一种基于“蝴蝶效应”的电化学生物传感器制备方法及应用 |
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| 申请号 | CN202210105427.2 | 申请日 | 2022-01-26 | 公开(公告)号 | CN114509481B | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 宁波大学; | 发明人 | 胡宇芳; 胡凯悦; 任信信; 秦玲霞; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了基于“蝴蝶效应”的电化学 生物 传感器 制备方法及应用，具体步骤如下：首先利用DNA四面体1中的巯基与Au相互作用形成Au‑S键将DNA四面体1固定到金 电极 表面，当在电极表面加入ATP后，通过ATP和适配体的特异性结合作用可以将DNA四面体2、金 纳米粒子 (AuNPs)、亚甲基蓝(MB)、3D 石墨 烯合成的 复合材料 拉到电极表面，采用亚甲基蓝(MB)作为 信号 输出，通过方波 伏安法 进行电化学检测。随后，利用ALP能够催化消耗ATP生成腺苷，该策略可用于实现ALP活性及其小分子 抑制剂 分析。该方法相对于2D 石墨烯 纳米材料 修饰电极，电化学信号急剧增大，类似于“蝴蝶效应”。基于此，构建了一种简单、稳定、快速、无标记、高灵敏度、高选择性的ATP(ALP)电化学分析方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种基于“蝴蝶效应”的电化学生物传感器，其特征在于，该电化学生物传感器利用DNA四面体1中的巯基与Au相互作用形成Au‑S键将DNA四面体1固定到金电极表面，当在电极表面加入腺嘌呤核苷三磷酸ATP后，通过ATP和适配体的特异性结合作用将DNA四面体2、金纳米粒子AuNPs、亚甲基蓝MB、3D石墨烯合成的复合材料拉到电极表面，采用亚甲基蓝MB作为信号输出，通过方波伏安法对不同浓度的ATP进行电化学检测；随后，利用碱性磷酸酶ALP能够催化消耗ATP生成腺苷，实现ALP活性及其小分子抑制剂分析； |
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| 说明书全文 | 一种基于“蝴蝶效应”的电化学生物传感器制备方法及应用技术领域背景技术[0002] 腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，简称三磷酸腺苷，是生命的直接能量来源，且在调节细胞代谢中起着重要作用，如在细胞呼吸、酶催化、生物合成和DNA复制等生物过程中起着重要的细胞外调节作用。研究发现人体内ATP水平的异常与临床中多种生理疾病、心血管疾病、帕金森氏症和阿尔茨海默氏症等疾病有着密切的关系，因此，ATP可作为有价值的临床诊断指标并引起科学家广泛关注，检测方法有色谱法、生物发光法、荧光法和比色法。尽管这些检测方法有较高的灵敏度和选择性，但是存在耗时、材料昂贵和预处理复杂等缺点，而电化学方法以操作简便、灵敏度高、响应快等优点成为科学家关注的焦点。与ATP联系紧密的酶——碱性磷酸酶(ALP)能去除ATP上的磷酸基团，并生成腺苷。ALP不仅是基因测定和免疫测定中最常用的酶之一，且由于它涉及肝胆和骨骼疾病，也是常规临床分析中的目标，因此人体内这种酶的活性对相关骨骼疾病诊断和治疗具有较大影响。开发一种新的电化学方法实现ATP及ALP灵敏检测对临床诊断和药物开发有着十分重要的意义。 [0003] DNA四面体是利用DNA的寻址性构建的三维DNA纳米结构，由于具有六个边和四个三角形面的金字塔状结构，与线性单链或双链DNA相比，显示出优异的机械刚性和结构稳定性。适配体是一种单链寡核苷酸，具有稳定的二级结构和高特异性，能以极高的亲和力与特定靶标特异性结合，与抗体相比，它们体积更小，可以确保电子转移过程接近检测表面，从而实现更高的灵敏度。此外，将DNA四面体作为支架所构建的传感器不仅可以使表面拥挤效应最小化，还能确保捕获探针的密度和方向得到很好的控制。因此，联合DNA四面体及ATP适配体构建电化学生物传感器并应用于ATP及ALP的分析检测，具有极大的潜力。 [0004] 蝴蝶效应，指在一个动力系统中，初始条件下微小的变化能带动整个系统的长期的巨大的连锁反应。本发明设计了一种DNA四面体介导的电化学生物传感器制备方法，该方法利用ATP适配体可以特异性结合ATP，将该适配体进行两段分配并分别设计到金基底电极的DNA四面体结构和3D石墨烯复合材料基底的DNA四面体结构上，利用静电吸附作用将亚甲基蓝MB作为电化学信号输出。主要机理如下：由于ATP及其适配体的特异性结合作用，将3D石墨烯复合材料拉近至金电极表面，由于3D石墨烯的巨大电子传输网络及多维空间结构，使得参与电子传输的材料比表面积增大，也使得电活性物质MB吸附量增加，同时多维空间结构能够增加电极表面液相环境的稳定性，致使电化学信号大幅度增加，类似于“蝴蝶效应”驱使的信号剧烈增强，相比于2D石墨烯材料的信号放大能力有较大的改善。本发明构建了一种基于“蝴蝶效应”的新型电化学方法以期实现三磷酸腺苷和碱性磷酸酶的分析监测，为心血管及骨骼疾病相关临床诊断及药物开发提供了一种新思路。到目前为止，还未见基于“蝴蝶效应”的新型电化学方法，也未见联合DNA纳米结构和3D石墨烯复合材料的新型电化学传感器用于三磷酸腺苷和碱性磷酸酶的分析监测。 发明内容[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于“蝴蝶效应”的电化学生物传感器制备方法及应用。 [0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于“蝴蝶效应”的电化学生物传感器制备方法及应用，具体步骤如下： [0007] (1)DNA四面体1和2的制备 [0008] 将1～5μL 20～70μM的Tetra‑A1、1～5μL 20～70μM Tetra‑B、1～5μL 20～70μM Tetra‑C和1～5μL 20～70μM Tetra‑D分别混合在2～7μL 20～70mM TCEP和20～50μL TM缓冲液(10～20mM Tris，10～50mM MgCl2，pH 7.0～8.0)中，得到总体积为10～100μL的溶液。随后溶液在80～105℃下反应1～10min，然后在1～60s内冷却到1～6℃。即可合成浓度为 0.1～3μM的DNA四面体1。之后，更改A1链为A2链，合成条件及步骤同上，合成四面体2。 [0009] (2)DNA四面体2@MB&3D‑GO‑AuNPs的合成 [0010] 通过一步自组装方法制备3D‑GO：将10～70mg L‑半胱氨酸和5～20mL 1～2.8mg ‑1mL 氧化石墨烯水分散液混合，通过超声形成悬浮液。随后，将混合物置于以聚四氟乙烯为内衬的高压釜中，在100～500℃下反应5～20h，然后冷却到室温。所得粗品加水洗涤三次后冷冻干燥即可得到3D氧化石墨烯。 [0011] 将1～3mg 3D GO加入到1～3mL HAuCl4(1～3mM)溶液中并搅拌10～20min，然后将300～500μL冰冷的NaBH4(0.005～0.02M)溶液缓慢滴加到混合物中并持续搅拌，直到溶液由浅黄色变为酒红色，超声分散2～5h，然后静置1～3h，得到3D GO‑AuNPs复合材料。之后，将DNA四面体2(2～5μM，2～20μL)加入到20～30μL的3D GO‑AuNPs溶液中，在35～37℃孵育2～4h，然后加入5～10μL浓度为1～5mM的MB，混匀0.4～1h，即可形成复合材料。 [0012] (3)电化学生物传感器的制备 [0013] a.将金电极(Au，直径为1～2mm)在麂皮上依次用粒径0.1～0.3μm、0.01～0.05μm的三氧化二铝粉末抛光0.5～5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用超纯水超声清洗1～5min，然后用N2吹干，记为电极1； [0014] b.取1～2.5μL 100～500nM DNA四面体1滴涂于Au表面，在室温下静置2～4h，使用超纯水缓缓冲洗电极(通过Au‑S键，在Au表面形成一层DNA四面体自组装单分子层从而固定了DNA四面体)，记为电极2。取1～2.5μL 10～100nM ATP滴涂于电极2，在30～37℃下孵育10～30min。蒸馏水缓缓冲洗电极。记为电极3。取1～3μL上述合成的复合材料DNA四面体2@MB&3D GO‑AuNPs滴涂于电极3表面，孵育10～30min，随后用蒸馏水缓缓冲洗电极，记为电极4。 [0015] (4)腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)及碱性磷酸酶(ALP)的分析检测 [0016] 基于以上(一)、(二)、(三)步骤，通过改变步骤(三)b中ATP浓度(终浓度：0.005～1000nM)，其它步骤不变，可实现对ATP的检测。 [0017] 基于以上(一)、(二)、(三)步骤，通过替换步骤(三)b中ATP为ALP反应液，其它步骤不变，可实现对ALP的检测。总体积为100μL的ALP反应液制备：含有ATP(终浓度：100nM)，ALP(终浓度：0～500U/L)和PBS(10mM，pH 7.0)，于37℃水浴锅中反应2h。 [0018] 其中所用到的DNA链如下： [0019] [0020] 利用上述基于“蝴蝶效应”的电化学生物传感器制备方法及应用，利用方波伏安法(Square Wave Voltammetry)，设置电位范围为‑0.5～0.1V，振幅为0.025V。利用所制备电化学传感器对亚甲基蓝(MB)的电化学响应，改变ATP的浓度或是在ATP条件下改变ALP浓度能够获得一系列不同浓度ATP(ALP)对应的电流大小，建立电流响应与ATP(ALP)之间的线性关系，根据两者之间的线性关系，确定待测样品中ATP(ALP)的含量。 [0021] 发明原理：本发明是基于“蝴蝶效应”的电化学生物传感器制备方法及应用，首先利用DNA四面体1中的巯基与Au相互作用形成Au‑S键将DNA四面体1固定到金电极表面，当在电极表面加入ATP后，通过ATP和适配体的特异性结合作用可以将DNA四面体2、金纳米粒子(AuNPs)、亚甲基蓝(MB)、3D石墨烯合成的复合材料拉到电极表面，采用亚甲基蓝(MB)作为信号输出，通过方波伏安法进行电化学检测。随后，利用ALP能够催化消耗ATP生成腺苷，该策略可用于实现ALP活性及其小分子抑制剂分析。基于此，构建了一种简单、稳定、快速、无标记、高灵敏度、高选择性的ATP(ALP)电化学分析方法。 [0022] 现有技术相比，本发明的优点在于：本发明基于“蝴蝶效应”的电化学生物传感器制备方法及应用，显然，在一定浓度范围内，ATP浓度越大，复合材料通过特异性结合作用吸附到电极表面越多，结合的信号分子越多，电流响应越明显；同理，ALP浓度越大，消耗ATP越多，电流响应越微弱。实验结果表明，电流的大小与ATP(ALP)的浓度在一定范围内呈现线性关系，成功实现对ATP(ALP)的检测。其优点在于： [0023] (1)优异的信号放大。2D石墨烯复合纳米材料在电极表面有着姣好的电子传输能力及法拉第笼效应，这在先前研究工作中已经证明。本专利所选用的3D石墨烯复合纳米材料不仅有着优秀的电子传输能力，还由于材料的多维空间结构，给电子传输提供了相对稳定的界面液相环境，导致电化学信号急剧增大，类似于“蝴蝶效应”。 [0024] (2)高灵敏度。本发明基于ATP与适配体的特异性结合作用以及ALP对ATP的催化分解作用，得到两条线性方程：电流响应对ATP浓度线性相关方程为y＝‑0.48lgCATP‑1.55，r＝0.9967，检测限为0.25pM；电流响应对ALP浓度线性相关方程为y＝0.49lgCALP‑1.33，r＝ 0.9994，检测限为0.21mU/L；说明该电化学传感器可对ATP(ALP)实现高灵敏度检测。 [0025] (3)高特异性。对ATP检测：其他对照物质如三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸尿苷(UTP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)对体系均无干扰。对ALP检测：其他对照物质如乙酰胆碱酯酶(AChE)、胆碱氧化酶(ChOx)、溶菌酶(LZM)、焦磷酸酶(PPase)、蛋白激酶(PKA)、木瓜蛋白酶(Papain)、尿嘧啶‑DNA糖基化酶(UDG)对体系均无干扰。 [0026] (4)结果准确。回收率均在90％～110％之间。 [0027] (5)制备与检测方法试剂用量少、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对ATP(ALP)的高灵敏检测。 [0028] 综上所述，本发明是基于“蝴蝶效应”的电化学生物传感器制备方法及在ATP及ALP分析传感中的应用，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现较低浓度ATP(ALP)的检测，具有良好的应用前景。附图说明 [0029] 图1为本发明传感器对电极层层修饰的实验图； [0030] 图2为本发明传感器对不同浓度ATP的电流响应对浓度的校准曲线图； [0031] 图3为本发明传感器对不同浓度ALP的电流响应对浓度的校准曲线图； [0032] 图4为本发明传感器对ATP(ALP)的特异性实验图。 具体实施方式[0033] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 [0034] 实施例1DNA四面体1和2的制备 [0035] 将2μL 50μM的Tetra‑A1、2μL 50μM Tetra‑B、2μL 50μM Tetra‑C和2μL 50μM Tetra‑D分别混合在5μL 30mM TCEP和37μL TM缓冲液(20mM Tris，50mM MgCl2，pH 8.0)中，得到总体积为50μL的溶液。随后溶液在95℃下反应5min，然后在30s内冷却到4℃。即可合成浓度为1μM的DNA四面体1。之后，更改A1链为A2链，合成条件及步骤同上，合成四面体2。 [0036] 实施例2DNA四面体2@MB&3D‑GO‑AuNPs的合成 [0037] 通过一步自组装方法制备3D‑GO：将50mg L‑半胱氨酸和10mL 1.8mg mL‑1氧化石墨烯水分散液混合，通过超声形成悬浮液。随后，将混合物置于以聚四氟乙烯为内衬的高压釜中，在200℃下反应12h，然后冷却到室温。所得粗品加水洗涤三次后冷冻干燥即可得到3D氧化石墨烯。 [0038] 将2mg 3D GO加入到2mL HAuCl4(1mM)溶液中并搅拌15min，然后将400μL冰冷的NaBH4(0.01M)溶液缓慢滴加到混合物中并持续搅拌，直到溶液由浅黄色变为酒红色，超声分散4h，然后静置2h，得到3D GO‑AuNPs复合材料。之后，将DNA四面体2(5μM，10μL)加入到30μL的3D GO‑AuNPs溶液中，在37℃孵育4h，然后加入10μL浓度为5mM的MB，混匀1h，即可形成复合材料。 [0039] 实施例3电化学生物传感器的制备 [0040] a.将金电极(Au，直径为2mm)在麂皮上依次用粒径0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末抛光5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用超纯水超声清洗5min，然后用N2吹干，记为电极1； [0041] b.取2.5μL 500nM DNA四面体1滴涂于Au表面，在室温下静置4h，使用超纯水缓缓冲洗电极(通过Au‑S键，在Au表面形成一层DNA四面体自组装单分子层从而固定了DNA四面体1)，记为电极2。取2.5μL 100nM ATP滴涂于电极2，在37℃下孵育30min。蒸馏水缓缓冲洗电极。记为电极3。取3μL上述合成的复合材料DNA四面体2@MB&3D GO‑AuNPs滴涂于电极3表面，孵育30min，随后用蒸馏水缓缓冲洗电极，记为电极4。 [0042] 如图1所示，随着DNA四面体、ATP、MB&3D GO‑AuNPs不断修饰在金电极表面，循环伏安曲线有明显的电流变化和电位变化：①随着DNA四面体1、ATP的引入，电流逐渐减少，电位差变大，可逆性变大，说明DNA四面体1、ATP已经成功引入；②随着DNA四面体2@MB&3D GO‑AuNPs的引入，电流变大，电位差变小，可逆性变小，说明DNA四面体2@MB&3D GO‑AuNPs已经成功引入；③对比DNA四面体2@MB&3D GO‑AuNPs和DNA四面体2@3D GO‑AuNPs两种复合材料，可以看出电活性物质MB对电流和电位差的影响较大。总之，从图1可以看出传感器已经成功制备。 [0043] 实施例4腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)及碱性磷酸酶(ALP)的分析检测 [0044] 基于实施例1‑3中步骤，通过改变实施例3b中ATP浓度(终浓度：0、0.001、0.003、0.005、0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、5.0、10、20、50、100、200、500、1000nM)，其它步骤不变，可实现对ATP的检测。 [0045] 基于以上(一)、(二)、(三)步骤，通过替换实施例3b中ATP为ALP反应液，其它步骤不变，可实现对ALP的检测。总体积为100μL的ALP反应液制备：含有ATP(终浓度：100nM)，ALP(终浓度：0、0.005、0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、300、400、500U/L)，和PBS(10mM，pH 7.0)，于37℃水浴锅中反应2h。 [0046] 结果如图2所示，随着ATP浓度的增加，电流强度不断增加，且传感器对ATP的电流响应与浓度呈良好的线性关系，传感器的电流响应对ATP浓度线性相关方程为y＝‑0.48lgCATP‑1.55，r＝0.9967，线性范围为0.005～200nM，检测限为0.25pM，说明传感器对ATP实现高灵敏检测；且为了对比，本专利用2D石墨烯替换3D石墨烯形成的复合材料，线性范围变得较窄，且检测限也变得较差。可见，本专利中3D石墨烯的优势(改进或放大电子传递)十分明显。 [0047] 此外如图3所示，随着ALP浓度的增加，电流强度不断减少，且电流响应对ALP浓度线性相关方程为y＝0.49lgCALP‑1.33，r＝0.9994，线性范围为0.005～300U/L，检测限为0.21mU/L，说明传感器ALP实现高灵敏检测；同时为了对比，本专利用2D石墨烯替换3D石墨烯形成的复合材料，线性范围变得较窄，且检测限也变得较差。可见，本专利中3D石墨烯的优势(改进或放大电子传递)十分明显。 [0048] 实施例5选择性实验 [0049] 如图4所示，对比于其他的小分子物质及蛋白酶物质，该传感器只对ATP或是ALP具有较好响应，具有较好的选择性。 [0050] 当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。 |
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