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活化的肝星状细胞（HSC）的消耗及其用途
申请号	CN202280057249.9	申请日	2022-06-30	公开(公告)号	CN117980328A	公开(公告)日	2024-05-03
申请人	来凯医药科技(上海)有限公司;			发明人	克里斯·向阳·卢; 祥巨·贾斯汀·顾; 张敏华; 张瑞鹏;
摘要	一种包含结合结构域和功能结构域的结合分子，该结合结构域与在活化的肝星状细胞(HSC)上表达的抗原结合，该功能结构域能够增强抗体效应子功能，诸如针对活化的HSC的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。本文还提供了此类结合分子的用途。
权利要求	1.一种结合分子，其包含一个或多个结合结构域和功能结构域，所述一个或多个结合结构域结合在活化的肝星状细胞(HSC)上表达的一种或多种抗原，所述功能结构域能够增强针对活化的HSC的抗体效应子功能，其中任选地所述抗体效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。 2.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述功能结构域是： (i)包含增强ADCC的一个或多个突变的Fc区；或 (ii)活化免疫细胞的结构域，并且其中任选地所述免疫细胞是NK细胞。 3.根据权利要求2所述的结合分子，其中所述功能结构域是包含增强ADCC的一个或多个突变的所述Fc区，并且其中任选地所述Fc区的所述一个或多个突变在根据EU编号的位置 233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、247、248、250、253、254、255、 256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、268、269、270、272、274、276、280、282、283、 285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、303、307、311、312、313、 315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、 340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、 384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、401、413、414、415、416、418、419、421、422、 424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、440、442、444和/或447处。 4.根据权利要求3所述的结合分子，其中所述Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/ I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。 5.根据权利要求2所述的结合分子，其中所述功能结构域是活化所述免疫细胞的结构域，并且其中所述功能结构域促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导。 6.根据权利要求5所述的结合分子，其中所述功能结构域结合和/或调节免疫细胞上的受体，并且其中任选地所述受体选自由以下组成的组：NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 7.根据权利要求5或权利要求6所述的结合分子，其中所述功能结构域结合NKG2D。 8.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述功能结构域衍生自NKG2D配体。 9.根据权利要求8所述的结合分子，其中所述功能结构域是MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体，并且其中任选地所述功能结构域包含SEQ ID NO:90‑93中任一者的氨基酸序列或其片段。 10.根据权利要求5或权利要求6所述的结合分子，其中所述功能结构域结合NKp46。 11.根据权利要求10所述的结合分子，其中所述功能结构域包含与NKp46结合的抗体。 12.根据权利要求11所述的结合分子，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:87所示的 HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 13.根据权利要求12所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。 14.根据权利要求12或权利要求13所述的结合分子，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 15.根据权利要求5所述的结合分子，其中所述功能结构域结合TGFb。 16.根据权利要求15所述的结合分子，其中所述功能结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体，并且其中任选地所述功能结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。 17.根据权利要求5或权利要求6所述的结合分子，其中所述功能结构域结合TIGIT。 18.根据权利要求17所述的结合分子，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:265所示的 HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 19.根据权利要求18所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。 20.根据权利要求18或权利要求19所述的结合分子，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 21.根据权利要求5或权利要求6所述的结合分子，其中所述功能结构域结合PVRIG。 22.根据权利要求21所述的结合分子，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:273所示的 HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 23.根据权利要求22所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。 24.根据权利要求21或权利要求22所述的结合分子，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 25.根据权利要求5至24中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子还包含Fc区，所述Fc区包含增强ADCC的一个或多个突变。 26.根据权利要求25所述的结合分子，其中所述Fc区包含在根据EU编号的位置233、 234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、 258、260、262、263、264、265、266、267、268、268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、 286、288、290、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、 317、318、320、322、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、 342、344、345、347、355、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、 386、388、389、390、391、392、396、398、400、401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、 428、430、433、434、435、436、437、438、439、440、442、444和/或447处的一个或多个突变。 27.根据权利要求26所述的结合分子，其中所述Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/ I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。 28.根据权利要求1至27中任一项所述的结合分子，其中在所述HSC上表达的所述抗原选自由以下组成的组：5HT1B、5HT1F、5HT2A、5‑HT2B、5‑HT7、A2a、A2b、a1b1整联蛋白、a2bi整联蛋白、a5b1整联蛋白、a6b4整联蛋白、a8b1整联蛋白、avb1整联蛋白、avb3整联蛋白、ACVR2A、ACVR2B、AdipoR1、AdipoR2、ADRA1A、ADRA1B、ANTXR1、AT1、AT2、BAMBI、BMPR2、C5aR、CB1、CB2、CCR1、CCR2、CCR5、CCR7、CD105、CD112、CD14、CD146、CD155、CD248、CD36、CD38、CD40、CD44、CD49e、CD62e、CD73、CD95、c‑MET、CNTFR、CXCR3、CXCR4、DDR1、DDR2、EGFR、ETA、ETB、FAP、FGFR2、FN、gp130、GPC3、GPR91、ICAM‑1、IGF‑1R、IGF‑2R、IL‑10R2、IL‑11RA、IL‑17RA、IL‑20R1、IL‑20R2、IL‑22R1、IL‑6R、KCNE4、ITGA8、LRP、MICA、MICB、NCAM、NGFR、NPR‑B、NPR3、OB‑Ra、OB‑Rb、OPRD1、P2X4、P2X7、P2Y6、p75NTR、PAFR、PAR1 PAR2 PAR4、PDGFRA、PDGFRB、PD‑L1、PD‑L2、Ptc、PTH‑1R、RAGE、SIRPA、CD47、SYP、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、TNFR1、TRKB、TRKC、ULBP1、ULPB2、uPAR、VACM‑1、VEGFR‑1和VEGFR‑2。 29.根据权利要求1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是PDGFRb。 30.根据权利要求29所述的结合分子，其中所述结合结构域包含如SEQID NO:67所示的 HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:68所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 31.根据权利要求30所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQID NO:4的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。 32.根据权利要求30或权利要求31所述的结合分子，其中所述结合结构域包含含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。 33.根据权利要求1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是SIRPA。 34.根据权利要求33所述的结合分子，其中所述结合结构域包含 (i)如SEQ ID NO:69所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:70所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3； (ii)如SEQ ID NO:71所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:72所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 (iii)如SEQ ID NO:73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:74所示的 LCDR1、LCDR2和LCDR3。 35.根据权利要求34所述的结合分子，其中： (i)所述HCDR1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列； (ii)所述HCDR1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；或 (iii)所述HCDR1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。 36.根据权利要求34或权利要求35所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： (i)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL； (ii)含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；或 (iii)含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL。 37.根据权利要求1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是FAPα。 38.根据权利要求37所述的结合分子，其中所述结合结构域包含 (i)如SEQ ID NO:75所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 (ii)如SEQ ID NO:77所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:78所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 39.根据权利要求38所述的结合分子，其中： (i)所述HCDR1包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；或 (ii)所述HCDR1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。 40.根据权利要求38或权利要求39所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： (i)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL；或 (ii)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL。 41.根据权利要求1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是PD‑L1。 42.根据权利要求41所述的结合分子，其中所述结合结构域包含如SEQID NO:79所示的 HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:80所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 43.根据权利要求42所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。 44.根据权利要求42或权利要求43所述的结合分子，其中所述结合结构域包含含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL。 45.根据权利要求1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是uPAR。 46.根据权利要求45所述的结合分子，其中所述结合结构域包含如SEQID NO:81所示的 HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:82所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 47.根据权利要求46所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。 48.根据权利要求46或权利要求47所述的结合分子，其中所述结合结构域包含含有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL。 49.根据权利要求1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是IGF‑1R。 50.根据权利要求49所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： (i)如SEQ ID NO:83所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:84所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 (ii)如SEQ ID NO:85所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:86所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 51.根据权利要求50所述的结合分子，其中： (i)所述HCDR1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或 (ii)所述HCDR1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。 52.根据权利要求50或权利要求51所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： (i)含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL；或 (ii)含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL。 53.根据权利要求1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是NKG2D配体，并且其中任选地所述NKG2D配体是MICA、MICB、ULBP1或ULBP2。 54.根据权利要求53所述的结合分子，其中所述结合结构域包含NKG2D胞外结构域或其片段或变体，并且其中任选地所述结合结构域包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列或其片段。 55.根据权利要求1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是ANTXR1。 56.根据权利要求55所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： (i)如SEQ ID NO:225所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:226所示的 LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 (ii)如SEQ ID NO:233所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:234所示的 LCDR1、LCDR2和LCDR3。 57.根据权利要求56所述的结合分子，其中： (i)所述HCDR1包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 232的氨基酸序列；或 (ii)所述HCDR1包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:236的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:237的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:238的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 240的氨基酸序列。 58.根据权利要求56或权利要求57所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： (i)含有SEQ ID NO:225的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:226的氨基酸序列的VL；或 (ii)含有SEQ ID NO:233的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:232的氨基酸序列的VL。 59.根据权利要求1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是CD248。 60.根据权利要求59所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： (i)如SEQ ID NO:241所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:242所示的 LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 (ii)如SEQ ID NO:249所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:250所示的 LCDR1、LCDR2和LCDR3。 61.根据权利要求60所述的结合分子，其中： (i)所述HCDR1包含SEQ ID NO:243的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:244的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:245的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:246的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:247的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 248的氨基酸序列；或 (ii)所述HCDR1包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 256的氨基酸序列。 62.根据权利要求60或权利要求61所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： (i)含有SEQ ID NO:241的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:242的氨基酸序列的VL；或 (ii)含有SEQ ID NO:249的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:250的氨基酸序列的VL。 63.根据权利要求1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是GPC3。 64.根据权利要求63所述的结合分子，其中所述结合结构域包含如SEQID NO:257所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:258所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 65.根据权利要求64所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:259的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:260的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:261的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:262的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:263的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:264的氨基酸序列。 66.根据权利要求64或权利要求65所述的结合分子，其中所述结合结构域包含含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:258的氨基酸序列的VL。 67.根据权利要求1至66中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子是IgG抗体或包含所述IgG抗体的融合蛋白。 68.根据权利要求67所述的结合分子，其中所述抗体是人源化抗体。 69.一种核酸分子，其编码根据权利要求1至68中任一项所述的结合分子或其片段。 70.一种载体，其包含根据权利要求69所述的核酸分子。 71.一种宿主细胞，其用根据权利要求70所述的载体转化。 72.一种组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至68中任一项所述的结合分子、根据权利要求69所述的核酸分子或根据权利要求70所述的载体、以及药学上可接受的赋形剂。 73.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求72所述的组合物。 74.根据权利要求73所述的方法，其中所述疾病或病症与活化的HSC相关。 75.根据权利要求74所述的方法，其中所述疾病或病症是肝纤维化。 76.一种消耗受试者中的活化的HSC的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求72所述的组合物。 77.根据权利要求76所述的方法，其中所述受试者患有与活化的HSC相关的疾病或病症。 78.根据权利要求77所述的方法，其中所述疾病或病症是肝纤维化。
说明书全文	活化的肝星状细胞(HSC)的消耗及其用途 [0001] 相关申请的交叉引用 [0002] 本申请要求于2021年7月2日提交的国际专利申请号PCT/CN2021/104201的优先权权益，该国际专利申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。 [0003] 序列表 [0004] 本申请以引用的方式并入与本申请一起提交的作为标题为“14668‑006‑228_SEQ_LISTING.txt”的文本文件的序列表，其创建于2022年6月27日，并且大小为568,110字节。1.技术领域 [0005] 本文提供了能够与活化的肝星状细胞(HSC)结合的分子、包含该分子的药物组合物及其用途。 2.背景技术 [0006] 活化的肝星状细胞(HSC)是在肝损伤时介导纤维发生的关键类型的细胞。非常需要靶向活化的HSC的治疗方法，以减缓或预防纤维化形成并且改善患有肝纤维化或肝硬化的患者的生活质量。本公开解决了本领域的这一需要和其他需要。 3.发明内容 [0007] 在一个方面，本文提供了一种结合分子，其包含一个或多个结合结构域和功能结构域，该一个或多个结合结构域结合在活化的肝星状细胞(HSC)上表达的一个或多个抗原，该功能结构域能够增强针对活化的HSC的抗体效应子功能。在一些实施方案中，该抗体效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，该功能结构域是包含增强ADCC的一个或多个突变的Fc区。在其他实施方案中，该功能结构域是活化免疫细胞的结构域。在一些实施方案中，该免疫细胞是NK细胞。 [0008] 在一些实施方案中，该功能结构域是包含增强ADCC的一个或多个突变的Fc区。在一些实施方案中，该Fc区的一个或多个突变在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、 238、239、240、241、243、244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、 264、265、266、267、268、268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、 293、294、295、296、297、298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、 325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、 355、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、 391、392、396、398、400、401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、 435、436、437、438、439、440、442、444和/或447处。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0009] 在其他实施方案中，该功能结构域是活化免疫细胞的结构域，并且其中该功能结构域促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导。 [0010] 在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节免疫细胞上的受体。在一些实施方案中，该功能结构域调节活化免疫细胞的受体。在其他实施方案中，该功能结构域调节抑制免疫细胞的受体。在一些实施方案中，该受体选自由以下组成的组：NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、 2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 [0011] 在一些实施方案中，该功能结构域结合NKG2D。在一些实施方案中，该功能结构域衍生自NKG2D配体。在一些实施方案中，该功能结构域是MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体，并且其中任选地该功能结构域包含SEQ ID NO:90‑93中任一者的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该功能结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该功能结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该功能结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该功能结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或其片段。 [0012] 在一些实施方案中，该功能结构域结合NKp46。在一些实施方案中，该功能结构域包含与NKp46结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列， LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0013] 在一些实施方案中，该功能结构域结合TGFb。在一些实施方案中，该功能结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体，并且其中任选地该功能结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。 [0014] 在一些实施方案中，该功能结构域结合TIGIT。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO: 268的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0015] 在一些实施方案中，该功能结构域结合PVRIG。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO: 276的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0016] 在一些实施方案中，除了上文所述的活化免疫细胞的功能结构域之外，结合分子还包含Fc区，该Fc区包含增强ADCC的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc区包含在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、247、248、 250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、268、269、270、272、274、 276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、303、 307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、 335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、361、362、373、375、376、 378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、401、413、414、415、416、 418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、440、442、444和/或447处的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、 L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0017] 在一些实施方案中，在HSC上表达的抗原选自由以下组成的组：5HT1B、5HT1F、5HT2A、5‑HT2B、5‑HT7、A2a、A2b、a1b1整联蛋白、a2bi整联蛋白、a5b1整联蛋白、a6b4整联蛋白、a8b1整联蛋白、avb1整联蛋白、avb3整联蛋白、ACVR2A、ACVR2B、AdipoR1、AdipoR2、ADRA1A、ADRA1B、ANTXR1、AT1、AT2、BAMBI、BMPR2、C5aR、CB1、CB2、CCR1、CCR2、CCR5、CCR7、CD105、CD112、CD14、CD146、CD155、CD248、CD36、CD38、CD40、CD44、CD49e、CD62e、CD73、CD95、c‑MET、CNTFR、CXCR3、CXCR4、DDR1、DDR2、EGFR、ETA、ETB、FAP、FGFR2、FN、gp130、GPC3、GPR91、ICAM‑1、IGF‑1R、IGF‑2R、IL‑10R2、IL‑11RA、IL‑17RA、IL‑20R1、IL‑20R2、IL‑22R1、IL‑6R、KCNE4、ITGA8、LRP、MICA、MICB、NCAM、NGFR、NPR‑B、NPR3、OB‑Ra、OB‑Rb、OPRD1、P2X4、P2X7、P2Y6、p75NTR、PAFR、PAR1、PAR2、PAR4、PDGFRA、PDGFRB、PD‑L1、PD‑L2、Ptc、PTH‑1R、RAGE、SIRPA、CD47、SYP、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、TNFR1、TRKB、TRKC、ULBP1、ULPB2、uPAR、VACM‑1、VEGFR‑1和VEGFR‑2。 [0018] 在一些实施方案中，该抗原是PDGFRb。在一些实施方案中，该结合结构域包含如SEQ ID NO:67所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:68所示的LCDR1、LCDR2和 LCDR3。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，该结合结构域包含含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的VL。 [0019] 在一些实施方案中，该抗原是SIRPA。在一些实施方案中，该结合结构域包含(i)如SEQ ID NO:69所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:70所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；(ii)如SEQ ID NO:71所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:72所示的 LCDR1、LCDR2和LCDR3；或(iii)如SEQ ID NO:73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:74所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，(i)HCDR1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列， LCDR1包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(ii)HCDR1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，HCDR2包含 SEQ ID NO:14的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；或(iii)HCDR1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，该结合结构域包含：(i)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL；(ii)含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 72的氨基酸序列的VL；或(iii)含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74 的氨基酸序列的VL。 [0020] 在一些实施方案中，该抗原是FAPα。在一些实施方案中，该结合结构域包含(i)如SEQ ID NO:75所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或(ii)如SEQ ID NO:77所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:78所示的 LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，(i)HCDR1包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列， HCDR2包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；或(ii)HCDR1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，该结合结构域包含：(i)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL；或(ii)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有 SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL。 [0021] 在一些实施方案中，该抗原是PD‑L1。在一些实施方案中，该结合结构域包含如SEQ ID NO:79所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:80所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，该结合结构域包含含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 80的氨基酸序列的VL。 [0022] 在一些实施方案中，该抗原是uPAR。在一些实施方案中，该结合结构域包含如SEQ ID NO:81所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:82所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在一些实施方案中，该结合结构域包含含有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 82的氨基酸序列的VL。 [0023] 在一些实施方案中，该抗原是IGF‑1R。在一些实施方案中，该结合结构域包含(i)如SEQ ID NO:83所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:84所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或(ii)如SEQ ID NO:85所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:86所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，(i)HCDR1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列， HCDR2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或(ii)HCDR1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在一些实施方案中，该结合结构域包含：(i)含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL；或(ii)含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH和含有 SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL。 [0024] 在一些实施方案中，该抗原是ANTXR1。在一些实施方案中，该结合结构域包含(i)如SEQ ID NO:225所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:226所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或(ii)如SEQ ID NO:233所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:234所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，(i)HCDR1包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列，并且LCDR3包含 SEQ ID NO:232的氨基酸序列；或(ii)HCDR1包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列，HCDR2包含 SEQ ID NO:236的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:237的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:238的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO: 240的氨基酸序列。在一些实施方案中，该结合结构域包含：(i)含有SEQ ID NO:225的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:226的氨基酸序列的VL；或(ii)含有SEQ ID NO:233的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:234的氨基酸序列的VL。 [0025] 在一些实施方案中，该抗原是CD248。在一些实施方案中，该结合结构域包含(i)如SEQ ID NO:241所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:242所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或(ii)如SEQ ID NO:249所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:250所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，(i)HCDR1包含SEQ ID NO:243的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:244的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:245的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:246的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:247的氨基酸序列，并且LCDR3包含 SEQ ID NO:248的氨基酸序列；或(ii)HCDR1包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列，HCDR2包含 SEQ ID NO:252的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO: 256的氨基酸序列。在一些实施方案中，该结合结构域包含：(i)含有SEQ ID NO:241的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:242的氨基酸序列的VL；或(ii)含有SEQ ID NO:249的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:250的氨基酸序列的VL。 [0026] 在一些实施方案中，该抗原是GPC3。在一些实施方案中，该结合结构域包含如SEQ ID NO:257所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:258所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:259的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO: 260的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:261的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:262的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:263的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:264的氨基酸序列。在一些实施方案中，该结合结构域包含含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:258的氨基酸序列的VL。 [0027] 在一些实施方案中，该抗原是NKG2D配体，诸如MICA、MICB、ULBP1或ULBP2。在一些实施方案中，该结合结构域包含NKG2D胞外结构域或其片段或变体，并且其中任选地该结合结构域包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列或其片段。 [0028] 在一些实施方案中，该结合分子是IgG抗体或包含该IgG抗体的融合蛋白。在一些实施方案中，该抗体是人源化抗体。 [0029] 在另一个方面，本文提供了一种编码本文所提供的结合分子或其片段的核酸分子。 [0030] 在另一个方面，本文提供了一种包含本文所提供的核酸分子的载体。 [0031] 在另一个方面，本文提供了一种用本文所提供的载体转化的宿主细胞。 [0032] 在另一个方面，本文提供了一种组合物，其包含治疗有效量的本文所提供的结合分子、核酸分子或载体以及药学上可接受的赋形剂。 [0033] 在又另一个方面，本文提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向该受试者施用本文所提供的组合物。在一些实施方案中，该疾病或病症与活化的HSC相关。在一些实施方案中，该疾病或病症是肝纤维化。 [0034] 在又另一个方面，本文提供了一种消耗受试者中的活化的HSC的方法，其包括向该受试者施用本文所提供的组合物。在一些实施方案中，该受试者患有与活化的HSC相关的疾病或病症。在一些实施方案中，该疾病或病症是肝纤维化。 4.附图说明 [0035] 图1A‑图1J显示了通过ELISA测量的抗体或重组融合蛋白与相应抗原的剂量依赖性结合。(图1A)α‑PDGFRb 1S239D/I332E与人PDGFRb ECD的结合；(图1B)NKG2D‑hIgG1 Fc S239D/I332E与人ULBP1 ECD的结合；(图1C)α‑SIRPA 1S239D/I332E、α‑SIRPA 2S239D/I332E和α‑SIRPA 3S239D/I332E与人SIRPA ECD的结合；(图1D)α‑FAPa 1S239D/I332E与人FAPa ECD的结合；(图1E)α‑uPAR 1S239D/I332E与人uPAR ECD的结合；(图1F)α‑IGF1R 1S239D/I332E和α‑IGF1R 2S239D/I332E与人IGF‑1R ECD的结合；(图1G)α‑PDL1 1S239D/I332E与人PD‑L1 ECD的结合。(图1H)α‑GPC3 1mIgG2a S239D/I332E与人GPC3 ECD的结合。 (图1I)α‑ANTXR1 1mIgG2a S239D/I332E和α‑ANTXR1 2mIgG2a S239D/I332E与人ANTXR1 ECD的结合。(图1J)α‑CD248 1mIgG2a S239D/I332E和α‑CD248 2mIgG2a S239D/I332E与人CD248 ECD的结合。 [0036] 图2A‑图2F显示了抗原在人TGFb1活化的原代人HSC细胞上的表面表达水平。(图2A)10ug/mlα‑PDGFRb 1S239D/I332E、α‑SIRPA 2S239D/I332E和α‑FAPa 2WT FACS结合的平均荧光强度；(图2B)10ug/mlα‑PDGFRb 1S239D/I332E、α‑uPAR 1S239D/I332E、α‑IGF1R 1S239D/I332E和α‑IGF1R 2S239D/I332E FACS结合的平均荧光强度；(图2C)10ug/mlα‑ PDGFRb 1S239D/I332E、α‑PDL1 1S239D/I332E FACS结合的平均荧光强度；(图2D)10ug/ml NKG2D hIgG1 Fc S239D/I332E FACS结合的平均荧光强度。(图2E)10ug/mlα‑GPC3 1mIgG2a S239D/I332E、α‑CD248 1mIgG2aS239D/I332E和α‑CD248 2mIgG2a S239D/I332E FACS结合的平均荧光强度。(图2F)10ug/mlα‑ANTXR1 1mIgG2a S239D/I332E和α‑ANTXR1 2mIgG2aS239D/I332E FACS结合的平均荧光强度。 [0037] 图3A‑图3G显示了测试抗体或蛋白质增加了原代NK细胞或PBMC细胞针对TGFb1活化的原代人HSC细胞的细胞毒性活性。数据表示为平均值±SD(n＝3/组)。(图3A)由α‑ PDGFRb 1S239D/I332E诱导的剂量依赖性细胞毒性(原代NK:HSC细胞＝4:1)；(图3B)由 10ug/ml NKG2D hIgG1Fc S239D/I332E和10ug/mlα‑PDGFRb 1S239D/I332E诱导的细胞毒性(原代NK:HSC细胞＝4:1)；(图3C)由α‑SIRPA 1S239D/I332E、α‑SIRPA 2S239D/I332E和α‑SIRPA 3S239D/I332E诱导的剂量依赖性细胞毒性(原代NK:HSC细胞＝4:1)；(图3D)由α‑ FAPa 1S239D/I332E诱导的剂量依赖性细胞毒性(原代NK:HSC细胞＝4:1)；(图3E)由α‑uPAR 1S239D/I332E、α‑IGF1R 1S239D/I332E和α‑IGF1R 2S239D/I332E诱导的剂量依赖性细胞毒性(原代PBMC:HSC细胞＝50:1)。将10ug/mlα‑PDGFRb 1S239D/I332E用作测定的阳性对照； (图3F)由α‑PD‑L1 1S239D/I332E诱导的剂量依赖性细胞毒性(原代NK:HSC细胞＝4:1)。将 10ug/mlα‑PDGFRb 1S239D/I332E用作测定的阳性对照。(图3G)测试抗体增加了原代人PBMC细胞针对TGFb1活化的原代人HSC细胞的细胞毒性活性(原代PBMC:HSC细胞＝25:1)。将α‑ SIRPA 2mIgG2a S239D/I332E用作阳性对照。将小鼠IgG2a同种型对照用作阴性对照。数据表示为平均值±SD(n＝2/组)。 [0038] 图4A‑图4C显示了Fc区的效应子功能对于抗体或蛋白质发挥针对TGFb1活化的人原代HSC细胞的ADCC细胞毒性是关键的。数据表示为平均值±SD(n＝2‑3/组)。(图4A)由具有不同Fc突变的α‑SIRPA 2诱导的剂量依赖性细胞毒性(原代PBMC:HSC细胞＝50:1)。效应子功能增强突变(S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L、 F243L/R292P/Y300L)增加了ADCC细胞毒性，而效应子功能沉默突变(L234A/L235A)消除了 ADCC细胞毒性。WT：野生型；(图4B)由具有不同Fc突变的α‑PDGFRb 1诱导的剂量依赖性细胞毒性(原代NK:HSC细胞＝4:1)。在NK/HSC共培养物中，具有S239D/I332E突变的抗体剂量依赖性地诱导针对原代HSC细胞的细胞毒性。N297S突变完全消除了ADCC效应。(图4C)10ug/ml NKG2D hIgG1 Fc S239D/I332E诱导的细胞毒性大于10ug/ml NKG2D hIgG1 Fc L234A/ L235A诱导的细胞毒性(原代PBMC:HSC细胞＝30:1)。 [0039] 图5显示了在CCL4治疗的C57BL/6J小鼠中在单剂量的1B3‑TRII之后肝中总PDGFRb水平的降低依赖于Fc效应子功能。将肝裂解物的100ug总蛋白质加载到凝胶上。使用抗 PDGFRb抗体(abcam Ab32570)印迹总PDGFRb。将α‑微管蛋白作为上样对照印迹(Beyotime，AF0001)。1B3‑TRII S239D/I332E处理降低了总PDGFRb蛋白水平，而1B3‑TRII L234A/L235A处理没有。1B3‑TRII：具有与重链C末端连接的人TGFb受体II ECD的抗小鼠PDGFRb抗体1B3； [0040] 图6显示了在CCL4治疗的C57BL/6J小鼠中在单剂量的1B3‑TRII S239D/I332E或1B3‑TRII L234A/L235A之后肝中可比较的抗体浓度。通过ELISA确定抗体浓度。数据表示为平均值±SD(n＝3/组)。1B3‑TRII：具有与重链C末端连接的人TGFb受体II ECD的抗小鼠 PDGFRb抗体1B3； [0041] 图7显示了在CCL4治疗的C57BL/6J小鼠中在多剂量的1B3‑TRII S239D/I332E和1B3‑TRII L234A/L235A之后血清中可比较的抗体浓度。在给药开始之后第9天和第27天测量血清抗体浓度。通过直接ELISA确定抗体浓度。数据表示为平均值±SD(n＝8‑10/组)。 [0042] 图8A‑图8C显示了与α‑PDGFRb 1S239D/I332E或NKG2D hIgG1 Fc S239D/I332E相比，双特异性抗体α‑PDGFRb 1‑NKG2D KIH S239D/I332E进一步增加了针对TGFb1活化的HSC细胞的细胞毒性。(图8A)通过ELISA所测量的，α‑PDGFRb 1S239D/I332E和α‑PDGFRb 1‑NKG2D KIH S239D/I332E剂量依赖性地结合人PDGFRb ECD；(图8B)通过ELISA所测量的， NKG2D hIgG1 Fc S239D/I332E和α‑PDGFRb 1‑NKG2D KIH S239D/I332E剂量依赖性地结合人MICA ECD。(图8C)通过α‑PDGFRb 1S239D/I332E、NKG2D hIgG1 Fc S239D/I332E或α‑PDGFRb 1‑NKG2D KIH S239D/I332E处理以剂量依赖性方式诱导的细胞毒性(原代PBMC: aHSC细胞＝25:1)。与α‑PDGFRb 1S239D/I332E或NKG2D hIgG1 Fc S239D/I332E相比，α‑PDGFRb 1‑NKG2D KIH S239D/I332E诱导更大的最大细胞毒性。数据表示为平均值±SD(n＝ 2/组)。 [0043] 图9显示了ULBP2与α‑PDGFRb 1重链的N末端的融合增加了原代PBMC细胞针对TGFb1活化的人原代HSC细胞的细胞毒性活性。用10ug/ml ULBP2‑HCα‑PDGFRb 1L234A/ L235A或α‑PDGFRb 1L234A/L235A处理原代PBMC和活化的HSC细胞的共培养物(原代PBMC: HSC细胞＝30:1)。将hIgG1同种型对照用作阴性对照。使用LDH释放确定对HSC细胞的细胞毒性。数据表示为平均值±SD(n＝3/组)。使用单因素ANOVA分析数据，随后与α‑PDGFRb 1L234A/L235A组进行多重比较(p<0.05)。 [0044] 图10显示了α‑NKp46 1与α‑PDGFRb 1的融合进一步增加了原代NK细胞针对TGFb1活化的HSC细胞的细胞毒性活性。用各种浓度的α‑PDGFRb1‑α‑NKp46 1S239D/I332E、α‑PDGFRb 1‑α‑NKp46 1N297S、α‑PDGFRb 1‑NA S239D/I332E、α‑PDGFRb 1‑NA N297S处理原代NK和活化的HSC细胞的共培养物(原代NK:HSC细胞＝4:1)。使用LDH释放确定对HSC细胞的细胞毒性。数据表示为平均值±SD(n＝2/组)。 [0045] 图11A‑图11D显示了α‑TIGIT1 IgG1进一步增强原代NK细胞针对TGFb1活化的HSC细胞的α‑PDGFRb 1S239D/I332E诱导的ADCC细胞毒性。(图11A)抗CD155‑BV421(Biolegend， 337631)和同种型对照BV421(BD Biosciences，562438)与用或不用2ng/ml TGFb1处理的 HSC细胞的FACS结合的平均荧光强度。(图11B)抗CD112‑APC(Biolegend，337412)和同种型对照APC(BD pharmingen，555751)与用或不用2ng/ml TGFb1处理的HSC细胞的FACS结合的平均荧光强度。(图11C)与人IgG4同种型对照相比，通过3ug/mlα‑TIGIT IgG1或α‑PVRIG IgG4处理诱导的针对活化的HSC的细胞毒性(原代NK:HSC细胞＝8:1)。(图11D)3ug/mlα‑ TIGIT IgG1进一步增加了由α‑PDGFRb 1S239D/I332E诱导的针对活化的HSC细胞的细胞毒性(原代PBMC:HSC细胞＝25:1)。数据表示为平均值±SD(n＝2/组)。 [0046] 图12A‑12C显示了通过TGFb受体II ECD(TRII)阻断TGFb信号传导增强了抗PDGFRb抗体诱导的针对活化的HSC细胞的细胞毒性。(图12A)α‑PDGFRb 1TRII S239D/I332E与单独的α‑PDGFRb 1S239D/I332E相比具有相似的ADCC效应。用各种浓度的α‑PDGFRb 1TRII S239D/I332E或α‑PDGFRb 1S239D/I332E处理原代NK和活化的HSC细胞的共培养物(原代NK: HSC细胞＝4:1)。使用LDH释放确定对HSC细胞的细胞毒性。数据表示为平均值±SD(n＝2/ 组)。(图12B)在CCL4治疗的C57BL/6J小鼠中在多剂量的1B3‑TRII S239D/I332E、1B3 S239D/I332E或1B3 WT之后的血清抗体浓度。通过直接ELISA确定抗体浓度。数据表示为平均值±SD(n＝8‑10/组)。(图12C)1B3 TRII S239D/I332E处理导致比1B3 S239D/I332E处理更多的肝总PDGFRb蛋白减少。通过夹心ELISA确定肝总PDGFRb蛋白水平。数据表示为平均值±SD(n＝5‑10/组)。使用单因素ANOVA分析数据，随后与同种型对照组进行多重比较(p< 0.05；*p<0.001；*p<0.0001)。通过非配对t检验分析1B3‑TRII SI组和1B3‑SI组的数据(p<0.05)。1B3：抗小鼠PDGFRb抗体；1B3‑TRII：具有与重链C末端连接的人TRII的抗小鼠PDGFRb抗体1B3；ISO‑TRII：具有与重链C末端连接的人TRII的同种型对照抗体 [0047] 图13A‑图13F显示了1B3 S239D/I332E的单剂量治疗降低了CCL4病变的C57BL/6J小鼠中的HSC标记表达。(图13A)在单剂量的1B3S239D/I332E治疗之后，肝PDGFRb蛋白水平降低。(图13B)在单剂量的1B3 S239D/I332E治疗之后，肝aSMA蛋白水平降低。(图13C)在单剂量的1B3 S239D/I332E治疗之后4小时，肝aSMA mRNA水平降低。(图13D)在单剂量的1B3 S239D/I332E治疗之后，肝GFAP mRNA水平没有显著变化。(图13E)在单剂量的1B3 S239D/ I332E治疗之后4小时，肝结蛋白mRNA水平降低。(图13F)在单剂量的1B3 S239D/I332E治疗之后，肝LRAT mRNA水平没有显著变化。数据表示为平均值±SD(n＝3/组)。使用双因素 ANOVA分析数据，随后与PBS组进行多重比较(p<0.05，p<0.01，p<0.001，*p< 0.0001)。 [0048] 图14A‑图14F显示了1B3 S239D/I332E的单剂量治疗增加了CCL4病变的C57BL/6J小鼠中的NK/免疫细胞活化标记表达，其与肝中的凋亡细胞水平相关(图14A)。在单剂量的 1B3 S239D/I332E治疗之后48小时，肝NKG2D mRNA水平增加。(图14B)在单剂量的1B3 S239D/I332E治疗之后48小时，肝NKp46 mRNA水平增加。(图14C)在单剂量的1B3 S239D/ I332E治疗之后48小时，肝粒酶B mRNA水平增加。(图14D)在单剂量的1B3S239D/I332E治疗之后，肝粒酶B强阳性细胞％增加。(图14E)肝中切割的胱天蛋白酶3阳性细胞％在单剂量的 1B3 S239D/I332E治疗之后4小时减少且之后48小时增加。数据表示为平均值±SD(n＝3/ 组)。使用双因素ANOVA分析数据，随后与PBS组进行多重比较(p<0.05，p<0.01，p< 0.001，**p<0.0001)。(图14F)在1B3 S239D/I332E治疗之后在肝中裂解的胱天蛋白酶3强阳性细胞％与肝中肝粒酶B阳性细胞％之间的相关性显著。使用线性回归生成数据(p＝ 0.0016)。 [0049] 图15A‑图15B显示了在CCL4病变的小鼠中通过1B3‑TRII S239D/I332E和1B3‑S239D/I332E治疗降低了如通过天狼星红(Sirius Red)染色所测量的肝纤维化。(图15A)用天狼星红对肝切片染色。通过软件HALO定量天狼星红染色阳性区域的百分比。数据表示为平均值±SD(n＝5‑10/组)。使用单因素ANOVA分析数据，随后与同种型对照组进行多重比较(p<0.05；p<0.01)。1B3：抗小鼠PDGFRb抗体；1B3‑TRII：具有与重链C末端连接的人TRII的抗小鼠PDGFRb抗体1B3；ISO‑TRII：具有与重链C末端连接的人TRII的同种型对照抗体。 (图15B)在总PDGFRb蛋白水平(通过ELISA确定的OD450)与天狼星红染色阳性区域的百分比之间的正相关性。使用线性回归生成数据(p<0.0001)。 [0050] 图16A‑图16B显示了与CDAA饮食处理的C57BL/6J小鼠中的1B3S239D/I332E相比，在多剂量的1B3 WT之后在血清中的抗体浓度更高。在给药开始之后第23天(图16A)和第42 天(图16B)测量血清抗体浓度。通过直接ELISA确定抗体浓度。数据表示为平均值±SD(n＝ 8/组)。 [0051] 图17A‑图17E显示了在C57BL/6J小鼠中1B3 WT和1B3 S239D/I332E的治疗降低了肝总PDGFRb水平(图17A)、CDAA饮食诱导的ALT增加(图17B)、AST增加(图17C)和肝中的脂滴增加％(图17D)。仅1B3S239D/I332E治疗降低了CDAA饮食诱导的肝纤维化，其被测量为肝中的天狼星红阳性面积％(图17E)。数据表示为平均值±SD(n＝8/组)。使用单因素ANOVA分析数据，随后与PBS组进行多重比较(p<0.01，***p<0.001)。 5.具体实施方式 [0052] 本公开部分地基于以下令人惊讶的发现：用具有ADCC增强特性的部分工程化的抗体表现出用于治疗活化HSC相关的疾病或病症(诸如肝纤维化)的优异效果。 [0053] 5.1.定义 [0054] 本文所描述或所引用的技术和程序包括本领域技术人员通常很好理解和/或使用常规方法学通常采用的那些技术和程序，诸如，例如在以下文献中所描述的广泛利用的方法：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版，2001)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编辑2009)；Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Albitar编辑2010)；以及Antibody Engineering第1卷和第2卷(Kontermann和D übel编辑，第2版，2010)。除非本文另有定义，否则在本说明书中所使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。出于解释本说明书的目的，术语的以下描述将适用，并且无论何时适当，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。在所阐述的术语的任何描述与以引用的方式并入本文的任何文献冲突的情况下，应以下文所阐述的术语的描述为准。 [0055] 术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可互换使用，并且以最广泛的含义使用，并且具体地涵盖例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性即可)、单链抗体以及它们的片段(例如，结构域抗体)，如下文所述。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的和/或亲和成熟的，以及来自其他物种(例如，小鼠、兔、美洲驼等)的抗体。术语“抗体”旨在包括免疫球蛋白类别的多肽内的B细胞多肽产物，其能够结合特异性分子抗原并且由两对相同的多肽链构成，其中每对具有一条重链(约50kDa‑70kDa)和一条轻链(约 25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100个至约130个或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如Antibody Engineering(Borrebaeck 编辑，第2版，1995)；以及Kuby,Immunology(第3版，1997)。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、包括来自骆驼科(Camelidae)物种(例如，美洲驼或羊驼)的抗体或它们的人源化变体、胞内抗体、抗独特型(抗Id)抗体、以及上文所述的任一种抗体的功能片段(例如，抗原结合片段)，该功能部分是指保留了该片段所来源的抗体的一些或全部结合活性的、抗体重链或轻链多肽的一部分。功能片段(例如，抗原结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。特别地，本文所提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，含有结合抗原的抗原结合位点的抗原结合结构域或分子(例如，抗体的一个或多个CDR)。此类抗体片段可见于例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference(Myers编辑，1995)；Huston等人, 1993,Cell Biophysics 22:189‑224；Plückthun和Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497‑ 515；以及Day,Advanced Immunochemistry(第2版，1990)。本文所提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。抗体可以既不是激动性的也不是拮抗性的。 [0056] “抗原”是抗体可以选择性地结合的结构。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原是多肽。在某些实施方案中，抗原与细胞相关，例如存在于细胞上或细胞中。 [0057] “完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以包括人恒定区或其氨基酸序列变体。在某些实施方案中，完整抗体具有一种或多种效应子功能。 [0058] 术语“结合(binds)”或“结合(binding)”是指分子之间的相互作用，包括例如以形成复合物。相互作用可以是例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。复合物还可以包括通过共价或非共价键、相互作用或力保持在一起的两个或更多个分子的结合。在抗体上的单一抗原结合位点与靶分子(诸如抗原)的单一表位之间的总非共价相互作用的强度是抗体或功能片段对该表位的亲和力。结合分子(例如，抗体) 对单价抗原的解离速率(koff)与缔合速率(kon)的比率(koff/kon)是解离常数KD，其与亲和力负相关。KD值越低，抗体的亲和力越高。KD的值对于不同的抗体和抗原复合物而变化，并且取决于kon和koff两者。本文所提供的抗体的解离常数KD可以使用本文所提供的任何方法或本领域技术人员熟知的任何其他方法来确定。在一个结合位点处的亲和力并不总是反映抗体与抗原之间的相互作用的真实强度。当含有多个重复抗原决定簇(诸如多价抗原)的复合物抗原与含有多个结合位点的抗体接触时，抗体与抗原在一个位点处的相互作用将增加在第二个位点处反应的可能性。在多价抗体与抗原之间的此类多重相互作用的强度被称为亲合力。 [0059] 关于本文所述的结合分子，术语诸如“与……结合”、“与……特异性地结合”和类似术语在本文中也可互换使用，并且是指与抗原(诸如多肽)特异性地结合的结合分子或抗原结合结构域。与抗原结合或特异性地结合的结合分子或抗原结合结构域可以例如通过免疫测定、或本领域技术人员已知的其他技术来鉴定。在一些实施方案中，当结合分子或抗原结合结构域以比结合任何交叉反应性抗原更高的亲和力结合抗原时，该结合分子或抗原结合结构域结合或特异性地结合抗原，如使用实验技术诸如放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)所确定。典型地，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且可以是背景的超过10倍。关于结合特异性的讨论，参见例如 Fundamental Immunology 332‑36(Paul编辑，第2版，1989)。在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域与“非靶”蛋白质的结合的程度为结合分子或抗原结合结构域与其特定靶抗原的结合的小于约10％，例如，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析或RIA所确定。与抗原结合的结合分子或抗原结合结构域包括如下结合分子或抗原结合结构域，其能够以足够的亲和力结合抗原使得该结合分子可用作例如靶向抗原的治疗剂和/或诊断剂。在某些实施方案中，与抗原结合的结合分子或抗原结合结构域具有小于或等于1μM、800nM、600nM、 550nM、500nM、300nM、250nM、100nM、50nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、 0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM的解离常数(KD)。在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域结合在来自不同物种的抗原中保守的抗原的表位。 [0060] 在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可以包含“嵌合”序列，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一种物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的对应序列以及此类抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性即可(参见美国专利号4,816,567；以及Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851‑55)。嵌合序列可以包括人源化序列。 [0061] 在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可以包含非人(例如，骆驼科动物、鼠科动物、非人灵长类动物)抗体的“人源化”形式的部分，该“人源化”形式包括来自人免疫球蛋白(例如，接受者抗体)的序列，其中天然CDR残基被来自非人物种(例如，供体抗体)(诸如骆驼科动物、小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的对应CDR的具有所需的特异性、亲和力和能力的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白序列的一个或多个FR区残基被对应的非人残基置换。此外，人源化抗体可以包含在接受者抗体中或在供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体性能。人源化抗体重链或轻链可以包含至少一个或多个可变区的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR对应于非人免疫球蛋白的那些CDR，并且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地人免疫球蛋白的恒定区。对于进一步的细节，参见Jones等人,Nature 321:522‑25(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323‑29 (1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593‑96(1992)；Carter等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285‑89(1992)；美国专利号：6,800,738；6,719,971；6,639, 055；6,407,213；和6,054,297。 [0062] 在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可以包含“全人抗体”或“人抗体”的部分，其中该术语在本文中可互换使用并且是指包含人可变区和例如人恒定区的抗体。结合分子可以包含抗体序列。在具体实施方案中，该术语是指包含人来源的可变区和恒定区的抗体。在某些实施方案中，“完全人”抗体还可以涵盖结合多肽并且由核酸序列编码的抗体，该核酸序列是人种系免疫球蛋白核酸序列的天然存在的体细胞变体。术语“全人抗体”包括具有与人种系免疫球蛋白序列对应的可变区和恒定区的抗体，该人种系免疫球蛋白序列如Kabat等人所述(参见Kabat等人(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH 出版号91‑3242)。“人抗体”是具有与由人产生的抗体的氨基酸序列对应和/或已经使用用于产生人抗体的任何技术产生的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术生产人抗体，该技术包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks等人, J.Mol.Biol.222:581(1991))和酵母展示文库(Chao等人,Nature Protocols 1:755‑68 (2006))。还可用于制备人单克隆抗体的方法描述于Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77(1985)；Boerner等人,J.Immunol.147(1):86‑95(1991)；以及van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368‑74(2001)中。可以通过将抗原施用于转基因动物来制备人抗体，该转基因动物已经被修饰以响应于抗原激发而产生此类抗体但 TM 其内源基因座已被禁用，例如，小鼠(关于XENOMOUSE 技术，参见例如，Jakobovits, Curr.Opin.Biotechnol.6(5):561‑66(1995)；Brüggemann和Taussing, Curr.Opin.Biotechnol.8(4):455‑58(1997)；以及美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还参见例如，Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557‑62(2006)。 [0063] 在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可以包含“重组人抗体”的部分，其中该短语包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的人抗体，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合人抗体文库分离的抗体、从对于人免疫球蛋白基因为转基因和/或转染色体的动物(例如，小鼠或牛)分离的抗体(参见例如，Taylor, L.D.等人,Nucl.Acids Res.20:6287‑6295(1992))或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体可以具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见Kabat,E.A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版号91‑3242)。然而，在某些实施方案中，对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用对于人Ig序列而言为转基因的动物时，体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列，该序列虽然来源于人种系VH和VL序列并且与之相关，但是可能在体内不天然地存在于人抗体种系库内。 [0064] 在某些实施方案中，结合分子或抗原结合结构域可以包含“单克隆抗体”的一部分，其中如本文所用的术语是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，例如，构成该群体的单独抗体是相同的，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变或熟知的翻译后修饰，诸如氨基酸异构化或脱酰胺、甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺，每种单克隆抗体典型地将识别抗原上的单一表位。在具体实施方案中，如本文所用的“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其他细胞产生的抗体。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何特定方法。例如，可用于本公开的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人,Nature 256:495(1975)所描述的杂交瘤方法学制备，或者可以在细菌细胞或真核动物细胞或真核植物细胞中使用重组 DNA方法制备(参见例如，美国专利号4,816,567)。例如，“单克隆抗体”还可以使用如下技术从噬菌体抗体文库中分离，该技术描述于Clackson等人,Nature 352:624‑28(1991)以及 Marks等人,J.Mol.Biol.222:581‑97(1991)。用于制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法是本领域熟知的。参见例如，Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人编辑，第5版，2002)。 [0065] 典型的4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的异四聚体糖蛋白。在IgG的情况下，该4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链取决于H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H链和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N末端具有可变结构域(VH)，随后是每条α链和γ链的三个恒定结构域(CH)以及μ同种型和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N末端具有可变结构域(VL)，随后在其另一端具有恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链可变结构域与重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别的抗体的结构和特性，参见例如Basic and Clinical Immunology 71(Stites等人编辑，第8版，1994)；以及 Immunobiology(Janeway等人编辑，第5版，2001)。 [0066] 术语“Fab”或“Fab区”是指与抗原结合的抗体区域。常规IgG通常包含两个Fab区，每个Fab区位于Y形IgG结构的两条臂中的一条臂上。每个Fab区典型地由每条重链和轻链的一个可变区和一个恒定区构成。更具体地，在Fab区中重链的可变区和恒定区是VH区和CH1 区，并且在Fab区中轻链的可变区和恒定区是VL区和CL区。在Fab区中的VH、CH1、VL和CL可以以各种方式排列以赋予根据本公开的抗原结合能力。例如，VH区和CH1区可以在一个多肽上，并且VL区和CL区可以在分开的多肽上，类似于常规IgG的Fab区。可替代地，VH区、CH1区、VL区和CL区可以全部在同一多肽上并且以不同的顺序定向，如在下文部分中更详细描述的。 [0067] 术语“可变区”、“可变结构域”、“V区”或“V结构域”是指抗体的轻链或重链的一部分，其通常位于轻链或重链的氨基末端并且在重链中具有约120个至130个氨基酸的长度和在轻链中具有约100个至110个氨基酸的长度，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。重链的可变区可以被称为“VH”。轻链的可变区可以被称为“VL”。术语“可变的”是指可变区的某些区段在抗体之间的序列上广泛不同的事实。V区介导抗原结合并且定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变区的110个氨基酸跨度上不是均匀分布的。相反，V区由约15个至30个氨基酸的被称为框架区(FR)的较少可变(例如，相对不变的)延伸段组成，这些延伸段被各自为约9个至12个氨基酸长的称为“高变区”的具有较大可变性(例如，极端可变性)的较短区域分开。重链和轻链的可变区各自包含四个FR，主要采用β折叠构型，通过三个高变区连接，该高变区形成连接β折叠结构的环并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见例如，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版，1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。可变区在不同抗体之间的序列上广泛不同。在具体实施方案中，可变区是人可变区。 [0068] 术语“根据Kabat的可变区残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变型是指在Kabat等人，见上文中用于抗体汇编的重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用此编号系统，实际线性氨基酸序列可以含有较少或另加的与可变结构域的FR或CDR的缩短或插入可变结构域的FR或CDR对应的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包括在残基52之后的单个氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在残基82之后三个插入的残基(例如，根据 Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定抗体，残基的Kabat编号可以通过在该抗体的序列的同源性区域与“标准”Kabat编号的序列对齐来确定。当提及可变结构域中的残基时通常使用Kabat编号系统(大约轻链的残基1‑107和重链的残基1‑113)(例如，Kabat等人，见上文)。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU指数”(例如，在Kabat等人，见上文中报道的EU指数)。“如Kabat中的EU指数”是指人IgG 1EU抗体的残基编号。其他编号系统已有描述，例如AbM、Chothia、Contact、IMGT和AHon。 [0069] 当用于指抗体时，术语“重链”是指约50kDa‑70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约120个至130个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基末端部分包括恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是被称为阿尔法(α)、德尔塔(δ)、伊普西隆(ε)、伽马(γ)和缪(μ)的五种不同类型(例如，同种型)中的一种。不同的重链大小不同：α、δ和γ含有大约 450个氨基酸，而μ和ε含有大约550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同类型的重链分别产生五个熟知的类别(例如，同种型)的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括四个IgG亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。 [0070] 当用于指抗体时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约100个至约110个或更多个氨基酸的可变区，并且羧基末端部分包括恒定区。轻链的大致长度为211个至217个氨基酸。存在两种不同的类型，基于恒定结构域的氨基酸序列称为卡帕 (κ)或兰布达(λ)。 [0071] 如本文所用，术语“高变区”、“HVR”、“互补决定区”和“CDR”可互换使用。“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ折叠框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一、或者抗体VLβ折叠框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。VH结构域中的CDR1、CDR2和CDR3也分别被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。VL结构域中的CDR1、CDR2和CDR3也分别被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。因此，CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。 [0072] CDR区是本领域技术人员熟知的，并且已通过熟知的编号系统定义。例如，Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性并且是最常用的(参见例如，Kabat等人，见上文；Nick Deschacht等人,J Immunol 2010；184:5696‑5704)。Chothia反而是指结构环的位置(参见例如，Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901‑17(1987))。当使用Kabat编号规则编号时， Chothia CDR‑H1环的末端在H32与H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果仅存在35A，则环在33处结束；如果35A和35B两者都存在，则环在34处结束)。AbM高变区代表了Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用(参见例如，Antibody Engineering第2卷(Kontermann和Dübel编辑，第2版，2010))。“contact”高变区基于对可用复杂晶体结构的分析。已经开发并广泛采用的另一种通用编号系统是 ImMunoGeneTics(IMGT) (Lafranc等人,Dev.Comp.Immunol.27(1):55‑77 (2003))。IMGT是在人和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHC)中专用的整合信息系统。在本文中，CDR是指按照氨基酸序列和在轻链或重链内的位置两者。由于CDR在免疫球蛋白可变结构域的结构内的“位置”在物种之间是保守的并且存在于称为环的结构中，通过使用根据结构特征对齐可变结构域序列的编号系统，容易地鉴定CDR和框架残基。该信息可以用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移植和置换到典型地来自人抗体的接受者框架中。另外的编号系统(AHon)已经由Honegger和Pl ückthun,J.Mol.Biol.309:657‑70(2001)开发。在编号系统(包括例如Kabat编号和IMGT独特编号系统)之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(参见例如，Kabat，见上文；Chothia和Lesk，见上文；Martin，见上文；Lefranc等人，见上文)。来自这些高变区或CDR中的每一个的残基在下文举例说明。 [0073] 根据各种编号系统的示例性CDR [0074] [0075] 取决于用于鉴定的方案，给定CDR的边界可以变化。因此，除非另有说明，否则术语给定抗体或其区域(诸如可变区)的“CDR”和“互补决定区”以及抗体或其区域的单个CDR(例如，CDR‑H1、CDR‑H2)应理解为涵盖如上文通过本文所述的任何已知方案所定义的互补决定区。在一些情况下，说明了用于鉴定一个特定CDR或多个CDR(诸如由IMGT、Kabat、Chothia或Contact方法所定义的CDR)的方案。在其他情况下，给出了CDR的特定氨基酸序列。应当注意，CDR区还可以通过各种编号系统的组合(例如，Kabat和Chothia编号系统的组合或Kabat和IMGT编号系统的组合来定义。因此，术语诸如“如在特定VH中所示的CDR1”包括如由上文所述的示例性CDR编号系统所定义的任何CDR1，但不限于此。一旦给出可变区(例如，VH或 VL)，本领域技术人员将理解，该区域内的CDR可以通过不同编号系统或其组合来定义。 [0076] 高变区可以包含如下“延伸的高变区”：VL中的24‑36或24‑34(L1)、46‑56或50‑56(L2)和89‑97或89‑96(L3)，以及VH中的26‑35或26‑35A(H1)、50‑65或49‑65(H2)和93‑102、94‑102或95‑102(H3)。 [0077] 术语“恒定区”或“恒定结构域”是指轻链和重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用。该术语是指相对于含有抗原结合位点的免疫球蛋白的其他部分(即可变区)，具有更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子的部分。恒定区可以含有重链的CH1、CH2和CH3区以及轻链的CL区。 [0078] 术语“框架”或“FR”是指在CDR侧翼的那些可变区残基。FR残基存在于例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、结构域抗体、双抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是除高变区残基或CDR残基以外的那些可变结构域残基。 [0079] 术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226或从Pro230的氨基酸残基延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以被去除，例如，在抗体的生产或纯化期间或者通过重组工程化编码抗体重链的核酸。因此，完整抗体的组合物可以包含去除了所有K447残基的抗体群体、没有去除K447残基的抗体群体以及具有含有和不含有K447残基的抗体混合物的抗体群体。功能性Fc区具有天然序列Fc区的效应子功能。示例性“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合区或结合结构域(例如，抗体可变区或结构域)组合并且可以使用本领域技术人员已知的各种测定来评估。“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰(例如，取代、添加或缺失)而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体Fc区与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如，在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中的约一个至约十个氨基酸取代、或约一个至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区可以与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约 80％的同源性，或者与其具有至少约90％的同源性，例如与其具有至少约95％的同源性。 [0080] 如本文所用，“表位”是本领域中的术语，并且是指结合分子(例如，抗体)可以特异性地结合的抗原的局部区域。表位可以是线性表位或者构象性、非线性或不连续表位。在多肽抗原的情况下，例如，表位可以是多肽的连续氨基酸(“线性”表位)，或者表位可以包含来自多肽的两个或更多个非连续区域的氨基酸(“构象性”、“非线性”或“不连续”表位)。本领域技术人员应当理解，一般来讲，线性表位可以依赖或可以不依赖于二级、三级或四级结构。例如，在一些实施方案中，结合分子结合一组氨基酸，而不管它们是否以天然三维蛋白质结构折叠。在其他实施方案中，结合分子需要构成表位的氨基酸残基表现出特定构象(例如，弯曲、扭转、翻转或折叠)以便识别和结合该表位。 [0081] 关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”被定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对可以以本领域技术内的各种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件(诸如BLAST、BLAST‑2、ALIGN或 TM MEGALIGN (DNASTAR)软件)来实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。 [0082] 术语“特异性”是指抗原结合蛋白对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。如本文所用的术语“多特异性”表示抗原结合蛋白具有两个或更多个抗原结合位点，其中至少两个抗原结合位点结合不同的抗原。如本文所用的“双特异性”表示抗原结合蛋白具有两种不同的抗原结合特异性。如本文所用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗原结合蛋白，每个结合位点结合相同的抗原。 [0083] 如本文所用的术语“价”表示在抗原结合蛋白中存在特定数目的结合位点。例如天然抗体或全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别表示在抗原结合蛋白中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。 [0084] 术语“多肽”和“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链的或支链的，其可以包含经修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物。例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括但不限于非天然氨基酸)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解，因为本公开的多肽可以基于抗体或免疫球蛋白超家族的其他成员，所以在某些实施方案中，“多肽”可以作为单链或作为两个或更多个缔合的链存在。 [0085] “多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸聚合物并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物、或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸以及它们的类似物。如本文所用的“寡核苷酸”是指短的、通常单链的、合成的多核苷酸，其长度通常但不一定为少于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并相互排斥。上文针对多核苷酸的描述同样并完全适用于寡核苷酸。产生本公开的结合分子的细胞可以包括亲本杂交瘤细胞，以及已经引入了编码抗体的核酸的细菌和真核宿主细胞。除非另有说明，否则本文所公开的任何单链多核苷酸序列的左手端是5'端；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5'方向。初生RNA转录物的5'至3'添加的方向被称为转录方向；在DNA链上具有与RNA转录物相同的序列的、对于RNA转录物的5'端位于5'的序列区域被称为“上游序列”；DNA链上具有与RNA转录物相同的序列的、对于RNA转录物的3'端位于3'的序列区域被称为“下游序列”。 [0086] “分离的核酸”是基本上与其他基因组DNA序列以及天然地伴随天然序列的蛋白质或复合物(诸如核糖体和聚合酶)分离的核酸(例如，RNA、DNA或混合的核酸)。“分离的”核酸分子是与该核酸分子的天然来源中存在的其他核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子(诸如cDNA分子)当通过重组技术产生时可以基本上不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时可以基本上不含化学前体或其他化学物质。在具体实施方案中，分离或纯化编码如本文所述的抗体的一种或多种核酸分子。该术语包括已经从其天然存在环境中去除的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物地合成的类似物。基本上纯的分子可以包括该分子的分离形式。具体地，编码本文所述的抗体的“分离的”核酸分子是从在产生其的环境中通常与其缔合的至少一种污染核酸分子中鉴定和分离的核酸分子。 [0087] 除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，其程度使得编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中可以含有内含子。 [0088] 术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适合用于原核生物的控制序列包括启动子、任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。 [0089] 如本文所用，术语“可操作地连接”和类似短语(例如，基因融合的)，当用于指核酸或氨基酸时，分别是指彼此处于功能关系中的核酸序列或氨基酸序列的可操作连接。例如，可操作地连接的启动子、增强子元件、开放阅读框、5'和3'UTR和终止子序列导致核酸分子(例如，RNA)的准确产生。在一些实施方案中，可操作地连接的核酸元件导致开放阅读框的转录并最终导致多肽的产生(即，开放阅读框的表达)。作为另一个实例，可操作地连接的肽是其中功能结构域彼此以适当的距离放置以赋予每个结构域的预期功能的肽。 [0090] 术语“载体”是指用于携带或包括核酸序列(包括例如编码如本文所述的结合分子(例如，抗体)的核酸序列)以便将核酸序列引入宿主细胞中的物质。适用于使用的载体包括例如表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，其可以包括可操作用于稳定整合到宿主细胞染色体中的选择序列或标记。另外，载体可以包括一个或多个选择标记基因和适当的表达控制序列。可以包括的选择标记基因例如提供对抗生素或毒素的抗性，补充营养缺陷型缺陷，或供应不在培养基中的关键营养物。表达控制序列可以包括组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等，它们在本领域中是熟知的。当要共表达两个或更多个核酸分子(例如，抗体重链和轻链两者或抗体VH和VL两者)时，可以将两个核酸分子插入例如单个表达载体中或分开的表达载体中。对于单个载体表达，编码核酸可以被可操作地连接到一个共同的表达控制序列或连接到不同的表达控制序列，诸如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。可以使用本领域熟知的方法确认将核酸分子引入宿主细胞中。此类方法包括例如核酸分析(诸如mRNA的Northern印迹或聚合酶链式反应(PCR)扩增)、基因产物表达的免疫印迹、或测试所引入核酸序列的表达或其对应基因产物的其他合适的分析方法。本领域技术人员应当理解，核酸分子以足以产生所需产物的量表达，并且还应当理解，可以使用本领域熟知的方法优化表达水平以获得足够的表达。 [0091] 如本文所用的术语“宿主”是指动物，诸如哺乳动物(诸如，人)。 [0092] 如本文所用的术语“宿主细胞”是指可以用核酸分子转染的特定受试细胞以及此类细胞的后代或潜在后代。由于可能在后续的世代中或核酸分子整合到宿主细胞基因组中发生的突变或环境影响，这种细胞的后代可能与用核酸分子转染的亲本细胞不同。 [0093] 如本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移到或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代受试细胞及其后代。 [0094] 如本文所用的术语“药学上可接受的”意指被联邦或州政府的管理机构批准，或者在《美国药典》(United States Pharmacopeia)、《欧洲药典》(European Pharmacopeia)或其他普遍认可的药典中列出用于动物以及更具体地用于人。 [0095] “赋形剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包封材料。赋形剂包括例如包封材料或添加剂，诸如吸收促进剂、抗氧化剂、粘合剂、缓冲剂、载剂、包衣剂、着色剂、稀释剂、崩解剂、乳化剂、膨胀剂、填充剂、调味剂、湿润剂、润滑剂、香料、防腐剂、推进剂、释放剂、杀菌剂、甜味剂、增溶剂、润湿剂以及它们的混合物。术语“赋形剂”还可以是指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))或媒介物。 [0096] 在一些实施方案中，赋形剂是药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的实例包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(例如，少于约10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘TM 露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN 、聚乙二醇TM (PEG)和PLURONICS 。药学上可接受的赋形剂的其他实例描述于Remington和Gennaro, Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版，1990)。 [0097] 在一个实施方案中，每种组分在与药物制剂的其他成分相容的意义上是“药学上可接受的”，并且适合用于与人和动物的组织或器官接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。参见例如，Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients，第6版；Rowe等人编辑；制药出版社(the Pharmaceutical Press)和美国制药协会(the American Pharmaceutical Association):2009；Handbook of Pharmaceutical Additives，第3版；Ash和Ash编辑；高尔出版公司(Gower Publishing Company):2007； Pharmaceutical Preformulation and Formulation，第2版；Gibson编辑；CRC出版社有限公司：Boca Raton,FL,2009。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是pH缓冲水溶液。 [0098] 在一些实施方案中，赋形剂是无菌液体，诸如水和油，包括石油来源、动物来源、植物来源或合成来源的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内地施用组合物(例如，药物组合物)时，水是示例性的赋形剂。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体赋形剂，特别是用于可注射溶液。赋形剂还可以包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂等形式。口服组合物(包括制剂)可以包括标准赋形剂，诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。 [0099] 组合物(包括药物化合物)可以含有例如分离或纯化形式的结合分子(例如，抗体)以及合适量的赋形剂。 [0100] 如本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指本文所提供的抗体、或包含药剂和抗体的治疗分子、或药物组合物足以产生所需结果的量。 [0101] 术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文所用，在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如非灵长类动物或灵长类动物(例如，人)。在具体实施方案中，受试者是人。在一个实施方案中，受试者是被诊断患有疾病或病症的哺乳动物(例如，人)。在另一个实施方案中，受试者是处于发展疾病或病症的风险中的哺乳动物(例如，人)。 [0102] “施用(administer)”或“施用(administration)”是指诸如通过粘膜、皮内、静脉内、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法，将存在于体外的物质注射或以其他方式物理递送到患者体内的行为。 [0103] 如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指由施用一种或多种疗法导致的疾病或病症的进展、严重性和/或持续时间的减少或改善。治疗可以通过以下方式来确定：评估与潜在病症相关的一种或多种症状是否已经减少、减轻和/或缓解，使得观察到患者的改善，尽管患者可能仍然受潜在病症折磨。术语“治疗”包括管理和改善疾病。术语“管理(manage)”、“管理(managing)”和“管理(management)”是指受试者从不一定导致疾病治愈的疗法中获得的有益效果。 [0104] 术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指降低疾病、病症、病状或相关症状(例如，糖尿病或癌症)的发作(或复发)的可能性。 [0105] 如本文所用，“延迟”疾病的发展意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推迟疾病的发展。这种延迟可以是不同长度的时间，这取决于疾病的病史和/或所治疗的个体。如对本领域技术人员显而易见的，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不发展疾病。“延迟”疾病发展的方法是当与不使用该方法相比时，降低在给定时间框架中疾病发展的可能性和/或降低在给定时间框架中疾病的程度的方法。此类比较典型地基于临床研究，使用统计学上显著数量的个体。 [0106] 如本文所用的术语“活化的肝星状细胞HSC相关的疾病或病症”或类似术语是指包含具有活化的HSC的组织的疾病或病症，包括至少部分地由活化的HSC引起的那些疾病或病症。在一些实施方案中，该疾病或病症的特征在于异常量(例如，高于正常量)的活化的HSC。此类疾病或病症包括例如肝纤维化。 [0107] 术语“约”和“大约”意指在给定值或范围的20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内或更小。 [0108] 如在本公开和权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。 [0109] 应当理解，无论在本文中何处用术语“包含”描述实施方案，也提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施方案。还应当理解，无论在本文中何处用短语“基本上由……组成”描述实施方案，也提供以“由……组成”描述的其他类似实施方案。 [0110] 如在短语诸如“在A和B之间”或“在A‑B之间”中所用的术语“在……之间”是指包括A和B两者的范围。 [0111] 本文在短语诸如“A和/或B”中所用的术语“和/或”旨在包括A和B两者。A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如在短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。 [0112] 5.2.结合分子 [0113] 如下文第7部分中所示，靶向活化的肝星状细胞(HSC)的结合分子当被工程化以具有增强的ADCC(例如，通过Fc突变)时在消耗HSC方面显著更有效。令人惊讶地，这种具有增强的ADCC的结合分子在治疗效果的体内研究中表现显著不同于没有这种增强的ADCC特性的可比较的结合分子，因此增强的ADCC对于这种活化的HSC结合分子发挥治疗效果以及用于治疗活化的HSC相关疾病或病症(诸如肝纤维化)是至关重要的。不受任何理论所束缚，由增强的ADCC赋予的治疗效果的这种显著差异似乎是HSC所独有的，并且可能是由于这种特定类型的细胞的特征。因此，在本文所提供的其他优点中，本公开为HSC相关疾病或病症提供了新的治疗策略(包括组合物和方法)。 [0114] 因此，本公开尤其提供了包含用于增强效应子功能(诸如ADCC)的手段的HSC结合分子及其用途。在一个方面，本文提供了一种结合分子，其包含结合结构域和功能结构域，该结合结构域与在活化的肝星状细胞(HSC)上表达的抗原结合，该功能结构域能够增强抗体效应子功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，结合分子是含有Fc的分子。在一些实施方案中，结合分子是抗体(包括完整抗体的抗原结合片段)。在其他实施方案中，结合分子包含与Fc区融合的结合结构域。如下文更详细描述的，用于增强ADCC的手段包括但不限于掺入增强ADCC的Fc突变和活化免疫细胞的另加的结合结构域。 [0115] 在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少10％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少20％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少30％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少40％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使 HSC的消耗增加至少50％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少60％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少70％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少80％。在某些实施方案中，与没有增强 ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少90％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少10％‑90％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少 20％‑90％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少30％‑90％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少40％‑90％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少50％‑90％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少60％‑90％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少70％‑90％。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少70％‑90％。 [0116] 在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少2倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少3倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少4倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少5倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使 HSC的消耗增加至少6倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少7倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少8倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少9倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少10倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少2倍至10倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少3倍至10 倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少4倍至10倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少5倍至10 倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少6倍至10倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少7倍至10 倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少8倍至10倍。在某些实施方案中，与没有增强ADCC的功能结构域的可比较的结合分子相比，本文所提供的结合分子使HSC的消耗增加至少9倍至10 倍。 [0117] 多特异性结合分子 [0118] 本文所提供的多特异性结合分子包含能够与在HSC上表达的一种或多种抗原结合的一个或多个HSC结合结构域，该一种或多种抗原包括例如：5HT1B、5HT1F、5HT2A、5‑HT2B、 5‑HT7、A2a、A2b、a1b1整联蛋白、a2bi整联蛋白、a5b1整联蛋白、a6b4整联蛋白、a8b1整联蛋白、avb1整联蛋白、avb3整联蛋白、ACVR2A、ACVR2B、AdipoR1、AdipoR2、ADRA1A、ADRA1B、ANTXR1、AT1、AT2、BAMBI、BMPR2、C5aR、CB1、CB2、CCR1、CCR2、CCR5、CCR7、CD105、CD112、CD14、CD146、CD155、CD248、CD36、CD38、CD40、CD44、CD49e、CD62e、CD73、CD95、c‑MET、CNTFR、CXCR3、CXCR4、DDR1、DDR2、EGFR、ETA、ETB、FAP、FGFR2、FN、gp130、GPC3、GPR91、ICAM‑1、IGF‑ 1R、IGF‑2R、IL‑10R2、IL‑11RA、IL‑17RA、IL‑20R1、IL‑20R2、IL‑22R1、IL‑6R、KCNE4、ITGA8、LRP、MICA、MICB、NCAM、NGFR、NPR‑B、NPR3、OB‑Ra、OB‑Rb、OPRD1、P2X4、P2X7、P2Y6、p75NTR、PAFR、PAR1、PAR2、PAR4、PDGFRA、PDGFRB、PD‑L1、PD‑L2、Ptc、PTH‑1R、RAGE、SIRPA、CD47、SYP、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、TNFR1、TRKB、TRKC、ULBP1、ULPB2、uPAR、VACM‑1、VEGFR‑1和VEGFR‑2。在一些实施方案中，HSC结合结构域如在下文“HSC结合结构域”部分中所描述的，或衍生自在下文“HSC结合结构域”部分中所描述的抗体。 [0119] 在一些实施方案中，本文所提供的多特异性结合分子包含能够与在HSC上表达的第一抗原结合的第一结合结构域和能够与在HSC上表达的第二抗原结合的第二结合结构域，该第一抗原和该第二抗原选自由以下组成的组：例如，5HT1B、5HT1F、5HT2A、5‑HT2B、5‑HT7、A2a、A2b、a1b1整联蛋白、a2bi整联蛋白、a5b1整联蛋白、a6b4整联蛋白、a8b1整联蛋白、avb1整联蛋白、avb3整联蛋白、ACVR2A、ACVR2B、AdipoR1、AdipoR2、ADRA1A、ADRA1B、ANTXR1、AT1、AT2、BAMBI、BMPR2、C5aR、CB1、CB2、CCR1、CCR2、CCR5、CCR7、CD105、CD112、CD14、CD146、CD155、CD248、CD36、CD38、CD40、CD44、CD49e、CD62e、CD73、CD95、c‑MET、CNTFR、CXCR3、CXCR4、DDR1、DDR2、EGFR、ETA、ETB、FAP、FGFR2、FN、gp130、GPC3、GPR91、ICAM‑1、IGF‑1R、IGF‑ 2R、IL‑10R2、IL‑11RA、IL‑17RA、IL‑20R1、IL‑20R2、IL‑22R1、IL‑6R、KCNE4、ITGA8、LRP、MICA、MICB、NCAM、NGFR、NPR‑B、NPR3、OB‑Ra、OB‑Rb、OPRD1、P2X4、P2X7、P2Y6、p75NTR、PAFR、PAR1、PAR2、PAR4、PDGFRA、PDGFRB、PD‑L1、PD‑L2、Ptc、PTH‑1R、RAGE、SIRPA、CD47、SYP、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、TNFR1、TRKB、TRKC、ULBP1、ULPB2、uPAR、VACM‑1、VEGFR‑1和VEGFR‑2。在一些实施方案中，该第一HSC结合结构域和该第二HSC结合结构域如在下文“HSC结合结构域”部分中所描述，或衍生自在下文“HSC结合结构域”部分中所描述的抗体。 [0120] 在一些实施方案中，本文所提供的多特异性结合分子还包含能够增强针对活化的HSC的抗体效应子功能的功能结构域。在一些实施方案中，该抗体效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，该功能结构域是包含增强ADCC的一个或多个突变的Fc区。在其他实施方案中，该功能结构域是活化免疫细胞的结构域。在一些实施方案中，该免疫细胞是NK细胞。 [0121] 在一些实施方案中，该功能结构域是包含增强ADCC的一个或多个突变的Fc区。在一些实施方案中，本文所提供的多特异性分子包含如在下文“包含变体Fc区的结合分子”部分中所描述的变体Fc区。 [0122] 在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节免疫细胞上的受体。在一些实施方案中，该功能结构域调节活化免疫细胞的受体。在其他实施方案中，该功能结构域调节抑制免疫细胞的受体。在一些实施方案中，该受体选自由以下组成的组：NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、 2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4、TIGIT、PVRIG和A2a。在一些实施方案中，该功能结构域如在下文“包含免疫细胞活化结构域的结合分子”部分中所描述的，或衍生自在下文“包含免疫细胞活化结构域的结合分子”部分中所描述的抗体。 [0123] 在一些实施方案中，本文所提供的多特异性分子是多特异性抗体。本文所提供的抗体包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。 [0124] 特别地，本文所提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有与抗原免疫特异性地结合的抗原结合位点的分子。本文所提供的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在具体实施方案中，本文所提供的抗体是IgG抗体，诸如IgG1抗体、IgG2抗体或IgG4抗体(例如，IgG4无效抗体(nullbody)和IgG4抗体的变体)。在具体实施方案中，IgG抗体是IgG1抗体。 [0125] 本领域已知的任何多特异性抗体平台或形式都可以用于本公开中，包括本领域中任何已知的双特异性抗体形式。 [0126] 在一些实施方案中，多特异性抗体包括具有促进异源二聚化的互补CH3结构域的IgG样分子；重组IgG样双重靶向分子，其中该分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的部分；IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双抗体与重链恒定结构域、Fc区或它们的部分融合；Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起；基于ScFv和基于双抗体的抗体和重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双抗体或不同的重链抗体(例如结构域抗体、纳米抗体)彼此融合或与另一个蛋白质或载剂分子融合。 [0127] 在一些实施方案中，具有互补CH3结构域分子的IgG样分子包括Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、杵臼结构(Knobs‑into‑Holes)(Genentech)、 CrossMAbs(Roche)和静电匹配的(Amgen)、LUZ‑Y(Genentech)、链交换工程化的结构域抗体(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic (Merus)和DuoBody(Genmab A/S)。 [0128] 在一些实施方案中，重组IgG样双重靶向分子包括双重靶向(DT)‑Ig(GSK/Domantis)、二合一抗体(Genentech)、交联Mab(Karmanos癌中心)、mAb2(F‑Star)和CovX抗体(CovX/Pfizer)。 [0129] 在一些实施方案中，IgG融合分子包括双重可变结构域(DVD)‑Ig(Abbott)、IgG样双特异性(ImClone/Eli Lilly)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)和BsAb(Zymogenetics)、HERCULES (Biogen Idec)和TvAb(Roche)。 [0130] 在一些实施方案中，Fc融合分子可以包括ScFv/Fc融合物(Academic Institution)、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion、Zymogenetics/BMS)、双亲和力重靶向技术(Fc‑DART)(MacroGenics)和双(ScFv)2‑Fab(中国国家抗体医药研究中心 (National Research Center for Antibody Medicine‑‑China))。 [0131] 在一些实施方案中，Fab融合双特异性抗体包括F(ab)2(Medarex/AMGEN)、双重作用(Dual‑Action)或双Fab(Genentech)、对接和锁定(Dock‑and‑Lock)(DNL) (ImmunoMedics)、二价双特异性(Biotecnol)和Fab‑Fv(UCB‑Celltech)。基于scFv、基于双抗体的抗体和结构域抗体包括但不限于双特异性T细胞接合物(BiTE)(Micromet)、串联双体体(Tandab)(Affimed)、双亲和力重靶向技术(DART)(MacroGenics)、单链双抗体 (Academic)、TCR样抗体(AIT，ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合物(Merrimack)和COMBODY(Epigen Biotech)、双靶向纳米抗体(Ablynx)、双靶向仅重链结构域抗体。 [0132] 本文所提供的全长双特异性抗体可以例如使用在两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换)通过在每一个半分子中的重链CH3界面处引入取代以有利于在体外在无细胞环境中或使用共表达形成具有不同特异性的两个抗体半分子的异二聚体来产生。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3结构域的解离‑缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键被还原。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，并且同时亲本抗体的CH3结构域通过解离‑缔合释放并重新形成。Fab臂的CH3结构域可以被工程化以有利于异源二聚化而不是同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，该两个Fab臂或半分子各自结合不同的表位。制备多特异性抗体的其他方法是已知的和预期的。 [0133] 如本文所用的“同源二聚化”是指具有相同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用的“同源二聚体”是指具有含有相同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。 [0134] 如本文所用的“异源二聚化”是指具有不相同的CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用的“异源二聚体”是指具有含有不相同的CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。 [0135] “杵臼结构”策略(参见例如，PCT公开号WO2006/028936)可以用于产生全长双特异性抗体。简言之，形成人IgG中的CH3结构域界面的选定氨基酸可以在影响CH3结构域相互作用的位置处发生突变以促进异源二聚体形成。将具有小侧链(杵)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并且将具有大侧链(臼)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达之后，由于具有“杵”的重链与具有“臼”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。 [0136] 可以使用其他策略，诸如通过取代在一个CH3表面上带正电荷的残基和在第二个CH3表面上带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如在美国专利公开号 US2010/0015133；美国专利公开号US2009/0182127；美国专利公开号US2010/028637；或美国专利公开号US2011/0123532中所述。在其他策略中，可以通过以下取代(表示为在第一重链的第一CH3结构域中的经修饰的位置/在第二重链的第二CH3结构域中的经修饰的位置) 来促进异源二聚化：L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405AY407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如在美国专利公开号US2012/0149876或美国专利公开号US2013/0195849中所述。 [0137] 除了上文所述的方法之外，本文所提供的双特异性抗体可以根据在PCT专利公开号WO2011/131746中所描述的方法在体外在无细胞环境中通过在两个单特异性同源二聚体抗体的CH3区中引入不对称突变并且在还原条件下从两个亲本单特异性同源二聚体抗体形成双特异性异源二聚体抗体以允许二硫键异构化来产生。在该方法中，该第一单特异性二价抗体和该第二单特异性二价抗体被工程化以在促进异源二聚体稳定性的CH3结构域处具有某些取代；在足以允许铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将抗体一起温育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。温育条件可以任选地恢复到非还原条件。可以使用的示例性还原剂是2‑巯基乙胺(2‑MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2‑羧乙基)膦(TCEP)、L‑半胱氨酸和β‑巯基乙醇，优选地还原剂选自由以下组成的组：2‑巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2‑羧乙基)膦。例如，可以使用在pH 5‑8，例如pH 7.0或pH 7.4，在至少25mM 2‑MEA的存在下或在至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下在至少20℃的温度下温育至少90分钟。 [0138] 包含变体Fc区的结合分子 [0139] 在一些实施方案中，赋予增强的效应子功能的功能结构域是包含增强ADCC的一个或多个突变的Fc变体。用于增强ADCC的任何已知的Fc突变可以用于本发明的结合分子中，包括但不限于在以下文献中所描述的那些：例如Sondermann等人,Nature,406:267‑273 (2000)；US8951517B2；US9714282B2；和US20090208500A1，其各自以引用的方式整体并入本文。例如，Fc区的一个或多个突变可以在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、 239、240、241、243、244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、 265、266、267、268、268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、 294、295、296、297、298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、 326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、 356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、 392、396、398、400、401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、 436、437、438、439、440、442、444和/或447处。在一些实施方案中，在Fc区中仅存在一个氨基酸突变。在其他实施方案中，在本发明的结合分子中的Fc区中存在多个氨基酸突变，诸如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个氨基酸突变。 [0140] 在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置233处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置234处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置235处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置236处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置237处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置238处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置239处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置240处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置241处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置243处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置244处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置245处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置246处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置247处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置248处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置250处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置253处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置254处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置255处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置256处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置258处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置260处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置262处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置263处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置264处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置265处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置266处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置267处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置268处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置268处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置269处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置270处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置272处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置274处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置276处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置280处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置282处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置283处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置285处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置286处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置288处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置290处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置292处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置293处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置294处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置295处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置296处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置297处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置298处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置299处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置300处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置301处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置303处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置307处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置311处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置312处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置313处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置315处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置317处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置318处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置320处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置322处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置325处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置326处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置327处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置328处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置329处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置330处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置331处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置332处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置333处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置334处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置335处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置337处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置338处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置339处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置340处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置342处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置344处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置345处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置347处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置355处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置356处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置358处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置359处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置360处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置361处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置362处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置373处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置375处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置376处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置378处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置380处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置382处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置383处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置384处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置386处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置388处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置389处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置390处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置391处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置392处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置396处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置398处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置400处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置401处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置413处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置414处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置415处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置416处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置418处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置419处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置421处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置422处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置424处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置428处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置430处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置433处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置434处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置435处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置436处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置437处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置438处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置439处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置440处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置442处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置444处的氨基酸突变。在一些实施方案中，本发明的Fc区包含在位置447处的氨基酸突变。Fc区中所有上文所述的氨基酸位置都是根据EU编号。 [0141] 在一些具体实施方案中，Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含 S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0142] 包含免疫细胞活化结构域的结合分子 [0143] 在其他实施方案中，该功能结构域是活化免疫细胞的结构域。在一些实施方案中，该功能结构域还包含结合结构域，使得结合分子是多特异性的(例如，双特异性的)结合分子。在一些实施方案中，该免疫细胞是NK细胞。在其他实施方案中，该功能结构域是通过促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导来活化免疫细胞的结构域。 [0144] 在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节免疫细胞上的受体。在一些实施方案中，该功能结构域调节活化免疫细胞的受体。在其他实施方案中，该功能结构域调节抑制免疫细胞的受体。在一些实施方案中，该受体选自由以下组成的组：NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、 2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节 NKp46。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节NKp30。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节NKp44。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节NKG2C。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节CD94。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节KIR2DS1。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节KIR2DS4。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节KIR2DS2。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节KIR2DL4。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节KIR3DS1。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节CD160。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节NKG2D。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节NKp80。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节DNAM1。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节2B4。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节NTB‑A。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节CRACC。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节4‑1BB。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节OX40。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节 CRTAM。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节CD16。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节LFA1。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节NKG2A。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节KIR2DL1。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节KIR2DL2。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节KIR2DL3。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节KIR3DL1。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节KIR3DL2。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节LILRB1。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节KIR2DL5。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节KLRG1。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节CD161。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节SIGLEC7。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节 SIGLEC9。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节LAIR1。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节TIGIT。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节CD96。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节PD‑1。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节PVRIG。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节CD122。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节CD132。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节CD218a。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节CD218b。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节IL12Rb1。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节 IL12Rb2。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节IL21R。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节TGFBR1。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节TGFBR2。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节TGFBR3。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节ACVR2A。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节ACVR2B。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节ALK4。在一些实施方案中，该功能结构域结合和/或调节A2a。 [0145] 在一些具体实施方案中，该功能结构域结合NKG2D。在一些实施方案中，该功能结构域衍生自NKG2D配体。在一些实施方案中，该功能结构域是MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该功能结构域是MICA的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该功能结构域是MICB的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该功能结构域是ULBP1的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该功能结构域是ULBP2的胞外结构域或其片段或变体。 [0146] 在一些实施方案中，该功能结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该功能结构域包含与SEQ ID NO:90具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0147] 在一些实施方案中，该功能结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该功能结构域包含与SEQ ID NO:91具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0148] 在一些实施方案中，该功能结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该功能结构域包含与SEQ ID NO:92具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0149] 在一些实施方案中，该功能结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该功能结构域包含与SEQ ID NO:93具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0150] 在一些实施方案中，该功能结构域结合NKp46。在一些实施方案中，该功能结构域包含与NKp46结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0151] 在一些实施方案中，该功能结构域结合TGFb。在一些实施方案中，该功能结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体。在一些实施方案中，该功能结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该功能结构域包含与SEQ ID NO:94具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％同一性的氨基酸序列。 [0152] 在一些实施方案中，该功能结构域结合TIGIT。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO: 268的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0153] 在一些实施方案中，该功能结构域结合PVRIG。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO: 276的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0154] 包含变体Fc区和免疫细胞活化结构域的结合分子 [0155] 在一些实施方案中，本文所提供的结合分子包含两种或更多种用于增强效应子功能(诸如ADCC)的手段。在一些实施方案中，本文所提供的结合分子包含含有一个或多个突变的增强ADCC的Fc变体和用于活化免疫细胞的结构域，该Fc变体和该结构域各自在上文更详细地和在下文简要地描述。 [0156] 在一些实施方案中，该Fc区包含在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、 265、266、267、268、268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、 294、295、296、297、298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、 326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、 356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、 392、396、398、400、401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、 436、437、438、439、440、442、444和/或447处的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0157] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域可以活化NK细胞。该免疫活化结构域可以通过促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导来活化免疫细胞。 [0158] 该免疫细胞活化结构域可以结合和/或调节免疫细胞上的受体。示例性受体包括NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 [0159] 在一些具体实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKG2D。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域衍生自NKG2D配体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICA的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICB的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 ULBP1的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是ULBP2 的胞外结构域或其片段或变体。 [0160] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:90具有至少75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:91具有至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:92具有至少75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:93具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0161] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKp46。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与NKp46结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、 LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0162] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TGFb。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:94具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0163] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TIGIT。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与TIGIT结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0164] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合PVRIG。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与PVRIG结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0165] HSC结合结构域 [0166] 本发明的结合分子包含能够与在HSC上表达的一种或多种抗原结合的一个或多个结合结构域，该一种或多种抗原包括例如：5HT1B、5HT1F、5HT2A、5‑HT2B、5‑HT7、A2a、A2b、a1b1整联蛋白、a2bi整联蛋白、a5b1整联蛋白、a6b4整联蛋白、a8b1整联蛋白、avb1整联蛋白、avb3整联蛋白、ACVR2A、ACVR2B、AdipoR1、AdipoR2、ADRA1A、ADRA1B、ANTXR1、AT1、AT2、BAMBI、BMPR2、C5aR、CB1、CB2、CCR1、CCR2、CCR5、CCR7、CD105、CD112、CD14、CD146、CD155、CD248、CD36、CD38、CD40、CD44、CD49e、CD62e、CD73、CD95、c‑MET、CNTFR、CXCR3、CXCR4、DDR1、DDR2、EGFR、ETA、ETB、FAP、FGFR2、FN、gp130、GPC3、GPR91、ICAM‑1、IGF‑1R、IGF‑2R、IL‑10R2、IL‑11RA、IL‑17RA、IL‑20R1、IL‑20R2、IL‑22R1、IL‑6R、KCNE4、ITGA8、LRP、MICA、MICB、NCAM、NGFR、NPR‑B、NPR3、OB‑Ra、OB‑Rb、OPRD1、P2X4、P2X7、P2Y6、p75NTR、PAFR、PAR1、PAR2、PAR4、PDGFRA、PDGFRB、PD‑L1、PD‑L2、Ptc、PTH‑1R、RAGE、SIRPA、CD47、SYP、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、TNFR1、TRKB、TRKC、ULBP1、ULPB2、uPAR、VACM‑1、VEGFR‑1和VEGFR‑2。 [0167] 在一些实施方案中，结合结构域结合5HT1B。在一些实施方案中，结合结构域结合5HT1F。在一些实施方案中，结合结构域结合5HT2A。在一些实施方案中，结合结构域结合5‑HT2B。在一些实施方案中，结合结构域结合5‑HT7。在一些实施方案中，结合结构域结合A2a。在一些实施方案中，结合结构域结合A2b。在一些实施方案中，结合结构域结合a1b1整联蛋白。在一些实施方案中，结合结构域结合a2bi整联蛋白。在一些实施方案中，结合结构域结合a5b1整联蛋白。在一些实施方案中，结合结构域结合a6b4整联蛋白。在一些实施方案中，结合结构域结合a8b1整联蛋白。在一些实施方案中，结合结构域结合avb1整联蛋白。在一些实施方案中，结合结构域结合avb3整联蛋白。在一些实施方案中，结合结构域结合ACVR2A。在一些实施方案中，结合结构域结合ACVR2B。在一些实施方案中，结合结构域结合AdipoR1。在一些实施方案中，结合结构域结合AdipoR2。在一些实施方案中，结合结构域结合ADRA1A。在一些实施方案中，结合结构域结合ADRA1B。在一些实施方案中，结合结构域结合AT1。在一些实施方案中，结合结构域结合AT2。在一些实施方案中，结合结构域结合BAMBI。在一些实施方案中，结合结构域结合BMPR2。在一些实施方案中，结合结构域结合C5aR。在一些实施方案中，结合结构域结合CB1。在一些实施方案中，结合结构域结合CB2。在一些实施方案中，结合结构域结合CCR1。在一些实施方案中，结合结构域结合CCR2。在一些实施方案中，结合结构域结合CCR5。在一些实施方案中，结合结构域结合CCR7。在一些实施方案中，结合结构域结合CD105。在一些实施方案中，结合结构域结合CD112。在一些实施方案中，结合结构域结合CD14。在一些实施方案中，结合结构域结合CD146。在一些实施方案中，结合结构域结合CD155。在一些实施方案中，结合结构域结合CD36。在一些实施方案中，结合结构域结合 CD38。在一些实施方案中，结合结构域结合CD40。在一些实施方案中，结合结构域结合CD44。在一些实施方案中，结合结构域结合CD49e。在一些实施方案中，结合结构域结合CD62e。在一些实施方案中，结合结构域结合CD73。在一些实施方案中，结合结构域结合CD95。在一些实施方案中，结合结构域结合c‑MET。在一些实施方案中，结合结构域结合CXCR3。在一些实施方案中，结合结构域结合CXCR4。在一些实施方案中，结合结构域结合DDR1。在一些实施方案中，结合结构域结合DDR2。在一些实施方案中，结合结构域结合EGFR。在一些实施方案中，结合结构域结合ETA。在一些实施方案中，结合结构域结合ETB。在一些实施方案中，结合结构域结合FAP。在一些实施方案中，结合结构域结合FGFR2。在一些实施方案中，结合结构域结合FN。在一些实施方案中，结合结构域结合gp130。在一些实施方案中，结合结构域结合GPR91。在一些实施方案中，结合结构域结合ICAM‑1。在一些实施方案中，结合结构域结合IGF‑1R。在一些实施方案中，结合结构域结合IGF‑2R。在一些实施方案中，结合结构域结合IL‑10R2。在一些实施方案中，结合结构域结合IL‑11RA。在一些实施方案中，结合结构域结合IL‑17RA。在一些实施方案中，结合结构域结合IL‑20R1。在一些实施方案中，结合结构域结合IL‑20R2。在一些实施方案中，结合结构域结合IL‑22R1。在一些实施方案中，结合结构域结合IL‑6R。在一些实施方案中，结合结构域结合ITGA8。在一些实施方案中，结合结构域结合LRP。在一些实施方案中，结合结构域结合MICA。在一些实施方案中，结合结构域结合MICB。在一些实施方案中，结合结构域结合NCAM。在一些实施方案中，结合结构域结合NPR‑B。在一些实施方案中，结合结构域结合OB‑Ra。在一些实施方案中，结合结构域结合OB‑Rb。在一些实施方案中，结合结构域结合OPRD1。在一些实施方案中，结合结构域结合P2X4。在一些实施方案中，结合结构域结合P2X7。在一些实施方案中，结合结构域结合P2Y6。在一些实施方案中，结合结构域结合p75NTR。在一些实施方案中，结合结构域结合PAFR。在一些实施方案中，结合结构域结合PAR1。在一些实施方案中，结合结构域结合PAR2。在一些实施方案中，结合结构域结合PAR4。在一些实施方案中，结合结构域结合PDGFRA。在一些实施方案中，结合结构域结合PDGFRB。在一些实施方案中，结合结构域结合PD‑L1。在一些实施方案中，结合结构域结合PD‑L2。在一些实施方案中，结合结构域结合Ptc。在一些实施方案中，结合结构域结合RAGE。在一些实施方案中，结合结构域结合SIRPA。在一些实施方案中，结合结构域结合CD47。在一些实施方案中，结合结构域结合SYP。在一些实施方案中，结合结构域结合TGFBR1。在一些实施方案中，结合结构域结合TGFBR2。在一些实施方案中，结合结构域结合TGFBR3。在一些实施方案中，结合结构域结合TLR2。在一些实施方案中，结合结构域结合 TLR3。在一些实施方案中，结合结构域结合TLR4。在一些实施方案中，结合结构域结合TLR7。在一些实施方案中，结合结构域结合TLR9。在一些实施方案中，结合结构域结合TNFR1。在一些实施方案中，结合结构域结合TRKB。在一些实施方案中，结合结构域结合TRKC。在一些实施方案中，结合结构域结合ULBP1。在一些实施方案中，结合结构域结合ULPB2。在一些实施方案中，结合结构域结合uPAR。在一些实施方案中，结合结构域结合VACM‑1。在一些实施方案中，结合结构域结合VEGFR‑1。在一些实施方案中，结合结构域结合VEGFR‑2。在一些实施方案中，结合结构域结合ANTXR1。在一些实施方案中，结合结构域结合CD248。在一些实施方案中，结合结构域结合CNTFR。在一些实施方案中，结合结构域结合GPC3。在一些实施方案中，结合结构域结合KCNE4。在一些实施方案中，结合结构域结合NGFR。在一些实施方案中，结合结构域结合NPR3。在一些实施方案中，结合结构域结合PTH‑1R。 [0168] 在某些实施方案中，本文所提供的HSC结合结构域衍生自包含其抗原结合片段的抗体。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V‑NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab')3、四抗 2 体、三抗体、双抗体、单结构域抗体、DVD‑Ig、Fcab、mAb、(scFv)2、scFv‑Fc或合成的HSC结合模块。术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可互换使用，并且以最广泛的含义使用，并且具体地涵盖例如单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、以及由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性即可)。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的和/或亲和成熟的，以及来自其他物种(例如，小鼠和兔等)的抗体。术语“抗体”旨在包括免疫球蛋白类别的多肽内的B细胞多肽产物，其能够结合特异性分子抗原并且由两对相同的多肽链构成，其中每对具有一条重链(约50kDa‑ 70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100个至约130个或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如Antibody Engineering(Borrebaeck编辑，第2版，1995)；以及Kuby,Immunology(第3版，1997)。在具体实施方案中，特异性分子抗原可以被本文所提供的抗体(包括多肽或表位)结合。抗体还包括但不限于合成抗体、重组产生的抗体、骆驼化抗体或它们的人源化变体、胞内抗体和抗独特型(抗Id)抗体。如本文所用的术语“抗体”还包括具有Fc区和上文所述的任何一种的功能片段(例如，抗原结合片段)的任何结合分子，该功能片段是指抗体重链或轻链多肽的保留了衍生该片段的抗体的一些或全部结合活性的一部分。功能片段(例如，抗原结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。特别地，本文所提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，含有结合抗原的抗原结合位点的抗原结合结构域或分子(例如，抗体的一个或多个CDR)。此类抗体片段可见于例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1989)；Mol.Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers编辑，1995)；Huston等人,1993,Cell Biophysics 22:189‑224；Plückthun和 Skerra,1989,Meth.Enzymol.178:497‑515；以及Day,Advanced Immunochemistry(第2版， 1990)。本文所提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。本文所提供的抗体可以具有与抗原特异性地结合的结构域。本文所提供的抗体可以包含κ轻链。本文所提供的抗体可以包含λ轻链。抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。在表5中列出了示例性恒定区(参见SEQ ID NO:143至154)。 [0169] 在其他实施方案中，与HSC上表达的抗原结合的结合结构域不衍生自抗体。在一些实施方案中，与HSC上表达的抗原结合的结合结构域衍生自与HSC上表达的抗原结合的天然肽(例如，天然配体或天然受体)。 [0170] 肽接头 [0171] 在一些实施方案中，本文所提供的结合分子还包含在上文所述的各种结构域之间的一个或多个接头。本文所述的各种结构域可以通过肽接头彼此融合。在一些实施方案中，某些结构域在没有任何肽接头的情况下直接彼此融合。连接不同结构域的肽接头可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，本文所提供的多肽包含在某些结构域之间但不在该多肽中的其他结构域之间的肽接头。 [0172] 本文所提供的多肽中的每个肽接头可以具有相同或不同的长度和/或序列。可以独立地对每个肽接头进行选择和优化。用于本发明的融合蛋白中的肽接头的长度、柔性程度和/或其他特性可能对特质(包括但不限于对一种或多种特定靶分子的亲和力、特异性或亲合力)具有一些影响。在一些实施方案中，肽接头包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻结构域相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸‑丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。 [0173] 肽接头可以具有任何合适的长度。在一些实施方案中，肽接头的长度为至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、50个或更多个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头的长度为不超过约100个、75个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、19个、18个、 17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或更少个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头的长度为约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长、或约30个氨基酸至约50个氨基酸中的任一者。 [0174] 肽接头可以具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，从仅重链抗体的铰链区衍生的序列可以用作接头。参见例如WO1996/34103。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。在一些实施方案中，本文所提供的肽接头是(GxS)n接头，其中x和n可以独立地是3与 12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多。示例性柔性接头包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸‑丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)n，其中n是至少为1的整数)、甘氨酸‑丙氨酸聚合物、丙氨酸‑丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。在下文表3中列出了示例性肽接头。在一些实施方案中，本文所提供的肽接头包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所提供的肽接头包含SEQ ID NO:96 的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所提供的肽接头包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所提供的肽接头包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所提供的肽接头包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所提供的肽接头包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所提供的肽接头包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所提供的肽接头包含SEQ ID NO: 102的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所提供的肽接头包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所提供的肽接头包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所提供的肽接头包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列。 [0175] 本公开的融合蛋白可以包含位于上文所述的结构域之间的铰链结构域。铰链结构域是通常在蛋白质的两个结构域之间发现的氨基酸区段，并且可以允许蛋白质的柔性和该结构域中的一个或两个相对于彼此的移动。 [0176] 该铰链结构域可以含有约10个至100个氨基酸，例如，约15个至75个氨基酸、20个至50个氨基酸或30个至60个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，该铰链结构域的长度可以为至少约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、 23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个或75个氨基酸中的任一者。 [0177] 在一些实施方案中，该铰链结构域是天然存在的蛋白质的该铰链结构域。在一些实施方案中，该铰链结构域是天然存在的蛋白质的该铰链结构域的至少一部分。抗体(诸如IgG抗体、IgA抗体、IgM抗体、IgE抗体或IgD抗体)的铰链结构域也适用于本文所述的融合蛋白。在一些实施方案中，该铰链结构域是连接抗体的恒定结构域CH1和恒定结构域CH2的该铰链结构域。在一些实施方案中，该铰链结构域是抗体的该铰链结构域，并且包含抗体的该铰链结构域和抗体的一个或多个恒定区。在一些实施方案中，该铰链结构域包含抗体的该铰链结构域和抗体的CH3恒定区。在一些实施方案中，该铰链结构域包含抗体的该铰链结构域和抗体的CH2恒定区和CH3恒定区。在一些实施方案中，该抗体是IgG抗体、IgA抗体、IgM抗体、IgE抗体或IgD抗体。在一些实施方案中，该抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，该抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一些实施方案中，铰链区包含铰链区以及IgG1抗体的CH2恒定区和CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和 CH3恒定区。 [0178] 非天然存在的肽也可以用作本文所述的融合蛋白的铰链结构域。 [0179] 本领域已知的其他接头(例如，如WO2016014789、WO2015158671、WO2016102965、US20150299317、WO2018067992、US7741465；Colcher等人,J.Nat.Cancer Inst82:1191‑ 1197(1990)；和Bird等人,Science 242:423‑426(1988)中所述的)也可以包括在本文所提供的融合蛋白中，这些文献各自的公开内容以引用的方式并入本文。 [0180] 结合PDGFRb的示例性结合分子 [0181] PDGFRb是在HSC上表达的示例性抗原。在一些实施方案中，本发明结合分子中靶向HSC的结合结构域包含下文所述的抗PDGFRb抗体或其变体。 [0182] 在一些实施方案中，本文所提供的抗PDGFRb抗体以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤‑8 ‑8 ‑13 ‑9 1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10 M或更小，例如10 M至10 M，例如10 M至 ‑13 10 M)的解离常数(KD)结合PDGFRb(例如，人PDGFRb)。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本公开的目的，包括通过RIA，例如用感兴趣的抗体的Fab形式及其抗原进行的(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865‑81)；通过生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定，通过 (使用例如 Red96系统)或通过 (使用例如 TM‑2000或 TM‑3000)。“缔合速率(on‑rate)”或“缔合速率(rate of association)”或“缔合速率(association rate)”或“kon”也可以用上文所述的相同生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)技术使用例如 Red96、 TM‑2000或 TM‑3000系统来确定。 [0183] 在一些实施方案中，本文所提供的抗PDGFRb抗体是在下文第7部分中所描述的那些。因此，在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的一个或多个CDR序列。可以根据熟知的编号系统确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据 IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，抗PDGFRb抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗 PDGFRb抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0184] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:67所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:68所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。 [0185] 在其他实施方案中，本文提供了与PDGFRb结合的抗体，该抗体包含含有与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR1；(ii)含有与SEQ ID NO:2具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR2；(iii)含有与SEQ ID NO: 3具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR3；(iv)含有与SEQ ID NO:4具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR1；(v)含有与SEQ ID NO:5具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR2；和/或(vi)含有与SEQ ID NO:6具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗PDGFRb抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗PDGFRb抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0186] 在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。 [0187] 在一些实施方案中，该抗体还包含SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68的一个或多个框架区。在一些实施方案中，本文所提供的抗体是人源化抗体。本文所述的框架区是基于CDR编号系统的边界确定的。换句话说，如果CDR通过例如Kabat、IMGT或Chothia确定，则框架区是从N末端到C末端在FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4格式的可变区中围绕CDR的氨基酸残基。例如，FR1被定义为位于如通过例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统所定义的CDR1氨基酸残基N末端的氨基酸残基，FR2被定义为在如通过例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统所定义的CDR1氨基酸残基与CDR2氨基酸残基之间的氨基酸残基，FR3被定义为在如通过例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统所定义的CDR2氨基酸残基与CDR3氨基酸残基之间的氨基酸残基，并且FR4被定义为位于如通过例如Kabat编号系统、IMGT编号系统或Chothia编号系统所定义的CDR3氨基酸残基C末端的氨基酸残基。 [0188] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。 [0189] 在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含相对于本文所提供的任何抗体(例如，在下文第7部分中所描述的那些)具有一定同一性百分比的氨基酸序列。 [0190] 在两个序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264 2268(1990)中的算法，如在Karlin和Altschul, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873 5877(1993)中进行修改的算法。将这种算法并入 Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可以用设定为例如得分＝100、字长＝12的NBLAST核苷酸程序参数进行，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用设定为例如评分＝50、字长＝3的 XBLAST程序参数进行，以获得与本文所述蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以如Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389 3402(1997)中所述利用缺口BLAST。可替代地，PSI BLAST可以用于进行迭代搜索，其检测分子之间的远距离关系(Id.)。当利用BLAST、缺口BLAST和PSI Blast程序时，可以使用相应程序的默认参数 (例如，XBLAST和NBLAST的默认参数)(参见例如，美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)，万维网：ncbi.nlm.nih.gov)。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是Myers和Miller,CABIOS 4:11‑17(1998)的算法。将这种算法并入ALIGN程序(版本2.0)中，其是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN 程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120重量残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4。可以使用与上文所述的那些技术类似的技术在允许或不允许缺口的情况下确定在两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，典型地仅计数精确匹配。 [0191] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗PDGFRb抗体保留与PDGFRb结合的能力。在一些实施方案中，在参考氨基酸序列中总共有1个至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，本文所提供的抗PDGFRb抗体包括参考序列的翻译后修饰。 [0192] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合PDGFRb。 [0193] 在一些实施方案中，可以例如通过组合丙氨酸扫描对功能表位作图，以鉴定PDGFRb蛋白中与本文所提供的抗PDGFRb抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，与PDGFRb结合的抗PDGFRb抗体的构象和晶体结构可以用于鉴定表位。在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合与本文所提供的任何抗PDGFRb抗体相同的表位的抗体。例如，在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗PDGFRb抗体相同的表位，该抗PDGFRb抗体包含含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。 [0194] 在一些实施方案中，本文提供了抗PDGFRb抗体或其抗原结合片段，该抗PDGFRb抗体或其抗原结合片段与本文所述的任何一种抗PDGFRb抗体竞争性地特异性地结合PDGFRb。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗PDGFRb抗体竞争性地特异性地结合PDGFRb，该抗PDGFRb抗体包含含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 68的氨基酸序列的VL。 [0195] 在一些实施方案中，本文提供了包含上文所述的任何一种抗PDGFRb抗体的PDGFRb结合蛋白。在一些实施方案中，PDGFRb结合蛋白是单克隆抗体，包括小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗PDGFRb抗体是抗体片段(例如，scFv)。在一些实施方案中，PDGFRb结合蛋白是包含本文所提供的抗PDGFRb抗体的融合蛋白。在其他实施方案中，PDGFRb结合蛋白是包含本文所提供的抗PDGFRb抗体的多特异性抗体。其他示例性 PDGFRb结合分子在下面部分中更详细地描述。 [0196] 在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗PDGFRb抗体或抗原结合蛋白可以单独地或组合地并入任何特征，如下文所述。 [0197] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含具有增强的ADCC的Fc变体。在一些实施方案中，该Fc区包含在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、 244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、 268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、 330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、 361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、 401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、 440、442、444和/或447处的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0198] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含可以活化NK细胞的免疫细胞活化结构域。该免疫活化结构域可以通过促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导来活化免疫细胞。 [0199] 该免疫细胞活化结构域可以结合和/或调节免疫细胞上的受体。示例性受体包括NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 [0200] 在一些具体实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKG2D。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域衍生自NKG2D配体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICA的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICB的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 ULBP1的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是ULBP2 的胞外结构域或其片段或变体。 [0201] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:90具有至少75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:91具有至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:92具有至少75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:93具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0202] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKp46。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与NKp46结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、 LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0203] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TGFb。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:94具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0204] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TIGIT。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与TIGIT结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0205] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合PVRIG。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与PVRIG结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0206] 在一些具体实施方案中，本文所提供的结合分子如表4、表6和表7中所示。 [0207] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列。 [0208] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列。 [0209] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。 [0210] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列。 [0211] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列。 [0212] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列。 [0213] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列。 [0214] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列。 [0215] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列。 [0216] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列。 [0217] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列。 [0218] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列。 [0219] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列。 [0220] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列。 [0221] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列。 [0222] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列。 [0223] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列。 [0224] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列。 [0225] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列。 [0226] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列。 [0227] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列。 [0228] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列。 [0229] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列。 [0230] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列。 [0231] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列。 [0232] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列。 [0233] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列。 [0234] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列。 [0235] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列。 [0236] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列。 [0237] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列。 [0238] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列。 [0239] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链、第二链和第三链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列，该第三链包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列。 [0240] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链、第二链和第三链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列，该第三链包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列。 [0241] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列。 [0242] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:224的氨基酸序列。 [0243] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链、第二链和第三链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:298的氨基酸序列，该第三链包含SEQ ID NO:299的氨基酸序列。 [0244] 结合SIRPA的示例性结合分子 [0245] SIRPA是在HSC上表达的另一种示例性抗原。在一些实施方案中，本发明结合分子中靶向HSC的结合结构域包含下文所述的抗SIRPA抗体或其变体。 [0246] 在一些实施方案中，本文所提供的抗SIRPA抗体以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、‑8 ‑8 ‑13 ‑9 ‑13≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10 M或更小，例如10 M至10 M，例如10 M至10 M) 的解离常数(KD)结合SIRPA(例如，人SIRPA)。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本公开的目的，包括通过RIA，例如用感兴趣的抗体的Fab形式及其抗原进行的(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865‑81)；通过生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定，通过 (使用例如 Red96系统)或通过 (使用例如 TM‑2000或 TM‑3000)。“缔合速率(on‑rate)”或“缔合速率 (rate of association)”或“缔合速率(association rate)”或“kon”也可以用上文所述的相同生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)技术使用例如 Red96、 TM‑2000或 TM‑3000系统来确定。 [0247] 在一些实施方案中，本文所提供的抗SIRPA抗体是在下文第7部分中所描述的那些。因此，在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含SEQ ID NO:69至74的一个或多个CDR序列。可以根据熟知的编号系统确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0248] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:69所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:70所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:71所示的HCDR1、HCDR2和 HCDR3、以及如SEQ ID NO:72所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:74所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。 [0249] 在其他实施方案中，本文提供了与SIRPA结合的抗体，该抗体包含含有与SEQ ID NO:7、13和19中的任一者具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR1； (ii)含有与SEQ ID NO:8、14和20中的任一者具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR2；(iii)含有与SEQ ID NO:9、15和21中的任一者具有至少75％、80％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR3；(iv)含有与SEQ ID NO:10、16和22中的任一者具有至少 75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR1；(v)含有与SEQ ID NO:11、17和23中的任一者具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR2；和/或(vi)含有与SEQ ID NO:12、18和24中的任一者具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0250] 在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。 [0251] 在一些实施方案中，该抗体还包含SEQ ID NO:69至74的一个或多个框架区。在一些实施方案中，本文所提供的抗体是人源化抗体。 [0252] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL。 [0253] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL。 [0254] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL。 [0255] 在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含相对于本文所提供的任何抗体(例如，在下文第7部分中所描述的那些)具有一定同一性百分比的氨基酸序列。 [0256] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗SIRPA抗体保留与SIRPA结合的能力。在一些实施方案中，在参考氨基酸序列中总共有1个至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，本文所提供的抗SIRPA抗体包括参考序列的翻译后修饰。 [0257] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合SIRPA。 [0258] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合SIRPA。 [0259] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合SIRPA。 [0260] 在一些实施方案中，可以例如通过组合丙氨酸扫描对功能表位作图，以鉴定SIRPA蛋白中与本文所提供的抗SIRPA抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，与 SIRPA结合的抗SIRPA抗体的构象和晶体结构可以用于鉴定表位。在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合与本文所提供的任何抗SIRPA抗体相同的表位的抗体。例如，在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗SIRPA抗体相同的表位，该抗 SIRPA抗体包含含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的 VL。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗SIRPA抗体相同的表位，该抗SIRPA抗体包含含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗SIRPA抗体相同的表位，该抗SIRPA抗体包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74 的氨基酸序列的VL。 [0261] 在一些实施方案中，本文提供了抗SIRPA抗体或其抗原结合片段，该抗SIRPA抗体或其抗原结合片段与本文所述的任何一种抗SIRPA抗体竞争性地特异性地结合SIRPA。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗SIRPA抗体竞争性地特异性地结合 SIRPA，该抗SIRPA抗体包含含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗SIRPA抗体竞争性地特异性地结合SIRPA，该抗SIRPA抗体包含含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH和含有 SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗SIRPA抗体竞争性地特异性地结合SIRPA，该抗SIRPA抗体包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL。 [0262] 在一些实施方案中，本文提供了包含上文所述的任何一种抗SIRPA抗体的SIRPA结合蛋白。在一些实施方案中，SIRPA结合蛋白是单克隆抗体，包括小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗SIRPA抗体是抗体片段(例如，scFv)。在一些实施方案中，SIRPA结合蛋白是包含本文所提供的抗SIRPA抗体的融合蛋白。在其他实施方案中， SIRPA结合蛋白是包含本文所提供的抗SIRPA抗体的多特异性抗体。其他示例性SIRPA结合分子在下面部分中更详细地描述。 [0263] 在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗SIRPA抗体或抗原结合蛋白可以单独地或组合地并入任何特征，如下文所述。 [0264] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含具有增强的ADCC的Fc变体。在一些实施方案中，该Fc区包含在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、 244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、 268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、 330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、 361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、 401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、 440、442、444和/或447处的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0265] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含可以活化NK细胞的免疫细胞活化结构域。该免疫活化结构域可以通过促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导来活化免疫细胞。 [0266] 该免疫细胞活化结构域可以结合和/或调节免疫细胞上的受体。示例性受体包括NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 [0267] 在一些具体实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKG2D。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域衍生自NKG2D配体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICA的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICB的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 ULBP1的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是ULBP2 的胞外结构域或其片段或变体。 [0268] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:90具有至少75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:91具有至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:92具有至少75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:93具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0269] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKp46。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与NKp46结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、 LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0270] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TGFb。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:94具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0271] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TIGIT。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与TIGIT结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0272] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合PVRIG。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与PVRIG结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0273] 在一些具体实施方案中，本文所提供的结合分子如表4中所示。 [0274] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列。 [0275] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列。 [0276] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列。 [0277] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列。 [0278] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。 [0279] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列。 [0280] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列。 [0281] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列。 [0282] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:291的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:292的氨基酸序列。 [0283] 结合FAPα的示例性结合分子 [0284] FAPα是在HSC上表达的又另一种示例性抗原。在一些实施方案中，本发明结合分子中靶向HSC的结合结构域包含下文所述的抗FAPα抗体或其变体。 [0285] 在一些实施方案中，本文所提供的抗FAPα抗体以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、‑8 ‑8 ‑13 ‑9 ‑13≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10 M或更小，例如10 M至10 M，例如10 M至10 M) 的解离常数(KD)结合FAPα(例如，人FAPα)。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本公开的目的，包括通过RIA，例如用感兴趣的抗体的Fab形式及其抗原进行的(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865‑81)；通过生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定，通过 (使用例如 Red96系统)或通过 (使用例如 TM‑2000或 TM‑3000)。“缔合速率(on‑rate)”或“缔合速率 (rate of association)”或“缔合速率(association rate)”或“kon”也可以用上文所述的相同生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)技术使用例如 Red96、 TM‑2000或 TM‑3000系统来确定。 [0286] 在一些实施方案中，本文所提供的抗FAPα抗体是在下文第7部分中所描述的那些。因此，在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含SEQ ID NO:75至78的一个或多个CDR序列。可以根据熟知的编号系统确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，抗FAPα抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗FAPα抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0287] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:75所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:77所示的HCDR1、HCDR2和 HCDR3、以及如SEQ ID NO:78所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。 [0288] 在其他实施方案中，本文提供了与FAPα结合的抗体，该抗体包含含有与SEQ ID NO:25或31具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR1；(ii)含有与SEQ ID NO:26或32具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR2；(iii)含有与SEQ ID NO:27或33具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR3；(iv)含有与SEQ ID NO:28或34具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR1；(v)含有与SEQ ID NO:29或35具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR2；和/或(vi)含有与SEQ ID NO:30或36具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗FAPα抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗FAPα抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0289] 在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列， LCDR2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。 [0290] 在一些实施方案中，该抗体还包含SEQ ID NO:75至78的一个或多个框架区。在一些实施方案中，本文所提供的抗体是人源化抗体。 [0291] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL。 [0292] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL。 [0293] 在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含相对于本文所提供的任何抗体(例如，在下文第7部分中所描述的那些)具有一定同一性百分比的氨基酸序列。 [0294] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗FAPα抗体保留与FAPα结合的能力。在一些实施方案中，在参考氨基酸序列中总共有1个至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，本文所提供的抗FAPα抗体包括参考序列的翻译后修饰。 [0295] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合FAPα。 [0296] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:78的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合FAPα。 [0297] 在一些实施方案中，可以例如通过组合丙氨酸扫描对功能表位作图，以鉴定FAPα蛋白中与本文所提供的抗FAPα抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，与FAPα结合的抗FAPα抗体的构象和晶体结构可以用于鉴定表位。在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合与本文所提供的任何抗FAPα抗体相同的表位的抗体。例如，在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗FAPα抗体相同的表位，该抗SIRPA抗体包含含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗FAPα抗体相同的表位，该抗FAPα抗体包含含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL。 [0298] 在一些实施方案中，本文提供了抗FAPα抗体或其抗原结合片段，该抗FAPα抗体或其抗原结合片段与本文所述的任何一种抗FAPα抗体竞争性地特异性地结合FAPα。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗FAPα抗体竞争性地特异性地结合FAPα，该抗FAPα抗体包含含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗FAPα抗体竞争性地特异性地结合FAPα，该抗FAPα抗体包含含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL。 [0299] 在一些实施方案中，本文提供了包含上文所述的任何一种抗FAPα抗体的FAPα结合蛋白。在一些实施方案中，FAPα结合蛋白是单克隆抗体，包括小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗FAPα抗体是抗体片段(例如，scFv)。在一些实施方案中，FAPα结合蛋白是包含本文所提供的抗FAPα抗体的融合蛋白。在其他实施方案中，FAPα结合蛋白是包含本文所提供的抗FAPα抗体的多特异性抗体。其他示例性FAPα结合分子在下面部分中更详细地描述。 [0300] 在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗FAPα抗体或抗原结合蛋白可以单独地或组合地并入任何特征，如下文所述。 [0301] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含具有增强的ADCC的Fc变体。在一些实施方案中，该Fc区包含在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、 244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、 268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、 330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、 361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、 401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、 440、442、444和/或447处的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0302] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含可以活化NK细胞的免疫细胞活化结构域。该免疫活化结构域可以通过促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导来活化免疫细胞。 [0303] 该免疫细胞活化结构域可以结合和/或调节免疫细胞上的受体。示例性受体包括NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 [0304] 在一些具体实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKG2D。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域衍生自NKG2D配体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICA的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICB的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 ULBP1的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是ULBP2 的胞外结构域或其片段或变体。 [0305] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:90具有至少75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:91具有至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:92具有至少75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:93具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0306] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKp46。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与NKp46结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、 LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0307] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TGFb。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:94具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0308] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TIGIT。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与TIGIT结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0309] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合PVRIG。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与PVRIG结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0310] 在一些具体实施方案中，本文所提供的结合分子如表4中所示。 [0311] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列。 [0312] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列。 [0313] 结合PD‑L1的示例性结合分子 [0314] PD‑L1是在HSC上表达的又另一种示例性抗原。在一些实施方案中，本发明结合分子中靶向HSC的结合结构域包含下文所述的抗PD‑L1抗体或其变体。 [0315] 在一些实施方案中，本文所提供的抗PD‑L1抗体以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、‑8 ‑8 ‑13 ‑9 ‑13≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10 M或更小，例如10 M至10 M，例如10 M至10 M) 的解离常数(KD)结合PD‑L1(例如，人PD‑L1)。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本公开的目的，包括通过RIA，例如用感兴趣的抗体的Fab形式及其抗原进行的(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865‑81)；通过生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定，通过 (使用例如 Red96系统)或通过 (使用例如 TM‑2000或 TM‑3000)。“缔合速率(on‑rate)”或“缔合速率 (rate of association)”或“缔合速率(association rate)”或“kon”也可以用上文所述的相同生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)技术使用例如 Red96、 TM‑2000或 TM‑3000系统来确定。 [0316] 在一些实施方案中，本文所提供的抗PD‑L1抗体是在下文第7部分中所描述的那些。因此，在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含SEQ ID NO:79和80的一个或多个CDR序列。可以根据熟知的编号系统确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，抗PD‑L1抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗PD‑L1抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0317] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:79所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:80所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。 [0318] 在其他实施方案中，本文提供了与PD‑L1结合的抗体，该抗体包含含有与SEQ ID NO:37具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR1；(ii)含有与SEQ ID NO:38具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR2；(iii)含有与SEQ ID NO:39具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR3；(iv)含有与SEQ ID NO:40具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR1；(v)含有与SEQ ID NO:41具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR2；和/或(vi)含有与SEQ ID NO:42具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗PD‑L1抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗PD‑L1抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0319] 在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。 [0320] 在一些实施方案中，该抗体还包含SEQ ID NO:79和80的一个或多个框架区。在一些实施方案中，本文所提供的抗体是人源化抗体。 [0321] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL。 [0322] 在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含相对于本文所提供的任何抗体(例如，在下文第7部分中所描述的那些)具有一定同一性百分比的氨基酸序列。 [0323] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗PD‑L1抗体保留与PD‑L1结合的能力。在一些实施方案中，在参考氨基酸序列中总共有1个至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，本文所提供的抗PD‑L1抗体包括参考序列的翻译后修饰。 [0324] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合PD‑L1。 [0325] 在一些实施方案中，可以例如通过组合丙氨酸扫描对功能表位作图，以鉴定PD‑L1蛋白中与本文所提供的抗PD‑L1抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，与PD‑L1结合的抗PD‑L1抗体的构象和晶体结构可以用于鉴定表位。在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合与本文所提供的任何抗PD‑L1抗体相同的表位的抗体。例如，在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗PD‑L1抗体相同的表位，该抗PD‑L1抗体包含含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL。 [0326] 在一些实施方案中，本文提供了抗PD‑L1抗体或其抗原结合片段，该抗PD‑L1抗体或其抗原结合片段与本文所述的任何一种抗PD‑L1抗体竞争性地特异性地结合PD‑L1。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗PD‑L1抗体竞争性地特异性地结合PD‑L1，该抗PD‑L1抗体包含含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL。 [0327] 在一些实施方案中，本文提供了包含上文所述的任何一种抗PD‑L1抗体的PD‑L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD‑L1结合蛋白是单克隆抗体，包括小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗PD‑L1抗体是抗体片段(例如，scFv)。在一些实施方案中，PD‑L1结合蛋白是包含本文所提供的抗PD‑L1抗体的融合蛋白。在其他实施方案中，PD‑L1结合蛋白是包含本文所提供的抗PD‑L1抗体的多特异性抗体。其他示例性PD‑L1结合分子在下面部分中更详细地描述。 [0328] 在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗PD‑L1抗体或抗原结合蛋白可以单独地或组合地并入任何特征，如下文所述。 [0329] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含具有增强的ADCC的Fc变体。在一些实施方案中，该Fc区包含在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、 244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、 268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、 330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、 361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、 401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、 440、442、444和/或447处的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0330] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含可以活化NK细胞的免疫细胞活化结构域。该免疫活化结构域可以通过促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导来活化免疫细胞。 [0331] 该免疫细胞活化结构域可以结合和/或调节免疫细胞上的受体。示例性受体包括NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 [0332] 在一些具体实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKG2D。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域衍生自NKG2D配体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICA的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICB的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 ULBP1的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是ULBP2 的胞外结构域或其片段或变体。 [0333] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:90具有至少75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:91具有至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:92具有至少75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:93具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0334] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKp46。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与NKp46结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、 LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0335] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TGFb。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:94具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0336] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TIGIT。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与TIGIT结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0337] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合PVRIG。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与PVRIG结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0338] 在一些具体实施方案中，本文所提供的结合分子如表4中所示。 [0339] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列。 [0340] 结合uPAR的示例性结合分子 [0341] uPAR是在HSC上表达的又另一种示例性抗原。在一些实施方案中，本发明结合分子中靶向HSC的结合结构域包含下文所述的抗uPAR抗体或其变体。 [0342] 在一些实施方案中，本文所提供的抗uPAR抗体以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、‑8 ‑8 ‑13 ‑9 ‑13≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10 M或更小，例如10 M至10 M，例如10 M至10 M) 的解离常数(KD)结合uPAR(例如，人uPAR)。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本公开的目的，包括通过RIA，例如用感兴趣的抗体的Fab形式及其抗原进行的(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865‑81)；通过生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定，通过 (使用例如 Red96系统)或通过 (使用例如 TM‑2000或 TM‑3000)。“缔合速率(on‑rate)”或“缔合速率 (rate of association)”或“缔合速率(association rate)”或“kon”也可以用上文所述的相同生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)技术使用例如 Red96、 TM‑2000或 TM‑3000系统来确定。 [0343] 在一些实施方案中，本文所提供的抗uPAR抗体是在下文第7部分中所描述的那些。因此，在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含SEQ ID NO:81和82的一个或多个CDR序列。可以根据熟知的编号系统确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，抗uPAR抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗uPAR抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0344] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:81所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:82所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。 [0345] 在其他实施方案中，本文提供了与uPAR结合的抗体，该抗体包含含有与SEQ ID NO:43具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR1；(ii)含有与SEQ ID NO:44具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR2；(iii)含有与SEQ ID NO:45具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR3；(iv)含有与SEQ ID NO:46具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR1；(v)含有与SEQ ID NO:47具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR2；和/或(vi)含有与SEQ ID NO:48具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗uPAR抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗uPAR抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0346] 在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。 [0347] 在一些实施方案中，该抗体还包含SEQ ID NO:81和82的一个或多个框架区。在一些实施方案中，本文所提供的抗体是人源化抗体。 [0348] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL。 [0349] 在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含相对于本文所提供的任何抗体(例如，在下文第7部分中所描述的那些)具有一定同一性百分比的氨基酸序列。 [0350] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗uPAR抗体保留与uPAR结合的能力。在一些实施方案中，在参考氨基酸序列中总共有1个至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，本文所提供的抗uPAR抗体包括参考序列的翻译后修饰。 [0351] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:81的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:82的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合uPAR。 [0352] 在一些实施方案中，可以例如通过组合丙氨酸扫描对功能表位作图，以鉴定uPAR蛋白中与本文所提供的抗uPAR抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，与uPAR 结合的抗uPAR抗体的构象和晶体结构可以用于鉴定表位。在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合与本文所提供的任何抗uPAR抗体相同的表位的抗体。例如，在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗uPAR抗体相同的表位，该抗uPAR抗体包含含有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL。 [0353] 在一些实施方案中，本文提供了抗uPAR抗体或其抗原结合片段，该抗uPAR抗体或其抗原结合片段与本文所述的任何一种抗uPAR抗体竞争性地特异性地结合uPAR。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗uPAR抗体竞争性地特异性地结合uPAR，该抗uPAR抗体包含含有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL。 [0354] 在一些实施方案中，本文提供了包含上文所述的任何一种抗uPAR抗体的uPAR结合蛋白。在一些实施方案中，uPAR结合蛋白是单克隆抗体，包括小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗uPAR抗体是抗体片段(例如，scFv)。在一些实施方案中，uPAR结合蛋白是包含本文所提供的抗uPAR抗体的融合蛋白。在其他实施方案中，uPAR结合蛋白是包含本文所提供的抗uPAR抗体的多特异性抗体。其他示例性uPAR结合分子在下面部分中更详细地描述。 [0355] 在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗uPAR抗体或抗原结合蛋白可以单独地或组合地并入任何特征，如下文所述。 [0356] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含具有增强的ADCC的Fc变体。在一些实施方案中，该Fc区包含在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、 244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、 268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、 330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、 361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、 401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、 440、442、444和/或447处的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0357] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含可以活化NK细胞的免疫细胞活化结构域。该免疫活化结构域可以通过促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导来活化免疫细胞。 [0358] 该免疫细胞活化结构域可以结合和/或调节免疫细胞上的受体。示例性受体包括NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 [0359] 在一些具体实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKG2D。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域衍生自NKG2D配体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICA的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICB的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 ULBP1的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是ULBP2 的胞外结构域或其片段或变体。 [0360] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:90具有至少75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:91具有至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:92具有至少75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:93具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0361] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKp46。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与NKp46结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、 LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0362] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TGFb。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:94具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0363] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TIGIT。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与TIGIT结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0364] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合PVRIG。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与PVRIG结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0365] 在一些具体实施方案中，本文所提供的结合分子如表4中所示。 [0366] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。 [0367] 结合IGF‑1R的示例性结合分子 [0368] IGF‑1R是在HSC上表达的又另一种示例性抗原。在一些实施方案中，本发明结合分子中靶向HSC的结合结构域包含下文所述的抗IGF‑1R抗体或其变体。 [0369] 在一些实施方案中，本文所提供的抗IGF‑1R抗体以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤‑8 ‑8 ‑13 ‑91nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10 M或更小，例如10 M至10 M，例如10 M至 ‑13 10 M)的解离常数(KD)结合IGF‑1R(例如，人IGF‑1R)。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本公开的目的，包括通过RIA，例如用感兴趣的抗体的Fab形式及其抗原进行的(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865‑81)；通过生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定，通过 (使用例如 Red96系统)或通过 (使用例如 TM‑2000或 TM‑3000)。“缔合速率(on‑rate)”或“缔合速率(rate of association)”或“缔合速率(association rate)”或“kon”也可以用上文所述的相同生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)技术使用例如 Red96、 TM‑2000或 TM‑3000系统来确定。 [0370] 在一些实施方案中，本文所提供的抗IGF‑1R抗体是在下文第7部分中所描述的那些。因此，在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含SEQ ID NO:83至86的一个或多个CDR序列。可以根据熟知的编号系统确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，抗IGF‑1R抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗IGF‑1R抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0371] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:83所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:84所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:85所示的HCDR1、HCDR2和 HCDR3、以及如SEQ ID NO:86所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。 [0372] 在其他实施方案中，本文提供了与IGF‑1R结合的抗体，该抗体包含含有与SEQ ID NO:49或55具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR1；(ii)含有与SEQ ID NO:50或56具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR2；(iii)含有与SEQ ID NO:51或57具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR3；(iv)含有与SEQ ID NO:52或58具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR1；(v)含有与SEQ ID NO:53或59具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR2；和/或(vi)含有与SEQ ID NO:54或60具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗IGF‑1R抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗IGF‑1R抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0373] 在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。 [0374] 在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。 [0375] 在一些实施方案中，该抗体还包含SEQ ID NO:83至86的一个或多个框架区。在一些实施方案中，本文所提供的抗体是人源化抗体。 [0376] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL。 [0377] 在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含相对于本文所提供的任何抗体(例如，在下文第7部分中所描述的那些)具有一定同一性百分比的氨基酸序列。 [0378] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗IGF‑1R抗体保留与IGF‑1R结合的能力。在一些实施方案中，在参考氨基酸序列中总共有1个至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，本文所提供的抗IGF‑1R抗体包括参考序列的翻译后修饰。 [0379] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:83的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:84的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合IGF‑1R。 [0380] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:85的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:86的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少 92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合IGF‑1R。 [0381] 在一些实施方案中，可以例如通过组合丙氨酸扫描对功能表位作图，以鉴定IGF‑1R蛋白中与本文所提供的抗IGF‑1R抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，与IGF‑1R结合的抗IGF‑1R抗体的构象和晶体结构可以用于鉴定表位。在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合与本文所提供的任何抗IGF‑1R抗体相同的表位的抗体。例如，在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗IGF‑1R抗体相同的表位，该抗IGF‑1R抗体包含含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗IGF‑1R抗体相同的表位，该抗IGF‑1R抗体包含含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL。 [0382] 在一些实施方案中，本文提供了抗IGF‑1R抗体或其抗原结合片段，该抗IGF‑1R抗体或其抗原结合片段与本文所述的任何一种抗IGF‑1R抗体竞争性地特异性地结合IGF‑1R。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗IGF‑1R抗体竞争性地特异性地结合IGF‑1R，该抗IGF‑1R抗体包含含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 84的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗IGF‑1R抗体竞争性地特异性地结合IGF‑1R，该抗IGF‑1R抗体包含含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL。 [0383] 在一些实施方案中，本文提供了包含上文所述的任何一种抗IGF‑1R抗体的IGF‑1R结合蛋白。在一些实施方案中，IGF‑1R结合蛋白是单克隆抗体，包括小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗IGF‑1R抗体是抗体片段(例如，scFv)。在一些实施方案中，IGF‑1R结合蛋白是包含本文所提供的抗IGF‑1R抗体的融合蛋白。在其他实施方案中，IGF‑1R结合蛋白是包含本文所提供的抗IGF‑1R抗体的多特异性抗体。其他示例性IGF‑1R结合分子在下面部分中更详细地描述。 [0384] 在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗IGF‑1R抗体或抗原结合蛋白可以单独地或组合地并入任何特征，如下文所述。 [0385] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含具有增强的ADCC的Fc变体。在一些实施方案中，该Fc区包含在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、 244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、 268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、 330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、 361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、 401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、 440、442、444和/或447处的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0386] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含可以活化NK细胞的免疫细胞活化结构域。该免疫活化结构域可以通过促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导来活化免疫细胞。 [0387] 该免疫细胞活化结构域可以结合和/或调节免疫细胞上的受体。示例性受体包括NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 [0388] 在一些具体实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKG2D。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域衍生自NKG2D配体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICA的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICB的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 ULBP1的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是ULBP2 的胞外结构域或其片段或变体。 [0389] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:90具有至少75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:91具有至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:92具有至少75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:93具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0390] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKp46。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与NKp46结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、 LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0391] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TGFb。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:94具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0392] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TIGIT。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与TIGIT结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0393] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合PVRIG。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与PVRIG结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0394] 在一些具体实施方案中，本文所提供的结合分子如表4中所示。 [0395] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列。 [0396] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列。 [0397] 结合ANTXR1的示例性结合分子 [0398] ANTXR1是在HSC上表达的又另一种示例性抗原。在一些实施方案中，本发明结合分子中靶向HSC的结合结构域包含下文所述的抗ANTXR1抗体或其变体。 [0399] 在一些实施方案中，本文所提供的抗ANTXR1抗体以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤‑8 ‑8 ‑13 ‑9 1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10 M或更小，例如10 M至10 M，例如10 M至 ‑13 10 M)的解离常数(KD)结合ANTXR1(例如，人ANTXR1)。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本公开的目的，包括通过RIA，例如用感兴趣的抗体的Fab形式及其抗原进行的(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865‑81)；通过生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定，通过 (使用例如 Red96系统)或通过 (使用例如 TM‑2000或 TM‑3000)。“缔合速率(on‑rate)”或“缔合速率(rate of association)”或“缔合速率(association rate)”或“kon”也可以用上文所述的相同生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)技术使用例如 Red96、 TM‑2000或 TM‑3000系统来确定。 [0400] 在一些实施方案中，本文所提供的抗ANTXR1抗体是在下文第7部分中所描述的那些。因此，在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含SEQ ID NO:225、226、233和234的一个或多个CDR序列。可以根据熟知的编号系统确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据 IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，抗ANTXR1抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗 ANTXR1抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0401] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:225所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:226所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:233所示的HCDR1、HCDR2和 HCDR3、以及如SEQ ID NO:234所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。 [0402] 在其他实施方案中，本文提供了与ANTXR1结合的抗体，该抗体包含含有与SEQ ID NO:227或235具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR1；(ii)含有与SEQ ID NO:228或236具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR2；(iii)含有与SEQ ID NO:229或237具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR3； (iv)含有与SEQ ID NO:230或238具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR1；(v)含有与SEQ ID NO:231或239具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR2；和/或(vi)含有与SEQ ID NO:232或240具有至少75％、80％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗ANTXR1抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗ANTXR1抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0403] 在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:229 的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列。在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO: 236的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:237的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:238的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:240的氨基酸序列。 [0404] 在一些实施方案中，该抗体还包含SEQ ID NO:225、226、233和234的一个或多个框架区。在一些实施方案中，本文所提供的抗体是人源化抗体。 [0405] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:225的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:226的氨基酸序列的VL。 [0406] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:233的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:234的氨基酸序列的VL。 [0407] 在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含相对于本文所提供的任何抗体(例如，在下文第7部分中所描述的那些)具有一定同一性百分比的氨基酸序列。 [0408] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗ANTXR1抗体保留与ANTXR1结合的能力。在一些实施方案中，在参考氨基酸序列中总共有1个至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，本文所提供的抗ANTXR1抗体包括参考序列的翻译后修饰。 [0409] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:225的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:226的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合ANTXR1。 [0410] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:233的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:234的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合ANTXR1。 [0411] 在一些实施方案中，可以例如通过组合丙氨酸扫描对功能表位作图，以鉴定ANTXR1蛋白中与本文所提供的抗ANTXR1抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，与ANTXR1结合的抗ANTXR1抗体的构象和晶体结构可以用于鉴定表位。在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合与本文所提供的任何抗ANTXR1抗体相同的表位的抗体。例如，在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗ANTXR1抗体相同的表位，该抗ANTXR1抗体包含含有SEQ ID NO:225的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:226的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗ANTXR1抗体相同的表位，该抗FAPα抗体包含含有SEQ ID NO:233的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:234的氨基酸序列的VL。 [0412] 在一些实施方案中，本文提供了抗ANTXR1抗体或其抗原结合片段，该抗ANTXR1抗体或其抗原结合片段与本文所述的任何一种抗ANTXR1抗体竞争性地特异性地结合ANTXR1。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗ANTXR1抗体竞争性地特异性地结合ANTXR1，该抗ANTXR1抗体包含含有SEQ ID NO:225的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:226的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗 ANTXR1抗体竞争性地特异性地结合ANTXR1，该抗ANTXR1抗体包含含有SEQ ID NO:233的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:234的氨基酸序列的VL。 [0413] 在一些实施方案中，本文提供了包含上文所述的任何一种抗ANTXR1抗体的ANTXR1结合蛋白。在一些实施方案中，ANTXR1结合蛋白是单克隆抗体，包括小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗ANTXR1抗体是抗体片段(例如，scFv)。在一些实施方案中，ANTXR1结合蛋白是包含本文所提供的抗ANTXR1抗体的融合蛋白。在其他实施方案中，ANTXR1结合蛋白是包含本文所提供的抗ANTXR1抗体的多特异性抗体。其他示例性 ANTXR1结合分子在下面部分中更详细地描述。 [0414] 在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗ANTXR1抗体或抗原结合蛋白可以单独地或组合地并入任何特征，如下文所述。 [0415] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含具有增强的ADCC的Fc变体。在一些实施方案中，该Fc区包含在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、 244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、 268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、 330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、 361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、 401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、 440、442、444和/或447处的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0416] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含可以活化NK细胞的免疫细胞活化结构域。该免疫活化结构域可以通过促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导来活化免疫细胞。 [0417] 该免疫细胞活化结构域可以结合和/或调节免疫细胞上的受体。示例性受体包括NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 [0418] 在一些具体实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKG2D。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域衍生自NKG2D配体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICA的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICB的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 ULBP1的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是ULBP2 的胞外结构域或其片段或变体。 [0419] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:90具有至少75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:91具有至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:92具有至少75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:93具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0420] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKp46。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与NKp46结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、 LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0421] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TGFb。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:94具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0422] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TIGIT。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与TIGIT结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0423] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合PVRIG。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与PVRIG结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0424] 在一些具体实施方案中，本文所提供的结合分子如表4中所示。 [0425] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:281的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:282的氨基酸序列。 [0426] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:283的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:284的氨基酸序列。 [0427] 结合CD248的示例性结合分子 [0428] CD248是在HSC上表达的又另一种示例性抗原。在一些实施方案中，本发明结合分子中靶向HSC的结合结构域包含下文所述的抗CD248抗体或其变体。 [0429] 在一些实施方案中，本文所提供的抗CD248抗体以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、‑8 ‑8 ‑13 ‑9 ‑13≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10 M或更小，例如10 M至10 M，例如10 M至10 M) 的解离常数(KD)结合CD248(例如，人CD248)。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本公开的目的，包括通过RIA，例如用感兴趣的抗体的Fab形式及其抗原进行的(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865‑81)；通过生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定，通过 (使用例如 Red96系统)或通过 (使用例如 TM‑2000或 TM‑3000)。“缔合速率(on‑rate)”或“缔合速率 (rate of association)”或“缔合速率(association rate)”或“kon”也可以用上文所述的相同生物层干涉测量(BLI)或表面等离子体共振(SPR)技术使用例如 Red96、 TM‑2000或 TM‑3000系统来确定。 [0430] 在一些实施方案中，本文所提供的抗CD248抗体是在下文第7部分中所描述的那些。因此，在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含SEQ ID NO:241、242、249和250的一个或多个CDR序列。可以根据熟知的编号系统确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据 IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，抗CD248抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD248抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0431] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:241所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:242所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:249所示的HCDR1、HCDR2和 HCDR3、以及如SEQ ID NO:250所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。 [0432] 在其他实施方案中，本文提供了与CD248结合的抗体，该抗体包含含有与SEQ ID NO:243或251具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR1；(ii)含有与SEQ ID NO:244或252具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR2；(iii)含有与SEQ ID NO:245或253具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR3； (iv)含有与SEQ ID NO:246或254具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR1；(v)含有与SEQ ID NO:247或255具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR2；和/或(vi)含有与SEQ ID NO:248或256具有至少75％、80％、85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗CD248抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD248抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0433] 在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:243的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:244的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:245 的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:246的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:247的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:248的氨基酸序列。在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO: 252的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:256的氨基酸序列。 [0434] 在一些实施方案中，该抗体还包含SEQ ID NO:241、242、249和250的一个或多个框架区。在一些实施方案中，本文所提供的抗体是人源化抗体。 [0435] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:241的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:242的氨基酸序列的VL。 [0436] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:249的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:250的氨基酸序列的VL。 [0437] 在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含相对于本文所提供的任何抗体(例如，在下文第7部分中所描述的那些)具有一定同一性百分比的氨基酸序列。 [0438] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗CD248抗体保留与CD248结合的能力。在一些实施方案中，在参考氨基酸序列中总共有1个至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，本文所提供的抗CD248抗体包括参考序列的翻译后修饰。 [0439] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:241的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:242的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合CD248。 [0440] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:249的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合CD248。 [0441] 在一些实施方案中，可以例如通过组合丙氨酸扫描对功能表位作图，以鉴定CD248蛋白中与本文所提供的抗CD248抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，与 CD248结合的抗CD248抗体的构象和晶体结构可以用于鉴定表位。在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合与本文所提供的任何抗CD248抗体相同的表位的抗体。例如，在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗CD248抗体相同的表位，该抗 CD248抗体包含含有SEQ ID NO:241的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:242的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗CD248抗体相同的表位，该抗CD248抗体包含含有SEQ ID NO:249的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:250的氨基酸序列的VL。 [0442] 在一些实施方案中，本文提供了抗CD248抗体或其抗原结合片段，该抗CD248抗体或其抗原结合片段与本文所述的任何一种抗CD248抗体竞争性地特异性地结合CD248。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗CD248抗体竞争性地特异性地结合 CD248，该抗CD248抗体包含含有SEQ ID NO:241的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:242的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗CD248抗体竞争性地特异性地结合CD248，该抗CD248抗体包含含有SEQ ID NO:249的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:250的氨基酸序列的VL。 [0443] 在一些实施方案中，本文提供了包含上文所述的任何一种抗CD248抗体的CD248结合蛋白。在一些实施方案中，CD248结合蛋白是单克隆抗体，包括小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗CD248抗体是抗体片段(例如，scFv)。在一些实施方案中，CD248结合蛋白是包含本文所提供的抗CD248抗体的融合蛋白。在其他实施方案中， CD248结合蛋白是包含本文所提供的抗CD248抗体的多特异性抗体。其他示例性CD248结合分子在下面部分中更详细地描述。 [0444] 在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗CD248抗体或抗原结合蛋白可以单独地或组合地并入任何特征，如下文所述。 [0445] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含具有增强的ADCC的Fc变体。在一些实施方案中，该Fc区包含在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、 244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、 268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、 330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、 361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、 401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、 440、442、444和/或447处的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0446] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含可以活化NK细胞的免疫细胞活化结构域。该免疫活化结构域可以通过促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导来活化免疫细胞。 [0447] 该免疫细胞活化结构域可以结合和/或调节免疫细胞上的受体。示例性受体包括NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 [0448] 在一些具体实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKG2D。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域衍生自NKG2D配体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICA的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICB的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 ULBP1的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是ULBP2 的胞外结构域或其片段或变体。 [0449] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:90具有至少75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:91具有至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:92具有至少75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:93具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0450] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKp46。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与NKp46结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、 LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0451] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TGFb。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:94具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0452] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TIGIT。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与TIGIT结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0453] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合PVRIG。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与PVRIG结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0454] 在一些具体实施方案中，本文所提供的结合分子如表4中所示。 [0455] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:285的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:286的氨基酸序列。 [0456] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:287的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:288的氨基酸序列。 [0457] 结合GPC3的示例性结合分子 [0458] GPC3是在HSC上表达的又另一种示例性抗原。在一些实施方案中，本发明结合分子中靶向HSC的结合结构域包含下文所述的抗GPC3抗体或其变体。 [0459] 在一些实施方案中，本文所提供的抗GPC3抗体以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、‑8 ‑8 ‑13 ‑9 ‑13≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10 M或更小，例如10 M至10 M，例如10 M至10 M) 的解离常数(KD)结合GPC3(例如，人GPC3)。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本公开的目的，包括通过RIA，例如用感兴趣的抗体的Fab形式及其抗原进行的(Chen等人,1999,J.Mol Biol 293:865‑81)；通过生物层干涉测量法(BLI)或表面等离子体共振(SPR)测定，通过 (使用例如 Red96系统)或通过 (使用例如 TM‑2000或 TM‑3000)。“缔合速率(on‑rate)”或“缔合速率 (rate of association)”或“缔合速率(association rate)”或“kon”也可以用上文所述的相同生物层干涉测量(BLI)或表面等离子体共振(SPR)技术使用例如 Red96、 TM‑2000或 TM‑3000系统来确定。 [0460] 在一些实施方案中，本文所提供的抗GPC3抗体是在下文第7部分中所描述的那些。因此，在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含SEQ ID NO:257和258的一个或多个CDR序列。可以根据熟知的编号系统确定CDR序列。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，抗GPC3抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗GPC3抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0461] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO:257所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:258所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。 [0462] 在其他实施方案中，本文提供了与GPC3结合的抗体，该抗体包含含有与SEQ ID NO:259具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR1；(ii)含有与SEQ ID NO:260具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR2；(iii)含有与SEQ ID NO:261具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的HCDR3；(iv)含有与SEQ ID NO:262具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR1；(v)含有与SEQ ID NO:263具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR2；和/或(vi)含有与SEQ ID NO:264具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗GPC3抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗GPC3抗体包含接受者人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。 [0463] 在一些实施方案中，在本文所提供的抗体或抗原结合片段中，HCDR1包含SEQ ID NO:259的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:260的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:261 的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:262的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:263的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:264的氨基酸序列。 [0464] 在一些实施方案中，该抗体还包含SEQ ID NO:257和258的一个或多个框架区。在一些实施方案中，本文所提供的抗体是人源化抗体。 [0465] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:258的氨基酸序列的VL。 [0466] 在某些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含相对于本文所提供的任何抗体(例如，在下文第7部分中所描述的那些)具有一定同一性百分比的氨基酸序列。 [0467] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗GPC3抗体保留与GPC3结合的能力。在一些实施方案中，在参考氨基酸序列中总共有1个至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，本文所提供的抗GPC3抗体包括参考序列的翻译后修饰。 [0468] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO:257的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH结构域和与SEQ ID NO:258的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL结构域，并且该抗体或抗原结合片段结合GPC3。 [0469] 在一些实施方案中，可以例如通过组合丙氨酸扫描对功能表位作图，以鉴定GPC3蛋白中与本文所提供的抗GPC3抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施方案中，与GPC3 结合的抗GPC3抗体的构象和晶体结构可以用于鉴定表位。在一些实施方案中，本公开提供了特异性地结合与本文所提供的任何抗GPC3抗体相同的表位的抗体。例如，在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合与抗GPC3抗体相同的表位，该抗GPC3抗体包含含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:258的氨基酸序列的VL。 [0470] 在一些实施方案中，本文提供了抗GPC3抗体或其抗原结合片段，该抗GPC3抗体或其抗原结合片段与本文所述的任何一种抗GPC3抗体竞争性地特异性地结合GPC3。在一些实施方案中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与抗GPC3抗体竞争性地特异性地结合GPC3，该抗GPC3抗体包含含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:258的氨基酸序列的VL。 [0471] 在一些实施方案中，本文提供了包含上文所述的任何一种抗GPC3抗体的GPC3结合蛋白。在一些实施方案中，GPC3结合蛋白是单克隆抗体，包括小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗GPC3抗体是抗体片段(例如，scFv)。在一些实施方案中，GPC3结合蛋白是包含本文所提供的抗GPC3抗体的融合蛋白。在其他实施方案中，GPC3结合蛋白是包含本文所提供的抗GPC3抗体的多特异性抗体。其他示例性GPC3结合分子在下面部分中更详细地描述。 [0472] 在一些实施方案中，根据任何上述实施方案的抗GPC3抗体或抗原结合蛋白可以单独地或组合地并入任何特征，如下文所述。 [0473] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含具有增强的ADCC的Fc变体。在一些实施方案中，该Fc区包含在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、 244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、 268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、 330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、 361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、 401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、 440、442、444和/或447处的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0474] 在一些实施方案中，上文所述的抗体包含可以活化NK细胞的免疫细胞活化结构域。该免疫活化结构域可以通过促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导来活化免疫细胞。 [0475] 该免疫细胞活化结构域可以结合和/或调节免疫细胞上的受体。示例性受体包括NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 [0476] 在一些具体实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKG2D。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域衍生自NKG2D配体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICA的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICB的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 ULBP1的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是ULBP2 的胞外结构域或其片段或变体。 [0477] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:90具有至少75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:91具有至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:92具有至少75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:93具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0478] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKp46。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与NKp46结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、 LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0479] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TGFb。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:94具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0480] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TIGIT。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与TIGIT结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0481] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合PVRIG。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与PVRIG结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0482] 在一些具体实施方案中，本文所提供的结合分子如表4中所示。 [0483] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链和第二链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:289的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:290的氨基酸序列。 [0484] 结合NKG2D配体的示例性结合分子 [0485] 在某些实施方案中，与HSC抗原结合的结合结构域本身不是抗体或不衍生自抗体。在一些实施方案中，与HSC抗原结合的结合结构域衍生自与HSC上的细胞表面抗原结合的天然配体或受体。例如，在一些实施方案中，在HSC上表达的抗原是NKG2D配体，诸如MICA、 MICB、ULBP1或ULBP2。在一些实施方案中，本发明结合分子中的结合结构域包含NKG2D胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，结合结构域包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，结合结构域包含与SEQ ID NO:89具有至少75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0486] 在一些实施方案中，结合结构域与具有增强的ADCC的Fc变体融合(直接地或通过肽接头)。在一些实施方案中，该Fc区包含在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、 239、240、241、243、244、245、246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、 265、266、267、268、268、269、270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、 294、295、296、297、298、299、300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、 326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、 356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、 392、396、398、400、401、413、414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、 436、437、438、439、440、442、444和/或447处的一个或多个突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含S239D/A330L/I332E突变。在一些实施方案中，该Fc区包含L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变。在一些实施方案中，该Fc区包含F243L/R292P/Y300L突变。 [0487] 在一些实施方案中，上文所述的结合分子包含可以活化NK细胞的免疫细胞活化结构域。该免疫活化结构域可以通过促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导来活化免疫细胞。 [0488] 该免疫细胞活化结构域可以结合和/或调节免疫细胞上的受体。示例性受体包括NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 [0489] 在一些具体实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKG2D。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域衍生自NKG2D配体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICA的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是MICB的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是 ULBP1的胞外结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域是ULBP2 的胞外结构域或其片段或变体。 [0490] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:90具有至少75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:91具有至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:92具有至少75％、80％、85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:93具有至少75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0491] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合NKp46。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与NKp46结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、 LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0492] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TGFb。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与SEQ ID NO:94具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。 [0493] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合TIGIT。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与TIGIT结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0494] 在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域结合PVRIG。在一些实施方案中，该免疫细胞活化结构域包含与PVRIG结合的抗体(包括抗原结合片段)。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR序列可以根据熟知的编号系统或其组合来确定。在一些实施方案中，CDR是根据IMGT编号的。在一些实施方案中，CDR是根据Kabat编号的。在一些实施方案中，CDR是根据AbM编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Chothia编号的。在其他实施方案中，CDR是根据Contact编号的。在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0495] 在一些具体实施方案中，本文所提供的结合分子如表4中所示。 [0496] 在具体实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的结合分子。在具体实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的结合分子。在具体实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的结合分子。在具体实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的结合分子。在具体实施方案中，本文提供了包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的结合分子。 [0497] 在具体实施方案中，本文提供了包含第一链、第二链和第三链的结合分子，该第一链包含SEQ ID NO:297的氨基酸序列，该第二链包含SEQ ID NO:298的氨基酸序列，该第三链包含SEQ ID NO:299的氨基酸序列。 [0498] 人源化抗体 [0499] 本文所述的抗体包括人源化抗体。人源化抗体(诸如本文所公开的人源化抗体)可以使用本领域已知的多种技术产生，这些技术包括但不限于CDR移植(欧洲专利号EP 239, 400；国际公开号WO 91/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、贴面或表面修整(欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,Molecular Immunology 28(4/ 5):489‑498(1991)；Studnicka等人,Protein Engineering 7(6):805‑814(1994)；以及 Roguska等人,PNAS 91:969‑973(1994))、链改组(美国专利号5,565,332)以及在以下文献中所公开的技术：例如美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、WO 9317105；Tan等人,J.Immunol.169:1119 25(2002)；Caldas等人,Protein Eng.13(5):353‑60(2000)； Morea等人,Methods 20(3):267 79(2000)；Baca等人,J.Biol.Chem.272(16):10678‑84 (1997)；Roguska等人,Protein Eng.9(10):895904(1996)；Couto等人,Cancer Res.55(23 增刊):5973s‑5977s(1995)；Couto等人,Cancer Res.55(8):1717‑22(1995)；Sandhu JS,Gene 150(2):409‑10(1994)；以及Pedersen等人,J.Mol.Biol.235(3):959‑73(1994)。还参见美国专利公开号US2005/0042664 A1(2005年2月24日)，其每一篇以引用的方式整体并入本文。 [0500] 用于将非人抗体人源化的各种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可以具有引入其中的来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。人源化可以按照例如Jones等人,Nature 321: 522‑25(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323‑27(1988)；以及Verhoeyen等人,Science 239:1534‑36(1988)的方法通过将高变区序列取代为人抗体的对应序列来进行。在具体实施方案中，本文所提供的抗体的人源化如在下文第6部分中所描述的进行。 [0501] 在一些情况下，通过CDR移植构建人源化抗体，其中将亲本非人抗体的CDR的氨基酸序列移植到人抗体框架上。例如，Padlan等人确定CDR中仅约三分之一的残基实际上接触抗原，并且将这些称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等人,FASEB J.9:133‑39(1995))。在SDR移植的技术中，仅SDR残基被移植到人抗体框架上(参见例如，Kashmiri等人,Methods 36:25‑34(2005))。 [0502] 用于制备人源化抗体的人可变结构域的选择可能对于降低抗原性是重要的。例如，根据所谓的“最佳匹配”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选非人抗体的可变结构域的序列。可以选择最接近非人抗体序列的人序列作为人源化抗体的人框架 (Sims等人,J.Immunol.151:2296‑308(1993)；以及Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901‑17(1987))。另一种方法使用从轻链或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285‑89(1992)；以及Presta等人,J.Immunol.151:2623‑32(1993))。在一些情况下，框架衍生自最丰富的人亚类VL6亚组I(VL6I)和VH亚组III(VHIII)的共有序列。在另一种方法中，使用人种系基因作为框架区的来源。 [0503] 在基于CDR的比较的替代性范例(称为超人源化)中，FR同源性是不相关的。该方法由非人序列与功能性人种系基因库的比较组成。然后选择编码与鼠序列相同或密切相关的典型结构的那些基因。接下来，在与非人抗体共享典型结构的基因内，选择在CDR内具有最高同源性的那些作为FR供体。最后，将非人CDR移植到这些FR上(参见例如，Tan等人, J.Immunol.169:1119‑25(2002))。 [0504] 通常还期望抗体被人源化并保留其对抗原的亲和力和其他有利的生物特性。为了实现这一目标，根据一种方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。计算机程序是可获得的，其说明和展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。这些包括例如WAM(Whitelegg和Rees,Protein Eng.13:819‑24 (2002))、Modeller(Sali和Blundell,J.Mol.Biol.234:779‑815(1993))和Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch,Electrophoresis 18:2714‑23(1997))。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从接受者序列和输入序列中选择和组合FR残基，从而实现所需的抗体特征，诸如对靶抗原的增加的亲和力。一般来讲，高变区残基直接且最主要地参与影响抗原结合。 [0505] 抗体人源化的另一种方法是基于称为人串含量(Human String Content，HSC)的抗体人性的度量。该方法将小鼠序列与人种系基因的库进行比较，并且将差异评分为HSC。然后靶序列通过以下方式进行人源化：使该靶序列的HSC最大化而不是使用全局同一性量度来产生多个不同的人源化变体(Lazar等人,Mol.Immunol.44:1986‑98(2007))。 [0506] 除了上文所述的方法之外，经验方法可以用于产生和选择人源化抗体。这些方法包括基于产生人源化变体的大文库和使用富集技术或高通量筛选技术选择最佳克隆的那些方法。抗体变体可以从噬菌体、核糖体和酵母展示文库中以及通过细菌菌落筛选来分离 (参见例如，Hoogenboom,Nat.Biotechnol.23:1105‑16(2005)；Dufner等人,Trends Biotechnol.24:523‑29(2006)；Feldhaus等人,Nat.Biotechnol.21:163‑70(2003)；以及Schlapschy等人,Protein Eng.Des.Sel.17:847‑60(2004))。 [0507] 在FR文库方法中，在FR中的特定位置处引入残基变体的集合，随后筛选文库以选择最佳支持移植CDR的FR。待取代的残基可以包括被鉴定为潜在地促成CDR结构的 “Vernier”残基中的一些或全部(参见例如，Foote和Winter,J.Mol.Biol.224:487‑99 (1992))，或来自由以下文献中所鉴定的更有限的靶残基集合：Baca等人J.Biol.Chem.272: 10678‑84(1997)。 [0508] 在FR改组中，将整个FR与非人CDR组合，而不是产生选定残基变体的组合文库(参见例如，Dall’Acqua等人,Methods 36:43‑60(2005))。可以使用一步FR改组过程。这种过程已被证明是有效的，因为所得抗体表现出改善的生物化学和物理化学特性，包括增强的表达、增强的亲和力和热稳定性(参见例如，Damschroder等人,Mol.Immunol.44:3049‑60 (2007))。 [0509] “人工程化(humaneering)”方法基于基本最小特异性决定簇(MSD)的实验鉴定，并且基于将非人片段连续置换到人FR文库中和结合的评估。该方法学典型地导致表位保留和鉴定来自具有不同人V区段CDR的多个亚类的抗体。 [0510] “人工程化”方法涉及通过对抗体的氨基酸序列进行特定改变来改变非人抗体或抗体片段，以便产生在人体内具有降低的免疫原性的经修饰的抗体，其仍然保留原始非人抗体的期望结合特性。通常，该技术涉及将非人抗体的氨基酸残基分类为“低风险”残基、“中风险”残基或“高风险”残基。使用总体风险/回报计算来进行分类，该总体风险/回报计算评价进行特定取代的预测益处(例如，对于人体内的免疫原性)针对取代将影响所得抗体折叠的风险。可以通过将来自非人抗体可变区的氨基酸序列与特定或共有人抗体序列的对应区域进行比对来选择在非人抗体序列的给定位置(例如，低风险或中风险)处要被取代的特定人氨基酸残基。根据比对，可以将非人序列中的低风险或中风险位置处的氨基酸残基取代为人抗体序列中的对应残基。在以下文献中更详细地描述了用于制备人工程化蛋白质的技术：Studnicka等人,Protein Engineering 7:805‑14(1994)；美国专利号5,766,886； 5,770,196；5,821,123；和5,869,619；以及PCT公开WO 93/11794。 [0511] 可以使用例如Composite Human AntibodyTM技术(Antitope有限公司，英国剑桥)来产生复合人抗体。为了产生复合人抗体，以避免T细胞表位的方式从多个人抗体可变区序列的片段设计可变区序列，从而最小化所得抗体的免疫原性。 [0512] 去免疫抗体是其中已去除T细胞表位的抗体。已经描述了用于制备去免疫抗体的方法。参见例如，Jones等人,Methods Mol Biol.525:405‑23(2009),xiv；以及De Groot等人,Cell.Immunol.244:148‑153(2006))。去免疫抗体包含T细胞表位缺失的可变区和人恒定区。简言之，将抗体的可变区克隆，并且随后通过在T细胞增殖测定中测试从抗体可变区衍生的重叠肽来鉴定T细胞表位。通过计算机模拟方法鉴定T细胞表位以鉴定与人MHC II类结合的肽。在可变区中引入突变以消除与人MHC II类的结合。然后利用突变的可变区来产生去免疫抗体。 [0513] 抗体变体 [0514] 在一些实施方案中，设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能期望优化抗体的结合亲和力和/或其他生物特性，包括但不限于特异性、热稳定性、表达水平、糖基化、降低的免疫原性或溶解度。因此，除了本文所述的抗体之外，预期可以制备本文所述的抗体的变体。例如，可以通过将适当的核苷酸改变引入编码DNA中和/或通过合成所需抗体或多肽来制备抗体变体。本领域技术人员理解氨基酸变化可能改变抗体的翻译后过程。 [0515] 在一些实施方案中，本文所提供的抗体是化学修饰的，例如通过任何类型的分子与抗体的共价连接。抗体衍生物可以包括已经被化学修饰的抗体，该化学修饰例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质的连接、或与一个或多个免疫球蛋白结构域(例如，Fc或Fc的一部分)的缀合进行。许多化学修饰中的任何一种可以通过已知技术进行，这些技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰基化、配制、衣霉素的代谢合成等等。另外，抗体可以含有一个或多个非经典的氨基酸。 [0516] 在一些实施方案中，改变本文所提供的抗体以增加或减少抗体被糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列使得产生或去除一个或多个糖基化位点来方便地实现糖基化位点的添加或缺失。 [0517] 当本文所提供的抗体与Fc区融合时，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体典型地包含分支的双触角寡糖，其通常通过N连接与Fc区的CH2结构域的Asn297连接。参见例如，Wright等人TIBTECH 15:26‑32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N‑乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸、以及与双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本文所提供的结合分子中的寡糖进行修饰，以便产生具有某些改善的特性的变体。 [0518] 在其他实施方案中，当本文所提供的抗体与Fc区融合时，本文所提供的抗体变体可以具有缺乏与所述Fc区(直接地或间接地)连接的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，在这种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量通过以下方式来确定：相对于与Asn 297连接的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，计算在糖链内在Asn297处岩藻糖的平均量，如通过MALDI‑TOF质谱法所测量的，例如如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297(Fc区残基的EU编号)处的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸处，即，在位置294与位置300之间，这是由于抗体中微小的序列变异。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如，美国专利公开号US2003/0157108和US2004/0093621。与“脱岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体有关的出版物的实例包括：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US2004/0093621； US2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119； WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140； Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239‑1249(2004)；Yamane‑Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87: 614(2004)。能够产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的 Lec13 CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533‑545(1986)；美国专利申请号 US2003/0157108；和WO 2004/056312)，以及敲除细胞系，诸如α‑1,6‑岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见例如，Yamane‑Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680‑688(2006)；和WO2003/085107)。 [0519] 包含本文所提供的抗体的结合分子还提供有二等分寡糖，例如，其中与Fc区连接的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean‑Mairet等人)；美国专利号6,602, 684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)中。还提供了与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类变体可以具有改善的CDC功能。此类变体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764中。 [0520] 半衰期增加的和对负责将母体IgG转移到胎儿中的新生儿Fc受体(FcRn)的结合改善的结合分子(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)以及Kim等人,J.Immunol.24:249 (1994))描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。那些分子包含其中具有一个或多个取代的Fc区，该一个或多个取代改善Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括具有在一个或多个以下Fc区残基处的取代的那些Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、 340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。关于Fc区变体的其他实例，还参见Duncan和Winter,Nature 322:738‑40 (1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。 [0521] 在一些实施方案中，可能期望产生半胱氨酸工程化抗体，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在一些实施方案中，取代的残基出现在抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性巯基基团由此定位于抗体的可及位点，并且可以用于将抗体缀合至其他部分，诸如药物部分或接头‑药物部分，以产生免疫缀合物，如本文进一步所描述。 [0522] 变异可以是编码抗体或多肽的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，其导致与原始抗体或多肽相比氨基酸序列的改变。取代诱变的感兴趣位点包括CDR和FR。 [0523] 氨基酸取代可以是将一种氨基酸置换为具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸(诸如将亮氨酸置换为丝氨酸，例如保守氨基酸置换)的结果。可以使用本领域技术人员已知的标准技术在编码本文所提供的分子的核苷酸序列中引入突变，包括例如导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。插入或缺失可以任选地在约1个至5个氨基酸的范围内。在某些实施方案中，取代、缺失或插入包括相对于原始分子少于25个氨基酸取代、少于 20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在具体实施方案中，取代是在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行的保守氨基酸取代。可以通过在序列中系统地进行氨基酸的插入、缺失或取代并且测试所得变体的由亲本抗体所表现出的活性来确定所允许的变异。 [0524] 氨基酸序列插入包括长度为一个残基到含有多个残基的多肽范围内的氨基末端和/或羧基末端融合、以及单个氨基酸残基或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。 [0525] 通过保守氨基酸取代产生的抗体包括在本公开中。在保守氨基酸取代中，氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基置换。如上文所述，在本领域中已经定义了具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。可替代地，可以诸如通过饱和诱变，沿全部或部分编码序列随机地引入突变，并且可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。在诱变后，可以表达所编码的蛋白质，并且可以确定蛋白质的活性。可以进行保守取代(例如，在具有相似特性和/或侧链的氨基酸基团内)，以便维持该特性或不显著改变该特性。下表中显示了示例性取代。 [0526] [0527] 氨基酸可以根据它们侧链的特性的相似性来分组(参见例如，Lehninger,Biochemistry 73‑75(第2版，1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；和(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。可替代地，天然存在的残基可以基于共同的侧链特性而分成几组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。例如，不参与维持抗体的正确构象的任何半胱氨酸残基也可以例如被另一种氨基酸(诸如丙氨酸或丝氨酸)取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。非保守性取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。 [0528] 一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体在某些生物学特性(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)方面将具有修饰(例如，改善)，并且/或者将基本上保留亲本抗体的某些生物特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如，本文所述的那些)方便地产生。简言之，使一个或多个CDR残基突变，并且将变体抗体展示在噬菌体上并筛选特定生物学活性(例如结合亲和力)。 [0529] 可以在CDR中进行改变(例如，取代)，例如，以改善抗体亲和力。此类改变可以在CDR“热点”(即，在体细胞成熟过程期间由以高频率经历突变的密码子编码的残基)(参见例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179‑196(2008))和/或SDR(a‑CDR)中进行，其中测试所得变体抗体或其片段的结合亲和力。例如在Hoogenboom等人于Methods in Molecular Biology 178:1‑37(O’Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中已经描述了通过构建和从二级文库中重新选择的亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任何一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及针对CDR的方法，其中将几个CDR残基(例如，一次4个至6个残基)随机化。例如使用丙氨酸扫描诱变或建模，可以特异性地鉴定参与抗原结合的 CDR残基。在下文部分中提供了关于亲和力成熟的更详细描述。 [0530] 在一些实施方案中，取代、插入或缺失可能发生在一个或多个CDR内，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文所提供的保守取代)。在本文所提供的变体抗体序列的一些实施方案中，每个CDR是未改变的，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。 [0531] 用于鉴定可以被靶向用于诱变的抗体的残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells,Science,244:1081‑1085(1989)所述。在该方法中，鉴定一个残基或一组靶残基(例如，带电荷的残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并且将其用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)置换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始取代表现出功能敏感性的氨基酸位置处引入另外的取代。可替代地或另外地，抗原‑抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体与抗原之间的接触点。此类接触残基和相邻残基可以作为用于取代的候选物被靶向或清除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。 [0532] 氨基酸序列插入包括长度为一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽范围内的氨基末端和/或羧基末端融合、以及单个氨基酸残基或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N 末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽的融合。 [0533] 可以使用本领域已知的方法，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来进行变异。定点诱变(参见例如，Carter,Biochem J.237:1‑7(1986)；以及Zoller等人,Nucl.Acids Res.10:6487‑500(1982))、盒式诱变(参见例如，Wells等人,Gene 34:315‑ 23(1985))或其他已知技术可以在克隆的DNA上进行，以产生抗体变体DNA。 [0534] 体外亲和力成熟 [0535] 在一些实施方案中，与亲本抗体相比具有改善的特性(诸如亲和力、稳定性或表达水平)的抗体变体可以通过体外亲和力成熟来制备。与天然原型一样，体外亲和力成熟基于突变和选择的原理。抗体文库展示在生物体(例如，噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞)的表面上或与其编码mRNA或DNA缔合(例如，共价地或非共价地)。所展示的抗体的亲和力选择允许分离携带编码抗体的遗传信息的生物体或复合物。使用展示方法(诸如噬菌体展示)的两轮或三轮突变和选择通常产生具有低纳摩尔范围的亲和力的抗体片段。亲和力成熟的抗体可以对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。 [0536] 噬菌体展示是广泛用于展示和选择抗体的方法。抗体作为与细菌噬菌体衣壳蛋白的融合物展示在Fd或M13细菌噬菌体的表面上。选择涉及暴露于抗原以允许噬菌体展示的抗体结合它们的靶标，该过程被称为“淘选(panning)”。回收与抗原结合的噬菌体并且将其用于感染细菌以产生噬菌体用于另外轮的选择。关于综述，参见例如，Hoogenboom, Methods.Mol.Biol.178:1‑37(2002)；以及Bradbury和Marks,J.Immunol.Methods 290:29‑ 49(2004)。 [0537] 在酵母展示系统(参见例如，Boder等人,Nat.Biotech.15:553–57(1997)；以及Chao等人,Nat.Protocols 1:755‑68(2006))中，该抗体可以与酵母凝集素蛋白Aga2p的粘附亚基融合，该粘附亚基通过与Aga1p的二硫键连接到酵母细胞壁上。蛋白质通过Aga2p的展示使蛋白质从细胞表面突出，从而最小化与酵母细胞壁上的其他分子的潜在相互作用。使用磁分离和流式细胞术来筛选文库，以选择具有改善的亲和力或稳定性的抗体。通过用生物素化抗原和第二试剂(诸如与荧光团缀合的链霉亲和素)标记酵母来确定与感兴趣的可溶性抗原的结合。可以通过单链抗体(例如，scFv)侧翼的血凝素或c‑Myc标签的免疫荧光标记来测量抗体表面表达的变异。已经显示表达与展示的蛋白质的稳定性相关，因此可以针对改善的稳定性以及亲和力来选择抗体(参见例如，Shusta等人,J.Mol.Biol.292:949‑ 56(1999))。酵母展示的另一个优点是展示的蛋白质在真核酵母细胞的内质网中折叠，利用内质网伴侣分子和质量控制机制。一旦成熟完成，抗体亲和力就可以被方便地“滴定”，同时展示在酵母表面上，清除了对每个克隆的表达和纯化的需要。酵母表面展示的理论限制是潜在地比其他展示方法更小的功能文库大小；然而，最近的方法使用酵母细胞的交配系统 14 来产生估计大小为10 的组合多样性(参见例如，美国专利公开2003/0186374；以及Blaise 等人,Gene 342:211–18(2004))。 [0538] 在核糖体展示中，产生抗体‑核糖体‑mRNA(ARM)复合物用于在无细胞系统中进行选择。将编码特定抗体文库的DNA文库与缺乏终止密码子的间隔区序列基因融合。当翻译时，该间隔区序列仍然连接到肽基tRNA上并占据核糖体通道，因此允许感兴趣的蛋白质从核糖体突出并折叠。所得的mRNA、核糖体和蛋白质复合物可以与表面结合的配体结合，从而允许通过用配体进行亲和力捕获而同时分离抗体及其编码mRNA。核糖体结合的mRNA然后被逆转录回cDNA，该cDNA然后可以经历诱变并且用于下一轮选择(参见例如，Fukuda等人, Nucleic Acids Res.34:e127(2006))。在mRNA展示中，使用嘌呤霉素作为衔接分子来建立抗体与mRNA之间的共价键(Wilson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:3750‑55(2001))。 [0539] 由于这些方法是完全在体外进行的，所以它们提供了优于其他选择技术的两个主要优点。首先，文库的多样性不受细菌细胞的转化效率所限制，而是仅受在试管中存在的核糖体和不同mRNA分子的数目所限制。第二，随机突变可以在每轮选择之后容易地引入，例如通过非校对聚合酶，因为在任何多样化步骤之后不必转化文库。 [0540] 在一些实施方案中，可以使用哺乳动物展示系统。 [0541] 也可以以靶向方式或通过随机引入将多样性引入抗体文库的CDR中。前一种方法包括通过高水平或低水平的诱变顺序地靶向抗体的所有CDR、或者靶向体细胞超突变的分离热点(参见例如，Ho等人,J.Biol.Chem.280:607‑17(2005))或基于实验基础或结构原因怀疑影响亲和力的残基。也可以通过DNA改组或类似技术置换天然具有多样性的区域来引入多样性(参见例如，Lu等人,J.Biol.Chem.278:43496‑507(2003)；美国专利号5,565,332和6,989,250)。靶向延伸到框架区残基中的高变环的替代性技术(参见例如，Bond等人, J.Mol.Biol.348:699‑709(2005))采用CDR中的环缺失和插入或者使用基于杂交的多样化 (参见例如，美国专利公开号2004/0005709)。在CDR中产生多样性的另外方法公开于例如美国专利号7,985,840中。可以用于产生抗体文库和/或抗体亲和力成熟的另外方法公开于例如美国专利号8,685,897和8,603,930以及美国公开号2014/0170705、2014/0094392、2012/ 0028301、2011/0183855和2009/0075378中，其各自以引用的方式并入本文。 [0542] 文库的筛选可以通过本领域已知的各种技术来完成。例如，可以将抗体固定到固体支持物、柱、针或纤维素/聚(偏二氟乙烯)膜/其他过滤器上，在附着于吸附板上的宿主细胞上表达或用于细胞分选，或者缀合到生物素上用于用链霉亲和素包被的珠进行捕获或用于任何其他淘选展示文库的方法中。 [0543] 关于体外亲和力成熟方法的综述，参见例如Hoogenboom,Nature Biotechnology 23:1105‑16(2005)；Quiroz和Sinclair,Revista Ingeneria Biomedia4:39‑51(2010)；以及其中的参考文献。 [0544] 抗体的修饰 [0545] 抗体的共价修饰被包括在本公开的范围内。共价修饰包括使抗体的靶向氨基酸残基与能够与抗体的选定侧链或N末端或C末端残基反应的有机衍生化药剂反应。其他修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为对应的谷氨酰和天冬氨酰残基；脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰残基或苏氨酰残基的羟基基团的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α‑氨基基团的甲基化(参见例如，Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties 79‑86(1983))；N末端胺的乙酰化；和任何C末端羧基基团的酰胺化。 [0546] 包括在本公开范围内的其他类型的共价修饰包括如上文所述改变抗体或多肽的天然糖基化模式(参见例如，Beck等人,Curr.Pharm.Biotechnol.9:482‑501(2008)；以及 Walsh,Drug Discov.Today 15:773‑80(2010))，并且以例如在以下文献中所阐述的方式将抗体连接至多种非蛋白质聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯)中的一种：美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337。本公开的抗体还可以被基因融合或缀合至一个或多个免疫球蛋白恒定区或其部分(例如，Fc)，以延长半衰期和/或赋予已知的Fc介导的效应子功能。 [0547] 本公开的抗体还可以被修饰以形成包含抗体的嵌合分子，该抗体与另一种异源多肽或氨基酸序列(例如，表位标签)(参见例如，Terpe,Appl.Microbiol.Biotechnol.60: 523‑33(2003))或IgG分子的Fc区(参见例如，Aruffo,Antibody Fusion Proteins 221‑42(Chamow和Ashkenazi编辑，1999))融合。 [0548] 本文还提供了包含本公开的抗体和异源多肽的融合蛋白。在一些实施方案中，与抗体基因融合或化学缀合的异源多肽可用于将抗体靶向至具有细胞表面表达的抗原的细胞。 [0549] 包含抗体的其他结合分子 [0550] 在另一个方面，本文提供了包含本文所提供的抗体的结合分子，该抗体基因融合或化学缀合至另一种药剂。本文描述了本公开的示例性结合分子。 [0551] 融合蛋白 [0552] 在各种实施方案中，本文所提供的抗体可以与另一种药剂(例如，基于蛋白质的实体)基因融合或化学缀合。抗体可以与药剂化学缀合，或者以其他方式与药剂非共价地缀合。该药剂可以是肽或抗体(或其片段)。 [0553] 因此，在一些实施方案中，本文提供了抗体以及其用途，该抗体重组融合或化学缀合(共价或非共价缀合)至异源蛋白质或多肽(或其片段，例如，至约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个、约100个、约150个、约200个、约250个、约300个、约350个、约400个、约450个或约500个氨基酸或超过500个氨基酸的多肽)以产生融合蛋白。特别地，本文提供了融合蛋白，该融合蛋白包含本文所提供的抗体的抗原结合片段(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)和异源蛋白质、多肽或肽。 [0554] 此外，本文所提供的抗体可以与标记或“标签”序列(诸如肽)融合以促进纯化。在具体实施方案中，标记或标签氨基酸序列是六组氨酸肽、血凝素(“HA”)标签和“FLAG”标签。 [0555] 用于将部分(包括多肽)融合或缀合至抗体的方法是已知的(参见例如，Arnon等人,Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy，于 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 243‑56(Reisfeld等人编辑，1985)； Hellstrom等人,Antibodies for Drug Delivery，于Controlled Drug Delivery 623‑53 (Robinson等人编辑，第2版，1987)；Thorpe,Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy:A Review，于Monoclonal Antibodies:Biological and Clinical Applications 475‑506(Pinchera等人编辑，1985)；Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy，于Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy 303‑16 (Baldwin等人编辑，1985)；Thorpe等人,Immunol.Rev.62:119‑58(1982)；美国专利号5, 336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,723,125；5,783,181；5,908, 626；5,844,095；和5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT公开WO 91/ 06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631和WO 99/04813；Ashkenazi等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10535‑39(1991)；Traunecker等人,Nature,331:84‑86 (1988)；Zheng等人,J.Immunol.154:5590‑600(1995)；以及Vil等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337‑41(1992))。 [0556] 融合蛋白可以例如通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)技术产生。DNA改组可以用于改变如本文所提供的抗体的活性，包括例如具有更高亲和力和更低解离速率的抗体(参见例如，美国专利号5,605,793；5,811,238；5,830, 721；5,834,252；和5,837,458；Patten等人,Curr.Opinion Biotechnol.8:724‑33(1997)； Harayama,Trends Biotechnol.16(2):76‑82(1998)；Hansson等人,J.Mol.Biol.287:265‑ 76(1999)；以及Lorenzo和Blasco,Biotechniques 24(2):308‑13(1998))。可以通过在重组之前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法进行随机诱变来改变抗体或编码的抗体。可以将编码本文所提供的抗体的多核苷酸与一个或多个异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。 [0557] 在一些实施方案中，将本文所提供的抗体与第二抗体缀合以形成抗体异源缀合物。 [0558] 在各种实施方案中，将该抗体与药剂基因融合。基因融合可以通过在抗体与药剂之间放置接头(例如，多肽)来完成。接头可以是柔性接头。 [0559] 在各种实施方案中，将该抗体与治疗分子基因缀合，其中铰链区将抗体与治疗分子连接。 [0560] 本文还提供了制备本文所提供的各种融合蛋白的方法。在第5.4部分中所描述的各种方法也可以用于制备本文所提供的融合蛋白。 [0561] 在具体实施方案中，本文所提供的融合蛋白是重组表达的。本文所提供的融合蛋白的重组表达可能需要构建含有编码该蛋白质或其片段的多核苷酸的表达载体。一旦已经获得编码本文所提供的蛋白质或其片段的多核苷酸，就可以使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术产生用于生产该分子的载体。因此，本文描述了用于通过表达含有编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。本领域技术人员熟知的方法可以用于构建含有编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。还提供了包含与启动子可操作地连接的核苷酸序列的可复制的载体，该核苷酸序列编码本文所提供的融合蛋白或其片段或CDR。 [0562] 可以通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生本文所提供的融合蛋白。因此，本文还提供了含有与异源启动子可操作地连接的多核苷酸的宿主细胞，该多核苷酸编码本文所提供的融合蛋白或其片段。 [0563] 多种宿主表达载体系统可以用于表达本文所提供的融合蛋白。此类宿主表达系统代表媒介物，通过该媒介物可以产生并随后纯化感兴趣的编码序列，而且还代表细胞，该细胞当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本文所提供的融合蛋白。这些包括但不限于微生物，诸如用含有编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；用含有编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒、CaMV、烟草花叶病毒、TMV)感染或用含有编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、NS0和3T3细胞)，该重组表达构建体含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。细菌细胞(诸如大肠杆菌)或真核细胞(特别是用于表达完整重组抗体分子的真核细胞)可以用于表达重组融合蛋白。例如，与载体(诸如来自人巨细胞病毒的主要即刻早期(major intermediate early)基因启动子元件)相结合的哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))是抗体或其变体的有效表达系统。在具体实施方案中，编码本文所提供的融合蛋白的核苷酸序列的表达由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调控。 [0564] 在细菌系统中，取决于所表达的融合蛋白的预期用途可以有利地选择许多表达载体。例如，当要生产大量的这种融合蛋白时，为了产生融合蛋白的药物组合物，可能期望指导表达高水平的易于纯化的融合蛋白产物的载体。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人,EMBO 12:1791(1983))，其中编码序列可以与lac Z编码区一起在读框内单独连接到载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye,Nucleic Acids Res.13:3101‑3109(1985)；Van Heeke和Schuster,J.Biol.Chem.24:5503‑5509(1989))；等等。pGEX载体也可以用于表达作为与谷胱甘肽5‑转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。一般来讲，此类融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附和结合到基质谷胱甘肽琼脂糖珠上，然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。pGEX载体被设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。 [0565] 在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体时，可以将感兴趣的编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合物(例如，晚期启动子和三联前导序列)上。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如，区域El或E3)中将产生是活的并且能够在感染的宿主中表达融合蛋白的重组病毒(例如，参见Logan和Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 1:355‑ 359(1984))。特定起始信号对于插入的编码序列的有效翻译也可能是必需的。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相，以确保整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以来自多种来源，既有天然的也有合成的。通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等，可以增强表达的效率(参见例如，Bittner等人,Methods in Enzymol.153:51‑544(1987))。 [0566] 此外，可以选择调节插入序列的表达或以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的此类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO细胞、VERY细胞、BHK细胞、Hela细胞、COS细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞、W138细胞、BT483细胞、Hs578T细胞、HTB2细胞、BT2O和T47D细胞、NS0细胞(不内源性地产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O细胞和HsS78Bst细胞。 [0567] 对于重组蛋白的长期、高产量生产，可以利用稳定的表达。例如，可以工程化稳定地表达融合蛋白的细胞系。代替使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用由适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择标记控制的DNA转化宿主细胞。在引入外源DNA之后，可以使工程化细胞在富集培养基中生长1天至2天，然后转换到选择培养基中。重组质粒中的选择标记赋予对选择的抗性，并且允许细胞稳定地将质粒整合到它们的染色体中并生长以形成焦点，该焦点进而可以被克隆并扩增成细胞系中。该方法可以有利地用于工程化表达融合蛋白的细胞系。此类工程化细胞系尤其可以用于筛选和评价与结合分子直接地或间接地相互作用的组合物。 [0568] 可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,Cell 11:223(1977))、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人,Cell 22: 8‑17(1980))基因，它们可以分别用于tk细胞、hgprt细胞或aprt细胞。此外，抗代谢物抗性可以用作对以下基因选择的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人, Natl.Acad.Sci.USA 77:357(1980)；O’Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527 (1981))；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78: 2072(1981))；neo，其赋予对氨基糖苷G‑418的抗性(Wu和Wu,Biotherapy 3:87‑95(1991)； Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573‑596(1993)；Mulligan,Science260: 926‑932(1993)；以及Morgan和Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191‑217(1993)；May,TIB TECH 11(5):l55‑2 15(1993))；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人,Gene 30: 147(1984))。可以常规地应用重组DNA技术领域中通常已知的方法来选择所需的重组克隆，并且此类方法描述于例如Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；以及在第12章和第13章中，Dracopoli等人(编辑),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994)； Colberre‑Garapin等人,J.Mol.Biol.150:1(1981)中，这些文献以引用的方式整体并入本文。 [0569] 可以通过载体扩增来增加融合蛋白的表达水平(关于综述，参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(Academic Press,New York,1987))。当表达融合蛋白的载体系统中的标记是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标记基因的拷贝数。由于扩增区域与融合蛋白基因相关联，所以融合蛋白的产生也将增加(Crouse等人,Mol.Cell.Biol.3:257(1983))。 [0570] 可以用本文所提供的多种表达载体共转染宿主细胞。载体可以含有相同的选择标记，其使得相应编码多肽能够相等表达。可替代地，可以使用编码并且能够表达多种多肽的单一载体。编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。 [0571] 一旦已经通过重组表达产生本文所提供的融合蛋白，该融合蛋白就可以通过本领域已知的用于纯化多肽(例如，免疫球蛋白分子)的任何方法来纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和层析(特别是通过在蛋白质A之后对特异性抗原的亲和力)、分级柱色谱法和κ选择亲和层析)、离心、差异溶解度或者通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术来纯化。此外，本文所提供的融合蛋白分子可以与本文所述或本领域原本已知的异源多肽序列融合以促进纯化。 [0572] 免疫缀合物 [0573] 在一些实施方案中，本公开还提供了免疫缀合物，该免疫缀合物包含与一种或多种细胞毒性剂缀合的本文所述的任何抗体，该一种或多种细胞毒性剂诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或它们的片段)或放射性同位素。 [0574] 在一些实施方案中，免疫缀合物是抗体‑药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，该一种或多种药物包括但不限于美登醇(maytansinoid)(参见美国专利号5, 208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425235B1)；澳瑞他汀(auristatin)，诸如单甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588以及7,498, 298)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714, 586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人,Cancer Res.53:3336‑3342(1993)；以及Lode等人,Cancer Res.58:2925‑2928(1998))；蒽环类药物，诸如道诺霉素或多柔比星(参见Kratz等人,Current Med.Chem.13:477‑523 (2006)；Jeffrey等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358‑362(2006)；Torgov等人, Bioconj.Chem.16:717‑721(2005)；Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829‑834 (2000)；Dubowchik等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529‑1532(2002)；King等人, J.Med.Chem.45:4336‑4343(2002)；以及美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷，诸如多西紫杉醇、紫杉醇、拉洛紫杉醇(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和奥他紫杉醇(ortataxel)；单端孢霉烯；和CC1065。 [0575] 在一些实施方案中，免疫缀合物包含如本文所述的抗体，该抗体缀合至酶活性毒素或其片段，包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A 链、α‑帚曲霉毒(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP‑S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素 (gelonin)、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯。 [0576] 在一些实施方案中，免疫缀合物包含如本文所述的抗体，该抗体与放射性原子缀211 131 合以形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。实例包括At 、I 、 125 90 186 188 153 212 32 212 I 、Y 、Re 、Re 、Sm 、Bi 、P 、Pb 和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，其可以包含用于闪烁照相研究的放射性原子，诸如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记，诸如再次碘‑123、碘‑131、铟‑111、氟‑19、碳‑ 13、氮‑15、氧‑17、钆、锰或铁。 [0577] 可以使用多种双功能蛋白偶联剂来制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，该双功能蛋白偶联剂诸如N‑琥珀酰亚胺‑3‑(2‑吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基‑4‑(N‑马来酰亚胺基甲基)环己烷‑1‑羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲基酯HCl)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮盐衍生物(诸如双‑(对重氮盐苯甲酰基)‑乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6‑二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5‑二氟‑2,4‑二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以如在Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述制备。碳‑14标记的1‑异硫氰基苄基‑3‑甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX‑DTPA)是用于放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。 [0578] 接头可以是“可切割的接头”，其促进所缀合的药剂在细胞中的释放，但不可切割的接头也涵盖在本文中。用于本公开的缀合物的接头包括但不限于酸不稳定接头(例如，腙接头)、含二硫化物的接头、肽酶敏感性接头(例如，包含氨基酸(例如缬氨酸和/或瓜氨酸(诸如瓜氨酸‑缬氨酸)或苯丙氨酸‑赖氨酸)的肽接头)、光不稳定接头、二甲基接头、硫醚接头或设计用于逃避多药转运蛋白介导的抗性的亲水性接头。 [0579] 本文中的免疫缀合物或ADC涵盖但不限于用交联剂试剂制备的此类缀合物，该交联剂试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC‑SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基‑EMCS、磺基‑GMBS、磺基‑KMUS、磺基‑MBS、磺基‑SIAB、磺基‑SMCC和磺基‑SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺‑(4‑乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是可商购获得的(例如，从 Pierce Biotechnology、Inc.、Rockford、IL.、U.S.A商购获得)。 [0580] 在其他实施方案中，将本文所提供的抗体与例如诊断分子缀合或重组融合。这种诊断和检测可以例如通过将抗体与可检测物质偶联来完成，该可检测物质包括但不限于各种酶，诸如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β‑半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，诸如但不限于链霉亲和素/生物素或抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，诸如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，诸如但不限于鲁米诺；生物发光材料，诸如但不限于荧光素酶、萤光素或水母发光蛋白；化学发光材料，诸如发射225Acγ的放射性同位素、发射俄歇效应的放射性同位素、发射β射线的放射性同位素、发射α射线的放射性同位素或发射正电子的放射性同位素。 [0581] 5.3.多核苷酸 [0582] 在某些实施方案中，本公开提供了编码本文所述的本发明结合分子(例如，抗体)的多核苷酸。本公开的多核苷酸可以是RNA的形式或DNA的形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链的或单链的，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。在一些实施方案中，多核苷酸是cDNA的形式。在一些实施方案中，多核苷酸是合成的多核苷酸。 [0583] 本公开还涉及本文所述的多核苷酸的变体，其中该变体编码例如本公开的结合分子的片段、类似物和/或衍生物。在某些实施方案中，本公开提供了多核苷酸，其包含具有与编码本公开的结合分子的多核苷酸至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、以及在一些实施方案中至少约96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列的多核苷酸。如本文所用，短语“具有与参考核苷酸序列至少例如95％“相同”的核苷酸序列的多核苷酸”旨在意指多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，除了多核苷酸序列可以在参考核苷酸序列的每100个核苷酸中包括至多五个点突变。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可以被缺失或被另一种核苷酸取代，或者数量为参考序列中总核苷酸的至多5％的核苷酸可以被插入参考序列中。参考序列的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5'或 3'末端位置或在这些末端位置之间的任何位置，单独散布在参考序列中的核苷酸之间或以一个或多个连续组散布在参考序列内。 [0584] 多核苷酸变体可以在编码区、非编码区或两者中含有改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变所编码多肽的特性或活性的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体包含导致多肽的氨基酸序列没有变化(由于遗传密码的简并性)的沉默取代。多核苷酸变体可以因多种原因而产生，例如，优化特定宿主的密码子表达(即，将人mRNA中的密码子改变为细菌宿主诸如大肠杆菌偏好的密码子。在一些实施方案中，多核苷酸变体在序列的非编码区或编码区中包含至少一个沉默突变。 [0585] 在一些实施方案中，产生多核苷酸变体以调节或改变所编码多肽的表达(或表达水平)。在一些实施方案中，产生多核苷酸变体以增加所编码多肽的表达。在一些实施方案中，产生多核苷酸变体以降低所编码多肽的表达。在一些实施方案中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体具有增加的所编码多肽的表达。在一些实施方案中，与亲本多核苷酸序列相比，多核苷酸变体具有降低的所编码多肽的表达。 [0586] 还提供了包含本文所述的核酸分子的载体。在一个实施方案中，可以将核酸分子掺入重组表达载体中。本公开提供了包含本公开的任何核酸的重组表达载体。如本文所用，术语“重组表达载体”意指经遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当该构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列并且载体在足以使该mRNA、蛋白质、多肽或肽在宿主细胞内表达的条件下与该细胞接触时，该构建体允许该mRNA、蛋白质、多肽或肽被该细胞表达。本文所述的载体不是作为一个整体天然存在的；然而，载体的部分可以是天然存在的。所描述的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链的或双链的、合成的或部分从天然来源获得的，并且其可以含有天然的核苷酸、非天然的核苷酸或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在的核苷酸间连接或非天然存在的核苷酸间连接、或两种类型的连接。非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间连接不阻碍载体的转录或复制。 [0587] 在一个实施方案中，本公开的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于增殖和扩增或设计用于表达或两者的载体，诸如质粒和病毒。载体可以选自由以下组成的组：pUC系列(Fermentas Life Sciences,Glen Burnie,Md.)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,Calif.)、pET系列(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,Calif.)。可以使用细菌噬菌体载体，诸如λGT10、λGT11、λEMBL4和λNM1149、λZapII(Stratagene)。植物表达载体的实例包括pBI01、pBI01.2、pBI121、 pBI101.3和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK‑Cl、pMAM和pMAMneo (Clontech)。重组表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒载体。 [0588] 在一个实施方案中，使用在例如Sambrook等人(见上文)和Ausubel等人(见上文)中所描述的标准重组DNA技术制备重组表达载体。可以制备环状或线性的表达载体构建体，以含有在原核宿主细胞或真核宿主细胞中起作用的复制系统。复制系统可以来源于例如 ColE1、SV40、2μ质粒、λ、牛乳头瘤病毒等。 [0589] 重组表达载体可以包含调控序列，诸如转录和翻译起始和终止密码子，其对将引入载体的宿主类型(例如，细菌、植物、真菌或动物)是特异性的，视情况而定并考虑载体是基于DNA的还是基于RNA的。 [0590] 重组表达载体可以包括一个或多个标记基因，其允许选择转化或转染的宿主。标记基因包括杀生物剂抗性(例如，对抗生素、重金属等的抗性)、在营养缺陷型宿主中提供原养型的互补作用等。用于所描述的表达载体的合适的标记基因包括例如新霉素/G418抗性基因、组氨醇x抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。 [0591] 重组表达载体可以包含与本公开的核苷酸序列可操作地连接的天然或标准启动子。启动子(例如，强启动子、弱启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子和发育特异性启动子)的选择在本领域技术人员的普通技能范围内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员的技术范围内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒 (CMV)启动子、RSV启动子、SV40启动子或在鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。 [0592] 重组表达载体可以被设计用于瞬时表达、用于稳定表达或用于两者。此外，重组表达载体可以制备用于组成型表达或诱导型表达。 [0593] 此外，可以制备重组表达载体以包含自杀基因。如本文所用，术语“自杀基因”是指引起表达该自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是对表达该基因的细胞赋予对药剂(例如，药物)的敏感性的基因，并且当细胞接触或暴露于该药剂时引起细胞死亡。自杀基因是本领域已知的，并且包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。 [0594] 在某些实施方案中，多核苷酸是分离的。在某些实施方案中，多核苷酸是基本上纯的。 [0595] 还提供了包含本文所述的核酸分子的宿主细胞。宿主细胞可以是含有异源核酸的任何细胞。异源核酸可以是载体(例如，表达载体)。例如，宿主细胞可以是来自任何生物体的细胞，其以任何方式被选择、修饰、转化、生长、使用或操作用于通过细胞产生物质(例如通过细胞表达基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶)。可以确定适当的宿主。例如，可以基于载体骨架和所需的结果选择宿主细胞。例如，可以将质粒或粘粒引入原核生物宿主细胞中以复制几种类型的载体。细菌细胞(诸如但不限于DH5α、JM109和KCB、感受态细胞和 SOLOPACK Gold细胞)可以用作载体复制和/或表达的宿主细胞。另外，细菌细胞(诸如大肠杆菌LE392)可以用作噬菌体病毒的宿主细胞。可以用作宿主细胞的真核细胞包括但不限于酵母(例如，YPH499、YPH500和YPH501)、昆虫和哺乳动物。用于复制和/或表达载体的哺乳动物真核宿主细胞的实例包括但不限于HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、COS、Saos、PC12、SP2/0(美国模式培养物保藏所(ATCC)，Manassas,VA，CRL‑1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏所 (ECACC)，Salisbury,Wiltshire,UK，ECACC号85110503)、FO(ATCC CRL‑1646)和Ag653(ATCC CRL‑1580)鼠细胞系。示例性的人骨髓瘤细胞系是U266(ATCC CRL‑TIB‑196)。其他有用的细胞系包括源自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些，诸如CHO‑K1SV(Lonza Biologics, Walkersville,MD)、CHO‑K1(ATCC CRL‑61)或DG44。 [0596] 5.4.结合分子的制备及其制备方法 [0597] 已经描述了制备结合分子(诸如抗体)的方法。参见例如，Els Pardon等人,Nature Protocol,9(3):674(2014)。抗体(诸如scFv片段)可以使用本领域已知的方法获得，诸如通过免疫骆驼科动物物种(诸如骆驼或美洲驼)并且从其获得杂交瘤，或通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆抗体文库并且随后通过ELISA用未选择的文库的单个克隆或通过使用噬菌体展示进行选择。 [0598] 可以通过培养用含有编码抗体的核酸的载体转化或转染的细胞来产生本文所提供的抗体。可以使用标准重组技术获得编码本公开的抗体的多肽组分的多核苷酸序列。可以从产生抗体的细胞诸如杂交瘤细胞或B细胞分离所需的多核苷酸序列并对其测序。可替代地，可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，就将编码多肽的序列插入能够在宿主细胞中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域中可获得且已知的许多载体可以用于本公开的目的。适当载体的选择将主要取决于将插入载体中的核酸的大小和将用载体转化的特定宿主细胞。适合用于表达本公开的抗体的宿主细胞包括原核生物，诸如古细菌和真细菌，包括革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体；真核微生物，诸如丝状真菌或酵母；无脊椎动物细胞，诸如昆虫或植物细胞；以及脊椎动物细胞，诸如哺乳动物宿主细胞系。用上文所述的表达载体转化宿主细胞并且在常规营养培养基中培养，该常规营养培养基视情况而定被修改以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。使用如本领域已知的标准蛋白质纯化方法纯化由宿主细胞产生的抗体。 [0599] 包括载体构建、表达和纯化的抗体生产方法在以下文献中进行了进一步描述：Plückthun等人,Antibody Engineering: Producing antibodies in Escherichia coli: From PCR to fermentation 203‑52(McCafferty等人编辑，1996)；Kwong和Rader,E.coli Expression and Purification of Fab Antibody Fragments，于Current Protocols in Protein Science(2009)；Tachibana和Takekoshi,Production of Antibody Fab Fragments in Escherichia coli，于Antibody Expression and Production(Al‑Rubeai 编辑，2011)；以及Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic(An编辑， 2009)。 [0600] 当然，预期可以使用本领域熟知的替代性方法来制备结合分子(诸如抗体)。例如，可以使用固相技术通过直接肽合成来产生适当的氨基酸序列或其部分(参见例如，Stewart等人,Solid‑Phase Peptide Synthesis(1969)；以及Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85: 2149‑54(1963))。可以使用手动技术或通过自动化进行体外蛋白质合成。抗体的各个部分可以单独地化学合成，并且使用化学或酶促方法组合以产生所需的抗体。可替代地，可以从经工程化以表达抗体的转基因动物的细胞或体液(诸如乳)纯化抗体，如例如在美国专利号 5,545,807和5,827,690中所公开。 [0601] 通常在动物中通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来产生多克隆抗体。使用双功能剂或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨 1 酸残基缀合)、N‑羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基缀合)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R N═C 1 ═NR(其中R和R独立地是低级烷基)，将相关抗原缀合至在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如，钥孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂可能是有用的。可以使用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL‑TDM佐剂(单磷酰脂质A、合成的海藻糖二棒杆菌分枝菌酸酯(trehalose dicorynomycolate))。免疫方案可以由本领域技术人员选择而无需过度实验。 [0602] 例如，通过将例如100μg或5μg的蛋白质或缀合物(分别对于兔或小鼠而言)与3体积的弗氏完全佐剂组合并在多个部位皮内注射该溶液来使动物对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫。一个月后，通过在多个位点皮下注射，用1/5至1/10原始量的在弗氏完全佐剂中的肽或缀合物对动物进行加强免疫。7天至14天以后，将动物放血并测定血清的抗体滴度。对动物加强免疫直到滴度达到稳定水平。缀合物还可以作为蛋白质融合物在重组细胞培养物中制备。聚集剂诸如明矾也适合于增强免疫应答。 [0603] 单克隆抗体获自基本上均质的抗体群体，即，构成该群体的单个抗体是相同的，除了可能以少量存在的可能天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是离散抗体的混合物。 [0604] 例如，单克隆抗体可以使用由Kohler等人,Nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(美国专利号4,816,567)。 [0605] 在杂交瘤方法中，对适当的宿主动物进行免疫以引发淋巴细胞，其产生或能够产生将特异性地结合用于免疫的蛋白质的抗体。可替代地，淋巴细胞可以在体外被免疫。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞 (Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，第59‑103页(Academic Press,1986)。 [0606] 免疫剂典型地将包括抗原蛋白或其融合变体。Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986)，第59‑103页。无限增殖化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞。将由此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并使其生长，该培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。优选的无限增殖化骨髓瘤细胞是那些有效地融合、支持由选定的产生抗体的细胞稳定地高水平产生抗体并且对培养基诸如HAT培养基敏感的细胞。 [0607] 测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。可以测定在其中培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对所需抗原的单克隆抗体。此类技术和测定是本领域已知的。例如，结合亲和力可以通过Munson等人,Anal.Biochem.,107:220(1980) 的Scatchard分析来确定。 [0608] 在鉴定产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释程序将克隆进行亚克隆并通过标准方法使其生长(Goding，见上文)。用于此目的的合适培养基包括例如D‑MEM或RPMI‑1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为肿瘤在哺乳动物中体内生长。 [0609] 通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如蛋白质A‑琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基、腹水或血清中适当地分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。 [0610] 单克隆抗体也可以通过重组DNA方法制备，该重组DNA方法诸如在美国专利号4,816,567中所述和如上文所述的那些方法。编码单克隆抗体的DNA很容易用常规程序(例如，通过使用能够特异性地结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。一旦分离，就可以将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以便在此类重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol., 5:256‑262(1993)；以及Pliickthun,Immunol.Revs.130:151‑188(1992)。 [0611] 在另一个实施方案中，可以从使用以下文献中所描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离抗体：McCafferty等人,Nature,348:552‑554(1990)；Clackson等人,Nature,352: 624‑628(1991)以及Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581‑597(1991)。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等人,Bio/Technology,10:779‑783 (1992))、以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等人,Nucl.Acids Res.,21:2265‑2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。 [0612] DNA还可以被修饰，例如，通过取代编码序列(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分与编码序列共价地连接。此类非免疫球蛋白多肽可以被取代以产生嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。 [0613] 嵌合或杂合抗体也可以使用合成蛋白质化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些方法)在体外制备。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和甲基‑4‑巯基丁亚氨酸酯(mercaptobutyrimidate)。 [0614] 在原核细胞中重组产生 [0615] 可以使用标准重组技术获得编码本公开的结合分子(诸如抗体)的多核酸序列。所需的多核酸序列可以从产生抗体的细胞诸如杂交瘤细胞中分离并测序。可替代地，可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，就将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域中可获得且已知的许多载体可以用于本公开的目的。适当载体的选择将主要取决于将插入载体中的核酸的大小和将用载体转化的特定宿主细胞。每个载体含有各种组分，这取决于其功能(异源多核苷酸的扩增或表达、或两者)及其与其所驻留的特定宿主细胞的相容性。载体组分通常包括但不限于复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录终止序列。 [0616] 一般来讲，将含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，典型地使用来源于大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例详细描述于Carter等人，美国专利号5,648,237中。 [0617] 另外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些TM 宿主相关的转化载体。例如，细菌噬菌体诸如GEM ‑11可以用于制备重组载体，该重组载体可以用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392。 [0618] 本申请的表达载体可以包含两个或更多个启动子‑顺反子对，其编码每种多肽组分。启动子是位于调节其表达的顺反子上游(5')的非翻译调控序列。原核生物启动子典型地分为两个类别，诱导型和组成型。诱导型启动子是响应于培养条件的变化(例如，营养物的存在或不存在或温度的变化)而在其控制下启动增加水平的顺反子转录的启动子。 [0619] 大量被多种潜在宿主细胞识别的启动子是熟知的。通过限制性酶消化从来源DNA去除启动子并将分离的启动子序列插入本申请的载体中，可以将选定的启动子可操作地连接到编码本发明抗体的顺反子DNA上。天然启动子序列和许多异源启动子两者均可以用于指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，使用异源启动子，因为它们与天然靶多肽启动子相比通常允许所表达的靶基因的更多转录和更高产量。 [0620] 适合用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中起作用的其他启动子(诸如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。已经公布了它们的核酸序列，从而使得本领域技术人员能够使用提供任何所需的限制性位点的接头或衔接子将它们可操作地连接到编码靶肽的顺反子上(Siebenlist等人Cell 20:269(1980))。 [0621] 在一个方面，重组载体内的每个顺反子包含分泌信号序列组分，其指导所表达的多肽跨膜转运。一般来讲，信号序列可以是载体的组分，或者其可以是插入载体中的靶多肽DNA的一部分。为了本发明的目的而选择的信号序列应当是被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工异源多肽天然的信号序列的原核宿主细胞，信号序列可以被选自例如由以下组成的组的原核生物信号序列取代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。 [0622] 在一些实施方案中，根据本公开的抗体的产生可以发生在宿主细胞的细胞质中，‑ 因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。某些宿主菌株(例如，大肠杆菌trxB菌株) 提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而允许所表达的蛋白质亚基的正确折叠和组装。 [0623] 适合用于表达本公开的抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、芽孢杆菌属(Bacilli)(例如，枯草芽孢杆菌)、肠杆菌(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种(例如，铜绿假单胞菌)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一些实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology，第2卷(Washington,D.C.：美国微生物学会(American Society for Microbiology),1987)，第1190‑1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物(包括具有基R 因型W3110 AfhuA(AtonA)ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc‑fepE)degP41 kan的菌株 33D3(美国专利号5,639,635))。其他菌株及其衍生物也是合适的，诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)。这些实例是说明性的而不是限制性的。用于构建具有确定基因型的任何上述细菌的衍生物的方法是本领域已知的并且描述于例如Bass等人,Proteins,8:309‑314(1990)中。通常有必要考虑复制子在细菌细胞中的复制能力来选择适当的细菌。例如，当熟知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410用于提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌物种可以合适地用作宿主。 [0624] 典型地，宿主细胞应当分泌最少量的蛋白水解酶，并且可以理想地将另外的蛋白酶抑制剂掺入细胞培养物中。 [0625] 用上文所述的表达载体转化宿主细胞并且在常规营养培养基中培养，该常规营养培养基视情况而定被修改以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。转化意指将DNA引入原核宿主中，使得DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合体复制。取决于所使用的宿主细胞，使用适于此类细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙进行钙处理通常用于含有大量细胞壁屏障的细菌细胞。另一种用于转化的方法采用聚乙二醇/DMSO。所使用的又另一种技术是电穿孔。 [0626] 用于产生本申请的抗体的原核细胞在本领域已知的且适合用于培养选定宿主细胞的培养基中生长。合适培养基的实例包括luria肉汤(LB)加上必需的营养补充物。在一些实施方案中，培养基还含有基于表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性地允许含有表达载体的原核细胞的生长。例如，将氨苄青霉素添加到培养基中以使表达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。 [0627] 除了碳、氮和无机磷酸盐来源之外，还可以包括以适当浓度的、任何单独引入或作为与另一种补充剂或介质(诸如复合氮源)的混合物引入的任何必要的补充剂。任选地，培养基可以含有一种或多种还原剂，该一种或多种还原剂选自由以下组成的组：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、硫乙醇酸盐、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。原核宿主细胞在合适的温度和pH下培养。 [0628] 如果在本申请的表达载体中使用诱导型启动子，则在适合用于启动子活化的条件下诱导蛋白质表达。在本申请的一个方面，将PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此，在用于诱导的磷酸盐限制性培养基中培养转化的宿主细胞。优选地，磷酸盐限制性培养基是 C.R.A.P培养基(参见例如，Simmons等人,J.Immunol.Methods 263:133‑147(2002))。根据所采用的载体构建体，可以使用多种其他诱导剂，如本领域已知的。 [0629] 本公开的表达抗体被分泌到宿主细胞的周质中并从其回收。蛋白质回收典型地涉及破坏微生物，通常通过诸如渗透压冲击、超声处理或裂解等方式。一旦细胞被破坏，就可以通过离心或过滤去除细胞碎片或全细胞。蛋白质可以进一步被纯化，例如，通过亲和树脂色谱法。可替代地，可以将蛋白质转运到培养基中并在其中分离。可以从培养物中去除细胞，并且过滤培养物上清液并浓缩以进一步纯化所产生的蛋白质。可以使用通常已知的方法(诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹测定)进一步分离和鉴定所表达的多肽。 [0630] 可替代地，通过发酵过程大量进行蛋白质生产。各种大规模补料分批发酵程序可用于生产重组蛋白。为了提高本公开抗体的产率和质量，可以修改各种发酵条件。例如，已经证明伴侣蛋白促进细菌宿主细胞中产生的异源蛋白的正确折叠和溶解度。Chen等人J Bio Chem 274:19601‑19605(1999)；美国专利号6,083,715；美国专利号6,027,888； Bothmann和Pluckthun,J.Biol.Chem.275:17100‑17105(2000)；Ramm和Pluckthun, J.Biol.Chem.275:17106‑17113(2000)；Arie等人,Mol.Microbiol.39:199‑210(2001)。 [0631] 为了使所表达的异源蛋白(尤其是那些对蛋白水解敏感的蛋白质)的蛋白水解最小化，某些缺乏蛋白水解酶的宿主菌株可以用于本发明，如例如在美国专利号5,264,365；美国专利号5,508,192；Hara等人,Microbial Drug Resistance,2:63‑72(1996)中所述。缺乏蛋白水解酶并且用过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株可以用作编码本申请抗体的表达系统中的宿主细胞。 [0632] 可以将本文所产生的抗体进一步纯化以获得基本上均质的制剂用于进一步测定和使用。可以采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是合适的纯化程序的实例：在免疫亲和柱或离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上或在阳离子交换树脂诸如DEAE上的色谱法、色谱聚焦、SDS‑PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如Sephadex G‑75的凝胶过滤。例如，固定在固相上的蛋白质A可以用于本公开的结合分子的免疫亲和纯化的一些实施方案中。固定蛋白质A的固相优选地是包含玻璃或二氧化硅表面的柱，更优选地可控孔度玻璃柱或硅酸柱。在一些实施方案中，该柱已经用试剂(诸如甘油)包被，以试图防止污染物的非特异性粘附。然后洗涤固相以去除非特异性结合到固相上的污染物。最后，通过洗脱从固相中回收感兴趣的抗体。 [0633] 在真核细胞中重组产生 [0634] 对于真核表达，载体组分通常包括但不限于下列中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因和增强子元件、启动子和转录终止序列。 [0635] 用于真核宿主的载体还可以包含编码信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端具有特异性切割位点的其他多肽的插入物。优选地选择的异源信号序列是被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的序列。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。这种前体区域的DNA可以在阅读框中连接至编码本申请抗体的DNA。 [0636] 通常，对于哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(典型地可以使用SV40起点，仅因为其含有早期启动子)。 [0637] 表达和克隆载体可以含有选择基因，也称为选择标记。选择基因可以编码如下蛋白质，该蛋白质赋予对抗生素或其他毒素(例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性；补充营养缺陷；或供应无法从复合培养基中获得的关键营养物。 [0638] 选择方案的一个实例利用药物来阻止宿主细胞的生长。用异源基因成功地转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质，因此在选择方案中存活。这种显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。 [0639] 哺乳动物细胞的合适选择标记的另一个实例是那些能够鉴定能够摄取编码本申请抗体的核酸的细胞的选择标记。例如，首先通过在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化体来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当采用野生型DHFR 时，示例性的适当宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。可替代地，用编码多肽的DNA序列、野生型DHFR蛋白和另一种选择标记诸如氨基糖苷3'‑磷酸转移酶(APH) 转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源DHFR的野生型宿主)可以通过使细胞在含有用于选择标记的选择剂(诸如氨基糖苷抗生素)的培养基中生长来选择。 [0640] 表达载体和克隆载体通常含有被宿主生物体识别并与编码所需多肽序列的核酸可操作地连接的启动子。真核基因具有富含AT的区域，其位于在起始转录的位点上游的大约25个至30个碱基。可以包括在许多基因转录起始上游70个至80个碱基发现的另一个序列。大多数真核生物的3'端可以是将多聚A尾巴添加到编码序列的3'端的信号。可以将所有这些序列插入真核表达载体中。 [0641] 在哺乳动物宿主细胞中多肽从载体的转录可以例如通过从病毒(诸如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40))的基因组获得、从异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)获得、从热休克启动子获得的启动子来控制，条件是此类启动子与宿主细胞系统相容。 [0642] 通常通过将增强子序列插入载体中来增加高等真核生物对编码本公开抗体的DNA的转录。现在已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α‑胎儿蛋白和胰岛素)的增强子序列。实例包括在复制起点的晚期侧的SV40增强子(bp 100‑270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点的晚期侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。关于用于活化真核启动子的增强元件，还参见Yaniv,Nature 297:17‑18(1982)。增强子可以在多肽编码序列的5'或3'位置剪接到载体中，但优选地位于启动子的5'位置。 [0643] 用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还含有对于终止转录和对于稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'非翻译区和偶尔3'非翻译区获得。这些区域含有在编码多肽的mRNA的未翻译部分中作为聚腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区域。 [0644] 用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适的宿主细胞包括本文所述的高等真核生物细胞，包括脊椎动物宿主细胞。培养物(组织培养物)中的脊椎动物细胞的增殖已经成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40(COS‑7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1系；人胚肾系(293细胞或亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293细胞，Graham等人, J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/‑DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠塞尔托利细胞(TM4， Mather,Biol.Reprod.23:243‑251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO‑76，ATCC CRL‑1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等人, Annals N.Y.Acad.Sci.383:44‑68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤系(Hep G2)。 [0645] 宿主细胞可以用上文所述的表达载体或克隆载体转化以产生抗体，并且在常规营养培养基中培养，该常规营养培养基视情况而定被修改以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。 [0646] 用于产生本申请的抗体的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购获得的培养基诸如Ham的F10(Sigma)、最低必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI‑1640(Sigma)和杜氏改良的伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium，DMEM)(Sigma)适合用于培养宿主细胞。此外，在Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国再颁专利30,985中所描述的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如TM 腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN 药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。还可以以本领域技术人员已知的适当浓度包含任何其他必要的补充剂。培养条件(诸如温度、pH等)是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于普通技术人员是显而易见的。 [0647] 当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、在周质间隙中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤去除宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片。在抗体被分泌到培养基中时，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何前述步骤中可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。 [0648] 从细胞制备的蛋白质组合物可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化，其中亲和层析是优选的纯化技术。亲和配体所连接的基质最常见的是琼脂糖，但其他基质也是可用的。机械稳定的基质诸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯‑二乙烯基)苯允许比用琼脂糖可以实现的更快的流速和更短的加工时间。取决于要回收的抗体，也可用其他用于蛋白质纯化的技术，诸如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色TM 谱法、肝素色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的SEPHAROSE 色谱法、色谱聚焦、SDS‑PAGE和硫酸铵沉淀。在任何初步纯化步骤之后，可以对包含感兴趣的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱。 [0649] 5.5.药物组合物 [0650] 在一个方面，本公开还提供了包含至少一种本公开的结合分子(例如，抗体)的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的本文所提供的结合分子和药学上可接受的赋形剂。 [0651] 通过将具有所需纯度的结合分子与任选的生理学上可接受的赋形剂(参见例如，Remington,Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版，1980))混合，以水溶液形式或冻干形式或其他干燥形式制备用于储存的包含结合分子的药物组合物。 [0652] 本公开的结合分子可以被配制成用于递送至靶细胞/组织的任何合适的形式，例如，作为微胶囊或粗乳剂(Remington，见上文；Park等人,2005,Molecules 10:146‑61； Malik等人,2007,Curr.Drug.Deliv.4:141‑51)、作为持续释放制剂(Putney和Burke,1998,Nature Biotechnol.16:153‑57)或在脂质体中(Maclean等人,1997,Int.J.Oncol.11:325‑ 32；Kontermann,2006,Curr.Opin.Mol.Ther.8:39‑45)。 [0653] 在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳剂中，还可以将本文所提供的结合分子包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别地羟甲基纤维素‑或明胶‑微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。此类技术公开于例如Remington，见上文中。 [0654] 各种组合物和递送系统是已知的并且可以与如本文所述的结合分子一起使用，包括但不限于包封在脂质体、微粒、微胶囊中，能够表达抗体或其抗原结合片段的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参见例如，Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429‑32)，构建作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸，等。在另一个实施方案中，组合物可以作为控制释放系统或持续释放系统提供。在一个实施方案中，可以使用泵来实现控制释放或持续释放(参见例如，Langer，见上文；Sefton,1987,Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201‑40；Buchwald等人, 1980,Surgery 88:507‑16；以及Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.321:569‑74)。在另一个实施方案中，聚合材料可以用于实现预防剂或治疗剂(例如，如本文所述的抗体或其抗原结合片段)或本文所提供的组合物的控制释放或持续释放(参见例如，Medical Applications of Controlled Release(Langer和Wise编辑，1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance(Smolen和Ball编辑，1984)；Ranger和Peppas, 1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61‑126；Levy等人,1985,Science 228: 190‑92；During等人,1989,Ann.Neurol.25:351‑56；Howard等人,1989,J.Neurosurg.71: 105‑12；美国专利号5,679,377；5,916,597；5,912,015；5,989,463；和5,128,326；PCT公开号WO 99/15154和WO 99/20253)。在持续释放制剂中使用的聚合物的实例包括但不限于聚 (2‑羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯‑共‑乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N‑乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯‑共‑乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，在持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可浸出杂质的、储存稳定的、无菌的和可生物降解的。 [0655] 在又另一个实施方案中，可以将控制释放系统或持续释放系统放置在特定靶组织(例如，鼻道或肺)的附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson,Medical Applications of Controlled Release第2卷,115‑38(1984))。例如Langer,1990,Science 249:1527‑33讨论了控制释放系统。本领域技术人员已知的任何技术都可以用于生产包含一种或多种如本文所述的抗体或其抗原结合片段的持续释放制剂(参见例如，美国专利号 4,526,938、PCT公开号WO 91/05548和WO 96/20698；Ning等人,1996,Radiotherapy& Oncology 39:179‑89；Song等人,1995,PDA J.of Pharma.Sci.&Tech.50:372‑97；Cleek等人,1997,Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853‑54；以及Lam等人,1997, Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759‑60)。 [0656] 5.6使用方法 [0657] 在一个方面，本文提供了消耗例如受试者中的HSC的方法，该方法包括将细胞暴露于有效量的本文所提供的结合分子(诸如抗体)。在一些实施方案中，本文所提供的方法用于消耗活化的HSC。 [0658] 在一个方面，本文提供了本文所提供的结合分子(诸如抗体)用于消耗例如受试者中的HSC的用途。在一些实施方案中，将结合分子用于消耗活化的HSC。 [0659] 在另一个方面，本文提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的本文所提供的结合分子(诸如抗体或其抗原结合片段)。在一个实施方案中，该疾病或病症是活化的HSC相关的疾病或病症。在一个实施方案中，该疾病或病症是肝纤维化。 [0660] 在另一个方面，本文提供了本文所提供的结合分子(诸如抗体或其抗原结合片段)在制备用于治疗受试者的疾病或病症的药物中的用途。在一个实施方案中，该疾病或病症是活化的HSC相关的疾病或病症。在一个实施方案中，该疾病或病症是肝纤维化。 [0661] 在另一个方面，本文提供了本文所提供的药物组合物在制备用于治疗受试者的疾病或病症的药物中的用途。在一个实施方案中，该疾病或病症是活化的HSC相关的疾病或病症。在一个实施方案中，该疾病或病症是肝纤维化。 [0662] 在一个方面，结合分子是基本上纯化的(即，基本上不含限制其作用或产生不希望的副作用的物质。施用疗法的受试者可以是哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴(诸如食蟹猕猴)或人)。在一个实施方案中，该受试者是人。在另一个实施方案中，该受试者是患有疾病或病症的人。 [0663] 各种递送系统是已知的并且可以用于施用预防剂或治疗剂(例如，本文所提供的结合分子)，包括但不限于包封在脂质体、微粒、微胶囊中，能够表达结合分子的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参见例如，Wu和Wu,J.Biol.Chem.262:4429‑4432(1987))，构建作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸，等。施用预防剂或治疗剂(例如，本文所提供的结合分子)或药物组合物的方法包括但不限于肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外施用和粘膜施用(例如，鼻内和口服途径)。在具体实施方案中，将预防剂或治疗剂(例如，本文所提供的结合分子)或药物组合物鼻内施用、肌内施用、静脉内施用或皮下施用。预防剂或治疗剂或组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注注射，通过上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、鼻内粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。此外，还可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器和用气雾化剂配制。参见例如美国专利号6,019,968、5,985, 320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，它们中的每一篇均以引用的方式整体并入本文。 [0664] 在具体实施方案中，可能期望将本文所提供的预防剂或治疗剂或药物组合物局部施用于需要治疗的区域。这可以通过例如但不限于局部输注、通过局部施用(例如，通过鼻内喷雾)、通过注射或通过植入物的方式来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜(诸如Sialastic膜)或纤维。在一些实施方案中，当施用本文所提供的结合分子时，必须小心使用结合分子(诸如抗体或其抗原结合片段)不吸收的材料。 [0665] 在另一个实施方案中，本文所提供的预防剂或治疗剂或组合物可以在囊泡(特别是脂质体)中递送(参见Langer,1990,Science 249:1527‑1533；Treat等人，于Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez‑Berestein和Fidler(编辑),Liss,New York，第353‑365页(1989)；Lopez‑Berestein，同上，第317‑327页；一般参见同上)。 [0666] 在另一个实施方案中，本文所提供的预防剂或治疗剂或组合物可以以控制释放系统或持续释放系统递送。 [0667] 在具体实施方案中，在本文所提供的组合物是编码预防剂或治疗剂(例如，，本文所提供的结合分子)的核酸的情况下，可以在体内施用该核酸以促进其编码的预防剂或治疗剂的表达，这是通过以下方式来进行：通过将其构建为适当核酸表达载体的一部分并施用其使得其变成细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)、或通过直接注射、或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic,Dupont)、或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被、或通过将其与已知进入细胞核的同源盒样肽连接施用(参见例如，Joliot等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864‑1868)等。可替代地，可以将核酸引入细胞内并掺入宿主细胞DNA中以通过同源重组表达。 [0668] 在具体实施方案中，本文所提供的组合物包含一种、两种或更多种本文所提供的结合分子。在另一个实施方案中，本文所提供的组合物包含一种、两种或更多种本文所提供的结合分子和除本文所提供的结合分子以外的预防剂或治疗剂。在一个实施方案中，已知这些药剂可用于或已经用于或目前用于预防、管理、治疗和/或改善疾病或病症。除了预防剂或治疗剂之外，本文所提供的组合物还可以包含赋形剂。 [0669] 本文所提供的组合物包括可用于制造可以用于制备单位剂型的药物组合物(例如，适合用于向受试者或患者施用的组合物)的散装药物组合物。在一个实施方案中，本文所提供的组合物是药物组合物。此类组合物包含预防有效量或治疗有效量的一种或多种预防剂或治疗剂(例如，本文所提供的结合分子或其他预防剂或治疗剂)和药学上可接受的赋形剂。药物组合物可以被配制成适合用于向受试者施用的途径。 [0670] 在具体实施方案中，术语“赋形剂”还可以指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全或不完全))或媒介物。药物赋形剂可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是示例性的赋形剂。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体赋形剂，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂还可以包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂等形式。口服制剂可以包括标准赋形剂，诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物赋形剂的实例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA中。此类组合物将含有预防有效量或治疗有效量的本文所提供的结合分子(诸如以纯化的形式)以及合适量的赋形剂，以便提供用于适当地施用于患者的形式。该制剂应当适合施用模式。 [0671] 在一个实施方案中，根据常规程序将组合物配制为适于静脉内施用于人类的药物组合物。典型地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。在必要时，该组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂(诸如利多卡因(lignocamne))以减轻注射部位的疼痛。然而，此类组合物可以通过除静脉内以外的途径施用。 [0672] 通常，本文所提供的组合物的成分单独提供或以单位剂型混合在一起提供，例如作为在指示活性剂的量的密封容器(诸如安瓿或药囊(sachette))中的冻干粉末或无水浓缩物。当组合物将通过输注施用时，其可以用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶分配。当组合物通过注射施用时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿，使得可以在施用之前混合各成分。 [0673] 可以将本文所提供的结合分子包装在指示结合分子的量的密封容器诸如安瓿或药囊中。在一个实施方案中，将结合分子作为干燥无菌冻干粉末或无水浓缩物在密封容器中提供，并且可以例如用水或盐水重构至用于施用于受试者的适当浓度。可以将冻干的结合分子以2℃至8℃储存在其原始容器中，并且结合分子可以在重构质后12小时内(诸如6小时内、5小时内、3小时内或1小时内)施用。在替代性实施方案中，本文所提供的结合分子以液体形式提供在指示抗体的量和浓度的密封容器中。 [0674] 可以将本文所提供的组合物配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括那些与阴离子形成的盐，诸如那些衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及那些与阳离子形成的盐，诸如那些衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2‑乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。 [0675] 可以通过标准临床技术确定将有效预防和/或治疗疾病或病症的预防剂或治疗剂(例如，本文所提供的结合分子)或本文所提供的组合物的量。此外，可以任选地采用体外测定以帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中所采用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重性，并且应当根据医师的判断和每个患者的情况来决定。 [0676] 可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量‑反应曲线外推有效剂量。 [0677] 在某些实施方案中，将本文所提供的结合分子的剂量施用于患者的途径是鼻内、肌内、静脉内、皮下或它们的组合，但本文所述的其他途径也是可接受的。可以或可以不通过相同的施用途径施用每个剂量。在一些实施方案中，本文所提供的结合分子可以通过多种施用途径与其他剂量的相同或不同的本文所提供的结合分子同时或相继施用。 [0678] 在某些实施方案中，将本文所提供的结合分子预防性地或治疗性地施用于受试者。可以将本文所提供的结合分子预防性地或治疗性地施用于受试者，以便预防、减轻或改善疾病或其症状。 [0679] 5.7.基因疗法和细胞疗法 [0680] 在具体实施方案中，将包含编码结合分子或其功能衍生物的序列的核酸施用于受试者以用于本文所提供的方法中，例如，以通过基因疗法的方式预防、管理、治疗和/或改善活化的HSC相关的疾病或病症。这种疗法涵盖通过向受试者施用表达的或可表达的核酸来进行的疗法。在一个实施方案中，该核酸产生其编码的抗体，并且该抗体介导预防效果或治疗效果。 [0681] 可以使用本领域中可获得的用于重组基因表达(或基因疗法)的任何方法。 [0682] 关于基因疗法方法的一般综述，参见Goldspiel等人,1993,Clinical Pharmacy 12:488‑505；Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87‑95；Tolstoshev,1993, Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573‑596；Mulligan,1993,Science 260:926‑932；以及Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191‑217；May,1993,TIBTECH 11(5):155‑ 215。可以使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法描述于Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；以及Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)中。 [0683] 在具体实施方案中，组合物包含编码本文所提供的结合分子(诸如抗体)的核酸，该核酸是在合适的宿主中表达该结合分子(诸如抗体或嵌合蛋白或其重链或轻链)的表达载体的一部分。特别地，此类核酸具有与编码区可操作地连接的启动子，诸如异源启动子，该启动子是诱导型的或组成型的并且任选地是组织特异性的。在另一个特定实施方案中，使用这样的核酸分子，其中编码序列和任何其他所需序列的侧翼是促进基因组中所需位点处的同源重组的区域，从而提供编码核酸的染色体内表达(Koller和Smithies,1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932‑8935；Zijlstra等人,1989,Nature 342:435‑438)。 [0684] 将核酸递送到受试者中可以是直接的，在这种情况下，受试者直接暴露于核酸或携带核酸的载体，或者是间接的，在这种情况下，细胞首先在体外用核酸转化，然后移植到受试者中。这两种方法分别已知为体内或离体基因疗法。 [0685] 在具体实施方案中，在体内直接施用核酸序列，其中该序列被表达以产生编码产物。这可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种来实现，例如通过将它们构建为适当的核酸表达载体的一部分并且施用该载体使得该序列变成细胞内的，例如，通过使用有缺陷的或减毒的逆转录病毒或其他病毒载体感染(参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射裸DNA，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic,Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，包封在脂质体、微粒或微胶囊中，或通过将它们与已知进入细胞核的肽连接施用，通过将其与经历受体介导的胞吞作用的配体连接施用(参见例如，Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429‑4432)(该配体可以用于靶向特异性地表达受体的细胞类型)，等。在另一个实施方案中，可以形成核酸‑配体复合物，其中该配体包含融合(fusogenic)病毒肽以破坏内体，从而允许核酸避免溶酶体降解。在又另一个实施方案中，通过靶向特异性受体，可以在体内靶向核酸以进行细胞特异性摄取和表达(参见例如，PCT公开WO 92/06180； WO 92/22635；WO 92/20316；W093/14188；WO 93/20221)。可替代地，可以通过同源重组将核酸引入细胞内并且掺入宿主细胞DNA中以进行表达(Koller和Smithies,1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932‑8935；以及Zijlstra等人,1989,Nature 342:435‑ 438)。 [0686] 在具体实施方案中，使用含有编码肽的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见Miller等人,1993,Meth.Enzymol.217:581‑599)。这些逆转录病毒载体含有正确包装病毒基因组和整合到宿主细胞DNA中所必需的组分。可以将编码用于基因疗法中的结合分子的核酸序列克隆到一个或多个载体中，这有利于将基因递送到受试者中。关于逆转录病毒载体的更多细节可以在Boesen等人,1994,Biotherapy 6:291‑302中找到，其描述了逆转录病毒载体向造血干细胞递送MDR1基因以便使干细胞对化学疗法更具抗性的用途。说明逆转录病毒载体在基因疗法中的用途的其他参考文献是：Clowes等人,1994, J.Clin.Invest.93:644‑651；Klein等人,1994,Blood 83:1467‑1473；Salmons和Gunzberg, 1993,Human Gene Therapy 4:129‑141；以及Grossman和Wilson,1993,Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110‑114。 [0687] 腺病毒是可以用于重组生产结合分子(诸如抗体)的其他病毒载体。腺病毒是用于将基因递送至呼吸道上皮的特别有吸引力的媒介物。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，在那里它们引起轻微的疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶标是肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson,1993,Current Opinion in Genetics and Development 3:499‑503提供了基于腺病毒的基因疗法的综述。Bout等人,1994,Human Gene Therapy 5:3‑10证明了腺病毒载体将基因转移到恒河猴的呼吸道上皮的用途。腺病毒在基因疗法中的用途的其他实例可以见于Rosenfeld等人, 1991,Science 252:431‑434；Rosenfeld等人,1992,Cell 68:143‑155；Mastrangeli等人, 1993,J.Clin.Invest.91:225‑234；PCT公开W094/12649；以及Wang等人,1995,Gene Therapy 2:775‑783。在具体实施方案中，使用腺病毒载体。 [0688] 也可以利用腺相关病毒(AAV)(Walsh等人,1993,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289‑300；以及美国专利号5,436,146)。在具体实施方案中，将AAV载体用于表达如本文所提供的抗体。在某些实施方案中，AAV包含编码VH结构域的核酸。在其他实施方案中，AAV包含编码VL结构域的核酸。在某些实施方案中，AAV包含编码VH结构域和VL结构域的核酸。在本文所提供的方法的一些实施方案中，向受试者施用包含编码VH结构域的核酸的AAV和包含编码VL结构域的核酸的AAV。在其他实施方案中，向受试者施用包含编码VH结构域和VL结构域的核酸的AAV。在某些实施方案中，VH结构域和VL结构域被过表达。 [0689] 基因疗法的另一种方法涉及通过诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染等方法将基因转移到组织培养物中的细胞中。通常，转移方法包括将选择标记转移到细胞中。然后将细胞置于选择下以分离已摄取并表达转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞递送至受试者。 [0690] 在该实施方案中，在体内施用所得的重组细胞之前将核酸引入细胞中。这种引入可以通过本领域已知的任何方法进行，该方法包括但不限于转染、电穿孔、微量注射、用含有核苷酸序列的病毒或细菌噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。许多技术在本领域中已知用于将外源基因引入细胞中(参见例如，Loeffler和Behr,1993,Meth.Enzymol.217:599‑618；Cohen等人,1993, Meth.Enzymol.217:618‑644；Clin.Pharma.Ther.29:69‑92(1985))并且可以根据本文所提供的方法使用，条件是接受者细胞的必要发育和生理功能不被破坏。该技术应当提供核酸向细胞的稳定转移，使得核酸可被细胞表达，诸如可其细胞后代遗传并且可由其细胞后代表达。 [0691] 所得的重组细胞可以通过本领域已知的各种方法递送至受试者。重组血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)可以静脉内施用。设想使用的细胞的量取决于所需的效果、患者状态等，并且可以由本领域技术人员确定。 [0692] 出于基因疗法的目的，可以向其中引入核酸的细胞涵盖任何所需的、可获得的细胞类型，并且包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞；血细胞，诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如，如从骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏等获得的。 [0693] 在具体实施方案中，用于基因疗法的细胞对受试者而言是自体的。 [0694] 在基因疗法中使用重组细胞的实施方案中，将编码抗体的核酸序列引入细胞中，使得它们可被细胞或其后代表达，然后在体内施用重组细胞以实现治疗效果。在具体实施方案中，使用干细胞或祖细胞。可以根据本文所提供的方法的该实施方案潜在地使用可以在体外分离和维持的任何干细胞和/或祖细胞(参见例如，PCT公开WO 94/08598；Stemple和Anderson,1992,Cell7 1:973‑985；Rheinwald,1980,Meth.Cell Bio.21A:229；以及 Pittelkow和Scott,1986,Mayo Clinic Proc.61:771)。 [0695] 在具体实施方案中，出于基因疗法的目的将引入的核酸包含与编码区可操作地连接的诱导型启动子，使得可通过控制适当的转录诱导物的存在或不存在来控制核酸的表达。 [0696] 在另一个方面，本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以是工程化细胞表面受体诸如嵌合抗原受体(CAR)的一部分。典型地，CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。 [0697] 在一些实施方案中，本文提供了包含胞外结构域的CAR，该胞外结构域包含一种或多种本文所提供的抗体或其片段。 [0698] 本公开的CAR包含可以直接地或间接地融合至胞外抗原结合结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以来源于天然来源或合成来源。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜(优选地真核细胞膜)中热力学稳定的任何蛋白质结构。可以从天然存在的蛋白质获得对于在本文所述的CAR中使用相容的跨膜结构域。可替代地，其可以是合成的、非天然存在的蛋白质区段，例如，在细胞膜中热力学稳定的疏水性蛋白质区段。基于跨膜结构域的三维结构对跨膜结构域进行分类。例如，跨膜结构域可以形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β桶或能够跨越细胞的磷脂双层的任何其他稳定结构。此外，跨膜结构域还可以或可选择地基于跨膜结构域拓扑学(包括跨膜结构域穿过膜的通行次数和蛋白质的取向)进行分类。例如，单次通行膜蛋白穿过细胞膜一次，而多次通行膜蛋白穿过细胞膜至少两次(例如，2次、3次、 4次、5次、6次、7次或更多次)。膜蛋白可以被定义为I型、II型或III型，这取决于它们的末端和膜通行区段相对于细胞内部和外部的拓扑学。I型膜蛋白具有单个跨膜区，并且被取向使得蛋白质的N末端存在于细胞脂质双层的细胞外侧，并且蛋白质的C末端存在于细胞质侧。 II型膜蛋白也具有单个跨膜区，但是被取向使得蛋白质的C末端存在于细胞脂质双层的细胞外侧，并且蛋白质的N末端存在于细胞质侧。III型膜蛋白具有多个跨膜区段，并且可以基于跨膜区段的数目以及N末端和C末端的位置被进一步分为亚类。在一些实施方案中，本文所述的CAR的跨膜结构域来源于I型单次通行膜蛋白。在一些实施方案中，来自多次通行膜蛋白的跨膜结构域对于在本文所述的CAR中使用也可以是相容的。多次通行膜蛋白可以包含复合(至少2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个)α螺旋或β折叠结构。在一些实施方案中，多次通行膜蛋白的N末端和C末端存在于脂质双层的相对侧上，例如，蛋白质的N末端存在于脂质双层的细胞质侧上，并且蛋白质的C末端存在于细胞外侧。在一些实施方案中，CAR的跨膜结构域包含跨膜结构域，该跨膜结构域选自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA‑1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4‑1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL‑2Rβ、IL‑2Rγ、IL‑7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA‑6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDlla、LFA‑1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA‑1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB‑A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO‑3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C。在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的分子：CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152和PD1。 [0699] 用于本文所述的CAR的跨膜结构域还可以包含合成的非天然存在的蛋白质区段的至少一部分。在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的非天然存在的α螺旋或β折叠。在一些实施方案中，蛋白质区段为至少大约20个氨基酸，例如，至少18个、19个、20个、21个、22个、 23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸。合成跨膜结构域的实例是本领域已知的，例如在美国专利号7,052,906和PCT公开号WO 2000/032776中，其相关公开内容以引用的方式并入本文。 [0700] 本文所提供的跨膜结构域可以包含跨膜区和位于跨膜结构域的C末端侧的胞质区。跨膜结构域的胞质区可以包含三个或更多个氨基酸，并且在一些实施方案中，帮助定向在脂质双层中的跨膜结构域。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的跨膜区中。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的胞质区中。在一些实施方案中，跨膜结构域的胞质区包含带正电荷的氨基酸。在一些实施方案中，跨膜结构域的胞质区包含氨基酸精氨酸、丝氨酸和赖氨酸。 [0701] 在一些实施方案中，跨膜结构域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。在一些实施方案中，本文所提供的CAR的跨膜结构域包含人工疏水序列。例如，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体可以存在于跨膜结构域的C末端。在一些实施方案中，跨膜区主要包含疏水性氨基酸残基，诸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，跨膜区是疏水的。在一些实施方案中，跨膜区包含聚‑亮氨酸‑丙氨酸序列。蛋白质或蛋白质区段的亲水性、或者疏水或亲水特性可以通过本领域已知的任何方法(例如Kyte和 Doolittle亲水性分析)评估。 [0702] 本公开的CAR包含胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域负责活化表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞质信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能的蛋白质部分。尽管通常可以采用整个胞质信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用胞质信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可以用于代替完整链，只要其转导效应子功能信号即可。因此，术语胞质信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的胞质信号传导结构域的任何截短部分。 [0703] 在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含基本上由免疫效应细胞的初级胞内信号传导结构域组成的胞内信号传导结构域。“初级胞内信号传导结构域”是指以刺激方式起作用以诱导免疫效应子功能的胞质信号传导序列。在一些实施方案中，初级胞内信号传导结构域含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。如本文所用，“ITAM”是保守的蛋白质基序，其通常存在于在许多免疫细胞中表达的信号传导分子的末尾部分。基序可以包含由6个至8个氨基酸分开的氨基酸序列YxxL/I的两个重复序列，其中每个x独立地是任何氨基酸，产生保守基序YxxL/Ix(6‑8)YxxL/I。信号传导分子内的ITAM对于细胞内的信号转导是重要的，该信号转导至少部分地由在信号传导分子活化后在ITAM中的酪氨酸残基的磷酸化介导。ITAM还可以作为参与信号传导途径的其他蛋白质的停靠位点起作用。示例性的含ITAM的初级胞质信号传导序列包括衍生自CD3ζ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一些实施方案中，初级胞内信号传导结构域衍生自CD3ζ。 [0704] 除了刺激抗原特异性信号之外，许多免疫效应细胞需要共刺激，以促进细胞增殖、分化和存活并且以活化细胞的效应子功能。在一些实施方案中，CAR包含至少一个共刺激信号传导结构域。如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”是指蛋白质的介导细胞内的信号转导以诱导免疫应答(诸如效应子功能)的至少一部分。本文所述的嵌合受体的共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激蛋白质的胞质信号传导结构域，其转导信号并调节由免疫细胞(诸如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)介导的应答。“共刺激信号传导结构域”可以是共刺激分子的胞质部分。术语“共刺激分子”是指在免疫细胞(诸如T细胞)上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性地结合，从而介导免疫细胞的共刺激应答(诸如但不限于增殖和存活)。 [0705] 在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含单个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个或更多个(诸如约2个、3个、4个或更多个中的任一者)共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个或更多个相同的共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含来自不同共刺激蛋白质(诸如本文所述的任何两个或更多个共刺激蛋白质)的两个或更多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含初级胞内信号传导结构域 (诸如CD3ζ的胞质信号传导结构域)和一个或多个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个共刺激信号传导结构域和初级胞内信号传导结构域(诸如CD3ζ的胞质信号传导结构域)通过任选的肽接头彼此融合。初级胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域可以以任何合适的顺序排列。在一些实施方案中，该一个或多个共刺激信号传导结构域位于跨膜结构域与初级胞内信号传导结构域(诸如CD3ζ的胞质信号传导结构域)之间。多个共刺激信号传导结构域可以提供加和或协同的刺激作用。 [0706] 宿主细胞(例如，免疫细胞)中共刺激信号传导结构域的活化可以诱导细胞增加或减少细胞因子的产生和分泌、吞噬特性、增殖、分化、存活和/或细胞毒性。任何共刺激分子的共刺激信号传导结构域对于在本文所述的CAR中使用可能是相容的。共刺激信号传导结构域的类型基于诸如效应分子将在其中表达的免疫效应细胞的类型(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)和所需的免疫效应子功能(例如，ADCC效应)等因素来选择。用于在CAR中使用的共刺激信号传导结构域的实例可以是共刺激蛋白质的胞质信号传导结构域，该共刺激蛋白质包括但不限于B7/CD28家族的成员(例如，B7‑1/CD80、B7‑ 2/CD86、B7‑H1/PD‑L1、B7‑H2、B7‑H3、B7‑H4、B7‑H6、B7‑H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA‑4、Gi24/VISTA/B7‑H5、ICOS/CD278、PD‑1、PD‑L2/B7‑DC和PDCD6)；TNF超家族的成员(例如，4‑1BB/TNFSF9/CD137、4‑1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/ TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/ TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/ TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素‑α/TNF‑β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF‑α和TNF RII/TNFRSF1B)；SLAM家族的成员(例如，2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F‑10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA‑ 3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB‑A/SLAMF6和SLAM/CD150)；以及任何其他共刺激分子，诸如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai‑1、CD90/Thy1、CD96、CD160、封闭蛋白18.20、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA‑DR、Ikaros、整联蛋白α4/CD49d、整联蛋白α4β1、整联蛋白α4β 7/LPAM‑1、LAG‑3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin‑1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM‑ 1/KIM‑1/HAVCR、TIM‑4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原‑1(LFA‑1)和NKG2C。在一些实施方案中，该一个或多个共刺激信号传导结构域选自由以下组成的组：CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、CD3、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA‑1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7‑H3和特异性地结合CD83的配体(诸如CD83和MD‑2)。在一些实施方案中，在本公开的CAR中的胞内信号传导结构域包含衍生自CD137(即，4‑1BB)的共刺激信号传导结构域。在本公开的范围内还包括本文所述的任何共刺激信号传导结构域的变体，使得该共刺激信号传导结构域能够调节免疫细胞的免疫应答。在一些实施方案中，与野生型对应物相比，共刺激信号传导结构域包含多达10个氨基酸残基变异(例如，1个、2个、3个、4个、5个或8个)。包含一个或多个氨基酸变异的此类共刺激信号传导结构域可以被称为变体。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可以导致信号转导的增加和增强的对免疫应答的刺激。相对于不包含突变的共刺激信号传导结构域，共刺激信号传导结构域的氨基酸残基的突变可以导致信号转导的降低和减少的对免疫应答的刺激。 [0707] 本公开的CAR可以包含位于细胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间的铰链结构域。铰链结构域是通常在蛋白质的两个结构域之间发现的氨基酸区段，并且可以允许蛋白质的柔性和该结构域中的一个或两个相对于彼此的移动。可以使用提供这种柔性和细胞外抗原结合结构域相对于效应分子的跨膜结构域的移动的任何氨基酸序列。该铰链结构域可以含有约10个至100个氨基酸，例如，约15个至75个氨基酸、20个至50个氨基酸或30个至60个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，该铰链结构域的长度可以为至少约10个、11个、 12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个或75个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，该铰链结构域是天然存在的蛋白质的该铰链结构域。本领域已知包含铰链结构域的任何蛋白质的铰链结构域对于在本文所述的嵌合受体中使用是相容的。在一些实施方案中，该铰链结构域是天然存在的蛋白质的该铰链结构域的至少一部分并且对嵌合受体赋予柔性。在一些实施方案中，该铰链结构域衍生自CD8α。抗体(诸如IgG抗体、IgA抗体、IgM抗体、IgE抗体或IgD抗体)的铰链结构域也适用于本文所述的pH依赖性嵌合受体系统。在一些实施方案中，该铰链结构域是连接抗体的恒定结构域CH1和恒定结构域CH2的该铰链结构域。在一些实施方案中，该铰链结构域是抗体的该铰链结构域，并且包含抗体的该铰链结构域和抗体的一个或多个恒定区。在一些实施方案中，该铰链结构域包含抗体的该铰链结构域和抗体的CH3恒定区。在一些实施方案中，该铰链结构域包含抗体的该铰链结构域和抗体的CH2恒定区和CH3恒定区。在一些实施方案中，该抗体是IgG抗体、IgA抗体、IgM抗体、IgE抗体或IgD抗体。在一些实施方案中，该抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，该抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一些实施方案中，铰链区包含铰链区以及IgG1抗体的CH2恒定区和CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。非天然存在的肽也可以用作本文所述的嵌合受体的铰链结构域。在一些实施方案中，在Fc受体的胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域是肽接头，诸如(GxS)n接头，其中x和n独立地可以是3与12之间的整数，包括3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12或更大。 [0708] 本公开的CAR可以在多肽的N末端包含信号肽(也称为信号序列)。一般来讲，信号肽是将多肽靶向细胞中所需的位点的肽序列。在一些实施方案中，信号肽将效应分子靶向细胞的分泌途径并且将允许效应分子整合和锚定到脂质双层中。对于在本文所述的CAR中使用是相容的、包括天然存在的蛋白质的信号序列或合成的非天然存在的信号序列的信号肽对本领域技术人员来说是显而易见的。在一些实施方案中，信号肽衍生自选自由CD8α、GM‑CSF受体α和IgG1重链组成的组的分子。在一些实施方案中，信号肽衍生自CD8α。 [0709] 在又另一个方面，本文提供了包含本文所述的任一种CAR的宿主细胞(诸如免疫效应细胞)及其例如用于治疗疾病或病症的用途。 [0710] 5.8.诊断测定和方法 [0711] 免疫特异性地结合抗原的标记的结合分子(诸如标记的抗体)及其衍生物和类似物可以用于诊断目的，以检测、诊断或监测疾病。 [0712] 本文所提供的抗体可以用于使用如本文所述或本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法测定生物样品中的抗原水平(例如，参见Jalkanen等人,1985, J.Cell.Biol.101:976‑985；以及Jalkanen等人,1987,J.Cell.Biol.105:3087‑3096)。可用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定 (ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的并且包括酶标记，诸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟 (121In)和锝(99Tc)；发光标记，诸如鲁米诺；以及荧光标记，诸如荧光素和罗丹明；以及生物素。 [0713] 在本领域中应当理解，受试者的大小和所使用的成像系统将决定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况下，对于人类受试者，所注射的放射性的量通常在约5毫居里至20毫居里的99Tc的范围内。然后，标记的抗体将在含有特定蛋白质的细胞位置处积累。体内肿瘤成像描述于S.W.Burchiel等人,“Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.”(Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer中第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编辑，Masson Publishing Inc.(1982)中。 [0714] 取决于几个变量，包括所使用的标记的类型和施用模式，施用后允许标记的抗体在受试者的部位浓缩和允许未结合的标记的抗体被清除至背景水平的时间间隔为6小时至 48小时或6小时至24小时或6小时至12小时。在另一个实施方案中，施用后的时间间隔为5天至20天或5天至10天。 [0715] 可以使用本领域已知的用于体内扫描的方法在受试者中检测标记的分子的存在。这些方法取决于所使用的标记的类型。技术人员将能够确定用于检测特定标记的适当方法。可以用于本文所提供的诊断方法中的方法和装置包括但不限于计算机断层摄影(CT)、全身扫描诸如正电子发射断层摄影(PET)、磁共振成像(MRI)和超声波检查。 [0716] 在具体实施方案中，将分子用放射性同位素标记，并且使用辐射响应性外科仪器在患者中检测(Thurston等人，美国专利号5,441,050)。在另一个实施方案中，将分子用荧光化合物标记，并且使用荧光响应性扫描仪器在患者中检测。在另一个实施方案中，将分子用正电子发射金属标记，并且使用正电子发射断层摄影在患者中检测。在又另一个实施方案中，将分子用顺磁性标记进行标记，并且使用磁共振成像(MRI)在患者中检测。 [0717] 5.9.试剂盒 [0718] 本文还提供了试剂盒，其包含包装在合适的包装材料中的本文所提供的结合分子(例如，抗体)或其组合物(例如，药物组合物)。试剂盒任选地包括标签或包装插页，该标签或包装插页包括组分的描述或其中的组分在体外、在体内或离体使用的说明。 [0719] 术语“包装材料”是指容纳试剂盒的组分的物理结构。包装材料可以无菌地保持组分，并且可以由通常用于此类目的的材料制成(例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)。 [0720] 本文所提供的试剂盒可以包括标签或插页。标签或插页包括“印刷品”(例如，纸或纸板)，单独或附着于组分、试剂盒或包装材料(例如，盒)上，或附在例如含有试剂盒组分的安瓿、管或小瓶上。标签或插页可以另外包括计算机可读介质，诸如磁盘(例如，硬盘、卡、存储盘)；光盘，诸如CD‑或DVD‑ROM/RAM、DVD、MP3；磁带；或电存储介质，诸如RAM和ROM；或这些的混合，诸如磁性/光学存储介质、FLASH介质或存储型卡。标签或插页可以包括鉴定制造商信息、批号、制造商地址和日期的信息。 [0721] 本文所提供的试剂盒可以另外包括其他组分。试剂盒的每种组分可以被包封在单独的容器内，并且所有各个容器可以在单个包装内。试剂盒也可以被设计用于冷藏。试剂盒还可以被设计成含有本文所提供的抗体或含有编码本文所提供的抗体的核酸的细胞。可以将试剂盒中的细胞维持在适当的储存条件下直到准备好使用。 [0722] 本文还提供了免疫特异性地结合抗原的结合分子(诸如抗体)组。在具体实施方案中，本文提供了具有不同的缔合速率常数、不同的解离速率常数、对抗原的不同亲和力和/或对抗原的不同特异性的抗体组。在某些实施方案中，本文提供了约10种，优选地约25种、约50种、约75种、约100种、约125种、约150种、约175种、约200种、约250种、约300种、约350种、约400种、约450种、约500种、约550种、约600种、约650种、约700种、约750种、约800种、约 850种、约900种、约950种、或约1000种抗体或更多种抗体的组。抗体组可以用于例如96孔板或384孔板中，诸如用于诸如ELISA的测定。 [0723] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管可以在本发明的实践或测试中使用与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但是本文描述了合适的方法和材料。 [0724] 如本文所用，贯穿本文件的数值通常以范围形式呈现。范围形式的使用仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本发明范围的不可改变的限制，除非上下文另外清楚地指示。因此，范围的使用明确地包括所有可能的子范围、该范围内的所有单个数值、以及包括此类范围内的整数和范围内值或整数的分数的所有数值或数值范围，除非上下文另外清楚地指示。无论范围的宽度如何并且在贯穿本专利文件的所有上下文中，该构造都适用。因此，例如，提及90％‑100％的范围包括91％‑99％、92％‑98％、93％‑95％、91％‑98％、 91％‑97％、91％‑96％、91％‑95％、91％‑94％、91％‑93％等。提及90％‑100％的范围还包括91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％等，以及91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％等，92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％等，等等。 [0725] 此外，提及1‑3、3‑5、5‑10、10‑20、20‑30、30‑40、40‑50、50‑60、60‑70、70‑80、80‑90、90‑100、100‑110、110‑120、120‑130、130‑140、140‑150、150‑160、160‑170、170‑180、 180‑190、190‑200、200‑225、225‑250的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20等。在另一个实例中，提及25‑250、250‑500、500‑1,000、1,000‑2,500、2, 500‑5,000、5,000‑25,000、25,000‑50,000的范围包括此类值内或涵盖此类值的任何数值或范围，例如，25、26、27、28、29…250、251、252、253、254…500、501、502、503、504…等。 [0726] 还如本文所用，贯穿本文件公开了一系列范围。一系列范围的使用包括上限和下限的组合以提供另一个范围。无论范围的宽度如何并且在贯穿本专利文件的所有上下文中，该构造都适用。因此，例如，提及一系列范围诸如5‑10、10‑20、20‑30、30‑40、40‑50、50‑ 75、75‑100、100‑150包括范围诸如5‑20、5‑30、5‑40、5‑50、5‑75、5‑100、5‑150、以及10‑30、 10‑40、10‑50、10‑75、10‑100、10‑150、以及20‑40、20‑50、20‑75、20‑100、20‑150、等等。 [0727] 为了简明起见，本文使用了某些缩写。一个实例是表示氨基酸残基的单字母缩写。氨基酸及其对应的三字母和单字母缩写如下： [0728] 丙氨酸 Ala (A) [0729] 精氨酸 Arg (R) [0730] [0731] 在本文中使用肯定的语言一般性地公开了本发明以描述多个实施方案。本发明还特别地包括其中完全或部分排除特定主题的实施方案，诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案、程序、测定或分析。因此，即使本发明通常不以本发明不包括什么的方式在本文中表达，但在本文中仍然公开了未明确包括在本发明中的方面。 [0732] 6.实施方案 [0733] 本公开包括以下非限制性实施方案： [0734] 实施方案1.一种结合分子，其包含一个或多个结合结构域和功能结构域，所述一个或多个结合结构域结合在活化的肝星状细胞(HSC)上表达的一种或多种抗原，所述功能结构域能够增强针对活化的HSC的抗体效应子功能，其中任选地所述抗体效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。 [0735] 实施方案2.根据实施方案1所述的结合分子，其中所述功能结构域是： [0736] (i)包含增强ADCC的一个或多个突变的Fc区；或 [0737] (ii)活化免疫细胞的结构域，并且其中任选地所述免疫细胞是NK细胞。 [0738] 实施方案3.根据实施方案2所述的结合分子，其中所述功能结构域是包含增强ADCC的一个或多个突变的Fc区，并且其中任选地所述Fc区的所述一个或多个突变在根据EU 编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、247、248、250、 253、254、255、256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、268、269、270、272、274、276、 280、282、283、285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、303、307、 311、312、313、315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、 337、338、339、340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、 380、382、383、384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、401、413、414、415、416、418、 419、421、422、424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、440、442、444和/或447处。 [0739] 实施方案4.根据实施方案3所述的结合分子，其中所述Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。 [0740] 实施方案5.根据实施方案2所述的结合分子，其中所述功能结构域是活化免疫细胞的结构域，并且其中所述功能结构域促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导。 [0741] 实施方案6.根据实施方案5所述的结合分子，其中所述功能结构域结合和/或调节免疫细胞上的受体，并且其中任选地所述受体选自由以下组成的组：NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、 2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4、TIGIT、PVRIG和A2a。 [0742] 实施方案7.根据实施方案5或实施方案6所述的结合分子，其中所述功能结构域结合NKG2D。 [0743] 实施方案8.根据实施方案7所述的结合分子，其中所述功能结构域衍生自NKG2D配体。 [0744] 实施方案9.根据实施方案8所述的结合分子，其中所述功能结构域是MICA、MICB、ULBP1或ULBP2的胞外结构域或其片段或变体，并且其中任选地所述功能结构域包含SEQ ID NO:90‑93中任一者的氨基酸序列或其片段。 [0745] 实施方案10.根据实施方案5或实施方案6所述的结合分子，其中所述功能结构域结合NKp46。 [0746] 实施方案11.根据实施方案10所述的结合分子，其中所述功能结构域包含与NKp46结合的抗体。 [0747] 实施方案12.根据实施方案11所述的结合分子，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:87所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:88所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 [0748] 实施方案13.根据实施方案12所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:63 的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:65 的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列。 [0749] 实施方案14.根据实施方案12或实施方案13所述的结合分子，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL。 [0750] 实施方案15.根据实施方案5所述的结合分子，其中所述功能结构域结合TGFb。 [0751] 实施方案16.根据实施方案15所述的结合分子，其中所述功能结构域包含TGFb受体II胞外结构域(TRII)或其片段或变体，并且其中任选地所述功能结构域包含SEQ ID NO: 94的氨基酸序列或其片段。 [0752] 实施方案17.根据实施方案5或实施方案6所述的结合分子，其中所述功能结构域结合TIGIT。 [0753] 实施方案18.根据实施方案17所述的结合分子，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:265所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:266所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 [0754] 实施方案19.根据实施方案18所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列。 [0755] 实施方案20.根据实施方案18或实施方案19所述的结合分子，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:265的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:266的氨基酸序列的VL。 [0756] 实施方案21.根据实施方案5或实施方案6所述的结合分子，其中所述功能结构域结合PVRIG。 [0757] 实施方案22.根据实施方案21所述的结合分子，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:273所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:274所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 [0758] 实施方案23.根据实施方案22所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。 [0759] 实施方案24.根据实施方案21或实施方案22所述的结合分子，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VL。 [0760] 实施方案25.根据实施方案5至24中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子还包含Fc区，所述Fc区包含增强ADCC的一个或多个突变。 [0761] 实施方案26.根据实施方案25所述的结合分子，其中所述Fc区包含在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、247、248、250、253、 254、255、256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、268、269、270、272、274、276、280、 282、283、285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、303、307、311、 312、313、315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、 338、339、340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、 382、383、384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、401、413、414、415、416、418、419、 421、422、424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、440、442、444和/或447处的一个或多个突变。 [0762] 实施方案27.根据实施方案26所述的结合分子，其中所述Fc区包含S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L突变。 [0763] 实施方案28.根据实施方案1至27中任一项所述的结合分子，其中在所述HSC上表达的所述抗原选自由以下组成的组：5HT1B、5HT1F、5HT2A、5‑HT2B、5‑HT7、A2a、A2b、a1b1整联蛋白、a2bi整联蛋白、a5b1整联蛋白、a6b4整联蛋白、a8b1整联蛋白、avb1整联蛋白、avb3整联蛋白、ACVR2A、ACVR2B、AdipoR1、AdipoR2、ADRA1A、ADRA1B、ANTXR1、AT1、AT2、BAMBI、BMPR2、C5aR、CB1、CB2、CCR1、CCR2、CCR5、CCR7、CD105、CD112、CD14、CD146、CD155、CD248、CD36、CD38、CD40、CD44、CD49e、CD62e、CD73、CD95、c‑MET、CNTFR、CXCR3、CXCR4、DDR1、DDR2、EGFR、ETA、ETB、FAP、FGFR2、FN、gp130、GPC3、GPR91、ICAM‑1、IGF‑1R、IGF‑2R、IL‑10R2、IL‑ 11RA、IL‑17RA、IL‑20R1、IL‑20R2、IL‑22R1、IL‑6R、KCNE4、ITGA8、LRP、MICA、MICB、NCAM、NGFR、NPR‑B、NPR3、OB‑Ra、OB‑Rb、OPRD1、P2X4、P2X7、P2Y6、p75NTR、PAFR、PAR1、PAR2、PAR4、PDGFRA、PDGFRB、PD‑L1、PD‑L2、Ptc、PTH‑1R、RAGE、SIRPA、CD47、SYP、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、TNFR1、TRKB、TRKC、ULBP1、ULPB2、uPAR、VACM‑1、VEGFR‑1和VEGFR‑2。 [0764] 实施方案29.根据实施方案1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是PDGFRb。 [0765] 实施方案30.根据实施方案29所述的结合分子，其中所述结合结构域包含如SEQ ID NO:67所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:68所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 [0766] 实施方案31.根据实施方案30所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。 [0767] 实施方案32.根据实施方案30或实施方案31所述的结合分子，其中所述结合结构域包含含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。 [0768] 实施方案33.根据实施方案1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是SIRPA。 [0769] 实施方案34.根据实施方案33所述的结合分子，其中所述结合结构域包含 [0770] (i)如SEQ ID NO:69所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQID NO:70所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3； [0771] (ii)如SEQ ID NO:71所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQID NO:72所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 [0772] (iii)如SEQ ID NO:73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQID NO:74所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 [0773] 实施方案35.根据实施方案34所述的结合分子，其中： [0774] (i)所述HCDR1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列； [0775] (ii)所述HCDR1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列；或 [0776] (iii)所述HCDR1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:22 的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。 [0777] 实施方案36.根据实施方案34或实施方案35所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： [0778] (i)含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL； [0779] (ii)含有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；或 [0780] (iii)含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL。 [0781] 实施方案37.根据实施方案1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是FAPα。 [0782] 实施方案38.根据实施方案37所述的结合分子，其中所述结合结构域包含 [0783] (i)如SEQ ID NO:75所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQID NO:76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 [0784] (ii)如SEQ ID NO:77所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQID NO:78所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 [0785] 实施方案39.根据实施方案38所述的结合分子，其中： [0786] (i)所述HCDR1包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 30的氨基酸序列；或 [0787] (ii)所述HCDR1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 36的氨基酸序列。 [0788] 实施方案40.根据实施方案38或实施方案39所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： [0789] (i)含有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL；或 [0790] (ii)含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL。 [0791] 实施方案41.根据实施方案1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是PD‑L1。 [0792] 实施方案42.根据实施方案41所述的结合分子，其中所述结合结构域包含如SEQ ID NO:79所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:80所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 [0793] 实施方案43.根据实施方案42所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:39 的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:41 的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。 [0794] 实施方案44.根据实施方案42或实施方案43所述的结合分子，其中所述结合结构域包含含有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL。 [0795] 实施方案45.根据实施方案1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是uPAR。 [0796] 实施方案46.根据实施方案45所述的结合分子，其中所述结合结构域包含如SEQ ID NO:81所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:82所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 [0797] 实施方案47.根据实施方案46所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:45 的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:47 的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。 [0798] 实施方案48.根据实施方案46或实施方案47所述的结合分子，其中所述结合结构域包含含有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL。 [0799] 实施方案49.根据实施方案1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是IGF‑1R。 [0800] 实施方案50.根据实施方案49所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： [0801] (i)如SEQ ID NO:83所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:84所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 [0802] (ii)如SEQ ID NO:85所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:86所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 [0803] 实施方案51.根据实施方案50所述的结合分子，其中： [0804] (i)所述HCDR1包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 54的氨基酸序列；或 [0805] (ii)所述HCDR1包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO: 60的氨基酸序列。 [0806] 实施方案52.根据实施方案50或实施方案51所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： [0807] (i)含有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL；或 [0808] (ii)含有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VL。 [0809] 实施方案53.根据实施方案1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是NKG2D配体，并且其中任选地所述NKG2D配体是MICA、MICB、ULBP1或ULBP2。 [0810] 实施方案54.根据实施方案53所述的结合分子，其中所述结合结构域包含NKG2D胞外结构域或其片段或变体，并且其中任选地所述结合结构域包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列或其片段。 [0811] 实施方案55.根据实施方案1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是ANTXR1。 [0812] 实施方案56.根据实施方案55所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： [0813] (i)如SEQ ID NO:225所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:226所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 [0814] (ii)如SEQ ID NO:233所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:234所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 [0815] 实施方案57.根据实施方案56所述的结合分子，其中： [0816] (i)所述HCDR1包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:228的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 230的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列；或 [0817] (ii)所述HCDR1包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:236的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:237的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 238的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:239的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:240的氨基酸序列。 [0818] 实施方案58.根据实施方案56或实施方案57所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： [0819] (i)含有SEQ ID NO:225的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:226的氨基酸序列的VL；或 [0820] (ii)含有SEQ ID NO:233的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:232的氨基酸序列的VL。 [0821] 实施方案59.根据实施方案1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是CD248。 [0822] 实施方案60.根据实施方案59所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： [0823] (i)如SEQ ID NO:241所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:242所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或 [0824] (ii)如SEQ ID NO:249所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:250所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。 [0825] 实施方案61.根据实施方案60所述的结合分子，其中： [0826] (i)所述HCDR1包含SEQ ID NO:243的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:244的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:245的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 246的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:247的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:248的氨基酸序列；或 [0827] (ii)所述HCDR1包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 254的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:256的氨基酸序列。 [0828] 实施方案62.根据实施方案60或实施方案61所述的结合分子，其中所述结合结构域包含： [0829] (i)含有SEQ ID NO:241的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:242的氨基酸序列的VL；或 [0830] (ii)含有SEQ ID NO:249的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:250的氨基酸序列的VL。 [0831] 实施方案63.根据实施方案1至28中任一项所述的结合分子，其中所述抗原是GPC3。 [0832] 实施方案64.根据实施方案63所述的结合分子，其中所述结合结构域包含如SEQ ID NO:257所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3、以及如SEQ ID NO:258所示的LCDR1、LCDR2和 LCDR3。 [0833] 实施方案65.根据实施方案64所述的结合分子，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:259的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:260的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:261的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:262的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:263的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO:264的氨基酸序列。 [0834] 实施方案66.根据实施方案64或实施方案65所述的结合分子，其中所述结合结构域包含含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:258的氨基酸序列的VL。 [0835] 实施方案67.根据实施方案1至66中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子是IgG抗体或包含所述IgG抗体的融合蛋白。 [0836] 实施方案68.根据实施方案67所述的结合分子，其中所述抗体是人源化抗体。 [0837] 实施方案69.一种核酸分子，其编码根据实施方案1至68中任一项所述的结合分子或其片段。 [0838] 实施方案70.一种载体，其包含根据实施方案69所述的核酸分子。 [0839] 实施方案71.一种宿主细胞，其用根据实施方案70所述的载体转化。 [0840] 实施方案72.一种组合物，其包含治疗有效量的根据实施方案1至68中任一项所述的结合分子、根据实施方案69所述的核酸分子或根据实施方案70所述的载体、以及药学上可接受的赋形剂。 [0841] 实施方案73.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用根据实施方案72所述的组合物。 [0842] 实施方案74.根据实施方案73所述的方法，其中所述疾病或病症与活化的HSC相关。 [0843] 实施方案75.根据实施方案74所述的方法，其中所述疾病或病症是肝纤维化。 [0844] 实施方案76.一种消耗受试者中的活化的HSC的方法，其包括向所述受试者施用根据实施方案72所述的组合物。 [0845] 实施方案77.根据实施方案76所述的方法，其中所述受试者患有与活化的HSC相关的疾病或病症。 [0846] 实施方案78.根据实施方案77所述的方法，其中所述疾病或病症是肝纤维化。 [0847] 已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，以下实施例旨在说明而非限制在权利要求书中或以其他方式在本公开中所描述的本发明的范围。 [0848] 7.实施例 [0849] 以下是在研究中所使用的各种方法和材料的描述，并且被提出以便向本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本公开的完整公开内容和描述，并且不旨在限制本发明人认为是其公开的内容的范围，也不旨在表示进行了下面的实验并且下面的实验是可以进行的所有实验。应当理解，以一般现在时书写的示例性描述不一定被执行，而是可以执行这些描述以产生与本公开的教导相关联的数据等。已经努力确保所使用的数字(例如，量、百分比等)的准确性，但应该考虑一些实验误差和偏差。 [0850] 7.1.实施例1：用于靶向活化的肝星状细胞(HSC)的构建体 [0851] 活化的肝星状细胞(HSC)是在肝损伤时介导纤维发生的关键类型的细胞。非常需要靶向活化的HSC的治疗方法来减缓或预防纤维化形成并且改善患有肝纤维化或肝硬化的患者的生活质量。然而，尚未开发出通过由抗体消耗活化的HSC的成功策略。在本研究中，产生与在活化的HSC细胞上表达的抗原结合的抗体，并且其表现出吸引免疫系统以清除肝中的这些细胞。通过减少肝损伤后活化的HSC的数量，抗体可以有效地减缓肝纤维化的进展。 [0852] 根据本公开，可以靶向具有足够胞外结构域的可被抗体识别的表面抗原。本文所提供的示例性非限制性表面抗原包括：5HT1B、5HT1F、5HT2A、5‑HT2B、5‑HT7、A2a、A2b、a1b1整联蛋白、a2bi整联蛋白、a5b1整联蛋白、a6b4整联蛋白、a8b1整联蛋白、avb1整联蛋白、avb3整联蛋白、ACVR2A、ACVR2B、AdipoR1、AdipoR2、ADRA1A、ADRA1B、ANTXR1、AT1、AT2、BAMBI、BMPR2、C5aR、CB1、CB2、CCR1、CCR2、CCR5、CCR7、CD105、CD112、CD14、CD146、CD155、CD248、CD36、CD38、CD40、CD44、CD49e、CD62e、CD73、CD95、c‑MET、CNTFR、CXCR3、CXCR4、DDR1、DDR2、EGFR、ETA、ETB、FAP、FGFR2、FN、gp130、GPC3、GPR91、ICAM‑1、IGF‑1R、IGF‑2R、IL‑10R2、IL‑11RA、IL‑17RA、IL‑20R1、IL‑20R2、IL‑22R1、IL‑6R、KCNE4、ITGA8、LRP、MICA、MICB、NCAM、NGFR、NPR‑B、NPR3、OB‑Ra、OB‑Rb、OPRD1、P2X4、P2X7、P2Y6、p75NTR、PAFR、PAR1、PAR2、PAR4、PDGFRA、PDGFRB、PD‑L1、PD‑L2、Ptc、PTH‑1R、RAGE、SIRPA、CD47、SYP、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、TNFR1、TRKB、TRKC、ULBP1、ULPB2、uPAR、VACM‑1、VEGFR‑1和VEGFR‑2。 [0853] 在本实施例中研究了在HSC细胞上的多种示例性表面抗原。构建并测试了靶向在活化的HSC细胞上表达的已知抗原(包括PDGFRb、FAPa、NKG2D ligands、uPAR、IGF1R、CD248)的示例性抗体(包括含Fc的结合分子)。另外，鉴定和研究了三种新的表达表面蛋白 (ANTXR1、SIRPA和PD‑L1)的HSC。 [0854] 抗FAPa抗体、抗CD248抗体、抗ANTXR1抗体和抗GPC3抗体被工程化为mIgG2a。其他测试抗体被重组工程化为hIgG1。通过将两个拷贝的NKG2D胞外结构域融合至hIgG1 Fc来工程化NKG2D‑Fc重组蛋白。工程化并表达具有来自鼠抗体的可变区和来自hIgG1的恒定区的嵌合抗SIRPA抗体。将人源化抗PD‑L1抗体表达为hIgG1同种型。这些示例性构建体的序列显示在下表中。 [0855] [0856] [0857] [0858] [0859] [0860] [0861] [0862] [0863] [0864] 表2.示例性胞外结构域的序列 [0865] [0866] [0867] 表3.示例性接头的序列 [0868] [0869] 表4.示例性构建体的全长序列 [0870] [0871] [0872] [0873] [0874] [0875] [0876] [0877] [0878] [0879] [0880] [0881] [0882] [0883] [0884] [0885] [0886] [0887] [0888] [0889] [0890] [0891] 在图1A‑图1J中证明了这些示例性构建体对它们各自抗原的结合活性。简言之，将PDGFRb、FAPa、ULBP1、uPAR、IGF1R、SIRPA、PD‑L1、ANTXR1、CD248或GPC3的重组胞外结构域(30ng/孔)包被在白色optiplate TM‑384孔HB板上。在过夜包被之后，进行标准直接ELISA测定。在使用与HRP缀合的二抗之后检测发光信号。基于剂量依赖性结合曲线确定每种抗体的结合活性。 [0892] 使用FACS测定在活化的HSC上抗原的相对表达水平。在培养基(ScienCell，5300)中培养人原代肝星状细胞(ScienCell，5301)。使用2ng/ml人TGFb1(Sinobiological， 10804‑HNAC)将细胞活化24小时。然后收集这些细胞用于FACS测定。简言之，将细胞与封闭缓冲液(10％ FBS的PBS溶液)中的10ug/ml一抗在4℃下温育1小时。在两轮PBS洗涤之后，将细胞用与荧光团缀合的二抗染色。使用FACS测量平均荧光强度。将FACS结果总结在图2A‑图 2F中。在所测试的抗原中，成纤维细胞活化蛋白α(FAPa)以相对高的水平表达，而uPAR、IGF‑ 1R、GPC3、CD248和NKG2D配体在TGFb1活化的HSC细胞上以相对低的水平表达。 [0893] 通过将人原代NK或PBMC细胞与TGFb1活化的HSC细胞共培养进行体外抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定。简言之，在含有10％FBS的RPMI 1640培养基中用100U/ml IL‑2将人原代NK或PBMC细胞活化过夜。用2ng/ml hTGFb1将人原代HSC细胞活化过夜。在 ADCC测定当天，收集活化的HSC细胞并将其接种到U形96孔板上。将这些细胞用不同浓度的测试抗体(全部在Fc区含有S239D/I332E突变)在37℃下预处理30分钟。预处理之后，收集活化的NK或PBMC细胞并将它们以E:T比率＝4:1(对于NK细胞)或以E:T比率＝25:1或50:1(对于PBMC细胞)接种到板上。将共培养物在37℃下再培养4小时。共培养之后，收集培养基并且通过CytoTox 非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega，G1780)测量从濒死细胞释放的 LDH。如图3A‑图3G中所示，在将人NK/PBMC与HSC细胞共培养之后，所有靶向表面抗原的抗体均对HSC发挥ADCC细胞毒性。通过测试抗体或测试蛋白质诱导的细胞毒性的量级由于靶蛋白的表达水平而不同。只要靶抗原在活化的HSC细胞上表达，就存在使用抗体或重组蛋白的ADCC效应。 [0894] 7.2实施例2：Fc效应子功能是对活化的HSC的ADCC细胞毒性所必需的。 [0895] 在抗体的Fc区与免疫细胞上的Fcγ受体之间的相互作用对于效应子功能是关键的，该效应子功能包括ADCC、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)等。在人IgG1的Fc区上的非岩藻糖基化和某些突变两者均增强ADCC的效应子功能。此类示例性的非限制性Fc突变包括Fc 变体，其含有在根据EU编号的位置233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、 246、247、248、250、253、254、255、256、258、260、262、263、264、265、266、267、268、268、269、 270、272、274、276、280、282、283、285、286、288、290、292、293、294、295、296、297、298、299、 300、301、303、307、311、312、313、315、317、318、320、322、325、326、327、328、329、330、331、 332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、345、347、355、356、358、359、360、361、362、 373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、390、391、392、396、398、400、401、413、 414、415、416、418、419、421、422、424、428、430、433、434、435、436、437、438、439、440、442、 444、447处的一个或多个氨基酸改变(参见例如，Sondermann等人,Nature,406:267‑273 (2000)；US8951517B2；US9714282B2；和US20090208500A1，其各自以引用的方式并入本文)，该一个或多个氨基酸改变可以被引入本发明的含Fc的结合分子中以增强ADCC。 [0896] 将示例性突变引入Fc区以增强或消除效应子功能，尤其是ADCC活性。工程化S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/ Y300L突变以增强效应子功能。工程化L234A/L235A或N297S以清除效应子功能。示例性的恒定区及其变体显示在下表5中。 [0897] 通过将IL‑2活化的NK或PBMC与hTGFb1活化的人原代HSC细胞共培养来进行体外ADCC测定。如图4A中所示，具有野生型hIgG1 Fc的抗SIRPA抗体α‑SIRPA 2诱导对HSC细胞的剂量依赖性ADCC细胞毒性。突变(S239D/I332E、S239D/A330L/I332E、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L或F243L/R292P/Y300L)增强了这种效应。沉默突变L234A/L235A完全降低了 ADCC效应。对于抗PDGFRb抗体和NKG2D‑Fc融合蛋白，还观察到Fc依赖性ADCC效应。如图4B和图4C中所示，具有增强的效应子功能的S239D/I332E突变增加了ADCC细胞毒性，而沉默突变(对于抗PDGFRb抗体为N297S，对于NKG2D‑Fc蛋白为L234A/L235A)消除了ADCC效应。 [0898] 表5.示例性恒定区序列 [0899] [0900] [0901] [0902] 本文证明了Fc效应子功能对于体内消耗肝活化的HSC也是必需的。具有增强的ADCC效应子功能的抗体可以有效地清除在小鼠肝脏中的活化的HSC，而具有消除的ADCC效应子功能的可比较抗体在肝纤维化的小鼠模型中没有效果。简言之，将雄性野生型C57小鼠用CCL4(0.7ml/kg，腹膜内注射，每周三次)处理三周以诱导HSC细胞活化和肝纤维化。向这些动物给予单剂量(45mg/kg，静脉内注射)的具有与重链C末端融合的TGFb1受体II胞外结构域(TRII)的抗小鼠PDGFRb抗体(1B3，参见US7740850B2)的双特异性抗体(1B3‑TRII S239D/I332E和1B3‑TRII L234A/L235A)。这些抗体全部被工程化为mIgG2a，并且具有 S239D/I332E作为效应子功能增强突变或L234A/L235A作为效应子功能沉默突变的Fc突变。在抗体给药后48小时收集肝组织。将肝样品在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中均质化。离心之后，收集上清液作为肝裂解物。通过蛋白质印迹测量肝裂解物中的总PDGFRb蛋白水平作为肝中活化的HSC细胞消耗的指示。如图5中所示，1B3‑TRII S239D/ I332E(具有重链C末端连接的TRII、mIgG2a、在Fc中的S239D/I332E突变的抗mPDGFRb抗体) 处理显著降低了肝中的总PDGFRb蛋白水平，而1B3‑TRII L234A/L235A(具有重链C末端连接的TRII、mIgG2a、在Fc中的L234A/L235A突变的抗mPDGFRb抗体)对总PDGFRb蛋白水平没有影响。将另外的肝样品在裂解缓冲液(PBS:Me 3:1)中均质化。离心之后，收集上清液用于确定肝中的抗体浓度。使用小鼠PDGFRb ECD作为包被抗原和抗TRII抗体作为检测抗体使用直接 ELISA测量肝中的测试抗体水平。在1B3‑TRII S239D/I332E治疗组与1B3‑TRII L234A/ L235A治疗组之间观察到肝中可比较的抗体浓度(图6)，表明两个治疗组对总PDGFRb水平的不同效应不是由于肝中不同的抗体暴露。 [0903] 接下来，在经CCL4处理的小鼠中进行抗小鼠PDGFRb抗体的多剂量研究。用CCL4(0.7ml/kg，腹膜内注射，每周三次)处理雄性野生型C57BL/6J小鼠三周以诱导HSC细胞活化。然后，向这些小鼠给予45mg/kg的抗小鼠PDGFRb双特异性抗体(1B3‑TRII S239D/I332E、 1B3‑TRII L234A/L235A)(静脉内，每周两次，持续4周，总共8个剂量)，同时再进行CCL4注射 4周。收集肝样品并将其在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中均质化。离心之后，收集上清液作为肝裂解物。通过夹心ELISA测量肝裂解物中的总PDGFRb水平。使用抗PDGFRb抗体(abcam Ab32570)作为捕获抗体。使用1B3 mIgG2a作为检测抗体。如图12C中所示，与单剂量研究一致，多剂量的1B3‑TRII S239D/I332E处理显著降低肝中的总PDGFRb蛋白水平，而多剂量的1B3‑TRII L234A/L235A对总PDGFRb蛋白水平没有显著影响，证实了抗体Fc效应子功能对体内消耗活化的HSC的关键作用。抗体暴露不太可能促成这种对HSC消耗的差异效应。使用小鼠PDGFRb作为包被抗原和抗TRII抗体作为检测抗体使用直接ELISA确定血清抗体水平。在处理开始后第9天和第27天，血清中的1B3‑TRII S239D/I332E浓度低于 1B3‑TRII L234A/L235A(图7)。 [0904] 这些结果证明，具有增强的ADCC效应子功能的活化的HSC靶向抗体可以在体外和在体内有效地消耗活化的HSC，因此可以用作活化的HSC相关的纤维化疾病或病症的有效治疗剂。 [0905] 7.3.实施例3：通过靶向多种表面蛋白增加对活化的HSC的细胞毒性 [0906] 双特异性抗体被设计为靶向aHSC细胞上的多个靶标。将NKG2D的胞外结构域与α‑PDGFRb 1S239D/I332E融合以制备杵臼结构双特异性抗体(α‑PDGFRb 1‑NKG2D KIH S239D/I332E)。这种双特异性抗体可以识别在aHSC细胞上表达的人PDGFRb和NKG2D配体(例如， MICA、MICB)。其示例性构建体显示于下表6中。纯化双特异性抗体α‑PDGFRb 1‑NKG2D KIH S239D/I332E。如图8A和图8B中所示，双特异性抗体α‑PDGFRb 1‑NKG2DKIH S239D/I332E在ELISA测定中以剂量依赖性方式结合人PDGFRb ECD和MICA ECD两者。在体外ADCC测定中，α‑PDGFRb 1‑NKG2D KIH S239D/I332E、α‑PDGFRb 1S239D/I332E和NKG2D hIgG1 Fc S239D/I332E全部均剂量依赖性地增加对aHSC细胞的细胞毒性。与单独的α‑PDGFRb 1S239D/I332E或NKG2D hIgG1 Fc S239D/I332E处理相比，α‑PDGFRb 1‑NKG2D KIH S239D/I332E进一步增加了最大aHSC杀伤(图8C)。 [0907] 表6.示例性α‑PDGFRb1‑NKG2DKIHS239D/I332E构建体的全长序列 [0908] [0909] [0910] 7.4.实施例4：通过活化免疫细胞增加对活化的HSC的细胞毒性 [0911] 除了Fc依赖性效应子功能之外，通过操纵细胞上的免疫受体的活性来活化免疫细胞(诸如NK细胞)可以是进一步增强对活化的HSC的细胞毒性的另一种方法。在非限制性方面，这些免疫检查点受体包括：NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、CD94、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR2DS2、KIR2DL4、KIR3DS1、CD160、NKG2D、NKp80、DNAM1、2B4、NTB‑A、CRACC、4‑1BB、OX40、CRTAM、CD16、LFA1、NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、LILRB1、KIR2DL5、KLRG1、CD161、SIGLEC7、SIGLEC9、LAIR1、TIGIT、CD96、PD‑1、PVRIG、CD122、CD132、CD218a、CD218b、IL12Rb1、IL12Rb2、IL21R、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVR2A、ACVR2B、ALK4和A2a。 [0912] 为了进一步研究调节免疫细胞受体的活性对针对消耗HSC的细胞介导的细胞毒性的影响，开发了多种设计和构建体。双特异性抗体被设计成具有与活化的HSC结合的一个基序和活化免疫细胞的另一个基序。NKG2D是在具有细胞毒性活性的免疫细胞上表达的活化受体。NKG2D的接合可以活化免疫细胞以对靶细胞发挥溶细胞功能。设计并纯化NKG2D配体 (例如，MICA、MICB、ULBP1、ULBP2)的ECD与抗PDGFRb抗体重链的N末端或C末端融合的双特异性抗体。其示例性构建体显示于下表7中。 [0913] 在体外ADCC细胞毒性测定中评价这些双特异性构建体的效果。为了避免干扰抗体Fc效应子ADCC功能，这些抗体被工程化以含有效应子功能沉默突变(L234A/L235A)以消除在Fc与Fcγ受体之间的相互作用。如图9中所示，与单独的抗PDGFRb抗体相比，ULBP2的ECD与抗PDGFRb抗体重链的N末端融合的双特异性抗体可以有效地诱导对活化的HSC细胞的更多细胞毒性，表明NKG2D信号传导途径的活化可以进一步增强对活化的HSC的抗体依赖性细胞毒性。 [0914] 表7.示例性α‑PDGFRb1蛋白融合物构建体的全长序列 [0915] [0916] [0917] [0918] [0919] [0920] [0921] [0922] [0923] [0924] [0925] [0926] [0927] [0928] [0929] [0930] [0931] [0932] [0933] [0934] [0935] [0936] [0937] [0938] [0939] [0940] [0941] [0942] [0943] [0944] [0945] [0946] [0947] [0948] NKp46信号传导的活化也可以增强对活化的HSC的ADCC细胞毒性。NKp46是在NK细胞上表达的另一种活化受体。通过将抗NKp46激动剂抗体融合至抗PDGFRb抗体重链的C末端来设计双特异性抗体。其示例性构建体显示于下表8中。将Fc突变(增强效应子功能的 S239D/I332E或消除效应子功能的N297S)引入双特异性抗体中。在体外ADCC细胞毒性测定中表达、纯化和评价这些抗体。如图10中所示，抗NKp46激动剂抗体与抗PDGFRb抗体的融合显著增强了对TGFb1活化的人HSC细胞的ADCC细胞毒性。当Fc效应子功能被N297S突变沉默时，这种效应更加明显。 [0949] 表8.示例性α‑PDGFRb1‑α‑NKp461融合物构建体的全长序列 [0950] [0951] [0952] [0953] [0954] [0955] [0956] 通过表达抑制性免疫检查点受体的多种配体，aHSC抑制肝中的NK细胞的活性。阻断这些配体与它们的抑制性免疫检查点受体之间的相互作用是调节NK细胞活性的另一种方式。如图11A和图11B中所示，在用或不用2ng/ml TGFb1处理的情况下，CD155(TIGIT的配体)和CD112(PVRIG的配体)在人HSC细胞上高度表达。用Calcein‑AM荧光染料标记TGFb1活化的HSC细胞。通过释放到培养基中的Calcein‑AM的量来测量ADCC细胞毒性。通过α‑TIGIT 1IgG1抗体阻断CD155与TIGIT之间的相互作用或通过α‑PVRIG 1IgG4阻断CD112与PVRIG之间的相互作用显著增加了NK细胞对活化的HSC细胞的基线ADCC细胞毒性(图11C)。重要的是，与单独的α‑PDGFRb 1S239D/I332E处理相比，3ug/mlα‑TIGIT 1IgG1与一系列浓度的α‑PDGFRb 1S239D/I332E的组合诱导更多的对aHSC的ADCC细胞毒性(图11D)。 [0957] TGFb是免疫阻遏性细胞因子。已知其抑制免疫细胞的细胞毒性活性。TGFb对其受体具有高结合亲和力。可溶性TGFb受体II ECD(TRII)已被用作诱饵受体以阻断TGFb信号传导。为了阻断TGFb的免疫阻遏功能，通过将TRII与抗人PDGFRb抗体的重链C末端融合来设计双特异性抗体。示例性构建体显示于表7中。将该双特异性抗体与单独的抗PDGFRb抗体一起在体外ADCC细胞毒性测定中进行测试。人原代HSC被hTGFb1活化24小时。在ADCC测定的当天，收集活化的HSC细胞并将其与原代NK细胞在RPMI 1640培养基中共培养。在ADCC测定过程期间，培养基中不包含TGFb1。在具有TRII的抗PDGFRb抗体处理的组与单独的抗PDGFRb抗体处理的组之间没有观察到ADCC细胞毒性的显著差异(图12A)。 [0958] 尽管在体外ADCC测定中没有观察到显著差异，但在抗小鼠PDGFRb抗体连接的TRII处理组与抗小鼠PDGFRb抗体组之间观察到差异体内效应。在CCL4处理的小鼠模型中评价抗小鼠PDGFRb抗体TRII双特异性的体内活性。用CCL4处理雄性野生型C57BL/6J小鼠三周以诱导HSC细胞活化。然后向这些小鼠给予45mg/kg的抗mPDGFRb抗体TRII双特异性抗体(1B3‑ TRII S239D/I332E)(静脉内，每周两次，持续4周，总共8个剂量)、抗mPDGFRb抗体(1B3 S239D/I332E)(静脉内，每周一次，持续4周，总共4个剂量)，并且将CCL4再注射4周。将Fc突变S239D/I332E工程化到抗体中以增强效应子功能。mIgG2a同种型对照抗体连接的TRII双特异性抗体组(ISO‑TRII)(静脉内，每周一次，持续4周，总共4个剂量)也包括在本研究中。在抗体处理开始后第9天和第27天收集血清样品。在研究结束时收集肝样品并将其在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中均质化。离心之后，收集上清液作为肝裂解物。通过夹心ELISA测量肝裂解物中的总PDGFRb水平。使用抗PDGFRb抗体(abcam Ab32570) 作为捕获抗体。使用1B3 mIgG2a作为检测抗体。使用小鼠PDGFRb作为包被抗原和抗TRII抗体作为检测抗体使用直接ELISA确定血清中的抗体水平。如图12B中所示，在1B3‑TRII S239D/I332处理组和1B3 S239D/I332E处理组之间的血清抗体水平是可比较的。作为活化的HSC消耗的指示，两个处理组的肝总PDGFRb水平显著降低(图12C)。1B3‑TRII S239D/ I332E处理导致比1B3 S239D/I332E处理更多的总PDGFRb减少。这些结果证明了阻断TGFb信号传导可以进一步增强肝中活化的HSC细胞的抗体介导的消耗。 [0959] 这些结果进一步证实，通过促进免疫细胞活化信号传导或阻遏免疫细胞抑制性信号传导来调节免疫细胞活性可以在体外和在体内进一步增强抗体介导的细胞毒性以有效地消耗活化的HSC。 [0960] 7.5.实施例5：肝中活化的HSC的消耗与体内HSC标记和NK活化标记的变化相关。 [0961] 用CCL4(0.7ml/kg，腹膜内注射，每周三次)处理雄性野生型C57BL/6J小鼠三周以诱导HSC细胞活化。然后向这些小鼠给予CCL4以及45mg/kg抗mPDGFRb抗体1B3 S239D/I332E (静脉内)、15mg/kg抗mPDGFRb抗体1B3 S239D/I332E(皮下)或5mg/kg抗mPDGFRb抗体1B3 S239D/I332E(皮下)。在抗体给药开始后4小时、48小时和168小时收集肝样品。一半肝用于蛋白质或mRNA提取，并且另一半肝用于病理学研究。 [0962] 为了探索与体内HSC消耗相关的标记变化，研究了多种HSC标记。如图13A中所示，1B3 S239D/I332E处理时间依赖性地降低肝总PDGFRb水平，如通过ELISA所测量的。所有三个给药组在抗体给药后4小时和48小时均诱导了显著的PDGFRb减少。在抗体给药后168小时，仅45mg/kg组降低了肝PDGFRb水平，这与抗体血清PK一致。在抗体给药后4小时和48小时，5mg/kg 1B3 S239D/I332E组最显著降低活化的HSC标记aSMA的蛋白质水平(图13B)。使用定量RT‑PCR，在给药后4小时，5mg/kg和45mg/kg1B3 S239D/I332E组也显著降低了aSMA mRNA水平(图13C)。Pan HSC标记(在休眠的和活化的HSC上均表达)诸如GFAP、结蛋白和LRAT在mRNA水平上没有被抗体处理显著改变(图13D至图13F)。 [0963] 还研究了免疫细胞和NK细胞活化标记。如图14A和图14B中所示，在抗体给药后48小时，1B3 S239D/I332E处理增加了NK标记NKG2D和NKp46的mRNA水平。在抗体给药后48小时，免疫细胞活化标记粒酶BmRNA水平也显著增加(图14C)。使用IHC，1B3 S239D/I332E处理在抗体给药开始后4小时和168小时显著增加了肝中粒酶B强阳性细胞％。在48小时也观察到5mg/kg 1B3 S239D/I332E增加粒酶B强阳性细胞％的趋势。在开始给药后4小时5mg/kg和 45mg/kg 1B3 S239D/I332E减少了并且在48小时5mg/kg 1B3 S239D/I332E增加了通过切割的胱天蛋白酶3IHC定量的在肝中的凋亡细胞％。在粒酶B强阳性细胞％与切割的胱天蛋白酶3阳性细胞％之间存在良好的相关性，表明1B3 S239D/I332E活化在肝中的免疫细胞以发挥HSC杀伤效应。 [0964] 7.6.实施例6：活化的HSC的消耗减少了肝纤维化 [0965] 在CCL4处理的小鼠中的抗mPDGFRb抗体的多剂量研究中评价了活化的HSC的消耗是否可以减少肝纤维化。用CCL4(0.7ml/kg，腹膜内注射，每周三次)处理雄性野生型C57BL/ 6J小鼠三周以诱导HSC细胞活化。然后向这些小鼠给予45mg/kg的抗mPDGFRb抗体TRII双特异性抗体(1B3‑TRII S239D/I332E、1B3‑TRII L234A/L235A)(静脉内，每周两次，持续4周，总共8个剂量)、抗mPDGFRb抗体(1B3 S239D/I332E、1B3 WT)(静脉内，每周一次，持续4周，总共4个剂量)，并且将CCL4再注射4周。将Fc突变S239D/I332E工程化到抗体中以增强效应子功能。将Fc突变L234A/L235A工程化到抗体中以消除效应子功能。mIgG2a同种型对照抗体连接的TRII双特异性组(ISO‑TRII)(静脉内，每周一次，持续4周，总共4个剂量)也包括在本研究中。在研究结束时收集肝样品，并且将一半样品在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解缓冲液中均质化。通过ELISA测量肝裂解物中的总PDGFRb水平，作为活化的HSC细胞的体内消耗的指示。使用剩余的肝样品产生FFPE组织块。将肝切片用天狼星红染料(SR)染色以确定肝纤维化的程度。通过图像软件HALO定量SR染色强度和染色面积。 [0966] 如图12C中所示，在具有正常效应子功能或增强效应子功能的抗体(1B3TRII S239D/I332E、1B3 S239D/I332E和1B3 WT)的处理组中观察到指示为总PDGFRb蛋白水平的活化HSC的消耗。有趣的是，肝纤维化(定量为SR面积％)仅被1B3 TRII S239D/I332E和1B3 S239D/I332E处理显著降低(图15A)。尽管1B3 WT处理降低了总PDGFRb水平，但其不能抑制肝纤维化进展。1B3 TRII L234A/L235A处理对总PDGFRb蛋白水平和肝纤维化没有影响。观察到如通过SR染色所测量的总PDGFRb蛋白水平和肝纤维化之间的显著相关性(图15B)。这些结果表明活化的HSC的消耗可以体内有效地减少肝纤维化。增强的效应子功能(例如通过 Fc突变)是HSC靶向抗体发挥针对具有肝纤维化的疾病的治疗效果所需要的。 [0967] 在缺乏胆碱的L‑氨基酸高脂肪饮食(CDAA饮食)处理的小鼠中进一步评价抗mPDGFRb抗体的效果。向雄性野生型C57BL/6J小鼠给予CDAA饮食(缺乏胆碱、0.1％甲硫氨酸、1％胆固醇、45％高脂肪饮食)连同45mg/kg1B3 S239D/I332E或45mg/kg 1B3 WT(静脉内，每周一次)持续6周。使用PBS作为对照。在抗体给药开始后第23天和第42天收集血清样品。在研究结束时收集肝样品，并且将一半肝在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中均质化。通过ELISA测量肝裂解物中的总PDGFRb水平，作为活化的HSC细胞的体内消耗的指示。使用另一半肝产生FFPE组织块。将肝切片用天狼星红染料(SR)染色以确定肝纤维化的程度。通过图像软件HALO定量SR染色强度和染色面积。 [0968] 如图16A和图16B中所示，在第23天和第42天两个时间点，与1B3S239D/I332E组相比，1B3 WT组具有更高的血清抗体浓度。在抗体施用6周之后，1B3 S239D/I332E处理和1B3 WT处理两者均显著降低了通过ADVIA 2400化学系统测量的血清ALT/AST水平(图17B和图 17C)。肝样品分析显示，1B3 S239D/I332E处理和1B3 WT处理两者均显著降低了肝总PDGFRb蛋白水平(图17A)和肝中的脂滴％(图17D)。有趣的是，仅1B3 S239D/I332E处理显著降低了肝纤维化，如通过肝中SR阳性面积％所测量的(图17E)。这与来自CCL4处理的动物研究的发现一致(图15A)。具有增强的效应子功能的Fc是aHSC靶向抗体的抗纤维化效应所需要的。

活化的肝星状细胞（HSC）的消耗及其用途

活化的肝星状细胞(HSC)的消耗及其用途

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