。将400mL麦芽汁转移到500-mL瓶中，盖紧瓶盖并在沸水浴中加热60分钟。将瓶子额外置于水浴中60分钟，而不进行进一步加热。

[0473] DMSP水平的数 据

[0474] 为了检测多种烘干温度如何影响本发明的野生型和突变体麦芽中的DMSP含量，谷粒首先进行小试制麦并随后以等分试样分开，然后在40° C、75° C和85° C三个不同温度下烘干。

[0475] 含野生型MMT基因的大麦株系的谷粒特征在于，最终的麦芽中含高水平DMSP。然而，在更高温度下烘干后检测到水平降低(表2)。相比之下，在所有无效MMT基因型的麦芽中均检测到明显低水平的DMSP。

[0476] 还测定了由上文提及的麦芽产生的麦芽汁中的DMSP水平，给出的DMSP水平对应于在麦芽中测定的水平。该发现与Dickenson和Anderson (1981)之前的结果一致,显示了麦芽和麦芽汁的DMSP含量之间的紧密关联。对于所有无效MMT基因型，在相应的麦芽汁中均检测到明显低的DMSP水平，这与制备麦芽所用的烘干温度无关。

[0477] T2N前体和游离T2N水平的数据

[0478] 为了检测多种烘干温度如何影响游离T2N和T2N前体的水平，按照上文描述测定经小试制麦和小试糖化产生的甜麦芽汁和冷麦芽汁中所述化合物的浓度。结果显不于表3中。

[0479] 对于野生型麦芽的麦芽汁，烘干温度对T2N和T2N前体的浓度具有显著影响。当使用野生型麦芽时，高烘干温度对于避免T2N前体的大量产生是完全必要的。

[0480] 烘干温度对于无效L0X-1-无效MMT麦芽中T2N及其加合物的产生具有较小的影响。

[0481] 还值得注意的是对于三无效麦芽的麦芽汁，游离T2N及其前体的浓度在所有样品中均很低，而与烘干温度无关。

[0482] 实施例7[0483] 利用未发芽大麦的小试糖化

[0484] 通过将90-g碾磨的大麦样品与270mL自来水以及0.12g大麦酿造酶混合物OndeaPro (Novozymes)混合，随后在500_mL瓶中54° C温育30分钟，实现cv.Power和三无效的未发芽大麦的小试糖化。在10分钟内将温度斜坡升温至64° C，随后为在64° C45分钟时长的糖化停止。然后14分钟内将温度斜坡升温至78。C，之后为在所述温度10分钟时长的糖化终止(marshing-off)阶段。随后的冷却、稀释、过滤和加热步骤均按照对小试发芽糖化的描述进行(见实施例4)。

[0485] 测定由cv.Power和三无效的大麦粉生产的麦芽汁中的DMSP水平(表4)。显然，由三无效大麦生产的麦芽汁中的DMSP含量要显著低于野生型cv.Power中的含量。由于认为大麦不含有 DMSP (Yang, B.等人:Factors involved in the formation of two precursorsof dimethyl sulphide during malting, J.Am.Soc.Brew.Chem.56:85-92，1998)，因此这是一个令人惊喜的发现。

[0486] 如PCT专利申请第PCT/DK2009/050355号(参考所述申请中的图12和实施例9)中所示，在来自双无效LOX的样品的煮沸的大麦酿造麦芽汁和煮沸的正常麦芽汁的T2N前体水平明显较低。因此，预期三无效大麦的麦芽汁具有类似性质，使得三无效大麦成为用于具有低的或完全不含T2N和DMS异味物的大麦酿造饮料的高品质原材料。

[0487] 实施例8

[0488] 中试规模的制麦和酿造[0489] 实验设计

[0490] 用三无效和cv.Quench (对照麦芽)麦芽的制麦和酿造分析包括以下步骤:(i)制麦；Qi)制备麦芽汁；(iii)分离麦芽汁；(iv)煮沸麦芽汁；(v)用卡尔酵母发酵麦芽汁；(vi)贮藏啤酒；(vii)过滤清啤酒和(viii)啤酒装瓶(参考图6B、C)。

[0491] 用三无效和cv.Quench的麦粒以20_kg重的规模进行制麦实验,在制麦厂中如下进行:

[0492] ⑴16°C浸泡:润湿I小时，干燥I小时，润湿I小时，干燥I小时，润湿I小时，最终水含量为45% ；

[0493] (ii)发芽120小时，开始16° C并斜坡降温至14° C ；

[0494] (iii)干燥14小时，开始65° C并斜坡升温至85° C ;在85° C保持3小时。

[0495] 对于三无效和cv.Quench(后者用作参照)的糖化,使用25kg麦芽样品。将各麦芽样品碾磨后，加入自来水至体积为146-L。在40°C进行20分钟起始糖化(mashing-1n),然后为25分钟的从40°C至65°C的斜坡升温。65°C的糖化停止为60分钟，然后为在13分钟的加热阶段加热至78°C，以及10分钟的78°C糖化终止。

[0496] 将野生型cv.Quench的一份麦芽汁样品和三无效的一份样品分别在101° C煮60分钟(导致6.7%的蒸发)，而剩余两份麦芽汁样品在98° C加热60分钟(导致3.9%的蒸发)。如上文提及的其余酿造步骤(即过滤、涡旋分离、发酵、贮藏和包装在绿色玻璃瓶中)均按照标准酿造实践的说明书来进行。

[0497] 基本上如Hysert等人(1980)所述,使用静态顶空气相色谱法在350B硫化学发光检测器(Sievers)上用硫特异检测来测定DMSP和DMS水平。使用HS-40自动设备(PerkinElmer)进行顶空取样。[0498] 通过将各个样品在碱性条件下煮沸I小时，获得绿色烘干麦芽的麦芽汁和提取物中的总DMS水平，即游离DMS和DMSP的之和。随后将煮沸和未煮沸的样品进行顶空分析，以测定DMS水平。将总DMS(在煮沸样品中测定的)和游离DMS(在未煮沸样品中测定的)间的差异定义为等于样品中存在的DMSP量。啤酒中游离DMS的量测定为基本与麦芽汁中的测定相同(Hysert等人,上文)。

[0499] 耒芽汁样品中DMSP/DMS和T2N前体/游离T2N水平的数据

[0500] 使用现代酿造设备，通常需要蒸发6-10%的麦芽汁来在相应的成品啤酒中获得令人满意的DMS水平，S卩[DMS]〈50ppb，这是人对异味的味觉阈值水平。根据这些事实，按上文描述来设计中试酿造试验。目的是检测降低能量输入(例如在加压温育过程中不煮沸)对麦芽汁和最终的啤酒中DMS水平的影响。因此，实验设计包括与标准条件下的麦芽汁煮沸的比较。

[0501] 在cv.Quench麦芽汁的加热过程中测到了高水平的DMSP和游离DMS，并在加压麦芽汁中观察到游离DMS水平随时间增高。相比之下，煮沸并蒸发的麦芽汁在煮沸结束时仅积累了很少量的DMS，而之后游离DMS再度积累。与上文描述的小试糖化的结果一致，中试规模的三无效麦芽的麦芽汁的特征是，与衍生自cv.Quench的类似样品相比，其具有极低水平的DMSP和游离DMS (参考表5)。应注意的是，即使在麦芽汁中，三无效麦芽的所述DMS水平仍显著低于50-ppb的味觉阈值水平。

[0502] 基本上如Gronqvist等人(1993)所述,用O- (2, 3, 4, 5, 6_五氟节基)轻胺对羰基衍生化后，通过GC-MS测定来自野生型麦芽cv.Quench和三无效麦芽的麦芽汁和啤酒中T2N前体和游离T2N的浓度。

[0503] 在cv.Quench麦芽汁的加热过程中测到了高浓度的T2N前体，并发现在煮沸/加热处理开始时的值最大(表6)。对于由三无效麦芽制成的麦芽汁，发现T2N前体的食品显著较低(大约为使用野 生型原材料时水平的40%)，并且在煮沸/加热处理开始时的值最大。低能加热方案(即采用加压热处理)对两种麦芽类型的T2N前体水平仅具有较小的影响。在所有的麦芽汁样品中，均检测到了低水平的游离T2N。

[0504] 应注意的是，即使在麦芽汁加热过程中采用了低能量输入，无效LOXl和无效L0X-2突变的有益作用仍是明显可见的。

[0505] 啤酒样品中DMS和T2N前体/游离T2N的水平的数据

[0506] 测定了使用上文描述的两种不同的煮沸/加热方案由三无效麦芽以及野生型麦芽cv.Quench制成的新鲜啤酒中的DMS浓度。结果总结于表7中。

[0507] 使用标准煮沸方案由cv.Quench的野生型麦芽生产的啤酒含有65ppbDMS，即略高于50-ppb的味觉阈值。使用上文描述的节能方法(如“在加压温育过程中不煮沸”)和野生型麦芽导致最终的啤酒中的DMS浓度非常高(151ppb)。

[0508] 相比之下，无论用何种加热方法，由三无效麦芽生产的啤酒均含非常低水平的DMS。

[0509] 无论用何种麦芽汁制备方法，由三无效麦芽生产的啤酒的T2N前体含量远小于无论使用何种煮沸方法由野生型麦芽cv.Quench生产的啤酒的T2N前体含量(总计下降56%至 58%)(表 7)。

[0510] 在所检测的四份新鲜啤酒(即，使用cv.Quench或三无效的麦芽并结合允许蒸发或加压的麦芽汁制备物)中，新鲜啤酒中的游离T2N水平均低，但在37° C强制陈化2周后，观察到了显著区别。尽管由采用标准煮沸或加压加热制备的野生型麦芽制成的啤酒分别含0.041ppb和0.061ppb的T2N，但由三无效麦芽生产的啤酒的相应值却更低，即分别下降至95%和64% (表7)。

[0511] 啤酒泡沫的数据

[0512] 比较了在cv.Quench (参考图6B)和三无效(参考图6C)麦芽的麦芽汁加热过程中进行蒸发或加压生产的中试酿造啤酒。啤酒取自取样点9(参考图6B、C)，在超声浴中脱气20分钟，然后加入50mL H2O至150mL啤酒中。将混合物缓慢倒入由16_cm长、7_cm宽的玻璃管(在底部和顶部分别有玻璃滤器和接头)组成的发泡塔中。将队气以400mL/分钟的流速从底部发泡通过所述混合物以产生啤酒泡沫。将其引导通过管，并收集到位于秤(weight)上的分级沉淀杯中。

[0513] 以5分钟间隔记录四种啤酒各自的总泡沫重量直至发泡终止(图7)。无论蒸发或加压方法，泡沫水平都是相似的。然而，在用三无效麦芽作为原材料的啤酒中，发泡得到显著改善。

[0514] 啤酒味道

[0515] 专家品尝小组对所生产的四种啤酒(即，使用cv.Quench或三无效的麦芽并结合允许蒸发或加压的麦芽汁制备物)，以新鲜生产的啤酒和在37° C强制陈化I周和2周后的啤酒分别进行了评价(表8)。

[0516] 无论用何种煮沸方法，由三无效麦芽生产的新鲜啤酒均获得了最高的总风味分值。相比之下，使用标准煮沸方案由野生型麦芽生产的啤酒获得的总风味分值略低；被认为是“轻度DMS”。应用加压加热技术导致啤酒具有非常低的总风味分值，并被认为是“重度DMS ”。

[0517] 在37° C强制陈化I周或2周后，由三无效麦芽生产的啤酒获得的总陈化分值显著低于由野生型麦芽生产的啤酒，尤其是由于源自较低浓度的陈化组分T2N的“纸样”性质的分值降低。

[0518] 实施例9

[0519] 中试规模的制麦和酿造

[0520] 实验设计

[0521] 用三无效(双无效LOX-无效MMT)和cv.Rosalina (野生型参照)的麦芽的制麦和酿造分析包括以下步骤:(i)制麦；(ii)制备麦芽汁；(iii)分离麦芽汁；(iv)煮沸麦芽汁；(V)用卡尔酵母发酵麦芽汁；(vi)贮藏啤酒；(vii)过滤清啤酒；和(viii)啤酒装瓶。

[0522] 用三无效和cv.Rosalina的麦粒以21_kg重的规模进行制麦实验,在制麦厂如下进行:

[0523] (i) 16°C浸泡:润湿I小时,干燥I小时,润湿I小时，干燥I小时，润湿I小时，滴水36小时至最终水含量为45% ；

[0524] (ii)萌芽120小时，开始16° C斜坡将温至14° C ；

[0525] (iii)在中试烘干机中用常温程序或低温程序进行萌芽麦粒的干燥/烘干；

[0526] (iv)正常干燥/烘干程序，开始于45° C，在14小时内斜坡升温至85° C，然后在85° C温育2小时；[0527] (V)低温干燥/烘干程序，开始于45° C，在12小时内斜坡升温至75° C，然后在75° C温育2小时。

[0528] 对于三无效和cv.Rosalina两者的糖化，均使用34kg麦芽样品。将各麦芽样品碾磨后,加入自来水至体积为180-L。在60°C进行20分钟糖化起始,然后是5分钟从60°C至65°C的斜坡升温。65°C的糖化停止为60分钟，然后为13分钟的加热阶段加热至78°C，和10分钟在78 °C的糖化终止。

[0529] 将野生型cv.Rosalina和三无效样品的麦芽汁样品分别在开口容器中100° C煮沸60分钟(导致4.5%的蒸发)，或在密闭容器中加热至99.5° C并在99.5° C保持60分钟(导致0%的蒸发)。

[0530] 用栽培品种、烘干条件和煮沸条件的不同组合，制成六种不同的麦芽汁(见表9).[0531] 如上文提及的其余酿造步骤(即涡旋分离、发酵、贮藏、过滤和包装在绿色玻璃瓶中)均按照标准酿造实践的说明书来进行。

[0532] 按上文实施例8中的描述测定DMSP和DMS水平。

[0533] 耒芽样品中DMSP/DMS水平的数据

[0534] 在现代制麦厂里，为了获得可从中得到具有令人满意的DMS水平的麦芽汁的麦芽，麦粒干燥通常需要在85° C的固化温度保持至少2个小时以将麦芽中的DMSP降至低水平(即低于4.5mg/kg的麦芽)(见下文)。

[0535] 根据这些事实，按上文描述设计中试制麦试验。目的是检测低能量输入(例如低温干燥)对麦芽、麦芽汁和最终的啤酒中DMS和DMSP水平的影响。因此，实验设计包括与根据标准条件干燥的谷粒的比较。

[0536] 在使用85° C标准干燥由cv.Rosalina制成的麦芽中，测定DMSP为4.7mg/kg麦芽。在使用75° C干燥由cv.Rosalina制成的麦芽中，测定DMSP为16.2mg/kg(表10)。在由三无效的谷粒制成的麦芽中，无论干燥温度多少，均获得了实际低于检测限的极低的DMSP水平。

[0537] 耒芽汁样品中DMSP/DMS水平的数据

[0538] 使用现代酿造技术，为了在相应的成品啤酒中获得令人满意的DMS水平，优选为[DMS]〈50ppb，通常需要具有4.5-10%的麦芽汁蒸发量的至少一小时的煮沸。根据这些事实，按上文描述设计酿造试验。目的是检测低能量输入(例如低温麦粒干燥或在密闭容器中的无蒸发热处理)对麦芽汁和最终的啤酒中DMS水平的影响。因此，实验设计包括与标准条件的谷粒干燥和麦芽汁煮沸的比较。

[0539] 在用正常干燥制成的cv.Rosalina麦芽汁的加热过程中，测到了高水平的DMSP和游离DMSP。在密闭容器中观察到游离DMS水平随时间上升。相比之下，煮沸并蒸发的麦芽汁在煮沸结束时仅积累了很少量的DMS，随后游离DMS再度积累(表11)。使用cv.Rosalina低温干燥，DMSP和DMS水平比用正常干燥高得多。在用cv.Rosalina制成的所有三种麦芽汁中，最终的麦芽汁均具有高于50-ppb的DMS水平。

[0540] 与上文描述的其它结果一致，三无效麦芽的麦芽汁的特征在于与衍生自cv.Rosalina的类似样品相比，其具有极低水平的DMSP和游离DMS。应注意的是，无论使用何种烘干和煮沸方案，即使在麦芽汁中，三无效麦芽的所述DMS水平均仍显著低于50-ppb。

[0541] 麦芽汁样品中T2N前体/游离T2N水平的数据[0542] 基本上按Gronqvist等人(1993)所述，用O-(2，3，4，5，6_五氟苄基)羟胺对羰基衍生化后，通过GC-MS测定来自野生型麦芽cv.Rosalina和三无效麦芽的麦芽汁和啤酒中T2N前体和游离T2N的浓度。

[0543] 在cv.Rosalina的麦芽汁中测到了高浓度的T2N前体(表12)。发现由三无效麦芽制成的麦芽汁中的T2N前体水平尤其较低，为当使用野生型原材料时水平的〜40%。低能加热方案(即低温烘干或在密闭容器中麦芽汁的无蒸发热处理)对于两种麦芽类型的T2N前体水平仅具有很小的影响。在所有的麦芽汁样品中，均检测到低水平的游离T2N。

[0544] 应注意的是，即使使用低能量输入，无效LOXl和无效L0X-2突变的有益作用仍是明显可见的。

[0545] 啤酒样品中DMS和T2N前体/游离T2N水平的数据

[0546] 使用上文描述的两种不同的麦粒干燥和煮沸/加热方案，测定了由三无效麦芽以及cv.Rosali na的野生型麦芽制成的新鲜啤酒中的DMS浓度。结果总结于表13中。

[0547] 由使用标准干燥条件产生的cv.Rosalina的野生型麦芽通过标准煮沸方案生产的啤酒含有117ppb DMS，即高于50-ppb。使用上文描述的节能方法(如“在密闭容器中无蒸发”)及野生型麦芽产生174ppb DMS，即最终的啤酒中具有非常高浓度的异味物。

[0548] 相比之下，无论使用何种煮沸和烘干方法，由三无效麦芽生产的啤酒均含非常低水平的DMS。

[0549] 在所检测的啤酒(S卩，使用cv.Rosalina或三无效的麦芽并结合允许蒸发的煮沸或在密闭容器中无蒸发的热处理)中，新鲜啤酒中的游离T2N水平均低，但在37° C强制陈化2周后，观察到了显著区别。尽管通过标准煮沸和在密闭容器中的无蒸发热处理生产的野生型麦芽制成的啤酒分别含0.055ppb和0.035ppb T2N，但由三无效麦芽生产的啤酒的相应值却明显更低，即分别下降67%和51%(参考表13)。

[0550] 啤酒味道

[0551] 专家品尝小组对所生产的6种啤酒(S卩，使用cv.Rosalina或三无效的麦芽并结合允许蒸发的煮沸或在密闭容器中的无蒸发的热处理或标准或低温干燥)进行了评价，均以新鲜生产的啤酒和在37° C强制陈化2周后的啤酒而进行(表14)。

[0552] 无论使用何种烘干和煮沸方法，由三无效麦芽生产的新鲜啤酒获得的总风味分值均最高。相比之下，使用标准煮沸方案由85° C烘干的野生型麦芽生产的啤酒获得的总风味分值低得多；这被认为是“显著DMS”。将在密闭容器里的无蒸发热处理应用于麦芽汁制备物，产生总风味分值甚至更低的啤酒，其被认为是“重度DMS”.[0553] 在37° C强制陈化2周后，由85° C烘干的三无效麦芽经正常煮沸生产的啤酒获得的总陈化分值显著低于由野生型麦芽生产的相应啤酒的总陈化分值，原因尤其是源自较低浓度的陈化组分T2N的“纸样”性质的低分值。

[0554] 对于由野生型麦芽生产的啤酒，评估老化特征并非真正可行，主要原因是显著至重度的DMS异味。

[0555] 实施例10

[0556] 比较大麦酿造啤酒和普通啤酒-THA

[0557] 几十年前早已描述了来自亚油酸的啤酒特异性THA(Drost等人，1974)。此后，多个报告均已证实啤酒中THA的总量为〜5-12ppm(Hamberg，1991;及其中的参考文献)。尽管9，12，13-THA通常构成了啤酒中75-85%的THA (9，10, 13-THA的量占15-25%)，但也发现了痕量的其它异构体。

[0558] 在由三无效大麦麦芽制备的麦芽汁生产的啤酒中(参考实施例9)，9，12，13-THA的浓度与由cv.Rosalina麦芽制成的对照啤酒相比降低了 80_87% (表15)。观察到9，10, 13-THA异构体具有65-72%的降低。使用标准HPLC质谱分析进行这些测定(Hamberg，上文)。

[0559] 实施例11

[0560] 啤酒中源自原材料的DNA的扩增

[0561] 尽管PCR方法可用于确定麦芽粉混合物中物种特异性DNA序列的存在与否，但啤酒样品的认定存在更多挑战。在啤酒生产中，原材料来源的核酸酶、高温和过滤的组合效应使得啤酒产品仅含有非常低水平的完整DNA，用于扩增植物基因片段。在此，描述了结合了DNA提取和扩增的有效的新方法，其产生了用于可视化的足量DNA。

[0562] 已经开发出用于啤酒样品的原材料认定的新的四步法。所述方法以连续方式利用三种生物分子试剂盒的试剂和方案，最终形成用于可视化的DNA片段的扩增:

[0563] (i)通过与磁珠结合从啤酒中提取DNA[按照DNA提取试剂盒(Tepnel BiosystemsLtd.,目录号901040N)的说明书中针对液体样品的说明的建议];

[0564] (i i)通过等温链置换扩增DNA (I I lustra GenomiPhi V2DNA扩增试剂盒，GEHealthcare,目录号 25-6600-30) ; (iii)使用 REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix (Sigma,目录号XNAP-1KT)用引物进行PCR，以检测特异性DNA突变；

[0565] (iV)琼脂糖凝胶 电泳，以分离扩增产物，随后用溴化乙锭染色使其可视化。

[0566] 上文步骤(i)涉及从以下样品的400-μ L等分试样中纯化DNA:

[0567] (a)使用野生型麦芽:大麦的75%: 25%混合物的面粉(Carlsberg Breweries A/S;商标注册 26.11.11704)生产的 TuborgGr0HPilsner;

[0568] (b)使用含50%无效L0X-1麦芽的混合物(Carlsberg试验标识号2C10084)以中试规模生产的啤酒；

[0569] (c)使用由三无效大麦生产的麦芽以中试规模酿造的非煮沸麦芽汁(Carlsberg试验标识号2C11001);

[0570] (d)使用三无效麦芽以中试规模酿造的煮沸麦芽汁(CarI sberg试验标识号2C11001)，即由上文(C)中的描述而加工的麦芽汁。

[0571] 将从每一种上文提及的样品(a)、(b)、(c)和(d)中纯化的DNA最终重悬于50 μ L的 ρΗ7.4 的 10-mM Tris-EDTA 缓冲液中。

[0572] 在上文的步骤(ii)中，将1-UL按(i)中详述纯化的麦芽汁来源或啤酒来源的DNA的样品等分试样进行扩增。将DNA在含非特异结合DNA的随机六聚物的样品缓冲液中短暂热变性并随后冷却。加入含DNA聚合酶、随机六聚物、核苷酸、盐和缓冲液的主体混合物(master-mix)，并使用20 μ L的最终反应体积在30°C进行等温扩增2.0小时。随后，在65° C温育10分钟内将聚合酶热失活。

[0573] 关于上文步骤(iii)，14-μ L PCR扩增的参数(包括1.0或4.2_ μ L如上文(ii)中描述制备的样品的模板等分试样，和7pmol的用于检测无效L0X-1突变的每一种引物FL820(W02010/075860 的 SEQ ID NO: 10)和 FL823 (W02010/075860 的 SEQ ID NO: 11) '参考Skadhauge, B.等人的 W02010/075860 中的图 18B)如下:

[0574] ⑴I个循环，96° C变性2分钟；

[0575] (^)30个循环:

[0576] (a) 95。C 变性 I 分钟；

[0577] (b)68° C 退火 I 分钟；

[0578] (c) 72。C 延伸 I 分钟

[0579] (iii) 72° C 终延伸 10 分钟

[0580] (iv)保持

[0581] 上文的步骤(iv)由在掺有溴化乙锭的2%(w/v)琼脂糖凝胶中电泳分离全部PCR混合物组成。电泳后，用UV光照射凝胶并拍照(图10)。

[0582] 图10中显示的DNA带型分析，表明由Tuborg啤酒的等分试样没有产生扩增产物，由于原材料为野生型来源(即不来源于无效L0X-1大麦)，因此这是预料之中的结果。然而，可从由含50%无效L0X-1麦芽的混合物酿造的啤酒样品检测到预期长度的扩增产物。类似但更为显著地，在由三无效麦芽制备的非煮沸麦芽汁中获得了染色。可能由于热损伤及随后沉淀的原因，在三无效原材料的煮沸麦芽汁样品中扩增PCR产物较少。

[0583] 利用在独立的PCR中用引物对FL1034-FL1039(分别为W02010/075860的SEQID N0:9 和 SEQ ID N0:8;还见于 Skadhauge 等人的 W02010/075860 中的图 18)、引物组20 (TO2010/063288 的 SE Q ID N0:77 和 SEQID NO:81)及引物组 21 (W02010/063288 的 SEQID N0:78 和 SEQ ID NO:82;还见于Knudsen 等人的 W02010/063288 中的图 15)以上文(ii)中的描述产生的扩增产物，但按照与上文详述的本实施例的条件相似的条件，证明是否通过使用三无效原材料生产麦芽汁或啤酒样品。

[0584]

[0597]

[0604] 引用的参考文献

[0605] 专利文件

[0606] Mullis, K.B.等人的美国专利号 4.683.195

[0607] Mullis, K.B.等人的美国专利号 4.800.159

[0608] Douma, A.C.等人的 PCT 专利申请 W002/053721

[0609] Breddam, K.等人的 PCT 专利申请 W02005/087934

[0610] Hirota, N.等人的欧洲专利号EP1609866

[0611] Knudsen, S.等人的 PCT/DK2009/050315[0612] Skadhauge, B.等人的 PCT/DK2009/050355

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