肉制品的特性 |
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| 申请号 | CN202180025825.7 | 申请日 | 2021-02-04 | 公开(公告)号 | CN115667495A | 公开(公告)日 | 2023-01-31 |
| 申请人 | 阿普賽德食品公司; | 发明人 | K·J·凯泽; M·L·里斯; M·E·尤哈斯; J·M·乔斯林; U·S·瓦勒蒂; E·N·舒尔策; | ||||
| 摘要 | 本公开提供了用于生产免屠宰肉制品的方法和组合物及其特征。与通过采集死亡动物组织而获得的常规肉相比，免屠宰肉制品包含几个区别点。这些区别点包括但不限于显著减少或基本没有：类固醇 激素 、抗生素或微 生物 污染 ；较低的脂肪含量；无血管系统；以及在室温和冷藏时延长保质期。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种表现出延长保质期的用于饮食消费的免屠宰肉制品，其中与通过屠宰获得的常规肉相比，所述保质期延长了，且其中所述保质期在收获后延长了至少3天。 |
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| 说明书全文 | 肉制品的特性[0001] 相关申请的交叉引用 背景技术[0003] 动物肉是全世界许多人的首选蛋白质来源。2018年美国肉类(鸡肉、火鸡肉、小牛肉、羊肉、牛肉、猪肉)的总消费量估计为人均219磅。预计从屠宰动物(如牲畜、家禽和鱼类)中获取肉类的传统(常规)方法，通常涉及屠宰，可能不足以满足未来对肉类的需求。此外，尽管在法律上是可以接受的，但这些来源的肉类生产与几个缺陷有关，如微生物污染水平 增加，以及接触常规肉制品中传统上可发现的激素和抗生素。常规的肉类生产也与一些环 境缺陷有关，如热量输入转化不佳、温室气体排放、土地使用、用水和当地污染。涉及屠宰的常规肉类生产的一种可替代方法，是通过在实验室中培养后生动物细胞的肉类生产(本文 也可互换地称为，基于细胞的肉(cell‑based meat)、基于细胞的肉(cell‑based meat)、基于细胞培养的肉(cell culture‑based meat)、基于细胞的肉(cell‑based meat)、基于细胞的肉(cell‑based meat)或培养的肉(cultured meat))。 [0004] 在食品供应链中采用基于细胞的肉制品将取决于各种因素，如肉类自身的可量化特征，包括但不限于：宏观和微观营养构成、激素水平和抗生素以及保质期。与常规产品的比较将需要确保营养构成的可比性，同时寻求可区分的因素，如低/无激素或抗生素含量和微生物数量。基于细胞的肉制品尚未上市，但最终监管机构也将要求拟上市肉类产品的量 化和问责、销售前的食品安全建设以及拟上市肉制品的上市后合规性。 [0006] 发明概述 [0007] 本文提供了涉及生产从培养物中生长的细胞产生的免屠宰肉制品的方法和组合物；这些肉制品在本文中可互换地称为基于细胞的肉制品。 [0008] 在一个方面，本文提供了一种表现出延长保质期的用于饮食消费的免屠宰肉制品，其中当与通过屠宰获得的常规肉相比时，所述保质期在收获后延长了变化的持续时间。 在一个相关的方面，本文提供了一种表现出较低的微生物污染数量的用于饮食消费的免屠 宰肉制品，与通过屠宰获得的常规肉相比，其中所述较低的微生物污染数量在收获后表现 出了变化的持续时间。免屠宰肉制品可以是本文公开的任何种类。 [0010] 图1显示了与常规肉相比，在示例性免屠宰、基于细胞的肉样品中发现的氨基酸构成。美国农业部(USDA)数据库包括来自以下的氨基酸数据：蓝鳍金枪鱼、罗非鱼、黄鳍金枪鱼、火鸡肉、羊肉、鸡肉、牛肉、科尼什鸡肉(cornish game hens)、珍珠鸡肉、野鸡肉、鹌鹑肉、乳鸽肉、鹅肉、鸭肉、鸵鸟肉、牛里脊肉、牛小排、牛小腿、鸡胸肉、鸡腿肉、猪肩肉、草饲野牛肉、鸡翅、鸡颈、火鸡胸肉、火鸡翅、火鸡大腿和羔羊小腿。 [0011] 图2显示了在示例性基于细胞的肉样品中羟脯氨酸的平均浓度范围(表示为每100g湿质量的基于细胞的肉中羟脯氨酸克数)。 [0012] 图3显示了具有细菌菌落的代表性平板，指示微生物污染，显示了免屠宰基于细胞的鸭肉、商店购买的(常规)牛肉和商店购买的鸡肉的示例性样品的结果。 [0014] 图5显示了脂肪酸数据的主成分分析(PCA)，收集自用于常规肉制品的美国农业部数据库。 [0015] 图6显示了示例性免屠宰基于细胞的鸡肉样品中欧米伽(ω)6：3脂肪酸的比例。 [0016] 图7显示了在用于从培养物中的细胞产生基于细胞的肉(CBM)的培养基中，血清的存在会影响脂肪酸构成；该图显示了在无血清培养基与含血清培养基中产生的示例性免屠 宰基于细胞的肉样品中的脂肪酸百分比。W3＝欧米伽(ω)3FA；W6＝欧米伽(ω)6FA；W9＝欧米伽(ω)9FA。 [0017] 图8显示了在免屠宰基于细胞的肉样品中，使用来自不同来源的血清赋予不同的脂肪酸构成。数据来自表1中的方法10。关键词‑BS：牛血清；CS：鸡血清；FBS：胎牛血清；Hy： 基于大豆的植物水解物；培养基含有8‑10％的特定血清；DMEM‑F12用作基础培养基。 [0018] 图9显示了从成肌细胞的多克隆群体中分离出的成肌细胞克隆体可以影响免屠宰基于细胞的肉样品的脂肪酸构成。 [0019] 图10显示了基于免屠宰基于细胞的肉的脂肪酸构成受培养基组成和靶向肝脏X受体β(LXRβ)的激动剂添加的影响。 [0020] 图11显示了基于免屠宰基于细胞的肉的脂肪酸构成受培养基组成和核黄素添加的影响。 [0021] 图12显示了将脂肪酸滴定到用于培养基于细胞的肉的培养基中可以改变免屠宰基于细胞的肉的脂肪酸构成。 [0022] 图13显示了与常规鸡肉和牛肉相比，由成纤维细胞/成肌细胞共培养物和单一培养物产生的免屠宰基于细胞的肉的煮熟硬度。 [0023] 发明详述 [0024] 本文提供了涉及肉制品的免屠宰生产的方法和组合物，并且依赖于使用基于细胞培养的方法进行细胞的生长、收获和配制成为肉制品。当与通过屠宰获得的常规肉相比时，本公开的免屠宰肉制品存在几个差异，并且这些差异在全文中进行了描述。 [0025] 在详细描述特定实施方案之前，应当理解，本公开不限于本文所描述的特定实施方案，这些实施方案可以有变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定说明性实施方案的目的，不旨在限制，除非另有定义。本说明书中使用的术语在本公开的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中，通常具有其在本领域中的普通含义。某些术语在下文或说 明书中的其他地方进行了讨论，以在描述本发明的组合物和方法以及如何制造和使用它们 时为从业者提供额外的指导。术语的任何使用范围和含义从使用该术语的特定语境中将是 显而易见的。因此，本文所述的定义旨在为确定本发明的特定实施方案提供说明性指导，而不限于特定组合物或生物系统。 [0027] 本公开的全文和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括/包含(comprise)”或变体例如“包括/包含(comprises/comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的元素或元素群，但不排除任何其他元素或元素群。 [0028] 本文所用的基于细胞的肉的上下文中的术语“可食用的”，涵盖生肉或未煮熟的肉以及部分或完全煮熟的肉。 [0029] 除非提供具体的定义，否则本文描述的与分子生物学、细胞生物学、分析化学和合成有机化学相关的术语以及实验室程序和技术均为本领域众所周知和常用的术语。标准技术可用于重组技术、分子生物学、微生物学、化学合成和化学分析。 [0030] 适用于获取常规肉的方式的术语“屠宰”，覆盖传统上用于杀死动物的所有方法，目的是直接收获其肉类供饮食消费。 [0031] 本公开的适用于基于细胞的肉制品的术语“免屠宰”，是指从培养中的细胞开始产生肉的过程，并且该方法不涉及屠宰动物以直接从动物身上获得肉类供饮食消费。应当理解，在一些实施方案中，所述用于细胞培养方法的起始细胞可以在动物屠宰或活组织检查 后获得是可能的—尽管所述用于培养中的起始细胞可以通过这种方式获得，但由细胞培 养、收获和可能的后续配制产生的肉仍被认为是以免屠宰方式获得的肉。值得注意的是，作为一般事项，如本文所用，免屠宰基于细胞的肉制品的收获可能涉及使用水的缓冲溶液(或其他水溶液)来从肉生长的地方(例如，生物反应器的表面，或在包含悬浮培养细胞的容器 中)移除所述肉，然后所述肉可以在收集装置(例如网、筛、滤器)中捕获。在一些实施方案中，所述肉可以通过物理方法(例如刮削)、酶学方法和/或化学方法收获。在一些实施方案中，所述肉可通过上述任一种方法收获，并随后用缓冲溶液(或其他水溶液)冲洗。 [0032] 短语“基于细胞的肉”、“免屠宰基于细胞的肉”，“体外生产的肉”，“体外基于细胞的肉”，“培养的肉”，“免屠宰培养的肉”、“体外生产的培养的肉”，“体外肉”，“体外培养的肉”和其他类似短语在本文中可以互换使用，是指从培养物中的细胞开始在体外产生的肉，并且该方法不涉及屠宰动物以直接从动物身上获得肉类供饮食消费。 [0033] I.免屠宰基于细胞的肉的产生 [0034] 本文提供了以免屠宰的方式生产基于细胞的肉制品的方法。 [0035] A.细胞 [0036] 本公开的免屠宰基于细胞的肉制品是通过在培养物中培养自然发生的、转基因的或修饰的细胞而生产的组合物。 [0037] 本公开的方法中使用的细胞可以是原代细胞，或细胞系。本文提供的方法适用于任何培养物中的后生动物细胞。一般来说，所述细胞可以来自其组织适合饮食消费的任何 后生动物物种。在一些实施方案中，所述细胞证明了骨骼肌组织特异化的能力(例如成肌细胞)。在其他实施方案中，所述细胞未证明骨骼肌组织特异化的能力。 [0038] 在一些实施方案中，所述细胞来源于任何拟用于人类或非人类饮食消费的非人类动物物种。在一些实施方案中，所述细胞可以是禽类、绵羊类、山羊类、猪类、牛类或鱼类来源。在一些实施方案中，所述细胞可以是家畜、家禽、鸟类、猎物或水生物种。 [0039] 在一些实施方案中，所述细胞来自家畜，如驯养的牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、水牛、兔子等。在一些实施方案中，所述细胞来自禽类，如驯养的鸡、火鸡、鸭子、鹅、鸽子等。在一些实施方案中，细胞来自猎物物种，如野生的鹿、鹑鸡类家禽、水禽、野兔等。在一些实施方案中，所述细胞来自从野生渔业或水产养殖作业中商业收获的水生物种或半水生物种，或用于娱乐，包括某些鱼类、甲壳类动物、软体动物、头足类、鲸类、鳄类、龟类、蛙类等。 [0040] 在一些实施方案中，所述细胞来自外来、保守或灭绝的动物物种。在一些实施方案中，所述细胞来自原鸡(Gallus gallus)、乌鸡(Gallus domesticus)、黄牛(Bos taurus)、野猪(Sus scrofa)、野生火鸡(Meleagris gallopavo)、绿头野鸭(Anas platyrynchos)、大西洋鲑(Salmo salar)、蓝鳍金枪鱼(Thunnus thynnus)、绵羊(Ovis aries)、鹌鹑(Coturnix)、家山羊(Capra aegagrus hircus)或美洲螯龙虾(Homarus americanus)。因 此，本公开的示例性免屠宰基于细胞的肉制品包括禽类肉制品、鸡肉制品、鸭肉制品和牛肉制品。 [0041] 在一些实施方案中，所述细胞是原代干细胞、自我更新干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、诱导的多能干细胞或转分化多能干细胞。 [0043] 在一些实施方案中，所述细胞是肌源细胞，注定成为肌肉或类似肌肉细胞。在一些实施方案中，肌源细胞是原生肌源性的，例如成肌细胞。原生肌源性的细胞包括但不限于：成肌细胞、肌细胞、卫星细胞、侧群细胞、肌肉衍生的干细胞、间质干细胞、肌源性周细胞或中胚层成血管细胞。 [0044] 在一些实施方案中，细胞是骨骼肌谱系细胞。骨骼肌谱系细胞包括成肌细胞、肌细胞和骨骼肌祖细胞，也称为肌源性祖细胞，其包括卫星细胞、侧群细胞、肌肉衍生的干细胞、间质干细胞、肌源性周细胞或中胚层成血管细胞。 [0045] 在一些实施方案中，所述细胞是非肌源性的，并且这种非肌源细胞可以被编程为肌源性的，例如，细胞可以包括经修饰以表达一个或多个肌源性转录因子的成纤维细胞。在示例性实施方案中，肌源性转录因子包括MYOD1、MYOG、MYF5、MYF6、PAX3、PAX7、旁系同源、直系同源及其遗传变体。在一些实施方案中，对所述细胞进行修饰以表达一个或多个肌源性 转录因子，如PCT公开文本WO/2015/066377中所述，其内容通过引用整体并入本文。 [0046] 在一些实施方案中，所述细胞包含本文所述的细胞群的混合物，例如共培养中的纤维源性细胞和肌源性细胞的混合物，例如共培养中成纤维细胞与成肌细胞的混合物。在 一些实施方案中，用于生产基于细胞的肉的细胞是悬浮共培养中的成纤维细胞与成肌细胞 的混合物。在一些实施方案中，用于生产基于细胞的肉的细胞是贴壁共培养中的成纤维细 胞与成肌细胞的混合物。在一些实施方案中，共培养中的细胞包括额外的细胞类型，如脂肪细胞、内皮细胞和通常来自中胚层谱系的细胞。 [0047] 在一些共培养实施方案中，所述细胞处于悬浮共培养中；在一些实施方案中，细胞处于贴壁共培养中；在一些实施方案中，培养过程中使用这两种技术。本文提供的共培养物包含至少一种成纤维细胞与成肌细胞的混合物。在一些实施方案中，成纤维细胞(fibroblasts)与成肌细胞(myoblasts)(指定为F和M)的比例范围为约5F:95M至约95F:5M。 在示例性实施方案中，成纤维细胞与成肌细胞的比例约为5F:95M、10F:90M、15F:85M、20F: 80M、25F:75M、30F:70M、35F:65M、40F:60M、45F:55M、50F:50M、55F:45M、60F:40M、65F:35M、 70F:30M、75F:25M、80F:20M、85F:15M、90F:10M，或甚至约为95F:5M。 [0048] 在一些实施方案中，所述细胞经过遗传修饰以抑制一条通路，例如HIPPO信号通路。抑制HIPPO信号通路的示例性方法描述于PCT申请PCT/US2018/031276，其内容通过引用整体并入本文。 [0049] 在一些实施方案中，所述细胞经过修饰以表达端粒酶逆转录酶(TERT)和/或抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKI)。在一些实施方案中，细胞经过修饰以表达TERT和/ 或抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，如PCT公开文本WO 2017/124100中所述，其内容通过引用整体并入本文。 [0050] 在一些实施方案中，所述细胞经过修饰以表达谷氨酰胺合成酶(GS)、胰岛素样生长因子(IGF)和/或白蛋白。修饰细胞以表达GS、IGF和/或白蛋白的示例性方法描述于PCT申请PCT/US2018/042187，其内容通过引用整体并入本文。 [0051] 在一些实施方案中，所述细胞可以包括本文所述的修饰的任何组合。 [0052] B.培育基础设施 [0053] 如本文所述，培育基础设施是指培养或培育的环境以提供二维或三维肉制品。 [0055] 尽管所述培育基础设施本身可以具有三维结构或形状，但在所述培育基础设施中培养的细胞可以形成单层细胞。本公开的组合物和方法可以促进培育基础设施中后生动物 细胞的三维生长，以提供三维细胞生物量的无支架自组装。 [0056] 可以根据需要将三维培育基础设施雕刻成不同的尺寸、形状和形式，以提供肌细胞生长的形状和形式，类似于不同类型的肌组织，如牛排、里脊、小腿、鸡胸、鸡腿、羊排、鱼片、龙虾尾等。三维培育基础设施可以由无毒的天然或合成生物材料制成，以便如果摄取时不会造成伤害。天然生物材料可以包括，例如，胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白或其他细胞外基质。合成生物材料可以包括，例如，羟基磷灰石、海藻酸盐、聚乙醇酸、聚乳酸或其共聚物。三维培育基础设施可以形成为固体或半固体支撑。 [0057] 培育基础设施可以具有任何规模，并支持任何体积的细胞生物量和培养试剂。在一些实施方案中，所述培育基础设施的范围为约10μL至约100000L。在示例性实施方案中，所述培养基础设施为约10μL、约100μL，约1mL、约10mL、约100mL、约1L、约10L、约100L、约 1000L、约10000L或甚至约100000L。 [0058] 在一些实施方案中，培育基础设施包括底物。培育基础设施可以包括可渗透的底物(例如可渗透到生理溶液)，或不可渗透的底物(例如不可渗透到生理溶液)。底物可以是 平的、凹的或凸的。底物可被纹理化以促进细胞生长和细胞片附着。 [0059] 在一些实施方案中，在所述培育基础设施中培养细胞可以诱导细胞外基质(ECM)的生产，其可作为自体固有的支架来引导三维细胞生长，例如，引导细胞在垂直于底物的平面上的附着、增殖和过度生长。 [0060] 在一些实施方案中，所述培育基础设施不包含外源性添加的支架，以促进三维细胞生物量的自组装。在一些实施方案中，所述培育基础设施不包含外源性支架，如水凝胶或软琼脂。 [0061] C.培养条件 [0062] 所述产生基于细胞的肉的培养条件通常是无菌和消毒的。 [0063] 细胞可以以贴壁培养形式生长以形成细胞片，或者可以悬浮培养形式生长以形成细胞球团。表1提供了可以生产的各种肉制品的示例性培养方法。 [0064] 在一些实施方案中，所述培养基基本上不含来源于动物的血清或其他成分。 [0065] 因此，在一些实施方案中，本文提供了一种生产免屠宰基于细胞的肉的方法，包括：(a)提供来自非人类生物体的细胞；(b)在细胞以悬浮培养或贴壁培养方式生长的条件 下于培养基中培养细胞，其中所述培养基基本上不含来源于动物的血清或其他成分；以及 可选地(c)分离所述细胞并生产免屠宰肉制品。在一些实施方案中，培养中的细胞包括成纤维细胞、成肌细胞或成纤维细胞与成肌细胞的共培养物；在一些实施方案中，共培养中的细胞包括额外的细胞类型，如脂肪细胞、内皮细胞和通常来自中胚层谱系的细胞。 [0066] 在一些实施方案中，本文提供了一种生产免屠宰肉制品的方法，与通过屠宰获得的常规肉相比，所述免屠宰肉制品表现出延长的保质期和/或较低的微生物含量，所述方法包括：(a)提供来自非人类生物体的细胞；(b)在细胞以悬浮培养或贴壁培养方式生长的条 件下于培养基中培养细胞，其中所述培养基基本上不含来源于动物的血清或其他成分；以 及可选地(c)分离所述细胞并生产免屠宰肉制品。在一些实施方案中，培养中的细胞包括成纤维细胞、成肌细胞或成纤维细胞与成肌细胞的共培养物；在一些实施方案中，共培养中的细胞包括额外的细胞类型，如脂肪细胞、内皮细胞和通常来自中胚层谱系的细胞。 [0067] 在一些实施方案中，所述细胞在悬浮培养物中生长，例如在摇瓶中，且所述培养物的产物产生细胞球团。在一些实施方案中，所述产物可以通过物理方法(例如离心、重力辅助沉降)、化学方法、酶学方法、沉淀、浓缩、絮凝等获得。在其他实施方案中，所述细胞在贴壁培养物中生长，所述培养物的产物为细胞片。 [0068] D.收获和配制 [0069] 在一些实施方案中，本公开所述免屠宰基于细胞的肉是从生物反应器(或其他细胞生长设备)中收获的，并在配制前评估其性质。在一些实施方案中，所述收获是在无菌条件下进行的(例如，在层流罩中使用无菌的手套和工作环境)。 [0070] 本公开所述免屠宰基于细胞的肉可以在收获后(例如处理、加工)配制成一种特定的可食用食品类型，任何不同类型的产品，包括但不限于：肉丸、肉饼、鱼糜、肉排、香肠、面包、嫩肉、鱼片式产品、热狗、小圆块等。本公开的免屠宰基于细胞的肉配制产品也可以包括已经调味或干燥的肉，如肉干或零食棒类型的产品，例如为了进一步延长保质期。本公开的免屠宰基于细胞的肉配制产品也可以包括额外的成分(添加剂)，如粘合剂、香料、稳定剂、防腐剂等。在示例性实施方案中，配制包括向所述收获的基于细胞的肉中添加以下一种或 多种成分：活性麦麸、氯化钙、IOTA‑卡拉胶、香精前体混合物、转谷氨酰胺酶粉(麦芽糊精、酶)、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、多糖、卡拉胶、调味料、酵母菌提取物、酶、纤维、纹理化蛋白、果胶、淀粉。 [0071] II.基于细胞的肉的特性 [0072] 本文提供的是包含一些独特的特点使其能够区别于常规肉(涉及屠宰或以其他方式杀死活体动物)的免屠宰基于细胞的肉制品。这些方法也可以被定制以实现所需的特征，如健康益处和感官益处。区别点至少包括基于细胞的肉的延长的保质期、激素水平、抗生素和微生物污染，但也可以包括进一步的定制，如脂肪含量水平、氨基酸构成、纹理等的改变。 下面将依次讨论这些问题。 [0073] A.激素 [0074] 与常规肉相比，本公开所述免宰基于细胞的肉包含明显较低的类固醇激素量。例如，使用所述培养方法，不需要向培养物中添加任何外源性激素，因此在所述产生的肉中导致较低或不存在的激素水平。因此，在一些实施方案中，所述免屠宰基于细胞的肉制品基本上不含类固醇激素(即，几乎不含或不含类固醇激素)。这与为常规肉生产而饲养的动物形 成鲜明对比，在常规肉生产中，动物经常被喂食或以其他方式施用外源性激素。值得注意的是，即使是为常规肉生产而饲养的动物(如小鸡、家畜)，如果没有喂食或施用任何外源性激素，仅由于动物腺体系统的基本生产水平仍然含有睾酮、雌二醇、孕酮等一系列激素。雌二醇、孕酮和睾酮是在常规肉中发现的依动物性别而处于一些低水平的天然激素。相反，本公开所述基于细胞的肉包含较低水平的类固醇激素，或者甚至基本上不含类固醇激素。例如，针对17β‑雌二醇的ELISA结果表明，与常规鸡肉相比，免屠宰鸡肉样品产生的的浓度较低。 使用ELISA试剂盒，免屠宰鸡肉的17β‑雌二醇水平平均为35ng雌二醇/kg湿质量，而从当地杂货店购买的常规鸡肉中的雌二醇水平为90ng雌二醇/kg湿质量。 [0075] 因此，在一些实施方案中，本公开所述基于细胞的肉包含不超过约1ug、0.5ug、0.1ug、0.05ug、0.01ug、0.005ug或甚至约0.001ug类固醇激素/kg干质量的基于细胞的肉。 在一些实施方案中，所述基于细胞的肉包含不超过约1ug、0.5ug、0.1ug、0.05ug、0.01ug、 0.005ug或甚至约0.001ug孕酮/kg干质量的基于细胞的肉。在一些实施方案中，所述基于细胞的肉包含不超过约1ug、0.5ug、0.1ug、0.05ug、0.01ug、0.005ug或甚至约0.001ug睾酮/kg干质量的基于细胞的肉。在一些实施方案中，所述基于细胞的肉包含不超过约0.05ug、 0.01ug、0.005ug或甚至约0.001ug雌二醇/kg干质量的基于细胞的肉。在示例性实施方案 中，所述基于细胞的肉包含不超过约35ng雌二醇/kg干质量的基于细胞的肉。 [0076] B.微生物污染 [0077] 使用所述培养方法，免屠宰基于细胞的肉制品基本上不含微生物污染物。“基本上不含”是指微生物或寄生虫的浓度低于具有临床意义的污染水平，例如，低于摄取会导致疾病或不良健康状况的水平。如此低的污染水平导致保质期的增加。这与为常规肉生产而饲养的用于屠宰的动物形成鲜明对比。如本文所用，微生物污染包括但不限于：细菌、真菌、病毒、原生动物及其组合。有害微生物可以包括：大肠菌群(粪便细菌)、大肠杆菌、酵母菌、霉菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、肠杆菌科、阴沟肠杆菌复合体、甲型流感、乙型流感和葡萄球菌。熟练的技术人员应当理解，任何污染物都可以被测量。 [0078] 值得注意的是，与通过屠宰获得的常规肉相比，与本公开所述免屠宰基于细胞的肉制品有关的较低的微生物污染在所有温度下都表现出来：例如，从约0℃到约30℃，例如在标准家用冰箱温度下(例如约2℃至约6℃)和在室温下(例如，约22℃至约25℃)。还应注 意的是，与通过屠宰获得的常规肉相比，与本公开所述免屠宰基于细胞的肉制品有关的较 低的微生物污染在收获后表现出来持续至少3天、7天、14天、30天或148天，在收获后表现出来持续至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或几周。还应注意的是，在无菌条件下和非无菌条件下均可观察到较低的污染，在肉收获后没有后续配制 的情况下测量，以及在肉收获后并配制后的情况下测量，均可观察到较低的污染。 [0079] 此外，在培养物中生长的细胞可以基本上没有寄生虫，如感染整个动物细胞的绦虫，这些寄生虫通过食用未充分煮熟的肉转移给人类。 [0081] 与常规肉相比，本公开所述免屠宰基于细胞的肉包含明显较低的微生物污染量。实施例3、实施例9、表12和13提供了免屠宰基于细胞的肉与杂货店通过屠宰获得的常规肉 中污染物的比较。常规鸭肉，特别是常规牛肉，具有明显较高的微生物污染量。图3显示了指示细菌菌落的代表性平板，特别显示了基于细胞的鸭肉、常规牛肉和常规鸡肉的结果。 [0082] 因此，在一些实施方案中，本文提供了与通过屠宰获得的常规肉相比，一种用于饮食消费的表现出较低的微生物污染数量的免屠宰肉制品，其中较低的微生物污染数量在收获后表现出来持续至少3天。 [0083] 在一些实施方案中，所述较低的微生物污染数量在收获后表现出来持续至少2、3、4、5、6、7、10、14、15、20、21、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、148、150、 160、170、180、190、200、210、220、230、240或至少250天。 [0084] 在一些实施方案中，所述微生物污染数量在收获后和配制前确定。在其他实施方案中，所述微生物污染数量在配制后确定。 [0085] 在一些实施方案中，所述免屠宰的肉制品保持在非无菌条件下，仍然表现出较低的微生物污染数量。 [0086] 在一些实施方案中，通过测量总微生物数量(TC)、大肠杆菌/大肠菌群数量(EC)、大肠杆菌微生物数量、大肠菌群数量或大肠杆菌/大肠菌群数量来确定所述微生物污染数 量。在一些实施方案中，通过测量其他微生物的数量来确定所述微生物污染数量，包括但不限于：霉菌、酵母菌、沙门氏菌、李斯特菌和葡萄球菌。 [0087] 在一些实施方案中，所述免屠宰的肉制品包含： [0088] (a)根据美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》确定的微生物污染不超过100cfus/g湿质量； [0089] (b)根据美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》确定的大肠菌群污染不超过10cfus/g湿质量； [0090] (c)根据美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》确定的大肠杆菌污染不超过10cfus/g湿质量； [0091] (d)根据美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》确定的酵母菌污染不超过10cfus/g湿质量； [0092] (e)根据美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》确定的霉菌污染不超过10cfus/g湿质量； [0093] (f)根据美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》确定的未检测到沙门氏菌污染水平/25g湿质量； [0094] (g)根据美国分析化学家协会2004.06方法确定的未检测到李斯特菌污染水平/25g湿质量； [0095] (h)根据美国分析化学家协会2003.07方法确定的葡萄球菌污染不超过10cfus/g湿质量；和/或 [0097] 在一些实施方案中，所述免屠宰的肉制品包括免屠宰鸡肉、鸭肉或牛肉，常规肉包括通过屠宰获得的鸡肉、鸭肉或牛肉。 [0098] 实施例3和9提供了各种示例性方案，根据这些方案可以观察保质期和微生物污染。熟练的技术人员将理解，有许多方法可以用来测量微生物污染。这些方法至少由以下文本提供：(1)美国食品和药物管理局的《细菌学分析手册》(BAM)(第8版，修订版A/1998)，以及(2)美国农业部食品安全和检验局《微生物学实验室指南》。美国分析化学家协会还提供了至少以下用于确定微生物污染的测试： [0099] a.肠杆菌科，美国分析化学家协会2003.01 [0100] b.大肠杆菌和大肠菌群，美国分析化学家协会998.08 [0101] c.酵母菌和霉菌，美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》第18章 [0102] d.李斯特菌，美国分析化学家协会2004.06 [0103] e.沙门氏菌(25g)，美国分析化学家协会2011.03 [0104] f.弯曲杆菌，美国分析化学家协会RI 051201 [0105] g.美国分析化学家协会2003.07‑‑葡萄球菌 [0106] h.好氧菌平板计数，美国分析化学家协会990.12 [0107] i.沙门氏菌，美国分析化学家协会2013.02,RI PTM 081201 [0108] j.李斯特菌，美国分析化学家协会‑RI PTM#081401 [0109] k.好氧菌数量，美国分析化学家协会990.12 [0110] l.大肠菌群和大肠杆菌，美国分析化学家协会991.14 [0111] m.酵母菌和霉菌数量，美国分析化学家协会2014.05 [0112] C.抗生素 [0113] 与常规肉相比，本公开所述免屠宰基于细胞的肉包含明显较低的抗生素量，或基本不含抗生素，或完全不含抗生素。例如，使用所述培养方法，可以控制或消除培养物中抗生素的使用，从而在所述基于细胞的肉中导致较低或不存在的抗生素水平。因此，在一些实施方案中，免屠宰基于细胞的肉制品基本上不含抗生素(即，几乎不含或不含抗生素)。这与为常规肉生产而饲养的动物形成鲜明对比，在常规肉生产中，动物经常被喂食或以其他方 式施用外源性抗生素。 [0114] 因此，在一些实施方案中，本公开所述基于细胞的肉包含不超过约100ug抗生素/kg干质量的基于细胞的肉、90ug抗生素/kg干质量的基于细胞的肉、80ug抗生素/kg干质量 的基于细胞的肉、70ug抗生素/kg干质量的基于细胞的肉、60ug抗生素/kg干质量的基于细 胞的肉、50ug抗生素/kg干质量的基于细胞的肉、40ug抗生素/kg干质量的基于细胞的肉、 30ug抗生素/kg干质量的基于细胞的肉、20ug抗生素/kg干质量的基于细胞的肉、10ug抗生 素/kg干质量的基于细胞的肉、5ug抗生素/kg干质量的基于细胞的肉、1ug抗生素/kg干质量的基于细胞的肉，0.5ug抗生素/kg干质量的基于细胞的肉、0.1ug抗生素/kg干质量的基于 细胞的肉、0.05ug抗生素/kg干质量的基于细胞的肉、或甚至约0.01ug抗生素/kg干质量的 基于细胞的肉。 [0115] D.脂类 [0116] 与常规肉相比，本公开所述免屠宰基于细胞的肉的包含较低的平均总脂类(脂肪)含量。基于细胞的肉通常具有约0.5％至约5.0％的平均总脂肪含量，而常规肉中的脂肪酸 含量变化很大，可以在约3％至约18％的范围内，取决于肉的切割。 [0117] 表14显示了几个示例性免屠宰基于细胞的肉样品的总脂肪酸分析。图4显示了示例性免屠宰基于细胞的肉样品中针对饱和、单不饱和和多不饱和脂肪酸的总脂肪酸组成。 [0118] 因此，在一些实施方案中，当以所述基于细胞的肉的总湿质量的百分比来衡量，本公开所述基于细胞的肉包含平均总脂肪含量为约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约 1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％，约2.6％，约 2.7％，约2.8％，约2.9％，约3.0％，约3.1％，约3.2％，约3.3％，约3.4％，约3.5％，约 3.6％，约3.7％，约3.8％，约3.9％，约4.0％、约4.1％、约4.2％、约4.3％、约4.4％、约 4.5％、约4.6％、约4.7％、约4.8％、约4.9％或约5.0％。 [0119] 在一些示例性实施方案中，所述基于细胞的肉包含所示量的以下一种或多种脂肪酸类别，表示为该类别占总脂肪酸的百分比： [0120] a.饱和脂肪酸含量为约10％至约60％，例如约20％至约50％、约30％至约40％、约10％至约50％、约10％至约40％、约10％至约30％和/或约10％至约20％。 [0121] b.单不饱和脂肪酸含量为约10％至约60％，例如约20％至约50％，约30％至约40％，约10％至约50％，约10％至约40％，约10％至约30％和/或约10％至约20％。 [0122] c.多不饱和脂肪酸含量为约1％至约50％，例如约10％至约40％，约20％至约30％，约30％至约20％，和/或约40％至约10％。 [0123] 在一些实施方案中，本公开所述基于细胞的肉包含约2:1至约18:1的欧米伽6:3脂肪酸类别的比例。(α‑亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是主要的欧米伽3脂肪酸)。因此，在一些实施方案中，本公开所述基于细胞的肉包含约2:1、3:1、4:1、 5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1或约18:1的欧米伽6: 3脂肪酸类别的比例。另一方面，常规肉(如常规鸡肉)包含大于18:1的欧米伽6:3脂肪酸类 别的比例。 [0124] 与常规肉相比，基于细胞的肉的较低脂肪含量提供了较低的卡路里含量、较低的欧米伽6:3比例以及其他相关的健康益处。 [0125] 所述免屠宰基于细胞的肉的生产可以进一步被定制，以实现所需的构成。收获后干燥可进一步增加脂肪含量和/或其他固体成分。增加生长培养基中的脂质含量也可以增 加脂肪含量。 [0127] 因此，本文提供所述方法可以通过至少以下机制改变特定脂肪酸构成，以实现所需的味道特性或脂肪酸构成，如欧米伽3:6比例： [0128] a.在一些实施方案中，培养基中血清的存在可以影响脂肪酸构成。图7显示了无血清培养基与含血清培养基中的脂肪酸百分比。 [0129] b.在一些实施方案中，不同来源的血清可以用于培养物中，以在免屠宰基于细胞的肉制品中获得不同的脂肪酸构成。(图8) [0130] c.在一些实施方案中，从多克隆群体中分离出的克隆体的使用，也可用于改变脂肪酸构成。(图9)。 [0131] d.在一些实施方案中，所述脂肪酸构成通过以下方式来调节，改变培养基的脂肪酸组成，或通过培养基组分的添加，包括添加以改变脂肪酸组成的化合物，例如，但不限于激动剂(例如LXRβ激动剂)或核黄素。培养基的这种调整可以影响脂肪的构成。(图10、图 11)。 [0132] e.在一些实施方案中，所述脂肪酸构成通过培养物中细胞的组成来调节。因此，在一些实施方案中，培养物的成纤维细胞、培养物的成肌细胞或共培养物中的成纤维细胞/成肌细胞可进一步修饰以包括脂肪细胞。 [0133] 在图9中，使用共培养方法(表1中所述的方法15)形成组织(细胞片)，使用具有增强水平的各种化合物的培养基来调节特定的生化路径。核黄素(一种维生素和常见的辅助 因子)被滴定到细胞培养基中。显示了对脂肪酸浓度的整体影响。 [0134] 在本公开所述基于细胞的肉中较低水平的脂肪酸也促进肉的保质期延长，例如通过导致肉中较低的脂肪酸氧化产物水平。 [0135] E.氨基酸 [0136] 同样可取的是，本公开所述免屠宰基于细胞的肉制品与常规肉制品有相似之处。本公开所述免屠宰基于细胞的肉制品通常包含约50g至约95g(按重量计)氨基酸/100g干质 量。例如，本公开所述免屠宰基于细胞的肉制品包含所示量的以下一种或多种氨基酸(所述量表示为g氨基酸/100g总氨基酸)：色氨酸约1至约2.2，苏氨酸约4.6和6.5，异亮氨酸约3.8至约5，亮氨酸约6.1至约8.9，赖氨酸约5.7至约8.8，蛋氨酸约0.14至约3.0，半胱氨酸约1.5至约1.8，苯丙氨酸约3.7至约4.8，酪氨酸约3.0至约5.2，缬氨酸约4.8至约6.1，精氨酸约 7.0至约8.0，组氨酸约2.5至约4，丙氨酸约5.0至约6.3，天冬氨酸约8.6至约10.4，谷氨酸约 12.5至约14.6，甘氨酸约4.6至约9.8，脯氨酸约4.6至约6.8，丝氨酸4.4至5.3，和/或羟脯氨酸约0.0至4.0。 [0137] 在一些实施方案中，与常规的对应物相比，在所述从成纤维细胞单一培养物中产生的基于细胞的肉中羟脯氨酸的水平是升高的。不受任何理论或机制的约束，羟脯氨酸水 平的这种增加可能是由于成纤维细胞分泌细胞外基质成分导致的更高水平的胶原形成。在 一些实施方案中，当成肌细胞(MB))添加到培养系统中作为多克隆细胞混合物(成肌细胞的 混合群体)或单克隆成肌细胞混合物(从混合群体中分离出的单细胞并扩增)时，羟脯氨酸 浓度可降低至接近常规肉的浓度。值得注意的是，在本文提供的实施方案中，羟脯氨酸浓度也可以被调节以改变肉制品的纹理。 [0138] F.维生素E含量 [0139] 与常规肉相比，本公开所述免屠宰基于细胞的肉包含更高的维生素E(α‑生育酚)含量。在一些实施方案中，本公开所述免屠宰基于细胞的肉制品包含至少约0.5mg、至少约 0.6mg、至少约0.7mg、至少约0.8mg、至少约0.9mg或至少约1.0mg维生素E/100g湿质量的基于细胞的肉。 [0140] G.水分含量 [0141] 本公开所述免屠宰基于细胞的肉制品一般具有约65％至约95％的水分含量。在一些实施方案中，所述水分含量在收获后和配制前测量。在其他实施方案中，水分含量在配制后测量。 [0142] H.基于细胞的肉的结构 [0143] 免屠宰基于细胞的肉和常规肉之间还有额外的区别点。并不要求纯粹为了肉食目的(如本文所述)生长的细胞为白色的，以拥有允许移植和功能的功能特征，在某些情况下，它们可以进一步工程化，以包括将赋予功能性的成分。 [0144] 基于细胞的肉，除非另有处理以包含，否则不包含血管组织如静脉和动脉，而常规肉确实包含这种血管系统并包含在血管系统中发现的血液。因此，在一些实施方案中，所述基于细胞的肉基本上不含任何血管系统。如本文一般预期的，血管系统包括血液和/或淋巴液。 [0145] 同样，基于细胞的肉，虽然由肌肉或类似肌肉的组织组成，但除非另有处理以包含，否则不包含功能性肌肉组织。因此，在一些实施方案中，所述基于细胞的肉不包含功能性肌肉组织。 [0146] 值得注意的是，诸如血管系统(可能包含血液、淋巴等)和功能性肌肉组织的特征可以进一步工程化到所述基于细胞的肉中，如果有这样做的意愿。例如，可利用导致血管长出的方案将血管系统引入本公开所述免屠宰基于的肉制品中，并允许增加所述肉制品的灌 注。 [0147] I.味道 [0148] 肉的脂肪酸组成通常会影响整体肉质量，并影响所述肉的味道、多汁性和嫩度(Wood et al.,Manipulating meat quality and composition.Proceedings of the Nutrition Society.1999；58:363‑370.DOI:org/10.1017/S009665199000488)。特定的脂肪酸，如MUFA油酸(18:1ω9)和MUFA棕榈烯酸(16:1ω9)是经常主要与良好味道相关的脂肪 酸。 [0149] 脂肪含量越高的肉通常越美味，但随着脂肪含量的增加，发生不良反应的风险越大。肉中的脂肪构成驱动了关键的感官构成，不仅驱动了消费者的偏好，还驱动着建立独特的物种识别。然而，某些脂肪类型与不良健康后果的更大风险如心脏病有关。因此，可以在培养中调节整体细胞培养基组成、向培养物中补充脂肪酸和/或成肌细胞/成纤维细胞/脂 肪细胞/内皮细胞/其他中胚层谱系细胞的比例，以生产具有最佳味道和健康效果的免屠宰 基于细胞的肉制品。在示例性实施方案中，在共培养中脂肪细胞的比例被改变。可以通过选择特定的肌源细胞克隆体、控制最初在培养物中接种的细胞的比例和/或根据需要改变作 用于细胞的生长因子或其他培养基成分的浓度和比例来实现调节。特定的脂肪酸，如MUFA 油酸(18:1ω9)，可以通过培养基组成和营养设计来富集。 [0150] J.补充 [0151] 在其他实施方案中，可以添加其他营养物质如维生素，以增加肉的营养价值。例如，这可以通过向生长培养基中外源性添加营养物质或通过基因工程技术实现。 [0152] K.煮熟咬合力和硬度 [0153] 本公开所述免屠宰基于细胞的肉制品可以被修饰以获得某些纹理特征，如所需的煮熟咬合力或煮熟硬度。表17显示了示例性的基于细胞的肉样品的煮熟纹理。图13显示了 从成肌细胞：成纤维细胞共培养或成纤维细胞单培养的细胞中产生的示例性的肉的煮熟硬 度。 [0154] 本公开所述基于细胞的肉的煮熟咬合力范围可以为约100g至5000g。在一些示例性实施方案中，本公开所述基于细胞的肉从贴壁细胞培养中收获时的煮熟咬合力范围为约 450g至约3000g。在一些实施方案中，本公开所述基于细胞的肉从贴壁细胞培养中收获时的煮熟咬合力范围为约2500g至约2000g。在一些实施方案中，本公开的基于细胞的肉的煮熟 咬合力和/或煮熟硬度处于或低于检测极限，例如在一些实施方案中，所述肉是从悬浮培养中生长的细胞中收获的。 [0155] L.保质期 [0156] 每年有相当一部分的肉和肉制品被毁掉。据估计，大约有35亿公斤的家禽肉和肉在消费者、零售商和餐饮服务层面被浪费，这对经济和环境产生了重大影响(Kantor et al.(1997))。这一损失中的很大一部分是由于微生物腐败造成的。 [0157] 常规肉是易腐烂的，并且具有相对短的保质期稳定性(在本文中可替换地简称为“保质期”)。常规肉的组成以及屠宰和收获肉的条件，通常为包括粪便细菌(例如大肠菌群)在内的各种微生物创造有利的生长条件；常规肉也非常容易因化学、氧化和酶活动而腐败。 因此，如本文所使用的，在一些实施方案中，所述保质期是指食物保持适合饮食消费并仍然可口的时间量，例如在摄取时不会引起任何疾病或不良健康影响，如呕吐、腹泻、恶心等，并且不产生表明腐烂(例如微生物引起的、分子腐烂、物理腐烂)过程已经开始的气味。 [0158] 在不受理论或机制约束的情况下，一般认为微生物生长、氧化和酶的自溶是导致肉腐败的三种机制，从而缩短了保质期。肉中脂肪、蛋白质和碳水化合物的分解导致特异气味和特异味道的产生，这些特异气味和特异味道使肉不适合人类食用。根据收获的种类和 方法，常规肉制品在相对短的储存时间后食用并不安全。例如，鸡肉应在购买后几天内煮 熟。煮熟的家禽肉在冷藏室中只能安全储存3‑5天，在冷冻室中最多可储存约3‑5个月。因此，有必要控制肉腐败，以增加其保质期并保持其营养价值、纹理和味道。 [0159] 常规肉的保质期经常通过各种工序包括添加防腐剂、腌制、盐渍、脱水、罐装、发酵或在黑暗中储存来延长。本公开所述基于细胞的肉表现出延长的保质期，不需要使用这些方法中的任何一种，但值得注意的是，可以添加这些方法甚至进一步增加保质期。因此，在一些实施方案中，与通过屠宰获得的常规肉相比，本公开所述基于细胞的肉表现出指示保 质期延长的测量结果，其中常规肉是未加工的(例如没有进一步应用任何工艺，如上面列出的那些)。 [0160] 免屠宰基于细胞的肉，通过其生产方法和组成，生产出的肉制品比常规肉制品具有延长的保质期，并且不需要添加防腐剂来获得保质期稳定性。所述基于细胞的肉的组成 使得检测到的特异气味和特异味道更少。此外，所述用于生产基于细胞的肉的制造方法需 要清洁和无菌条件。这些条件确保了收获的产品和后续食品加工中的微生物细胞数量都很 低。这些多重因素有助于延长基于细胞的肉的保质期稳定性。 [0161] 相对于常规肉，本公开所述基于细胞的肉的腐败而导致保质期增强。在所有温度下都是如此，例如在室温下(约22℃至约26℃)，和在类似于家用冰箱温度的较冷温度下(例如在约2℃至4℃)。延长的保质期与减少污染、基于细胞的肉的组成、减少的基于细胞的肉的降解以及降低基于细胞的肉的颜色、腐败、气味和味道的变化速率相关，并允许所述肉保持适于饮食消费。 [0162] 在不受理论或机制约束的情况下，与常规肉相比，所述基于细胞的肉中总脂肪酸含量降低，导致脂肪酸氧化产物水平降低，进而导致所述肉颜色、气味或味道的变化速率较慢。氧化酸败与空气中的氧气降解有关。不饱和脂肪酸的双键可以通过涉及分子氧的自由 基反应被断裂。这种反应导致恶臭和高挥发性醛和酮的释放。氧化反应主要发生在不饱和 脂肪中。例如，即使肉在冷藏或冷冻状态下保存，多不饱和脂肪可以继续氧化并慢慢变得酸败。脂肪氧化过程在动物被屠宰后立即开始，肌肉、肌肉内、肌肉间和表面脂肪暴露于空气中的氧气中。 [0163] 在不受理论或机制约束的情况下，与常规肉相比，所述基于细胞的肉中的脂肪酶数量减少，导致较低的脂肪酸分解水平，进而导致所述肉颜色、气味或味道的变化速率较 慢。 [0164] 在不受理论或机制约束的情况下，与常规肉相比，由于所述基于细胞的肉中缺乏血管系统，存在较少的氧气，导致较低的脂肪酸氧化和好氧细菌的生长水平，导致微生物污染水平降低，进而导致所述肉颜色、气味、香气或味道的变化速率较慢。 [0165] 在不受理论或机制约束的情况下，与常规肉相比，由于基于细胞的肉中缺乏功能性肌肉组织(如肌红蛋白)，存在较少的氧气，导致脂肪酸氧化和好氧细菌的生长水平较低，导致微生物污染水平降低，并导致肉颜色、气味或味道的变化速率较慢。 [0166] 在不受理论或机制约束的情况下，与常规肉相比，由于所述基于细胞的肉中的维生素E含量较高，有较高的抗氧化活性，导致对脂肪酸氧化的保护，进一步导致所述肉颜色、气味或味道的变化速率较慢。肉中脂质的氧化取决于几个因素，包括脂肪酸组成、抗氧化剂维生素E(α‑生育酚)水平和助氧化剂，如存在于肌肉中的游离铁。 [0167] 因此，在一些实施方案中，与常规肉相比，所述免屠宰基于细胞的肉制品的保质期延长了至少约1.5倍、至少约2倍、至少大约2.5倍，至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、或甚至至少约10倍。在约2℃和约26℃以及两者之间的所有温度(包括端点)下均可观察到保质期延长。 [0168] 在一些实施方案中，本文提供了一种用于饮食消费的免屠宰基于细胞的肉制品，表现出延长的保质期，其中与通过屠宰获得的常规肉相比，保质期延长，并且保质期在所有温度下均延长。在一些实施方案中，所述延长的保质期在收获后保持至少2、3、4、5、6、7、10、 14、15、20、21、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、148、150、160、170、180、 190、200、210、220、230、240或至少250天。在一些实施方案中，所述延长的保质期在约22℃‑ 26℃下收获后保持至少3、7、14、30或148天。在一些实施方案中，所述保质期在收获后和配制前确定。在一些实施方案中，所述保质期在配制后确定。在一些实施方案中，所述保质期在约2℃至约6℃，以及约22℃‑26℃的非无菌条件下均延长。在一些实施方案中，所述保质期是通过测量总微生物数量(TC)、大肠杆菌/大肠菌群数量(EC)、大肠杆菌微生物数量或大肠菌群数量确定的。 [0169] 在一些实施方案中，所述通过屠宰获得的常规肉的TC测量值，比免屠宰肉制品的TC测量值高至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、10倍、15倍、20倍、甚至25倍，并导致常规肉较低的保质期。 [0170] 在一些示例性实施方案中，所述免屠宰基于细胞的肉制品包括以下所述一个或多个特征，这些特征在一定程度上有助于表现出延长的保质期： [0171] (a)根据美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》确定的微生物污染未检出水平，或不超过1、10、50或100cfus/g湿质量； [0172] (b)根据美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》确定的大肠菌群污染未检出水平，或不超过1、10、50或100cfus/g湿质量； [0173] (c)根据美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》确定的大肠杆菌污染未检出水平，或不超过1、10、50或100cfus/g湿质量； [0174] (d)根据美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》确定的酵母菌污染未检出水平，或不超过1、10、50或100cfus/g湿质量； [0175] (e)根据美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》确定的霉菌污染未检出水平，或不超过1、10、50或100cfus/g湿质量； [0176] (f)根据美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》确定的沙门氏菌污染未检出水平，或不超过1、10、50或100cfus/g湿质量； [0177] (g)根据美国分析化学家协会2004.06方法确定的李斯特菌污染未检出水平，或不超过1、10、50或100cfus/g湿质量； [0178] (h)根据美国分析化学家协会2003.07方法确定的葡萄球菌污染未检出水平，或不超过1、10、50或100cfus/g湿质量；和/或 [0179] (i)根据CompactDry协议确定的总好氧菌数量污染未检出水平，或不超过1、10、50或100cfus/g湿质量，或不超过55cfus/g湿质量。 [0180] 在一些实施方案中，所述表现出延长保质期的免屠宰肉制品包括免屠宰鸡肉、鸭肉或牛肉，所述常规肉包括通过屠宰获得的鸡肉、鸭肉或牛肉。 [0181] 实施例9讨论了各种示例性方案，根据这些方案可以观察保质期和微生物污染。熟练的技术人员将理解，有许多方法可以用来测量微生物污染。这些方法至少由以下文本提 供：(1)美国食品和药物管理局的《细菌学分析手册》(BAM)(第8版，修订版A/1998)，以及(2)美国农业部食品安全和检验局《微生物学实验室指南》。美国分析化学家协会还提供了至少以下用于确定微生物污染的测试： [0182] a)肠杆菌科，美国分析化学家协会2003.01 [0183] b)大肠杆菌和大肠菌群，美国分析化学家协会998.08 [0184] c)酵母菌和霉菌，美国食品和药物管理局《细菌学分析手册》18章。 [0185] d)李斯特菌，美国分析化学家协会2004.06 [0186] e)沙门氏菌(25g)，美国分析化学家协会2011.03 [0187] f)弯曲杆菌，美国分析化学家协会RI 051201 [0188] g)美国分析化学家协会2003.07‑‑葡萄球菌 [0189] h)好氧菌平板计数，美国分析化学家协会990.12 [0190] i)沙门氏菌，美国分析化学家协会2013.02,RI PTM 081201 [0191] j)李斯特菌，美国分析化学家协会‑RI PTM#081401 [0192] k)好氧菌数量，美国分析化学家协会990.12 [0193] l)大肠菌群和大肠杆菌，美国分析化学家协会991.14 [0194] m)酵母菌和霉菌数量，美国分析化学家协会2014.05 [0195] 可以测试额外的端点，作为保质期的指示性指标。这些包括但不限于：酸败测试；加速保质期研究；水分、pH和水活性变化；不同储存条件下的产品稳定性；微生物、化学和物理测试；感官评价；以及益生菌稳定性。 [0196] III.列举的实施方案 [0197] 本发明可通过参考以下几组列举的示例性实施方案来限定： [0198] 第1组 [0199] 实施方案1.一种基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品包含至少两个以下特征： [0200] a.不超过约1ug类固醇激素/kg干质量的基于细胞的肉制品； [0201] b.不超过约100ug抗生素/kg干质量的基于细胞的肉制品； [0202] c.不超过约100cfus微生物污染/g湿质量的基于细胞的肉制品； [0203] d.当以基于细胞的肉制品的湿质量百分比测量时，平均总脂肪含量为约0.5％至约5.0％； [0204] e.基本上没有血管系统；以及 [0205] f.与常规肉相比具有至少增加2倍的保质期。 [0206] 实施方案2.实施方案1所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品包含至少三个、四个、五个或六个(a)至(f)的特征。 [0207] 实施方案3.实施方案1至2所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品包含不超过约1ug孕酮/kg干质量的基于细胞的肉。 [0208] 实施方案4.实施方案1至3所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品包含不超过约1ug睾酮/kg干质量的基于细胞的肉。 [0209] 实施方案5.实施方案1至4中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品包含不超过约35ng雌二醇/kg干质量的基于细胞的肉。 [0210] 实施方案6.实施方案1至5中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品包含约50g至约90g重量的氨基酸/100g干质量。 [0211] 实施方案7.实施方案1至6中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品包含所示量的以下一种或多种氨基酸(表示为g氨基酸/100g总氨基酸)：色氨酸约 1至约2.2，苏氨酸约4.6和6.5，异亮氨酸约3.8至约5，亮氨酸约6.1至约8.9，赖氨酸约5.7至约8.8，蛋氨酸约0.14至约3.0，半胱氨酸约1.5至约1.8，苯丙氨酸约3.7至约4.8，酪氨酸约 3.0至约5.2，缬氨酸约4.8至约6.1，精氨酸约7.0至约8.0，组氨酸约2.5至约4，丙氨酸约5.0至约6.3，天冬氨酸约8.6至约10.4，谷氨酸约12.5至约14.6，甘氨酸约4.6至约9.8，脯氨酸约4.6至约6.8，丝氨酸4.4至5.3，和/或羟脯氨酸约0.0至4.0。 [0212] 实施方案8.实施方案1至7中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品具有约65％至约95％的水分含量。 [0213] 实施方案9.实施方案8所述的基于细胞的肉制品，其中所述水分含量在收获后但在配制前测量。 [0214] 实施方案10.实施方案8所述的基于细胞的肉制品，其中所述水分含量在配制和脱水过程后但在成分添加前测量。 [0215] 实施方案11.实施方案1至10中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品是基于细胞的家禽肉制品。 [0216] 实施方案12.实施方案11所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的家禽肉制品是基于鸡肉细胞的肉制品。 [0217] 实施方案13.实施方案11所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的家禽肉制品是基于鸭肉细胞的肉制品。 [0218] 实施方案14.实施方案1至10中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品是基于细胞的牛肉制品。 [0219] 实施方案15.实施方案1至14中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品是细胞球团。 [0220] 实施方案16.实施方案1至14中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品是细胞片。 [0221] 实施方案17.实施方案1至16中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品由培养物中的成纤维细胞产生。 [0222] 实施方案18.实施方案1至16中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品由培养物中的成肌细胞产生。 [0223] 实施方案19.实施方案1至16中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品由培养物中的成纤维细胞和成肌细胞共培养产生。 [0224] 实施方案20.实施方案16至19中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述培养物进一步包括脂肪细胞、内皮细胞和/或中胚层谱系细胞。 [0225] 实施方案21.实施方案19所述的基于细胞的肉制品，其中所述共培养物中的成纤维细胞与成肌细胞的比例为约95F:5M至约5F:95M。 [0226] 实施方案22.实施方案1至21中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品包含至少约0.5mg维生素E/100g湿质量的基于细胞的肉。 [0227] 实施方案23.实施方案1至22中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品包含所示量的以下一种或多种脂肪酸类别，表示为该类别占总脂肪酸的百分 比： [0228] a.饱和脂肪酸含量为约29％至约42％； [0229] b.单不饱和脂肪酸含量为约19％至约54％；以及 [0230] c.多不饱和脂肪酸含量为约5％至约36％。 [0231] 实施方案24.实施方案1至23中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品包含比例约2:1至18:1的欧米伽6:3脂肪酸类别。 [0232] 实施方案25.实施方案23或24所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品由鸡肉细胞、鸭肉细胞或牛肉细胞生产。 [0233] 实施方案26.实施方案23或24所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉是在脂肪酸含量已被处理的培养基中产生的。 [0234] 实施方案27.实施方案1至25中任一项所述的基于细胞的肉制品，其中所述基于细胞的肉制品包括以下纹理特征中的至少一个： [0235] a.煮熟咬合力为450g至约2970g；以及 [0236] b.煮熟硬度为约280g至约1900g。 [0237] 实施方案28.实施方案1至27中任一项所述的基于细胞的肉制品，与常规肉相比，所述基于细胞的肉制品的稳定性和保质期至少增加了10倍。 [0238] 实施方案29.实施方案28所述的基于细胞的肉制品，其中所述保质期的增加在约4℃下测量。 [0239] 实施方案30.实施方案28所述的基于细胞的肉制品，其中所述保质期的增加在约25℃下测量。 [0240] 实施方案31.一种生产基于细胞的肉的方法，包括： [0241] a.提供来自非人类生物体的成纤维细胞和/或成肌细胞； [0242] b.在悬浮培养条件或贴壁培养条件下的培养基中培养成纤维细胞和/或成肌细胞，其中所述培养基基本上不含来源于动物的血清或其他成分；以及 [0243] c.分离细胞并生产所述基于细胞的肉。 [0244] 实施方案32.实施方案31所述的方法，其中所述成纤维细胞和/或成肌细胞以约95F:5M至约5F:95M的比例提供。 [0245] 实施方案33.实施方案31至32中任一项所述的方法，与常规肉相比，其中所述基于细胞的肉制品的保质期至少增加2倍。 [0246] 实施方案34.实施方案31至33中任一项所述的方法，其中所述方法包括调整所述培养基的脂肪酸含量，其中所产生的基于细胞的肉制品具有比例约2:1至约18:1的欧米伽 6:3脂肪酸类别。 [0247] 第2组 [0248] 实施方案1.一种表现出延长保质期的用于饮食消费的免屠宰肉制品，其中与通过屠宰获得的常规肉相比，所述保质期延长了，且其中所述保质期在收获后延长了至少3天。 [0249] 实施方案2.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中在约0℃至约30℃下收获后，所述延长的保质期保持至少3天。 [0250] 实施方案3.实施方案1至2中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述保质期在收获后和配制前确定。 [0251] 实施方案4.实施方案1至3中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述保质期在配制后确定。 [0252] 实施方案5.实施方案3所述的免屠宰肉制品，其中当在非无菌条件下收获所述肉时，所述保质期延长。 [0253] 实施方案6.实施方案1至5中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述保质期是通过测量总微生物数量(TC)、大肠杆菌/大肠菌群数量(EC)、大肠杆菌微生物数量或大肠菌群数量确定的。 [0254] 实施方案7.实施方案6所述的免屠宰肉制品，其中通过屠宰获得的常规肉的TC测量值比免屠宰肉制品的TC测量值高至少1.5倍。 [0255] 实施方案8.实施方案1至7中任一项所述的免屠宰肉制品，包含不超过1cfus微生物污染/g湿质量。 [0256] 实施方案9.实施方案1至8中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含不超过约1ug类固醇激素。 [0257] 实施方案10.实施方案1至9中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述基于细胞的肉制品包含约50g至约90g重量的氨基酸/100g干质量。 [0258] 实施方案11.实施方案1至10中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含所示量的以下一种或多种氨基酸(表示为g氨基酸/100g总氨基酸)：色氨酸约1至约 2.2，苏氨酸约4.6和6.5，异亮氨酸约3.8至约5，亮氨酸约6.1至约8.9，赖氨酸约5.7至约 8.8，蛋氨酸约0.14至约3.0，半胱氨酸约1.5至约1.8，苯丙氨酸约3.7至约4.8，酪氨酸约3.0至约5.2，缬氨酸约4.8至约6.1，精氨酸约7.0至约8.0，组氨酸约2.5至约4，丙氨酸约5.0至约6.3，天冬氨酸约8.6至约10.4，谷氨酸约12.5至约14.6，甘氨酸约4.6至约9.8，脯氨酸约 4.6至约6.8，丝氨酸约4.4至约5.3，和/或羟脯氨酸约0.0至4.0。 [0259] 实施方案12.实施方案1至11中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品具有约65％至约95％的水分含量，其中所述水分含量在收获后但在配制前测量。 [0260] 实施方案13.实施方案1至12中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含至少约0.5mg维生素E/100g湿质量的免屠宰肉制品。 [0261] 实施方案14.实施方案1至13中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含所示量的以下一种或多种脂肪酸类别，表示为该类别占总脂肪酸的百分比： [0262] a.饱和脂肪酸含量为约10％至约60％； [0263] b.单不饱和脂肪酸含量为约10％至约60％；以及 [0264] c.多不饱和脂肪酸含量为约1％至约50％。 [0265] 实施方案15.实施方案1至14中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含比例约为2:1至18:1的欧米伽6:3脂肪酸类别。 [0266] 实施方案16.实施方案1至15中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包括免屠宰的鸡肉、鸭肉或牛肉，常规肉包括通过屠宰获得的鸡肉、鸭肉或牛肉。 [0267] 实施方案17.实施方案1至16中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品基本上不含血管系统。 [0268] 实施方案18.实施方案1至17中任一项所述的免屠宰肉制品，其中常规肉没有被加工。 [0269] 实施方案19.一种用于饮食消费的与通过屠宰获得的常规肉相比表现出较低的微生物污染数量的免屠宰肉制品，其中所述较低的微生物污染数量在收获后表现出来持续至 少3天。 [0270] 实施方案20.实施方案19所述的免屠宰肉制品，其中在约0℃至约30℃下收获后，所述较低的微生物污染数量保持至少3天。 [0271] 实施方案21.实施方案19至20中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述微生物污染数量在收获后和配制前确定。 [0272] 实施方案22.实施方案19至21中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品保持在非无菌条件下。 [0273] 实施方案23.实施方案19至22中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述微生物污染数量是通过测量总微生物数量(TC)、大肠杆菌/大肠菌群数量(EC)、大肠杆菌微生物数量或大肠菌群数确定的。 [0274] 实施方案24.实施方案19至23中任一项所述的免屠宰肉制品，包含不超过1cfus微生物污染/g湿质量。 [0275] 实施方案25.实施方案19至24中任一项所述的免屠宰肉制品，其中通过屠宰获得的常规肉的TC测量值比免屠宰肉制品的TC测量值高至少1.5倍。 [0276] 实施方案26.实施方案19至25中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含不超过约1ug类固醇激素。 [0277] 实施方案27.实施方案19至26中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含所示量的以下一种或多种氨基酸(表示为g氨基酸/100g总氨基酸)：色氨酸约1至 约2.2，苏氨酸约4.6和6.5，异亮氨酸约3.8至约5，亮氨酸约6.1至约8.9，赖氨酸约5.7至约 8.8，蛋氨酸约0.14至约3.0，半胱氨酸约1.5至约1.8，苯丙氨酸约3.7至约4.8，酪氨酸约3.0至约5.2，缬氨酸约4.8至约6.1，精氨酸约7.0至约8.0，组氨酸约2.5至约4，丙氨酸约5.0至约6.3，天冬氨酸约8.6至约10.4，谷氨酸约12.5至约14.6，甘氨酸约4.6至约9.8，脯氨酸约 4.6至约6.8，丝氨酸约4.4至约5.3，和/或羟脯氨酸约0.0至4.0。 [0278] 实施方案28.实施方案19至27中任一项所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含所示量的以下一种或多种脂肪酸类别，表示为该类别占总脂肪酸的百分比： [0279] a.饱和脂肪酸含量为约10％至约50％； [0280] b.单不饱和脂肪酸含量为约10％至约54％；以及 [0281] c.多不饱和脂肪酸含量为约1％至约50％。 [0282] 实施方案29.实施方案19至28所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含比例约为2:1至18:1的欧米伽6:3脂肪酸类别。 [0283] 实施方案30.实施方案19至29所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包括免屠宰的鸡肉、鸭肉或牛肉，常规肉包括通过屠宰获得的鸡肉、鸭肉或牛肉。 [0284] 实施方案31.一种生产免屠宰肉制品的方法，与通过屠宰获得的未加工常规肉相比表现出增加的保质期，所述方法包括： [0285] a.提供来自非人类生物体的细胞； [0286] b.在悬浮培养条件或贴壁培养条件下的培养基中培养细胞，其中所述培养基基本上不含来源于动物的血清或其他成分；以及 [0287] c.分离细胞并生产所述免屠宰肉制品。 [0288] 实施方案32.实施方案31所述的方法，其中所述细胞包括成肌细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞、中胚层谱系细胞及其组合。 [0289] 实施方案33.实施方案31‑32中任一项所述的方法，其中所述细胞至少包含成纤维细胞和成肌细胞，所述成纤维细胞和成肌细胞以约95F:5M至约5F:95M的比例提供。 [0290] 实施方案34.实施方案31‑33中任一项所述的方法，所述方法包括调整所述培养基的脂肪酸含量，其中所产生的免屠宰肉制品具有比例约2:1至约18:1的欧米伽6:3脂肪酸类 别。 [0291] 第3组 [0292] 实施方案1.一种表现出延长保质期的用于饮食消费的免屠宰肉制品，其中与通过屠宰获得的常规肉相比，所述保质期延长了，且其中所述保质期在收获后延长了至少3天。 [0293] 实施方案2.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中在约0℃至约30℃下收获后，所述延长的保质期保持至少3天。 [0294] 实施方案3.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中所述保质期在收获后和配制前确定。 [0295] 实施方案4.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中所述保质期在配制后确定。 [0296] 实施方案5.实施方案3所述的免屠宰肉制品，其中当在非无菌条件下收获所述肉时，所述保质期延长。 [0297] 实施方案6.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中所述保质期是通过测量总微生物数量(TC)、大肠杆菌/大肠菌群数量(EC)、大肠杆菌微生物数量或大肠菌群数量确定的。 [0298] 实施方案7.实施方案6所述的免屠宰肉制品，其中通过屠宰获得的常规肉的TC测量值比免屠宰肉制品的TC测量值高至少1.5倍。 [0299] 实施方案8.实施方案1所述的免屠宰肉制品，包含不超过1cfus微生物污染/g湿质量。 [0300] 实施方案9.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含不超过约1ug类固醇激素。 [0301] 实施方案10.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中所述基于细胞的肉制品包含约50g至约90g重量的氨基酸/100g干质量。 [0302] 实施方案11.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含所示量的以下一种或多种氨基酸(表示为g氨基酸/100g总氨基酸)：色氨酸约1至约2.2，苏氨酸约 4.6和6.5，异亮氨酸约3.8至约5，亮氨酸约6.1至约8.9，赖氨酸约5.7至约8.8，蛋氨酸约 0.14至约3.0，半胱氨酸约1.5至约1.8，苯丙氨酸约3.7至约4.8，酪氨酸约3.0至约5.2，缬氨酸约4.8至约6.1，精氨酸约7.0至约8.0，组氨酸约2.5至约4，丙氨酸约5.0至约6.3，天冬氨酸约8.6至约10.4，谷氨酸约12.5至约14.6，甘氨酸约4.6至约9.8，脯氨酸约4.6至约6.8，丝氨酸约4.4至约5.3，和/或羟脯氨酸约0.0至4.0。 [0303] 实施方案12.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品具有约65％至约95％的水分含量，其中所述水分含量在收获后但在配制前测量。 [0304] 实施方案13.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含至少约0.5mg维生素E/100g湿质量的免屠宰肉制品。 [0305] 实施方案14.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含所示量的以下一种或多种脂肪酸类别，表示为该类别占总脂肪酸的百分比： [0306] a.饱和脂肪酸含量为约10％至约60％； [0307] b.单不饱和脂肪酸含量为约10％至约60％；以及 [0308] c.多不饱和脂肪酸含量为约1％至约50％。 [0309] 实施方案15.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含比例约为2:1至18:1的欧米伽6:3脂肪酸类别。 [0310] 实施方案16.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包括免屠宰的鸡肉、鸭肉或牛肉，常规肉包括通过屠宰获得的鸡肉、鸭肉或牛肉。 [0311] 实施方案17.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品基本上不含血管系统。 [0312] 实施方案18.实施方案1所述的免屠宰肉制品，其中常规肉没有被加工。 [0313] 实施方案19.一种用于饮食消费的与通过屠宰获得的常规肉相比表现出较低的微生物污染数量的免屠宰肉制品，其中所述较低的微生物污染数量在收获后表现出来持续至 少3天。 [0314] 实施方案20.实施方案19所述的免屠宰肉制品，其中在约0℃至约30℃下收获后，所述较低的微生物污染数量保持至少3天。 [0315] 实施方案21.实施方案19所述的免屠宰肉制品，其中所述微生物污染数量在收获后和配制前确定。 [0316] 实施方案22.实施方案19所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品保持在非无菌条件下。 [0317] 实施方案23.实施方案19所述的免屠宰肉制品，其中所述微生物污染数量是通过测量总微生物数量(TC)、大肠杆菌/大肠菌群数量(EC)、大肠杆菌微生物数量或大肠菌群数确定的。 [0318] 实施方案24.实施方案19所述的免屠宰肉制品，包含不超过1cfus微生物污染/g湿质量。 [0319] 实施方案25.实施方案19所述的免屠宰肉制品，其中通过屠宰获得的常规肉的TC测量值比免屠宰肉制品的TC测量值高至少1.5倍。 [0320] 实施方案26.实施方案19所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含不超过约1ug类固醇激素。 [0321] 实施方案27.实施方案19所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含所示量的以下一种或多种氨基酸(表示为g氨基酸/100g总氨基酸)：色氨酸约1至约2.2，苏氨酸 约4.6和6.5，异亮氨酸约3.8至约5，亮氨酸约6.1至约8.9，赖氨酸约5.7至约8.8，蛋氨酸约 0.14至约3.0，半胱氨酸约1.5至约1.8，苯丙氨酸约3.7至约4.8，酪氨酸约3.0至约5.2，缬氨酸约4.8至约6.1，精氨酸约7.0至约8.0，组氨酸约2.5至约4，丙氨酸约5.0至约6.3，天冬氨酸约8.6至约10.4，谷氨酸约12.5至约14.6，甘氨酸约4.6至约9.8，脯氨酸约4.6至约6.8，丝氨酸约4.4至约5.3，和/或羟脯氨酸约0.0至4.0。 [0322] 实施方案28.实施方案19所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含所示量的以下一种或多种脂肪酸类别，表示为该类别占总脂肪酸的百分比： [0323] a.饱和脂肪酸含量为约29％至约42％； [0324] b.单不饱和脂肪酸含量为约19％至约54％；以及 [0325] c.多不饱和脂肪酸含量为约5％至约36％。 [0326] 实施方案29.实施方案19所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包含比例约为2:1至18:1的欧米伽6:3脂肪酸类别。 [0327] 实施方案30.实施方案19所述的免屠宰肉制品，其中所述免屠宰肉制品包括免屠宰的鸡肉、鸭肉或牛肉，常规肉包括通过屠宰获得的鸡肉、鸭肉或牛肉。 [0328] 实施方案31.一种生产免屠宰肉制品的方法，与通过屠宰获得的未加工常规肉相比表现出增加的保质期，所述方法包括： [0329] a.提供来自非人类生物体的细胞； [0330] b.在悬浮培养条件或贴壁培养条件下的培养基中培养细胞，其中所述培养基基本上不含来源于动物的血清或其他成分；以及 [0331] c.分离细胞并生产免屠宰肉制品。 [0332] 实施方案32.实施方案31所述的方法，其中所述细胞包括成肌细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞、中胚层谱系细胞及其组合。 [0333] 实施方案33.实施方案31所述的方法，其中所述细胞至少包含成纤维细胞和成肌细胞，且所述成纤维细胞和成肌细胞以约95F:5M至约5F:95M的比例提供。 [0334] 实施方案34.实施方案31所述的方法，所述方法包括调整所述培养基的脂肪酸含量，其中所产生的免屠宰肉制品具有比例约2:1至约18:1的欧米伽6:3脂肪酸类别。 [0335] 本文公开的发明通过以下不应被解释为限制性的附加实施例进一步说明。根据本公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的特定实施方案进行多种变化，并且仍然获得同等或相似的结果。 [0336] 本公开中引用的所有专利和非专利文献通过引用整体并入本文。实施例 [0337] 实施例1：基于细胞培养的肉制品的产生 [0338] 举例说明，如下所述来自家鸡(Gallus)(鸡肉)、野鸭(Anas platyrhynchos)(鸭肉)和黄牛(Bos taurus)(牛、牛肉)的肉是在培养物中产生的，如表1所示。 [0339] 培养条件：所分析的细胞片(组织)和细胞通过成纤维细胞(F)和成肌细胞(M)的单培养或共培养产生。除非规定为单克隆(例如方法14)，否则所有群体均为多克隆的。 [0340] 贴壁培养形式：将细胞解冻到容器中，并在贴壁培养物中生长至接近汇合(70‑90％)。所述细胞在贴壁培养物中扩增6至10倍，直到达到适于接种用于组织形成的数量。通过将细胞以目标密度(目标范围：每平方厘米10,000‑20,000个细胞)贴壁接种来产生组织，如果所述组织包含两种或更多的细胞类型，则以特定的比例。所述细胞在含有特定数量动 物血清的培养基中培养一定的时间(10‑20天)。在培养结束时，肉组织被物理性地收获，并在缓冲液中清洗以去除培养基成分。 [0341] 悬浮培养形式：将细胞解冻到含有特定数量动物血清的培养基中，并在悬浮培养物中生长。加入新鲜培养基以保持每毫升50,000至1,000,000个细胞的密度，以扩增细胞群体。 [0342] 本文中表1提供了用于各种肉制品的示例性培养方法。除非规定为单克隆(例如方法14、15，单克隆成肌细胞群体)，否则所有群体均为多克隆。 [0343] 表的符号说明—成纤维细胞：F；成肌细胞：M；牛血清：BS；鸡血清：CS；胎牛血清：FBS；马血清：HS；(高)：培养基含有8‑10％的特定血清；(低)：培养基含有1‑2.5％的特定血清。除非在接种培养或组织形成部分另有说明，否则使用含有10％FBS的DMEM‑F12。 [0344] 表1：用于产生基于细胞的肉的细胞培养方法 [0345] [0346] [0347] 实施例2：基于细胞培养的肉制品的氨基酸构成 [0348] 在培养物中产生肉组织，如实施例1所述的使用方法和表1所述。 [0349] 基于细胞培养的肉制品的氨基酸构成检测如下。总氨基酸构成包括游离氨基酸和结合氨基酸的总和，而游离氨基酸构成包括非蛋白质结合的氨基酸。 [0351] 完全水解：将约4mg的冻干组织放入水解试管中(记录样品的实际质量)。所述样品浸泡在500μL甲酸中过夜，然后干燥。对样品进行液相水解(200μL6N盐酸/1％苯酚在110℃下水解24h)，然后干燥样品。然后对样品进行旋涡、离心，并使用50μL进行分析。因此，完全水解通过盐酸消化完成。 [0352] 自由水解：约18mg冻干组织放入水解试管中(记录样品的实际质量)。所述样品溶解在1mL 0.1N盐酸中，然后用玻璃珠(BioEruptor)超声处理15min。然后用250uL 10％的5‑磺基水杨酸沉淀整个样品，然后在室温下静置15min，之后所述样品在‑20℃下冷冻过夜。然后离心样品，取上清液，制备AE‑cys(或NorLeu)稀释液，以达到所指示的最终稀释度。然后对样品进行旋涡、离心，并使用50μL进行分析。除了蛋氨酸(MET)、半胱氨酸(CYS)和色氨酸(TRP)需要不同的水解条件，因为盐酸会破坏它们，该方法适用于所有氨基酸。对于MET和 CYS，使用过甲酸进行单独水解，TRP需要使用氢氧化钠进行碱性水解。 [0353] 分析：酸稳定的氨基酸通过日立L‑8900和L‑8800a分析仪进行检测，该分析仪使用柠檬酸锂缓冲系统，并针对生理样品进行了优化。所述分析仪使用离子交换色谱法分离氨基酸，然后使用“柱后”茚三酮反应检测系统。每种氨基酸通过峰保留时间(RT)来识别，并通过峰面积进行定量；下表2中列出了目标氨基酸的代表性RT值。 [0354] 表2：氨基酸的峰保留时间 [0355]氨基酸 缩写 保留时间(min) 天冬氨酸 ASX 8.5 苏氨酸 THR 12.2 丝氨酸 SER 13.4 谷氨酸 GLX 16.8 脯氨酸 PRO 25.7 甘氨酸 GLY 26.9 丙氨酸 ALA 28.4 缬氨酸 VAL 33.9 异亮氨酸 ILE 53.4 亮氨酸 LEU 57.5 酪氨酸 TYR 61.4 苯丙氨酸 PHE 66.4 赖氨酸 LYS 100.5 组氨酸 HIS 103.2 精氨酸 ARG 116 [0356] 下表3‑5总结了表1中列出的几种样品的氨基酸(AA)构成数据—在某些情况下，测量结果为一式两份或三份。数值表示为g/100g总氨基酸。标记为“总数”的列表示氨基酸的总克数，不包括色氨酸(TRP)、半胱氨酸(CYS)、蛋氨酸(MET)、HYP(羟脯氨酸)、HYL(羟赖氨酸)，用来归一化所呈现的氨基酸值。TRP、CYS、MET、HYP和HYL被排除在外，因为所有样本的测量结果不一致。NT＝未测试。 [0357] 表3：氨基酸构成 [0358] [0359] 表4：氨基酸构成 [0360] [0361] [0362] 表5：氨基酸构成 [0363] [0364] [0365] 表6‑8分别显示了鸡肉、鸭肉和牛肉的综合平均氨基酸值(表示为总氨基酸的百分比)。所述总氨基酸的百分比表示为每种单独氨基酸的g/100g数值，通过所有测量的分析物的总和归一化，不包括色氨酸(TRP)、半胱氨酸(CYS)、蛋氨酸(MET)、羟脯氨酸(HYP)和羟基赖氨酸(HYL)，因为这些参数在所有样品中测量不一致。因此，所述总数值的百分比允许所有样品的直接比较，无论TRP、CYS、MET、HYP和HYL是否被特定测量。 [0366] 表9显示了表6‑8的数据的组合—所有基于细胞的肉样品(表1中方法的组合)氨基酸组成数据。 [0367] 表6：基于细胞的鸡肉的氨基酸组成 [0368] [0369] [0370] 表7：基于细胞的鸭肉的氨基酸组成 [0371] [0372] [0373] 表8：基于细胞的牛肉的氨基酸组成 [0374] [0375] [0376] 表9：所有基于细胞的肉样品(表1中方法的组合)氨基酸组成(g氨基酸/100g样品) [0377] 平均值 标准差 样本数 最小值 最大值氨基酸 TRP 1.67 0.60 5 1 2.22 苏氨酸 THR 5.39 0.46 23 4.58 6.47 异亮氨酸 ILE 4.46 0.33 23 3.82 4.95 亮氨酸 LEU 7.64 0.68 23 6.1 8.93 赖氨酸 LYS 7.05 0.78 23 5.68 8.80 蛋氨酸 MET 2.25 0.68 15 0.14 2.96 半胱氨酸 CYS 1.66 0.10 15 1.48 1.82 苯丙氨酸 PHE 4.25 0.25 23 3.72 4.76 酪氨酸 TYR 3.86 0.41 23 3.05 5.15 缬氨酸 VAL 5.56 0.41 23 4.78 6.10 精氨酸 ARG 7.40 0.23 23 7.05 7.95 组氨酸 HIS 3.34 0.43 23 2.51 3.94 丙氨酸 ALA 5.58 0.38 23 5.02 6.28 天冬氨酸 ASX 9.45 0.49 23 8.61 10.39 谷氨酸 GLX 13.32 0.50 23 12.47 14.64 甘氨酸 GLY 6.72 1.46 23 4.56 9.83 脯氨酸 PRO 5.69 0.61 23 4.59 6.79 丝氨酸 SER 4.74 0.20 23 4.46 5.29 [0378] 总体而言，所述基于细胞的肉的氨基酸构成与常规肉相当(图1)，然而存在关键的差异。例如，基于细胞的肉中的羟脯氨酸浓度高于常规肉(美国农业部数据库食品中心数据库)。与基于细胞的肉的比较如表10所示(单位为g羟脯氨酸/100g总蛋白)。显示了常规和基于细胞的牛肉、鸭肉和鸡肉的浓度。所述基于细胞的肉使用表1中的方法2、3和7产生。在用作对照的三个物种中，羟脯氨酸的浓度在所述基于细胞的肉中升高。 [0379] 表10：羟脯氨酸浓度(g羟脯氨酸/100g总蛋白) [0380] [0381] 图2和表11显示了由方法7、13和14产生的基于细胞的肉中基于细胞的鸡肉的羟脯氨酸浓度，并进一步处理。图2显示了羟脯氨酸浓度，单位为g/100g基于细胞的肉湿质量。整个所述基于细胞的肉的羟脯氨酸平均浓度为0.15‑0.17g/100g基于细胞的肉湿质量之间 (图2)。表11显示了羟脯氨酸浓度，单位为g/100g总蛋白。对照条件(Ctrl)是用表1中分别用于成纤维细胞、成纤维细胞/成肌细胞(共培养)和成纤维细胞/成肌细胞(单培养)的方法7、 13、14产生。与常规的对应物相比，仅由成纤维细胞培养物产生的基于细胞的肉中的羟脯氨酸水平升高。当成肌细胞(MB)作为多克隆细胞混合物(成肌细胞的混合群体)(例如，表1中 的方法13)或单克隆成肌细胞混合物(表1中方法14)(从混合群体中分离出的单细胞并扩 增)添加到培养系统中时，所述羟脯氨酸浓度降低至接近常规肉的浓度。使用改良的培养条件(处理1熊果酸，20mM；或处理2亮氨酸，20mM)，羟脯氨酸浓度进一步降低。这些处理应用于表1中的方法13和14。 [0382] 表11：羟脯氨酸浓度(g/100g总蛋白) [0383] [0384] 实施例3：基于细胞的肉制品的微生物污染检测 [0385] 对基于细胞的肉组织进行微生物污染评估，例如大肠杆菌、酵母菌、霉菌、沙门氏菌和李斯特菌。 [0386] 这些研究由第三方实验室Anresco Laboratories进行。标准平板计数(SPC)、大肠杆菌/大肠菌群和酵母菌/霉菌，由标准美国食品和药物管理局生物分析方法协议确定。美 国分析化学家协会方法用于沙门氏菌(AOAC2011.03)、李斯特菌(AOAC2004.06)和葡萄球菌 (AOAC 2003.07)。 [0387] 简单地说，标准平板计数(SPC)是通过制备基于细胞的肉匀浆的十进制稀释液，并将每次稀释液中的1ml等分试样移到单独的、重复的、近似标记的培养皿中来完成的，其中添加了12‑15ml平板计数琼脂。样品稀释液和琼脂培养基充分混合，允许所述琼脂凝固。将凝固的培养皿倒置，并在35℃下孵育48±2h，之后读取平板计数。(https://www.fda.gov/ food/laboratory‑methods‑food/bam‑aerobic‑plate‑count#conventional) [0388] 大肠杆菌/大肠菌群的测量是通过如下来确定的：制备50g基于细胞的肉匀浆样品到450ml巴特菲尔德(Butterfield)磷酸盐缓冲液中并混合；制备十进制稀释液，并将1ml体积等分加入用于3试管最近似数(MPN)的3个月桂基胰蛋白胨(LST)肉汤的每一个中。LST试 管在35℃下孵育，并在24±2h后进行检查，以观察气体置换或泡腾现象；任何气体阴性试管再孵育24h以确认阴性。为了确认大肠菌群，从每个充气LST试管中，将一环样品转移到亮绿色乳糖胆汁(BGLB)肉汤试管中，并在35℃下孵育48±3h。MPN是根据连续3次稀释的确认的 充气LST试管的比例计算的。为了确认大肠杆菌，从每个充气LST试管中，将一环样品转移到大肠杆菌/大肠菌群(EC)肉汤试管中，并在44.5℃下培养24±2h。任何阴性结果都再次孵 育，并在48h再次检查。此外，通过在35℃下移除L‑EMB琼脂平板上的一环肉汤和分离的条纹 18‑24h，对每个充气EC试管进行取样；将任何大肠杆菌菌落转移至PCA斜面，并在35℃下进一步孵育18‑24h。MPN是根据含有大肠杆菌的3个连续稀释液中EC试管的比例计算的。 (https://www.fda.gov/food/laboratory‑methods‑food/bam‑4‑enumeration‑ escherichia‑coli‑and‑coliform‑bacteria#conventional) [0389] 酵母菌/霉菌数量是通过分析25‑50g基于细胞的肉样品，在0.1％的蛋白胨水中消‑1 化以达到10 的稀释度，并在均质机中匀浆2min或混合30‑60秒而获得的。使用涂布平板法或倾倒平板法进行接种，并在25℃的黑暗中孵育。5天后对平板进行计数；阴性平板再孵育 48h。(https://www.fda.gov/food/laboratory‑methods‑food/bam‑yeasts‑molds‑and‑mycotoxins) [0390] 表12提供了基于细胞的肉与常规杂货店的肉中污染物的比较。常规的鸭肉，尤其是常规的牛肉，微生物污染量明显更高。 [0391] 所述常规的鸭肉是在当地的杂货店(加利福尼亚州伯克利)购买的。所述肉从皮和脂肪中分离出来，用消毒过的刀和砧板切碎。将肉装入50mL离心管(falcon tube)中并密 封。所述封闭的试管用70％的乙醇喷洒，并在‑80℃下冷冻。样品在‑80℃冷冻，然后在测试前保持在4℃。 [0392] 所述基于细胞的鸭肉是使用表1中所述方法1和2的组织的组合。组织从冷冻储存中取出，混合，并使用消毒过的砧板和刀切碎。肉装入50mL离心管并密封。所述封闭的试管用70％的乙醇喷洒，并在‑80℃下冷冻。样品在‑80℃下冷冻，然后在测试前保持在4℃。 [0393] 特级瘦肉型(97％瘦肉)碎牛肉购买自当地一家杂货店(加利福尼亚州伯克利)。牛肉直接装入50mL离心管。所述试管密封并喷洒70％的乙醇。试管在‑80℃下冷冻。样品在‑80℃下冷冻，然后在测试前保持在4℃。 [0394] 所述基于细胞的牛肉是使用表1中的方法3获得的组织的组合。将组织从冷冻储存中取出，混合，并使用消毒过的砧板和刀切碎。肉装入50mL的离心管并密封。所述封闭的试管用70％的乙醇喷洒，并在‑80℃下冷冻。样品在‑80℃下冷冻，然后在测试前保持在4℃。 [0395] 表12：常规肉和基于细胞的肉中的污染物比较 [0396] [0397] [0398] 在进一步的实验中，微生物显色测试(CompactDry)平板用于检测基于细胞的肉样品和常规肉样品的总好氧菌数量和大肠杆菌/大肠菌群数量；所有评估的样品都是未煮熟 的和生的。 [0399] 使用微生物显色测试(CompactDry)平板，其中涉及使用乙醇消毒过的用品收集1g样本量，并转移到无菌试管中；加入无菌巴特菲尔德(Butterfield)磷酸盐缓冲液，以保持 25g样品对应225ml缓冲液的比例。旋涡试管，在室温下放置10min以将任何细菌转移到溶液中，然后以300xg离心5min以将固体沉降到底部；所述上清液收集到无菌试管中并制备十进TM TM 制稀释液。将每次稀释的1ml等分试样接种在总计数CompactDry TC上和CompactDry EC平 板上，分别用于总好氧菌计数(TC)和大肠杆菌/大肠菌群计数(EC)。平板根据制造商规范孵育，菌落数量表示为cfu/mL，并根据25g/225ml样品消化比例转换为cfu/g。 [0400] 一般而言，所述基于细胞的肉回收率是低的，通常低于检测限(约10cfu/g)，因此没有检测到(ND)，如表13。更具体地说，不同批次的基于细胞的鸭肉产出，针对TC为从ND(< 9cfu/g)至54cfu/c，而针对总EC为ND(＜9cfu/g)。对于TC，基于细胞的牛肉样品产出为ND(< 9cfu/g)，而基于细胞的鸡肉样品产出从ND(小于9cfu/g)至18cfu/g。当基于细胞的鸭肉和 牛肉样品(含有低的总好氧菌数量)故意被常规生鸡肉污染(表13中表示为基于细胞的肉样 品“被鸡肉污染”)时，TC飙升至>900cfu/g，表明所述样品基质的检测的实用性，并确认没有因基质效应而发生信号抑制。常规生牛肉和鸡肉样品的TC均>900cfu/g，EC分别为315cfu/g和>900cfu/g。与常规生肉样品相比，所述基于细胞的肉样品均显示出表明生物负荷显著降低的没有检测到至低(<100cfu/g)TC和EC数量。图3显示了指示细菌菌落的代表性微生物显 色测试(CompactDry)平板，具体显示了基于细胞的鸭肉、常规牛肉和常规鸡肉的EC和TC结 果。这在表13中进行了量化。 [0401] 表13：常规和基于细胞的肉样品的生物负荷 [0402] [0403] 实施例4：基于细胞的肉制品的脂肪酸含量检测 [0404] 本节中的大部分数据涉及通过脂肪酸甲酯气相色谱分析(GC‑FAME)方法(方法FA1)检测脂肪酸构成，其中样品进行直接水解(在加热下使用盐酸，样品溶解在氯仿和乙醇中)，以分解所述样品基质，释放甘油三酯(TG)，并将TG转化为脂肪酸。通过乙醚萃取回收脂肪酸，并作为非极性层收集。脂肪酸通过甲醇硫酸衍生为其脂肪酸甲酯(FAME)对应物，最终的FAME化合物通过乙醚萃取回收。所述含有FAME的非极性层通过气相色谱‑火焰离子化检 测器(GC‑FID)注射用于分析。单独的FAME化合物根据保留时间确认，并通过与标准曲线相比的峰下面积进行定量。回收率根据甘油三酯内标评估。图8中的数据根据AOCS CE 1F‑96，通过技术上不同(尽管相似)的方法(方法FA2)检测，其中采用气相色谱法通过其链长、饱 和/不饱和程度以及不饱和位置来分离脂肪酸衍生物(FAME)。 [0405] 在这两种方法中，从所述分析中回收的原始数值被报告为每种脂肪酸占总脂肪酸的百分比。在方法FA1中，来自检测中报告的数值为ug脂肪酸/g湿质量。总脂肪酸的百分比表示为g/100g数值，每种单独的脂肪酸通过所有测量的脂肪酸分析物的总和进行归一化。 方法FA2报告脂肪酸为占总脂肪的百分比。 [0406] 表14显示了基于细胞的肉的总脂肪酸分析。使用表1所述的方法确定制备的基于细胞的肉中的总FA，如图所示。表中所述数据以湿质量的百分比测量。当调整所述基于细胞的肉以模拟常规肉的水分含量时(基于细胞的肉经过强制空气脱水过程，以调节水分含量 为65％至85％)，正如美国农业部通常测量和记录的那样，％FA最高达到约5％。 [0407] 表14：总脂肪酸分析 [0408] [0409] [0410] 图4显示了全部样品(N＝24)中饱和、单不饱和和多不饱和脂肪酸的总脂肪酸组成，样品包括使用表1中每种方法的代表性样品。所述数据以FA类别/总FA的百分比表示。所有样品(表1，1‑15)均在含血清的培养基中，除了悬浮单一培养物M(方法16，表1)，其在化学定义的(CD)细胞培养基中。图中显示了来自所有物种的基于细胞的肉原型样品的脂肪酸全 部四个主要的脂肪酸类别名称(饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸和高度不饱和脂肪酸(HUFA))的分布。盒子的两端是上四分位和下四分位，因此盒子跨越四分位之间的范围，中间值由盒子内部的垂直线标记，盒子外围的胡须或线是盒子外部延伸到最高和最 低观察值的两条线。 [0411] 图5显示了美国农业部物种FA的主成分分析(PCA)。它显示了不同物种的FA不同，但在同类物种(如家禽)中相似。脂肪酸数据的主成分分析(PCA)来自美国农业部肉制品数 据库，图5。左侧的图表显示了分析的主成分。三角形代表家禽产品，圆圈代表鱼产品，正方形代表牛肉，菱形代表猪肉。该分析占脂肪酸数据中发现的变异的66.3％。右边的图表显示了每种脂肪酸对成分分析的方向和幅度影响。从这一分析中可以清楚地看出，不同类型的 肉(鸡肉、猪肉、牛肉和鱼肉)基于每种肉的脂肪酸构成情况，在单独和不同的群体中相互聚集在一起。在常规肉中，饮食显著影响脂肪酸构成。同样，不同物种的脂肪酸构成也不同。 [0412] 图6显示了基于细胞的鸡肉中欧米伽6:3脂肪酸的比例，N＝23。离群数据点均来自表1中的方法16的化学定义(CD)的细胞培养基。在N＝3的样本量中，常规鸡肉(从当地杂货 店购买)的欧米伽6:3脂肪酸比例>18:1。 [0413] 本文提供的方法可以通过几种机制改变特定的脂质构成，以实现期望的味道特征或脂肪酸构成，如欧米伽3/6比例： [0414] a.所述培养基中血清的存在会影响脂肪酸构成。图7显示了无血清培养基对比含血清培养基，其中的脂肪酸百分比。 [0415] b.不同来源的血清会在培养的组织中产生不同的脂肪酸构成。(图8) [0416] c.来自多克隆群体的分离克隆体也影响FA构成。成肌细胞克隆7对比8(图9)。 [0417] d.脂肪酸构成受培养基组成和添加培养基成分的影响，包括为改变FA组成而添加的化合物，如激动剂，或核黄素(例如)。对培养基的调整可以影响脂肪构成。(图10，图11)。 [0418] 图10显示了使用共培养方法(表1中所述的方法15)形成组织，使用具有增强水平的各种化合物的培养基来调节特定的生化途径。在图10中，激动剂T0901317被滴定到细胞 培养基中。显示了对脂肪酸浓度的总体影响。激动剂T0901317靶向肝X受体β(LXRβ)。抑制LXRβ，上调硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)的合成，导致饱和脂肪酸进一步转化为不饱和脂肪酸(例如，硬脂酸‑18:0转化为油酸‑18:1和亚油酸‑18.2)。 [0419] 图11显示了使用共培养方法(表1中所述的方法15)形成组织，使用具有增强水平的各种化合物的培养基来调节特定的生化途径。在图中，核黄素(一种维生素和常见的辅助因子)被滴定到细胞培养基中。显示了对脂肪酸浓度的总体影响。 [0420] 图12显示了FA滴定到培养基中以改变特定FA的构成。根据其在常规鸡肉中的普遍性，四种特定脂肪酸，棕榈油酸(C16:1)、棕榈酸(C16∶0)、亚油酸(C18:2)和油酸(C118:1)，被选择通过补充到所述细胞培养基中来实现有针对性的增加。使用共培养方法(表1中所述 的方法14)形成组织，使用图12中描述的具有增强水平的每种脂肪酸的培养基。(10mg/L的 总FA:2.8mg/L C16:0、0.5mg/L C16:1、4.2mg/L C1 8:1和2.5mg/L C18:2；20mg/L的总FA: 5.6mg/L C16:0、1.0mg/L C16:1、8.4mg/L C 18:1和5.0mg/L C18:2)。 [0421] 实施例5：基于细胞的肉制品中宏量营养素的分析 [0422] 检测所述肉组织中的宏量营养素含量，包括水分、蛋白质和脂肪。 [0423] 总水分通过两种方法之一进行检测，即水分‑1或水分‑2。在水分‑1中，采用AOAC方法950.46。简而言之，这种方法使用2g样品，其在铝盘中称重，并在机械对流空气烘箱中于100‑102℃干燥16‑18h。干燥的样品在干燥器中冷却并重新称重；所述水分被报告为样品重量的损失。在水分‑2中，将>100mg的样品添加到预先称重的铝盘中，并在70℃下干燥至少过夜至恒定质量。也可使用其他温度，如50℃。在水分‑1和水分‑2中，样品干燥后的质量损失归结为样品中总水分的百分比。 [0424] 总蛋白通过两种方法之一进行检测，即蛋白质‑1或蛋白质‑2。在蛋白质‑1中，采用了AOAC方法977.14。这种方法是凯氏定氮法，其中样品中的氮在催化剂和加热下于酸中还原为氨。然后用水蒸气蒸馏氨并用酸滴定。6.25的氮素因子用于将氮含量转化为粗蛋白。在蛋白‑2中，使用了改进的Pierce BCA测定法。将100mg样品在1M氢氧化钠中以0.1g/mL的比例在超声作用下消化3h，以溶解样品基质。然后稀释样品消化物，并通过比色Pierce BCA测定法进行检测。使用0.1g/mL消化比例将最终μg/mL值转换为g蛋白质/g湿质量。 [0425] 总脂肪通过两种方法之一进行检测，即脂肪‑1或脂肪‑2。在脂肪‑1中，使用石油醚作为溶剂，通过AOAC方法991.36从样品基质中提取可溶性脂肪。在这种方法中，在套管中称量样品，并插入萃取装置中，该装置通过溶剂回收系统添加溶剂进行萃取。干燥萃取杯，并称重。以类似的方式，脂肪‑2涉及改良的Folch萃取，其中在预先称重的16mL小瓶中称量>250mg样品，并在70℃下干燥过夜；干燥后的质量损失归结于水分。干燥的样品保留在小瓶中，并使用Hydranal LipoSolverCM溶剂(10ml)进行萃取。用聚四氟乙烯(PTFE)内衬瓶盖盖住小瓶，并在室温下以200rpm振荡24h。萃取后，样品通过预先称重的聚四氟乙烯过滤器 (0.2μm孔径)过滤，并在50℃下干燥48h，在化学通风柜中通风。在脂肪‑1和脂肪‑2中，提取后样品的质量损失归结于样品中总脂肪的百分比。 [0426] 实施例6：基于细胞培养的肉制品中的激素分析 [0427] 由第三方分析实验室(Eurofins Central Analytical Laboratories)，使用带有内部参考的LC‑MS/MS方法检测肉样品的激素水平。激素ELISA试剂盒检测结果表明，与基于细胞的鸡肉样品(以贴壁或悬浮培养物方式生长)相比，常规鸡肉样品产生更高的激素浓 度。收集额外的数据以确认这个检测对目标样品基质的有效性。简而言之，使用德国拜发 (R‑biopharm)公司的 17β‑ 雌二醇试剂盒进行17β‑雌二醇检测。在带 有聚四氟乙烯内衬瓶盖的玻璃瓶中，测量出1‑1.5g湿肉样品，并使用带锯齿配件的手持均质器，以1ml缓冲液与1g湿样品质量的比例在67mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)中均质。均质后，加入5ml甲基叔丁基醚(MTBE)，然后振荡30min。离心样品管，收集MTBE上清液层，并对样品进行额外的5ml MTBE提取；将两个MTBE层合并以供后续使用。MTBE溶剂在40℃下蒸发过夜， 1mL 80％的甲醇加入到"干燥"的小瓶中，旋涡混合，然后加入2ml 20mM PBS并旋涡。得到的溶液通过 C18色谱柱，该色谱柱用甲醇预冲洗，并用20mM PBS进行调节。样品级分 通过柱后，用40％甲醇溶液(弃置层)清洗柱子，然后在氮气流下干燥，最终样品为使80％甲醇通过柱并收集的层。样品使用真空浓缩器干燥，然后在分析前重新悬浮在50μL缓冲液中。 该试剂盒根据制造商规范使用，使用校准范围为0至12.8μg/L。平板的吸光度最后使用平板读取器测量，样品值根据得出的校准曲线确定。检测结果以μg/L为单位，并使用初始的样品制备比例(1g样品与1ml提取缓冲液)将其换算为ng/kg。 [0428] 质谱分析方法对目标激素分析物没有适合的检测限(LOD)，无法对基于细胞的肉样品中的水平非常低或不存在的激素产生定量回收。例如，睾酮、孕酮和17β‑雌二醇的LOD值分别为1、1和20μg/kg。在基于细胞的肉样品中，MS色谱图未显示与这些激素对应的任何条带。表15显示了LC‑MS/MS结果汇总。所有激素均返回为没有检测到(ND)或低于检测限。 [0429] 17β‑雌二醇的ELISA结果表明，与常规鸡肉和牛肉样品相比，基于细胞的鸡肉样品产生的浓度较低。使用ELISA试剂盒，基于细胞的肉的17β‑雌二醇水平平均为35ng雌二醇/kg湿质量，而从当地杂货店购买的常规鸡肉为90ng雌二醇/kg湿质量。在后续研究中的阴性对照在30ng/kg雌二醇/kg湿质量范围内，表明基于细胞的肉样品的水平也接近或低于两种检测方法的检测限。表16显示了17β‑雌二醇水平，使用基于ELISA的方法检测常规和基于细胞的鸡肉。 [0430] 表15：基于细胞的肉样品中的激素水平 [0431] [0432] [0433] 表16：17β‑雌二醇水平 [0434] 样品 ng/kg 17β‑雌二醇鸡肉 89 家禽(鸡肉)成纤维细胞/成肌细胞组织4(表1) 34 家禽(鸡肉)成肌细胞2(表1) 36 [0435] 实施例7：基于细胞培养的肉制品中的煮熟质地的分析 [0436] 对所述基于细胞的肉样品进行评估，以确定对人类感知质地有意义的物理特性，包括“煮熟咬合力”和“煮熟硬度”。 [0437] 对在贴壁培养物中生长的细胞产生的肉制品进行了分析，这些细胞经历了强制空气脱水过程，以调节水分含量为65％至85％。脱水发生在低于100°F的温度下，以免“煮熟”，或其他方式使肉制品中的成分变性。 [0438] 所有样品的分析都是由该公司使用配备有5公斤负荷传感器的TA.XTplus质地分析仪进行的。用于分析的样品质量为400mg+/‑40mg，并装在直径为10.4mm、高度为17mm的圆柱形容器中。将煮熟的样品于150°F的温度下放置在它们单独的密封容器内水浴中90min， 并在分析前冷却。 [0440] [0441] [0443] [0444] [0445] 表17显示了基于细胞的肉样品的煮熟质地。图13显示了共培养和成纤维细胞单培养组织的煮熟硬度。 [0446] 表17：煮熟质地 [0447] [0448] 实施例8：基于细胞的肉中的维生素E水平 [0449] 基于细胞的肉具有更高富集的α‑生育酚(维生素E)。表18显示了示例性基于细胞的肉样品中的维生素E的量，与常规肉相比，该样品具有约0.90mg维生素E/100g湿质量的基于细胞的肉(表18)。使用外部实验室、认证实验室，根据UPLC方法AOAC 2001.13确定维生素E。 [0450] 表18：维生素E水平 [0451] 样品 样本数 平均值 标准差基于细胞的肉 3 0.90mg/100g 0.08mg/100g 常规生产的鸡肉 27 0.28mg/100g 0.12mg/100g [0452] 实施例9：保质期的确定 [0453] 方法一：将0.5‑1.5g常规肉或基于细胞的肉等分到干净的新的15mL离心管中。样品全部于‑80℃在试管中冷冻。然后将冷冻样品试管从‑80℃温度下取出，并在室温下放置 0、1、2、7、14和28天。 [0454] 指定天数过后，打开样品试管，使用Butterfields配方进行连续稀释。将连续稀释液接种于琼脂平板(40g/L Miller LB琼脂粉末)—100uL溶液，并用乙醇/火焰消毒过的扩‑1 张器进行涂布。稀释液为10 ，例如1g放入9mL中。为每个样品稀释液准备两个平板—所有平板在37℃下孵育48h，并在0、24和48h拍照。表19显示了结果。 [0455] 表19：室温下的保质期 [0456] 0天 1天 2天 7天 14天 28天 基于细胞的肉 ND ND ND ND ND ND 鸭肉 ND TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC 鸡肉 ND TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC TNTC＝数量太多无法计算 ND＝未检测到 [0457] 方法二：将1.0g常规或体外基于细胞的肉等分到干净的新的15mL离心管中。样品在4℃或25℃(室温)下储存3天。 [0458] 所述3天过后，打开样品试管，使用Butterfields配方进行连续稀释。将连续稀释液接种在用于总微生物数量(TC)或大肠杆菌/大肠菌群数量(EC)的琼脂平板上—如上所 ‑1 述，1ml溶液添加到CompactDry平板中。稀释液为10 ，例如1g放入9mL中。为每个样品稀释液准备三个平板—所有平板在37℃下孵育48h，并在0、24和48h拍照。表20显示了结果。 [0459] 表20：室温下的保质期，3天，EC和TC数量 [0460] [0461] 使用上述提供的方法进行额外的检测，以评估更长时间阶段的保质期。在4℃下经过指定天数后，打开样品式管，使用Butterfields配方进行连续稀释。将连续稀释液接种于琼脂平板，评估总好氧细菌数量。表21显示了结果。 [0462] 表21：4℃下的保质期，0‑148天，总好氧细菌数量(cfu/g) [0463] [0464] 进行额外的检测以评估保质期，特别是确定大肠杆菌和大肠菌群数量，在4℃和23℃下，持续148天。表22‑24显示了结果。表22显示了第148天4℃时大肠杆菌和大肠菌群的数量(cfu/g)。表23和24显示了第0、1、2、3、7、30和148天23℃时的大肠杆菌(表23)和大肠菌群(表24)数量。TMTC是指菌落太多，无法计数。 [0465] 表22：保质期，4℃，第148天，大肠杆菌和大肠菌群数量 [0466] [0467] 表23：保质期，23℃，第0‑148天，大肠杆菌数量 [0468] [0469] [0470] 表24：保质期，23℃，第0‑148天，大肠菌群数量 [0471] [0472] 实施例10：基于细胞的家禽肉中的水分确定 [0473] 水分根据AOAC 950.46检测。表25中显示的结果包括三个使用血清生产的非连续批次的基于细胞的家禽肉，以及三个无血清的非连续批次的基于细胞的家禽肉。当将基于 细胞的家禽肉结果与USDA的农业研究服务中心食品数据中央数据库进行比较时，为常规鸡 肉选择了两个类别：(1)所有USDA鸡肉(无器官)，其中包括来自27个不同的公开样本的数 据，范围包括带皮和无皮的浅色肉、带皮和无皮的深色肉、磨碎的生肉，和用于烘烤或炖煮的其他鸡肉样品，但不包括仅有皮或鸡肉器官的数据；以及(2)美国农业部鸡肉白肉(无 皮)，其中包括4个被指定为浅色肉、纯肉的公开的样品的数据。 [0474] 表25显示了水分数据，被报告为平均值(avg.)和标准差(std.dev.)，用于一式三份的含血清生产批次、一式三份的无血清生产批次，以及来自USDA农业研究局食品数据中 央数据库(包括“所有USDA鸡肉(无器官)”和“USDA鸡白肉(无皮)”)的鸡肉数据。 [0475] 表25.水分分析 [0476] |
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