[0001] 政府利益的声明

[0002] 本发明在国立卫生研究院颁布的U54 CA163059、U01 CA189291、R01 CA142750、R01 CA200007和R01 EB020644下在政府支持下完成。政府具有本发明的某些权利。

[0003] 相关申请的交叉引用

[0004] 本申请要求2015年12月2日提交的美国临时专利申请系列号62/262,159的权益，其通过引用整体并入本文。

[0005] 通过引用并入以电子格式呈递的材料

[0006] 本申请含有计算机可读形式的序列表(文件名：50184PCT_SeqListing.txt；1,629字节-ASCII文本文件，于2016年12月1日创建，其通过引用整体并入本文)作为公开内容的
单独部分。

[0007] 本公开内容涉及HER2-特异性的肽试剂，使用所述肽试剂检测初癌、早期癌症和癌症的方法，以及使用所述肽试剂靶向初癌细胞、早期癌细胞和癌细胞的方法。

[0008] 结直肠癌(CRC)是世界上癌症相关死亡的最常见原因之一。在2012年在全世界诊断出大约1,360,000个新病例，导致每年约693,000例死亡。由于肥胖的快速增加和更多发
展中国家采用西方饮食，预期这些数字在接下来的20年中几乎翻倍。需要对恶化前病变(发
育异常)的早期检测的更大关注[Vogelstein等人,Science,339:1546-1558(2013)]。

[0009] 乳腺癌是全世界女性中最常见的癌症。据估测，在2012年在女性中发生了超过170个万新乳腺癌病例。HER2的扩增或过表达发生在大约15-30％的乳腺癌中[Mitri等人,
Chemother Res Pract,743:193(2012)]。

[0010] 每年在全世界诊断出超过450,000个新食管腺癌(EAC)病例，且大于400,000人将死于该疾病。在过去的三十年中，在发达国家中食管癌的发生率已经比任何其它癌症更快
地升高。EAC具有预后不良，因而早期癌症检测是关键性的。认为该疾病源自巴雷特食管
(BE)，即一种恶化前病症，其中正常鳞状上皮被化生柱状上皮替代。由于肥胖和酸回流的快
速升高，BE在工业化社会变得更常见。认为BE会转化成低级发育异常(LGD)和继续进展至高
级发育异常(HGD)，随后是EAC。在内窥镜检查术上，发育异常可以在体系结构上是扁平的且
在分布上是不规则的。具有随机4-象限活组织检查的白光内窥镜检查术被推荐用于监督，
但是被证实取样误差和假阴性。对于HGD和早期EAC的检测而言，该方案具有从28％至85％
范围内的灵敏度和从56％至100％范围内的特异性。结果，这些指南没有被社区医师广泛实
践。每1-2年推荐监督内窥镜检查术。但是，发现HGD/EAC的发生率非常低，且大多数患者具
有许多没有收集到病理学上瘤形成证据的活组织检查。在某些患者群体中发生癌症的风险
可能低至每年～0.12％。使过表达的分子靶标快速显影的新成像方法可能更有效地检测发
育异常，使活组织检查最小化，并降低监督的频率和成本。

[0011] 胆管上皮癌(胆管癌)是最常见的胆道恶性肿瘤，且在发病率和死亡率方面在世界上逐渐增加。该疾病经常在晚期阶段确诊，此时预后较差。胆道上皮内瘤形成(BilIN)代表
前体病症，且如果准确地检测到，患者可以经历外科手术切除术并具有优良的结果。疑似具
有胆管上皮癌的患者经常呈现在经腹成像时发现的不确定的胆管狭窄。但是，该发现是非
特异性的，且可以代表恶性或良性疾病[Shaib等人,Semin Liver Dis,24:115-125
(2004)]。因为胆管在尺寸上较小，可以为细胞学或组织学得到的细胞和组织的量经常不足
以做出确定诊断。患者经常延迟治疗或经历重大外科手术以后才发现良性狭窄或晚期癌
症。需要新的成像方法以在不确定的胆管狭窄中准确地鉴别早期胆管上皮癌以引导医师做
出治疗决策。

[0012] 据估计，在2012年已经发生了大概100万新胃癌病例(952,000例，总数的6.8％)，使它成为世界上第五最常见的恶性肿瘤。胃癌是世界上两种性别的癌症死亡的第三大原因
(723,000例死亡，总数的8.8％)[国际癌症研究组织(International Agency for 
Research on Cancer，IARC)和世界卫生组织(World Health Organization，WHO)
.GLOBOCAN 2012:Estimated cancer incidence,mortality and prevalence worldwide 
in 2012]。

[0013] 内窥镜检查术是一种被患者和有关医师广泛接受的经常执行的成像检查。但是，已经在显著肉眼可见的腺瘤性息肉的背对背检查中发现了>25％的显著缺失率。此外，平坦
性病变可以引起癌，且已经发现高达所有腺瘤的36％。已经发现平坦性病变比息肉更有侵
袭性，且在某些患者群体中包含原位癌或粘膜下癌的可能性高5倍。结果研究还表明，结肠
镜检查导致在近侧结肠(右侧)中产生的癌症的死亡率的微小下降。此外，在“负”结肠镜检
查以后诊断出的癌症更频繁地发生在近侧结肠中。这些发现已经归因于更大的遗传不稳定
性和平坦形态学。因而，对平坦性病变敏感的成像方法可以改善CRC的检测和预防。尽管为
了筛查广泛地执行结肠镜检查，但是在近侧结肠中产生的癌的死亡率微小下降。此外，在
“负”结肠镜检查以后诊断出的癌症更频繁地发生在近侧结肠中。这些发现已经归因于更大
的遗传不稳定性和平坦形态学。

[0014] 使用外源荧光标记探针的内窥镜成像是一种通过鉴别独特分子靶标的表达而在肿瘤病变的检测中实现较大特异性的有前途的方法。成像会提供精确的定位，并且荧光会
提供改善的反差。在以前，已经将几种诊断分子用作用于检测不同类型的癌症中的恶化前
病变和恶性病变的靶向试剂，包括抗体和抗体片段。但是，抗体和抗体片段的应用受免疫原
性、生产成本和长血浆半衰期限制。还已经使用小分子、RNA适体和可活化的探针。肽代表与在消化道中的临床应用、特别是局部施用相容的一类新成像剂。

[0015] 人表皮生长因子受体2(HER2，也被称作ErbB2)是酪氨酸激酶家族(其也包括HER1(EGFR)、HER3和HER4)的一个成员，并且位于17号染色体q21上[Brandt-Rauf等人,Critical 
Reviews in Oncogenesis,5:313-329(1994)；Tao和Maruyama,Journal of Cell Science,
121:3207-3217(2008)；Baselga和Swain,Nature Reviews Cancer,9:463-475(2009)]。它
编码185kDa跨膜蛋白，其缺乏天然配体并且作为共受体起作用以与其它HER家族成员形成
同二聚体和异二聚体。二聚化导致包括MAPK和PI3K/AKT途径(它们是细胞增殖和分化所必
需的)的信号传递级联的活化[Katz等人,Biochim Biophys Acta.,1773(8):1161-1176
(2007)；Fornaro等人,Nature Reviews胃肠病学and Hepatology,8(7):369-383(2011)]。
有证据表明，HER2在许多类型的肿瘤中高度过表达。该基因的扩增和/或过表达已经与有丝
分裂发生、恶性转化、增加的细胞能动性、侵入和转移相关联[Ross,Cancer Invest.,19
(5):554-68(2001)；Seo等人,PLoS ONE,9(5):e98528(2014)；Khelwatty等人,PLoS ONE,9
(3):e91139(2014)]。

[0016] 几种HER2特异性抗体和抗体片段已经被用于光和核成像，但是受限于缓慢的结合动力学，并且具有从几小时至几天的范围内的半衰期，这限制了它们的临床应用。在大量制
备中也存在多得多的困难，并且具有不可接受地高的成本，从而限制了用于体内成像的广
泛临床应用。已经报道对HER2特异性的且具有更高结合亲合力的肽被用于SPECT成像
[Larimer等人,Mol Imaging Biol,16:449-458(2014)；Geng,Theranostics 5:1154-1165
(2015)]，这些要求高灵敏的成像系统用于检测。

[0017] 本领域中需要用于初癌(发育异常)、早期癌症和癌症的早期检测的新产品和方法。用于早期检测的新产品和方法具有重要的临床应用用于增加CRC和其它上皮细胞衍生
的癌症的存活率并用于降低健康护理成本。

[0018] 在一个方面，本公开内容提供了基本上由肽KSPNPRF(SEQ ID NO:1)、RHPFPRF(SEQ ID NO:2)、RHPWPNR(SEQ ID NO:3)、RHPYPQR(SEQ ID NO:4)或RKPFPRH(SEQ ID NO:5)或所
述肽的多聚体形式组成的试剂，其中所述试剂特异性地结合HER2。在某些实施方案中，所述
多聚体形式是二聚体。

[0019] 在某些实施方案中，所述试剂包含至少一个与所述肽或所述肽的多聚体形式连接的可检测标记。在某些实施方案中，所述多聚体形式是二聚体。在某些实施方案中，所述可
检测标记是通过显微术、光声、超声、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)或磁共振成像可检测的。在某些实施方案中，所述通过显微术可检测的标记
是异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy5、Cy5.5或IRDYE800。在某些实施方案中，所述可检测标记通
过肽接头与所述肽连接。在某些实施方案中，所述接头的末端氨基酸是赖氨酸。在某些实施
方案中，所述接头包含在SEQ ID NO:6中所示的序列GGGSK。

[0020] 在某些实施方案中，所述试剂包含至少一个与所述肽或所述肽的多聚体形式连接的治疗部分。在某些实施方案中，所述治疗部分是化学治疗剂。

[0021] 在某些实施方案中，所述试剂包含至少一个与所述肽或所述肽的多聚体形式连接的可检测标记和至少一个与所述肽或所述肽的多聚体形式连接的治疗部分。

[0022] 在另一个方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含本公开内容的试剂和药学上可接受的赋形剂。

[0023] 在另一个方面，本公开内容提供了用于检测患者中的结肠发育异常的方法，所述方法包括下述步骤：将本公开内容的试剂施用给所述患者，和检测所述试剂与发育异常的
结肠细胞的结合。本公开内容也提供了用于检测患者中的早期结肠癌的方法，所述方法包
括下述步骤：将本公开内容的试剂施用给所述患者，和检测所述试剂与所述结肠中的早期
癌细胞的结合。本公开内容也提供了用于检测患者中的结肠癌的方法，所述方法包括下述
步骤：将本公开内容的试剂施用给所述患者，和检测所述试剂与所述结肠中的癌细胞的结
合。

[0024] 在另一个方面，本公开内容提供了用于检测患者中的发育异常的方法，所述方法包括下述步骤：将本公开内容的试剂施用给所述患者，和检测所述试剂与发育异常细胞的
结合。本公开内容也提供了用于检测患者中的早期癌症的方法，所述方法包括下述步骤：将
本公开内容的试剂施用给所述患者，和检测所述试剂与早期癌细胞的结合。本公开内容也
提供了用于检测患者中的癌症的方法，所述方法包括下述步骤：将本公开内容的试剂施用
给所述患者，和检测所述试剂与癌细胞的结合。

[0025] 在另一个方面，本公开内容提供了一种确定治疗对患者中癌症和/或癌症转移或癌症复发的有效性的方法，所述方法包括下述步骤：将本公开内容的试剂施用给所述患者，
观察用所述试剂标记的细胞的第一量，和将所述第一量与以前观察的用所述试剂标记的细
胞的第二量进行对比，其中标记的细胞的第一量相对于以前观察的标记的细胞的第二量的
减小指示有效的治疗。在某些实施方案中，所述方法还包括得到被所述试剂标记的细胞的
活组织检查。

[0026] 在另一个方面，本公开内容提供了一种用于将治疗部分递送至患者的发育异常细胞的方法，所述方法包括将本公开内容的试剂施用给所述患者的步骤。

[0027] 在另一个方面，本公开内容提供了一种用于将治疗部分递送至患者的早期癌细胞的方法，所述方法包括将本公开内容的试剂施用给所述患者的步骤。

[0028] 在另一个方面，本公开内容提供了一种用于将治疗部分递送至患者的癌细胞的方法，所述方法包括将本公开内容的试剂施用给所述患者的步骤。

[0029] 在本文描述的每个方面的方法中，特别预见到起源于上皮细胞的发育异常、早期癌症或癌症，例如，所述上皮细胞是在结肠、子宫颈、鳞状细胞、甲状腺、脑、乳房、卵巢、前列腺、肝、肺、食管、胃、膀胱、胆道、胰腺、口腔和皮肤中。

[0030] 在另一个方面，本公开内容提供了一种用于将本公开内容的组合物施用给有此需要的患者的试剂盒，其包含所述组合物、所述组合物的使用说明书和用于将所述组合物施
用给患者的装置。

[0031] 在另一个方面，本公开内容提供了由氨基酸序列KSPNPRF(SEQ ID NO:1)、RHPFPRF(SEQ ID NO:2)、RHPWPNR(SEQ ID NO:3)、RHPYPQR(SEQ ID NO:4)或RKPFPRH(SEQ ID NO:5)
组成的肽。
附图说明

[0032] 图1–对HER2特异性的肽的选择.A)使用HER2-ECD的结构模型(2A91)来评价该靶标和候选肽之间的结合相互作用。前5种候选物是FITC标记的，且用体外共焦显微术评价结
合。B)Flo1-HER2和Q-hTERT(对照)细胞的蛋白质印迹显示了HER2表达的差异。C)相对于Q-
hTERT细胞，KSPNPRF(PEP1)(SEQ ID NO:1)显示出与具有Flo1-HER2的其它肽候选物相比最
高的平均荧光强度。将数据转化成以2为底的对数。D)经由GGGSK接头(蓝色)(SEQ ID NO:6)
用Cy5.5荧光团(红色)标记的KSPNPRF肽(黑色)(SEQ ID NO:1)的化学结构；KSP*-Cy5.5。E)
乱序对照肽PPSNFKR；PPS*-Cy5.5。对于两种肽，F)峰吸收发生在λex＝671nm，和G)荧光波谱显示在NIR中在708nm附近的最大发射。

[0033] 图2–结合在细胞表面上表达的HER2的特异性肽试剂的验证.在共焦显微术上，A,B)KSP*-Cy5.5(红色)结合HT29和SW480细胞的表面(箭头)，而C,D)PPS*-Cy5.5(阴性对照)
显示了最小结合。E,F)抗-HER2-AF488(绿色)用作阳性对照。对于HT29和SW480细胞，KSP*-
Cy5.5的平均荧光强度显著大于PPS*-Cy5.5的平均荧光强度，通过配对t检验，分别P＝1.5
×10-7和1.4×10-2。类似地，抗-HER2-AF488的结果大于PPS*-Cy5.5的结果，通过配对t检
验，分别P＝4.0×10-7和6.3×10-4。G)每个结果是独立地收集的3个图像的平均值。H)蛋白
质印迹显示了HT29和SW480细胞之间的HER2表达的差异。与K,L)siHER2击倒细胞相比，I,J)
KSP*-Cy5.5(红色)和抗-HER2-AF488(绿色)显著更大地结合siCL处理过的对照HT29细胞的
表面(箭头)，通过配对t检验，分别P＝1.0×10-4和1.7×10-4。M)结果是独立地收集的3个图
像的平均值。N)蛋白质印迹显示了与对照(siCL)相比HER2(siHER2)的有效击倒。O)KSP*-
Cy5.5和抗-HER2-AF488的结合共定位至HT29细胞的表面，Pearson氏系数ρ＝0.74。P)在竞
争时，我们发现荧光强度以浓度依赖性的方式下降，在数据点上面显示了与在0min的值相
比在每个时间点的强度的P-值。每个结果是3个独立测量结果的平均值。我们测量了Q)
2
KSP*-Cy5.5对HT29细胞的表观解离常数(结合亲和力)kd＝21nM，R＝0.98，和R)表观结合时
间常数k＝0.14min-1(7.1min),R2＝0.92。每次测量的结果是3个独立实验的代表。

[0034] 图3–用局部HER2肽试剂对小鼠结肠发育异常的体内成像.A)具有白光照明的内窥镜图像显示自发的息肉(箭头)。B)KSP*-Cy5.5的局部施用以后的NIR荧光图像显示增加的
来自息肉的强度(箭头)。C)几天以后使用PPS*-Cy5.5对照的相同区域的图像显示显著减轻
的信号。D)使用E)KSP*-Cy5.5和F)PPS*-Cy5.5的白光和NIR荧光图像显示具有扁平腺瘤(箭
头)的类似结果。G)来自n＝7只小鼠，局部地施用的KSP*-Cy5.5(n＝15腺瘤)导致比PPS*-
Cy5.5(n＝7腺瘤)更高的平均(±std)T/B比率，分别为3.64±2.13和1.46±0.25，通过不成
对t检验，P＝1.4×10-3。

[0035] 图4–用全身HER2肽试剂对小鼠结肠发育异常的体内成像.A)对于静脉内肽试剂施用，来自n＝4小鼠中的结肠腺瘤的平均T/B比率显示在100min的峰。B)来自息肉的代表性荧
光图像显示增加的强度的区域。C)来自腺瘤的平均荧光强度比来自未涉及的周围正常粘膜
层的值高5.03倍，通过配对t检验，P＝2.6×10-9。D)切离的小鼠结肠的暴露粘膜表面的代表
性白光图像显示众多的息肉。E)对应的荧光图像显示在息肉部位处增加的荧光强度。

[0036] 图5–结合小鼠结肠发育异常过度表达的HER2的特异性肽试剂的验证.在共焦显微术上，我们发现A)KSP*-Cy5.5相对于B)PPS*-Cy5.5对发育异常切片的强烈染色。C)组织学
(H&E)显示低级发育异常的特征(箭头)。用D)KSP*-Cy5.5或E)PPS*-Cy5.5观察到最小染色。
G)组织学(H&E)。关于使用已知抗体的免疫组织化学，我们证实了发育异常中的HER2的过表
达。H)无抗体(对照)。I)具有和J)没有抗体(对照)的正常结肠粘膜层。

[0037] 图6-结合人近侧结肠瘤形成过度表达的HER2的特异性肽试剂的验证。关于A)KSP*-Cy5.5(红色)和B)抗-HER2-AF488抗体(绿色)对发育异常(箭头)的染色，观察到增加
的荧光强度。C)来自邻近切片的对应组织学(H&E)。D)显示了肽试剂(红色)和抗体(绿色)结
合的共定位，Pearson氏相关系数ρ＝0.50。在A)中的虚线红色和绿色框的高放大率图像显
示与F)正常相比增加的KSP*-Cy5.5肽试剂(红色)对E)发育异常的染色。在B)中的虚线红色
和绿色框的高放大率图像显示与H)正常相比增加的抗-HER2-AF488抗体(绿色)对G)发育异
常的染色。I)从免疫荧光，对于正常(n＝30)、增生息肉(n＝12)、固着锯齿状腺瘤(n＝13)和散发性腺瘤(n＝30)，发现平均(±sem)强度分别为2.72±0.31、0.12±0.08、6.07±0.73和
11.9±0.61。通过Tukey氏多重比较，散发性腺瘤的平均结果与正常、增生息肉和固着锯齿
状腺瘤的差异的P-值分别为P＝3.6×10-5、P＝8.7×10-12和P＝0.03。SSA和正常结肠的平均
强度之间的差异是P＝0.20。

[0038] 图7-HER2在人近侧结肠瘤形成中的过表达.在存档的样本的免疫组织化学(IHC)上，从A)正常结肠的所有切片和B)增生息肉的大多数切片观察到最小染色。从一些C)固着
锯齿状腺瘤(SSA)和D)许多散发性腺瘤看到强烈的细胞表面染色。E)可以看到来自息肉状
腺瘤的发育异常的和正常的隐窝之间的HER2表达的差异。F)来自E)中的虚线红色框的放大
图显示发育异常的结肠细胞的强烈染色(箭头)。G)为扁平腺瘤显示了发育异常的和正常的
隐窝之间的染色的差异。H)来自G)中的虚线红色框的放大图。I)无抗体(对照)。J)使用标准
的IHC评分系统在2个GI病理学家之间的一致揭示了在0％(0/30)的正常、25％(3/12)的增
生息肉、14％(2/14)的SSA和41％(12/29)的腺瘤中的过表达，其由2+或3+染色定义。

[0039] 图8-Cy5.5-标记的肽试剂的质谱法.我们在质谱法上测量了KSP*-Cy5.5和PPS*-Cy5.5的1794.98的实验性质量/电荷(m/z)比率，这与预期值一致。

[0040] 图9-HER2肽没有开始细胞信号传递.在5和100μM的浓度与KSP*一起温育的HT29细胞没有表明HER2磷酸化(p-HER2)以及AKT和ERK的下游磷酸化的减少。通过对比，对于1-
1000nM的递增浓度，用拉帕替尼处理过的相同细胞表明p-HER2、p-AKT和p-ERK的剂量依赖
性减少。用1％DMSO处理过的HT29细胞和未处理的细胞显示为对照。β-微管蛋白用作加载对
照。

[0041] 图10-肽试剂和抗体在人BilIN样本上的共定位.A,B)对于KSP*-Cy5.5肽试剂或HER2抗体，正常人胆管的切片显示最小染色。C-F)对于与HER2抗体一起定位的KSP*-Cy5.5
肽试剂，人BilIN的切片表明增加的细胞表面染色(箭头)。

[0042] 图11–包含对HER2特异性的肽试剂的示例性试剂.A,B)用于用在成像中的经由接头用近红外染料(诸如IRDYE800)标记的肽。

[0043] 图12-KSP*-Cy5.5肽试剂对在人巴雷特食管中过表达的ErbB2(HER2)的特异性结合.对于在切离的人样本上的巴雷特食管中的癌症进展，关于A-E)KSP-Cy5.5肽试剂的染色
观察到递增的荧光强度。F-J)用PPS*-Cy5.5(用于对照的乱序肽试剂)观察到最小染色。图
例：SQ-鳞状，BE-巴雷特食管，LGD-低级发育异常，HGD-高级发育异常，EAC-食管腺癌。

[0044] 图13-RHP*-Cy5.5肽试剂与在人巴雷特食管中过表达的ErbB2(HER2)的特异性结合.对于在切离的人样本上的巴雷特食管中的癌症进展，关于A-E)RHP*-Cy5.5肽试剂的染
色观察到递增的荧光强度。F-J)用PPF*-Cy5.5(用于对照的乱序肽试剂)观察到最小染色。
图例：SQ-鳞状，BE-巴雷特食管，LGD-低级发育异常，HGD-高级发育异常，EAC-食管腺癌。

[0045] 转化的细胞和组织在肉眼可见的形态学变化之前就表达分子变化，从而为癌症的早期检测提供独特机会。结合癌前病变的肽具有针对内窥镜“不可见的”病变引导组织活组
织检查的潜力。肽具有体内优点，因为可以局部地递送它们以鉴别癌症起源的上皮细胞表
面上的早期分子变化。另外，它们可以表现出快速的结合动力学以及扩散进患病的组织中。

[0046] 在一个方面，本公开内容提供了特异性地结合HER2的肽。HER2在发育异常细胞和/或癌细胞上表达。“癌细胞”在本文中包括早期癌症和癌细胞。所述肽包括、但不限于肽
KSPNPRF(SEQ ID NO:1)、RHPFPRF(SEQ ID NO:2)、RHPWPNR(SEQ ID NO:3)、RHPYPQR(SEQ ID NO:4)和RKPFPRH(SEQ ID NO:5)。

[0047] 在另一个方面，本公开内容提供了包含本公开内容的肽的试剂。本文中使用的“试剂”包含至少两个组分：本公开内容的肽和与所述肽连接的另一个部分。所述试剂的为HER2
的结合做出贡献的唯一组分是本公开内容的肽。换而言之，所述试剂“基本上由本公开内容
的肽组成”。在某些实施方案中，所述其它部分包含氨基酸，但是本公开内容的肽不天然地
连接至那些氨基酸，且所述其它氨基酸不会影响所述肽与HER2的结合。此外，在本文中预见
到的试剂中的其它部分不是噬菌体展示文库中的噬菌体或任何其它类型的肽展示文库的
组分。

[0048] 在某些实施方案中，所述试剂包含至少一个可检测标记作为与本公开内容的肽连接的部分。所述可检测标记可以是可检测的，例如，通过显微术、超声、PET、SPECT或磁共振成像。在某些实施方案中，所述通过显微术可检测的标记是异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy5、
Cy5.5和IRdye800。

[0049] 在某些实施方案中，所述可检测标记通过肽接头连接至本公开内容的肽。所述接头的末端氨基酸可以是赖氨酸诸如在示例性的接头GGGSK(SEQ ID NO:6)中。

[0050] 在某些实施方案中，所述试剂包含至少一个与本公开内容的肽连接的治疗部分。所述治疗部分可以是化学预防剂或化学治疗剂。在某些实施方案中，所述治疗部分是塞来
考昔、5-氟尿嘧啶和/或苯丁酸氮芥。

[0051] 在某些实施方案中，所述试剂包含至少一个与所述肽或所述肽的多聚体形式连接的可检测标记、和至少一个与所述肽或所述肽的多聚体形式连接的治疗部分。

[0052] 在另一个方面，本公开内容提供了一种组合物，其包含本公开内容的试剂和药学上可接受的赋形剂。

[0053] 在另一个方面，本公开内容提供了一种用于特异性地检测患者中的初癌(发育异常)、早期癌症和/或癌症的方法，所述方法包括下述步骤：将与可检测标记连接的本公开内
容的试剂施用给患者和检测所述试剂与发育异常细胞或早期癌细胞的结合。在某些实施方
案中，所述可检测的结合发生在体内。在其它实施方案中，所述可检测的结合发生在体外。
在其它实施方案中，所述可检测的结合发生在原位。特别预见到起源于上皮细胞的初癌(发
育异常)、早期癌症和/或癌症的检测。特别预见到起源于上皮细胞的发育异常、早期癌症或
癌症，例如，所述上皮细胞是在结肠、子宫颈、鳞状细胞、甲状腺、脑、乳房、卵巢、前列腺、肝、肺、食管、胃、膀胱、胆道、胰腺、口腔和皮肤中。

[0054] 短语“特异性地结合”和“特异性地检测”细胞在本文中是指，所述试剂结合表达HER2的细胞和/或与表达HER2的细胞结合地被检测到，且所述试剂不会结合另一类细胞和
不会与所述另一类细胞结合地在进行所述方法的灵敏度水平被检测到。

[0055] 在结肠中，例如，从恶化前粘膜层向癌的转化涉及扁平性和凹陷性(非息肉样)病变、腺瘤性息肉(息肉样病变)和然后真实癌(结肠癌细胞)的发展。根据本公开内容检测结
肠发育异常(即，发育异常细胞)、初癌细胞和/或癌细胞包括检测与扁平性和凹陷性病变、
腺瘤性息肉和/或癌细胞的结合。在某些实施方案中，本公开内容的试剂特异性地检测扁平
性和凹陷性病变的细胞。在某些实施方案中，本公开内容的试剂特异性地检测腺瘤性息肉
的细胞。在某些实施方案中，本公开内容的试剂特异性地检测结肠癌细胞。在某些实施方案
中，本公开内容的试剂可以特异性地检测扁平性和凹陷性病变的两种或更多种细胞、腺瘤
性息肉细胞和结肠癌细胞。

[0056] 扁平性发育异常病变也在慢性溃疡性结肠炎的场合中观察到，且也预见到可通过本公开内容的方法检测。

[0057] 在另一个方面，本公开内容提供了一种确定治疗对患者中癌症和/或癌症转移或癌症复发的有效性的方法，所述方法包括下述步骤：将与可检测标记连接的本公开内容的
试剂施用给患者，观察用所述试剂标记的细胞的第一量，和将所述第一量与以前观察的用
所述试剂标记的细胞的第二量进行对比，其中标记的细胞的第一量相对于以前观察的标记
的细胞的第二量的减小指示有效的治疗。在某些实施方案中，5％的减小指示有效的治疗。
在其它实施方案中，约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约
50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更多的减小指示有效的治疗。在某些实施方案中，所述方法还包括得到被所述试剂标记的细胞的活
组织检查。

[0058] 在另一个方面，本公开内容提供了一种用于将治疗部分递送至患者的方法，所述方法包括下述步骤：将与治疗部分连接的本公开内容的试剂施用给所述患者。

[0059] 在另一个方面，本公开内容提供了一种用于将治疗部分递送至患者的方法，所述方法包括下述步骤：将与治疗部分连接的本公开内容的试剂施用至所述患者的结肠。

[0060] 在另一个方面，本公开内容提供了一种用于将本公开内容的组合物施用给有此需要的患者的试剂盒，其中所述试剂盒包含本公开内容的组合物、所述组合物的使用说明书
和用于将所述组合物施用给患者的装置。

[0061] 接头、肽和肽类似物

[0062] 本文中使用的“接头”是位于本公开内容的肽的C-端处的氨基酸的序列。在某些实施方案中，所述接头序列以赖氨酸残基终止。

[0063] 在某些实施方案中，与在没有接头存在下所述试剂的可检测结合相比，接头的存在导致本公开内容的试剂与发育异常的结肠细胞或癌性的结肠细胞的可检测结合的至少
1％增加。在不同的方面，可检测结合的增加是至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少
6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少
15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约100倍或更多。

[0064] 术语“肽”表示2-50个氨基酸的分子、3-20个氨基酸的分子和6-15个氨基酸的分子。本公开内容预见到的肽和接头可以是5个氨基酸长度。在不同的方面，多肽或接头可以
是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、
32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个氨基酸长度。

[0065] 在不同的方面，将示例性肽通过本领域已知的方法随机产生，装入多肽文库(例如、但不限于，噬菌体展示文库)中，通过蛋白的消化衍生化，或化学合成。使用噬菌体展示技术已经开发了在本公开内容中举例说明的肽，所述噬菌体展示技术是一种强大的组合方
法，其使用重组DNA技术产生多肽的复杂文库用于通过对细胞表面靶标的优先结合进行选
择[Scott等人,Science,249:386-390(1990)]。将细菌噬菌体(诸如丝状M13或二十面体T7)
的蛋白外壳遗传工程改造成表达非常大量(>109)具有独特序列的不同多肽以实现亲和力
结合[Cwirla等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378-6382(1990)]。然后通过针对培养的
过表达靶标的细胞和组织对噬菌体文库生物淘选来执行选择。然后将这些候选噬菌体的
DNA序列回收并用于合成多肽[Pasqualini等人,Nature,380:364-366(1996)]。任选地用荧
光染料标记优先结合发育异常的粘膜层的多肽，所述荧光染料包括、但不限于，FITC、Cy 
5.5、Cy 7和Li-Cor。这些多肽-染料试剂已经被开发且已经表现出对培养物中的结肠癌
(HT29)细胞和对临床前异种移植物模型的优先结合[Kelly等人,Cancer Res.,64:6247-51
(2004)]。

[0066] 肽包括D和L形式，是经纯化的或两种形式的混合物。本公开内容也预见到与本公开内容的肽竞争对结肠细胞的结合的肽。

[0067] 在某些实施方案中，本公开内容的试剂的肽以多聚体形式存在。本领域已知多种在其上面可以呈现多种肽的支架。在某些实施方案中，在三赖氨酸树枝状楔上以多聚体形
式呈现肽。在某些实施方案中，使用接头以二聚体形式呈现肽，所述接头包括、但不限于氨
基己酸接头。本领域已知的其它支架包括、但不限于其它树枝状聚合物和聚合的(例如，
PEG)支架。

[0068] 应该理解，本公开内容的肽和接头任选地包含本领域已知的修饰，并且改变这样的修饰的位置和数目以在所述肽和/或接头类似物中达到最佳的效果。

[0069] 在某些实施方案中，所述化合物是具有基于本文中公开的肽之一(“亲本肽”)的结构的肽类似物，但是在一个或多个方面不同于所述亲本肽。因此，本领域普通技术人员会明
白，关于本文中提供的亲本肽的教导也可以适用于肽类似物。

[0070] 在某些实施方案中，所述肽类似物包含亲本肽的结构，但是所述肽类似物包含一个或多个非肽键来替代肽键。在某些实施方案中，所述肽类似物包含替代肽键的酯键、醚
键、硫醚键、酰胺键等。在某些实施方案中，所述肽类似物是包含酯键来替代肽键的缩酚酸
肽。

[0071] 在某些实施方案中，所述肽类似物包含本文描述的亲本肽的结构，但是所述肽类似物包含一个或多个氨基酸置换，例如，一个或多个保守氨基酸置换。保守氨基酸置换是本
领域已知的，并且包括这样的氨基酸置换：其中用一个具有特定物理和/或化学性质的氨基
酸交换另一个具有相同化学或物理性质的氨基酸。例如，保守氨基酸置换可以是用酸性氨
基酸置换另一个酸性氨基酸(例如，Asp或Glu)，用一个具有非极性侧链的氨基酸置换另一
个具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)，用一个碱性氨基酸置换另一个碱性氨基酸(Lys、Arg等)，用一个具有极性侧链的氨基酸置换另
一个具有极性侧链的氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)等。

[0072] 在某些方面，所述肽类似物包含一个或多个合成的氨基酸，例如，对于哺乳动物而言非天然的氨基酸。合成的氨基酸包括β-丙氨酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙氨酸(Me-Ala)、氨基丁酸(Abu)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、氨基甲基吡咯羧酸、氨基哌啶羧酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-甲酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰
胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、氮杂环丁烷羧酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基-正戊酸(瓜氨酸，Cit)、β-环己基丙氨酸(Cha)、乙酰氨基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟基苯丙氨酸(DOPA)、二甲基噻唑烷(DMTA)、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸(Hse)、羟脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基-异亮氨
酸(MeIle)、4-哌啶甲酸(Isn)、甲基-亮氨酸(MeLeu)、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲
基-赖氨酸、桥亚甲基脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜(Met(O))、甲硫氨酸-砜(Met(O2))、正亮氨酸
(Nle)、甲基-正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对-氨基苯甲酸(PABA)、青霉胺(Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、
4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO2))、4-氰基苯丙氨酸((Phe(4-CN))、苯基甘氨酸(Phg)、哌啶基
丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒代半胱氨酸
(Sec)、O-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5-环己基-3-羟基
戊酸(ACHPA)、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4,-四氢-异喹啉-3-甲酸(Tic)、
四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸(Thi)、O-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸酯四丁基胺、甲基-缬氨酸
(MeVal)和烷基化的3-巯基丙酸。

[0073] 在某些实施方案中，所述肽类似物包含一个或多个非保守的氨基酸置换，且所述肽类似物仍然在与亲本肽类似的程度、相同程度或提高的程度起作用。在某些实施方案中，
包含一个或多个非保守的氨基酸置换的肽类似物表现出与亲本肽相比大约相同或更大的
对发育异常细胞或早期癌细胞的结合。

[0074] 在某些实施方案中，与本文描述的亲本肽相比，所述肽类似物包含一个或多个氨基酸插入或缺失。在某些实施方案中，所述肽类似物与亲本肽相比包含一个或多个氨基酸
的插入。在某些实施方案中，所述肽类似物与亲本肽相比包含一个或多个氨基酸的缺失。在
某些实施方案中，所述肽类似物与亲本肽相比包含一个或多个氨基酸在N-或C-端处的插
入。在某些实施方案中，所述肽类似物与亲本肽相比包含一个或多个氨基酸在N-或C-端处
的缺失。在这些实施方案中，所述肽类似物仍然表现出与亲本肽相比大约相同或更大的对
发育异常细胞或早期癌细胞的结合。

[0075] 可检测的标志物

[0076] 本文中使用的“可检测的标志物”是可以用于鉴别本公开内容的组合物与发育异常细胞或早期癌细胞的结合的任何标记。可检测的标志物的非限制性例子是能够实现多肽
的观察的荧光团、化学或蛋白标签。在某些方面，用肉眼或装置(例如、但不限于，内窥镜)进行观察，且也可能涉及替代光或能源。

[0077] 预见到用于本公开内容中的荧光团、化学标签和蛋白标签包括、但不限于FITC,Cy 5.5,Cy 7,Li-Cor,放射性标记,生物素,萤光素酶,1,8-ANS(1-苯胺基萘-8-磺酸),1-苯胺
基萘-8-磺酸(1,8-ANS),5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素pH 9.0,5-FAM pH 9.0,5-ROX
(5-羧基-X-罗丹明,三乙基铵盐),5-ROX pH 7.0,5-TAMRA,5-TAMRA pH 7.0,5-TAMRA-
MeOH,6JOE,6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0,6-羧基罗丹明6G pH 7.0,6-羧基罗丹
明6G,盐酸盐,6-HEX,SE pH 9.0,6-TET,SE pH 9.0,7-氨基-4-甲基香豆素pH 7.0,7-羟基-
4-甲基香豆素,7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0,Alexa 350,Alexa 405,Alexa 430,Alexa 
488,Alexa 532,Alexa 546,Alexa 555,Alexa 568,Alexa 594,Alexa 647,Alexa 660,
Alexa 680,Alexa 700,Alexa Fluor 430抗体缀合物pH 7.2,Alexa Fluor 488抗体缀合物
pH 8.0,Alexa Fluor 488酰肼-水,Alexa Fluor 532抗体缀合物pH 7.2,Alexa Fluor 555
抗体缀合物pH 7.2,Alexa Fluor 568抗体缀合物pH 7.2,Alexa Fluor 610R-藻红蛋白抗
生蛋白链菌素pH 7.2,Alexa Fluor 647抗体缀合物pH 7.2,Alexa Fluor 647R-藻红蛋白
抗生蛋白链菌素pH 7.2,Alexa Fluor 660抗体缀合物pH 7.2,Alexa Fluor 680抗体缀合
物pH 7.2,Alexa Fluor 700抗体缀合物pH 7.2,别藻蓝蛋白pH 7.5,AMCA缀合物,氨基香豆
素,APC(别藻蓝蛋白),Atto 647,BCECF pH 5.5,BCECF pH 9.0,BFP(蓝荧光蛋白),钙黄绿
素,钙黄绿素pH 9.0,Calcium Crimson,Calcium Crimson Ca2+,Calcium Green,Calcium 
Green-1Ca2+,Calcium Orange,Calcium Orange Ca2+,羧基萘并荧光素pH 10.0,Cascade 
Blue,Cascade Blue BSA pH 7.0,Cascade Yellow,Cascade Yellow抗体缀合物pH 8.0,
CFDA,CFP(蓝绿色荧光蛋白),CI-NERF pH 2.5,CI-NERF pH 6.0,柠檬素,香豆素,Cy 2,Cy 
3,Cy 3.5,Cy 5,C5.5,CyQUANT GR-DNA,Dansyl Cadaverine,Dansyl Cadaverine,MeOH,
DAPI,DAPI-DNA,Dapoxyl(2-氨基乙基)磺酰胺,DDAO pH 9.0,Di-8 ANEPPS,Di-8-ANEPPS-
脂质,DiI,DiO,DM-NERF pH 4.0,DM-NERF pH 7.0,DsRed,DTAF,dTomato,eCFP(增强的蓝绿
色荧光蛋白),eGFP(增强的绿色荧光蛋白),曙红,曙红抗体缀合物pH 8.0,赤藓红-5-异硫
氰酸酯pH 9.0,eYFP(增强的黄色荧光蛋白),FDA,FITC抗体缀合物pH 8.0,FlAsH,Fluo-3,
+
Fluo-3Ca2 ,Fluo-4,Fluor-Ruby,荧光素,荧光素0.1M NaOH,荧光素抗体缀合物pH 8.0,荧
光素葡聚糖pH 8.0,荧光素pH 9.0,Fluoro-Emerald,FM 1-43,FM 1-43脂质,FM 4-64,FM 
4-64,2％CHAPS,Fura Red Ca2+,Fura Red,高Ca,Fura Red,低Ca,Fura-2 Ca2+,Fura-2,
Fura-2,GFP(S65T),HcRed,Indo-1Ca2+,Indo-1,游离Ca,Indo-1,饱和Ca,JC-1,JC-1pH 
8.2,丽丝胺罗丹明,萤光黄,CH,Magnesium Green,Magnesium Green Mg2+,Magnesium 
Orange,Marina Blue,mBanana,mCherry,mHoneydew,mOrange,mPlum,mRFP,mStrawberry,
mTangerine,NBD-X,NBD-X,MeOH,NeuroTrace 500/525,绿色荧光Nissl染料-RNA,尼罗蓝,
尼罗红,尼罗红-脂质,Nissl,俄勒冈绿488,俄勒冈绿488抗体缀合物pH 8.0,俄勒冈绿514,
俄勒冈绿514抗体缀合物pH 8.0,太平洋蓝,太平洋蓝抗体缀合物pH 8.0,藻红蛋白,R-藻红
蛋白pH 7.5,ReAsH,试卤灵,试卤灵pH 9.0,Rhod-2,Rhod-2 Ca2+,罗丹明,罗丹明110,罗丹
明110pH 7.0,罗丹明123,MeOH,Rhodamine Green,罗丹明鬼笔环肽pH 7.0,罗丹明Red-X抗
体缀合物pH 8.0,Rhodamine Green pH 7.0,Rhodol Green抗体缀合物pH 8.0,Sapphire,
SBFI-Na+,Sodium Green Na+,磺酰罗丹明101,四甲基罗丹明抗体缀合物pH 8.0,四甲基罗
丹明葡聚糖pH7.0,和Texas Red-X抗体缀合物pH 7.2。

[0078] 本公开内容预见到的化学标签的非限制性例子包括放射性标记。例如、但不限于，在本公开内容的组合物和方法中预见到的放射性标记包括11C、13N、15O、18F、18F-FDG、32P、
52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、90Y、94mTc、94Tc、95Tc、99mTc、103Pd、105Rh、109Pd、111Ag
111 123 124 125 131 140 149 153 154-159 165 166 166 169 175 175
、 In、 I、 I、 I、 I、 La、 Pm、 Sm、 Gd、 Dy、 Dy、 Ho、 Yb、 Yb、 Lu、
177Lu、186Re、188Re、192Ir、198Au、199Au和212Bi。

[0079] 本领域的普通技术人员会明白，存在许多这样的可检测的标志物，其可以用于在体外、在体内或离体使细胞显影。

[0080] 治疗部分

[0081] 本公开内容预见到的治疗部分包括、但不限于多肽(包括蛋白治疗剂)或肽、小分子、化学治疗剂或它们的组合。

[0082] 本文中使用的术语“小分子”表示化学化合物，例如可以任选地衍生化的肽模仿物(peptidometic)或寡核苷酸，或任何其它低分子量有机化合物，无论是天然的还是合成的。

[0083] “低分子量”是指具有小于1000道尔顿、通常在300-700道尔顿之间的分子量的化合物。在不同的方面，低分子量化合物是约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约1000或更多道尔顿。

[0084] 在某些实施方案中，所述治疗部分是蛋白治疗剂。蛋白治疗剂包括、但不限于，细胞蛋白或循环蛋白以及其片段和衍生物。其它治疗部分包括多核苷酸，包括、但不限于，编
码蛋白的多核苷酸、编码调节性多核苷酸的多核苷酸和/或其本身是调节性的多核苷酸。任
选地，所述组合物包含本文所述化合物的组合。

[0085] 在某些实施方案中，蛋白治疗剂包括细胞因子或造血因子，包括但不限于IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-11,集落刺激因子-1(CSF-1),M-CSF,SCF,GM-CSF,
粒细胞集落刺激因子(G-CSF),EPO,干扰素-α(IFN-α),复合干扰素,IFN-β,IFN-γ,IL-7,
IL-8,IL-9,IL-10,IL-12,IL-13,IL-14,IL-15,IL-16,IL-17,IL-18,血小板生成素(TPO),
血管生成素，例如Ang-1,Ang-2,Ang-4,Ang-Y,人血管生成素-样多肽,血管内皮生长因子
(VEGF),血管生成素,骨形态形成蛋白-1,骨形态形成蛋白-2,骨形态形成蛋白-3,骨形态形
成蛋白-4,骨形态形成蛋白-5,骨形态形成蛋白-6,骨形态形成蛋白-7,骨形态形成蛋白-8,
骨形态形成蛋白-9,骨形态形成蛋白-10,骨形态形成蛋白-11,骨形态形成蛋白-12,骨形态
形成蛋白-13,骨形态形成蛋白-14,骨形态形成蛋白-15,骨形态形成蛋白受体IA,骨形态形
成蛋白受体IB,脑衍生的神经营养因子,睫状神经营养因子,睫状神经营养因子受体,细胞
因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1,细胞因子诱导的嗜中性粒细胞,趋化因子2α,细胞因
子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β,β内皮细胞生长因子,内皮缩血管肽1,表皮生长因子,
上皮衍生的嗜中性粒细胞引诱剂,成纤维细胞生长因子4,成纤维细胞生长因子5,成纤维细
胞生长因子6,成纤维细胞生长因子7,成纤维细胞生长因子8,成纤维细胞生长因子8b,成纤
维细胞生长因子8c,成纤维细胞生长因子9,成纤维细胞生长因子10,酸性的成纤维细胞生
长因子,碱性的成纤维细胞生长因子,神经胶质细胞系衍生的神经营养因子受体α1,神经胶
质细胞系衍生的神经营养因子受体α2,生长相关的蛋白,生长相关的蛋白α,生长相关的蛋
白β,生长相关的蛋白γ,结合肝素的表皮生长因子,肝细胞生长因子,肝细胞生长因子受
体,胰岛素-样生长因子I,胰岛素-样生长因子受体,胰岛素-样生长因子II,胰岛素-样生长
因子结合蛋白,角质形成细胞生长因子,白血病抑制因子,白血病抑制因子受体α,神经生长
因子神经生长因子受体,神经营养因子-3,神经营养因子-4,胎盘生长因子,胎盘生长因子
2,血小板衍生的内皮细胞生长因子,血小板衍生的生长因子,血小板衍生的生长因子A链,
血小板衍生的生长因子AA,血小板衍生的生长因子AB,血小板衍生的生长因子B链,血小板
衍生的生长因子BB,血小板衍生的生长因子受体α,血小板衍生的生长因子受体β,前-B细胞
生长刺激因子,干细胞因子受体,TNF，包括TNF0,TNF1,TNF2,转化生长因子α,转化生长因子
β,转化生长因子β1,转化生长因子β1.2,转化生长因子β2,转化生长因子β3,转化生长因子β
5,潜在转化生长因子β1,转化生长因子β结合蛋白I,转化生长因子β结合蛋白II,转化生长
因子β结合蛋白III,肿瘤坏死因子受体类型I,肿瘤坏死因子受体类型II,尿激酶-型纤溶酶
原激活物受体,血管内皮生长因子,和嵌合蛋白和其生物学上或免疫学上有活性的片段。

[0086] 在某些实施方案中，治疗部分也包括化学治疗剂。预见到用在本公开内容的试剂中的化学治疗剂包括、但不限于，烷化剂，包括：氮芥，诸如氮芥-乙胺,环磷酰胺,异环磷酰胺,美法仑和苯丁酸氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(BCNU),洛莫司汀(CCNU),和司莫司汀
(甲基-CCNU)；乙烯亚胺/甲基三聚氰胺诸如三亚乙基三聚氰胺(TEM),三乙烯,硫代磷酰胺
(塞替派),六甲蜜胺(HMM,六甲蜜胺)；烷基磺酸酯诸如白消安；三嗪诸如达卡巴嗪(DTIC)；
抗代谢药包括叶酸类似物诸如甲氨蝶呤和三甲曲沙,嘧啶类似物诸如5-氟尿嘧啶,氟脱氧
尿苷,吉西他滨,胞嘧啶阿糖胞苷(AraC,阿糖胞苷),5-氮胞苷,2,2′-二氟脱氧胞苷,嘌呤类
似物诸如6-巯基嘌呤,6-硫鸟嘌呤,硫唑嘌呤,2'-脱氧助间型霉素(喷司他丁),赤-羟基壬
基腺嘌呤(EHNA),磷酸氟达拉滨,和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨,2-CdA)；天然产物，包括抗有
丝分裂的药物诸如紫杉醇,长春花生物碱包括长春碱(VLB),长春新碱,和长春瑞滨,泰索
帝,雌莫司汀,和磷酸雌莫司汀；epipodophylotoxin诸如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素诸如
actimomycin D,道诺霉素(红比霉素),多柔比星,米托蒽醌,伊达比星,博来霉素,普卡霉素
(普卡霉素),丝裂霉素C，和放线菌素；酶诸如L-天门冬酰胺酶；生物应答调节剂诸如干扰
素-α,IL-2,G-CSF和GM-CSF；各种药剂，包括铂配位络合物诸如顺铂和卡铂,蒽二酮诸如米
托蒽醌,取代的脲诸如羟基脲,甲基肼衍生物包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼,肾上腺皮质
抑制剂诸如米托坦(o,p′-DDD)和氨鲁米特；激素和拮抗剂包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂诸
如泼尼松和等效物,地塞米松和氨鲁米特；黄体酮诸如己酸羟孕酮,醋酸甲羟孕酮和乙酸甲
地孕酮；雌激素诸如己烯雌酚和炔雌醇当量；抗雌激素剂诸如他莫昔芬；雄激素包括丙酸睾
酮和氟甲睾酮/等效物；抗雄激素诸如氟他胺,促性腺素释放激素类似物和亮丙瑞林；和非
甾体类抗雄激素诸如氟他胺。也特别预见到吉非替尼和厄洛替尼。

[0087] 提供的治疗部分的剂量作为例如以mg/kg为单位测量的剂量施用。预见到的公开的治疗剂的mg/kg剂量包括约1mg/kg至约60mg/kg。以mg/kg为单位的具体剂量范围包括约
1mg/kg至约20mg/kg、约5mg/kg至约20mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg、约25mg/kg至约50mg/
kg、和约30mg/kg至约60mg/kg。受试者的精确有效量将取决于受试者的体重、大小和健康；
病症的性质和程度；以及为施用选择的治疗剂或治疗剂的组合。通过例行实验可以确定用
于给定情形的治疗有效量，所述例行实验是在临床医师的技能和判断内。

[0088] 本文中使用的“有效量”表示这样的本公开内容的试剂的量：其足以显现鉴别的疾病或病症，或表现出可检测的治疗或抑制作用。所述作用通过例如临床状况的改善或征状
的减轻来检测。受试者的精确有效量将取决于受试者的体重、大小和健康；病症的性质和程
度；以及为施用选择的治疗剂或治疗剂的组合。通过例行实验可以确定用于给定情形的治
疗有效量，所述例行实验是在临床医师的技能和判断内。

[0089] 试剂的显影

[0090] 与发育异常细胞或癌细胞的结合的显影是通过本领域普通技术人员已知的任何措施。如本文所讨论的，显影是，例如、但不限于，体内、体外或原位显影。

[0091] 在其中可检测标记是放射性标记的某些实施方案中，通过核成像检测放射性标记。核成像在本领域中被理解为，施用放射性示踪剂材料以后，通过检测来自身体的不同部
位的辐射而产生图像的方法。所述图像记录在计算机上和胶片上。

[0092] 本公开内容的方法的一些实施方案涉及从患者获取组织样品。所述组织样品选自所述患者的组织或器官。

[0093] 制剂

[0094] 取决于特定施用模式和剂型，用药学上可接受的赋形剂诸如载体、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等配制本公开内容的组合物。通常配制所述组合物以达到生理上相容的pH，且
范围从约3的pH至约11的pH，约pH 3至约pH 7，取决于制剂和施用途径。在替代实施方案中，将pH调至约pH 5.0至约pH 8的范围。在不同的方面，所述组合物包含治疗有效量的至少一
种如本文中所述的化合物、以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。任选地，所述组合物包
含本文所述化合物的组合，或可以包括可用于治疗或预防细菌生长的第二种活性成分(例
如、但不限于，抗细菌剂或抗微生物剂)，或可以包括本公开内容的试剂的组合。

[0095] 合适的赋形剂包括，例如，载体分子，其包括大的、缓慢代谢的大分子诸如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。其它示例性的赋形剂包括抗氧化剂(例如、但不限于，抗坏血酸)、螯合剂(例如、但不限于，EDTA)、碳水化合物(例如、但不限于，糊精、羟基烷基纤维素和羟基烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如、但不限于，油、水、盐水、甘油和乙醇)润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

[0096] 实施例

[0097] 通过参考详述本发明的示例性实施方案的以下实施例将会更充分地理解本发明。

[0098] 在实施例中使用的材料和方法

[0099] 细胞、化学物质和材料

[0100] 人HT29、SW480、Q-hTERT和SKBR3细胞得自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)。我们为HT29和SKBR3使用McCoy氏培养基，为SW480使用Dulbecco氏改良的伊
格尔培养基(DMEM)，和为Q-hTERT使用角质形成细胞-SFM培养基(Gibco)。将Flo-1Her2细胞
维持在补充了G418的DMEM中。将所有细胞在37℃在5％CO2中培养，并补充含有1％青霉素/
链霉素的10％胎牛血清(FBS)。对于siRNA击倒研究，省略青霉素/链霉素。对于角质形成细
胞-SFM培养基，省略FBS。使用含有胰蛋白酶(Mediatech Inc,Mansas,VA)的0.25％EDTA，将
细胞传代。用血球计数器计数细胞数目。肽合成试剂得自Anaspec(Fremont,CA)或AAPPTEC
(Louisville,KY)，并且具有可得到的最高等级(>99％纯度)，并不经进一步纯化地使用。溶
剂和其它化学试剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)，除非另外提及。

[0101] 使用结构模型的肽选择

[0102] HER2细胞外结构域(ECD)的晶体结构(ID#2A91)得自Protein Data Bank(PDB).83。使用PepSite-2.40将具有7个随机氨基酸残基的肽文库与2A91比对。使用模拟位.36产
生约1000个肽序列。我们评价了具有由链A指定的2A91蛋白结构的候选肽序列的结合。所述
软件综合地评价了7个氨基酸中的每一个的预测结合基序的所有可能组合，并产生了候选
肽和HER2-ECD靶标之间的结合相互作用的3D模型。对于每种肽，将原始评分拟合至Gumbel
分布并然后通过P-值排序。

[0103] 将Flo-1-Her2和Q-hTERT细胞与～7,500个细胞一起用1.5mm厚玻璃盖玻片接种进12-孔平板中，并培养至～70％汇合。将所述细胞用冷PBS轻轻洗涤，然后加入所述肽。将10μM FITC-标记的肽加给每个孔，并在4℃温育1小时。温育以后，将所述细胞用PBS洗涤3次，在冰冷的4％PFA中固定10min，并用PBS洗涤1次。随后，将所述细胞在显微镜载玻片上用含有
DAPI(Invitrogen)的ProLong Gold试剂包埋，并将载玻片用Leica TCS SP5共焦显微镜使
用63X油浸物镜(Leica Microsystems,Leider Lane IL)分析。一式四份地试验FITC-标记
的肽和抗-HER2抗体。

[0104] 肽合成

[0105] 我们用FITC或Cy5.5合成并标记了所述肽——使用标准的Fmoc介导的固相化学合成。我们使用Fmoc和Boc保护的L-氨基酸，并在rink酰胺MBHA树脂上组装合成。在PS3自动合
成仪(Protein Technologies Inc.Tucson,AZ)上合成所述肽。包含C-端赖氨酸作为Fmoc-
Lys(ivDde)-OH，且给N-端氨基酸包含Boc保护以避免在荧光团标记之前在ivDde部分的去
保护过程中不希望的Fmoc除去。在肽的完全装配后，将树脂转移至反应容器用于用染料手
工地标记。在连续摇动下在室温(RT)用在DMF中的5％肼(3x20min)除去ivDde侧链保护基。
将树脂用二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)洗涤3次，每次1min。在有DIEA存在下将被保
护的树脂结合的肽与FITC或Cy5.5-NHS酯(Lumiprobe LLC,Hallandale Beach,FL)一起温
育过夜，并通过定性茚三酮试验监测反应的结束。在标记结束后，在摇动下在暗处在室温使
用TFA:TIS:H2O(95:2.5:2.5v/v/v)从树脂切割肽4小时。从树脂分离肽以后，将滤液用N2气
蒸发，随后用冷乙醚沉淀并在-20℃储存过夜。将沉淀物在3000rpm离心5min，并用乙醚洗涤
3次，并在每个洗涤步骤之间离心。将粗制的肽溶解在1:1乙腈/H2O(v/v)中，并使用水
(0.1％TFA)-乙腈(0.1％TFA)梯度用C18柱(Waters Inc,Milford,MA)通过制备型HPLC纯
化。通过分析型C18-柱证实最终的肽纯度。用ESI(Waters Inc.)或Q-TOF(Agilent 
Technologies)质谱法执行进一步表征。使用相同的方法将乱序(对照)肽PPS*-Cy5.5合成、
标记和纯化。

[0106] 波谱测量

[0107] 使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific,Waltham,MA)收集肽吸光度波谱。使用具有λex＝671nm的二极管泵送的固态激光器(Technica Laser Inc,Winter 
Park,FL)，用纤维偶联的分光光度计(Ocean Optics,Dundin,FL)收集荧光发射。将分光光
度计探针放置成与在PBS中稀释的5μM肽溶液接触。使用Origin 6.1软件(OriginLab Corp,
Northampton,MA)绘制波谱。

[0108] 共焦荧光显微术

[0109] 将细胞用PBS洗涤，并与5μM KSP*-Cy5.5和PPS*-Cy5.5一起在4℃温育30min。然后将细胞在PBS中洗涤3次，用冰冷的4％低聚甲醛(PFA)固定10min，用PBS洗涤1次，然后用含
有DAPI(Invitrogen)的ProLong Gold试剂固定在载玻片上。用Cy5.5和DAPI过滤器(Leica 
Inverted SP5X Confocal Microscope System)收集共焦荧光图像。对于抗体染色，将细胞
用冷甲醇在-20℃预固定10min，并用2％BSA在室温封闭30min。将细胞用抗HER2抗体的1:
450稀释液在4℃温育过夜。将细胞用PBS洗涤3次，并处理用于第二次染色。将山羊-抗兔
Alexa-Fluor 488(AF488)加给所述细胞并在室温温育1小时。将细胞进一步用PBS洗涤3次
并固定在玻璃盖玻片上。使用定制Matlab(Mathworks)软件定量来自3个独立图像的荧光强
度。

[0110] HER2的siRNA击倒和共定位

[0111] 我们使用ON-TARGETplus人ERBB2siRNA(#L-003126-00-0005)、ON-TARGETplus非靶向集合(#D-001810-10-05)和来自Thermo Scientific(Waltham,MA)的DharmaFECT转染
试剂检查了HT29细胞中的HER2的击倒。简而言之，将细胞在不含抗生素的补充了10％胎牛
血清的McCoy氏5A培养基中在30％汇合时接种进6-孔培养板中。次日，使用寡核苷酸转染
(Thermo Scientific)，以5μmol/L的终浓度用siRNA转染细胞。通过蛋白质印迹来证实HER2
的击倒。首先将细胞在PBS中洗涤，并然后在含有1％Nonidet P40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、10mg/ml苯基甲基磺酰基氟和1mM原钒酸钠的RIPA缓冲液中裂解。将等分试样在冰上放
置30min并在14,000RPM离心10min。将蛋白等分试样在加载缓冲液中在95℃变性5min，在
SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上分离，并转移到PVDF膜上。将所述膜用封闭缓冲液(在
0.1％PBST中的5％脱脂乳)封闭30min。将所述膜与抗-HER2第一抗体一起在4℃温育过夜。
用PBST洗涤5次和用PBS洗涤5次以后，将所述膜在过氧化物酶-缀合的第二抗体(1:5000稀
释度；GE Healthcare,UK)中温育1小时，并使用蛋白质印迹化学发光底物(GE Healthcare,
USA)显色。通过向X-射线胶片(Denville Scientific；NJ,USA)的暴露，检测发光信号。

[0112] 我们评价了KSP*-Cy5.5和经验证的抗-HER2抗体向HT29细胞的表面的结合的共定位。将在5μM浓度的KSP*-Cy5.5在4℃温育1小时。将所述细胞洗涤，并用4％PFA固定5min，然后用第一抗-HER2和第二AF488-标记的抗体温育。我们首先施用肽试剂，因为它的较低亲和
力。较低浓度(<10μM)不太可能干扰抗体结合。

[0113] 关于肽试剂结合的竞争

[0114] 用未标记的KSP*肽试剂在竞争性抑制上验证了KSP*-Cy5.5与HT29细胞的特异性结合。一式三份地在盖玻片上将约7500个HT29细胞培养至约70％汇合。加入在0、10、25、50和100μM的未标记的KSP*肽，并在4℃与所述细胞一起温育30min。将所述细胞用PBS洗涤3
次，并进一步与2μM KSP*-Cy5.5一起在4℃温育另外30min。将所述细胞用PBS洗涤3次，并用
4％PFA固定10min。将所述细胞用PBS洗涤，并用含有DAPI(Invitrogen)的ProLong Gold试
剂固定。在每个浓度收集共焦荧光图像，并使用定制Matlab(Mathworks)软件定量来自3个
独立图像的强度。

[0115] 肽试剂结合亲和力和时间常数的测量

[0116] 我们测量了HER2肽试剂对HT29细胞的表观解离常数作为结合亲和力的评估。将KSP*-Cy5.5在0、5、10、25、50、100和200nM的浓度在PBS中系列稀释。将约105个HT29细胞与KSP*-Cy5.5一起在4℃温育1小时，并用冷PBS洗涤。用流式细胞计量术( LSRII,BD 
Biosciences)测量平均荧光强度。通过执行所述数据与非线性方程式I＝(I0+Imaxka[X])/
(I0+ka[X])的最小二乘法拟合，计算平衡解离常数kd＝1/ka。I0和Imax是最初和最大荧光
强度，分别对应于无肽试剂和在饱和时，且[X]代表结合的肽试剂的浓度。使用Graphpad 
prism分析软件(Graphpad Software Inc,La Jolla,CA)计算kd和ka。

[0117] 我们测量了所述肽试剂与HT29细胞的表观结合时间常数以评估结合的定时。使HT29细胞在10cm盘中生长至约80％汇合，并用基于PBS的细胞解离缓冲液(Invitrogen)脱
离。将约105个细胞与5μM KSP*-Cy5.5一起在4℃温育在0-60min范围内的不同时间间隔。将
所述细胞离心，用冷PBS洗涤，并用4％PFA固定。执行流式细胞计量术，并使用Flowjo软件绘制中间荧光强度(y)与在不同时间点(t)没有加入肽试剂的情况下的HT29细胞的值的关系。
使用Graphpad Prism 5.0软件，如下计算速率常数k：将所述数据拟合至一阶动力学模型y
(t)＝Imax[1-exp(-kt)]，其中Imax＝最大值,82。

[0118] HER2肽对细胞信号传递的影响

[0119] 通常使用SKBR3细胞来评价HER2信号传递，并在6孔板中培养至约60％汇合。将未标记的KSP*肽以5和100μM的浓度加入单独的孔。将拉帕替尼(一种酪氨酸激酶抑制剂)用作
阳性对照，并以1、25、100和1000nM的浓度加入。将在1mg/mL开始的拉帕替尼储备溶液在
DMSO和PBS中稀释。将1％DMSO处理过的细胞和未处理的细胞用作对照。处理后48小时以后，
将所述细胞收获用于蛋白质印迹分析。按照生产商的说明书使用抗-HER2抗体(Cell 
Signaling,#2165)、磷酸-HER2/ErbB2(Tyr1248)抗体(Cell Signaling,#2247)、抗-AKT
(Cell Signaling,#4691P)、抗-ERK1/2(Cell Signaling,#4695P)、抗-磷酸-AKT(pS473)、
(Cell Signaling,#4060P),抗-磷酸-ERK1/2(Cell Signaling,#4370P)和抗-微管蛋白
(Invitrogen,#32-2600)。

[0120] 在小鼠结肠瘤形成中过表达的局部HER2的体内成像

[0121] 在密西根大学动物使用和护理委员会(University of Michigan Committee on the Use and Care of Animals，UCUCA)批准下执行小鼠成像研究。将小鼠圈养在无病原体
条件下，并在湿度(50±10％)、光(12/12小时光照/黑暗周期)和温度(25℃)的控制条件下
随意供给水。通过鼻锥体用吸入的异氟烷(其与氧混合，浓度为2-4％，流速为约0.5L/min)
诱导和维持麻醉。将结肠首先用自来水冲洗以除去粘液和碎片。首先使用白光照射来鉴别
解剖学界标，包括息肉、粘膜襞、结肠段、和内窥镜尖部离肛门的距离，以登记具有组织学的体内图像。穿过3个Fr器械通道以1.5mL的体积以100μM的浓度局部地递送Cy5.5-标记的肽
试剂。温育5min以后，将结肠用自来水冲洗3次以除去未结合的肽试剂。使用小动物内窥镜
(Karl Storz Veterinary Endoscopy)执行成像。在成像过程中，我们记录：1)内窥镜尖部
和肛门之间的距离，和2)高强度的每个区域的顺时针方向位置。几天以后，重复内窥镜检查
术以证实来自KSP*-Cy5.5的所有残余信号已经消失，然后用PPS*-Cy5.5对照肽试剂使小鼠
成像。

[0122] 对于彩色和荧光图像分别以具有24(RGB)和8(灰度)位数字分辨率的avi格式输出白光和荧光视频。选择表现出最小运动伪差且缺少碎片(粪便、粘液)的流用于定量。使用定
制的Matlab软件输出各个帧。在荧光图像上，挑选具有25×25像素的尺寸的3个目标区域
(ROI)以代表正常和患病组织的染色范围，并取平均值。确定在这些ROI内的平均强度以计
算靶标/背景(T/B)比率。

[0123] 在小鼠结肠瘤形成中过表达的静脉内HER2的体内成像

[0124] 将小鼠用异氟烷麻醉，经由尾静脉施用200μL在300μM浓度的KSP*-Cy5.5肽试剂。在肽试剂注射之前执行成像以评估基线荧光，和在注射以后直到观察到最大信号。通过绘
制在每个时间点的目标区域，计算腺瘤中的荧光强度与正常区域中的荧光强度的比率。

[0125] 在小鼠结肠瘤形成中过表达的HER2的离体肉眼验证

[0126] 在成像以后，将结肠切离，用PBS冲洗，并纵向切开用IVIS 200系统使用Cy5.5过滤器(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA)成像。使用675nm激发和720nm发射(具有1秒曝
光)，收集NIR荧光图像。将尺子放在样本旁边以确定从肛门的距离用于登记内窥镜检查术
和组织学图像。然后通过在与粘膜表面平行的平面中切割切片，将样本处理用于组织学。使
用5倍放大率用Zeiss Axiovision显微镜(Thornwood,NY)收集数字图像，并使用Image 
Composite Editor(Microsoft,Redmond,WA)缝在一起。由对成像结果不知情的专家胃肠病
理学家(SRO)评论组织学，并鉴别发育异常和正常结肠的区域。使用Living Image 4.0软件
(Caliper Life Sciences；Hopkinton,MA)从来自正常和息肉的相等面积的2个同心椭圆形
测量来自这些部位的荧光强度。将来自息肉和正常的强度分别用于定义靶标(T)和背景(B)
值。

[0127] 在小鼠结肠腺瘤上的肽试剂免疫荧光

[0128] 如前所述，将小鼠结肠腺瘤的样本用福尔马林固定和处理。将系列5μm切片与2μM的每种肽一起在室温温育10min。将所述切片用PBS洗涤3次，并用含有DAPI(Invitrogen)的
Prolong Gold试剂固定。将邻近切片处理用于组织学(H&E)。

[0129] HER2肽试剂与人近侧结肠瘤形成的结合

[0130] 从病理科(Department of Pathology)的存档组织库得到福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)人近侧结肠样本。切割5μm厚切片，并固定在载玻片(Superfrost Plus,
Fischer Scientific)上。将所述组织脱石蜡，并执行抗原提取。将所述切片用蛋白血清在
室温封闭15min，随后用PBS冲洗。然后将所述切片用5μM浓度的KSP*-Cy5.5在室温染色
10min。然后将所述切片用PBS洗涤3次(每次3min)并进一步与抗-HER2抗体一起在4℃温育
过夜。将切片用PBST洗涤3次，并使用#1盖玻片(1.5μm厚度)用含有DAPI(Invitrogen)的
Prolong Gold试剂固定。我们将3个具有20×20μm2的尺寸的框完全放在每个图像中的结肠
上皮内，并使用定制Matlab软件测量平均荧光强度。避免饱和强度的区域。

[0131] HER2在人近侧结肠中的过表达

[0132] 使用来自Cell Signaling Inc(Danvers,MA)的抗-HER2/neu(#29D8；兔单克隆抗体#2165)的1:450稀释度执行免疫组织化学(IHC)。按照生产商的说明书使用Vectastain 
Elite试剂盒(Vector Laboratories Inc,Burlingame,CA)。简而言之，使用标准的脱水/再
水合方案将福尔马林固定的样本脱石蜡，并如下执行抗原暴露：将载玻片在pH 6.0的含有
0.05％吐温的10mM柠檬酸钠缓冲液中煮沸，然后在亚沸腾温度维持15min。将载玻片冷却
30min。将所述切片用dH2O洗涤3次各3min，然后在3％的H2O2在甲醇中的溶液中温育10min。
将所述切片在dH2O中洗涤3次各2min和在PBST中洗涤5min。用来自Dako(Carpinteria,CA)
的蛋白封闭剂#X0909在室温执行封闭15min。将封闭溶液用PBS洗涤1次。将所述切片与抗-
HER2/neu抗体一起在潮湿室中在4℃温育过夜，并然后在PBST中洗涤3次各5min。将生物素
化的第二抗体(山羊抗-兔IgG)的1:200稀释液加给每个切片并在室温温育30min，然后通过
用PBST洗涤3次各5min而除去。将预混合的Elite Vectastain ABC试剂(来自Vector Labs)
加给每个切片并在室温温育30min。将所述切片在PBS中洗涤3次各5min，并用3,3'-二氨基
联苯胺(DAB)底物显色。监测反应直到5min，然后通过将载玻片浸在dH2O中淬灭。加入作为
复染色剂的苏木精约20秒，并将所述切片在递增浓度的乙醇(在70％、80％、95％和100％各
2份)中脱水。使用在二甲苯中的封固前封固介质(#SP15-100,Fisher)封固盖玻片。将系列
切片处理用于常规组织学(H&E)。

[0133] 由不知道临床病理学信息或分子成像结果的先前知识的胃肠病学病理学专家独立地执行IHC评分。如下根据DAKO HercepTestTM指南执行评分：0+，在≥10％的肿瘤细胞中
的无反应或膜染色；1+，在≥10％的肿瘤细胞中的微弱的/几乎不能觉察的部分膜染色；2+，在≥10％的肿瘤细胞中的弱至中等完全或基底外侧膜染色；3+，在≥10％的肿瘤细胞中的
中等至强完全膜染色。认为具有2+和3+的IHC评分是HER2过表达阳性的。

[0134] 统计分析

[0135] 如果需要的话将荧光强度转化成以2为底的对数来改善正态性和稳定方差。使用对数转化的数据的差异的反对数(anti-log)估计分类对之间的倍数变化。我们将具有4个
组织学分类的人数据与单因素方差分析模型拟合并使用Tukey氏多重比较。在Pearson氏相
关系数上评价肽试剂和抗体结合的共定位。

[0136] 实施例1

[0137] 使用结构模型的肽选择

[0138] 我们使用结构模型鉴别了特异性地结合HER2(2A91)的细胞外结构域(ECD)的肽，图1A[Garrett等人,Mol Cell.11:495-505(2003)]。靶向ECD，因为它可接近以成像。我们如
下使用模拟位(www.mimotopes.com)产生了约1000种候选物：考虑在N-端处的Arg或Lys氨
基酸残基以与HER2-ECD形成亲水相互作用[Lemmon,Exp.Cell Res.,315:638-648(2009)；
Franklin等人,Cancer Cell,5:317-328(2009)]。将疏水残基诸如Phe、Trp、Val、Met、Ile和Leu附加在C-端以增加疏水/亲水相互作用的可能性(Garrett等人,出处同上)。使用其它氨
基酸诸如Ser、His、Arg、Tyr、Thr、Asp和Asn来增加肽多样性[Wang等人,Anal Chem.18:
8367-8372(2015)]。在中间区域通过构象上刚性的间隔基团(诸如PFP、PNP、PYP和PWP)连接
所述肽的N或C-端。我们使用Pepsite-2评价了这些候选物与HER2-ECD结构域1-3的结合相
互作用[Trabuco等人,Nucleic Acids Res.,40:W423-426(2012)]。我们基于P-值合成了五
种主要候选物。

[0139] KSPNPRF(SEQ ID NO:1)

[0140] RHPFPRF(SEQ ID NO:2)

[0141] RHPWPNR(SEQ ID NO:3)

[0142] RHPYPQR(SEQ ID NO:4)

[0143] RKPFPRH(SEQ ID NO:5)

[0144] 我们将FITC标记连接至每种肽，并使用共焦显微术成像与Flo1-HER2和Q-hTERT细胞(对照)的结合。这些细胞的蛋白质印迹显示了HER2表达的差异，图1B。基于与Flo1-HER2
的结合的最高平均荧光强度，我们选择了KSPNPRF，图1C。从我们的模型，该肽结合HER2结构域3。然后将所述肽(黑色)经由在C-端上的GGGSK接头(蓝色)用Cy5.5(红色)荧光团标记用
于深组织成像，此后称作KSP*-Cy5.5，图1D。为高量子产率和光稳定性选择Cy5.5。所述接头通过使所述荧光团与所述肽在空间上分离而阻止位阻。我们如下开发了用于用作对照的乱
序序列PPSNFKR：改变所述构象上刚性的间隔物PNP并移动在C-端处的疏水和亲水氨基酸。
我们还经由GGGSK将该对照肽连接至Cy5.5，此后称作PPS*-Cy5.5，图1E。5μM的KSP*-Cy5.5
和PPS*-Cy5.5在PBS中的吸光度波谱显示在680nm的最大值，图1F。荧光发射峰在NIR光谱中
发生在708nm。对于两种肽，我们用HPLC实现了>98％纯度，并在质谱法上测得1794.98的实
验性质量/电荷(m/z)比率，这与预期值一致，图8A，B。

[0145] 实施例2

[0146] 共焦荧光显微术

[0147] 我们执行共焦显微术以证实肽与质膜的结合(箭头)，并观察到对于HT29和SW480细胞而言KSP*-Cy5.5比PPS*-Cy5.5显著更大的荧光强度，图2A-D。AF488-标记的抗-HER2抗
体也表现出比对照肽显著更大的信号，图2E,F。显示了定量的值，图2G。蛋白质印迹显示了
HT29和SW480对HER2的表达的差异，图2H。

[0148] 实施例3

[0149] HER2的siRNA击倒和共定位

[0150] 我们用HT29细胞执行siRNA击倒实验以验证KSP*-Cy5.5与HER2的特异性结合。在共焦显微术上，KSP*-Cy5.5(红色)和AF488-标记的抗-HER2抗体(绿色)强烈地结合对照
HT29细胞(用siCL转染，非靶向siRNA)的表面(箭头)，图2I,J。对于HT29击倒细胞(用siHER2
转染，靶向siRNA)，观察到显著减小的荧光强度，图2K,L。显示了定量的结果，图3M。蛋白质印迹显示了有效的HER2击倒，图2N。我们还在合并的图像上观察到肽试剂和抗体结合的共
定位(箭头)(Pearson氏系数ρ＝0.743),图2O。

[0151] 实施例4

[0152] 关于肽试剂结合的竞争

[0153] 通过加入未标记的KSP*来与HT29细胞上的KSP*-Cy5.5竞争，我们执行了竞争研究来证实，所述肽发生结合，所述荧光团不会发生结合。我们发现荧光强度以浓度依赖性的方
式显著地下降，图2P。

[0154] 实施例5

[0155] 肽试剂结合的表征

[0156] 我们使用流式细胞计量术评价了KSP*-Cy5.5与HT29细胞的结合参数。我们测量了kd＝21nM的表观解离常数(R2＝0.98)，从而导致高结合亲和力，图2Q。我们还测量了k＝
0.14min-1(7.14min)的表观结合时间常数(R2＝0.92)，以支持与局部施用的快速结合，图
2R。

[0157] 实施例6

[0158] 肽对细胞信号传递途径的影响

[0159] 我们评价了KSP*肽结合对SKBR3细胞中的HER2介导的信号传递的影响。在蛋白质印迹上，在加入5和100μM的KSP*的情况下，我们没有观察到HER2(p-HER2)或下游AKT(p-
AKT)和ERK(p-ERK)的磷酸化的变化，图9。通过对比，拉帕替尼(一种酪氨酸激酶抑制剂，已
知其会中断实体瘤中的HER2信号传递)的添加表明p-HER2、p-AKT和p-ERK的浓度依赖性方
式的减少表达。用1％DMSO处理过的细胞和未处理的细胞没有表明HER介导的信号传递的抑
制。

[0160] 实施例7

[0161] 在小鼠结肠瘤形成中过表达的HER2的体内成像

[0162] 我们在CPC；Apc小鼠中评价了KSP*-Cy5.5与过表达HER2的结肠腺瘤的特异性结合。将该小鼠遗传工程改造成在肉体上缺少在Cre调节下的Apc等位基因，并自发地在结肠
中发生息肉样和扁平腺瘤。该模型是人疾病的代表，因为在>80％的散发性结直肠癌中发现
了Apc突变。使用对NIR荧光敏感的小动物内窥镜在体内执行成像。首先鉴别出息肉状腺瘤
(箭头)的白光图像，图3A。然后局部地施用KSP*-Cy5.5，并将其温育几分钟。将未结合的肽
试剂冲掉以后，荧光图像显示在息肉处增加的强度(箭头)，图3B。该信号在几天后消失以
后，然后使用来自相同区域的PPS*-Cy5.5(对照)收集图像进行对比。观察到微小信号，图
3C。也显示了在白光下具有精细外观的扁平腺瘤(箭头)，图3D。对应的荧光图像显示了增加
的强度，具有可见的隐窝-样结构，图3E。几天以后收集的具有PPS*-Cy5.5的图像显示微小
信号，图3F。在所有荧光图像中，周围的正常结肠粘膜层产生微小背景。定量的结果显示发
育异常与正常相比显著更大的荧光强度，图3G。

[0163] 然后将KSP*-Cy5.5经由尾静脉全身性地施用，并在每只小鼠中随时间收集NIR荧光图像。在n＝4小鼠中，发现平均强度在100min达到峰值，图4A。显示了在静脉内肽试剂注
射以后100min的息肉状腺瘤的代表性荧光图像，图4B。

[0164] 实施例8

[0165] 在小鼠结肠瘤形成中过表达的HER2的离体肉眼验证

[0166] 成像以后，将动物安乐死，并将结肠切离，并纵向切开以暴露粘膜表面用于用IVIS收集肉眼可见的白光和荧光图像，图4D,E。将所述组织沿着与表面平行的平面切片，并由对
成像结果不知情的病理学家(SRO)鉴别组织学上的发育异常和正常的区域。在n＝4小鼠中，
我们发现发育异常与正常相比显著更大的平均荧光强度，图4C。

[0167] 我们还将样本切片用于收集共焦图像以执行肽试剂结合的微观验证。我们发现KSP*-Cy5.5与PPS*-Cy5.5相比对发育异常的隐窝(箭头)的增加的细胞表面染色，图5A,B。
对于正常小鼠结肠粘膜层，我们观察到任一种肽试剂的最小染色，图5D,E。显示了对应组织
学(H&E)，图5C,F。

[0168] 我们用已知的抗体执行免疫组织化学以验证小鼠结肠发育异常中的HER2的过表达，图5G。没有使用第一抗体的系列切片(对照)表现出微小反应性，图5H。通过对比，用或不用抗-HER2的情况下，正常小鼠结肠粘膜层表现出微小反应性，图5I,J。

[0169] 实施例9

[0170] HER2肽试剂对人近侧结肠瘤形成的结合

[0171] 通过在福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)人近侧结肠样本上检查对过表达的HER2的特异性结合，我们证实了HER2肽试剂的临床翻译的潜力。在共焦显微术上，我们在邻
近切片上观察到KSP*-Cy5.5(红色)和AF488-标记的抗-HER2抗体(绿色)对发育异常的隐窝
相对于正常隐窝而言更大的结合，分别图6A,B。显示了对应组织学(H&E)；图6C。在较高放大率，可以看到与发育异常的结肠细胞的表面(箭头)结合的肽试剂和抗体的共定位，图6D。并
且，可以察觉对于KSP*-Cy5.5(红色)而言在来自图6A的虚线红色和绿色框的发育异常和正
常之间的荧光强度的差异，图6E,F。可以看到对于AF488-标记的抗-HER2抗体(绿色)而言在
来自图6B的虚线红色和绿色框的发育异常和正常之间的荧光强度的差异，图6G,H。显示了
正常(n＝30)、增生息肉(n＝12)、固着锯齿状腺瘤(n＝13)和散发性腺瘤(n＝30)的定量荧
光强度(平均值±std)，图6I。腺瘤的平均结果显著大于正常、增生和SSA的结果，而SSA和正
常之间的差异不是统计上显著的。

[0172] 实施例10

[0173] HER2在人近侧结肠中的过表达

[0174] 我们用已知的抗体执行了免疫组织化学以验证HER2在人结肠发育异常中的过表达。我们观察到在正常结肠和增生息肉的上皮的细胞膜上或细胞质中的HER2的弱染色(0+/
1+)，图7A,B。通过对比，我们发现了对于固着锯齿状腺瘤(SSA)和散发性腺瘤而言在发育异
常的隐窝中的不同染色强度，图6C,D。对于息肉样和扁平腺瘤而言，可以察觉发育异常和正
常之间的反应性对比，图6E,G。在相同视野中在瘤形成和正常隐窝之间的HER2表达的差异
支持对发育异常特异性的HER2表达。放大图显示了在发育异常的结肠细胞的膜上的强烈染
色，图6F,H。在不使用第一抗体的情况下执行对照实验，图6I。使用标准IHC评分系统的专家GI病理学家(SRO)揭示在0％(0/30)的正常、25％(3/12)的增生息肉、14％(2/14)的SSA和
41％(12/29)的腺瘤中的过表达，其由2+或3+染色定义，图6J。这些结果支持HER2作为用于
检测近侧结肠癌的有前途的早期靶标。

[0175] 实施例11

[0176] 讨论

[0177] 我们发现KSP*-Cy5.5以kd＝21nM结合HER2。尽管抗体可以实现治疗用途所需的高得多的结合亲合力，该结果对于诊断成像而言是适当的。发现该肽试剂在局部施用时快速
地结合，k＝0.14min-1(7.1min)。该特征非常适合在以高体积执行内窥镜操作的操作单元
中提供有效监督。我们发现该肽试剂对HER2信号传递没有影响。对于诊断成像，该性质会提
供胜过其它靶向部分的优点，已知所述其它靶向部分刺激HER2信号传递途径并导致细胞增
殖和肿瘤发生的调节。我们用Cy5.5标记HER2肽，因为它的高量子产率、光稳定性和NIR发射
的深组织穿透。4通过提供非常不均匀的肿瘤中的HER2表达的更综合图像，该肽也可以用于
引导患者疗法。靶向HER2的疗法的选择标准以前主要依赖于IHC和FISH，其在仅得自患病组
织的小病灶的活组织检查样本上评价。

[0178] 我们使用局部和全身注射证实了结合小鼠中的自发结肠腺瘤的特异性肽试剂，所述自发结肠腺瘤在体内和离体验证过程中在形态学上是息肉样或扁平的。来自KSP*-Cy5.5
的荧光信号与息肉样和扁平息肉相关联并允许检测来自周围非肿瘤粘膜层的腺瘤，从而提
示，KSP*-Cy5.5可以用作工具用于改善使用结肠镜检查对结肠直肠腺瘤的检测。当静脉内
地施用KSP*-Cy5.5时，所述探针可能比当局部施用时更可接近，因为仅部分穿透结肠粘膜
层。这可能解释当静脉内地施用所述探针时我们实现的提高的TBR(图4C相对于3G)。最后，
我们发现与正常和增生息肉相比显著更大的来自肽试剂(其结合来自人近侧结肠的SSA和
腺瘤)的荧光强度。

[0179] 实施例12

[0180] 肽试剂和抗体在人BilIN样本上的共定位

[0181] 从存档的组织库得到福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)人BilIN样本。我们使用来自n＝22位患者的具有不同组织学等级的人BilIN样本，包括n＝7位具有低等级(BilIN-
1)，n＝4位具有中等级(BilIN-2)，n＝5位具有高等级(BilIN-3)，和n＝6位具有癌。我们使
用来自相同样本的邻近正常胆道上皮用于对照。这些正常样本中的一些含有炎症。制作5μm
厚切片，并固定到载玻片(Superfrost Plus,Fischer Scientific)上。将所述组织脱石蜡，
并执行抗原提取。将所述切片用蛋白血清在室温封闭15min，随后用PBS冲洗。然后将所述切
片用5μM浓度的KSP*-Cy5.5在室温染色10min。然后将所述切片用PBS洗涤3次(每次3min)并
与抗-ErbB2抗体(#2165,Cell Signaling Technology)一起以1:400稀释度温育过夜。将所
述切片用PBST洗涤3次，并与AF488(Invitrogen)标记的(1:500)山羊抗-兔抗体一起在室温
温育1小时。将所述切片用PBST再洗涤3次，并使用#1盖玻片(1.5μm厚度)用含有DAPI
(Invitrogen)的Prolong Gold试剂固定。对于所有样本用相同曝光时间收集图像。

[0182] 正常人胆管的切片显示KSP*-Cy5.5试剂或HER2抗体的最小染色(图10A,B)。人BilIN的切片显示与HER2抗体一起定位的KSP*-Cy5.5试剂的增加的细胞表面染色。

[0183] 实施例13

[0184] 将肽KSPNPRF(SEQ ID NO:1)和RHPFPRF(SEQ ID NO:2)经由接头GGGSC(SEQ ID NO:7)用近红外染料标记用于深组织成像的靶向检测。在溶液相合成中使用马来酰亚胺化
学用IRDYE800标记肽。参见图11A,B。

[0185] 实施例14

[0186] 肽试剂对在人巴雷特食管中过表达的HER2的特异性结合

[0187] 从存档的组织库得到福尔马林固定的、石蜡包埋的(FFPE)人食管样本。制作5μm厚切片，并固定到载玻片(Superfrost Plus,Fischer Scientific)上。将所述组织脱石蜡，并
执行抗原提取。将所述切片用蛋白血清在室温封闭15min，随后用PBS冲洗。然后将所述切片
用5μM浓度的KSP*-Cy5.5或RHP*-Cy5.5在室温染色10min。然后将所述切片用PBS洗涤3次
(每次3min)并进一步与抗-HER2抗体一起在4℃温育过夜。将所述切片用PBST洗涤3次，并使
用#1盖玻片(1.5μm厚度)用含有DAPI(Invitrogen)的Prolong Gold试剂固定。

[0188] 图12A-E显示用KSP-Cy5.5肽试剂的染色导致随着在切离的人巴雷特食管样本中的癌症进展逐渐增加的荧光强度。图12F-J显示，用PPS*-Cy5.5(用于对照的乱序肽试剂)观
察到最小染色。类似地，图13A-E显示用RHP*-Cy5.5肽试剂的染色导致随着在切离的人巴雷
特食管样本中的癌症进展逐渐增加的荧光强度，而图13F-J显示，用PPF*-Cy5.5(用于对照
的乱序肽试剂)观察到最小染色。

[0189] 尽管已经以具体方面和实施方案的方式描述了本发明，应当理解，本领域技术人员会做出变化和修改。因此，仅出现在权利要求中的这类限制应当置于本发明。

[0190] 在本申请中引用的所有文件特此通过引用整体并入，特别注意它们提及的公开内容。