具有低水平大麦醇溶蛋白的大麦 |
|||||||
| 申请号 | CN200880111180.3 | 申请日 | 2008-08-13 | 公开(公告)号 | CN101821375B | 公开(公告)日 | 2013-07-10 |
| 申请人 | 联邦科学技术研究组织; 沃尔特和伊丽莎豪医学研究所; 粮食研究发展公司; 墨尔本健康公司; | 发明人 | G·J·坦纳; C·A·豪伊特; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及产生适于 乳糜泻 对象消耗的食品或基于麦芽的饮料的方法。特别地，本发明涉及生产具有低 水 平 大麦 醇溶蛋白的食品或者基于麦芽的饮料的方法。本发明还提供了产生可用于本发明方法中的谷粒的大麦 植物 。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种生产食品或者基于麦芽的饮料的方法，所述方法包括将大麦谷粒或者从所述谷粒生产的麦芽、面粉或者全麦面粉与至少一种其它食品或者饮料成分混合，从而生产所述食品或者基于麦芽的饮料， |
||||||
| 说明书全文 | 具有低水平大麦醇溶蛋白的大麦发明领域 [0001] 本发明涉及生产适于乳糜泻对象消耗的食品或者基于麦芽的饮料的方法。本发明特别涉及生产具有低水平大麦醇溶蛋白的食品或者基于麦芽的饮料的方法。本发明还提供 了产生可用于本发明方法中的谷粒的大麦植物。 [0002] 发明背景 [0003] 乳糜泻(CD)是小肠的由T细胞介导的自身免疫疾病，其在易感个体中通过摄取来自小麦(由麦谷蛋白和麦醇溶蛋白组成的谷蛋白)、大麦(大麦醇溶蛋白)或者黑麦(裸 麦醇溶蛋白)的统称为谷醇溶蛋白的特定贮藏蛋白而触发。燕麦谷醇溶蛋白(燕麦蛋白) 看起来被大多数乳糜泻对象耐受(Hogberg etal.，2004；Peraaho et al.，2004a)，但是 在少数乳糜泻对象中可诱导阳性反应(Lundin et al.2003；Peraaho et al.2004b)。CD 在至少澳洲、北美洲和南美洲、欧洲、非洲和印度的大约0.25-1％人群中发生(Hovell et al.2001；Fasano et al.2003；Treem 2004)，但是这个疾病可能经常未被诊断。随着对于 未治疗的CD的症状和后果的了解逐渐增多，使得在澳洲CD的诊断率每年增加15％。大约 1/4的高加索人和西亚人携带HLA-DQ8或者-DQ2等位基因，其是CD的必需但非足够的决 定簇(Treem 2004)。然而，具有这些等位基因的人只有大约1/20的人发生CD。目前唯一 的治疗方法是完全避免小麦、大麦和黑麦，因为每天消耗少如10mg的谷蛋白也可触发复发 (Biagi et al.，2004)。 [0004] 如果未诊断或者未治疗，CD具有严重的健康后果，可以危及生命，特别是在婴幼儿中。CD导致小肠吸收绒毛变形且可以导致绒毛破坏。结果营养物质吸收不良，这与体重 减轻、疲乏、矿物质缺乏、皮炎和夜视力丧失以及剧烈的肠道不适相关，所述肠道不适一般 包括腹胀、腹泻和腹部绞痛。未治疗的CD对象发生癌症的危险增加，如小肠癌的危险增加 10倍，非霍奇金淋巴瘤的危险增加3-6倍，小肠T细胞淋巴瘤的危险增加28倍。CD对象也 表现出1型糖尿病危险增加3倍(Peters et al.2003；Peters et al.2003；Verkarre et al.2004)。在乳糜泻患者中已报道精神抑郁的迹象增加5倍 (Pynnonen et al.2004)。 [0005] 乳糜泻的分子机制目前已经充分了解(Sollid 2002；Hadjivassiliou etal.2004)，这是对谷醇溶蛋白中特异性氨基酸序列的反应。消化不良的谷醇溶蛋白肽富含 脯氨酸和谷氨酰胺，符合由肠粘膜中人组织反式谷氨酰胺酶(tTG)靶向的底物基序，使得 关键的谷氨酰胺残基脱酰胺化。所得负电荷的谷氨酸使得脱酰胺的谷醇溶蛋白结合特殊类 别的HLA分子(DQ2或者DQ8)(Kim et al.2004)。靶向肠道内皮的特异性T-细胞克隆即所 谓的DQ2(8)/CD4+限制的T细胞被刺激增殖，释放使得绒毛萎缩或者抗体产生的淋巴因子 (Hadjivassiliou et al.2004)。在饮食攻击之后大约第6天这些T细胞克隆在乳糜泻对象 外周血中达到最大浓度(Anderson et al.2000)。因此纯化的蛋白质的腹腔毒性(coeliac toxicity)可以通过测量其刺激T细胞产生IFN-γ的能力而灵敏且特异地确定，IFN-γ是 导致在乳糜泻中所见肠病发病的基础细胞因子。因此这个疾病看起来是由于宿主免疫系统 与谷醇溶蛋白反应而引起，就像其是入侵的病原体而发起强免疫应答，而非变态反应。 [0006] 小麦谷蛋白由几百个不同但相关的蛋白质组成，包括单体麦醇溶蛋白和聚合的麦谷蛋白。麦醇溶蛋白占大约一半的谷蛋白级分，α-麦醇溶蛋白组成50％以上的麦醇溶蛋 白(Wieser et al.，1994；Gellrich et al.，2003)。迄今为止大部分腹腔毒性数据集中于 α-麦醇溶蛋白，这是第一个被克隆和充分测序的谷醇溶蛋白(Kasarda et al.1984)。小 麦α-麦醇溶蛋白的腹腔毒性主要由位于关键的17氨基酸表位中的一个谷氨酰胺残基决 定(Arentz-Hansen et al.2000；Anderson et al.2000；Shan et al.2002)。已经鉴别在 这个区域具有点突变的天然发生的肽及合成的肽是无毒性的(Vader et al.2003)。因此， 看来可能可以鉴别其它非毒性但是具有功能的谷醇溶蛋白分子。目前对于腹腔毒性的可用 预测限于小部分谷醇溶蛋白，已经鉴定了其氨基酸序列或者编码其的基因的核苷酸序列。 [0007] 大麦是二倍体谷物，广泛生长于寒冷气候环境中，用以制作食品和饮料。大麦种子蛋白根据其分别在水、盐溶液、醇水溶液以及碱性或酸性溶液中的溶解度被分为白蛋白、球 蛋白、谷醇溶蛋白(大麦醇溶蛋白)和谷蛋白。发现几乎一半的大麦种子贮藏蛋白是谷醇 溶蛋白。这些谷醇溶蛋白主要是储备蛋白，作为发芽之后生长和发育所需的碳、氮或硫的来 源。大麦醇溶蛋白组成种子蛋白的大约40％，但是依赖于生长期间植物的氮供应。已经 鉴 定了编码大麦谷醇溶蛋白的基因座，主要是因为其有助于大麦麦芽制造质量及在啤酒生产 中的泡沫形成和混浊。在大麦中有四类谷醇溶蛋白，即分别由染色体1H上的Hor2、Hor1、 Hor3和Hor5基因座编码的B、C、D和γ-大麦醇溶蛋白(Shewry et al.1999)。这些基因 座编码从单个谷醇溶蛋白(例如D大麦醇溶蛋白)至含有20-30个成员的蛋白质家族(例 如B和C大麦醇溶蛋白)不等的蛋白质。B和C大麦醇溶蛋白相对更丰富，分别包含大约 70％和24％的总大麦醇溶蛋白。D和γ-大麦醇溶蛋白以均为大约2-4％的较少量存在。 大麦醇溶蛋白的分子量为大约35kDa-100kDa。没有与小麦α-麦醇溶蛋白密切同源的大麦 谷醇溶蛋白，然而普遍认为大麦醇溶蛋白具有腹腔毒性(Williamson & Marsh 2000)。目前 还未报道大麦的各个大麦醇溶蛋白诱导CD的程度。 [0008] 啤酒是由发芽的大麦制成的广泛消耗的产品，因此普遍认为其不适于乳糜泻对象且一般排除于其日常饮食之外。Kanerva et al.(2005)在除了一些之外的所有啤酒中均能 鉴别出低水平谷醇溶蛋白。医生和营养学家通常要求其CD患者坚持不懈地避免任何含有 小麦、大麦或者黑麦的产品，包括啤酒。在美国，FDA定义“无谷蛋白”要求所述产品由无谷 蛋白原材料制成，即不含有任何小麦、大麦或者黑麦。Codex Alimentarius允许具有“无谷 蛋白”标记的食品含有不超过200ppm谷蛋白(0.2g/kg或者0.2g/L)，这也是欧洲“无谷蛋 白”标准。大多数乳糜泻对象可耐受直至大约10mg谷蛋白/天，而无明显影响(Thompson， 2001)。 [0009] 谷醇溶蛋白对于乳糜泻患者的毒性可以通过使用如ELISA等免疫测定法特异性检测(Ellis et al.，1990；Sorell et al.，1998)。这些测定法依赖于蛋白质与抗体之间 的特异性相互作用。也可以使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和 HPLC(Kanerva et al.，2005；Marchylo et al.，1986；Sheehan and Skerritt，1997)。 [0010] 因此需要这样的大麦，其诱导CD的大麦醇溶蛋白水平明显降低，可以用于CD易感人群的食品和饮料中。 [0011] 发明概述 [0013] 同时先前已经鉴别了产生降低水平的某些类别大麦醇溶蛋白的各种大麦突变体，也已经观测到这类突变体至少通过其它类别大麦醇溶蛋白的产生增加而补偿。这提示大麦 种子具有补偿机制，以保证为种子存活所需的一定水平的大麦醇溶蛋白。令人惊奇地，本发 明人已经确定可以消除大多数(如果不是全部)大麦醇溶蛋白产生，且获得在田间能萌发 及产生大麦植物的存活种子，尽管种子中大多数贮藏形式的氮丧失。这些种子可特别用于 产生供乳糜泻对象消耗的食品和饮料。 [0014] 因此，本发明一方面提供了生产食品或者基于麦芽的饮料的方法，所述方法包括将大麦谷粒或者从所述谷粒中产生的麦芽、面粉或者全麦面粉(wholemeal)与至少一种其 它食品或者饮料成分混合，其中所述谷粒、麦芽、面粉或者全麦面粉与相应野生型大麦植物 的谷粒或者以相同方式从相应野生型大麦植物的谷粒中产生的麦芽、面粉或者全麦面粉相 比包含大约25％或更低水平的大麦醇溶蛋白，从而生产所述食品或者基于麦芽的饮料。 [0015] 优选所述谷粒、麦芽、面粉或者全麦面粉与相应野生型大麦植物的谷粒或者以相同方式产生的野生型麦芽、面粉或者全麦面粉相比包含大约15％或更低、大约10％或更 低、大约7.5％或更低、大约5％或更低、或者更优选大约2.5％或更低水平的大麦醇溶蛋 白。 [0016] 野生型大麦植物的实例包括但不限于Bomi、Sloop、Carlsberg II、K8或L1。 [0017] 在另一个实施方案中，所述谷粒与相应野生型大麦植物的谷粒相比包含大约25％或更低、大约20％或更低、大约15％或更低、大约10％或更低、大约7.5％或更低、大约5％ 或更低或者更优选大约2.5％或更低水平的B、C和/或D大麦醇溶蛋白或者其任意组合。 所述麦芽、面粉或者全麦面粉在B、C和/或D大麦醇溶蛋白或者其任意组合的水平中可包 含相同程度的降低。 [0018] 在另一个实施方案中，所述面粉包含低于大约0.4％、低于大约0.3％、低于大约0.2％及更优选低于大约0.1％的大麦醇溶蛋白。从所述谷粒生产的面粉中的大麦醇溶蛋白 水平可以通过本领域技术人员已知的任何技术如醇分级分离技术确定。 [0019] 在一个实施方案中，所述谷粒的平均重量(100个谷粒重量)是至少大约2.4g。优选所述谷粒的平均重量是大约2.4g至大约6g，更优选平均重量是 大约3.5g至大约6g。 [0020] 在另一个实施方案中，所述谷粒的淀粉含量是至少大约50％(w/w)。更优选所述谷粒的淀粉含量是大约50％至大约70％(w/w)。淀粉含量可以通过使用本领域已知的任何 技术确定。例如可以使用实施例4中提供的方法。 [0021] 在再一个实施方案中，从所述谷粒生产的面粉的腹腔毒性低于从相应野生型大麦植物谷粒生产的面粉的相应毒性的大约50％、大约25％、更优选是大约10％或更低。所述 腹腔毒性可以通过使用本领域已知的任何技术确定。例如，可以使用实施例1中提供的方 法。 [0022] 在另一个实施方案中，所述谷粒产生的麦芽包含低于大约200ppm大麦醇溶蛋白、低于大约125ppm大麦醇溶蛋白，更优选低于大约75ppm大麦醇溶蛋白。大麦醇溶蛋白含量 也可以通过使用本领域已知的任何技术确定。例如，可以使用实施例7中提供的方法。 [0023] 在另一个实施方案中，大麦谷粒的至少大约50％的基因组与大麦栽培种Sloop的基因组相同。 [0024] 优选所述谷粒来自这样的植物，其对于导致与相应野生型大麦植物相比B、C和D类别的至少一个、至少两个或者所有三个类别大麦醇溶蛋白水平降低的一或多个遗传变异 的至少一个、至少两个、至少三个或者更多个基因座是纯合的。更优选这些遗传变异是缺失 在Hor2基因座的大多数或者所有B-大麦醇溶蛋白编码基因的等位基因和/或在大麦Lys3 基因座的突变等位基因。 [0025] 在一个实施方案中，所述谷粒来自非转基因植物。例如所述谷粒可以来自Riso 56与Riso 1508之间的杂交植物或者其分别包含存在于这些亲本品系中的hor2和lys3突变 的后代。优选这种后代植物包含与Riso 56或者Riso 1508明显不同的遗传背景，例如包 含这些亲本品系的大约25％以下的遗传背景。 [0026] 在另一个实施方案中，所述谷粒来自转基因植物。 [0027] 转基因植物的一个实施方案是包含转基因的植物，所述转基因编码下调谷粒中至少一种大麦醇溶蛋白的产生的多核苷酸。优选这个实施方案的多核苷酸是反义多核苷酸、 有义多核苷酸、催化性多核苷酸、人工微小RNA或者双链体RNA分子，其下调编码大麦醇溶 蛋白的一个或者优选多个基因的表达。 [0028] 转基因植物的另一实施方案是包含转基因的植物，所述转基因编码对于乳糜泻对象低毒性或者优选无毒性的谷醇溶蛋白。对于乳糜泻对象无毒性的谷醇溶蛋白的实例包括 但不限于燕麦蛋白和玉米醇溶蛋白。 [0029] 在一个实施方案中，所述方法包括从所述谷粒生产面粉或者全麦面粉。 [0030] 在一个特别优选的实施方案中，所述方法进一步包括从所述谷粒中生产麦芽。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将干燥的发芽谷粒分级分离成胚乳级分、内皮层级 分、外壳级分、初生叶级分和麦芽小根级分的两或多种；以及组合及混合预定量的两或多种 这些级分。 [0031] 对于生产麦芽和啤酒，大麦种子的重要成分是淀粉。然而，先前已经示出大麦醇溶蛋白水平降低的大麦突变体中淀粉水平也降低，预期该植物种子不适于生产麦芽和啤酒。 本发明人令人惊奇地发现在已经除去大部分(如果不是全部)大麦醇溶蛋白产生的大麦种 子可用于生产具有适于商业生产特性的麦芽和啤酒。因此在一个特别优选的实施方案中， 基于麦芽的饮料是啤酒或者威士忌，所述方法包括使所述谷粒发芽。 [0032] 在一个实施方案中，所述基于麦芽的饮料是啤酒，其包含至少大约2％、更优选至少大约4％的醇。优选所述醇是乙醇。 [0033] 在再一个实施方案中，基于麦芽的饮料是啤酒，其包含低于大约1ppm大麦醇溶蛋白。 [0034] 在再一个实施方案中，至少大约50％的谷粒在用于麦芽制造的典型麦芽条件下在吸涨之后3天内发芽。 [0035] 使用本发明的方法可以生产的食品的例子包括但不限于面粉、淀粉、发酵或未发酵面包、意大利面(pasta)、面条、动物饲料、早餐谷物、零食、蛋糕、麦芽、点心(pastry)或 者含有基于面粉的调味品的食品。 [0036] 优选所述食品或者基于麦芽的饮料是供人消耗的。在另一个优选的实施方案中，在消耗所述食品或者饮料之后，乳糜泻对象的至少一种乳糜泻症状不发生。 [0037] 另一方面，本发明提供了生产食品或者基于麦芽的饮料的方法，所述方法包括将包含一或多种大麦谷粒蛋白和低于大约200ppm大麦醇溶蛋白的麦芽和/或包含一或多种 大麦谷物蛋白和低于大约0.4％大麦醇溶蛋白的面粉与至少一种其它食品或者饮料成分混 合，从而生产所述食品或者基于麦芽的饮料。 [0038] 在一个实施方案中，所述方法包括获得所述麦芽和/或面粉。 [0039] 另一方面，本发明提供了生产食品或者基于麦芽的饮料的方法，所述方法包括将大麦谷粒或者从所述谷粒中产生的麦芽、面粉或者全麦面粉与至少一种其它食品或者饮料 成分混合，从而生产食品或者基于麦芽的饮料，其中从所述谷粒生产的面粉包含低于大约 0.4％大麦醇溶蛋白，和/或从所述谷粒生产的麦芽包含低于大约200ppm大麦醇溶蛋白。 [0040] 在一个实施方案中，所述方法包括获得所述麦芽和/或面粉。 [0041] 另一方面，本发明提供了大麦植物，其产生与相应野生型大麦植物谷粒相比包含大约25％或更低水平大麦醇溶蛋白的谷粒。 [0042] 优选所述谷粒与相应野生型大麦植物谷粒相比包含大约15％或更低、大约10％或更低、大约7.5％或更低、大约5％或更低或者更优选大约2.5％或更低水平的大麦醇溶 蛋白。 [0043] 野生型大麦植物的例子包括但不限于Bomi、Sloop、Carlsberg II、K8或者L1。 [0044] 在另一个实施方案中，所述谷粒与相应野生型大麦植物谷粒相比包含大约25％或更低、大约20％或更低、大约15％或更低、大约10％或更低、大约7.5％或更低、大约5％或 更低或者更优选大约2.5％或更低水平的B、C和/或D大麦醇溶蛋白或者其任意组合。 [0045] 在另一个实施方案中，从所述谷粒中产生的面粉包含低于大约0.4％、低于大约0.3％、低于大约0.2％及更优选低于大约0.1％大麦醇溶蛋白。 [0046] 在一个实施方案中，所述谷粒的平均重量(100个谷粒重量)是至少大约2.4g。优选所述谷粒的平均重量是大约2.4g至大约6g，更优选平均重量是大约3.5g至大约6g。 [0047] 在另一个实施方案中，所述谷粒的淀粉含量是至少大约50％(w/w)。更优选所述谷粒的淀粉含量是大约50％至大约70％(w/w)。 [0048] 在再一个实施方案中，从所述谷粒生产的面粉的腹腔毒性低于相应野生型大麦植物谷粒生产的面粉的相应毒性的大约50％、大约25％、更优选是大约10％或更低。 [0049] 在另一个实施方案中，从所述谷粒生产的麦芽包含低于大约200ppm大麦醇溶蛋白、低于大约125ppm大麦醇溶蛋白、更优选低于大约75ppm大麦醇溶蛋白。 [0050] 在另一个实施方案中，所述大麦谷粒的至少大约50％的基因组与大麦栽培种Sloop的基因组相同。 [0051] 优选所述谷粒来自这样的植物，其对于导致与相应野生型大麦植物相比B、C和D类别的至少一个、至少两个或者所有三个类别的大麦醇溶蛋白水平降低的一或多个遗传变 异的至少一个、至少两个、至少三个或者更多个基因座是纯合的。 [0052] 在一个实施方案中，所述谷粒来自非转基因植物。例如所述谷粒可以来自Riso 56与Riso 1508之间的杂交植物或者其包含分别存在于这些亲本品系中的hor2和lys3突变 的后代。优选这种谷粒包含与Riso 56或者Riso1508明显不同的遗传背景，例如包含大约 25％以下的这些亲本品系的遗传背景。 [0053] 在另一个实施方案中，所述谷粒来自转基因植物。 [0054] 转基因植物的一个实施方案是包含转基因的植物，所述转基因编码下调谷粒中至少一种大麦醇溶蛋白的产生的多核苷酸。优选这个实施方案的多核苷酸是反义多核苷酸、 有义多核苷酸、催化性多核苷酸、人工微小RNA或者双链体RNA分子，其下调编码大麦醇溶 蛋白的一个或者优选多个基因的表达。 [0055] 转基因植物的另一实施方案是包含转基因的植物，所述转基因编码对于乳糜泻对象低毒性、优选无毒性的谷醇溶蛋白。对于乳糜泻对象无毒性的谷醇溶蛋白的实例包括但 不限于燕麦蛋白。 [0056] 在再一个实施方案中，在用于麦芽制造的典型条件下至少大约50％谷粒在吸涨之后3天内发芽。 [0057] 另一方面，本发明提供了产生谷粒的大麦植物，其中从所述谷粒生产的面粉包含低于大约0.4％大麦醇溶蛋白，和/或从所述谷粒生产的麦芽包含低于大约200ppm大麦醇 溶蛋白。 [0058] 另一方面，本发明提供了本发明大麦植物的谷粒。 [0059] 再一方面，本发明提供了产生大麦谷粒的方法，所述方法包括： [0060] a)使本发明的大麦植物生长， [0061] b)收获谷粒， [0062] c)任选加工所述谷粒。 [0063] 优选使所述植物以商业规模在田间生长。例如在一个实施方案中，所 述方法包括使至少1,000株、更优选至少5,000株植物在至少1公顷的田间生长。 [0064] 本发明还提供了生产得自谷粒的面粉、全麦面粉、淀粉或者其它产品的方法，所述方法包括： [0065] a)获得本发明的谷粒， [0066] b)加工所述谷粒，生产所述面粉、全麦面粉、淀粉或者其它产品。 [0067] 再一方面，本发明提供了从本发明的大麦植物或者本发明的谷粒中生产的产品。 [0068] 在一个实施方案中，所述产品是食品或者基于麦芽的饮料产品。 [0069] 优选基于麦芽的饮料产品是啤酒或者威士忌。 [0071] 另一方面，本发明提供了使用本发明方法生产的食品或者基于麦芽的饮料。 [0072] 在一个实施方案中，基于麦芽的饮料是啤酒，其包含至少大约2％、更优选至少大约4％的醇。优选所述醇是乙醇。 [0073] 在再一个实施方案中，基于麦芽的饮料是啤酒，其包含低于大约1ppm大麦醇溶蛋白。 [0074] 另一方面，本发明提供了啤酒，其包含一或多种大麦谷物蛋白和低于大约1ppm大麦醇溶蛋白。在一个实施方案中，所述啤酒具有低于大约.05ppm的大麦醇溶蛋白。 [0075] 优选所述啤酒包含至少大约2％、更优选至少大约4％的醇。优选所述醇是乙醇。 [0076] 举例的大麦谷物蛋白包括但不限于9kDa脂质大麦蛋白1(LTP1)和蛋白Z。 [0077] 另一方面，本发明提供了包含一或多种大麦谷物蛋白和低于大约0.4％大麦醇溶蛋白的面粉。 [0078] 在一个实施方案中，所述面粉包含低于大约0.3％、低于大约0.2％及更优选低于大约0.1％的大麦醇溶蛋白。 [0079] 优选所述面粉包含低于大约7mg、更优选低于大约5mg的醇溶蛋白/g 干重面粉。 [0080] 另一方面，本发明提供了包含一或多种大麦谷物蛋白和低于大约200ppm大麦醇溶蛋白的麦芽。 [0081] 在一个实施方案中，所述麦芽包含低于大约125ppm大麦醇溶蛋白，更优选低于大约75ppm大麦醇溶蛋白。 [0082] 再一方面，本发明提供了鉴别大麦谷粒的方法，所述谷粒可用于生产供乳糜泻对象消耗的食品和/或基于麦芽的饮料，所述方法包括： [0083] a)获得一或多种如下材料： [0084] i)能产生所述谷粒的植物样品， [0085] ii)谷粒 [0086] iii)从所述谷粒生产的麦芽，和/或 [0087] iv)所述谷粒的提取物； [0088] b)分析步骤a)的材料的至少一种大麦醇溶蛋白和/或至少一种编码大麦醇溶蛋白的基因， [0089] 其中所述谷粒产生的大麦醇溶蛋白的量越多，则该谷粒越不适于产生供乳糜泻对象消耗的食品和/或基于麦芽的饮料。 [0090] 在一个实施方案中，所述样品是谷粒且步骤b)包括分析所述材料的B和/或C大麦醇溶蛋白。这可以使用本领域已知的任何技术进行，例如使用免疫学方法如ELISA测定 法进行。可以使用实施例1中所述方法。在一个实施方案中，步骤b)包括给乳糜泻对象口 服施用步骤a)的材料并确定得自该对象的T细胞对于一或多种大麦醇溶蛋白的免疫反应 性。 [0091] 在另一个实施方案中，步骤a)的样品材料包含基因组DNA且步骤b)包括检测一或多个功能性大麦醇溶蛋白基因的不存在。同样，这可以使用本领域已知的任何技术进行。 例如进行如实施例9所述基因扩增步骤。 [0092] 在一个实施方案中，所述方法包括从多个植物、谷粒或者麦芽中选择本发明的用以繁殖或使用的大麦植物、谷粒或者麦芽的步骤。这种选择直接或者间接基于所述材料的 降低的腹腔毒性。 [0093] 再一方面，本发明提供了防止或者降低乳糜泻对象的发病率或严重性的方法，所述方法包括给所述对象口服施用本发明的食品或者基于麦芽的饮料或者本发明的谷粒。在 这种情形中疾病的发生率或者严重性降低应理解为是相对于施用等量的从野生型大麦制 备的食品或饮料而降低。所述食 品或饮料可用于为乳糜泻对象提供营养物质或者增加量 的营养物质，同时减轻触发疾病症状的危险。 [0094] 另一方面，本发明提供了本发明的食品或者基于麦芽的饮料或者本发明的谷粒在生产药物中的应用，所述药物口服施用给对象同时防止或者降低乳糜泻的发生率或严重 性。 [0095] 显然本发明一个方面的优选特征和特性可应用于本发明的任何其它方面。 [0098] 附图简述 [0099] 图1：总谷醇溶蛋白提取物的反相FPLC，示出来自小麦(a)、大麦(b)、燕麦(c)、玉米(d)或者空白梯度(e)的A280nm层析图。加样等价于0.2g面粉的谷醇溶蛋白。图中示 出氧化的DTT(DTTox)；对层析图进行补偿(offset)以更清晰。 [0100] 图2：大麦醇溶蛋白的反相FPLC。示出从大麦提取物中分离大麦醇溶蛋白级分1(#1)、2(#2)、3(#3)、4(#4)、5(#5)或者6(#6)期间A280nm(实线)和溶剂成分(虚线)的 代表性层析图。如图所示(粗线)从相继的注射中集合指定级分。 [0101] 图3：通过SDS-PAGE使用0.06％考马斯蓝G250染色凝胶分析20μg的大麦醇溶蛋白级分#1-6。分子量标准(kDa，BenchMark，Invitrogen)的位置在左侧泳道中示出。 [0102] 图4：在存在(●，n＝21)或者不存在(○，n＝13)tTG预处理的条件下在饮食攻击之后6天分离自乳糜泻对象(coeliacs)的T细胞中IFN-γ产生的刺激，所述饮食攻 击是用从大麦、小麦、燕麦或者玉米中制备的总谷醇溶蛋白进行。计数IFN-γ阳性集落并 以平均SFU±S.E表示。当S.E.小于符号(symbol)时，误差棒(Error bar)未示出。 [0103] 图5：在存在(●，n＝21)或者不存在(○，n＝13)tTG预处理的条件下在饮食攻击之后6天分离自乳糜泻对象的T细胞中IFN-γ产生的刺激，所述饮食 攻击是用大麦 醇溶蛋白级分#1、2、3、4、5和6进行。计数IFN-γ阳性集落并以平均SFU±S.E表示。当 S.E.小于符号时，误差棒未示出。 [0104] 图6：分离的大麦醇溶蛋白级分的反相HPLC层析图分析。代表性的层析图示出在纯化自大麦的大麦醇溶蛋白级分#1、2、3、4、5、6的HPLC期间的A280nm。为了进行对比，示 出野生型大麦(Himalaya)层析图，示出D、C和B大麦醇溶蛋白以及主要积累C大麦醇溶蛋 白的突变体R56的洗脱(实线)。 [0105] 图7：通过SDS-PAGE和western印迹鉴定Riso56和Riso1508中的谷醇溶蛋白。将来自指定大麦品系的如实施例1所述纯化的20μg谷醇溶蛋白在含有6.6M尿素、2％(w/ v)SDS、1％(w/v)DTT、62.5mM Tris-HCl(pH 6.8)和0.01％(w/v)溴酚蓝的缓冲液中在室 温保温30分钟并加样于一式两份12％丙烯酰胺凝胶上，在200V电泳40分钟。将凝胶在 含有192mM甘氨酸、25mMTris-base和20％(v/v)甲醇的转移缓冲液中漂洗10分钟，转移 至硝基纤维素(Amersham Hybond C+)，在100V维持1小时。左侧膜在于3％(w/v)三氯乙 酸、3％5-磺基水杨酸中的0.2％(w/v)Ponceau S中染色，并且在水中短暂脱色；右侧膜在 于PBST中的5％脱脂乳中封闭1小时，然后与在PBST中的小鼠单克隆抗体12224(Skerrit， 1988)保温，在PBST中洗涤3次、每次10分钟，与在PBST中的绵羊抗小鼠-HRP(Selenius) 保温，在PBST中洗涤3次、每次5分钟，与Amersham ECL试剂根据厂商指导保温，并在 AmershamHyperfilm上曝光。产生针对总谷蛋白提取物的MAb 12224，检测所有大麦醇溶蛋 白和谷醇溶蛋白(Skerrit，1988)。 [0106] 图8：与野生型Bomi和Carlsberg II对比，在Riso56和Riso1508中大麦醇溶蛋白提取物的反相FPLC。如实施例1所述，大麦醇溶蛋白纯化自指定品系，将等价于0.2g面 粉的量注射在FPLC柱中，使用实施例所述第一种FPLC方法。图中示出C-大麦醇溶蛋白 (C-Hor)和B-大麦醇溶蛋白(B-Hor)的洗脱时间。 [0107] 图9：在每个种子基础上加样的醇溶蛋白的代表性SDS-PAGE。如上述从Riso1508与Riso56的杂交植物的各个F2大麦种子中提取谷醇溶蛋白提取物(10μl)。在左侧泳道 示出30、50、70和100kDa的蛋白质标准的位置。图中也示出亲本品系Riso1508和Riso56 以及野生型(Bomi)的蛋白质谱(profile)。推定的双无效(double null)的6个泳道含有 极少的蛋白质(无 效(null))，其它6个泳道含有水平降低很多的蛋白质(降低)。 [0108] 图10：在等蛋白质基础上加样的醇溶蛋白的代表性SDS-PAGE。对含有从各个F2大麦种子提取的20μg醇溶蛋白的样品进行电泳，用考马斯蓝进行凝胶染色。对亲本品系 (Riso 1508和Riso 56)和野生型(Bomi)样品也进行电泳。最外侧和中心泳道(10kDa)含 有已知分子量的蛋白质标准，图中示出30、50、70和100kDa条带位置。 [0109] 图11：来自F3大麦种子的醇溶提取物的RP-FPLC层析图。如所述从各个F3种子中提取醇溶蛋白，组合每个品系两个种子的上清，将50μl注射进反相FPLC柱中并如实施 例1所述洗脱。 [0110] 图12：如实施例4所述确定来自品系J4、J1、BB5、G1、5RB植物的野生型大麦(Sloop，Carlsberg II，Bomi)、单无效亲本(Riso 56，Riso 1508)和F4种子的一式两份面 粉样品中水溶性(A)、盐溶性(B)、醇溶性(C)和尿素溶性(D)蛋白质的含量。总可提取蛋 白质(E)含量通过各个级分含量总和确定。总蛋白质含量也可根据Dumas方法通过元素分 析而估算(F)。蛋白质含量以平均值±SE表示。 [0111] 图13：如实施例5所述，使用在攻击之后6天分离自乳糜泻对象的T细胞确定从各个面粉样品中纯化的大麦醇溶蛋白的腹腔毒性，平均斑点形成单位(spot forming unit， SFU)±SE对面粉鲜重绘图。为清楚起见，仅示出在存在(+tTG)或者不存在(-tTG)组织转 谷氨酰胺酶的条件下从野生型大麦(Sloop)或者双无效品系(G1)中纯化的大麦醇溶蛋白 的平均SFU(A)。在所有情况中用tTG处理正如预期地增加了大麦醇溶蛋白对于乳糜泻的毒 性。也示出了tTG处理的纯化自野生型大麦(Sloop)、单无效亲本(R56，R1508)和F4种子 (4BH)的面粉样品的大麦醇溶蛋白(B)的SFU。 [0112] 图14：如实施例9所述从品系9RE、4BH或者亲本品系R56的各个F4秧苗的DNA提取物中扩增了特异于对照基因(γ3-Hor)或者B-大麦醇溶蛋白基因(B-Hor)的基因序 列。 [0113] 发明详述 [0114] 一般技术和定义 [0116] 除非特别指出，本发明中使用的重组蛋白质、细胞培养以及免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。这种技术在例如以下文献中描述和解释：J.Perbal， A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(editor)，EssentialMolecular Biology：A Practical Approach，Volumes 1and 2，IRL Press(1991)，D.M.Glover and B.D.Hames(editors)， DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press(1995and 1996)， 和 F.M.Ausubel et al.，(editors)，Current Protocols in Molecular Biology， Greene Pub.Associates andWiley-Interscience(1988，including all updates until present)，Ed Harlow andDavid Lane(editors)Antibodies：A Laboratory Manual， Cold Spring HarbourLaboratory，(1988)，和J.E.Coligan et al.，(editors)Current Protocols inImmunology，John Wiley & Sons(包括迄今为止的所有更新材料)。 [0117] 如本文所用，术语“大麦”是指大麦属(Hordeum)的任何物种，包括其祖先以及其通过与其它物种植物杂交产生的后代。优选的大麦是Hordeumvulgare种。 [0118] 乳糜泻是小肠的自身免疫疾病，在早期婴儿期(early infancy)之后的所有年龄组具有遗传倾向个体中发生。其影响大约1％的印欧人群，但是其处于明显诊断不足状态。 乳糜泻是与麦醇溶蛋白的反应而引起，这种蛋白质是在小麦发现的一种谷蛋白(以及包括 其它栽培种如大麦和黑麦的Triticeae的相似蛋白质)。在暴露于麦醇溶蛋白时，组织转谷 氨酰胺酶修饰该蛋白质，且免疫系统与肠组织交叉反应，导致炎症反应。这导致小肠绒毛扁 平，干扰营养物质的吸收。唯一有效的治疗是终生无谷蛋白饮食。这个病症有许多其它名 称，包括：乳糜泻(结扎(with ligature))，乳糜性口炎性腹泻，非热带口炎性腹泻，地方性 口炎性腹泻，谷蛋白肠病或者谷蛋白敏感性肠病，以及谷蛋白不耐受症。乳糜泻的症状每个 人各不相同。乳糜泻的症状可包括如下一或多个症状：排气、复发性腹部胃气胀和疼痛、慢 性腹泻、便秘、苍白、污秽气味、或脂肪便、体重减轻/体重增加、疲劳、无法解释的贫血(红 细胞计数低导致疲劳)、骨或关节痛、骨质疏松症、骨质减少、行为变化、腿麻木(来自神经 损害)、肌肉抽筋、发作(seizures)、 错过月经周期(通常因为体重过度降低)、不育、反复 流产、生长延迟、婴儿发育不正常、称为口疮性溃疡的口腔中苍白疡、牙齿变色或者牙釉质 脱失、以及称作疱疹样皮炎的瘙痒性皮疹。一些更常见的症状包括：疲倦，间歇性腹泻，腹痛 或痉挛，消化不良，肠胃胀气，腹胀，以及体重降低。乳糜泻可以如WO 01/025793所述进行 诊断。 [0119] 如本文所用，术语“对乳糜泻对象无毒性”是指消耗食品或者饮料后不引起患有所述疾病对象发生乳糜泻的症状。如本文所述，从相应野生型大麦植物生产的食品或者饮料 导致出现疾病症状。 [0120] 术语“种子”和“谷粒(grain)”在本文可互换使用。“谷粒”通常是指成熟的、收获的谷粒，但是也可以是指在如其中大多数谷粒保持完整的研磨或者抛光等加工后的谷粒， 或者是指在吸涨或发芽后的谷粒。成熟谷粒通常具有低于大约18-20％的含水量。野生型 大麦谷粒(整谷粒)一般含有9-12％蛋白质，其大约30-50％、典型地35％是谷醇溶蛋白， 因此野生型大麦谷粒具有大约3-4％重量的谷醇溶蛋白。谷醇溶蛋白几乎只在胚乳中发现， 其占大约70％的整谷粒重量。 [0121] 如本文所用，术语“相应野生型”大麦植物是指包含至少大约50％、更优选至少75％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少99％以及更优选99.5％的本发明植 物的基因型、但是产生具有未修饰的大麦醇溶蛋白水平的谷粒的植物。在一个实施方案中， “相应野生型”大麦植物是在植物育种试验中使用的栽培种，以导入遗传变异，从而使得所 述谷粒中大麦醇溶蛋白产生降低。在另一个实施方案中，“相应野生型”大麦植物是亲本栽 培种，在其中已经导入降低谷粒中大麦醇溶蛋白产生的转基因。在再一个实施方案中，“相 应野生型”大麦植物是于本申请之时用于商业生产大麦谷粒的栽培种，例如但不限于Bomi、 Sloop、Carlsberg II、K8、L1、Vlamingh、Stirling、Hamelin、Schooner、Baudin、Gairdner、 Buloke、WI3586-1747、WI3416、Flagship、Cowabbie、Franklin、SloopSA、SloopVic、Quasar、 VB9104、Grimmett、Cameo*Arupo 31-04、Prior、Schooner、Unicorn、Harrington、Torrens、 Galleon、Morex、Dhow、Capstan、Fleet、Keel、Maritime、Yarra、Dash、Doolup、Fitzgerald、 Molloy、Mundah、Onslow、Skiff、Unicorn、Yagan、Chebec、Hindmarsh、Chariot、Diamant、 Korál、Rubín、Bonus、Zenit、Akcent、Forum、Amulet、Tolar、Heris、Maresi、Landora、 Caruso、Miralix、Wikingett Brise、Caruso、Potter、Pasadena、Annabell、Maud、Extract、 Saloon、Prestige、Astoria、Elo、Cork、Extract、Laura。在一个实施方案中，“相应野生型” 大麦植物产生具有未修饰的大麦醇溶蛋白水平的谷粒，因为其包含编码功能性大麦醇溶蛋 白的功能性大麦醇溶蛋白基因的完全互补物，包括由Hor2、Hor1、Hor3和Hor5基因座编码 的B、C、D和γ-大麦醇溶蛋白。 [0122] 如本文所用，术语“一或多种大麦谷物蛋白”是指由大麦谷粒产生的天然发生的蛋白质。这种蛋白质的实例为本领域技术人员已知。具体的实例包括但不限于大麦白蛋白 如9kDa脂质转移蛋白1(LTP1)(见Douliez et al.(2000)综述及Swiss-prot Accession No.P07597)和蛋白质Z(见Brandt et al.(1990)和Genbank Accession No.P06293)，包 括其加工(成熟)形式以及由于产生本发明的麦芽、面粉、全麦面粉、食品或者具有麦芽的 饮料而产生的其变性形式和/或其片段。 [0123] 如本文所用，术语“麦芽”是指大麦麦芽，“面粉”是指大麦面粉，“全麦面粉”是指大麦全麦面粉，“啤酒”是指大麦啤酒。更特别地，本发明的麦芽、面粉、啤酒、全麦面粉、食品 等的来源来自大麦谷粒的加工(例如研磨和/或发酵)。这些术语包括从谷粒混合物中产 生的麦芽、面粉、啤酒、全麦面粉、食品等。在优选的实施方案中，用于产生麦芽、面粉、啤酒、 全麦面粉、食品等的至少50％的谷粒是大麦谷粒。 [0124] 如本文所用，术语“植物”作为名词是指完整植物，如用于商业化大麦生产的在田间生长的植物。“植物部分”是指植物营养结构(例如叶，茎)、根、花器官/结构、种子(包 括胚、胚乳和种皮)、植物组织(例如维管组织、基本组织等)、细胞、淀粉颗粒或其后代。 [0125] “转基因植物”、“遗传修饰的植物”或者其变化用语是指含有在相同物种、品种或者栽培种的野生型植物中未发现的基因构建体(转基因)的植物。“转基因”在本文具有与 生物技术领域相同的正常含义，包括已经通过重组DNA或RNA技术产生或者改变且已经导 入植物细胞中的遗传序列。所述转基因可包括衍生自植物细胞的遗传序列。典型地，所述 转基因已经通过人工操纵例如转化但是也可以使用本领域技术人员公认的任何方法而被 导入植物中。 [0126] “核酸分子”是指多核苷酸，例如DNA、RNA或者寡核苷酸。其可以是源于基因组或者合成的、双链或单链的、以及组合碳水化合物、脂质、 蛋白质或者其它材料以进行本文指 定活性的DNA或者RNA。 [0127] 如本文所用，“可操纵地连接”是指两或多个核酸(如DNA)节段之间的功能联系。典型地，其是指转录调节元件(启动子)与被转录序列之间的功能联系。例如，如果启动子 刺激或调节编码序列如本文限定的多核苷酸在适当细胞中的转录，则该启动子与所述编码 序列是可操纵地连接的。通常，与被转录序列可操纵地连接的启动子转录调节元件与被转 录序列是物理性连续的，即其是顺式作用的。然而，一些转录调节元件如增强子不需要与其 转录被所述增强子增强的编码序列物理性连续或者紧密相邻。 [0128] 如本文所用，术语“基因”取其最广泛的含义，包括脱氧核糖核苷酸序列，所述脱氧核糖核苷酸序列包含结构基因的蛋白质编码区及包括位于5’和3’末端(与每一端距离至 少大约2kb)与编码区邻近且参与所述基因的表达的序列。位于编码区5’且呈现于mRNA上 的序列被称作5’非翻译序列。位于编码区的3’或下游且呈现于mRNA上的序列被称作3’ 非翻译序列。术语“基因”包含cDNA以及基因的基因组形式。基因的基因组形式或者克隆 含有可以用称作“内含子”或者“间插区”或者“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内 含子是被转录为核RNA(hnRNA)的基因节段；内含子可含有调节元件如增强子。内含子从核 或者初级转录物中被除去或者“剪接掉(spliced out)”，因此在信使RNA(mRNA)转录物中 不存在内含子。mRNA在翻译期间发挥指定新生多肽中氨基酸序列或顺序的功能。术语“基 因”包括编码本发明所述所有或部分蛋白质的合成或融合分子以及上述任一的互补核苷酸 序列。 [0129] 如本文所用，术语“其它食品或者饮料成分”是指适于动物消耗的任何物质，优选适于人消耗的任何物质。例子包括但不限于水、其它植物谷粒、糖等。 [0130] 如本文所用，术语“导致至少一种大麦醇溶蛋白水平降低的遗传变异”是指降低大麦醇溶蛋白产生的大麦植物的任何多态性。所述遗传变异可以是例如缺失一或多种大麦醇 溶蛋白基因或者其部分，降低大麦基因转录的突变。这种遗传变异的实例存在于Riso 56、 Riso 527和Riso 1508中。因此，这种植物可用于本发明方法中。再者，本发明的植物可以 是任何这些大麦突变体之间的杂交植物。在优选的实施方案中，本发明的植物是Riso 56 与Riso 1508之间的杂交植物或者其包含存在于这些品系中的hor2和lys3突变 的后代。 在一个实施方案中，所述植物不是Riso 527与Riso 1508之间的杂交植物。 [0131] 如本文所用，除非相反指出，则短语“大约”是指根据所述数值的任何合理范围。在优选的实施方案中，术语“大约”是指指定数值的±10％，更优选±5％。 [0132] 谷醇溶蛋白和大麦醇溶蛋白 [0133] 谷类谷醇溶蛋白(在小麦中称作麦醇溶蛋白，在大麦中称作大麦醇溶蛋白，在黑麦中称作裸麦醇溶蛋白，在燕麦中称作燕麦蛋白，在玉米中称作玉米醇溶蛋白)是在除了 燕麦和水稻之外所有谷物谷粒中主要的胚乳贮藏蛋白(Shewry and Halford，2002)。大麦 醇溶蛋白在大麦种子种占总蛋白质的35-50％(Jaradat，1991)。它们以迁移率降低的顺序 被分为四组：A(也称作γ大麦醇溶蛋白)、B、C和D(Field et al.，1982)。B大麦醇溶蛋白 是主要的蛋白质级分，与C大麦醇溶蛋白的硫含量不同(Kreis and Shewry，1989)。B大麦 醇溶蛋白占总蛋白质的70-80％，C大麦醇溶蛋白占10-20％(Davies et al.，1993)。 大麦醇溶蛋白通常不被认为是贮藏蛋白，而D大麦醇溶蛋白与高分子量的麦谷蛋白同源。 大麦醇溶蛋白以及其余的相关谷类谷醇溶蛋白在合子胚自身中不表达，与其它贮藏蛋白如 油菜籽蛋白不同；确信其只在种子发育的中期至后期在淀粉胚乳中表达。 [0134] 大麦醇溶蛋白氨基酸序列的例子(提供了登记号；在NCBI中的描述；gi详述)包括但不必需限于： [0135] 1103203A；大麦醇溶蛋白B；gi|224385|prf||1103203A[224385]； [0136] 1103203B；大麦醇溶蛋白B；gi|224386|prf||1103203B[224386] [0137] 1103203C；大麦醇溶蛋白C；gi|224387|prf||1103203C[224387] [0138] 1210226A；大麦醇溶蛋白B1；gi|225171|prf||1210226A[225171] [0139] 1307151A；大麦醇溶蛋白C；gi|225588|prf||1307151A[225588] [0140] 1307151B；大麦醇溶蛋白C；gi|225589|prf||1307151B[225589] [0141] 1604464A；γ大麦醇溶蛋白；gi|226755|prf||1604464A[226755] [0142] AAA32942；C-大麦醇溶蛋白；gi|167016|gb|AAA32942.1|[167016] [0143] AAA32943；C-大麦醇溶蛋白贮藏蛋白；gi|167018|gb|AAA32943.1|[167018] [0144] AAA32944；C-大麦醇溶蛋白贮藏蛋白；gi|167020|gb|AAA32944.1|[167020] [0145] AAA32955；γ-1大麦醇溶蛋白前体；gi|167042|gb|AAA32955.1|[167042] [0146] AAA32967；大麦醇溶蛋白；gi|530093|gb|AAA32967.1|[530093] [0147] AAA92333；C大麦醇溶蛋白；gi|893242|gb|AAA92333.1|[893242] [0148] AAB28161；C-大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare]； [0149] gi|442524|gb|AAB28161.1||bbm|324752|bbs|139926[442524] [0150] AAB71678；种子贮藏蛋白[Hordeum vulgare]； [0151] gi|2454599|gb|AAB71678.1|[2454599] [0152] AAB71679；种子贮藏蛋白[Hordeum vulgare]； [0153] gi|2454600|gb|AAB71679.1|[2454600] [0154] AAP31050；球蛋白[Hordeum vulgare]； [0155] gi|30421166|gb|AAP31050.1|[30421166] [0156] AAP31051；D-大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare]； [0157] gi|30421167|gb|AAP31051.1|[30421167] [0158] AAQ63842；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0159] gi|34329251|gb|AAQ63842.1|[34329251] [0160] AAQ63843；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0161] gi|34329253|gb|AAQ63843.1|[34329253] [0162] AAQ63844；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0163] gi|34329255|gb|AAQ63844.1|[34329255] [0164] AAQ63845；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0165] gi|34329257|gb|AAQ63845.1|[34329257] [0166] AAQ63846；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0167] gi|34329259|gb|AAQ63846.1|[34329259] [0168] AAQ63847；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0169] gi|34329261|gb|AAQ63847.1|[34329261] [0170] AAQ63848；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0171] gi|34329263|gb|AAQ63848.1|[34329263]AAQ63849；3大麦醇溶蛋白 [0172] [Hordeum chilense]；gi|34329265|gb|AAQ63849.1|[34329265] [0173] AAQ63850；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0174] gi|34329267|gb|AAQ63850.1|[34329267] [0175] AAQ63851；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0176] gi|34329269|gb|AAQ63851.1|[34329269] [0177] AAQ63852；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0178] gi|34329271|gb|AAQ63852.1|[34329271] [0179] AAQ63853；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0180] gi|34329273|gb|AAQ63853.1|[34329273] [0181] AAQ63854；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0182] gi|34329275|gb|AAQ63854.1|[34329275] [0183] AAQ63855；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0184] gi|34329277|gb|AAQ63855.1|[34329277] [0185] AAQ63866；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0186] gi|34329299|gb|AAQ63866.1|[34329299] [0187] AAQ63867；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0188] gi|34329301|gb|AAQ63867.1|[34329301] [0189] AAQ63868；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0190] gi|34329303|gb|AAQ63868.1|[34329303] [0191] AAQ63869；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0192] gi|34329305|gb|AAQ63869.1|[34329305] [0193] AAQ63870；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0194] gi|34329307|gb|AAQ63870.1|[34329307] [0195] AAQ63871；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0196] gi|34329309|gb|AAQ63871.1|[34329309] [0197] AAQ63872；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum chilense]； [0198] gi|34329311|gb|AAQ63872.1|[34329311] [0199] AAU06227；B大麦醇溶蛋白[Hordeum brevisubulatum subsp.turkestanicum]； [0200] gi|51556914|gb|AAU06227.1|[51556914] [0201] AAU06228；B大麦醇溶蛋白[Hordeum brevisubulatum subsp.turkestanicum]； [0202] gi|51556916|gb|AAU06228.1|[51556916] [0203] AAU06229；B大麦醇溶蛋白[Hordeum brevisubulatum subsp. [0204] turkestanicum]；gi|51556918|gb|AAU06229.1|[51556918] [0205] AAZ76368；B大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare subsp.vulgare]； [0206] gi|73427781|gb|AAZ76368.1|[73427781] [0207] ABA06537；B 大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare subsp.vulgare]； [0208] gi|74422695|gb|ABA06537.1|[74422695] [0209] ABB82613；B大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare subsp.vulgare]； [0210] gi|82548223|gb|ABB82613.1|[82548223] [0211] ABB82614；B大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare subsp.vulgare]； [0212] gi|82548225|gb|ABB82614.1|[82548225] [0213] ABH01262；B大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare subsp.vulgare]； [0214] gi|110832715|gb|ABH01262.1|[110832715] [0215] BAA11642；D大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare subsp.vulgare]； [0216] gi|1167498|dbj|BAA11642.1|[1167498] [0217] CAA25509；未命名的蛋白质产物[Hordeum vulgare]； [0218] gi|18907|emb|CAA25509.1|[18907] [0219] CAA25912；未命名的蛋白质产物[Hordeum vulgare]； [0220] gi|18914|emb|CAA25912.1|[18914] [0221] CAA25913；未命名的蛋白质产物[Hordeum vulgare]； [0222] gi|829269|emb|CAA25913.1|[829269] [0223] CAA25914；未命名的蛋白质产物[Hordeum vulgare]； [0224] gi|18949|emb|CAA25914.1|[18949] [0225] CAA26889；未命名的蛋白质产物[Hordeum vulgare]； [0226] gi|18910|emb|CAA26889.1|[18910] [0227] CAA31861；未命名的蛋白质产物[Hordeum vulgare subsp.vulgare]； [0228] gi|18980|emb|CAA31861.1|[18980] [0229] CAA37729；B大麦醇溶蛋白前体[Hordeum vulgare subsp.vulgare]； [0230] gi|18929|emb|CAA37729.1|[18929] [0231] CAA42642；未命名的蛋白质产物[Hordeum vulgare subsp.vulgare]； [0232] gi|19001|emb|CAA42642.1|[19001] [0233] CAA48209；D大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare subsp.vulgare]； [0234] gi|18970|emb|CAA48209.1|[18970] [0235] CAA51204；γ3大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare]； [0236] gi|288709|emb|CAA51204.1|[288709] [0237] CAA59104；D-大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare subsp.vulgare]； [0238] gi|671537|emb|CAA59104.1|[671537] [0239] CAA60681；B1大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare]； [0240] gi|809031|emb|CAA60681.1|[809031] [0241] CAE45747；推定的γ2大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare]； [0242] gi|34365052|emb|CAE45747.1|[34365052] [0243] P06470；B1-大麦醇溶蛋白前体；gi|123458|sp|P06470|HOR1_HORVU[123458] [0244] P06471；B3-大麦醇溶蛋白；gi|123459|sp|P06471|HOR3_HORVU[123459] [0245] P06472；C-大麦醇溶蛋白(PCP387)； [0246] gi|123460|sp|P06472|HOR7_HORVU[123460] [0247] P17990；γ-大麦醇溶蛋白-1前体； [0248] gi|123464|sp|P17990|HOG1_HORVU[123464] [0249] P17991；C-大麦醇溶蛋白(克隆PC HOR1-3)； [0250] gi |123461|sp|P17991|HOR8_HORVU[123461] [0251] P17992；C-大麦醇溶蛋白(克隆PC-919)； [0252] gi|123462|sp|P17992|HOR9_HORVU[123462] [0253] P29835；19kDa球蛋白前体(α-球蛋白)； [0254] gi|115505553|sp|P29835|GL19_ORYSJ[115505553] [0255] P80198；γ-大麦醇溶蛋白-3；gi|1708280|sp|P80198|HOG3_HORVU[1708280]。 [0256] 编码大麦醇溶蛋白的基因和/或cDNA的例子(提供了登记号；在NCBI中的描述；gi详述)包括但不必需限于： [0257] AF016237；Hordeum vulgare种子贮藏蛋白(HORDB3a)mRNA，部分cds；gi|2454596|gb|AF016237.1|HVHORD1[2454596] [0258] AF016238；Hordeum vulgare种子贮藏蛋白(HORDB3a)mRNA 3′末端序列，部分cds；gi|2454597|gb|AF016238.1|HVHORD2[2454597] [0259] AH005570；Hordeum vulgare subsp.vulgare种子贮藏蛋白基因，部分cds；gi|2454598|gb|AH005570.1|SEG_HVHORD[2454598] [0260] AJ580585；Hordeum vulgareγ-2hor基因编码推定的γ2大麦醇溶蛋白；gi|34365051|emb|AJ580585.1|[34365051] [0261] AY268139；Hordeum vulgare BAC 184G9，完整序列；gi|30421164|gb|AY268139.1|[30421164] [0262] AY338365；Hordeum chilense克隆1栽培种H1γ3大麦醇溶蛋白mRNA，完整cds；gi|34329250|gb|AY338365.1|[34329250] [0263] AY338366；Hordeum chilense克隆2栽培种H1γ3大麦醇溶蛋白mRNA，完整cds；gi|34329252|gb|AY338366.1|[34329252] [0264] AY338367；Hordeum chilense克隆3栽培种H1γ3大麦醇溶蛋白mRNA，完整cds；gi|34329254|gb|AY338367.1|[34329254] [0265] AY338368；Hordeum chilense克隆4栽培种H1γ3大麦醇溶蛋白mRNA，完整cds；gi|34329256|gb|AY338368.1|[34329256] [0266] AY338369；Hordeum chilense克隆5栽培种H1γ3大麦醇溶蛋白mRNA，完整cds；gi|34329258|gb|AY338369.1|[34329258] [0267] AY338370；Hordeum chilense克隆6栽培种H1γ3大麦醇溶蛋白mRNA，完整cds；gi|34329260|gb|AY338370.1|[34329260] [0268] AY338371；Hordeum chilense克隆7栽培种H7γ3大麦醇溶蛋白mRNA，部分cds；gi|34329262|gb|AY338371.1|[34329262] [0269] AY338372；Hordeum chilense克隆8栽培种H7γ3大麦醇溶蛋白mRNA，部分cds；gi|34329264|gb|AY338372.1|[34329264] AY338373；Hordeum chilense克隆9栽培种 H7γ3大麦醇溶蛋白mRNA，部分cds；gi|34329266|gb|AY338373.1|[34329266] [0270] AY338374；Hordeum chilense克隆10栽培种H7γ3大麦醇溶蛋白mRNA，部分cds；gi|34329268|gb|AY338374.1|[34329268] [0271] AY338375；Hordeum chilense克隆11栽培种H7γ3大麦醇溶蛋白mRNA，部分cds；gi|3432920|gb|AY338375.1|[34329270] [0272] AY338376；Hordeum chilense克隆12栽培种H7γ3大麦醇溶蛋白mRNA，部分cds；gi|34329272|gb|AY338376.1|[34329272] [0273] AY338377；Hordeum chilense克隆13栽培种H7γ3大麦醇溶蛋白mRNA，部分cds；gi|34329274|gb|AY338377.1|[34329274] [0274] AY338378；Hordeum chilense克隆14栽培种H7γ3大麦醇溶蛋白mRNA，部分cds；gi|34329276|gb|AY338378.1|[34329276] [0275] AY338379；Hordeum chilense克隆1栽培种H47γ3大麦醇溶蛋白基因，部分cds；gi|34329298|gb|AY338379.1|[34329298] [0276] AY338380；Hordeum chilense克隆2栽培种H47γ3大麦醇溶蛋白基因，部分cds；gi|34329300|gb|AY338380.1|[34329300] [0277] AY338381；Hordeum chilense克隆3栽培种H210γ3大麦醇溶蛋白基因，部 分cds；gi|34329302|gb|AY338381.1|[34329302] [0278] AY338382；Hordeum chilense克隆4栽培种H210γ3大麦醇溶蛋白基因，部分cds；gi|34329304|gb|AY338382.1|[34329304] [0279] AY338383；Hordeum chilense克隆5栽培种H210γ3大麦醇溶蛋白基因，部分cds；gi|34329306|gb|AY338383.1|[34329306] [0280] AY338384；Hordeum chilense克隆6栽培种H210γ3大麦醇溶蛋白基因，部分cds；gi|34329308|gb|AY338384.1|[34329308] [0281] AY338385；Hordeum chilense克隆7栽培种H252γ3大麦醇溶蛋白基因，部分cds；gi|34329310|gb|AY338385.1|[34329310] [0282] AY695367；Hordeum brevisubulatum subsp.turkestanicum B大麦醇溶蛋白基因，完整cds；gi|51556913|gb|AY695367.1|[51556913] [0283] AY695368；Hordeum brevisubulatum subsp.turkestanicum B大麦醇溶蛋白基因，完整cds；gi|51556915|gb|AY695368.1|[51556915] [0284] AY695369；Hordeum brevisubulatum subsp.turkestanicum B大麦醇溶蛋白基因，完整cds；gi|51556917|gb|AY695369.1|[51556917] [0285] AY700807；Hordeum chilense栽培种H7克隆pC63-2B3-大麦醇溶蛋白假基因mRNA，完整cds；gi|57118094|gb|AY700807.1|[57118094] [0286] AY998005；Hordeum chilense克隆pC39-1D-大麦醇溶蛋白样mRNA，部分序列；gi|66354246|gb|AY998005.1|[66354246] [0287] AY998008；Hordeum chilense克隆pC36-2(4)D-大麦醇溶蛋白样mRNA，部分序列；gi|66354251|gb|AY998008.1|[66354251] [0288] AY998009；Hordeum chilense D-大麦醇溶蛋白基因，5′UTR和部分cds；gi|66354252|gb|AY998009.1|[66354252] [0289] AY998010；Hordeum chilense B-大麦醇溶蛋白基因，5′UTR和部分cds；gi|66354254|gb|AY998010.1|[66354254] [0290] D82941；Hordeum vulgare Hor3mRNA for D 大 麦 醇 溶 蛋 白，完 整 cds；gi|1167497|dbj |D82941.1|BLYHOR3[1167497] [0291] DQ148297；Hordeum vulgare subsp.vulgare栽培种XQ053B大麦醇溶蛋白基因，完整cds；gi|73427780|gb|DQ148297.1|[73427780] [0292] DQ 178602；Hordeum vulgare subsp.vulgare栽培种Aba-siqing B大麦醇溶蛋白基因，完整cds；gi|74422694|gb|DQ 178602.1|[74422694] [0293] DQ 189997；Hordeum vulgare subsp.vulgare克隆Hn3B大麦醇溶蛋白假基因，完整序列；gi|75991848|gb|DQ 189997.1|[75991848] [0294] DQ267476；Hordeum vulgare subsp.vulgare克隆Hn4B大麦醇溶蛋白假基因，完整序列；gi|82548218|gb|DQ267476.1|[82548218] [0295] DQ267477；Hordeum vulgare subsp.vulgare克隆Hn5B大麦醇溶蛋白假基因，完整序列；gi|82548220|gb|DQ267477.1|[82548220] [0296] DQ267478；Hordeum vulgare subsp.vulgare克隆Hn6B大麦醇溶蛋白基因，完整cds；gi|82548222|gb|DQ267478.1|[82548222] [0297] DQ267479；Hordeum vulgare subsp.vulgare克隆Hn7B大麦醇溶蛋白基因，完整cds；gi|82548224|gb|DQ267479.1|[82548224] [0298] DQ267480；Hordeum vulgare subsp.vulgare克隆Hn8B大麦醇溶蛋白假基因，完整序列；gi|82548226|gb|DQ267480.1|[82548226] [0299] DQ267481；Hordeum vulgare subsp.vulgare克隆Hn9B大麦醇溶蛋白假基因，完整序列；gi|82548228|gb|DQ267481.1|[82548228] [0300] DQ826387；Hordeum vulgare subsp.vulgare B大麦醇溶蛋白基因，完整cds；gi|110832714|gb|DQ826387.1|[110832714] [0301] J01237；barley b1大麦醇溶蛋白mrna(部分)；gi|167002|gb|J01237.1|BLYB1HOR[167002] [0302] K03147；Barley(Hordeum vulgare L.)C-大麦醇溶蛋白mRNA，克隆pHvE-c251；gi|167015|gb|K03147.1|BLYCHORD2[167015] [0303] M23836；Hordeum vulgare大麦醇溶蛋白(hor2-1)mRNA，3′UTR；gi|530091|gb|M23836.1|BLYHOR21A[530091] [0304] M23869；Hordeum vulgare B 1大麦醇溶蛋白mRNA，3′末端；gi|530092|gb|M23869.1|BLYHORDB1A[530092] [0305] M35610；Barley C-大麦醇溶蛋白贮藏蛋白，3′末端；gi|167017|gb|M35610.1|BLYCHORDA[167017] [0306] M35611；Barley C-大麦醇溶蛋白贮藏蛋白，3′末端；gi|167019|gb|M35611.1|BLYCHORDB[167019] [0307] M36378；Barley γ-1大麦醇溶蛋白贮藏蛋白基因，完整cds；gi|167041|gb|M36378.1|BLYG1HORDA[167041] [0308] M36941；Hordeum vulgare C-大麦醇溶蛋白基因，完整cds； gi|167062|gb|M36941.1|BLYHORDCA[167062] [0309] S66938；C-大麦醇溶蛋白[Hordeum vulgare＝barley，M564，Genomic，2806nt]；gi|442523|bbm|324747|bbs|139925|gb|S66938.1|[442523] [0310] X01024；B 1大麦醇溶蛋白的大麦mRNA片段；gi|18906|emb|X01024.1|[18906] [0311] X01777；B3-大麦醇溶蛋白的大麦mRNA片段； [0312] X01778；B 1-大麦醇溶蛋白的大麦mRNA片段；gi|18908|emb|X01778.1|[18908] [0313] X01779；C- 大 麦 醇 溶 蛋 白 的 大 麦 mRNA 片 段 (pcP387)；gi|18948|emb|X01779.1|[18948] [0314] X03103；B1大麦醇溶蛋白的大麦基因；gi|18909|emb|X03103.1|[18909] [0315] X13508；贮 藏 蛋 白 γ- 大 麦 醇 溶 蛋 白 的 大 麦 基 因；gi|18979|emb|X13508.1|[18979] [0316] X53690；B- 大 麦 醇 溶 蛋 白 的 Hordeum vulgare DNA(pcr31)；gi|18928|emb|X53690.1|[18928] [0317] X53691 ；B 大 麦 醇 溶 蛋 白 的 H.vulgare DNA(pcr47) ；gi|18930|emb|X53691.1|[18930] [0318] X60037；C- 大 麦 醇 溶 蛋 白 的 H.vulgare hor1-17 基 因；gi|19000|emb|X60037.1|[19000] [0319] X68072；D大麦醇溶蛋白的H.vulgare mRNA；gi|18969|emb|X68072.1|[18969] [0320] X72628；γ3大麦醇溶蛋白的H.vulgare mRNA，3′末端；gi|288708|emb|X72628.1|[288708] [0321] X84368；H.vulgare Hor3基因；gi|671536|emb|X84368.1|[671536] [0322] X87232；H.vulgare B1大麦醇溶蛋白基因；gi|809030|emb|X87232.1|[809030]。 [0323] 本发明的一个实施方案涉及转基因大麦植物，其包含对于乳糜泻对象无毒性的谷醇溶蛋白。如本文所示，这种谷醇溶蛋白的例子是燕麦蛋白和玉米醇溶蛋白。燕麦蛋白氨 基酸序列的例子(提供了登记号；在NCBI中的描述；gi详述)包括但不必需限于： [0324] 1411172A；燕麦蛋白快组分N9；gi|226123|prf||1411172A[226123] [0325] 1502200A；谷醇溶蛋白；gi|226227|prf||1502200A[226227] [0326] AAA32713；燕麦蛋白；gi|166551|gb|AAA32713.1|[166551] [0327] AAA32714；燕麦蛋白；gi|166553|gb|AAA32714.1|[166553] [0328] AAA32715；燕麦蛋白；gi|166555|gb|AAA32715.1|[166555] [0329] AAA32716；燕麦蛋白；gi|166557|gb|AAA32716.1|[166557] [0330] AAB23365；γ3燕麦蛋白，腹免疫反应性蛋白2，CIP-2，谷醇溶蛋白2；gi|256082|gb|AAB23365.1||bbm|240522|bbs|113745[256082] [0331] AAB32025；醇溶燕麦蛋白-3＝23.2kda蛋白[Avena sativa＝oat，Narymsky943，Peptide，201aa]；gi|693794|gb|AAB32025.1||bbm|352847|bbs|156888[693794] [0332] ABD14148；燕麦蛋白[Avena sativa]；gi|86610884|gb|ABD14148.1|[86610884] [0333] CAE85306；未命名的蛋白产物[Avena sativa]；gi|39923008|emb|CAE85306.1|[39923008] [0334] CAE85351；未命名的蛋白产物[Avena sativa]；gi|39923098|emb|CAE85351.1|[39923098] [0335] P27919；燕麦蛋白前体；gi|114720|sp|P27919|AVEN_AVESA[114720] [0336] P80356；燕麦蛋 白-3前体(谷 醇溶 蛋白)；gi|728937|sp|P80356|AVE3_AVESA[728937] [0337] Q09095；燕麦蛋白-A(γ-4燕麦蛋白)(谷醇溶蛋白)(乳糜泻免疫反应性蛋白1)(CIP-1)；gi|75107163|sp|Q09095|AVEA_AVESA[75107163] [0338] Q09097；燕麦蛋白-F(γ-3燕麦蛋白)(谷醇溶蛋白)(乳糜泻免疫反应性蛋白2)(CIP-2)；gi|75107165|sp|Q09097|AVEF_AVESA[75107165] [0339] Q09114；燕麦蛋白-E(α-2燕麦蛋白)(燕麦蛋白N9)(谷醇溶蛋白)(乳糜泻免疫反应性蛋白3)(CIP-3)；gi|75107166|sp|Q09114|AVEE_AVESA[75107166] [0340] S06211；燕麦蛋白α-2-small naked oat(片段)； [0341] gi|82325|pir||S06211[82325] [0342] S07621；燕麦蛋白γ-3-small naked oat(片段)； [0343] gi|2119756|pir||S07621[2119756] [0344] S07622；燕麦蛋白γ-4-small naked oat(片段)； [0345] gi|82327|pir||S07622[82327]。 [0346] 麦芽制造 [0347] 本发明提供的基于麦芽的饮料包括通过使用麦芽作为其起始材料的一部分或全部而产生的醇饮料(包括蒸馏饮料)和非醇饮料。例子包括啤酒、happoshu(低麦芽啤酒 饮料)、威士忌、低醇基于麦芽的饮料(如含有低于1％醇的基于麦芽的饮料)以及非醇饮 料。 [0348] 麦芽制造是受控的浸渍(steeping)和发芽以及随后的干燥大麦谷粒的过程。这个事件顺序对于导致谷粒修饰的多种酶的合成非常重要，这主要是使死亡的胚乳细胞壁解 聚以及迁移谷粒营养物质的过程。在随后的干燥程序中，由于化学褐变反应而产生气味和 颜色。尽管最初使用麦芽用于饮料生产，但是其也可以用于其它工业过程中，例如在烘焙业 中作为酶源，或者在食品业中作为香味剂和着色剂，例如作为麦芽或者作为麦芽粉，或者间 接作为麦芽糖浆等。 [0349] 在一个实施方案中，本发明涉及产生麦芽组合物的方法。所述方法优选包括如下步骤： [0350] (i)提供本发明的大麦植物谷粒， [0351] (ii)浸渍所述谷粒， [0352] (iii)使浸渍的谷粒在预定条件下发芽， [0353] (iv)干燥所述发芽的谷粒。 [0354] 例如，麦芽可以通过Hoseney(Principles of Cereal Science and Technology，Second Edition，1994：American Association of Cereal Chemists，St.Paul，Minn.)所 述任何方法产生。然而，本发明也可以使用产生麦芽的任何其它合适方法，如产生特质麦芽 的方法，包括但不限于烘焙麦芽的方法。一个非限制性实例在实施例6中描述。 [0355] 麦芽可以通过仅使用本发明的大麦植物产生的谷粒或者包含其它谷粒的混合物制备。 [0356] 麦芽主要用于酿造啤酒，但是也用于生产蒸馏酒精。酿造包括产生麦芽汁、主要和次要发酵以及后处理。首先碾碎麦芽，在水中搅拌及加热。在这个“淀粉糖化(mashing)” 期间，麦芽制造中激活的酶使谷粒(kernel)的淀粉降解为可发酵的糖。澄清产生的麦芽 汁，加入酵母，使该混合物发酵并进行后处理。 [0357] 在另一个实施方案中，麦芽汁组合物可以从麦芽制备。所述麦芽汁可以是初次和/或二次和/或进一步制备的麦芽汁。通常麦芽汁组合物具有高含 量的氨基氮和可发酵 的碳水化合物，主要是麦芽糖。典型地，麦芽汁是通过将麦芽与水保温即通过淀粉糖化而制 备。在淀粉糖化期间，可以为所述麦芽/水组合物补加其它碳水化合物富集的组合物，例如 大麦、玉米或者水稻辅料。未麦芽化的(unmalted)谷类佐剂不含有活性酶，因此依赖于麦 芽或者外源酶提供糖转化必需的酶。 [0358] 通常，麦芽汁产生过程的第一步是研磨麦芽，以在淀粉糖化期间使水可以进入谷粒颗粒中，这基本上是用酶使底物解聚的麦芽制造过程的延伸。在麦芽制造期间，将研磨的 麦芽与液体级分如水保温。温度保持恒定(等温麦芽制造)或者逐步升高。在任一情况中， 在麦芽制造和淀粉糖化过程中产生的可溶物质被提取至所述液体级分中，之后通过过滤将 其分离为麦芽汁与表示用过的谷粒的残余固体颗粒。这个麦芽汁也表示初次麦芽汁。在过 滤后，获得二次麦芽汁。进一步的麦芽汁可以通过重复该程序制备。制备麦芽汁的合适方 法的非限制性例子在Hoseney(如前)中描述。 [0359] 所述麦芽汁组合物也可以通过将本发明的大麦植物或者其部分与一或多种合适的酶保温而制备，所述酶如酶组合物或者酶混合物组合物，例如Ultraflo或者 Cereflo(Novozymes)。所述麦芽汁组合物也可以使用麦芽与未麦芽化的大麦植物或者其部 分的混合物制备，任选在所述制备期间加入一或多种合适的酶。此外，在麦芽汁发酵期间可 以加入特异性破坏参与乳糜泻的毒性氨基键的脯氨酰内肽酶以降低残余大麦醇溶蛋白的 毒性(DeAngelis et al.，2007；Marti et al.，2005；Stepniak et al.，2006)。 [0360] 谷粒加工 [0361] 可以使用本领域已知的任何技术对本发明的大麦谷粒进行加工以生产食品或者非食品产品。 [0362] 在一个实施方案中，所述产品是整谷粒面粉(whole grain four)(超细研磨的整谷粒面粉，如超细研磨的整谷粒面粉；整谷粒面粉，或者由大约100％谷粒制成的面粉)。整 谷粒面粉包括精制面粉成分(精制面粉)和粗制级分(超细研磨的粗制级分)。 [0363] 精制面粉可以是例如通过研磨和筛选纯净的大麦而制备的面粉。食品和药品管理局(FDA)要求面粉符合一定的颗粒大小标准以包含于精制大麦面粉的目录中。精制 面粉的颗粒大小被描述为其中不低于98％的面粉可通过具有孔径不大于称作“212微米 (U.S.Wire 70)”的金属丝编织网的网的面 粉。 [0364] 粗制级分包含麸和胚芽中的至少一种。例如，胚芽是在大麦谷粒(barleykernel)中发现的胚体。所述胚芽包含脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质以及植物营养物质如类黄 酮。所述麸包含一些细胞层且具有大量的脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和植物营养物 质如类黄酮。再者，粗制级分可包含糊粉层，其也包含脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和 植物营养物质如类黄酮。所述糊粉层在学术上认为是胚乳的一部分，呈现出许多与麸相同 的特性，因此在研磨过程期间与麸和胚芽一起典型被除去。糊粉层含有蛋白质、维生素和植 物营养物质如阿魏酸。 [0365] 进一步地，所述粗制级分可以混合精制面粉成分。优选所述粗制级分与精制面粉成分均质混合。均质混合所述粗制级分与精制面粉成分可有助于降低在运输期间由于大小 造成的颗粒分层。所述粗制级分可与精制面粉成分混合，形成整谷粒面粉，由此与精制面粉 相比提供营养值、纤维含量和抗氧化剂能力增加的整谷粒面粉。例如，所述粗制级分或者整 谷粒面粉可以不同量使用以代替烘焙食品、点心和食品中的精制或者整谷粒面粉。本发明 的整谷粒面粉(即超细研磨的整谷粒面粉)也可以直接销售给消费者，用于其自制烘焙食 品。在举例的实施方案中，整谷粒面粉的颗粒谱(granulation profile)是占所述整谷粒 面粉重量98％的颗粒低于212微米。 [0366] 在进一步的实施方案中，在整谷粒面粉和/或粗制级分的麸和胚芽中发现的酶是失活的以稳定所述整谷粒面粉和/或粗制级分。本发明认为所述失活也可以意味着被抑 制、变性等。稳定是使用蒸汽、加热、照射或者其它处理方法使在麸和胚芽层中发现的酶失 活的过程。麸和胚芽中天然发生的酶催化面粉中的化合物发生变化，不利地影响所述面 粉的烹制特性以及贮存期。失活的酶不催化面粉中发现的化合物发生变化，因此稳定化 的面粉保留其烹制特性且具有较长的贮存期。例如本发明可实施双流研磨(two-stream milling)技术研磨所述粗制级分。一旦分离并稳定所述粗制级分，将粗制级分通过研磨机 优选凹口研磨机(gap mill)研磨，形成颗粒大小分布低于或等于大约500微米的粗制级 分。在举例的实施方案中，所述凹口研磨机顶端速度(tip speed)通常在115m/s-144m/s 之间，高顶端速度产生热。在研磨过程期间产生的热气流导致降低粗制级分中的微生物荷 载。在进一步的实施方案中，在凹口研磨机中研磨之前，粗制级分的平均需氧菌平板 计数 为95,000菌落形成单位/g(cfu/g)，平均大肠杆菌计数为1,200cfu/g。在通过凹口研磨机 后，粗制级分的平均需氧菌平板计数为10,000cfu/g，平均大肠杆菌计数为900cfu/g。因 此，本发明的粗制级分中微生物荷载显著降低。在过筛后，可以对颗粒大小大于500微米的 任何经研磨的粗制级分进行进一步研磨。 [0367] 在其它的实施方案中，所述整谷粒面粉或者粗制级分可以是食品成分。例如，食品可以是百吉圈(bagel)、饼干、面包、小圆面包(bun)、新月形面包(croissant)、饺子 (dumpling)、英国烤饼(English muffin)、松糕(muffin)、皮塔饼(pita bread)、速制糕 饼(quickbread)、冷藏/冷冻面食(refrigerated/frozen dough products)、面团、baked beans、玉米煎饼(burrito)、chili、玉米粉卷(taco)、tamale、玉米薄饼(tortilla)、菜 肉馅饼(pot pie)、速食麦片(ready to eat cereal)、方便食品(ready to eat meal)、 填料(stuffing)、微波炉食物(microwaveable meal)、巧克力蛋糕(brownie)、蛋糕、乳 酪蛋糕、咖啡蛋糕、曲奇饼(cookie)、甜点、油酥糕点(pastry)、甜卷饼(sweet roll)、 块状糖(candy bar)、派皮(pie crust)、饼馅(pie filling)、婴儿食品、baking mix、 面糊(batter)、拌粉(breading)、gravy mix、meatextender、meat substitute、调味粉 (seasoning mix)、汤粉(soup mix)、肉汁(gravy)、乳酪面粉糊(roux)、色拉酱(salad dressing)、汤、酸奶油(sourcream)、面条、意大利面(pasta)、拉面(ramen noodle)、炒 面(chow meinnoodle)、捞面(lo mein noodle)、ice cream inclusion、冰砖(ice cream bar)、蛋卷冰淇淋(ice cream cone)、冰淇淋三明治(ice cream sandwich)、薄脆饼 干(cracker)、油炸面包丁(crouton)、甜甜圈(doughnut)、蛋卷(egg roll)、挤压零食 (extruded snack)、fruit and grain bar、微波炉零食(microwaveablesnack product)、 营养棒(nutritional bar)、烙饼(pancake)、par-baked bakeryproduct、椒盐卷饼 (pretzel)、布丁(pudding)、granola-based product、snackchip、零食(snack food)、 snack mix、华夫饼(waffle)、匹萨面皮(pazza crust)、动物饲料或者宠物食品。 [0368] 在另外的实施方案中，所述整谷粒面粉或者粗制级分可以是营养补充剂的成分。例如，所述营养补充剂可以是加入饮食中的含有一或多种成分的产品，典型包括维生素、矿 物质、草药(herb)、氨基酸、酶、抗氧化剂、香料、益生菌剂、提取物、益生素和纤维。本发明的 整谷粒面粉或者粗制 级分包括维生素、矿物质、氨基酸、酶和纤维。例如，所述粗制级分含 有浓缩量的膳食纤维以及其它必需营养物质如B-维生素、硒、铬、锰、镁以及抗氧化剂，这 些是健康膳食必需的。例如22g本发明的粗制级分提供33％的个体每日推荐的纤维摄取 量。进一步地，14g是提供20％的个体每日推荐的纤维摄取量所需的。因此，所述粗制级分 是个体摄取纤维需要量的极佳补充来源。因此，在这个实施方案中，所述整谷粒面粉或者粗 制级分可以是营养补充剂的成分。所述营养补充剂可包含有助于个体全面健康的任何已知 的营养成分，例子包含但不限于维生素、矿物质、其它纤维成分、脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸、 肽、蛋白质、叶黄素、核糖、ω-3脂肪酸和/或其它营养成分。 [0369] 在其它实施方案中，所述整谷粒面粉或者粗制级分可以是纤维补充剂或者其成分。目前许多纤维补充剂如车前子壳(psyllium husk)、纤维素衍生物以及水解的果阿胶 除了其纤维含量之外还具有有限的营养价值。此外，许多纤维补充剂具有不希望的质地和 不佳味道。从所述整谷粒面粉或者粗制级分中制备的纤维补充剂可帮助提供纤维以及蛋 白质和抗氧化剂。所述纤维补充剂可以但不限于如下形式提供：速溶饮料混合物(instant beveragemix)、即饮饮料(ready-to-drink beverages)、营养棒、华夫饼、曲奇饼、薄脆饼 干、gel shots、胶囊、求斯糖(chews)、咀嚼片(chewable tablet)以及丸剂(pill)。一个 实施方案是以调味奶昔(flavored shake)或者麦芽类型饮料形式提供纤维补充剂，这个实 施方案可特别感兴趣地作为儿童纤维补充剂。 [0370] 在另一实施方案中，研磨程序可用于生产多谷粒(multi-grain)面粉、多大麦面粉或者多谷粒粗制级分。例如，可以研磨一种类型大麦的麸和胚芽并与另一类型大麦的经 研磨的胚乳或者整谷粒面粉混合。或者可以研磨一种类型谷物的麸和胚芽并与另一类型谷 物的经研磨的胚乳或整谷粒面粉混合。在另一实施方案中，可以将第一种类型大麦或谷物 的麸和胚芽与第二种类型大麦或谷物的麸和胚芽混合，产生多谷粒粗制级分。预期本发明 包含混合一或多种谷物的一或多种麸、胚芽、胚乳和整谷粒面粉的任意组合。这种多谷粒、 多大麦方法可用于生产定制面粉，以及利用多种类型谷物和大麦的品质和营养含量生产一 种面粉。 [0371] 本发明的整谷粒面粉可以通过各种研磨方法产生。一个举例的实施方 案包括以单流(single stream)研磨谷粒，而不将谷物的胚乳、麸和胚芽分离成单独流(separate stream)。清洗和调和的谷物被传送至首次通过(firstpassage)研磨机，如锤磨机、辊磨 机(roller mill)、钉式粉磨机(pin mill)、冲击研磨机、圆盘式研磨机、空气磨浆机(air attrition mill)、凹口研磨机(gapmill)等。在一个实施方案中，所述研磨机可以是凹口 研磨机。在研磨之后，倒出谷物并运送至筛子。可以使用筛除经研磨的颗粒的本领域已知 的任何筛子。通过筛子的筛网的材料是本发明的整谷粒面粉，不需要进一步加工。保留在 筛网上的材料称作二级级分。所述二级级分需要另外降低颗粒大小。因此，这个二级级分 可以运送至二次通过研磨机。在研磨后，可以将此二级级分运送至第二个筛子。通过第二 个筛子的筛网的材料是本发明的整谷粒面粉。保留在筛网上的材料是四级级分，需要进一 步降低颗粒大小。将在第二个筛子的筛网上的四级级分再运送回至首次通过研磨机或者二 次通过研磨机上，通过反馈循环进一步加工。在本发明的另一个实施方案中，所述方法可包 括多个首次通过研磨机以提供较高的系统能力。 [0372] 预期本发明的整谷粒面粉、粗制级分和/或谷物制品可以通过本领域已知的任何研磨方法产生。再者，预期本发明的整谷粒面粉、粗制级分和/或谷物制品可以通过各种其 它方法例如发酵、速溶、挤出、包囊、烘烤、烘焙等修饰或强化。 [0373] 下调大麦醇溶蛋白产生的多核苷酸 [0374] 在一个实施方案中，本发明的和/或用于本发明方法中的谷粒来自转基因大麦植物，所述转基因植物包含编码下调谷粒中至少一种大麦醇溶蛋白产生的多核苷酸的转基 因。这种多核苷酸的例子包括但不限于反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化性多核苷酸、人 工微小RNA或者双链体RNA分子。当存在于谷粒中时，这些多核苷酸的每一个均导致可用 于翻译的大麦醇溶蛋白mRNA降低。 [0375] 反义多核苷酸 [0376] 术语“反义多核苷酸”应是指DNA分子或者RNA分子或者其组合，其与编码大麦醇溶蛋白的特异性mRNA分子的至少一部分互补且能干扰转录后事件如mRNA翻译。反 义方法的应用为本领域熟知(见例如G.Hartmannand S.Endres，Manual ofAntisense Methodology，Kluwer(1999))。植物中反义技术的应用见Bourque(1995)和Senior(1998) 综述。Senior(1998)指出反义 方法目前是操纵基因表达的经充分确立的技术。 [0377] 本发明大麦植物中的反义多核苷酸与靶多核苷酸在生理条件下杂交。如本文所用，术语“在生理条件下杂交的反义多核苷酸”是指在正常条件下在大麦细胞中多核苷酸 (完全或部分单链)至少能与编码蛋白质如大麦醇溶蛋白的mRNA形成双链多核苷酸。 [0378] 反义分子可包含相应于结构基因的序列或者实现控制基因表达或者剪接事件的序列。例如，反义序列可相应于本发明基因的靶向的编码区，或者5’-非翻译区(UTR)或者 3’-UTR或者这些区域的组合。其与内含子序列可以部分互补，所述内含子序列在转录期间 或者之后可以被剪接掉，优选仅与靶基因的外显子序列互补。鉴于UTR通常更大的趋异性， 靶向这些区域提供了更大特异性的基因抑制作用。 [0379] 反义序列的长度应是至少19个连续核苷酸，优选至少50个核苷酸，更优选至少100、200、500或者1000个核苷酸。可以使用与完整基因转录物互补的全长序列。所述长度 最优选为100-2000个核苷酸。反义序列与靶向转录物的相同性程度应为至少90％以及更 优选为95-100％。所述反义RNA分子当然可包含稳定该分子的无关序列。 [0380] 催化性多核苷酸 [0381] 术语“催化性多核苷酸/核酸”是指特异性识别不同底物且催化该底物的化学修饰的DNA分子或者含有DNA的分子(在本领域也称作“脱氧核酶”)或者RNA分子或者含有 RNA的分子(也称作“核酶”)。所述催化性核酸中的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T(以及 对于RNA可以是U)。 [0382] 典型地，所述催化性核酸含有特异性识别靶核酸的反义序列以及核酸裂解酶活性(在本文也称作“催化结构域”)。特别用于本发明中的核酶的类型是锤头核酶(Haseloff and Gerlach，1988，Perriman et al.，1992)和发夹核酶(Shippy et al.，1999)。 [0383] 本发明大麦植物中的核酶以及编码该核酶的DNA可以通过使用本领域熟知的方法化学合成。所述核酶也可以从与RNA聚合酶启动子可操纵地连接的DNA分子制备(基 于转录产生RNA分子)，所述启动子如T7RNA聚合酶或者SP6RNA聚合酶的启动子。当载体 也含有与DNA分子可操纵地连接的RNA聚合酶启动子时，可以通过与RNA聚合酶和核苷酸 保温在体外产生所述核酶。在一个单独的实施方案中，可以将DNA插入表达盒或 者转录盒 中。在合成之后，RNA分子可以通过与具有稳定核酶的能力的DNA分子连接而被修饰，且使 其对Rnase具有抗性。 [0384] 与本文所述反义多核苷酸一样，催化性多核苷酸在“生理条件下”应也能杂交靶核酸分子(例如编码大麦醇溶蛋白的mRNA)，所述生理条件即在大麦细胞内的那些条件。 [0385] RNA干扰 [0386] RNA干扰(RNAi)特别用于特异性抑制特定蛋白质的产生。尽管不希望受理论的限制，Waterhouse et al.(1998)提供了通过其dsRNA(双链RNA)可用于降低蛋白质产生的 机制模型。这种技术依赖于dsRNA分子的存在，其含有与感兴趣的基因的mRNA或者其一部 分基本相同的序列，在本文情况中是编码本发明多肽的mRNA。所述dsRNA可以便利地在重 组载体和宿主细胞中从单个启动子产生，其中所述有义和反义序列两侧是不相关的序列， 其使得所述有义和反义序列杂交形成dsRNA分子，而不相关序列形成环结构。适于本发明 的dsRNA分子的设计和产生为本领域技术人员熟知，特别见于Waterhouse et al.(1998)、 Smith et al.(2000)、WO 99/32619、WO99/53050、WO 99/49029和WO 01/34815所述。 [0387] 在一个实施例中，导入DNA，其指导与被失活的靶基因同源的至少部分双链(双链体)RNA产物的合成。因此所述DNA包含有义和反义序列，当转录为RNA时可以杂交形成双 链RNA区域。在优选的实施方案中，有义和反义序列由间隔区分隔，所述间隔区包含当转录 为RNA时被剪接掉的内含子。这个序列排列示出产生更高效力的基因沉默。所述双链区可 包含从一或两个DNA区域转录的一或两个RNA分子。据认为所述双链分子的存在触发内源 植物系统的应答，其破坏所述双链RNA以及来自靶植物基因的同源RNA转录物，有效地降低 或者消除靶基因的活性。 [0388] 杂交的有义和反义序列的长度应均至少为19个连续核苷酸，优选至少30或50个核苷酸，更优选至少100、200、500或1000个核苷酸。可以使用相应于完整基因转录物的全 长序列。所述长度最优选为100-2000个核苷酸。有义和反义序列与靶向转录物的相同性 程度应为至少85％，优选至少90％，及更优选95-100％。所述RNA分子当然可包含稳定该 分子的不相关序列。所述RNA分子可以在RNA聚合酶II或者RNA聚合酶III启动子控制 下表达。后者的实例包括tRNA或者snRNA启动子。 [0389] 优选的小干扰RNA(siRNA)分子包含与靶mRNA的大约19-21个连续核苷酸相同的核苷酸序列。优选所述靶mRNA序列从二核苷酸AA开始，包含大约30-70％(优选30-60％， 更优选40-60％以及更优选大约45％-55％)的GC含量，且例如通过标准BLAST检索确定 与其所导入的大麦植物基因组中除了靶序列之外的任何核苷酸序列均不具有高百分比相 同性。 [0390] 微小RNA [0391] 微小RNA调节是RNA沉默途径的一个明确特异化的分支，其与常规的RNAi/PTGS不同，朝向基因调节进化。微小RNA是特殊类别的小RNA，在以特征性反向重复组构的基因 样元件中编码。当转录时，微小RNA基因产生茎-环前体RNA，随后从中加工成微小RNA。 微小RNA的长度典型为大约21个核苷酸。释放的miRNA掺入含有特定Argonaute蛋白亚 型的RISC样复合物中，发挥序列特异性基因抑制作用(见例如Millar and Waterhouse， 2005；Pasquinelli et al.，2005；Almeida and Allshire，2005)。 [0392] 共抑制 [0393] 可以使用的另一分子生物学方法是共抑制。共抑制的机制不完全清楚，但是认为涉及转录后基因沉默(PTGS)，其在此方面与反义抑制的许多实例非常相似。其包括以相对 于用于其表达的启动子有义的方向在植物中导入基因或其片段的额外拷贝。有义片段的大 小、与靶基因区域的相应性以及与靶基因的序列相同性程度如上述针对反义序列所述。在 一些情况中，基因序列的额外拷贝干扰靶植物基因的表达。参见WO 97/20936和EP0465572 所述实施共抑制的方法。 [0394] 核酸构建体 [0395] 可用于产生转基因植物的核酸构建体可以使用标准技术产生。 [0396] 当插入编码mRNA的区域时，所述构建体包含内含子序列。这些内含子序列可有助于转基因在植物中的表达。术语“内含子”以其正常含义使用，是指被转录但是不编码蛋白 质且在翻译之前从RNA中剪接除去的基因节段。如果转基因编码翻译产物，则内含子可以 掺入在5’-UTR或者编码区中，或者如果转基因不编码翻译产物则内含子可以掺入在转录 区中任意位置。然而在优选的实施方案中，任何多肽编码区是作为单个开放读框提供的。正 如技术人员所意识到，这种开放读框可以通过逆转录编码多肽的mRNA获得。 [0398] 包含调节元件的转录起始区可提供在植物中的调节或者组成型表达。优选表达至少在种子细胞中发生。 [0399] 本领域已经描述了在植物细胞中有活性的许多组成型启动子。适于在植物中组成型表达的启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，玄参花叶病毒 (FMV)35S，甘蔗杆状病毒启动子，鸭跖草黄斑驳病毒启动子，来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化 酶的小亚基的光诱导启动子，水稻胞质丙糖磷酸异构酶启动子，拟南芥(Arabidopsis)的 腺嘌呤磷酸核糖基转移酶启动子，水稻肌动蛋白1基因启动子，甘露碱合酶和章鱼碱合酶 启动子，Adh启动子，蔗糖合酶启动子，R基因复合物启动子，以及叶绿素α/β结合蛋白基 因启动子。这些启动子用于产生在植物中表达的DNA载体，见例如WO 84/02913所述。所 有这些启动子均用于产生各种类型植物可表达的重组DNA载体。 [0400] 启动子可以由如温度、光或者应激等因素调节。通常调节元件提供在表达的遗传序列的5’。构建体也可以含有增强转录的其它元件，如nos 3’或者ocs 3’聚腺苷酸化区 域或者转录终止子。 [0401] 5′非翻译前导序列可以衍生自选择用于表达异源基因序列的启动子，且如果需要则可以被特异性修饰以增加mRNA的翻译。关于转基因的优化表达的综述见Koziel et al.(1996)。5′非翻译区也可以得自植物病毒RNA(烟草花叶病毒、烟草蚀刻病毒、玉米矮 花叶病毒、苜蓿花叶病毒等)，得自合适的真核基因-植物基因(小麦和玉米叶绿素a/b结 合蛋白基因前导序列)，或者得自合成的基因序列。本发明非限于使用其中非翻译区衍生 自伴随启动子序列的5’非翻译序列的构建体。前导序列也可以衍生自不相关的启动子或 者编码序列。可用于本发明中的前导序列包含玉米Hsp70前导序列(US5,362,865和US 5,859,347)以及TMV omega元件。 [0402] 转录终止通过将3’非翻译DNA序列与嵌合载体中感兴趣的核苷酸可操纵地连接而实现。重组DNA分子的3′非翻译区含有在植物中起作用的聚腺苷酸化信号，使得在RNA 的3’末端添加腺苷酸化核苷酸。所述3’非翻译区可得自在植物细胞中表达的各个基因。 这种情况通常使用烟碱合酶3’非翻 译区，来自豌豆小亚基Rubisco基因的3’非翻译区， 来自大豆7S种子贮藏蛋白基因的3’非翻译区。也可以使用3’转录的非翻译区，其含有农 杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因的聚腺苷酸化信号。 [0403] 典型地，所述核酸构建体包含选择标记。选择标记有助于鉴别和筛选已经用外源核酸分子转化的植物或者细胞。选择标记基因可为大麦细胞提供抗生素或者除草剂抗性， 或者使得可以利用底物如甘露糖。选择标记优选赋予大麦细胞潮霉素抗性。 [0404] 优选所述核酸构建体稳定掺入植物基因组中。因此所述核酸包含合适的元件，使得所述分子得以掺入基因组中，或者所述构建体置于可以掺入植物细胞染色体中的合适载 体中。 [0405] 本发明的一个实施方案包括使用重组载体，其包含插入在能将核酸分子输送至宿主细胞中的任何载体中的本文所述的至少一个转基因。这种载体含有异源核酸序列，即非 天然发现与本发明核酸分子相邻且优选衍生自除了所述核酸分子从中衍生的物种之外的 物种的核酸序列。所述载体可以是原核或真核RNA或DNA，典型是病毒或者质粒。 [0406] 适于稳定转染植物细胞或者适于建立转基因植物的许多载体在如Pouwelset al.，Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985，supp.1987；Weissbach and Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，AcademicPress，1989；and Gelvin et al.，Plant Molecular Biology Manual，KluwerAcademic Publishers，1990中描述。典型 地，植物表达载体包括在5’和3’调节序列和显性选择标记的转录控制下的一或多个克隆 的植物基因。这种植物表达载体也可以含有启动子调节区(如控制可诱导的或者组成型表 达、环境或者发育调节的表达或者细胞或组织特异性表达的调节区)，转录起始位点，核糖 体结合位点，RNA加工信号，转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。 [0407] 转基因植物 [0408] 如本文所述，转基因大麦植物包括已经使用重组技术遗传修饰的植物(以及所述植物的部分和细胞)及其后代，使得在希望的植物或者植物器官中产生至少一种多核苷酸 和/或多肽。转基因植物可以使用本领域已知的技术产生，如在A.Slater et al.，Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation ofPlants，Oxford University Press(2003)， and P.Christou and H.Klee，Handbookof Plant Biotechnology，John Wiley and Sons(2004)中所述那些技术。 [0409] 在优选的实施方案中，所述转基因植物对于每一个导入的基因(转基因)均是纯合的，由此其后代不分离希望的表型。所述转基因植物对于导入的转基因也可以是杂合的， 例如从杂交种子中生长的F1后代。这种植物可提供如本领域熟知的杂交优势的优势。 [0410] 本领域已经描述了将基因直接输送至细胞中的四种一般方法：(1)化学方法(Graham et al.，1973)；(2)物理方法如显微注射法(Capecchi，1980)，电穿孔(见例如WO 87/06614、US 5,472,869、5,384,253、WO 92/09696和WO93/21335所述)以及基因枪(见例 如US 4,945,050和US 5,141,131)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu et al.，1993；Eglitis et al.，1988)；和(4)受体介导机制(Curiel et al.，1992；Wagner et al.，1992)。 [0411] 可以使用的加速方法包括例如微粒轰击等。将转化核酸分子输送至植物细胞的一个方法的例子是微粒轰击。这种方法由Yang et al.，ParticleBombardment Technology for Gene Transfer，Oxford Press，Oxford，England(1994)综述。非生物学粒子(微粒) 可以用核酸包被且可以通过推进力输送至细胞中。举例的微粒包括包含钨、金、铂等的那 些。除了是可再生地转化单子叶植物的有效方式之外，微粒轰击的特别优势是不需要分离 原生质体，也不需要农杆菌感染的易感性。通过加速将DNA输送至玉米(Zea mays)细胞中 的举例的实施方案是生物射弹α-粒子输送系统，其可用于推进用DNA包被的微粒通过筛 如不锈钢或Nytex筛的筛，到达用悬浮培养的谷物细胞覆盖的滤膜表面上。适用于本发明 的粒子输送系统是氦加速PDS-1000/He枪，可得自Bio-Rad Laboratories。 [0412] 对于轰击，可将悬浮培养的细胞在滤膜上浓缩。含有待被轰击的细胞的滤膜以适当距离置于微粒轰击终止板下方。如果需要，在枪与被轰击的细胞之间可以放置一或多个 筛。 [0413] 或者，可以将不成熟胚或者其它靶细胞排列在固体培养基上。被轰击的细胞以适当距离置于微粒轰击终止板下方。如果需要，在加速装置与被轰击的细胞之间可以放置一 或多个筛。通过使用本文所述技术可以获得直至1000或更多个瞬时表达标记基因的细胞 转化灶。在轰击后48小时转化灶中表达外源基因产物的细胞数目通常范围为1-10个，平 均1-3个。 [0414] 在轰击转化中，可以优化预轰击培养条件以及轰击参数以产生最大数目的稳定转化体。在这个技术中，重要的是轰击的物理和生物学参数。物 理因素是涉及操纵DNA/微 粒轰击沉淀的那些因素，或者影响或者巨粒轰击(macroprojectiles)或者微粒轰击的飞 行和速度的那些因素。生物学因素包括在轰击之前和紧接着之后操纵细胞的所有步骤，靶 细胞的渗透压调节以帮助减轻轰击相关创伤，以及转化DNA的性质，如线性化DNA或者完整 的超螺旋质粒。确信预轰击处理对于不成熟胚的成功转化尤为重要。 [0415] 在另一实施方案中，可以稳定转化质体。在高等植物中质体转化的方法包括通过粒子枪输送含有选择标记的DNA以及通过同源重组将所述DNA靶向质体基因组 (U.S.5,451,513，U.S.5,545,818，U.S.5,877,402，U.S.5,932479和WO 99/05265)。 [0416] 因此，预期希望可以在小规模研究中调节轰击参数的各个方面以充分优化条件。特别希望可以调节物理参数如缺口(gap)距离、飞行距离、组织距离和氦压。也可以通过修 改影响接受细胞的生理学状态的条件以最小化创伤降低因素，且因此可影响转化和整合效 率。例如，可以调整接受细胞的渗透压状态、组织水合和传代培养阶段或者细胞周期以优化 转化。根据本发明揭示本领域技术人员将获知实施其它常规调整的方法。 [0417] 农杆菌-介导的转移是将基因导入植物细胞中广泛应用的系统，因为所述DNA可以导入整个植物组织中，从而不需要从原生质体中再生完整植物。本领域熟知使用农杆菌 介导的植物整合载体将DNA导入植物细胞中(见例如US 5,177,010、US 5,104,310、US 5,004,863、US 5,159,135)。进一步地，T-DNA的整合是相对精确的过程，产生很少的重排。 被转移的DNA区域由边界序列限定，间插DNA通常被插入在植物基因组中。 [0418] 现代农杆菌转化载体能在大肠杆菌(E.coli)以及农杆菌中复制，便于进行所述常规操纵(Klee et al.，In：Plant DNA Infectious Agents，Hohn andSchell，eds.， Springer-Verlag，New York，pp.179-203(1985))。此外，农杆菌介导的基因转移中载体的 技术进展改良了载体中基因和限制位点的排列以便于表达不同多肽编码基因的载体的构 建。所述载体具有侧翼为启动子和聚腺苷酸化位点的便利的多接头区域，用以指导插入的 多肽编码基因的表达，且适于本发明的目的。另外，含有有毒(armed)和无毒(disarmed)Ti 基因的农杆菌可用于转化。在其中农杆菌介导的转化有效的那些植物品种中，因为基因转 移的便利和确定性质而是选择的方法。 [0419] 使用农杆菌转化方法形成的转基因植物在一个染色体上含有一个遗传 基因座。这种转基因植物可被认为对于添加的基因是半合子的。更优选对于添加的结构基因是纯合 的转基因植物，即含有两个添加的基因的转基因植物，一个基因位于一对染色体的每条染 色体上相同基因座上。纯合转基因植物可以通过如下方法获得，即有性交配(自交)含有 一个添加的基因的独立分离的转基因植物，萌发一些产生的种子并分析所得植物感兴趣的 基因。 [0420] 也应理解也可以交配两个不同的转基因植物以产生含有两个独立分离的外源基因的后代。合适后代的自交可以产生对于中两个外源基因均纯合的植物。也包括与亲本植 物回交以及与非转基因植物异型杂交，无性繁殖方法也包括在内。对于不同性状和作物常 用的其它培育方法的描述可见Fehr，In：Breeding Methods for Cultivar Development， Wilcox J.ed.，AmericanSociety ofAgronomy，Madison Wis.(1987)所述。 [0421] 植物原生质体的转化可以通过使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔及组合这些处理等方法实现。这些系统应用于不同植物品种依赖于从原生质体再生特定植物 株系的能力。举例的从原生质体再生谷物的方法见Fujimura et al.，1985、Toriyama et al.，1986、Abdullah et al.，1986所述。 [0422] 也可以使用其它细胞转化方法，包括但不限于通过将DNA直接转移至花粉中、通过将DNA直接注射进植物的繁殖器官中、或者通过将DNA直接注射进不成熟胚的细胞中随 后再水合脱水胚而将DNA导入植物中。 [0423] 本领域熟知来自单一植物原生质体转化体或者来自各种转化的外植体的植物的再生、发育和栽培(Weissbach et al.，In：Methods for Plant MolecularBiology， Academic Press，San Diego，Calif.，(1988))。这种再生和生长方法典型包括选择转化细 胞、培养从胚发育至生根小植物阶段这些个体化细胞的步骤。相似地再生转基因胚和种子。 之后将所得转基因生根的芽种植于合适的植物生长培养基如土壤中。 [0424] 本领域熟知含有外来、外源基因的植物的发育和再生。优选对再生的植物进行自花授粉以提供纯合的转基因植物。此外，将得自再生植物的花粉与农业重要品系的种子生 长的植物杂交。相反，这些主要品系植物的花粉用于对再生植物授粉。使用本领域技术人 员熟知的方法栽培含有希望的外源核酸的本发明的转基因植物。 [0425] 已经公开了转化双子叶植物的方法，主要是通过使用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)获 得 转 基 因 植 物，对 于 棉 花 见 U.S.5,004,863、 U.S.5,159,135、 U.S.5,518,908所述，对于大豆见U.S.5,569,834、U.S.5,416,011所述，对于芸苔见 U.S.5,463,174所述，对于花生见Cheng et al.，1996所述，以及对于豌豆见Grant et al.， 1995所述。 [0426] 本领域熟知转化谷类植物如大麦的方法，是通过导入外源核酸在植物中导入遗传变异，以及从原生质体或者不成熟植物胚再生植物，见例如CA2,092,588、AU 61781/94、AU 667939、US 6,100,447、PCT/US97/10621、US 5,589,617、US 6,541,257和WO 99/14314所 述。优选转基因大麦植物通过根癌农杆菌介导的转化方法产生。可以将携带希望的核酸构 建体的载体导入组织培养的植物或者外植体或者合适的植物系统如原生质体的可再生大 麦细胞中。 [0427] 可再生的大麦细胞优选来自未成熟胚的盾盖，成熟胚，衍生自这些的愈伤组织，或者分生组织。 [0428] 为了证实转基因细胞和植物中存在所述转基因，可以使用本领域技术人员已知的方法进行聚合酶链反应(PCR)扩增或者Southern印迹分析。转基因的表达产物可以根据 产物的性质而通过各种方式检测，包括Western印迹和酶测定。一种特别有益的量化蛋白 质表达及检测在不同植物组织中复制的方法是使用报道基因如GUS。一旦获得转基因植物， 可以使其生长产生具有希望表型的植物组织或部分。可以收获所述植物组织或者植物部 分，和/或收集种子。所述种子可以作为生长具有希望特性的组织或部分的另外的植物的 来源。 [0429] TILLING [0430] 本发明的植物可以通过使用称作TILLING(定向诱导基因组局部突变(TargetingInduced Local Lesions IN Genomes))的方法产生。第一步，在一群植物中通过用化学诱 变剂处理种子(或者花粉)诱导导入的突变如新的单一碱基对改变，然后促进植物生长产 生突变被稳定遗传的世代。从所有成员中提取DNA，贮藏种子，产生可以随时重复存取的资 源。 [0431] 对于TILLING测定，设计PCR引物以特异性扩增感兴趣的单一靶基因。如果靶是基因家族成员或者多倍体基因组的一部分，则特异性尤为重要。接着，可以使用染料标记的 引物从多个个体的集合的DNA中扩增PCR产物。这些PCR产物被变性和再退火以形成错配 的碱基对。错配或者异源双链体代表天然发生的单核苷酸多态性(SNP)(即该群中的一些 植物可能携带 相同多态性)和诱导的SNP(即仅很少的个体植物可能展示突变)。在异源 双链体形成之后，关键是使用核酸内切酶如识别并裂解错配DNA的Cel I以在TILLING群 中揭示新SNP。 [0432] 使用这种方法，可以筛选几千种植物以鉴别具有单碱基改变以及在基因组的任何基因或特定区域具有小的插入或缺失(1-30bp)的任何个体。测定的基因组片段的大小可 以是0.3-1.6kb。在8倍集合中，每个测定使用1.4kb片段(扣除由于噪音而难以进行SNP 检测的片段末端)和96个泳道，这种组合使得在每一个测定中可以筛选直至1百万个基因 组DNA的碱基对，使得TILLING是高通量技术。 [0433] TILLING在Slade and Knauf(2005)和Henikoff et al.，(2004)中进一步描述。 [0434] 除了可以有效检测突变之外，高通量TILLING技术是检测天然多态性的理想方法。因此，通过与已知序列形成异源双链体询问未知同源DNA表明多态性位点的数目和位 置。本发明鉴别了核苷酸改变和小的插入与缺失，包括至少一些重复数目多态性。这已经 被称作Ecotilling(Comai et al.，2004)。 [0435] 每个SNP均由其在几个核苷酸内的大致位置记录。因此每个单元型均可以基于其迁移率建档。序列数据可以使用与用于错配-裂解测定相同扩增的DNA等份以相对较少增 加的努力而获得。通过其与多态性的接近性选择一个反应的左侧或者右侧测序引物。测序 仪软件进行多重排列对比并揭示碱基改变，在每种情况中证实凝胶条带。 [0436] Ecotilling与目前用于大多数SNP揭示的方法-完全测序-相比，可以更低成本地进行。可以筛选含有列阵的生态型DNA的平板，而不用筛选来自诱变植物的DNA集合。由 于检测是在凝胶上以近乎碱基对分辨率进行并且背景模式在泳道之间是均一的，因此相同 大小的条带可以被匹配，因此在一个步骤中就可以揭示和确定SNP基因型。在这种方式中， 最终SNP测序是简化且有效的，对等份的与用于筛选相同的PCR产物进行DNA测序更是如 此。 实施例 [0437] 实施例1：材料和方法 [0438] 谷醇溶蛋白的分离与纯化 [0439] 为了从谷物中分离谷醇溶蛋白，将全麦面粉(10g)在200ml缓冲液中在25℃搅拌30分钟，所述缓冲液含有20mM三乙醇胺-HCl(TEA)、1％(w/v)抗坏血酸钠、1％(w/v)聚乙 二醇(MW 6000；PEG6000)和200μl植物蛋白酶抑制剂混合物(Sigma#P9599)，均调节为pH 8。将该悬浮液在7,000g离心15分钟，对沉淀再洗涤两次以除去溶解于水相缓冲液中的蛋 白质。将洗涤的沉淀中的谷醇溶蛋白通过在25℃搅拌30分钟溶解于40ml的含有1％(w/ v)二硫苏糖醇(DTT)、1％(w/v)PEG6000、1％(w/v)抗坏血酸钠的50％(v/v)丙-2-醇中。 离心该悬浮液，使用2体积的丙-2-醇从上清中沉淀谷醇溶蛋白并在-20℃贮存。当需要 时，通过在160g在4℃离心10分钟沉淀等价于10g面粉的等份，将沉淀物再次溶解于10ml 含有25mM TEA、8M新鲜去离子化尿素和1％DTT(均调节为pH 6)的缓冲液(缓冲液A)中， 或者溶解于所述其它缓冲液中。 [0440] 通过如下所述反相-快速蛋白质液相层析(RP-FPLC)从每个谷粒样品中纯化总谷醇溶蛋白级分：将谷醇溶蛋白(200μl)注射进与相似的3ml柱系列连接的1ml Resource RPC柱(Pharmacia)中。用2ml的95％溶剂A/5％溶剂B洗涤该柱，以及以2ml/分钟用30ml 从95％溶剂A/5％溶剂B至100％溶剂B的线性梯度洗脱谷醇溶蛋白。溶剂A是于水中的 0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)，溶剂B是于60％(v/v)乙腈水溶液中的0.1％(v/v)TFA。集 合相应于蛋白质峰的洗脱物。从未注射蛋白质的相似运行中集合溶剂对照物。 [0441] 通过如下所述RP-FPLC进一步分级分离大麦醇溶蛋白：除了洗脱梯度改变之外进行如上所述相同程序，溶剂B的浓度是在4ml是50％、在17ml是52％、在34ml是56％、 在37ml是58％、在41ml是60％、在44ml是62％、在47ml是64％、在50ml是66％、在 53ml是100％、在57ml是100％。收集1ml级分，并集合相应于A280峰的级分11-14(#1)、 19-23(#2)、31-34(#3)、43-51(#4)、53-58(#5)和63-64(#6)。 [0442] 分析方法 [0443] 将谷醇溶蛋白级分在25℃溶解于6M尿素、2％(w/v)SDS、1％(w/v)DTT、0.01％(w/v)溴酚蓝、0.0625M Tris-HCL(pH 6.8)中，通过如下所述SDS-PAGE检测。将5μl等 份谷醇溶蛋白-SDS溶液加样于SDS-PAGE凝胶上，使用预制(pre-cast)245×110×0.5mm、 8-18％聚丙烯酰胺梯度凝胶(ExcelGel Pharmacia)，在600V在15℃运行90分钟。将该凝 胶在于10％乙 酸中的40％MeOH中洗涤30分钟，然后用水洗涤10分钟。通过将该凝胶在 于8.5％磷酸中的0.06％(w/v)胶状Coomassie G250中浸湿30分钟对谷醇溶蛋白进行染 色，并且凝胶在水中脱色过夜。每个凝胶均根据10kDa标准Protein Ladder(BenchMark， Invitrogen)校准。 [0444] 将大麦醇溶蛋白级分也溶解于50％(v/v)异丙醇水溶液、1％(w/v)DTT中，用过量的乙烯基吡啶处理以还原二硫键并通过反相-HPLC(RP-HPLC，Larroque et al.，2000)检 验，用分离自大麦品系Riso56或Riso1508的谷醇溶蛋白校准，其中由于突变的原因整个B 或C大麦醇溶蛋白家族均未积累(Doll，1983)。 [0445] 提取物或级分中蛋白质水平通过Bradford(1976)所述方法确定。典型地，以96孔形式如下所述测量蛋白质含量，将10μl每个DTT/丙-2-醇上清加入200μl在水中1∶5 稀释的Coomassie蛋白质测定浓缩物(BioRAD)中，用γ球蛋白校准，并测量在595nm的吸 光度。 [0446] 离体T-细胞毒性测定 [0447] 将谷醇溶蛋白(50mg/ml于2M尿素中)用含有1mM CaCl2的PBS稀释，产生62.5、250、625、2500或者6250μg谷醇溶蛋白/ml，通过将25μl每种溶液加入100μl豚鼠肝 tTG(转谷氨酰胺酶(Sigma，T5398)，25μg/ml tTG在含有1mM CaCl2的PBS中)中脱酰胺 化，及在37℃保温6小时。通过在没有tTG的条件下保温相似地制备未脱酰胺化的溶液。 对于最高浓度谷醇溶蛋白加入溶剂对照物。其它对照物含有50μg/ml称作626fEE的已 知毒性ω-麦醇溶蛋白肽，所述626fEE肽单独或者与破伤风类毒素一起(50光形成单位/ ml)。称作DQ2-ω-1的ω-麦醇溶蛋白肽626fEE具有氨基酸序列QPEQPFPQPEQPFPWQP(SEQ ID NO：1)，由澳大利亚墨尔本Mimotopes合成。通过质谱分析和HPLC证实其相同性和纯度 (91％)。破伤风类毒素得自墨尔本Commonwealth Serum Laboratories。然后将所有溶液 在-20℃冷冻。 [0448] 为已经严格限制无谷蛋白饮食至少3个月的21个经生物活检证实HLA-DQ2+的乳糜泻对象提供3天每天150g煮沸的大麦作为其饮食的一部分，所述对象另外仍保 持无谷蛋白饮食。在饮食攻击开始之前或者在6天后立即收集肝素化的静脉血，通过 Ficoll-Hypaque密度离心(Anderson et al.，2000)自每个血样中分离外周血单个核细胞 (PBMC)。将PBMC细胞重悬于含有10％热失活的、集合的人AB血清的完全HT-RPMI培养基 (Invitrogen) 中。将脱酰胺化或者未脱酰胺化的谷醇溶蛋白和对照溶液解冻，并将25μl 5 加入含有100μl PBMC的孔中(3-8x10PBMC每孔)。将其在37℃在96孔平板(MAIP-S-45； Millipore，Bedford，MA)中培养过夜。通过加入25μl含有1mM CaCl2的PBS(单独缓冲液 对照物)进行对照培养。最终的谷醇溶蛋白浓度为2.5、10、25、100或者250μg/ml，最终尿 素浓度为50mM。每个培养物中产生的表示每种谷醇溶蛋白毒性的IFN-γ的水平通过目测 斑点形成而测定，使用二级抗体根据厂商指导进行测定(Mabtech，Stockholm，Sweden)，斑 点形成单位(SFU)使用自动ELISPOT阅读器(AID Autoimmun DiagnostikaGmbH；Germany) 6 计数。结果以平均斑点形成单位(SFU)±S.E表示。典型地，SFU/10PBMC的测定内变异系 6 数百分比基于6个CD对象中与0.5×10 个细胞保温的阳性对照物的6个一式两份测定结 果为14％(均＞20SFU/孔)。 [0449] 统计学分析 [0450] 方差分析(ANOVA)或者使用GenStat的t-检验用于确定观测到的由T细胞产生的平均SFU差异显著性，所述T细胞在饮食攻击之前(n＝10)或之后(n＝21)分离自乳 糜泻对象，且与大麦醇溶蛋白、谷醇溶蛋白或者对照物一起保温。 [0451] 21个攻击后个体的应答曲线显著不同，大比例的变异性是由于这些差异所致。为了考虑到不同患者应答，拟合随机系数模型。这是一种混合模型分析，使用Residual Maximum Likelihood(REML)进行，其允许随机选项，包括对象(患者)和患者体内的攻击 (蛋白质浓度)。为了稳定变异的实质异质性，在进行这项分析之前将数据进行对数转化。 为了解决0计数的问题，在采取对数之前在所有数据中加1。这个模型中的固定项是tTG与 包含的大麦醇溶蛋白级分的存在与不存在及其相互作用。 [0452] T细胞的双曲线模型也拟合未转化的平均SFU，所述T细胞得自21个经攻击后患者，暴露于6个tTG大麦醇溶蛋白级分或者4个tTG处理的谷物谷醇溶蛋白制品。 [0453] 大麦转化 [0454] 转化的大麦植物可以通过Tingay et al.，(1997)所述方法产生。二元载体中的基因构建体可以通过三亲接合导入高毒性农杆菌菌株(AGL1)中，然后将其用于将含有转 基因和选择标记基因(编码潮霉素抗性，从CaMV35S启动子表达)的T-DNA导入不成熟大 麦胚的盾盖的可再生细胞中，如下所述。 [0455] 将得自品种Golden Promise的开花12-15天之后的发育中的大麦种子从在温室中生长的植物的生长中的穗状花序中取出，在20％(v/v)漂白剂中灭菌10分钟，随后用 95％乙醇漂洗1次及用无菌水漂洗7次。然后在无菌条件从种子中取出胚(大小为大约 1.5-2.5mm)，从每个胚中切下体轴。将所述胚以切面向下置于含有愈伤组织诱导培养基的 培养皿上。使农杆菌转接合子在含有壮观霉素(50mg/L)和利福平(20mg/L)的MG/L肉汤 (每升含有5g甘露醇、1g L-谷氨酸、0.2g KH2PO4、0.1g NaCl、0.1g MgSO4·7H2O、5g胰蛋白 8 胨、2.5g酵母提取物和1μg生物素，pH 7.0)中在28℃通风生长至浓度为大约2-3×10 个 细胞/ml。然后将大约300μl细胞悬浮液加入培养皿中的胚中。2分钟之后，倾斜平板倒 出过量的液体，轻弹所述胚使切面(盾盖的体轴侧)向上。然后将所述胚移至愈伤组织诱 导培养基新鲜平板中，在24℃置于黑暗中2-3天。将所述胚移至愈伤组织诱导培养基中选 择(50μg/ml潮霉素和15μg/ml timentin)。 [0456] 将胚在这个培养基中在黑暗处在24℃保持2周。然后分离健康的愈伤组织，置于新鲜选择培养基中，在24℃在黑暗处进一步培育2周。之后将所述胚在含有细胞分裂素的 再生培养基中在24℃在光照下培育2周，移至含有细胞分裂素和植物生长素的生根培养基 中培育三个2周周期。然后将幼植物移至土壤混合物中，在喷雾苗床上保持2周，最后移至 温室中。 [0457] 包括γ射线照射的诱变方法 [0458] 大麦中导致D、C、B或γ-大麦醇溶蛋白表达降低的基因突变可以通过γ射线照射或者化学诱变方法如使用甲磺酸乙酯(EMS)实现。对于γ射线诱导的突变，可以 60 20-50kR的 Co源的剂量照射种子(Zikiryaeva and Kasimov，1972)。EMS诱变可以通过用 EMS(0.03％，v/v)处理种子进行，如Mullins etal.(1999)所述。在B+C双无效背景中，突 变谷粒可基于蛋白质或者大麦醇溶蛋白含量降低或者谷粒形态学改变而鉴别，并通过如上 述方法证实。一个大麦醇溶蛋白基因突变体可以与另一个突变体杂交，以组合所述突变及 产生在胚乳中基本没有大麦醇溶蛋白的非转基因大麦品种。 [0459] 实施例2：大麦醇溶蛋白对于腹腔的毒性 [0460] 大麦及其它谷物的谷醇溶蛋白组成 [0461] 谷醇溶蛋白作为醇水溶液可溶蛋白从腹腔毒性谷物、大麦和小麦、低 毒性燕麦和无毒性玉米中分离，并如实施例1所述通过一次RP-FPLC循环纯化。在RP-FPLC中通过A280nm 确定的谷醇溶蛋白的蛋白质洗脱谱(图1)示出通过急速增加溶剂梯度而洗脱的各个蛋白 质的一系列部分分离峰(resolved peak)。组合并冻干含有针对每个谷物10次纯化的蛋白 质的级分。各个谷物(2g)的谷醇溶蛋白典型产量是：玉米，10mg；燕麦，23mg；大麦，73mg； 小麦，114mg。冻干并贮存每个谷物的总谷醇溶蛋白以用于离体T细胞测定(见下述)。从 RP-FPLC程序中也制备溶剂对照物。 [0462] 对大麦谷醇溶蛋白(大麦醇溶蛋白)也通过如实施例1所述RP-FPLC进行分级分离。在最初实验中分级分离期间获得的洗脱谱示于图2。获得6个峰，回收每个峰的蛋白 质。组合并冻干来自20个相继注射的相应集合的级分。4g全麦面粉的典型产量为：级分 1，19mg；级分2，26mg；级分3，14mg；级分4，104mg；级分5，24mg以及级分6，11mg。 [0463] 每个级分中大麦醇溶蛋白通过如实施例1所述SDS-PAGE确定，并通过分析RP-HPLC证实。结果在图3和6中示出。HPLC示出级分#1含有大约39％D大麦醇溶蛋白， 其在SDS-PAGE上行至90kDa，以及含有大约61％C大麦醇溶蛋白，其在SDS-PAGE上行至47 和48kDa(图3，#1)。通过SDS-PAGE和HPLC示出级分#2含有C大麦醇溶蛋白。级分#3含 有较宽的蛋白质条带，其在SDS-PAGE上行至大约45kDa，但是在HPLC上解离为6个峰，相应 于C和B大麦醇溶蛋白二者的洗脱。通过HPLC估计所述组成分别含有43％和57％的C和 B大麦醇溶蛋白。级分#4、5、6含有B大麦醇溶蛋白；这些级分也含有少量γ-大麦醇溶蛋 白。这些大麦醇溶蛋白级分的二维电泳和胰蛋白酶质量指纹分析未产生足够特殊的肽片段 以明确鉴别各个大麦醇溶蛋白。这也许是由于分离的大麦醇溶蛋白与得自数据库的序列之 间的微小序列变化导致。这个实验中的分级分离因此导致来自大麦的特定大麦醇溶蛋白富 集，但未完全纯化。进一步的纯化可以通过进一轮的RP-FPLC或者RP-FLPC组合离子交换 层析方法实现。 [0464] 将每个大麦醇溶蛋白级分样品用或不用将蛋白质中谷氨酰胺残基转变为谷氨酸的tTG处理，然后冻干以用于T细胞测定中。 [0465] 毒性测定 [0466] 如实施例1所述进行T-细胞测定，使用分离自经证实患有乳糜泻的对象的PBMC，以确定总谷醇溶蛋白制备物与大麦醇溶蛋白级分的毒性。在 用大麦饮食攻击之前和之后 分离PBMC，将谷醇溶蛋白样品用或不用tTG处理。在饮食攻击之前分离自10个乳糜泻对 象的T-细胞对谷醇溶蛋白无应答。使用ANOVA的统计学分析示出最高浓度的所有tTG处 理的谷醇溶蛋白、肽或者大麦醇溶蛋白级分(组平均SFU±S.E.为1.52±0.18)与对照培 养物(平均SFU±S.E.为1.40±0.45)的IFN-γ阳性斑点的平均数之间无显著差异(P＝ 0.77)。相反，分析示出与谷醇溶蛋白相比，预先攻击T细胞与阳性对照物破伤风类毒素(平 均SFU±S.E.为22.3±4.72)强烈反应(P＜0.001)。这表明分离的T细胞是功能性的且能 与已知毒素反应，并证实在饮食攻击之前分离的群中存在少量谷醇溶蛋白反应性T细胞。 [0467] 与在饮食攻击之前对谷醇溶蛋白无应答相反，在饮食攻击之后分离的T细胞是高反应性的。当与暴露于非脱酰胺化谷醇溶蛋白的这组的一个亚组(n＝13)的T细胞相比， 在攻击之后6天分离自21个乳糜泻对象的T-细胞对于tTG处理的谷醇溶蛋白强应答。图 4示出谷物、总大麦谷醇溶蛋白诱导最高数目的SFU，随后是依次降低的小麦、燕麦和玉米 中的谷醇溶蛋白(分别见图4中A、B、C、D)。尽管玉米谷醇溶蛋白在这些测定中激发低剂 量依赖性T细胞应答，但是其在饮食攻击中通常不激发应答，被认为是乳糜泻对象安全性 谷物。肠道内消化可破坏全玉米谷醇溶蛋白中存在的表位，其在我们的测定中保持完整且 在体外刺激T细胞。 [0468] 在大麦醇溶蛋白级分中，级分#1、#2和#3与大麦醇溶蛋白级分#4、#5和#6相比产生更高数目的SFU(图5)。 [0469] 随着测定中谷醇溶蛋白浓度增加，IFN-γ斑点的数目以双曲线方式增加，与在酶与其底物之间通常可见的Michaelis-Menten酶动力学方式相似(图4和5)，但是还不清楚 这些细胞测定为什么出现这种情况。 [0470] 每个96孔平板均含有许多内部阳性和阴性对照。但对比对照培养物与溶剂对照物时，平均SFU之间存在少量但显著的差异(P＜0.001)(在不存在和存在tTG的条件 下，对照培养物SFU分别为2.75±0.67和1.49±0.24；溶剂对照SFU分别为2.64±0.23 和2.75±0.23)。尽管存在统计学意义，但是这些数值与阳性对照或者含有谷醇溶蛋白的 测定中攻击后SFU对比非常小。这证实溶剂杂质不产生假阳性。阳性对照肽626fEE产生 一致性高应答(在不存在和存在tTG的条件下，平均SFU±S.E.分别为29.55±4.38和 33.60±2.97)。预期626fEE对tTG无应答，因为这个肽在第10个残基是用谷氨酸合成 的， 不需要用tTG处理其毒性。溶剂对照物的加入不明显抑制阳性626fEE肽的应答(P＝ 0.13)，证实溶剂杂质不产生假阴性。破伤风类毒素对照物的平板与平板之间的一致性(P ＝0.193)证实T细胞应答谷醇溶蛋白中的差异不是由于平板与平板之间的变化引起，但是 反映出来自不同对象的T细胞群的不同敏感性。 [0471] 不同对象对于相同浓度谷醇溶蛋白的应答存在多如200倍的变化。因此，拟合随机系数REML模型为标准化SFU数据，发现由于蛋白质浓度不同而使得患者应答弯曲的模型 与不考虑浓度的拟合的单一患者应答的模型相比提供明显更好的数据拟合(P＜0.001)， 偏差从1982.28(1616df)改变至1640.91(1613df)。由tTG(P＜0.001)和谷醇溶蛋白级分 (P＜0.001)所致主要作用具有显著意义，二者之间无相互作用。这证实在用大麦进行饮食 攻击之后6天在乳糜泻对象中诱导谷醇溶蛋白应答性T细胞。标准化的SFU数据的对数规 格的拟合平均值是1.613(无tTG)和2.026(加上tTG)，标准误差(SED)是0.0527，证实用 tTG预处理对于应答具有显著作用。大麦醇溶蛋白级分#1-#6的拟合平均值分别是1.903、 1.909、1.956、1.693、1.724和1.733，SED为0.0826。这些结果示出大麦醇溶蛋白级分分成 两个显著不同的毒性组，大麦醇溶蛋白级分#1、#2和#3组成比大麦醇溶蛋白级分#4、#5和 #6级分更具毒性的组。 [0472] 令人感兴趣地注意到大多数毒性大麦醇溶蛋白级分首先从反相FPLC和HPLC中洗脱，因此比稍后洗脱的低毒性级分更具极性。 [0473] 结论 [0474] 如对于乳糜泻所预期的，与未脱酰胺化的谷醇溶蛋白相比，在攻击之后6天分离自21个乳糜泻对象的T-细胞对于tTG处理的谷醇溶蛋白强应答(Hadjivassiliou et al.， 2004；Kim et al.，2004)。这可以通过脱酰胺化的谷醇溶蛋白与关键蛋白如将刺激性蛋白 + 呈递给参与炎症应答的CD4T-细胞上的受体的HLA-DQ2分子中的结合位点之间的相互作 用来解释。 [0475] 尽管大麦醇溶蛋白级分的毒性存在可测量的差异，但是所有大麦醇溶蛋白与认为对于大多数腹腔是安全的玉米和燕麦谷醇溶蛋白相比均明显更具毒性。统计学分析示出大 麦谷醇溶蛋白和大麦醇溶蛋白级分#1、#2和#3(含有D和C大麦醇溶蛋白)组成最毒性的 组。主要含有B大麦醇溶蛋白的大麦醇溶蛋白级分#4、#5和#6和小麦谷醇溶蛋白组成第 二位的较低毒性的 组。燕麦和玉米谷醇溶蛋白组成最低毒性组。这表明乳糜泻对象内由 大麦攻击诱导的T细胞对于小麦和燕麦较不敏感。这也许是由于大麦谷醇溶蛋白中的显性 表位与小麦和燕麦谷醇溶蛋白中的那些明显不同。尽管拟合数据表明燕麦谷醇溶蛋白比大 麦谷醇溶蛋白的毒性显著更低，但是不同对象对于相同浓度燕麦谷醇溶蛋白应答之间存在 50倍差异，来自21个对象中的5个对象的T细胞在最高谷醇溶蛋白浓度具有20个以上的 SFU。这与关于对燕麦的严重腹腔应答个体的其它报道一致(Arentz-Hansen et al.，2004； Lundin et al.，2003)。 [0476] 基于这个数据可以认为，在饮食攻击中所有大麦醇溶蛋白级分均激发乳糜泻对象显著的肠道反应。这提示所有大麦醇溶蛋白级分均需要缺失或修饰以产生对于腹腔完全无 毒性的大麦。这也提示主要成分大麦醇溶蛋白B和C应首先被除去或修饰。 [0477] 实施例3：B和C大麦醇溶蛋白均降低的大麦谷粒的产生 [0478] 先前已经鉴别了大麦醇溶蛋白合成与积累受影响的许多大麦突变体。这些大麦突变体未针对降低谷粒中大麦醇溶蛋白的目的而分离，而是针对增加谷粒中赖氨酸水平而分 离和选择，随后发现大麦醇溶蛋白降低。 [0479] 突变体Riso 7首先由Doll et al.(1976)描述，是在对亲本Bomi进行快中子处理之后鉴别。其含有基因阴性突变，导致与Bomi相比谷醇溶蛋白降低29％以及蛋白质的赖 氨酸含量增10％。赖氨酸含量低的谷醇溶蛋白降低由其它相对富含赖氨酸的贮藏蛋白补 偿，导致赖氨酸含量增加。与亲本相比，谷粒产量和淀粉含量分别降低6％和7％(Talberg， 1982；Doll，1983)。 [0480] Riso 56首先由Doll et al.(1973)描述，是通过亲本Carlsberg II的γ射线突变而产生。谷粒大小、谷粒产量和谷醇溶蛋白含量相对于亲本分别降低30％、47％和25％， 而突变谷粒中蛋白质的赖氨酸含量与亲本相比增加13％。降低的大麦醇溶蛋白含量与增 加的非蛋白质氮及水和盐溶性蛋白质相关(Shewry PR et al.1980)。Riso 56中蛋白质的 高赖氨酸含量是由于在称为Hor2ca的基因座(Doll，1980)的染色体5上的隐性突变所致 (Ullrich andEslick，1978)。所述突变包括从编码大麦中B大麦醇溶蛋白的Hor2基因座 缺失80-90kb DNA。B大麦醇溶蛋白的表达在突变体中降低75％，而C大麦醇溶蛋白的表达 增加2倍(Kreis et al.，1983)。这个缺失与也存在于Riso 56 中的染色体2和5之间的 易位无关(Olsen，1977)。 [0481] Riso 527首先由Doll et al.(1973)描述，也是通过γ射线突变而产生，但是来自亲本Bomi。谷粒大小、谷粒产量和谷粒谷醇溶蛋白含量与亲本相比分别降低13％、25％ 和20％，而突变体中蛋白质的赖氨酸含量增加12％。这个突变是隐性的，在染色体6上称 为lys6i的基因中(Jensen，1979)。这个突变体具有降低水平的D大麦醇溶蛋白和增加水 平的B1大麦醇溶蛋白(Klemsdal et al.，1987)。 [0482] Riso 1508在亲本Bomi的EMS突变后被鉴别(Doll et al.，1973；Ingerversenet al.，1973；Doll，1973)。谷粒大小、谷粒产量和谷粒谷醇溶蛋白含量与亲本谷粒相比分 别降低8％、12％和70％，而突变体中蛋白质的赖氨酸含量增加42％。所述高赖氨酸含量是 由于位于大麦染色体7的着丝粒区域附近的基因中的隐性突变所致(Karlsson，1977)。这 个基因首先被命名为shrunken endosperm xenia sex3c(Ullrich and Eslick，1977)，但是 现在通常已知为lys3a(Tallberg，1977)。突变体谷粒中的蛋白质类型的相对水平被改变， 具有更多的水溶性蛋白质(白蛋白/球蛋白)，总种子蛋白氮从27％增加到46％，更少的谷 醇溶蛋白，相对于亲本降低70％，总种子蛋白氮从29％降低到9％(Ingerversen et al.， 1973；Doll，1973)。当植物在高水平氮肥下生长时，与亲本相比在Riso 1508中游离氨基酸 和非蛋白N均有4倍增加(Koeieand Kreis，1978)。Shewry et al.(1978)证实了盐溶性 非蛋白氮的水平被加倍。与Bomi相比，在Riso 1508中作为大麦醇溶蛋白的种子氮比例降 低70％，盐溶性蛋白增加70％。详细的分子学分析显示B和C大麦醇溶蛋白水平分别降低 80％和93％，而D大麦醇溶蛋白增加4倍。这些对蛋白质积累的作用是由于mRNA丰度或稳 定性中的变化所致(Kreis et al.，1984)。这可能是由在Riso 1508突变体中编码B和C 大麦醇溶蛋白的基因的启动子的甲基化增加所介导(Sorensen et al.，1996)。Riso 1508 的种子大小较小主要是由于淀粉合成降低导致(Koeie and Breis，1978；Kreis and Doll， 1980；Doll，1983)。与亲本相比，Riso 1508中糖增加2倍而淀粉合成降低大约20-30％。 Kreis(1979)报道了β-淀粉酶水平在Riso 1508中降低，而Hejgaard and Boisen(1980) 报道了相似水平的β-淀粉酶。 [0483] Hiproly是自发突变体，从Ethiopian种质CI 3947中鉴别(Munck et al.，1970)，其具有增加水平的总蛋白质及蛋白质赖氨酸，相对于野生型大麦增 加20-30％(Doll， 1983)。当与野生型大麦杂交时，高蛋白质含量丧失，而增加的蛋白质赖氨酸含量保留，证实 这些性状是独立遗传的。增加的赖氨酸含量是由于染色体7上lys基因的单隐性突变导致。 突变增加了水及盐溶性蛋白质的水平及因此的赖氨酸含量。与Riso高赖氨酸突变体不一 样，在Hiproly中的大麦醇溶蛋白水平及种子重量在回交后代中不降低。非蛋白质氮也不 增加。β-淀粉酶含量增加4倍(Hejgaard and Boisen，1980)。 [0484] 亲本品系Riso 56和Riso 1508的鉴定 [0485] 亲本品系Riso 56和Riso 1508积累的谷醇溶蛋白的特征经SDS-PAGE和反相HPLC证实。从谷粒中提取的盐溶性蛋白质经凝胶电泳分离并转移至膜(Western印迹)。对 总蛋白染色(图7，左侧)或用谷醇溶蛋白特异性单克隆抗体(小鼠单克隆抗体MAb1224，针 对总麦谷蛋白提取物产生，其检测全部大麦醇溶蛋白和谷醇溶蛋白(Skerritt，1988))处 理的(右侧)膜上的蛋白质模式显示B大麦醇溶蛋白水平在Riso 56中非常低，而相对于 Riso527中的水平C大麦醇溶蛋白增加。抗体检测证实Riso 56提取物中的B大麦醇溶蛋 白水平极低(虚线方框)。Riso 56中可见的与B大麦醇溶蛋白共迁移的3个蛋白质很可 能是γ-大麦醇溶蛋白。在Riso 1508中，B大麦醇溶蛋白的积累降低，而C-大麦醇溶蛋 白几乎不可检测(虚线方框)。这与公开文献一致。相对较少的谷醇溶蛋白成分D大麦醇 溶蛋白水平在用于这个凝胶中的蛋白质荷载看起来不增加。 [0486] 图8显示了在反相FPLC分析后纯化提取物中不同大麦醇溶蛋白的相对水平。等价于0.2g面粉的大麦醇溶蛋白提取物如实施例1所述经FPLC分析。因此，A280层析图下 面积与每个样品的相对蛋白质含量成比例。在Riso 56中，与亲本Carlsberg II相比C大 麦醇溶蛋白水平增加400％，B大麦醇溶蛋白水平降低86％。在Riso 1508中，与亲本Bomi 相比C和B大麦醇溶蛋白均降低(分别91％和86％)。这些模式与公布数据相似。 [0487] 具有两个大麦醇溶蛋白突变的种子的鉴别 [0488] 品系Riso 56和Riso 1508的植物通过去雄Riso 1508并在两天后将它们用新鲜Riso 56花粉授粉而杂交。萌发10个F1种子，生长F1植物并使得其自花受精。成熟时收 获F2种子。 [0489] 为鉴别群中的双突变体，每种288个F2种子的一半在塑料微管中用不锈钢球逐个粉碎并研磨成粉末，在96孔振动磨(Retsch Gmbh，Rheinische) 中30/秒振荡3x 1.5分 钟。向每管中加入水性缓冲液等份(400μl)以提取水溶性蛋白质。缓冲液含有20mM三乙 胺-HCl(TEA)，1％(w/v)抗坏血酸钠，1％(w/v)PEG6000和1/1000植物蛋白酶抑制剂稀释 液(Sigma P9599)，在室温(RT)pH 8。再次振荡每管内容物，然后在RT以160g离心10分钟。 以同样方式再洗涤水不溶性面粉沉淀2次，集合各个上清以产生水溶性级分。沉淀中的醇 溶性谷醇溶蛋白然后如下提取，加入400μl 50％(v/v)含有1％(w/v)DTT的水性丙-2-醇 并如上振荡试管，随后在RT保温30分钟，如上第二轮振荡和离心。合并含有提取的谷醇溶 蛋白的各个上清并转移至新试管。在DTT/丙-2-醇上清中的蛋白质含量用Coomassie试 剂(BioRAD)测量，200μl等份中的谷醇溶蛋白用400μl丙-2-醇沉淀并在-20℃储存过 夜。. [0490] 如实施例1所述通过SDS-PAGE检查每种谷醇溶蛋白半种子提取物等份的B和C大麦醇溶蛋白的丧失(图9)。筛选凝胶以每个种子基础上样，每泳道携带1/20种子等价物。 特别地，检查提取物中在40kDa(B大麦醇溶蛋白特异的)和70kDa(C大麦醇溶蛋白特异的) 的特征性大麦醇溶蛋白条带的不存在或降低。亲本品系Riso 56和Riso 1508的种子的B 和C大麦醇溶蛋白分别降低，但是仍含有低水平的在100kDa的D大麦醇溶蛋白(图9)。大 部分F2种子提取物含有野生型模式，存在D、C和B大麦醇溶蛋白(图9)，证实两个亲本品 系之间的有效杂交已经制备。16个种子看起来缺少B和C大麦醇溶蛋白，因此被记录为对 亲本中存在的两种遗传损害是纯合的。这些从288个半种子中鉴别(频率为0.055)。这与 针对两个简单的、隐性突变组合预期的1/16(0.0625)的频率相似。 [0491] F2半种子的醇溶性提取物中的总蛋白质水平与来自野生型和亲本种子的进行了比较。数据示于表1。F2种子提取物中的蛋白质水平降低到野生型的20％以下，在一些情 况中15％以下。这些值可能已被提取物中存在的非蛋白质氮化合物如游离氨基酸升高。 [0492] 表1.在F2大麦半种子的醇溶性提取物中的蛋白质水平 [0493]样品 醇溶性蛋白(μg/种子±SE) ％Bomi 对照 Bomi 512±130 100％ Riso 56 364±44 71％ Riso 1508 147±26 28％ 双无效 RE9 129.6 25％ RF8 89.6 18％ RH2 85.6 17％ BA9 85.6 17％ RB10 85.6 17％ RA9 82.4 16％ RG12 75.2 15％ BB11 72.8 14％ BD5 72 14％ BD9 73.6 14％ BE8 58.4 11％ BF8 59.2 12％ BB5 57.6 11％ RB5 57.6 11％ [0494] F2品系之间观察到的谷醇溶蛋白水平的差异可能是由于来自亲本的其它基因或突变的分离导致。 [0495] 通过取含有20μg蛋白质的DTT/丙-2-醇上清、在SpeediVac中真空干燥、将蛋白质溶解在20μl含有62.5mM Tris-HCl(pH 6.8)，12.5％(w/v)甘油，2％(w/v)SDS，1％ (w/v)DTT和0.112％(w/v)溴酚蓝的缓冲液中及在沸水浴中加热90秒而进行额外的蛋白 质凝胶电泳。将每种溶液上样到预制SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，电泳，染色并如上所述检查。 典型凝胶示于图10。大多数选择的F2种子看起来同时缺少B和C大麦醇溶蛋白，假定为 “双无效”。尽管每条泳道根据染料结合蛋白质测定上样相同量的蛋白质，但是大多数来自 双无效的提取物看起来含有比对照少相当多的蛋白质，特别是它们含有极少的大于20kDa 的蛋白质材料。这可以通过提取物中存在非蛋白质氮化合物如游离氨基酸而解释，其可以 升高由染料-结合蛋白测定估计的表观蛋白质水平。这个作用也在Riso 1508提取物中见 到，其中作为蛋白质条带电泳的总可染色材料与Riso 56或Bomi相比减少。Riso 1508已 示出积累更多的非蛋白质N如游离氨基酸(Koie and Kreis，1978)。 [0496] 还检查了F2种子的截面。当与野生型相比时，在一些情况中，表观双无效种子的胚乳看起来中度收缩，在其它一些中重度收缩。 [0498] 表2.F2大麦植物的生长和产量参数，根据F3种子的100种子重量排名，Red＝对于特异的大麦醇溶蛋白是降低的 [0499]) 8K ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ％( ％001 ％8.49 ％1.09 ％5.68 ％2.68 ％4.28 ％6.97 ％6.97 ％7.57 ％6.67 ％7.07 ) ) ％3.65 ％8.65 量重 61. (11. (50. (31. (20. (10. (90. (90. (80. (21. (30. (71. ％4. ％5. (11. (10. 子种 0±7 0±5 0±1 0±9 0±2 0±1 0±3 0±0 0±0 0±2 0±6 0±9 26(0 16(6 0±2 0±4 001 4.5 6.4 4.4 1.4 0.4 0.4 8.3 7.3 7.3 5.3 5.3 2.3 9.2 8.2 6.2 6.2 4 穗/子 7.0±3.0 4.1±9.1 1.1±0.2 2.1±0.9 7.0±0.0 2.1±8.5 0.1±0.6 9.0±5 2.1±8.6 6.0±3.4 4.0±9.3 6.0±7.9 8.0±2. 6.1±6. 5.1±6. 1.1±4.种 1 2 2 1 2 1 1 1 1 1 2 1 9 6 9 7 20. 20. 10. 10. 10. 20. 20. 10. 10. 20. 20. 10. 20. 50. 30. 30. 数 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 指 ±0 ±3 ±6 ±6 ±6 ±6 ±5 ±5 ±1 ±2 ±7 ±6 ±7 ±5 ±7 ±5 获收 6.0 6.0 6.0 5.0 6.0 4.0 4.0 4.0 5.0 5.0 5.0 5.0 4.0 3.0 3.0 3.0 79 5. 0. 数 .0± 3±5 2±0 蘖分 2.9 43 04 11 .72 82 43 91 .02 43 23 91 42 32 21 71 2.2 61. 49. 41. 43.0 42. 91. 86. 43.0 63. 17. 97. 32. 66. 97. 95. ±43 1±7 0±6 2±8 ±14 2±0 1±4 1±9 ±42 1±3 1±7 0±9 1±3 1±4 2±9 0±8 度高 .63 .45 .64 .65 .63 .26 .16 .36 .65 .74 .05 .44 .24 .16 .15 .94 型 表 白 蛋 溶 醇麦大C和 T T T 的低降c B.deR，效无 的低降c 的低降c B.de 效无 T 的低降c B.de 的低降c B.de T 的低降cB W W W b c b b R b W b R b R W b 物 pool 8 1 ER 8051 BR 1 DB 65 5 1 HB 6 FR 1 4 植 S K L 9 R 5 G 5 R B J 4 D 6 B J [0500] 测量植物高度、穗和茎重量、分蘖数、每穗种子及100种子重量。收获指数从穗重量/(茎重量+穗重量)比率计算。F3种子然后在田中生长以提供每个品系的F4种子。 [0501] F3种子当与亲本和对照品系Sloop相比时在所有测量参数中均显示相当差异。许多表观双无效品系如J4和6RF具有降低高达大约40％的100种子重量，或者相对于野生型 同胞K8降低的每穗种子数。这提示在群体中有其它基因分离及大麦醇溶蛋白B或C突变 对产量有作用。但是，一些F3品系具有大于或等于亲本的种子重量，因此可能其它基因可 以与B大麦醇溶蛋白和lys3a突变分离。 [0502] 在截面中，当与野生型同胞或对照Sloop相比时，F3种子的外观从收缩(类似于Riso 1508)至轻微收缩(类似于Riso 56)而变化。 [0503] 来自一些品系的8个F3种子的总水溶性和醇溶性蛋白如上所述提取。醇溶性和水溶性级分的蛋白质含量如实施例1所述使用已知量的γ-球蛋白作为蛋白质标准而测量。 但是在一些F3种子样品中的总醇溶性蛋白水平基本上与Riso 1508相同。随后确定这些 种子样品对于Lys3a基因的野生型等位基因是分离的，不是均一的“双无效”。 [0504] 经RP-FPLC量化F3种子中的大麦醇溶蛋白水平 [0505] 组合来自每个品系的两个种子的醇溶提取物并如上所述经RP-FPLC检查50μl。层析图如图11所示。计算相应于大麦醇溶蛋白的层析图下总面积并相对于野生型品系中 的水平表示。数据(表3)显示F3谷粒具有野生型水平30％以下的大麦醇溶蛋白水平，在 一些情况中为20％以下，甚至低至5.3％。SDS-PAGE后缺乏实质蛋白质条带支持了这样的 假说，总醇溶蛋白水平由于F3种子中的升高的非蛋白质氮水平而升高。 [0506] 表3.由RP-FPLC测量的F3种子中相对大麦醇溶蛋白水平 [0507]品系 大麦醇溶蛋白含量 野生型(K8) 100％ R56 70％ R1508 50％ 4BH 26％ 5RB 21％ 9RE 16％ J1 5％ [0508] 实施例4.田间生长的F4大麦谷粒的性质 [0509] 比较了温室生长和田间生长的选择的品系(9RE，J1，G1，4BH)、单无效亲本(Riso56和Riso 1508)及野生型大麦(Sloop；Bomi；及K8，一种来自与双无效品系相同的杂交的 重构(reconstituted)的野生型同胞)的F4种子的特征。 [0510] 种子重量 [0511] 在温室中生长的F4种子的100种子重量在Sloop的60-76％之间变化(每100种子5.47+0.16g)，而田间生长谷粒的F4的100种子重量更低，在Sloop的58-65％之间变化 (4.75g+0.04)。 [0512] 谷粒萌发 [0513] 将来自两个选择的F4大麦品系的种子的萌发与野生型栽培种Sloop进行比较，通过将100谷粒样品在湿纸上吸涨6天而进行。萌发观测为从种皮出现根尖。F4谷粒看起来 以与野生型谷粒相同速率萌发，在3天后有大约60-70％萌发。在吸涨之前将谷粒在37℃ 储存4周略增加两个F4品系的％萌发。在4℃处理3天在新鲜收获材料上也实现相同增 加。 [0514] 这证实F4品系的谷粒未出现任何严重的萌发延迟，因此预测是农学有用的。 [0515] F4谷粒中的蛋白质水平 [0516] F4品系谷粒中的水溶性、醇溶性及尿素溶性蛋白质的水平用双份20mg全麦面粉样品测量，所述样品来自选择的品系(9RE，J1，G1，4BH)、单无效亲本(Riso 56和Riso 1508)及野生型大麦(Sloop；Bomi；及K8)的温室生长的F4种子。 [0517] 用0.5ml水从每种面粉样品提取水溶蛋白，即混合30分钟，在13000rpm离心混合物5分钟，除去上清，重复提取沉淀2次。集合上清(水溶性提取物)，以相同方式依次提取 沉淀3次，使用0.5ml的0.5M NaCl(盐溶提取物)，随后0.5ml含有1％(w/v)DTT的50％ (v/v)丙-1-醇(醇溶提取物(大麦醇溶蛋白))，随后含有1％(w/v)DTT的8M尿素(尿素 溶性提取物)。每个级分的蛋白质含量用染料结合测定(BioRad)根据厂商指导测量，针对 作为蛋白质标准的γ-球蛋白校准。数据示于图12。总可提取蛋白质含量(图12E)从所 有可溶级分的蛋白质含量之和计算。 [0518] 另外用一式双份2.5mg相同面粉样品经元素分析测量了总氮(总N；图12F)，元素分析在1800℃燃烧、在600℃还原为N2后进行，用质谱(Dumas法)量化。总蛋白质含量用 下式计算：蛋白质含量＝6.63x总N量。经MS得到的总蛋白质水平的数字与预期的总可提 取蛋白质含量合理相似，显示蛋白质提取是有效的。 [0519] F4谷粒的大麦醇溶蛋白含量(测量为醇溶蛋白质水平)降低至亲本(R1508和R56)的17-39％及野生型栽培种Sloop的7-16％。这代表了相对于野生型大麦Sloop，这 些谷粒样品中如上所示对于腹腔具有毒性的总大麦醇溶蛋白的水平大约10倍的降低。 [0520] 其它类型蛋白质特别是水溶和盐溶蛋白据认为对大麦谷粒的酿造性质具有有益效果。因为F4谷粒的水溶和盐溶蛋白水平类似于野生型Sloop的，认为F4谷粒具有足够 的这些蛋白质用于酿造目的。 [0521] 脂肪酸含量和组成 [0522] 由于种子生长发育期间的主要氮库(sink)已通过降低大麦醇溶蛋白而去除，分析突变体谷粒以确定发育中的种子是否可以通过增加其它成分的储存而补偿，这些成分中 有一些可能对于谷粒应用是有害的。来自F4谷粒的全麦面粉的一式双份50mg样品中的脂 肪酸被提取，甲基化并用定量气相层析(GC)使用Folich et al.(1957)的方法进行分析。 [0523] 品系G1、BB5、J1和J4的F4谷粒中的总脂肪酸浓度在大约2.5％至3％(w/w)的范围中变化，与单无效及野生型大麦谷粒中的水平相似。结论是双无效谷粒不含有升高水 平的脂肪酸。 [0524] 谷粒脂质中的脂肪酸主要包含亚油酸(C18:2)、油酸(C18:1)及棕榈酸(C16:0)，其它脂肪酸水平较低。与单无效亲本或野生型大麦相比选择的F4谷粒中积累的各个脂肪 酸的浓度无显著差异。特别地，高浓度对人体有毒的芥酸(C22:1n-9)在F4谷粒中的浓度 未增加。因此突变体谷粒具有正常脂肪酸含量及组成。 [0525] 淀粉水平 [0526] 淀粉是谷类谷粒的主要成分，典型地包含大约55-65％干重。淀粉水平在用于麦芽制造的大麦中特别重要。淀粉含量太低可导致形成的麦芽的糖含量不足以使得在酿造过程 中发生有效发酵，因此测量了大麦谷粒中的淀粉水平。 [0527] 基本上如Megazyme Method(AACC76.13)所述使用20mg全麦面粉样品分离和测定突变体谷粒的淀粉。F4谷粒中的总淀粉水平在57％-66％(w/w)范围内，与在51-64％(w/ w)范围内的单无效亲本和野生型大麦的淀粉含量相似。 [0528] 结论是F4大麦谷粒具有足够的淀粉，能够从谷粒产生麦芽。 [0529] β葡聚糖水平 [0530] 如Megazyme Method(AACC32.23)所述使用20mg全麦面粉样品测定突变体谷粒中的β-葡聚糖含量。品系G1，BB5，J1，J4谷粒中的β-葡聚糖水平在1.2-2.6％(w/w)范 围内，与在2.4-3.3％(w/w)范围内的单无效亲本谷粒和野生型大麦谷粒的β-葡聚糖含量 相似。 [0531] 高β-葡聚糖水平涉及在储存期间在啤酒中形成冷藏混浊(chillinghaze)。结论是F4谷粒的β-葡聚糖含量与野生型谷粒相比不升高，所述水平不太可能干扰这些谷粒的 酿造性能。 [0532] 游离氨基酸水平 [0533] 游离氨基酸积累增加可能对于谷粒应用是有害的。例如，足够量的游离天冬酰胺如果在淀粉存在下加热到高温可能形成有毒的化合物丙烯酰胺。 [0534] 谷粒中游离氨基酸的含量和组成用20mg来自温室生长的F4种子的全 麦面粉的双份样品测量。样品溶解于0.1N HCl中，取等份并干燥，用WatersAccQTag化学经 Australian Proteome Analysis Facility(Sydney)分析氨基酸。 [0535] 大麦面粉中的最主要氨基酸是下降顺序的脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和天冬氨酸，范围为从大约1.5mg/g面粉下降至0.5mg/g面粉。选择的F4谷粒中的游离脯氨酸含量在 0.6-1.5mg/g范围，与在0.2-1.2mg/g范围的单无效亲本及野生型大麦的游离脯氨酸含量 相似。所有其它游离氨基酸水平在F4和对照谷粒中相应地相似。特别地，F4谷粒中的游 离天冬酰胺含量对于品系G1、BB5和J1是大约0.5mg/g，对于品系J4是大约1.0mg/g。在 单无效亲本谷粒中，游离天冬酰胺水平是0.3或0.9mg/g，在野生型大麦谷粒中游离天冬酰 胺是在0.3-0.6mg/g范围。 [0536] 由于F4谷粒的游离天冬酰胺含量与相应野生型谷粒中的水平相似，认为在麦芽制造或谷粒其它应用期间从游离天冬酰胺产生丙烯酰胺与野生型谷粒无不同。 [0537] 游离赖氨酸已知是动物营养中的限制性氨基酸，因此这个氨基酸的水平对于谷粒潜在用作动物饲料是感兴趣的。品系G1、BB5和J1的F4谷粒中的游离赖氨酸含量是大约 0.5mg/g，品系F4的谷粒中是1.0mg/g。这代表了与栽培种Sloop的野生型谷粒中的水平相 比增加181％-1020％。因此F4品系相比Sloop是游离赖氨酸更营养的来源。 [0538] 实施例5.测试F4谷粒-T细胞毒性测试 [0539] 为测试F4谷粒的腹腔毒性，如下所述从来自田间生长种子的全麦面粉的10g样品分离和纯化大麦醇溶蛋白，所述种子是选择的品系9RE，J1，G1和4BH，单无效亲本(Riso 56 和Riso 1508)及野生型大麦(Sloop；Bomi；和K8)的种子。纯化的大麦醇溶蛋白加入到分 离自乳糜泻对象群体的T细胞以测试腹腔毒性。测试涉及测量与纯化蛋白质过夜保温后产 生γ-干扰素的T细胞数，使用抗体测定γ-干扰素水平。即γ-干扰素水平是谷粒中蛋 白质的毒性程度的指示。面粉的腹腔毒性的这个测量然后作为得自谷粒的面粉鲜重的函数 绘图。 [0540] 谷醇溶蛋白(大麦醇溶蛋白)的纯化 [0541] 全麦面粉(10g)在200ml含有20mM三乙醇胺-HCl(TEA)、1％(w/v)抗坏血酸钠、1％(w/v)聚乙二醇(MW 6000；PEG 6000)和1μg/ml蛋白酶抑制 剂E64和AEBSF(Sigma) 的缓冲液中于25℃搅拌30分钟；缓冲液调整至pH8。在5000g离心悬浮液5分钟，弃上清， 再将洗涤沉淀2次。洗涤的沉淀中的蛋白质溶解于80ml含有1％(w/v)DTT的50％(v/v) 丙-2-醇中，在60℃搅拌30分钟。悬浮液在4℃冰冷10分钟，在10000g、4℃离心10分钟。 上清中的包括大麦醇溶蛋白的蛋白质用2体积丙-2-醇在-20℃过夜沉淀，在10000g、4℃ 沉淀10分钟，沉淀溶解于10ml含有8M新鲜去离子化尿素、1％DTT、20mM TEA并调整至pH 6的缓冲液中。 [0542] 如下所述经FPLC纯化大麦醇溶蛋白。将大麦醇溶蛋白溶液(1ml)注射进8mlSource 15反相层析柱(RPC，Pharmacia)中。柱用4ml 5％溶剂B洗涤，大麦醇溶蛋白用 2.5ml从5％溶剂B至35％溶剂B的线性梯度以4ml/分钟洗脱，随后是36ml从35％溶剂B 至83％溶剂B的线性梯度。溶剂A是0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)于水中，溶剂B是0.1％ (v/v)TFA于60％(v/v)水性乙腈中。合并在25和43ml之间洗脱的级分。溶剂对照类似 地从无注射的柱中合并。组合并冻干相应的来自10个依次注射的集合。 [0543] 离体T细胞测定 [0544] FPLC纯化的大麦醇溶蛋白(50mg/ml于2M尿素中)用含有1mM CaCl2的PBS稀释，产生25，62.5，125，250，625，3,750或6250μg大麦醇溶蛋白/ml并通过将25μl每种溶液 加入到100μl豚鼠肝脏tTG(Sigma；25μg/ml tTG于含有1mM CaCl2的PBS中)中脱酰胺 化，并在37℃保温6小时。非脱酰胺化的溶液通过在不存在tTG下保温而相似制备。对于 最高大麦醇溶蛋白浓度加入溶剂对照。其它对照样品含有溶剂对照，含有已知毒素破伤风 类毒素(50光形成单位/ml，得自Commonwealth Serum Laboratories，Melbourne)的溶剂 对照；或者破伤风类毒素(50光形成单位/ml)单独。所有溶液然后在-20℃冷冻。 [0545] T细胞如下获得。严格无谷蛋白饮食至少3个月的6个生物活检证实的HLA-DQ2+乳糜泻对象每日消耗150g煮沸的大麦3天。经Ficoll-Hypaque密度离心从肝素化静脉 血分离PBMC，所述血液在即将开始饮食攻击之前或开始6天后收集，所述PBMC重悬于含有 10％热失活的集合的人AB血清的完全HT-PRMI中。将脱酰胺化或未脱酰胺化的大麦醇溶 蛋白和对照溶液解冻，并将25μl加入到含有100μl PBMC(3-8x105PBMC每孔)的孔中， 在96孔板(MAIP-S-45；Millipore，Bedford，MA)于37℃过夜培养，与加入25μl 仅含有 1mM CaCl2的PBS的对照培养物(无添加)比较。最终大麦醇溶蛋白浓度是0，1，2.5，5， 10，25，150或250μg/ml。最高的尿素终浓度是10mM。用第二抗体如厂商指导(Mabtech， Stockholm，Sweden)如先前Anderson et al.(2005)所述观测IFN-γ，用自动化ELISPOT 读数仪(AID AutoimmunDiagnostika GmbH；Germany)计数斑点形成单位(SFU)。结果以平 均斑点形成单位(SFU)±S.E比含有计算量的大麦醇溶蛋白的面粉的等价重量表示。每种 面粉样品的大麦醇溶蛋白含量在实施例5中计算，使得可以计算面粉重量。 [0546] 数据用GraphPAD Prism分析，最佳拟合曲线计算并显示为平均值+S.E。数据的r2值大于0.83，表示观测数据与最佳拟合曲线之间的良好拟合(图13)。 [0547] 结果 [0548] 在饮食攻击之前分离自一个乳糜泻对象的T细胞与在用大麦饮食攻击后分离自同一个体的T细胞相比对于以25μg/ml加入的谷醇溶蛋白的应答更低。对于在饮食攻击 之前和之后分离的T细胞观测到平均SFU±S.E.为29.5±3.0和104±15.9。这表明饮食 攻击诱导了乳糜泻特异性T细胞。 [0549] 使用在饮食攻击后6天分离的T细胞，阳性对照破伤风类毒素在tTG存在和不存在下给出一致应答(平均SFU±S.E.分别为28.1±5.9和20.2±7.4)。加入溶剂对照不 显著抑制阳性破伤风类毒素对照的应答(在tTG不存在和存在下平均SFU±S.E.分别为 20.5+4.1和17.6±6.0)，证实溶剂杂质不产生假阴性或抑制阳性应答。 [0550] 当与针对乳糜泻所预期的(Hadjivassiliou et al.，2004，Kim et al.，2004)暴露于非脱酰胺化的大麦醇溶蛋白的T细胞相比时，分离自攻击后6天的乳糜泻对象的T细 胞更强应答所有tTG处理的大麦醇溶蛋白级分(图13A；为清楚起见仅2个大麦醇溶蛋白 样品Sloop和G1的应答被示出)。这证实被测量的T细胞应答与腹腔毒性相关。 [0551] 随着大麦醇溶蛋白浓度增加，SFU数也以双曲线方式增加，如在酶与其底物之间的正常Michaelis-Menten酶动力学预期一样。通常用两个参数描述这种曲线：Bmax，预期在 最高浓度的最大SFU数；及Kd，诱导半数最大SFU所需的蛋白质浓度。面粉样品越有毒，Kd 越小。 [0552] 系数Kd和Bmax从最佳拟合曲线计算。Bmax值在野生型和突变体之 间不显著变化，如预期一样。相反，F4品系的Kd值与野生型品系相比高10倍(表4)。即与野生型面 粉相比需要大约10倍多的来自突变体品系的面粉来诱导半数最大毒性应答(表4)。因此， 结论是F4谷粒的腹腔毒性与野生型品系相比降低了大约10倍。这一降低水平与在F4谷 粒中经蛋白质确定发现的降低的大麦醇溶蛋白水平相当。 [0553] 表4.大麦面粉的T细胞毒性 [0554]品系 Kd (对于半数最大斑点的mg面粉) 野生型：Sloop 0.18±0.03 Bomi 0.18±0.02 单无效：Riso56 0.47±0.09 Riso1508 3.31±0.47 F4品系：G1 2.3±0.3 5RB 2.6±0.5 4BH 1.7±0.2 J1 1.4±0.2 [0555] F4谷粒的毒性比Riso 56的更低，与预期一致。但是F4谷粒的毒性与另一亲本Riso 1508相似。随后，在F4谷粒的进一步遗传鉴定中，发现这是由于在选择的F4品系中 编码B-大麦醇溶蛋白的基因的突变的杂合性导致，其具有升高大麦醇溶蛋白含量高于预 期值的作用。 [0556] 实施例6.F4谷粒的麦芽制造 [0557] 为确定大麦谷粒用于麦芽制造的适合性，进行分析，包括小规模麦芽制造(微型麦芽制造)试验。 [0558] 影响麦芽制造能力的一个因素是种子大小。来自F4谷粒的样品通过计数1000个种子由2.8、2.5或2.2mm筛保留的比例而分析种子大小分布。F4谷粒平均小于野生型并与 亲本谷粒Riso 1508和Riso 56相似，少于5％种子被2.5mm筛保留(表5)。这与对照品 系Galleon和Sloop相反，它们的90％种子大于2.5mm。注意衍生自相同Riso 1508X Riso 56杂交的野生型品系K8的谷粒大小也降低，因此种子大小降低至少部分与遗传背景相关， 而不是直接由降低的大麦醇溶蛋白水平所致。另外，较小的种子大小可以通过在谷粒浸渍 方法中的修改而补偿。 [0559] 表5.用于微型麦芽制造的种子大小 [0560]品系 由2.5mm筛保留的％种子群体 G1 1.0 4BH 2.6 5RB 3.2 J1 2.0 9RE 6.2 Riso 1508 4.0 Riso 56 6.9 K8 24.8 Bomi 56.6 Carlsberg II 57.5 Galleon 83.9 Sloop 91.6 [0561] 种子水分水平可影响麦芽制造性能。％水分及％氮经近红外(NIR)分析在微型麦芽制造之前测量。所有F4谷粒样品的种子水分水平均在11-11.4％之间的范围并与除栽培 种Galleon(GA1，8.9％)谷粒之外的对照品系相似。双无效品系的种子氮在2.3％和2.5％ 之间，高于为1.6％的对照麦芽制造品系栽培种Galleon。对于麦芽制造，种子氮水平最佳 在1.5和2.0％之间。 [0562] 来自选择的品系5RB，G1，J1，9RE，4BH的田间生长的F4谷粒、单无效亲本(Riso56和Riso 1508)及野生型大麦K8、栽培种Bomi，Carlsberg II，Sloop和Galleon的大麦 样品(170g)在16℃浸渍，即浸泡6小时，随后空气中休眠7小时，随后浸泡6小时，然后在 JWM微型麦芽制造系统中在15℃萌发4天。萌发谷粒在最低50℃、最高80℃烤干21小时， 通过摩擦和过筛清洁所得麦芽的根。 [0563] 分析麦芽的水分(％)，经整谷粒NIR分析总氮(％干重)和产量(表示为清洁的麦芽的重量作为大麦初始重量的百分比)。 [0564] 另外，在锤磨机中研磨麦芽样品，50g样品溶解于水中，从45℃加热至70℃，产生450g终重量溶液，分析其提取物(％溶解的谷粒重量)、颜色、可溶氮(N)、Kohlbach指数 (KI：％可溶蛋白/总蛋白)、β-葡聚糖、粘度、AAL(表观减弱极限(apparent attenuation limit)或可发酵性，用酿造酵母发酵期间密度的％降低)，每种均根据标准European Brewery Convention方案，http://www.ebc-nl.com/(表6)。 [0565] 麦芽的蛋白质含量通常高于希望的规范。这由总麦芽N及可溶N示出， 但可溶蛋白与总蛋白的比例(KI)接近于规范。F4麦芽汁的颜色和粘度接近于规范，麦芽汁中β-葡 聚糖水平低。这些特征对于麦芽制造是可接受的。 [0566] 麦芽制造过程涉及3个阶段：麦芽制造、麦芽汁制造(worting)和发酵。整体效率从每个阶段效率的3个测量计算：分别是产量、提取物及AAL。这些表明在每个阶段F4谷 粒效率比基准谷粒栽培种Galleon大约低10％。与Galleon相比，整体上需要大约1.3倍 多的F4品系谷粒以产生强度与商业标准相等的啤酒。 [0567] 所有这些说明麦芽可以从F4谷粒制造。 [0568] [0569] 实施例7.生麦芽样品的ELISA分析 [0570] 来自实施例6的大约40ml麦芽汁样品被冷冻、冻干并在室温溶解于20ml 6M尿素、1％(w/v)DTT、20mM TEA(pH 6)中。每个样品的蛋白质含量用Bradford的染料结合法 确定。含有在100μl 6M尿素、1％DTT和20mMTEA(pH 6)中的20μg麦芽蛋白质的系列稀 释液加至硝基纤维素膜(Amersham Hybond C+)，所述膜已在点印迹装置(BioRad)中在PBS 缓冲液中预平衡并用纯化的C-大麦醇溶蛋白标准(2μg)校准。溶液在降低的压力下通过 膜，膜用含有0.1％Tween 20的PBS缓冲液(PBST)洗涤，拆卸装置，将膜通过在室温在含 有0.1％Tween 20的PBS缓冲液中的5％(w/v)脱脂乳中保温1小时而封闭。大麦醇溶蛋 白用在PBST缓冲液中1∶2000稀释的第一抗体(与辣根过氧化物酶缀合的兔抗小麦麦 醇溶蛋白抗体，来自Sigma)在室温检测30分钟。膜用3次更换PBST缓冲液洗涤，通过在 10mlAmersham ECL western印迹试剂A和B的1∶1(v/v)试剂混合物(GEHealthCare)保 温而显色，信号通过曝光于Amersham Hyperfilm 30秒而检测。显色胶片并用Total Lab TL 100软件(Non-linear dynamics，2006)量化。 [0571] 从选择的F4谷粒产生的生麦芽溶液具有58±12.7ppm的平均大麦醇溶蛋白水平。 [0572] 这个水平大大低于FSANZ设定的澳大利亚低谷蛋白食品的200ppm限度并显著低于来自野生型栽培种Galleon，Sloop.K8，Bomi和Carlsberg II的麦芽中发现的平均 687±158ppm。其还显著低于从亲本Riso 56和Riso 1508制备的麦芽的大麦醇溶蛋白含 量。 [0573] 通常混合物的谷蛋白(大麦醇溶蛋白)含量通过麦芽制造、麦芽汁制造及发酵过程而急剧降低，最终稳定化啤酒可含有生麦芽中存在水平的1/1000(Dostalek et al.， 2006)。 [0574] 因此预测从F4麦芽制造的加工啤酒中的大麦醇溶蛋白水平将会降低至大约0.05ppm，大大低于从野生型大麦谷粒制造的啤酒中发现的3-40ppm范围(Dostalek et al.，2006)。 [0575] 最近一些文献推荐乳糜泻对象饮食中谷蛋白的限制。这些最可靠的是基于多中心、安慰剂对照的、双盲试验，并且显示消耗小于10mg/天对于乳糜泻对象是安全的；并且 推荐消耗应保持低于50mg/天(Catassi et al.，2007)。另一项最近研究证实这些发现并且 (Collin et al.，2004)建议消耗具有100ppm 谷蛋白的食品会导致消耗大约30mg/天并导 致对乳糜泻对象损害很小。FSANZ设定新西兰和澳大利亚的食品标准。Codex Alimentarius Commission在1963年由FAO和WHO创建以开发食品标准、指南和相关文件如在JointFAO/ WHO Food Standards Programme下的实施代码，并且在欧洲和北美洲被接受为法定规 定。Codex目前设定无谷蛋白限制是每100g食品小于0.05gN(作为谷蛋白)。有建议修 改Codex标准并建议对于从不含谷蛋白谷类制造的食品为20ppm的限制，对于从含有谷蛋 白的谷类制造的食品为200ppm的限制(p32，PROPOSAL P264，REVIEW OF GLUTEN CLAIMS WITHSPECIFIC REFERENCE TO OATS AND MALT，F SANZ 网址： http://www.foodstandards. gov.au/_srcfiles/P264 Gluten Claims FAR.pdf#search＝％22gluten％20free％22)。 [0576] 上述分析的结论是消耗从F4大麦品系产生的啤酒会很好地低于在上述研究中及包括由FSANZ和Codex Alimentarius设定的规定为用于乳糜泻或者的无谷蛋白食品设定 的安全限制。 [0577] 实施例8.F4品系的进一步鉴定 [0578] 醇溶蛋白从收获自每个指示品系的大量F4种子纯化，如上所述。来自品系G1，J1，4BH，5RB和9RE的F4谷粒的纯化的蛋白质样品(20μg)在25℃溶解于6M尿素、2％(w/v) SDS、1％(w/v)DTT、0.01％(w/v)溴酚蓝、0.0625M Tris-HCL(pH 6.8)，经SDS-PAGE检查，用 0.006％胶体考马斯蓝染色，并与分离自Riso 56，Riso 1508和野生型品系(K8)的大麦醇 溶蛋白比较。迁移与分子量标准比较以确定分子量(表7)。 [0579] 蛋白质序列通过质谱分析从凝胶切下的蛋白质斑点的胰酶消化物而获得，并如前所述(Campbell et al.，2001)经MS-MS片段化加工用于蛋白质测序，对NCBI非冗余数据 库检索。 [0580] 表7.SDS-PAGE的蛋白质鉴别 [0581]斑点 数 ID A 匹配的肽 (％蛋白质) NCBI 登录号 MSMS 评分之和 置信度E 3 D-大麦醇溶蛋白 15(20％) 30421167 205 确定 4 B3-大麦醇溶蛋白B 9(27％) 82371 122 确定 5 γ-3-大麦醇溶蛋白C 3(11％) 1708280 47 可靠 6 γ-大麦醇溶蛋白-1前体 1(2％) 123464 14 仅表明同源性 7 γ-大麦醇溶蛋白-1前体 6(24％) 123464 94 确定 8 γ-3-大麦醇溶蛋白D 14(30％) 1708280 199 确定 [0582] [0583] A：所有消化物均含有来自猪胰蛋白酶的肽，如预期。 [0583] B：还含有低水平D-大麦醇溶蛋白 [0584] C：还含有低水平B-大麦醇溶蛋白. [0585] D：还含有低水平γ-大麦醇溶蛋白-1前体 [0586] E：MSMS检索评分之和指示鉴定(identity assignment)置信度。从过去经验，可靠鉴别需要超过15的评分，超过50的评分表示几乎确定的鉴别。 [0587] 来自每个样品的肽结合至Agilent Zorbax SB-C185μm 150x 0.5mm柱，流速为0.1％(v/v)甲酸/5％(v/v)乙腈，20μl/min进行1分钟，然后用增加乙腈浓度至0.1％ (v/v)甲酸/20％(v/v)乙腈的梯度以5μl/min洗脱1分钟，然后至0.1％(v/v)甲酸/50％ (v/v)乙腈洗脱28分钟，然后至0.1％(v/v)甲酸/95％(v/v)乙腈洗脱1分钟。柱用从 0.1％(v/v)甲酸/95％(v/v)乙腈至0.1％(v/v)甲酸/100％(v/v)乙腈的梯度以20μl/ min洗涤5分钟，用0.1％(v/v)甲酸/5％(v/v)乙腈再平衡7分钟，之后施加来自样品的 肽。 [0588] 来自柱的洗脱液通过仪器的微喷雾器电喷雾离子源导入Agilent XCT离子阱质谱仪中。随着肽从柱洗脱，离子阱收集全光谱正离子扫描(100-2200m/z)随后根据仪器的 ‘SmartFrag’和‘Peptide Scan’设定在全谱中观测到4个离子MS/MS扫描。一旦对任何 特定m/z值收集了两个片段谱，其从选择中被排除用于分析进一步30秒以避免收集冗余数 据。 [0589] 质谱数据组用Agilent的Spectrum Mill软件(Rev A.03.02.060)与序列数据库匹配。假阳性匹配通过使用软件的“自身验证”默认设置避免。这包括需要肽匹配显著好 于针对反向数据库的最佳匹配及各种加权有利于更可能的离子化及片段化模式(“质子迁 移性评分”)。氧化的甲硫氨酸允许作为可变修饰。 [0590] 蛋白质测序结果确立了来自选择的品系的F4种子除了预期的γ1-大麦醇溶蛋白和D-大麦醇溶蛋白之外出乎意料地含有B3-大麦醇溶蛋白条带。γ-1和-3大麦醇溶蛋白 条带的鉴定通过测序来自Riso 56突变体的蛋白质而确立，其中这些蛋白质未被共迁移的 B-大麦醇溶蛋白条带遮蔽。这表明选择的F4品系不完全缺乏B3大麦醇溶蛋白。 [0591] 实施例9.缺乏B和C大麦醇溶蛋白的大麦谷粒的鉴别 [0592] 来自田间生长的品系G1的F4植物一个单穗的各个半种子在含有蛋白酶抑制剂E64和AEBSF(1μg/ml)的水中吸胀过夜，在塑料微管中用不锈钢 球逐个粉碎并研磨，在96 孔振动磨(Retsch Gmbh，Rheinische)中以30/秒振荡3x 1.5分钟，然后在3000g在RT离 心5分钟，弃去上清。以相同方式再洗涤水不溶性面粉沉淀2次，弃上清。然后通过加入 400μl含有1％(w/v)DTT的50％(v/v)水性丙-2-醇提取沉淀中的醇溶性大麦醇溶蛋白， 随后如上振荡并离心。含有提取的大麦醇溶蛋白的上清转移至新鲜试管中，用Coomassie 试剂(BioRAD)测量DTT/丙-2-醇上清中的蛋白质含量。 [0593] 每种大麦醇溶蛋白提取物相应于20μg大麦醇溶蛋白的等份在真空下冻干过夜，溶解于15μl SDS-煮沸缓冲液中，在90℃加热3分钟，上样于预制12-18％Excell梯度凝 胶(Pharmacia)并如实施例1所述经SDS-PAGE检查。观测到大约43kDa的主要条带在各种 子中分离并且在16个种子5个的提取物中不存在。这个条带的位置与先前鉴别的B3-大 麦醇溶蛋白条带相同。 [0594] 蛋白质数据证实来自品系G1的F4种子对于一或多个B-大麦醇溶蛋白是杂合及分离的。这个情况在其它F4品系中也证实。 [0595] 遗传试验 [0596] 进行遗传试验以证实蛋白质数据。来自田间生长的选择的F4品系的各个半种子在湿土壤中萌发，在温室中于25℃白天和20℃夜间生长2周。用REDExtract-N-Amp Plant PCR Kit(Sigma)根据指导从0.5cm叶片分离DNA。特异于B1-大麦醇溶蛋白和γ-大麦醇溶 蛋白的基因序列通过独立的PCR反应扩增，PCR反应是加入10μl RMix，1μl每种B1-大麦 醇溶蛋白引物(5’B 1hor和3’B1hor)或者0.5μl每种γ3-大麦醇溶蛋白引物(5’gamma hor3和3’gamma3-full)，4μl植物DNA和MilliQ水至20μl，室温，然后在Eppendorf热 循环仪中进行下述温度计划：95℃、10分钟；随后是35个循环的95℃30秒、56℃30秒及 72℃1分钟。随后是72℃10分钟，冷却至10℃。 [0597] PCR引物序列如下： [0598] 5’B 1hor：5’-CAACAATGAAGACCTTCCTC-3’(SEQ ID NO：2) [0599] 3’B1hor：5’-TCGCAGGATCCTGTACAACG-3’(SEQ ID NO：3) [0600] 5’gamma hor3：5’-CGAGAAGGTACCATTACTCCAG-3’(SEQ ID NO：4) [0601] 3’gamma 3-full：5’-AGTAACAATGAAGGTCCATCG-3’(SEQ ID NO：5)。 [0602] 20μl每种PCR反应上样到含有EtBr的1cm，1％(w/v)琼脂糖凝胶上，在100V在TBE缓冲液中电泳1小时，用GelDoc成像系统(uvitec)获得DNA产物的荧光图像(图 14)。 [0603] γ3大麦醇溶蛋白对照基因的扩增的DNA条带如预期存在于所有泳道中(图14，下组，gamma3-Hor)。扩增的B-大麦醇溶蛋白DNA在来自Riso56的所有PCR泳道中均不 存在，如预期，该基因已在Riso 56中缺失(图14，上组，R56)。B-大麦醇溶蛋白基因的扩 增的DNA条带在来自F4品系9R3和4BH的单穗的种子的提取物中分离(图14，上组9RE， 4BH)。这表示一或多个B-大麦醇溶蛋白基因存在一些F4种子中，F3种子对于Riso 56中 B-大麦醇溶蛋白基因座的缺失不是纯合的。其它F4品系也示出这样。这个方法可用作基 于DNA的方法以鉴别和选择缺乏B1大麦醇溶蛋白的种子。 [0604] 遗传试验的结果用于选择不含有B-大麦醇溶蛋白基因的植物。选择12个经PCR对B-大麦醇溶蛋白基因是无效的个体F5植物，生长以产生F5种子群体，称为G1*。从单 穗取各个G1*F5半种子，在湿土壤中萌发，在温室中于25℃白天和20℃夜间生长2周，之后 如上所述进行DNA分离/PCR分析。相应的半种子用于大麦醇溶蛋白分离和分析，取相应于 40μg大麦醇溶蛋白的等份，真空下冻干过夜，溶解于15μl SDS煮沸缓冲液，在90℃加热 3分钟，上样于预制12％Longlife，1mm凝胶(Longlife Gels)，在150V电泳40分钟，如实 施例1所述染色。 [0605] PCR分析显示分离自阳性对照品系Sloop和Riso 1508的DNA给出预期的B-大麦醇溶蛋白条带。来自Sloop的条带的大小大于从Riso 1508扩增的条带，因为B 1-大麦醇 溶蛋白基因略有不同。对照基因γ3-大麦醇溶蛋白从所有植物扩增。从6个G1*个体的 提取物未扩增出PCR条带，证实该基因从这些植物中缺失。相应半种子中的大麦醇溶蛋白 模式证实这一点；在G1*中未观测到B-大麦醇溶蛋白条带。因此结论是G1*缺少可检测的 B-大麦醇溶蛋白并且推断对于编码B-大麦醇溶蛋白的基因座是纯合无效的。 [0606] 剩余250个F5G1*种子被萌发，测试秧苗并且证实对于B-大麦醇溶蛋白基因是无效的。随后世代用于增加这个品系的种子。 [0607] 大麦醇溶蛋白含量的分析 [0608] 大麦品种Sloop，R56，R1508和G1*在田间相邻小块地中生长，收获成熟谷粒并加工产生面粉。面粉样品中大麦醇溶蛋白水平如上所述分析。水、盐溶液、醇/DTT及尿素可 溶的蛋白质级分如实施例4所述获得并测量每种中的蛋白质含量。蛋白质含量示于表8，表 示为mg蛋白质/g干重面粉。每种总蛋白质含量通过该样品各级分的蛋白质含量之和而确 定。大麦醇溶蛋 白包含在醇溶性级分中，与其它醇溶性蛋白如丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、蛋 白酶抑制剂、LTP1和蛋白Z在一起。 [0609] 表8.在得自G1*谷粒的面粉的级分中的蛋白质含量 [0610]大麦品种 水溶性 盐溶性 醇/DTT (％Sloop) 尿素溶性 总计 Sloop 17.2 17.6 23.1(100％) 48.0 106 R56 16.7 19.0 13.2(58％) 58.6 108 R1508 22.2 15.0 8.0(35％) 53.5 99 G1* 19.0 22.2 4.8(21％) 58.6 105 [0611] 数据显示G1*谷粒中及因此面粉中的醇溶蛋白含量相对于野生型栽培种Sloop降低至22％以下。 [0612] 上述获得的醇溶蛋白级分如实施例5所述经FPLC富集大麦醇溶蛋白。每个FPLC洗脱液中的蛋白质被冻干，确定每10g面粉FPLC纯化的蛋白质的产量。这显示G1*的大 麦醇溶蛋白含量降低至低于8mg/10g面粉，相比之下Sloop为105mg/10g面粉，R56为38， R1508为24。这代表了G1*谷粒及面粉中大麦醇溶蛋白含量相对于Sloop降低至少92％。 [0613] 实施例10.用F4谷粒大规模麦芽制造及酿造 [0614] 进行大规模麦芽制造实验以产生足够量麦芽用于使用F4谷粒的酿造试验。这些试验使用修改的浸渍程序，在其它因素中考虑更小的谷粒大小，如下所述。使用每麦芽 制造罐800g谷粒样品。浸渍方案是17℃5小时，萌发温度是15℃94小时。烤干程序是 50-78℃17小时，50-74℃17小时。麦芽产生不使用赤霉酸，这不需要。 [0615] 淀粉糖化配方：4.65kg低谷蛋白麦芽，10升水，10g氯化钙，2g硫酸钙，64-65℃2小时。 [0616] Kettle：加入17g Target Hop Pellets(10.0％AA)60分钟，21g HallertauHopPellets(4.5％AA)10分钟。 [0617] 发酵是19升批次体积，发酵温度12℃，使用12g Fermentis W34/70干酵母，初始发酵8天，然后在0℃冷却9天。啤酒然后过1微米滤膜过滤，在小桶中充二氧化碳， 并用反压装瓶机装瓶。原始比重是1.044，发酵产物的最终重力是1.013，具有30IBU的 Approximate Bitterness，ApproximateAlcohol是4.0％(体积)。 [0618] 生产过程中测量的其它参数如下：麦芽水分：4.2％，提取物71.5；颜色3.9；WC1.0；TN 2.63％干基；SN 1.11；KI 51；粘度1.52；AAL 71.8％；β-葡糖苷酶130mg/l；DP 24。 [0619] 所有这些指示示出可以从F4谷粒的麦芽制造啤酒。 [0620] 还在G1*大麦谷粒上进行了大规模麦芽制造及酿造试验。800g谷粒在Joe WhiteMaltings自动化制麦仪中根据指示方案进行麦芽制造。G1*谷粒的优选麦芽制造条件被 确定为：在17℃浸渍3小时，在15℃萌发4天，随后在50-80℃干燥。浸渍G1*谷粒的最 佳时间长度与其它谷粒相比略有不同：Sloop：8hr-9hr-5hr浸渍/休眠/分段程序(step programme)，17℃；R1508：7hr-8hr-3hr浸渍/休眠/分段程序，17℃；R56：8hr-10hr-5hr浸 渍/休眠/分段程序，17℃。分析方案是European Brewing Convention(EBC)或Institute ofBrewing(IOB)规定的。谷粒水分含量通过近红外光谱(NIR)确定。总氮含量通过Dumas 法确定。麦芽的数据见表9。G1*谷粒与其它测试品种之间的一个显著差异是G1*和R1508 的糖化力测量比Sloop或R56谷粒低得多。因此这与G1*和R1508中的lys3突变相关。 [0621] 重复麦芽制造并将每一品种组合。来自品系G1*，R56，R1508和Sloop(野生型)的每个品系的大约4kg麦芽被如下酿造和装瓶。麦芽样品在煮沸温度下用Tettnang啤酒 花苦味化60分钟以达到21-22苦味单位(IBU)。用US-05酵母(Fermentis)在18-20℃发 酵。发酵产物不过滤就装小桶并在装瓶前充二氧化碳。所有啤酒在装瓶时仍是浑浊的但储 存2-4周后变得更澄清。当装小桶和装瓶时啤酒由于二乙酰而具有显著的“奶油硬糖”香 气和气味，但是在储存时逐渐消失。 [0622] 酿造产品的数据示于表10。从G1*谷粒制造的啤酒的醇含量是4.2％体积。G1*啤酒具有稍稍降低的但是满意的倾倒后泡沫头。 [0623] [0624] 表10.从G1*谷粒酿造的啤酒的特征数据 [0625]SLOOP R1508 R56 G1＊ 批次体积(lt) 15.0 14.1 18.6 18.0 麦芽重量(kg) 3.60 3.33 4.00 4.55 蛋白质休眠(温度/时间) 57C /20min 56C/20min 54C/20min 55C/20min 淀粉酶休眠(温度/时间) 65C/1hr 63-65C/1hr 64-65C/2hr 64-65C/2hr 原始重力(SG) 1.051 1.052 1.051 1.049 最终重力(SG) 1.014 1.013 1.012 1.017 醇体积含量(％) 4.8％ 5.1％ 5.2％ 4.2％ [0626] 这些实验表明G1*谷粒可以成功麦芽化和酿造。 [0627] 从G1*谷粒生产的啤酒中的大麦醇溶蛋白水平经免疫测定测量，预期为1ppm以下，在一些情况中为0.5ppm以下。这与小麦啤酒中的大麦醇溶蛋白水平范围10-41ppm，黑 啤中的9-15ppm，淡啤酒中3-9ppm的相比。 [0628] 本领域技术人员理解可以对特异实施方案中的本发明进行各种变化和/或修饰而不偏离广泛描述的本发明的精神或范围。本发明实施方案因此被认为是例证性而非限制 性的。 [0629] 本申请要求US 60/964,672的优先权，其全部内容援引加入本文。 [0630] 本文讨论和/或引用的所有出版物均以其全部援引加入本文。 [0631] 本发明说明书中包括的文件、法令、材料、设备、物品等的任何讨论仅是为了提供本发明的上下文的目的。不是承认这些材料的任意部分或全部在本申请要求的优先权日之 前构成现有技术基础的一部分或是与本发明领域相关的领域中的一般普通知识。 [0632] 参考文献 [0633] Abdullah et al.(1986)Biotechnology 4：1087. [0634] Almeida and Allshire(2005)TRENDS Cell Biol 15：251-258. [0635] Anderson et al.(2000)Nature Medicine 6：337-342. [0636] Anderson et al.(2005)Gut 54：1217-1223. [0637] Aventz-Hansen(2000)Journal of Experimental Medicine 191：603-612. [0638] Biagi et al.(2004)Nutrition Reviews 62：360-363. [0639] Bourque(1995)Plant Sci.105：125-149. [0640] Bradford(1976)Analytical Chemistry 72：248-254. [0641] Brandt et al.(1990)Eur J Biochem 194：499-505. [0642] Campbell et al.(2001)Insect Biochemistry and Molecular Biology 31：513-520. [0643] Capecchi(1980)Cell 22：479-488. [0644] Catassi et al.(2007)Am.J.Clin.Nutr.85：160-166. [0645] Cheng et al.(1996)Plant Cell Rep.15：653-657. [0646] Clapp(1993)Clin.Perinatol.20：155-168. [0647] Collin et al.(2004)Aliment Pharmacol Ther19：1277-1283. [0648] Comai et al.(2004)Plant J 37：778-786. [0649] Curiel et al.(1992)Hum.Gen.Ther.3：147-154. [0650] Davies et al.(1993)Cell Biology International Reports 17：195-202. [0651] De Anglis et al.(2007)J Food Protection 70：135-144. [0652] Doll(1976)Genetic studies of high lysine barley mutants.In″BarleyGenetics III″.Gaul H(ed).Verlag，Munchen：542-546. [0653] Doll(1980)Heriditas 93：217-222. [0654] Doll(1983)Barley seed proteins and possibilities for theirimprovement.In ″ Seed Proteins：Biochemistry，Genetics，Nutritional Value ″， Gottschalk W，Muller HP(eds).Martinus Nijhoff，The Hague：207-223. [0655] Doll et al(1973)Barley Genetics Newsletter 3：12-13. [0656] Douliez et al.(2000)J Cereal Sci 32：1-20. [0657] Dostalek et al.(2006)Food Additives and Contaminants 23：1074-1078. [0658] Eglitis et al.(1988)Biotechniques 6：608-614. [0659] Ellis et al.(1990)Clin Chim Acta 189：123-130. [0660] Fasano et al.(2003)Archives of Internal Medicine 163：286-292. [0661] Field et al.(1982)Theoretical and Applied Genetics 62：329-336. [0662] Folich et al.(1957)J Biol Chem.226：497-509. [0663] Fujimura et al.(1985)Plant Tissue Culture Letters 2：74. [0664] Gellrich et al.(2003)Cereal Chem 80：102-109. [0665] Graham et al.(1973)Virology 54：536-539. [0666] Grant et al.(1995)Plant Cell Rep.15：254-258. [0667] Hadjivassiliou et al.(2004)Trends Immunol 25：578-82. [0668] Haseloff and Gerlach(1988)Nature 334：585-591. [0669] Hejgaard and Boisen(1980)Hereditas 93：311-320. [0670] Henikoffet al.(2004)Plant Physiol 135：630-636. [0671] Hogberg et al.(2004)Gut 53：649-654. [0672] Hovell et al.(2001)Med J Aust 175：247-250. [0673] Ingerversen et al.(1973)Experientia 29：1151-1152. [0674] Jaradat(1991)Theor Appl Genet 83：164-168. [0675] Jensen(1979).Chromosomal location of one dominant and fourrecessivehigh-lysine genes in barley mutants.In″Seed Protein Improvement in Cerealsand Grain Legumes″.IAEA/FAO/GSF，STI/PUB/496，Vienna：86-96. [0676] Kanerva et al.(2005)JInstit Brewing 111：61-64. [0677] Karlsson(1977)Barley Genetics Newsletter 7：40-43. [0678] Kasarda et al.(1984)PNAS 81：4712-4716. [0679] Kim et al.(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101：4175-9. [0680] Klemsdal(1987)Hereditas 107：107-114. [0681] Koeie and Kreis(1978)Hordein and starch synthesis indevelopinghigh-lysine and normal barley seeds at different N-fertiliser levels.In″Carbohydrate and protein synthesis″Miflin BJ and Zoeschke M(eds). Commission of the European Communities，1978；publication EUR 6043En：137-150. [0682] Koziel et al.(1996)Plant Mol.Biol.32：393-405. [0683] Kreis(1979)Starch synthesis and prolamin level in single anddoublehigh-lysine barley mutants.Thesis Universsite Catholique de Louvain， Belgium127pp. [0684] Kreis and Doll(1980)Physiol.Plant 48：139-143. [0685] Kreis et al.(1983)Cell 34：161-177. [0686] Kreis et al.(1984)Biochem.Genetics 22：231-255. [0687] Kreis and Shewry(1989)BioEssays 10：201-207. [0688] Larroque et al.(2000)In Shewry and Tatham，eds.Seventh InternatlWorkshop on Gluten Proteins，Bristol UK.Instit for Arable Crops Res 2000： 136-139. [0689] Lu et al.(1993)J.Exp.Med.178：2089-2096. [0690] Lundin et al.(2003)Gut 52：1649-1652. [0691] Marchylo et al.(1986)Cereal Chem 63：219-231. [0692] Marti et al.(2005)J Pharmacol Exp Therapeut 312：19-26. [0693] Millar and Waterhouse(2005)Funct Integr Genomics 5：129-135. [0694] Mullins et al.(1999)Eur J Plant Pathol 105：465-475. [0695] Munck et al.(1970)Science 168：985-987. [0696] Olsen(1977)Hereditas 87：11-20. [0697] Pasquinelli et al.(2005)Curr Opin Genet Develop 15：200-205. [0698] Peraaho et al.(2004a)Journal of the American Dietetic Association 104：1148-1150. [0699] Peraaho et al.(2004b)Scandinavian Journal of Gastroenterology 39：27-31. [0700] Perriman et al.(1992)Gene 113：157-163. [0701] Peters et al.(2003)Arch Intern Med 163：1566-1572. [0702] Pynnonen et al.(2004)Psychosomatics 45：325-335. [0703] Senior(1998)Biotech.Genet.Engin.Revs.15：79-119. [0704] Shan et al.(2002)Science 297：2275-2279. [0705] Sheehan and Skerritt(1997)J Inst Brewing 103：297-306. [0706] Shewry et al.(1980)Biochemical Genetics 18：33-151. [0707] Shewry et al.(1978)Journal ofExperimental Botany 29：677-692. [0708] Shewry et al.(1999)The prolamins s of the Triticeae.In Shewry P.R.，Casey R.，eds Seed Proteins.Klewer，London，pp 35-78. [0709] Shewry and Halford(2002)Journal ofExperimental Botany 53：947-958. [0710] Shippy et al.(1999)Mol.Biotech.12：117-129. [0711] Slade and Knauf(2005)Transgenic Res 14：109-115. [0712] Skerritt(1988)J.Cereal Science 7：251-263. [0713] Smith et al.(2000)Nature 407：319-320. [0714] Sollid(2002)Nature Reviews Immunology 2：647-655. [0715] Sorell et al.(1998)FEBS Letts 439：46-50. [0716] Sorensen et al.(1996).Mol Gen Genet 250：750-760. [0717] Stepniak et al.(2006)Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol291：621-629. [0718] Tallberg(1977)Hereditas 87：43-46. [0719] Thompson(2001)J.Amer Diet Assoc 101：1456-1459. [0720] Tingay et al.(1997)Plant J 11：1369-1376. [0721] Toriyama et al.(1986)Theor.Appl.Genet.205：34. [0722] Treem(2004)Current Opinion in Pediatrics 16：552-559. [0723] Ullrich and Eslick(1977)Barley Genetics Newsletter 7：66-73. [0724] Ullrich and Eslick(1978)Barley Genetics Newsletter 8：114-125. [0725] Vader et al.(2003)Gastroenterology 125：1105-1113. [0726] Verkarre et al.(2004)J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 38：140-142. [0727] Wagner et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6099-6103. [0728] Waterhouse et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964. [0729] Wieser et al.(1994)Journal ofCereal Science 19，149-155. [0730] Williamson and Marsh(2000)Celiac Disease.In MN Marsh，ed CeliacDisease：Methods and Protocols.Humana Press，Totowa，NJ，pp 1-9. [0731] Zikiryaeva and Kasimov(1972)Uzbekskii Biologicheskii Zhurnal 6：18-20. |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈