非天然氨基酸

                       技术领域

本发明涉及非天然脱氨烷基氨基酸(desamino，alkyl amino acid)、 制备它们的方法、它们在肽中的应用以及这些肽的治疗、诊断和筛选用 途。

                       背景技术

某些非天然氨基酸对肽的结构和生物活性的影响已得到初步研究。 例如Moore等人(Can.J.Biochem.1978，56，315)公开了碱性氨基酸侧链 长度和倒数第二位残基对羧肽酶(carboxylicpeptidase B1，CPB)水解 苯甲酰二肽(benzoyldipeptide)的影响。包括高赖氨酸(homolysine) 和高精氨酸在内的非天然氨基酸被掺入小的肽链中，并测定了CPB催 化肽水解的动力学参数。同时，Lindeberg等人(Int.J.Peptide Protein Res. 1977，10，240)公开了1-脱氨-4-L-缬氨酸-8-DL-高赖氨酸-血管加压素 (1-deamino-4-L-valine-8-DL-homolysine-vasopressin)和被保护的1-脱 氨-4-L-缬氨酸-8-D-赖氨酸-血管加压素的合成，其中掺入了非天然氨基 酸。通过将亚甲基加成到赖氨酸和精氨酸上以分别形成非天然氨基酸高 赖氨酸和高精氨酸，由此形成非天然氨基酸。该研究表明具有高赖氨酸 和高精氨酸的肽降低了肽的抗利尿活性。

由于天然存在的内源性肽促进和调节生物过程的多种活性，因此它 们是理想的候选药物先导物。但是，肽的化学和生物学固有属性也是使 得它们成为不佳的候选药物的几个因素。肽最通常发挥局部效应，并在 机体内迅速降解。另外，大部分肽不能穿过生物膜，包括小肠和血脑屏 障(blood brain barrier，BBB)。最后，肽通常结合一种以上的受体或 受体亚型，由此很少表现出成功候选药物所需要的选择性。因此，要使 肽成为成功候选药物，就应在血液稳定性、受体选择性以及屏障穿透性 上有所改进，同时不消除其固有的结合亲和力。

已开发了很多作为提高肽稳定性方法的策略，包括阻止外肽酶活性 的N端修饰和C端修饰、酰胺主链修饰和使肽掩藏而免于被肽酶降解 的构象限制的引入。其它治疗化合物使用旨在改变其整体疏水性的前药 部分，这使得化合物可穿过生物膜。在这种情况下，化合物被内源酶裂 解成活性组分。尽管这其中的每一策略均已用于改善作为候选药物的 肽，但是尚未发现形成稳定的、具有受体选择性的、可穿过生物屏障的 肽的全面解决方案。

因此，本领域需要非天然氨基酸和掺入这些非天然氨基酸的肽以获 得例如提高诊断或疾病对抗活性的优良效果。因此，非天然氨基酸的概 念可应用于新型肽类药物的开发中。这种开发的一个实例是将该概念应 用于神经肽例如神经降压肽上。

                        发明内容

除非上下文明确另外指出，否则说明书和所附权利要求书中所使用 的单数形式“一”“一个”和“该”包括复数指代对象。

除非另有指明，否则通篇申请中的变量例如R1-R3、n、z、X、Y、 Cα和Cβ与此处所定义的变量相同。

本申请所使用的术语“烷基”指具有1至24个碳原子的支链或直 链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔 丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十烷 基、二十四烷基等。本申请优选的烷基基团含有1至6个碳原子。

本申请所使用的术语“链烯基”指具有2至24个碳原子且结构式 含碳碳双键的烃基，在此类别中优选的基团含有2至6个碳原子。

本申请所使用的术语“炔基”指具有2至24个碳原子且结构式含 碳碳叁键的烃基，在此类别中优选的基团含有2至6个碳原子。

除非另有定义，本申请所使用的术语“低级”，尤其是指烷基、链 烯基和炔基时，指具有1至6个碳原子、优选具有1至4个碳原子、更 优选具有1至2个碳原子的部分。

本申请所提供的术语“烷化剂”为具有结构式RX的化合物，其中 R为上述烷基、链烯基或炔基基团，X优选为卤素例如氯、溴或碘。

本申请所使用的术语“非天然氨基酸”指为天然氨基酸的同源物的 有机化合物，这是由于它具有与天然氨基酸相似的结构，因此它可模拟 天然氨基酸的结构和反应性。非天然氨基酸取代肽的天然氨基酸单位或 通过其它方式掺入肽时，本申请所定义的非天然氨基酸一般会提高或增 强肽的性质(如选择性、稳定性)。

本申请所使用的术语“肽”指一类由化学键合在一起的氨基酸组成 的化合物。一般而言，氨基酸通过酰胺键(-CONH-)化学键合在一起； 但是氨基酸可通过本领域已知的其它化学键键合在一起。例如，氨基酸 可通过胺键键合。本申请所使用的肽包括氨基酸的低聚物以及小肽和大 肽，包括多肽。

本申请所使用的术语“活性”指生物活性。

本申请所使用的术语“药理活性”指肽或多肽的固有物理性质。这 些性质包括但不限于半衰期、溶解性和稳定性以及其它药物代谢动力学 性质。

本申请所使用的术语“有机酸盐”指胺基团与烷基或芳基C1-C9羧 酸、磺酸或磷酸的盐形式。

本申请所使用的术语“无机酸盐”指胺基团与无机酸例如盐酸、硫 酸、磺酸、磷酸、硝酸、亚硝酸或氢溴酸的盐形式。

本申请所使用的术语“C6至C18芳族”指例如苯基、萘基、蒽基 (anthracenyl)或者例如苯甲基、苯乙基或萘亚甲基 (naphthylmethylenyl)的芳烷烃。

本申请所使用的术语“C4至C18且一个或两个选自氧、硫和氮的杂 原子任意组合形式的杂芳族”指含有一个或两个杂原子的杂芳烃或烷基 杂芳烃例如噻吩基、呋喃基、吡咯基、氮杂噻吩基(azathienyl)、氮杂 呋喃基(azafuryl)、吡啶基(pyridinyl)、硫代吡啶基(thiapyridinyl)、 吡嗪基、亚甲基吡啶基(methylenylpyridinyl)、1，2-亚乙基吡啶基 (ethylenylpyridinyl)、亚甲基吡咯基(methylenylpyrrolyl)等。

本申请中所使用的化学术语、药物学术语和生物学术语沿用本领域 的技术人员例如博士研究员认为应该属于它们的常用含义和习惯含义。 这些含义可参见恰当的技术辞典和规定，例如但不限于“Hawley’s Condensed Chemical Dictionary”，11th Ed.，Sax and Lewis Editors，Van Nostrand Reinhold Publishing，New York，NY 1987；“Concise Chemical and Technical Dictionary”，4th enlarged Ed.Bennett Editor，Chemical Publishing Inc.，New York，NY，1986；“The Merck Index”11th and succeeding Editions，Merck & Co.Rahway，NJ 1989以及更近一些的 “Advanced Organic Chemistry”4th Ed.，J.March，Wiley Interscience， New York，NY 1992；“Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology”，Pei-Show Juo Ed.，CRC Press，New York，NY 1996；“Molecular Cell Biology”，Darnell，Lodish，Baltimore，Scientific American Books， New York，NY 1986，所有这些辞典和规定的公开通过援引纳入本文。

本发明涉及能携带带正电荷的侧链的α-脱氨α-烷基氨基酸化合物 (脱氨烷基氨基酸化合物)、其合成、其作为生物活性肽的天然氨基酸 部分的取代部分的应用和所得到的肽。具体而言，α-烷基α-脱氨精氨酸、 赖氨酸和鸟氨酸及其侧链被取代和衍生化的类似物构成了本发明的优 选实施方案。这些脱氨烷基氨基酸化合物可取代任何已知的、生物活性 肽的精氨酸和/或赖氨酸部分，因此被取代的肽可在取代位置被截短。 或者，这些脱氨烷基氨基酸化合物可偶联到任何已知的、生物活性肽的 N端氨基基团上以产生延长肽(extended peptide)。由于截短肽或延长 肽对氨肽酶降解的抗性，它们具有显著的生物学选择性和生物半衰期。

第一方面，本发明涉及具有式I的非天然脱氨烷基氨基酸化合物：

或其羧酸基团的酯、酰胺、烷基酰胺或金属阳离子盐或铵盐，或其 胺基的有机酸盐或无机酸盐，或其任意组合；

其中

n为0至5、优选2至5的整数；

m为零或整数1；

R为C1-C6直链或支链烷基基团，或C6-C18芳香基团或具有一个或 两个选自卤素、烷氧基、羧基、酰胺或烷基的取代基任意组合形式的相 应取代芳香基团，或C4-C18且一个或两个选自氧、硫和氮的杂原子任意 组合形式的杂芳基团或具有一个或两个选自卤素、烷氧基、羧基、酰胺 或烷基的取代基任意组合形式的相应取代杂芳基团；

R1、R2和R3可各自独立为氢，或C1-C6支链或直链烷基、链烯基 或炔基，或C6-C18芳香基团或具有一个或两个选自卤素、烷氧基、羧基、 酰胺或烷基的取代基任意组合形式的相应取代芳香基团，或C4-C18且一 个或两个选自氧、硫和氮的杂原子任意组合形式的杂芳基团或具有一个 或两个选自卤素、烷氧基、羧基、酰胺或烷基的取代基任意组合形式的 相应取代杂芳基团，前提是R1、R2和R3中可最多选择两个为芳香基团、 取代芳香基团、杂芳基团或取代杂芳基团；

Cα为具有R或S立体化学的碳原子。

第二方面，本发明涉及式II的非天然脱氨烷基氨基酸化合物：

或其羧酸基团的酯、酰胺、烷基酰胺或金属阳离子盐或铵盐，或其 胺基的有机酸盐或无机酸盐，或其任意组合；

其中

n为0至6、优选2至5的整数；

虚线a不存在时，X和Y各自独立为氢或C1-C6低级支链或直链烷 基、链烯基或炔基；

虚线a存在时，X-Y为(CH2)z，其中z为1至8、优选2至4的整 数；

R为C1-C6直链或支链烷基基团，或C6-C18芳香基团或具有一个或 两个选自卤素、烷氧基、羧基、酰胺或烷基的取代基任意组合形式的相 应取代芳香基团，或C4-C18且一个或两个选自氧、硫和氮的杂原子任意 组合形式的杂芳基团或具有一个或两个选自卤素、烷氧基、羧基、酰胺 或烷基的取代基任意组合形式的相应取代杂芳基团；

R4为氢或C1-C6低级支链或直链烷基、链烯基或炔基，或C6-C18 芳香基团或具有一个或两个选自卤素、烷氧基、羧基、酰胺或烷基的取 代基任意组合形式的相应取代芳香基团，或C4-C18和一个或两个选自 氧、硫和氮的杂原子任意组合形式的杂芳基团或具有一个或两个选自卤 素、烷氧基、羧基、酰胺或烷基的取代基任意组合形式的相应取代杂芳 基团；并且

Cα为碳原子，并且Cα的立体化学可为R或S。

本发明的第三方面涉及式III的非天然脱氨烷基氨基酸化合物：

或其羧酸基团的酯、酰胺、烷基酰胺或金属阳离子盐或铵盐，或其 胺基的有机酸盐或无机酸盐，或其任意组合，

其中

n为0至5、优选2至5的整数；

X-Y为(CH2)z，其中z为0至6、优选2至4的整数；

R为C1-C6直链或支链烷基基团，或C6-C18芳香基团或具有一个或 两个选自卤素、烷氧基、羧基、酰胺或烷基的取代基任意组合形式的相 应取代芳香基团，或C4-C18且一个或两个选自氧、硫和氮的杂原子任意 组合形式的杂芳基团或具有一个或两个选自卤素、烷氧基、羧基、酰胺 或烷基的取代基任意组合形式的相应取代杂芳基团；

R6和R7可各自独立为氢或C1-C6低级支链或直链烷基、链烯基或 炔基，或C6-C18芳香基团或具有一个或两个选自卤素、烷氧基、羧基、 酰胺或烷基的取代基任意组合形式的相应取代芳香基团，或C4-C18且一 个或两个选自氧、硫和氮的杂原子任意组合形式的杂芳基团或具有一个 或两个选自卤素、烷氧基、羧基、酰胺或烷基的取代基任意组合形式的 相应取代杂芳基团；并且

Cα为碳原子，并且Cα的立体化学可为R或S。

本发明的第四方面涉及式IV的非天然脱氨烷基氨基酸化合物：

或其羧酸基团的酯、酰胺、烷基酰胺或金属阳离子盐或铵盐，或其 胺基的有机酸盐或无机酸盐，或其任意组合；

其中

n为0至5、优选2至4的整数；

R为C1-C6直链或支链烷基基团，或C6-C18芳香基团或具有一个或 两个选自卤素、烷氧基、羧基、酰胺或烷基的取代基任意组合形式的相 应取代芳香基团，或C4-C18且一个或两个选自氧、硫和氮的杂原子任意 组合形式的杂芳基团或具有一个或两个选自卤素、烷氧基、羧基、酰胺 或烷基的取代基任意组合形式的相应取代杂芳基团；

R9、R10和R11可各自独立为氢或C1-C6低级支链或直链烷基、链烯 基或炔基，或C6-C18芳香基团或具有一个或两个选自卤素、烷氧基、羧 基、酰胺或烷基的取代基任意组合形式的相应取代芳香基团，或C4-C18 且一个或两个选自氧、硫和氮的杂原子任意组合形式的杂芳基团或具有 一个或两个选自卤素、烷氧基、羧基、酰胺或烷基的取代基任意组合形 式的相应取代杂芳基团，前提是R9、R10和R11中可最多选择两个为芳 香基团、取代芳香基团、杂芳基团或取代杂芳基团；并且

Cα为碳原子，并且Cα的立体化学可为R或S。

本发明另一方面涉及将本发明的非天然脱氨烷基氨基酸化合物添 加到生物活性肽的N端氨基基团，或它们取代生物活性肽的天然存在 的同源氨基酸部分。优选的同源部分包括精氨酸和/或赖氨酸。

添加到已知的生物活性肽的N端氨基基团可提供生物活性具有选 择性、持续时间长的与已知的生物活性肽同类型的延长肽。添加可通过 将酸和胺基团偶联在一起形成酰胺的已知方法完成，包括酰基叠氮偶 联、碳二亚胺偶联、酸性离子交换树脂、三氨基硼烷和酶偶联的使用。 优选的方法涉及在促进肽键形成的条件下使用氨基外肽酶。在本发明的 某些实施方案中，可通过用非天然氨基酸化合物取代NT(8-13)的N 端精氨酸残基产生例如ABS201的半合成肽。

延长肽的基础肽的优选实施方案包括可用于治疗或预防疾患 (malcondition)的生物活性肽。优选的种类和实例的列表包括在下文 中。一些优选的种类包括但不限于转录因子、细胞受体的配体、激素和 胞外结合肽。一些优选的实例包括但不限于脑啡肽(enkephlin)、LHRH 和类似物、神经肽、糖肠降血糖素(glycoincretin)、整联蛋白和类似物、 胰高血糖素和胰高血糖素样肽、抗凝血肽、细胞因子和白细胞介素、转 铁蛋白、干扰素、内皮缩血管肽、利尿钠激素、胞外激酶配体、血管紧 张素酶抑制剂、肽抗病毒化合物、凝血酶、P物质、G物质、促生长素、 促生长素抑制素、GnRH和类似物、促胰液素、缓激肽、血管加压素和 类似物、胰岛素及其类似物、生长因子等等。通过将基础肽的N端氨 基基团偶联到本发明的脱氨烷基氨基酸化合物的羧基基团上形成延长 肽。

用脱氨烷基氨基酸部分取代生物活性肽的精氨酸或赖氨酸部分可 提供生物活性具有选择性、持续时间长的截短肽。在其氨基酸序列中具 有精氨酸和/或赖氨酸部分的任何已知的生物活性肽可作为相应截短肽 的基础。从该ARG或LYS部分开始，截短肽具有与已知的生物活性肽 相同的下游序列，但是没有上游序列。另外，该ARG或LYS部分可换 成脱氨烷基氨基酸部分，由此提供截短肽。几种已知的生物活性肽可为 倒数第二步形成的在前肽或前体裂解位置具有精氨酸或赖氨酸部分的 前肽形式，或者为形成的在可裂解而提供活性截短肽的位置含有精氨酸 或赖氨酸部分的最终肽形式。胰蛋白酶是专门针对这类裂解位点的酶。 实例包括胰高血糖素样肽、神经降压肽、胰岛素原和凝血酶。用脱氨烷 基氨基酸化合物取代精氨酸或赖氨酸部分的这些实例的截短形式可提 供具有选择性的、持续时间长的生物活性。

本发明另一方面包括脱氨烷基氨基酸化合物的药物组合物和美容 组合物、延长肽或截短肽的药物组合物和美容组合物，及其组合。包括 药物组合物的单位剂型和生物有效制剂。美容制剂包括恰当的油、霜、 蜡或水性基质美容载体。

本发明另一方面包括使用本发明的脱氨烷基氨基酸化合物和/或加 长或截短肽来筛选、诊断和治疗的方法。

本发明的一个实施方案为脱氨烷基氨基酸作为N端氨基酸部分的 截短神经降压肽。

本发明还提供了本申请所公开的可用于制备例如式I、II、III和/ 或IV化合物的本发明化合物以及含有这些化合物的肽的方法和中间 体。这其中的一类中间体包括式I、II、III和IV的N-被保护或羧基被 保护或N-和羧基均被保护的化合物。这些被保护的中间体将在本申请 的以下部分中详细描述。这其中的另一类中间体包括式I、II、III和IV 化合物的羧酸盐、这些化合物的有机酸胺盐或无机酸胺盐和复盐(羧酸 盐、胺盐)。

                     附图说明

图1NT(8-13)、ABS201和肽30的结构比较。

图2式I-IV的化合物的代表性实例。

图3A-3C式I-IV的化合物的合成方案。

图4ω-溴-2(S)-甲酸的不对称合成。

图5亚乙基桥连的(Nδ至Nω)精氨酸类似物的合成。

图6环状的和非环状的烷基精氨酸类似物的合成。

图7本发明的代表性肽的肽合成。

图8A-8Cα-甲基NT(8-13)类似物所引起的低体温的比较。

图9IP(实心符号)和口服给药(空心符号)后ABS201的低体 温效应。

图10A-10BIP和口服给予KH29(10A)和KH30(10B)后低体 温效应的比较。

图11A-11BIP给药后ABS201的剂量-反应曲线。

图12口服给药后，对ABS201的剂量依赖性低体温反应。

图13IP给予ABS201后d-苯异丙胺所引起的过兴奋的衰减。

图14口服给予ABS201后d-苯异丙胺所引起的过兴奋的衰减。

图15ABS201和氟哌啶醇(haloperidol)对僵住状的影响。

图16每天给予5mg/kg ABS201后，长期给予ABS201的低体温 效应。

图17每天给予5mg/kg ABS201后，每天重复给予ABS201对d- 苯异丙胺所引起的过度运动(hyperlocomotion)的影响。

图18Fmoc-脯氨酸-OH*的合成。

                     具体实施方式

本发明涉及某些脱氨烷基氨基酸化合物、其作为添加物或同源物在 已知的生物活性肽中的掺入、以及该化合物和肽在医学诊断、治疗和筛 选中的用途。本发明的几个方面涉及该烷基脱氨氨基酸化合物对天然氨 基酸精氨酸和/或赖氨酸的模拟。通过将其用作已知的生物活性肽中这 些天然氨基酸部分的同源物，可制备这些肽的截短形式，其中其生物活 性比已知肽的生物活性更具有选择性并且持续时间更长。通过将其用作 添加物，其作为已知的生物活性肽的N端部分加合物的位置也可提供 比已知肽的生物活性持续时间更长的生物活性。

本发明的脱氨烷基氨基酸化合物用于截短肽的一个实例为神经降 压肽。神经降压肽(neurotensin，NT)是具有神经学性质的13个氨基 酸肽。产生截短神经降压肽(8-13)的AA7处的裂解可提供具有选择 性的生物活性的肽。根据本发明，将AA8精氨酸转化为脱氨烷基氨基 酸化合物部分同样可产生具有显著的和选择性的生物活性的肽。NT和 该转化形式的实例在图1中示出。

本发明的生物活性肽具有脱氨烷基氨基酸部分作为其N端部分。 这些肽具有生物活性氨基酸的已知氨基酸序列，其中所述脱氨烷基氨基 酸既可通过酰胺键与已知肽的N端氨基共价偶联(延长肽)，也可取代 肽中其相应同源部分(类似的天然氨基酸部分)(截短形式)。在另一种 情况下，该肽在取代位置被截短使得该脱氨烷基氨基酸部分成为新的N 端，而该位置上游的氨基酸残基不再是该序列的一部分(截短肽)。延 长肽和截短肽在体内具有更长的寿命，并且具有与那些天然肽类似的生 物活性，所不同的是该活性更具有选择性。

本发明的脱氨烷基氨基酸化合物的一方面由上述式I提供。式I的 优选实施方案包括这样一些化合物，其中

R1、R2和R3可各自独立为氢或C1-C5低级支链或直链烷基，更优 选为氢或甲基。在另一个实施方案中，n为4。在又一实施方案中，R 为甲基、乙基或丙基。其它优选的实施方案包括那些其中R为甲基、 乙基、丙基或丁基的化合物，并且：

a)n为4，m为0，R1为氢，R2为甲基，式I的化合物为酸，并且Cα 的立体化学为R或S；

b)n为4，m为1，R1和R2为甲基，R3为氢或甲基，式I的化合物为 酸，Cα的立体化学为R或S；

c)n为4，m为1，R1为甲基，R2和R3为氢，式I的化合物为酸，Cα 的立体化学为R或S；

d)n为4，m为1，R1、R2和R3为氢，式I的化合物为酸，并且Cα 的立体化学为R或S；

e)n为3，m为0，R1和R2为甲基，式I的化合物为酸，Cα的立体化 学为R或S；

f)n为3，m为0，R1和R2为乙基，式I的化合物为酸，Cα的立体 化学为R或S；

g)n为3，m为0，R1和R2为丙基，式I的化合物为酸，Cα的立体化 学为R或S；

h)n为3，m为0，R1和R2为丁基，式I的化合物为酸，Cα的立体化 学为R或S；

i)n为2，m为0，R1和R2为甲基，式I的化合物为酸，Cα的立体 化学为R或S；

j)n为2，m为0，R1和R2为乙基，式I的化合物为酸，Cα的立体化 学为R或S；

k)n为2，m为0，R1和R2为丙基，式I的化合物为酸，Cα的立体化 学为R或；

l)n为2，m为0，R1和R2为丁基，式I的化合物为酸，Cα的立体化 学为R或S。

优选的还有任一上述优选实施方案a-l的酯或盐。

本发明的脱氨烷基氨基酸化合物的另一方面由上述式II阐述。式II 的优选实施方案包括那些其中n为3时虚线a不存在的化合物。其它优选 实施方案包括那些其中X为氢、并且其中Y和R4为相同低级支链或直链 烷基的化合物。在又一优选的实施方案中，R4和R5各自独立为氢或甲基。 在另一个优选的实施方案中，虚线a不存在，X为氢或C1-C5低级支链或 直链烷基、优选甲基或乙基，并且Y为氢或C1-C5低级支链或直链烷基、 优选甲基，或者虚线a存在，z为2，并且优选n为3。其它优选实施方案 包括那些其中R为甲基、乙基、丙基或丁基的化合物，并且：

a)n为3，虚线a不存在，式II的化合物为酸，R4为氢，X为氢、Y 为甲基，并且Cα的立体化学为R或S；

b)n为3，虚线a不存在，式II的化合物为酸，R4为甲基，X为氢、 Y为甲基，并且Cα的立体化学为R或S；

c)n为3，虚线a存在，式II的化合物为酸，z为2，R4为氢，并且Cα 的立体化学为R或S；

d)n为3，虚线a存在，式II的化合物为酸，z为2，R4为甲基，并且 Cα的立体化学为R或S；

e)n为3，虚线a不存在，式II的化合物为酸，R4为氢，X为甲基， Y为氢，并且Cα的立体化学为R或S；

f)n为3，虚线a不存在，式II的化合物为酸，R4为氢，X为乙 基，Y为氢，并且Cα的立体化学为R或S；

g)n为2，虚线a不存在，式II的化合物为酸，R4为氢，X为氢、Y 为甲基，并且Cα的立体化学为R或S；

h)n为2，虚线a不存在，式II的化合物为酸，R4为甲基，X为氢、 Y为丙基，并且Cα的立体化学为R或S；

i)n为4，虚线a存在，式II的化合物为酸，z为2，R4为氢，并且Cα 的立体化学为R或S；

j)n为3，虚线a存在，式II的化合物为酸，z为2，R4为甲基，并且 Cα的立体化学为R或S；

k)n为2，虚线a存在，式II的化合物为酸，z为3，R4为甲基，并且 Cα的立体化学为R或S；

l)n为3，虚线a不存在，式II的化合物为酸，R4为甲基，X为氢，Y 为乙基，并且Cα的立体化学为R或S。

优选的还有任一上述优选实施方案a-l的酯或盐。

本发明的脱氨烷基氨基酸化合物的第三方面由式III阐述。式III的 优选实施方案包括那些其中R6和R7各自独立为氢或C1-C5低级烷基或直 链烷基、优选氢或甲基，更优选均为氢的化合物。在另一实施方案中， z为2或3，优选3。在优选的实施方案中，n为3。其它优选实施方案包括 那些其中R为甲基、乙基、丙基或丁基的化合物，并且：

a)n为3，z为2，R6和R7为氢，式III的化合物为酸，并且Cα的立体 化学为R或S；

b)n为3，z为3，R6和R7为氢，式III的化合物为酸，并且Cα的立体 化学为R或S；

c)n为2，z为2，R6和R7为氢，式III的化合物为酸，并且Cα的立体 化学为R或S；

d)n为4，z为2，R6和R7为氢，式III的化合物为酸，并且Cα的立体 化学为R或S；

e)n为2，z为3，R6和R7为氢，式III的化合物为酸，并且Cα的立体 化学为R或S；

f)n为4，z为3，R6和R7为氢，式III的化合物为酸，并且Cα的立体 化学为R或S；

g)n为2，z为2，R6和R7为甲基，式III的化合物为酸，并且Cα的立 体化学为R或S；

h)n为4，z为2，R6和R7为甲基，式III的化合物为酸，并且Cα的立 体化学为R或S；

i)n为2，z为3，R6和R7为甲基，式III的化合物为酸，并且Cα的立 体化学为R或S；

j)n为4，z为3，R6和R7为甲基，式III的化合物为酸，并且Cα的立 体化学为R或S。

优选的还有任一上述优选实施方案a-j的酯或盐。

本发明的第四方面由式IV的脱氨烷基氨基酸化合物提供。式IV的 化合物的优选实施方案包括那些其中R9、R10和R11各自独立为氢或C1-C5 低级直链或支链烷基，优选氢、甲基或乙基的化合物。在另一实施方案 中，R10为甲基。在又一个优选的实施方案中，R9为氢、R10为甲基，R12 为氢，并且n为3。其它优选实施方案包括那些其中R为甲基、乙基、丙 基或丁基的化合物，并且：

a)n为3，R9和R11为氢，R10为甲基，式IV的化合物为酸，并且Cα 的立体化学为R或S；

b)n为3，R9为氢，R10和R11为甲基，式IV的化合物为酸，并且Cα 的立体化学为R或S；

c)n为3，R9为氢，R10为甲基，R11为乙基，式IV的化合物为酸， 并且Cα的立体化学为R或S；

d)n为2，R9和R11为氢，R10为甲基，式IV的化合物为酸，并且Cα 的立体化学为R或S；

e)n为2，R9为氢，R10和R11为甲基，式IV的化合物为酸，并且Cα 的立体化学为R或S；

f)n为4，R9为氢，R10为甲基，R11为乙基，式IV的化合物为酸， 并且Cα的立体化学为R或S。

优选的还有任一上述优选实施方案a-f的酯或盐。

本发明的特别优选的非天然脱氨烷基氨基酸化合物包括在图2中所 提供的化学式，其中R为甲基或乙基。

本发明的某些实施方案提供了本发明的被保护的中间体和被保护 的非天然氨基酸。某些实施方案提供了本发明的被保护的中间体和被保 护的非天然氨基酸，其中侧链胺基团被保护基团保护，该保护基团可阻 止该氨基基团的不良反应，并且它可通过也不同时引起酰胺基团裂解的 化学方法除去。某些实施方案提供了本发明的被保护的中间体和被保护 的非天然氨基酸，其中侧链羧基基团被保护基团保护，该保护基团可阻 止该羧基基团的不良反应，并且它可通过也不同时引起羧基基团裂解的 化学方法除去。在某些实施方案中，该保护基团为叔丁氧羰基(BOC) 或芴甲氧羰基(FMOC)。在某些实施方案中，该保护基团为BOC、 FMOC、Alloc(烯丙氧羰基)、CBZ(苯甲氧羰基)、Pbf(2，2，4，6，7-五 甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、NO2(硝基)、Pmc(2，2，5，7，8-五甲基苯 并二氢吡喃-6-磺酰基)、Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)或Tos (甲苯磺酰基)。

在一个实施方案中，式I-IV的非天然脱氨烷基氨基酸的结构与天然 存在的氨基酸赖氨酸、精氨酸以及天然存在的谷氨酰胺生物合成中间体 ——鸟氨酸的结构相似。在优选的实施方案中，本发明的化合物不同于 相应的天然氨基酸，尤其由于在(i)羧基端(它与肽中相邻氨基酸单 位形成N端键)、(ii)取代α氨基基团的烷基基团和(iii)取代胺侧链的 有机基团之间较长或较短的亚甲基桥。优选地，本发明的伸展桥 (extended bridge)比天然氨基酸桥多一个碳或少一个碳(即增碳形式 或减碳形式)。在其它优选的实施方案中，本发明的化合物与相似天然 氨基酸相比尤其具有较长的、较短的或者等长的亚甲基桥，并且在多个 部分有取代，形成不同部分，或将部分连接形成环结构。

本发明的每一种化合物均可制备成酸、酰胺、盐或酯。在水中，本 发明的非天然氨基酸将会带电荷；但是，在细胞的细胞膜和其它非极性 区域，该非天然氨基酸可不带电荷。在一个实施方案中，本发明的非天 然氨基酸的酯基团为甲基、乙基、叔丁基、苯甲基或烯丙基。在另一实 施方案中，非天然氨基酸的盐的反荷离子为钠、钾、胺和四烷基铵。

本发明的一些实施方案提供了含有本发明的非天然氨基酸化合物 的半合成肽。在一些实施方案中，该半合成肽含有非天然氨基酸化合物 作为其N端部分。在一些实施方案中，该半合成肽含有非天然氨基酸化 合物作为半合成神经降压肽(8-13)的N端部分。在一个实施方案中， 该半合成肽为ABS201。在一些实施方案中，与不包含取代的非天然氨 基酸化合物作为其N端部分、序列与所述半合成肽相同的肽相比，所述 半合成肽在体内具有更长的半衰期。

本发明的某些实施方案提供了含有本发明的肽和药物载体的药物 组合物。在某些实施方案中，该肽以单位剂型存在。

本发明的某些实施方案提供了含有本发明的非天然氨基酸化合物 和美容基质制剂的美容制剂。本发明的某些实施方案提供了含有本发明 的半合成肽和美容基质制剂的美容制剂。在某些实施方案中，该美容基 质制剂为水性基质或油性基质。

本发明的某些实施方案提供了用于医学治疗的本发明的非天然氨 基酸化合物。

本发明的某些实施方案提供了本发明的非天然氨基酸在制备用于 治疗哺乳动物的精神病的药剂中的用途。本发明的某些实施方案提供了 本发明的半合成肽在制备用于治疗哺乳动物的精神病的药剂中的用途。 在某些实施方案中，该精神病是精神分裂症。

本发明的某些实施方案提供了本发明的化合物在制备用于治疗哺 乳动物的癌症的药剂中的用途。

本发明的某些实施方案提供了本发明的化合物在制备用于治疗哺 乳动物的疼痛的药剂中的用途。

本发明的某些实施方案提供了用于医学治疗的本发明的半合成肽。

本发明的某些实施方案提供了一种降低患者体温的方法，包括给予 患者有效量的本发明的半合成肽以降低该患者的体温。

本发明的某些实施方案提供了一种降低患者体温的方法，包括给予 患者有效量的本发明的组合物以降低该患者的体温。

本发明的某些实施方案提供了一种治疗患精神病的患者的方法，包 括给予患者有效量的本发明的肽以治疗精神病。

本发明的某些实施方案提供了一种治疗患精神病的患者的方法，包 括给予患者有效量的本发明的组合物以治疗精神病。

本发明的某些实施方案提供了一种治疗癌症的方法，包括给予患者 有效量的本发明的任一肽以治疗癌症。

本发明的某些实施方案提供了一种治疗癌症的方法，包括给予患者 有效量的本发明的组合物以治疗癌症。

本发明的某些实施方案提供了一种治疗疼痛的方法，包括给予患者 有效量的本发明的肽以治疗疼痛。

本发明的某些实施方案提供了一种治疗疼痛的方法，包括给予患者 有效量的本发明的组合物以治疗疼痛。

本发明的某些实施方案提供了一种就某种活性筛选含有非天然氨 基酸化合物的肽的方法，包括如下步骤：a)测量具有已知氨基酸序列 的第一种肽的生物活性；以及b)测量本发明的任何一种半合成肽的相 同生物活性，其中，所述半合成肽具有除非天然氨基酸化合物外与所述 第一种肽相同的序列，或为除非天然氨基酸化合物外的所述第一种肽的 截短形式。在本发明的某些实施方案中，该生物活性为细胞凋亡 (poptosis)、程序性细胞死亡(apoptosis)、细胞信号传导、配体结合、 转录、翻译、代谢、细胞生长、细胞分化、稳态、半衰期、溶解性或稳 定性。在本发明的某些实施方案中，该生物活性包括对该半合成肽穿过 生物屏障的能力的直接或间接评估。在本发明的某些实施方案中，该生 物学活性为选择性。

本发明的某些实施方案提供了一种治疗由给予患者已知的第一种 肽而致病的患者的方法，包括给予所述患者本发明的半合成肽，其中， 所述半合成肽具有除非天然氨基酸化合物外与所述第一种肽相同的序 列，或为除非天然氨基酸化合物外的所述第一种肽的截短形式。

本发明的某些实施方案提供了一种提高已知的第一种肽穿过受试 者的生物屏障的能力的方法，包括置换为本发明的半合成肽，其中，所 述半合成肽具有除非天然氨基酸化合物外与所述第一种肽相同的序列， 或为除非天然氨基酸化合物外的所述第一种肽的截短形式。在某些实施 方案中，该屏障包括血脑屏障、细胞膜、肠上皮、皮肤或血眼屏障。

本发明的某些实施方案提供了一种提高已知肽的选择性的方法，包 括将所述已知肽置换为本发明的半合成肽，其中，所述半合成肽具有除 非天然氨基酸化合物外与所述第一种肽相同的序列，或为除非天然氨基 酸化合物外的所述第一种肽的截短形式。

本发明的某些实施方案提供了一种提高已知肽抵抗肽酶消化的能 力的方法，包括将所述已知肽置换为本发明的半合成肽，其中，所述半 合成肽具有除非天然氨基酸化合物外与所述第一种肽相同的序列，或为 除非天然氨基酸化合物外的所述第一种肽的截短形式。

本发明的某些实施方案提供了一种治疗由给予患者已知的、穿过机 体屏障的第一种肽而致病的患者的方法，包括给予所述患者本发明的半 合成肽，其中，所述半合成肽具有除非天然氨基酸化合物外与所述第一 种肽相同的序列，或为除非天然氨基酸化合物外的所述第一种肽的截短 形式。

本发明的某些实施方案提供了一种治疗由给予该患者已知的第一 种肽而导致脑病的患者的方法，包括给予所述患者本发明的任一种半合 成肽，其中，所述半合成肽具有除非天然氨基酸化合物外与所述第一种 肽相同的序列，或为除非天然氨基酸化合物外的所述第一种肽的截短形 式。

本发明的某些实施方案提供了一种制备在体内具有更长半衰期的 半合成肽的方法，包括将已知肽置换为本发明的半合成肽，其中，所述 半合成肽具有除非天然氨基酸化合物外与所述第一种肽相同的序列，或 为除非天然氨基酸化合物外的所述第一种肽的截短形式。

除非另外指出，本申请所使用的化合物名称ABS201、ABS48、KH48 和肽28表示相同的化合物。

脱氨烷基氨基酸化合物的制备

本发明的脱氨烷基氨基酸化合物的制备按照图3所示出的总体合成 方案进行。本方法的第一步为生成亚甲基单位链长对应式I至IV的n的α 烷基ω卤素羧酸。在下文的详细描述和图3中，该中间体被称为化合物 27。生成化合物27后，其ω卤素基团可易被过量亲核试剂取代以产生式 I-IV的脱氨烷基氨基酸化合物。

一般而言，生成化合物27的反应条件包括通过形成酰基噁唑酮对 ω羧酸的羧基进行保护。该酰基噁唑酮被转化为烯醇化物，该烯醇化物 与烷化剂例如烷基碘化物或烷基甲磺酰化物(alkyl mesylate)化合以形 成化合物27。使用远远过量的烷化剂和较长反应时间可显著提高化合 物27的收率。

如图3的合成方案所示，通过合适的侧链部分与化合物25的ω卤素 基团偶联可将α烷基ω卤素羧酸化合物25转化成任何一种侧链修饰物。 还优选采用对羧基的恰当保护。这些反应条件以及恰当的烷化剂和取代 剂遵循《高级有机化学》(“Advanced Organic Chemistry”，4th Edition， J.March，Wiley InterScience，New York，N.Y.1992)中所阐述的教导， 其全部公开通过援引纳入本申请。

具体而言，为制备式I的化合物(参见图3和4的合成方案)，ω卤素 羧酸化合物27可与恰当的胺亲核体(amine nucleophile)例如氨、伯胺 和仲胺化合。胺亲核体的化学式对应式I的侧链部分。反应条件遵循适 合胺亲核取代的反应条件，这些反应条件在上文引用的《高级有机化学》 中被公开，并如完全重复那样纳入本申请。这些化合物可直接用于下文 的肽合成，前提是侧链胺基团被恰当保护或以其它方式抑制了羧基缩 合。

同样，为制备式II的化合物(参见图3和5的合成方案)，ω卤素化合 物27首先在羧基位置受到保护，然后相继与二胺和溴化氰反应。脱保护 和纯化后获得式II的脱氨烷基氨基酸化合物。这些化合物可直接用于具 有恰当侧链保护的肽合成中。

式III和IV的化合物(参见图3和6的合成方案)也可通过将侧链部 分加成到ω卤素羧酸化合物27制备得到。在这种情况下，不必对羧基进 行保护。恰当的硫脲化合物的制备可通过将烷化剂例如烷基、链烯基或 炔基卤化物加成到硫脲、N-取代硫脲或N，N-二取代硫脲(市售)完成。 碱性条件下，所得到的恰当硫脲化合物在化合物27的ω卤素位置的亲核 取代提供了式IV的脱氨烷基氨基酸化合物。同样，碱性条件下，将恰当 的环状硫脲化合物加成到ω卤素化合物27提供了式III的脱氨烷基氨基 酸化合物。恰当的环状硫脲化合物可通过将烷化剂如烷基、烯链基或炔 基卤化物与相应未取代的、N-取代的或N，N-二取代的环状重氮硫酮 (diazathione)(市售)化合制备得到。反应粗产物可通过已知方法如 离子交换色谱法纯化，以得到式III和IV的烷基脱氨氨基酸化合物，它 们可直接用于具有恰当侧链保护的肽合成中。

在式I-IV的化合物用于肽合成前，其侧链既可被恰当保护，也可 确定被完全抑制使得它们不进行肽缩合反应。例如，如果式I的化合物 的侧链为伯胺基团，那么可根据肽合成相关领域的教导将它恰当保护。 参见例如在《有机合成方法汇编》(“Compendium of Organic Synthetic Methods，”I&S Harrison，Wiley Interscience，New York，NY，1971)中所 提供的胺保护基团的综述，其公开通过援引纳入本文。在这些实例中， 恰当的保护基团可为首字母缩写为BOC的叔丁氧羰基或首字母缩写为 FMOC的芴甲氧羰基。该BOC和FMOC保护基团可通过分别用酸例 如三氟乙酸水溶液和碱例如哌啶进行温和处理除去。

或者，ω卤素羧酸化合物27与次末肽(penultimate peptide)偶联 以在次末肽的N端形成ω卤素酰基部分。因为该ω卤素羧酸化合物27 在其侧链上不含氨基部分，所以可不太考虑保护和假肽形成。在此备选 方案中，氨基部分可与上述酰化的次末肽的ω卤素基团进行亲核反应， 以形成式I-IV的化合物。得到在其N端具有式I-IV的化合物的残基的 所需肽。在此备选方案中，可采用对羧基和氨基侧链的恰当保护和C 端的恰当保护以防止这些基团不合需要的反应。

肽合成和纯化

本发明包括截短肽和延长肽，它们含有式I、II、III或IV的化合物 的残基作为N端部分。这些肽可通过Merrifield固相法合成，对本领域的 技术人员而言，该方法为制备肽的完善的方法。参见R.B.Merrifield， Science，232，341-347(1986)，其公开通过援引纳入本申请，用以对 Merrifield固相肽合成进行解释并对其条件进行规定。此外，去N端氨基 酸单位的肽、或次末肽可通过已知生物学方法重组表达，并且可使用氨 肽酶通过酶缩合将式I-IV的脱氨烷基氨基酸化合物加成作N端。参见《酶 结构和机制》(“Enzyme Structure and Mechanism，”Alan Fersht，W.H. Freeman，New York，NY(1985))，其公开通过援引纳入本申请，用以对 肽的重组表达进行解释并对其条件进行规定。可用标准保护基团对式 I-IV的化合物在侧链氨基基团进行恰当保护。在优选的实施方案中，保 护基团为BOC和/或FMOC。

简而言之，对固相合成而言，可大批量生产次末肽，然后使用 Merrifield固相合成的保护和偶联技术将其偶联到式I-IV的任一种化合 物上。首先用被设计用于暴露氨基基团的恰当锚定树脂(anchor resin) 使具有例如FMOC基团的氨基保护基团的肽的羧基端氨基酸单位通过 可选择性断裂的羧基偶联的连接(link)锚定到该树脂上。然后将被锚 定的羧基端单位的氨基基团脱保护，然后其它的氨基被保护的氨基酸单 位以固有顺序依次被偶联。每一个偶联步骤均包括锚定肽链的被保护的 氨基基团的脱保护以及随后该未保护氨基基团和下一个氨基酸单位的 羧基基团之间的肽缩合。该缩合可通过碳二亚胺偶联、通过Schotten Bauman反应或通过活化酰基基团缩合轻易实现。这些缩合反应描述于 上文所引用的《高级有机化学》中。使用恰当的保护基团对胺和羧基侧 链的保护将使相继的氨基酸单位的选择性肽缩合成为可能，该保护基团 不同于进行肽缩合的α氨基基团的保护基团。恰当保护基团的选择和固 相肽合成的条件在上文引用的Merrifield参考文献中得以描述。

次末肽也可通过重组表达产生。该生物学方法涉及对微生物重新的 遗传工程改造以表达次末肽。编码次末肽序列的DNA区段可以正确的解 读形式插入能引起DNA的微生物表达的质粒或其它载体中。该载体还含 有恰当的控制DNA区段、启动子DNA区段和选择DNA区段。在插入微 生物例如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilus)后，可通过 用相应的选择试剂的处理对微生物混合物选择以得到恰当转染的微生 物。一般而言，该试剂为抗生素，并且该载体含有编码该抗生素相应解 毒酶的序列。氯霉素(Chloramphenacol)和青霉素为这其中的两种试 剂。培养该转染微生物，收获培养基中分泌物质形式的或通过裂解微生 物细胞形式的表达的肽，得到粗制次末肽。可通过已知技术例如冻干法、 色谱法等纯化次末肽。这些用于肽表达的重组技术在《冷泉港—分子生 物学的现有方法》(“Cold Spring Harbor-Current Protocols in Molecular Biology，”Wiley Interscience，Cold Spring Harbor(2003))中得 以完整阐述，其公开通过援引纳入本申请。

固相肽生产的实例通过对一组神经降压肽(8-13)化合物(NT肽) 的改进得以提供。这些化合物掺入了作为其N端的式I-IV的脱氨烷基氨 基酸化合物。它们为一类新型抗精神病药物，其生物学研究和背景在本 申请的下文中得以描述。

NT肽合成—概述

可使用对烷氧基苯甲醇固相法(65)大量合成肽NT(9-13)的次末 序列，并以完全保护形式将其储存。

原材料：对烷氧基苯甲醇树脂结合的Nα-Fmoc-亮氨酸、Nα-Fmoc- 异亮氨酸、Nα-Fmoc-叔亮氨酸、Nα-Fmoc-(But)-酪氨酸、Nα-Fmoc-(Boc)- 色氨酸、Nα-Fmoc-脯氨酸和Nα-Fmoc-(Pbf)-精氨酸购自Advanced Chemtech(Louisville，KY)。PyBOP购自Novabiochem(San Diego，CA)。 N-羟基苯并三唑(N-hydroxybenzoriazole，HOBt)、无水N，N-二甲基甲 酰胺(DMF)、N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三异丙基硅烷(TIS)和四氟 乙酸(TFA)购自Aldrich(Milwaukee，WI)。使用制备的非天然氨基酸类 似物。缩写：Fmoc，芴甲氧羰基；NH3，氨；NH2CH3，甲胺；NH(CH3)2， 二甲胺；N(CH3)3，三甲胺；EtOH，乙醇。

简而言之，树脂结合的Nα-Fmoc-亮氨酸可在DMF中溶胀，然后用哌 啶(20％，溶于DMF)进行Fmoc裂解。可真空过滤除去哌啶溶液，并用 DMF和CH2Cl2洗涤树脂结合的氨基酸。氨基酸(4eq)可在DMF中用 HOBt(4eq)、PyBOP(4eq)和DIPEA(10eq)活化，并直接加入肽反应容器 中。该氨基酸偶联可进行约6小时，用DMF和CH2Cl2洗涤树脂，并用Kaiser 测试(66)对游离胺存在与否进行监测。必要时可对残基进行重偶联。

可用随后的氨基酸重复该操作以获得次末肽序列。然后，树脂结合 的五聚体的整分试样可如上文所述与式I-IV的化合物偶联，以产生所需 肽。可用含有恰当清除剂的TFA溶液进行酸催化脱保护，粗制肽可在用 冰预冷的乙醚中沉淀。

肽纯化—概述

可使用反相高压液相色谱法纯化上述粗制肽。例如，可将Waters 双泵系统与Waters C18径向压缩柱联合用于此目的。可通过280nm的 UV吸光度对洗脱液进行监测。

含非天然氨基酸的肽的筛选

本发明提供了一种就其活性或者药理活性筛选肽的方法。该方法包 括如下步骤：a)测量具有所选择的天然氨基酸序列的肽的活性或药理 活性，并b)测量延长肽或截短肽的相同的活性或药理活性，该延长肽 或截短肽以与上述肽相同的氨基酸序列为基础，其中N端为具有上述式 I-IV的非天然氨基酸；并c)比较由步骤a)和b)测量得到的肽的活性 或药理活性以确定步骤b)的肽是否具有所需活性或药理活性。

本发明筛选所依据的活性包括任何与生物活性肽或拟肽 (peptidomimetic)相关的活性。下面为可在本筛选方法中确定的多种 活性的部分列表：

1.受体激动剂/拮抗剂活性：测量这些活性的具体筛选的实例汇总 可参见“The RBI Handbook of Receptor Classification and Signal Transduction”，K.J.Watling，J.W.Kebebian，J.L.Neumeyer，eds. Research Biochemicals International，Natick，MA，1995以及其中的参考 文献。分析方法可参见T.Kenakin，“Pharmacologic Analysis of Drug-Receptor Interactions”，2nd Ed.Raven Press，New York，1993以及 其中的参考文献。

2.酶抑制作用：测量这些活性的具体筛选的实例汇总可参见H. Zollner，“Handbook of Enzyme Inhibitors”，2nd Ed.VCH Weinheim，FRG， 1989和其中的参考文献。

3.中枢神经系统、自主神经系统(心血管和胃肠道)、抗组胺、抗 炎、麻醉、细胞毒性和抗生育活性：测量这些活性的具体筛选的实例汇总 可参见E.B.Thompson，“Drug Bioscreening：Drug Evaluation Techniques in Pharmacology”，VCH Publishers，New York，1990和其中的参考文献。

4.抗癌活性：测量这些活性的具体筛选的实例汇总可参见I.J.Fidler and R.J.White，“Design of Models for Testing Cancer Therapeutic Agents”，Van Nostrand Reinhold Company，New York，1982和其中的参 考文献。

5.抗菌和抗病毒(尤其是抗HIV)活性：测量这些活性的具体筛选 的实例汇总可参见“antibiotics in Laboratory Medicine”，3rd Ed.，V. Lorian，ed.Williams and Wilkens，Baltimore，1991和其中的参考文献。 测量这些活性的抗HIV筛选的汇总可参见“HIV Volume 2：Biochemistry， Molecular Biology and Drug Discovery”，J.Karn，ed.，IRL Press，Oxford， 1995和其中的参考文献。

6.免疫调节活性：测量这些活性的具体筛选的实例的汇总可参见：V. St.Georgiev(1990)，“Immunomodulatory Activity of Small Peptides” Trends Pharm.Sci. 11，373-378。

7.药物代谢动力学性质：在筛选方法中测定的药理活性包括半衰期、 溶解性或稳定性等。例如，分析和测量药物代谢动力学性质的方法可参见： J.-P.Labaune，“Handbook of Pharmacokinetics：Toxicity Assessment of Chemicals”，Ellis Horwood Ltd.，Chichester，1989和其中的参考文献。

在该筛选方法中，步骤a)的肽可由天然氨基酸组成。或者，步骤 a)的肽主要含有天然氨基酸，还含有一个或少量非天然氨基酸。这种 肽被认为基本由天然氨基酸组成。

在该筛选方法中，步骤b)的肽可为上文所述本发明的截短肽或延 长肽。在一个实施方案中，式I-IV的非天然氨基酸的结构与天然存在 的氨基酸赖氨酸和精氨酸的结构相似。

因此，在本申请所考虑的筛选方法中，任何延长肽或截短肽可与具 有相同下游序列和具有已知活性或药理活性的肽相比较，以确定该延长 肽或截短肽是否具有相同或不同水平的相同或相似活性或药理活性。根 据测量步骤如何进行的详细说明，本筛选方法也可用于检测延长肽或截 短肽所表现出的活性或药理活性。同样，该筛选方法还可用于检测和测 量相同或相似活性或药理活性的定性差异和定量差异。

因此，本发明的方法提供了延长肽或截短肽活性改变的评估方法。 一般而言，在脱氨烷基氨基酸部分参与结合(如受体-配体结合、酶-辅 因子结合、酶-底物结合)时，肽的疏水性提高，这间接导致结合活性 增强，由于结合强度与活性相关，因此可得到具有较高效能(测量得到 的较高活性水平)的肽。

另外，本发明的脱氨烷基氨基酸还可增强或提高肽的药理活性。例 如，因为脱氨烷基氨基酸疏水性更强(即亲脂性更强)，所以含有非天 然氨基酸的肽更有能力穿过机体屏障(如血脑屏障、血眼屏障、皮肤、 肠上皮)。此外，因为脱氨烷基氨基酸赋予肽增强的选择性和稳定性， 所以在与其他肽相比较时，该药理活性也可得以筛选。

治疗

本发明进一步涉及一种治疗或预防受试者疾患的方法，包括给予该 受试者式I-IV的氨基酸作为N端的延长肽或截短肽。形成延长肽或截 短肽的基础肽会与待治疗或预防的疾患在生物化学、生理学、药理学或 生物学上相关或被认为与之相关。该疾患可为某种疾病、生物功能异常 或机体功能异常或者例如但不限于例如皮肤斑(skin blotch)、痤疮等的 美容疾患的通常并不被认为是疾病或功能异常的某种不良生物状况。该 受试者为包括哺乳动物在内的人医学患者或兽医学患者，哺乳动物例如 人和非人哺乳动物例如狗、猫、牛、羊、猪以及禽类。

在本发明的方法中，可治疗或预防的疾患和可使用的肽有很多。肽 和疾患的部分列表如下：

激发B细胞和T细胞活性的肽可用于治疗自身免疫疾病，包括葡萄 膜炎、胶原诱导的、佐剂性和类风湿性关节炎、甲状腺炎、重症肌无力、 多发性硬化和糖尿病。这些肽的实例为白细胞介素(参见Aulitzky，WE； Schuler，M；Peschel，C.；Huber，C.；Interleukins.Clinical pharmacology and therapeutic use.Drugs.48(5)：667-77，1994 Nov.)和细胞因子(参 见Peters，M.；Actions of cytokines on the immune response and viral interactions：an overview.Hepatology.23(4)：909-16，1996 Apr.)。

脑啡肽(enkephlin)和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗AIDS、 ARC和癌症、疼痛调节(pain modulation)、亨廷顿氏(Huntigton’s) 疾病、帕金森氏(Parkinson’s)疾病。

LHRH和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗前列腺肿瘤和生殖生理 病理学，包括乳腺癌和不育。

靶向关键性酶、癌基因或癌基因产物、肿瘤抑制基因及其产物、生长 因子及其相应受体的肽和拟肽可用于治疗癌症。这些肽的实例描述于 Unger，C.Current concepts of treatment in medical oncology：new anticancer drugs.Journal of Cancer Research & Clinical Oncology. 122(4)：189-98，1996。

神经肽Y和其它胰多肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗紧张、 焦虑、抑郁和相关血管收缩作用。

糖肠降血糖素(gluco-incretin)，包括肠抑胃肽、糖依赖性促胰岛多 肽、PACAP/胰高血糖素和胰高血糖素样多肽1和2和类似物，激动剂和拮 抗剂可用于治疗II型糖尿病性高血糖。

心房钠尿肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗充血性心力衰竭。

整联蛋白和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗骨质疏松症、瘢痕形 成、骨形成、血管闭塞的抑制和肿瘤侵袭和转移的抑制。

胰高血糖素、胰高血糖素样肽1、PACAP/胰高血糖素和类似物、激 动剂和拮抗剂可用于治疗糖尿病心血管急症。

抗凝血肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗心血管疾病和脑血管 疾病。这些被称为RGD、D-Phe-Pro-Arg和其它名字的肽的实例描述于 Ojima I.；Chakravarty S.；Dong Q.Antithrombotic agents：from RGD to peptide mimetics.Bioorganic & Medicinal Chemistry.3(4)：337-60，1995。

细胞因子/白细胞介素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗炎性疾 病、免疫应答功能异常、血细胞生成、蕈样肉芽肿、再生障碍性贫血、血 小板减少和恶性黑素瘤。这些肽的实例为白细胞介素，参见Aulitzky等人 和Peters等人的文献。

内皮缩血管肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗动脉压过高、心 肌梗塞、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化、休克病症、肾衰竭、哮喘和血 管痉挛。

利尿钠激素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗心血管疾病和急性 肾衰竭。这些肽的实例在Espiner，E.A；.Richards，A.M.；Yandle，T.G.； Nicholls，M.G.；Natriuretic hormones.Endocrinology & Metabolism Clinics of North America.24(3)：481-509，1995中被命名和描述。

激活或抑制酪氨酸激酶或结合到TK激活肽或抑制肽的肽和类似物、 激动剂和拮抗剂可用于治疗慢性骨髓性白血病和急性淋巴性白血病、乳腺 癌和卵巢癌以及其它酪氨酸激酶相关疾病。这些肽的实例描述于 Smithgall，TE.；SH2 and SH3 domains：potential targets for anti-cancer drug design.Journal of Pharmacological & Toxicological Methods. 34(3)：125-32，1995。

肾素抑制剂类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗心血管疾病，包括高 血压和充血性心力衰竭。这些肽的实例描述于Rosenberg，S.H.；Renin inhibition.Cardiovascular Drugs & Therapy.9(5)：645-55，1995。

血管紧张素转化酶抑制剂、类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗心血 管疾病，包括高血压和充血性心力衰竭。

激活或抑制酪氨酸磷酸化酶的肽可用于治疗心血管疾病。这些肽的实 例描述于Srivastava，A.K.；Protein tyrosine phosphorylation in cardiovascular system.Molecular & Cellular Biochemistry. 149-150：87-94，1995。

以抗病毒剂为基础的肽可用于治疗病毒性疾病。这些肽的实例描述于 Toes，R.E.；Feltkamp，M.C.；Ressing，M.E.；Vierboom，M.P.；Blom，R.J.； Brandt，R.M；Hartman，M.；Offringa，R.；Melief，C.J.；Kast，W.M.； Cellular immunity against DNA tumour viruses：possibilities for peptide-based vaccines and immune escape.Biochemical Society Transactions.23(3)：692-6，1995。

促肾上腺皮质激素释放因子和肽类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗 高CRF相关疾病，即阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、神经性厌食、 抑郁病、关节炎和多发性硬化。

血小板源伤口愈合因子(platelet-derived wound-healing formula， PDWHF)的肽激动剂和拮抗剂可用作供体组织缺陷和外科手术中伤口愈 合抑制时的治疗。这些肽的实例描述于Rudkin，G.H.；Miller，T.A.； Growth factors in surgery.Plastic & Reconstructive Surgery. 97(2)：469-76，1996。

纤连蛋白、血纤肽抑制剂和类似物、激动剂和拮抗剂可用与治疗转移 (即酶抑制、肿瘤细胞迁移、侵袭和转移)。

趋化因子(各种细胞因子，包括白细胞介素-8、RANTES和单核细 胞趋化肽)类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗关节炎、超敏反应、血管 发生、肾病、肾小球肾炎、炎症和血细胞生成。

中性内肽酶抑制剂和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗高血压和炎 症。这些肽的实例描述于Gregoire，J.R；Sheps，S.G；Newer antihypertensive drugs.Current Opinion in Cardiology.10(5)：445-9， 1995。

P物质和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗免疫系统功能异常、痛 传递/痛知觉，并可用于自主反射和行为中。

α黑色素细胞刺激激素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗艾滋 病、类风湿性关节炎和心肌梗塞。

缓激肽(BK)和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗炎性疾病(水 肿等)、哮喘、变态反应(鼻炎等)、麻醉用途和败血性休克。

促胰液素可用于治疗心血管急症。

GnRH和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗依赖激素的乳腺肿瘤和 前列腺肿瘤。

促生长素抑制素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗消化道神经内 分泌肿瘤。

促胃液素、促胃液素释放肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用作小细胞 肺癌或其它恶性肿瘤中化疗或外科手术的佐剂，或者可用于治疗变应性呼 吸系统疾病、哮喘和变应性鼻炎。

层粘连蛋白、层粘连蛋白源抗转移药物YIGSR肽、层粘连蛋白源合 成肽类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗肿瘤细胞生长、血管发生、再生 研究、糖尿病眼血管化和局部缺血。这类肽可抑制白血病细胞的肿瘤生长 和转移，可用作白血病浸润的潜在治疗剂。含有该序列的肽还能抑制实验 性转移。示例性参考文献包括McGowan KA.Marinkovich MP.Laminins and human disease.Microscopy Research & Technique.51(3)：262-79， 2000 Nov 1；Yoshida N.Ishii E.Nomizu M.Yamada Y.Mohri S. Kinukawa N.Matsuzaki A.Oshima K.Hara T.Miyazaki S.The laminin-derived peptide YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)inhibits human pre-B leukaemic cell growth and dissemination to organs in SCID mice. British Journal of Cancer.80(12)：1898-904，1999”。这些肽的实例还描述 于Kleinman，H.K.；Weeks，B.S.；Schnaper，H.W.；Kibbey，M.C.； Yamamura，K.；Grant，D.S；The laminins：a family of basement membrane glycoproteins important in cell differentiation and tumor metastases.Vitamins & Hormones.47：161-86，1993。

防卫素、皮质稳定素(corticostatin)、蛙皮抗菌肽、mangainin和其 它抗菌(抗细菌和抗微生物)肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗感 染、组织炎症和内分泌调控。

血管加压素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗神经障碍、紧张和 糖尿病尿崩。

催产素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗神经障碍和用于诱导分 娩。

ACTH相关肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用作神经营养剂、神经保 护剂和外周脱髓鞘性神经病剂(peripheral demyelinating neuropathy agent)。

淀粉状蛋白β肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗阿尔茨海默 病。

表皮生长因子、受体和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗坏死性肠 结肠炎、佐林格-埃利森综合征(Zollinger-Ellison syndrome)、胃肠溃 疡、结肠炎和先天性微绒毛萎缩癌(microvillus atrophycarcinomas)。

白细胞黏附分子及其配体和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗动脉 粥样硬化、炎症。这些肽的实例描述于Barker，J.N.；Adhesion molecules in cutaneous inflammation.Ciba Foundation Symposium.189：91-101。

主要组织相容性复合物(MHC)结合肽和类似物、激动剂和拮抗剂 可用于治疗自身免疫疾病、免疫功能异常、免疫调节疾病，以及用作它们 相应的治疗剂。这些肽的实例描述于Appella，E.；Padlan，E.A.；Hunt， D.F；Analysis of the structure of naturally processed peptides bound by class I and class II major histocompatibility complex molecules.EXS. 73：105-19，1995。

促肾上腺皮质激素释放因子可用于治疗神经障碍。

神经营养蛋白(包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子 和神经营养蛋白3)和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗神经障碍。

细胞毒性T细胞激活肽可用于治疗感染疾病和癌症。这些肽的实例描 述于Chesnut R.W.；Sette，A.；Celis，E.；Wentworth，P.；Kubo，R.T.； Alexander，J.；Ishioka，G.；Vitiello，A.；Grey，H.M；Design and testing of peptide-based cytotoxic T-cell-mediated immunotherapeutics to treat infectious diseases and cancer.Pharmaceutical Biotechnology. 6：847-74，1995。

预防HIV-1和HTLV-1逆转录病毒感染的肽免疫原可用于治疗AIDS。 这些肽的实例描述于Hart，M.K.；Palker，T.J.；Haynes，BF；Design of experimental synthetic peptide immunogens for prevention of HIV-1 and HTLV-I retroviral infections.Pharmaceutical Biotechnology.6：821-45， 1995。

甘丙肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗阿尔茨海默病、抑郁、 进食障碍疾患、慢性疼痛、缺血损害的预防和生长激素调节。

速激肽(神经激肽A和神经激肽B)和类似物、激动剂和拮抗剂可用 于治疗痛传递/痛知觉，并可用于自主反射和行为中。

含有RGD的肽可用于治疗涉及细胞黏附的各种疾病、抗凝血病和急 性肾衰竭。

成骨生长肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用作全身性骨丢失的治疗。 这些肽的实例描述于Bab IA.Regulatory role of osteogenic growth peptide in proliferation，osteogenesis，and hemopoiesis.Clinical Orthopaedics & Related Research.(313)：64-8，1995。

甲状旁腺激素、甲状旁腺激素相关肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用 于治疗影响钙平衡(高钙血症)、骨代谢的疾病、血管病和动脉粥样硬化。

血管舒张素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗组织损伤或炎症和 CNS的疼痛信号传导病理状态。

T细胞受体肽疫苗和类似物、激动剂和拮抗剂可用于免疫治疗中。这 些肽的实例描述于Brostoff，SW；T cell receptor peptide vaccines as immunotherapy.Agents & Actions-Supplements.47：53-8，1995。

血小板源生长因子(PDGF)和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗 非致瘤性过度增生病症(non-neoplastic hyperproliferative disorder)、 用作供体组织缺陷和外科手术中伤口愈合抑制的治疗。

支链淀粉、降钙素基因相关肽(CGRP)和类似物、激动剂和拮抗剂 可用于治疗胰岛素依赖性糖尿病。

血管活性肠多肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗变应性呼吸系 统疾病、哮喘和变应性鼻炎，并可作为生殖功能的神经控制。

生长激素释放激素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗生长激素缺 乏症和免疫调节。

HIV蛋白酶抑制肽可用于治疗AIDS。这些肽的实例描述于Bugelski， P.J.；Kirsh，R.；Hart，T.K；HIV protease inhibitors：effects on viral maturation and physiologic function in macrophages.Journal of Leukocyte Biology.56(3)：374-80，1994。

胸腺生成素活性片段肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗类风湿 性关节炎和病毒感染。

杀菌肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用作抗菌剂。

甲状腺释放激素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗脊髓损伤和休 克。

红细胞生成素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗贫血。

成纤维细胞生长因子(FGF)、受体和类似物、激动剂和拮抗剂可用 作骨形成的刺激作用，还可用作卡波氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、神经 元再生、前列腺生长、肿瘤生长抑制和血管发生的治疗。

干细胞因子和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗贫血。

GP120、GP160、CD4片段肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗 AIDS。

胰岛素样生长因子、受体和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗乳腺 癌和其它癌症、非胰岛素依赖性糖尿病(noninsulin-dependen diabetest mellitus)、细胞增殖、程序性细胞死亡、血细胞生成、AIDS、生长障碍、 骨质疏松和胰岛素抵抗。

集落刺激因子(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因 子和巨噬细胞集落刺激因子)和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗贫血。

肯特肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于免疫调节。

淋巴细胞激活肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于免疫调节。这些肽 的实例描述于Loleit，M.；Deres，K.；Wiesmuller，K.H.；Jung，G.；Eckert， M.；Bessler，W.G；Biological activity of the Escherichia coli lipoprotein： detection of novel lymphocyte activating peptide segments of the molecule and their conformational characterization.Biological Chemistry Hoppe-Seyler.375(6)：407-12，1994 Jun。

促吞噬肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于免疫调节。

催乳素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗风湿病、全身性红斑狼 疮和高催乳素血症(hyperprolactemia)。

血管紧张素II及受体和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗高血压、 血液动力调节、神经障碍、糖尿病性肾病、主动脉动脉炎引起的RVH、 醛甾酮过多症、重金属引起的心血管效应、糖尿病和甲状腺机能障碍。

强啡肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗神经障碍、疼痛治疗、 感觉过敏、脊髓损伤和癫痫。

降钙素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗神经障碍、免疫系统功 能异常、钙平衡和骨质疏松症。

垂体腺苷酸环化酶激活多肽在生长、信号传导血管活性作用中起作 用，并在疾病中的确切的作用尚不确定。

缩胆囊素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗饮食障碍、惊恐性障 碍，并且具有抗阿片样物质性质。

胃酶抑制剂和类似物、激动剂和拮抗剂可用作胃蛋白酶和HIV蛋白酶 抑制剂(AIDS)。

苯丁抑制素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗肌肉萎缩、抗癌剂、 抗白血病药、免疫应答调节剂和治疗急性非淋巴细胞白血病。

抑酶醛肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用作蛋白酶抑制剂，在疾病中 的确切作用尚不确定。

黄体生成素和释放激素和类似物、激动剂和拮抗剂可用做不育雄性避 孕药。

神经降压肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用作例如抗紧张剂、止痛剂、 抗癌剂和/或例如通过引起低体温提供神经保护从而例如治疗中风患者的 神经保护剂。

促胃动素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于控制胃排空。

胰岛素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗糖尿病。

转化生长因子(TGF)和类似物、激动剂和拮抗剂可用于细胞增殖 和分化、癌症治疗、免疫调节、供体组织缺陷和外科手术中伤口愈合抑制 的治疗。

骨形态发生蛋白(BMP)和类似物、激动剂和拮抗剂可用作供体组 织缺陷、骨发生和外科手术中伤口愈合抑制的治疗。

铃蟾肽和肠抑素及其类似物、激动剂和拮抗剂可用于防止肿瘤细胞增 殖、调控饮食和神经内分泌功能。这些肽属于上述神经调节肽的一类 (supercategory)。这些肽在如下示例性参考文献中描述：Yamada K. Wada E.Wada K.Bombesin-like peptides：studies on food intake and social behaviour with receptor knock-out mice.Annals of Medicine. 32(8)：519-29，2000 Nov.；Ohki-Hamazaki H.Neuromedin B.Progress in Neurobiology.62(3)：297-312，2000 Oct.；Still CD.Future trends in weight management.Journal of the American Osteopathic Association.99(10 Su Pt 2)：S18-9，1999；Martinez V.Tache Y.Bombesin and the brain-gut axis. Peptides.21(11)：1617-25，2000；Afferent signals regulating food intake. Proceedings of the Nutrition Society.59(3)：373-84，2000；Takenaka Y. Nakamura F.Jinsmaa Y.Lipkowski AW.Yoshikawa M.Enterostatin (VPDPR)has anti-analgesic and anti-amnesic activities.Bioscience Biotechnology & Biochemistry.65(1)：236-8，2001 J.。

胰高血糖素、胰高血糖素样肽1和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治 疗糖尿病性心血管急症。

胰抑制素、嗜铬粒蛋白A、B和C及类似物、激动剂和拮抗剂—与抑 制胰岛素分泌、外分泌胰腺分泌和胃酸分泌以及egradati分泌刺激相关的 病症。

内啡肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗神经障碍、缓解疼痛、 阿片样物质滥用的治疗、肥胖和糖尿病。这些肽的实例在Dalayeun，J.F.； Nores，J.M.；Bergal，S.；Physiology of beta-endorphins.A close-up view and a review of the literature.Biomedicine & Pharmacotherapy. 47(8)：311-20，1993中被命名和描述。

各种阿片肽，包括(但不限于)肾上腺肽E、α酪蛋白片段、β酪啡 肽、皮啡肽、京都啡肽、甲八肽酰胺神经肽FF(metophamide neuropeptide FF，NPFF)、黑素细胞抑制因子和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗 神经障碍、缓解疼痛，还可用于阿片样物质滥用的治疗。

加压催产素和类似物、激动剂和拮抗剂可用于有待确定的临床用途 中。

蛋白激酶C和抑制剂及类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗癌症、程 序性细胞死亡、平滑肌功能和阿尔茨海默病。这些肽的实例在Philip，P.A.； Harris，A.L；Potential for protein kinase C inhibitors in cancer therapy. Cancer Treatment & Research.78：3-27，1995中被命名和描述。

淀粉状蛋白、淀粉样纤维蛋白、片段和类似物、激动剂和拮抗剂可用 于治疗神经变性疾病和糖尿病。

钙激活中性蛋白酶和其它钙调蛋白抑制蛋白和类似物、激动剂和拮抗 剂可用于治疗神经变性病症、脑缺血、白内障、心肌缺血、肌肉萎缩和血 小板聚集。

卡律蝎毒素、蜂神经毒肽和类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗神经 变性疾病和疼痛以及脑缺血。

磷脂酶A2和受体抑制/激活肽及类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗 急性胰腺炎、胰腺癌、腹部创伤和炎症，例如脓毒、感染、急性胰腺炎、 各种形式的关节炎、癌症、妊娠并发症和术后状态。

钾通道激活和抑制蛋白及类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗各种疾 病。这些肽的实例描述于Edwards，G.；Weston，A.H；Pharmacology of the potassium channel openers.Cardiovascular Drugs & Therapy.9 Suppl 2：185-93，1995 Mar。

IgG激活剂、抑制剂及类似物、激动剂和拮抗剂可用于治疗自身免疫 疾病和免疫功能异常。这些肽的实例描述于Mouthon，L.；Kaveri，S.V.； Spalter，S.H.；Lacroix-Desmazes，S.；Lefranc，C.；Desai，R.；Kazatchkine， M.D；Mechanisms of action of intravenous immune globulin in immune-mediated diseases.Clinical & Experimental Immunology.104 Suppl 1：3-9，1996。

内毒素和抑制剂及类似物、激动剂和拮抗剂可用于减小心脏输出量、 全身性低血压、减少的递送至组织的血流和O2、强烈的肺血管收缩和高 血压、支气管收缩、增大的渗透性、肺水肿、通气-灌注失衡、低氧血症 和血液浓稠性。这些肽的实例在Burrell，R；Human responses to bacterial endotoxin.Circulatory Shock.43(3)：137-53，1994 Jul中被命名和描述。

孤儿受体配体(包括但不限于ADNF、肾上腺髓质素、Apelin、生长 素释放肽、肥大脱粒肽(MCD肽)、黑色素浓缩激素(melanin concentrating hormone)、伤害感受肽/痛稳素(Nocistatin)、食欲肽、受体活性调节 蛋白、硬骨鱼紧张肽)。根据定义，孤儿受体并没有与之相关的功能，但 是它们被认为是在将来的药物开发中重要的角色。这些孤儿受体配体在如 下参考文献中描述：In DS.Orphan G protein-coupled receptor s and beyond.Japanese Journal of Pharmacology.90(2)：101-6，2002；Maguire JJ.Discovering orphan receptor function using human in vitro pharmacology.Current Opinion in Pharmacology.3(2)：135-9，2003； Szekeres PG.Functional assays for identifying ligands at orphan G protein-coupled receptor s.Receptor s & Channels.8(5-6)：297-308，2002； Shiau AK.Coward P.Schwarz M.Lehmann JM.Orphan nuclear receptor s：from new ligand discovery technologies to novel signaling pathways.Current Opinion in Drug Discovery & Development. 4(5)：575-90，2001；Civelli O.Nothacker HP.Saito Y.Wang Z.Lin SH.Reinscheid RK.Novel neurotransmitters as natural ligands of orphan G-protein-coupled receptor s.Trends in Neurosciences. 24(4)：230-7，2001；Darland T.Heinricher MM.Grandy DK.Orphan in FQ/nociceptin：a role in pain and analgesia，but so much more.Trends in Neurosciences.21(5)：215-21，1998。这些文献的公开通过援引纳入本 申请中。

另一类包括糖蛋白IIb/IIIa抑制剂。富含血小板的血栓在急性冠状动 脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)病变中的核心作用已为人们 熟知。糖蛋白IIb/IIIa(Gp IIb/IIIa)受体拮抗剂是血小板功能的有效抑制 剂，它们有望将ACS的自然史朝着好的方向影响。这类的示例性参考文献 包括Bhatt DL.Topol EJ.Current role of platelet glycoprotein IIb/IIIa inhibitors in acute coronary syndromes.JAMA.284(12)：1549-58，2000； Kereiakes DJ.Oral blockade of the platelet glycoprotein IIb/IIIa receptor：fact or fancy？.American Heart Journal.138(1 Pt 2)：S39-46， 1999；Bassand JP.Low-molecular-weight heparin and other antithrombotic agents in the setting of a fast-track revascularization in unstable coronary artery disease.Haemostasis.30 Suppl 2：114-21； discussion 106-7，2000。

含有脱氨烷基氨基酸的肽穿过机体屏障的用途

本发明涉及一种通过使用将式I-IV化合物的残基作为其N端的延 长肽或截短肽提高肽穿过受试者的机体屏障的能力的方法。

本发明还涉及一种治疗或预防受试者疾病或病症的方法，该疾病或 病症通过给予延长肽或截短肽治疗或预防，借此穿过机体屏障的延长肽 或截短肽的量比不含非天然氨基酸的肽要大。

本发明还涉及一种治疗或预防患者脑疾病或病症的方法，该疾病或 病症通过给予延长肽或截短肽治疗或预防。

由于无法穿过机体屏障，肽用作治疗剂的用途受到限制。短语“机 体屏障”在本申请中被定义为细胞膜或其它起着防止某些分子自由通过 (例如扩散)作用的结构。本发明的延长肽或截短肽的使用促进所得到 的肽穿过各种屏障。机体屏障的实例包括但不限于血脑屏障、细胞膜、 肠上皮、皮肤细胞或血眼屏障。在优选的实施方案中，机体屏障为血脑 屏障。

含有非天然氨基酸的肽的选择性和稳定性

本发明的某些实施方案涉及一种通过使用上述基于所选肽序列的 延长肽或截短肽提高所选肽的选择性的方法。

增强药物对生物靶标的选择性非常重要。在一个实施方案中，含有 精氨酸和/或赖氨酸的肽可根据本发明转化为延长肽或截短肽，以提高 该肽的选择性。在另一个实施方案中，本文所公开的任何一种非天然氨 基酸可用来提高肽的选择性。

药物组合物

本发明的肽可用于本领域的技术人员可用的任何治疗方法中，以治 疗任何与相应已知肽相关的疾病或生理问题。

本发明的肽可配制为药物组合物，并可以各种适于所选给药途径的 剂型给予例如人患者等的哺乳动物宿主，所选给药途径即口服给药或通 过静脉内、肌内、局部或皮下途径肠胃外给药。

因此，该肽可全身给药，例如通过灌注或注射静脉内或腹膜内给药。 该肽或肽缀合物的溶液可在水中制备，任选与无毒表面活性剂混合。分 散系也可在丙三醇、液体聚乙二醇、乙酸甘油酯、及其混合物中制备， 并可在油中制备。在常规保存和使用条件下，这些制剂含有防止微生物 生长的防腐剂。

适合注射或输注的药物剂型可包括含有活性成分的无菌水溶液或 分散系或无菌粉剂，该无菌水溶液或分散系或无菌粉剂适于临时配制成 无菌可注射或可输注溶液或分散系，任选可包封于脂质体中。在所有情 况下，最终剂型在制备和保存条件下必须是无菌的、能流动的和稳定的。 液体载体或赋形剂可为含有如下物质的溶剂或液体分散介质：例如水、 乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无 毒甘油酯，以及它们合适的混合物。恰当的流动性可例如通过形成脂质 体维持，就分散系而言可通过维持所需粒径大小来维持或通过使用表面 活性剂维持。对微生物作用的预防可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如 对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等实现。在很多情况 下，优选含有等渗剂例如糖、缓冲剂或氯化钠。注射用组合物的延长吸 收可通过在组合物中使用延缓吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶实现。

无菌注射用溶液可通过下述方法制备：在恰当的溶剂中将所需量的 肽或肽缀合物根据需要与上文列出的各种其它成分混合，然后过滤除 菌。就用于制备无菌注射用溶液的无菌粉剂而言，制备该粉剂的优选方 法是真空干燥和冷冻干燥技术，由此可获得活性成分以及在之前过滤除 菌溶液中存在的任何其他所需成分的粉末。

在一些情况下，本发明的肽也可与可药用赋形剂例如惰性稀释剂或 可同化的食用载体联合口服给药。该肽可被封装入明胶硬壳或软壳明胶 胶囊中，压成片剂，或直接掺入患者饮食的食物中。就口服治疗给药而 言，该肽或肽缀合物可与一种或多种赋形剂联合，以可吸收片剂、口含 片剂(buccal tablet)、糖锭、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、薄片剂(wafer) 等形式使用。这些组合物和制剂应含有至少0.1％的活性化合物。当然， 该组合物和制剂的百分比可有所变化，并且方便地介于既定单位剂型重 量的约2至约60％至约90％之间。这些治疗用组合物中的肽的量为将 获得有效剂量水平的量。

片剂、糖锭、丸剂、胶囊等还可含有如下物质：黏合剂例如黄蓍胶、 阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀 粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；和甜味剂例如蔗糖、 果糖、乳糖或阿斯巴甜，或增香剂例如薄荷、冬青油，或者也可加入樱 桃香精。当单位剂型为胶囊时，除了含有上述类型的物质外，还可含有 液体载体例如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以包衣形式或其它修 饰固体单位剂型物理形式的形式存在。例如，片剂、丸剂或胶囊可用明 胶、蜡、紫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂 的蔗糖或果糖，作为防腐剂的对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、染料 和香精如樱桃香精或橙香精。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料 应该是可药用的，并且在所使用量的水平上基本无毒。另外，本发明的 肽可被掺入到缓释制剂和装置中。

有用的固体载体包括细粒固体例如滑石、粘土、微晶纤维素、硅石、 矾土等。有用的液体载体包括水、乙醇或丙三醇或水-乙醇/丙三醇混合物， 其中本发明化合物可以有效水平溶解或分散，任选借助于无毒表面活性 剂。可加入佐剂例如香料和其它抗微生物剂以就既定用途使性质最优化。

增稠剂例如合成型聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤 维素或改性矿物质也可与液体载体一起使用以形成直接用于使用者皮肤 的可分散糊剂、凝胶、软膏、皂等。

本发明肽的有用剂量可通过与它们的体外活性和在本申请所述动 物模型中的体内活性相关联来确定。

本发明肽的治疗有效量需随受试者和有待治疗的疾病或生理问题 变化，并与相应已知肽的有效量相关。例如介于30至112,000μg/kg体 重的治疗量对静脉内给药是有效的。正如本领域的技术人员所认识到的 那样，该量可根据给药方法有所变化。治疗用所需的本发明肽的量还随 给药途径有所变化，而且还随所治疗病症的性质和患者年龄和状况有所 变化，最终由护理的内科医师或临床医师决定。

该化合物以例如每单位剂型含有1至1000mg、方便地为10至750 mg、最方便地为20至500mg肽的单位剂型方便地给药。

理想情况下，应以获得约0.1至约75μM、优选约1至50μM、最 优选约2至约30μM的血浆峰浓度给予该肽。这可例如通过静脉内注 射0.05至5％肽溶液(任选溶于盐水中)实现，或通过口服给予含有约 1-100mg此肽的大丸剂实现。所需血液水平可通过连续输注以提供约 0.01-5.0mg/kg/hr活性成分得以维持，或通过不连续输注含约0.4-15 mg/kg活性成分得以维持。

所需剂量可以分份剂量或以连续输注形式方便地存在于单次剂量 中。所需剂量也可在恰当间隔如以每天两次、三次、四次或多次小剂量 给药。

美容制剂

化妆用美容产品的一个重要作用是“美化”或使面容更漂亮。通常 该作用包括对皮肤粗糙度、斑疤(blemish)和肤色以及活力的改善。

本发明的美容组合物含有典型常用基质载体以及本发明的脱氨烷 基氨基酸化合物。用于此目的本发明的化合物通常为酯、酰胺或盐形式。 一般而言，美容基质取决于所配制的化妆品的种类：面霜、扑面粉、粉 饼、护肤霜、唇膏、胭脂(rouge)等。这些基质可含恰当的无毒色料、 emuliant、油、蜡、溶剂、乳化剂、脂肪酸、醇或酯、树胶、无机惰性 组分等。

例如，树胶可含有多种已知的多糖化合物，例如纤维素、半纤维素、 阿拉伯树胶、黄蓍胶、罗望子树胶(tamarind gum)、果胶、淀粉、甘 露聚糖、瓜耳树胶、刺槐豆胶、榠栌子胶、藻酸、角叉菜聚糖、琼脂、 苍耳烷树胶、葡聚糖、支链淀粉、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、 软骨素硫酸等，多糖化合物的衍生物例如羧甲基化衍生物、硫酸化衍生 物、磷酸化衍生物、甲基化衍生物、乙基化衍生物、例如环氧乙烷或氧 化丙烯的烯化氧加成衍生物，酰化衍生物、阳离子化衍生物、低分子量 衍生物，还可述及其它多糖衍生物。

可包含在本发明的外用组合物中的另一组分为粉末组分。可述及的 粉末组分为基于如下无机组分和有机组分的粉末组分：无机组分例如滑 石、高岭土、云母、丝云母、白云石、金云母、合成云母、鳞云母、黑 云母、锂云母、蛭石、碳酸镁、碳酸钙、硅酸铝、硅酸钡、硅酸钙、硅 酸镁、硅酸锶、钨酸(tungstenic acid)的金属盐、镁、硅石、沸石、 硫酸钡、烧结硫酸钙(烧结石膏)、磷酸钙、氟磷灰石、羟基磷灰石、 陶瓷粉、金属皂(肉豆蔻酸锌、棕榈酸钙、硬脂酸铵)、氮化硼 (boronitride)等，有机粉末组分例如聚酰胺树脂粉末(尼龙粉末)、聚 乙烯粉末、聚甲基丙烯酸甲酯粉末、聚苯乙烯粉末、苯乙烯和丙烯酸的共 聚物树脂粉末、苯胍胺(benzoguanamine)树脂粉末、硅氧烷树脂粉末、 硅氧烷橡胶粉末、硅氧烷树脂包被橡胶粉末、聚四氟乙烯粉末、纤维素粉 末等。

另外，根据需要可将通过由如下物质处理这些粉末组分的表面获得的 粉末组分配入本发明的外用组合物：硅氧烷化合物、氟修饰的硅氧烷化合 物、氟化合物、高级脂肪酸、高级醇、脂肪酸酯、金属皂、磷酸烷基酯等。

可使用已知染料或色素。可述及的，例如：无机白色色素例如二氧化 钛、氧化锌，无机红色色素例如氧化铁(三氧化二铁)、钛酸铁，无机棕 色色素例如γ-氧化铁，无机黄色色素例如黄色氧化铁、赭黄土，无机黑色 色素例如黑色氧化铁、碳黑、低价氧化钛和无机紫色色素例如芒果紫、钴 紫，无机绿色色素例如氧化铬、氢氧化铬、钛酸钴，蓝色色素例如普鲁士 蓝、群青，珍珠色色素例如氧化钛包被的云母、氧化钛包被的氯氧化铋、 氧化钛包被的滑石、有色氧化钛包被的云母、氯氧化铋、鱼鳞，金属粉末 色素例如铝粉、铜粉；锆色淀、钡色淀或铝色淀等的有机色素例如立索玉 红B(Lithol rubine)(Red No.201)、立索玉红BCA(Red No.202)、色淀 红CBA(Red No.204)、立索红(Red No.205)、深紫红(Red No.220)、赫 林顿粉红(Helidone pink)CN(Red No.226)、巴马通红(Permatone Red) (Red No.228)、永久红F5R(Red No.405)、永久橙(Orange No.203)、联 苯胺橙(Orange No.204)、联苯胺黄G(Yellow No.205)、汉撒黄(Hanza Yellow)(Yellow No.401)、Blue No.404和其它有机色素；赤藓红(Red No. 3)、焰红染料B(Red No.104)、酸性红(Red No.106)、坚牢酸性品红(Red No. 227)、曙红YS(Red No.230)、紫胺R(Red No.401)、油红XO(Red No. 505)、橙II(Orange No.205)、酒石黄(Yellow No.4)、日落黄FCF(Yellow No.5)、荧光素钠(Uranine，Yellow No.202)、喹啉黄(Yellow No.203)、坚 牢绿FCF(Green No.3)、亮蓝FCF(Blue No.1)。

本发明的美容组合物可用液体配制。可选择在例如美容剂等的外用 组合物中常用的挥发性组分作为该液体。具体而言，可以述及的是：例 如挥发性硅油、水或低级醇(或它们的混合物)。可根据本发明的外用 组合物的具体形式(例如，后文提到的“改善粗糙的组合物”或“化妆 品组合物”等)或载体类型(例如油性基质或乳液基质等)适当选择这 些挥发性组分。通过配制这些挥发性组分，就能在使用本发明外用组合 物时调节产品的粘度，并能调节外用组合物在皮肤上的涂抹厚度。

可使用在化妆品领域和其它外用组合物中所使用的挥发性硅油作 为该挥发性硅油。对它并不特别限定。具体而言，可述及的是：例如低 沸点线性硅油例如六甲基二硅氧烷、八甲基三硅氧烷、十甲基环五硅氧 烷、十二甲基环六硅氧烷和十四甲基环七硅氧烷，低沸点环状硅油例如 八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷、十二甲基环六硅氧烷和十四甲 基环七硅氧烷，等。

本发明外用组合物可根据需要在不减损本发明所需效果下含有下 列作为辅助组分的其它组分。

可将下列物质作为油性组分配制于本发明的外用组合物中，例如： 烃油例如液体石蜡、isoliquid石蜡、角鲨烷、油和脂例如橄榄油、棕榈 油、椰子油、澳洲坚果油、希蒙得木油，高级醇类例如异硬脂醇，酯油 例如高级脂肪油和肉豆蔻酸异丙酯等。本发明的外用组合物中的这些油 性组分，特别是形成极性油的油性组分能在一段时间内改善稳定性。

另外，可将下述物质混合于本发明的外用组合物中：二苯甲酮 (benzophenon)衍生物、对氨基苯甲酸酯衍生物、对甲氧基琥珀酸酯 衍生物、水杨酸酯衍生物和其它UV吸收剂；湿润剂、血液循环促进剂、 清凉剂、防汗剂、杀菌剂、皮肤活化剂、抗炎剂、维生素、抗氧化剂、 抗氧化剂佐剂、防腐剂、香精和芳香剂等。

本发明美容制剂可在恰当的介质中生产，这些介质包括但不限于 糊、粉末、饼、霜、油、洗剂、脂膏、蜡或类似美容基质。生产方法包 括将美容成分和式I-IV(优选酯、酰胺或盐形式)的任一种脱氨烷基氨 基酸化合物组合。将该组合物混合、揉捏、碾轧、研磨、加热或进行其 它处理以形成基本均一的备用物质或混合物。可通过使用捏和机、研磨 轮、滚轮、混合机、热交换器、挤压机等完成这些步骤。

如上所述，通过对天然肽神经降压肽进行修饰举例说明本发明。在 如下部分中详细讨论了本发明的技术背景、对神经降压肽和相应肽的修 饰及其生物活性。

神经降压肽的结构和生物学

1973年Carraway和Leeman首次从牛下丘脑中分离出作为降压肽 的神经降压肽(NT)。此后发现NT在中枢神经系统(CNS)和外周具 有多种不同生理效应。通过直接将NT注射到大脑中可促进低体温、抗 伤害感受、d-苯异丙胺诱导的过度运动的衰减以及巴比妥盐诱导的镇静 作用的增强。在外周，NT充当诱导低血压和减少胃酸分泌的激素。从结 构上来看，NT是具有如下序列的线性十三肽： pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH。在NT研 究早期发现C端六肽片段Arg8-Arg9-Pro10-Tyr11-Ile12-Leu13[NT(8-13)]在 产生NT的体外和体内生理效应上是等效的。

1990年，Tanaka和他的同事们首次从大鼠大脑中鉴定了NT受体 (NTR1)。此后，人NTR1被成功克隆和表达。这两种NTR均为含有7 个跨膜(7TM)结构域的典型G蛋白偶联受体，并具有84％同源性。NTR1 激活后，包括cGMP产生、钙动员和磷脂酰肌醇循环在内的第二信使系 统就被激发。NTR1的mRNA在大鼠和人的脑和肠中均有表达。还在大 鼠和人脑中鉴定了第二种NT受体(NTR2)，该受体对NT的亲和力显著 低于NTR1 (23-25)。NTR2也是一种7TM/G- 蛋白偶联受体，但是与NTR1相比，它具有较短N端胞外尾部，并具有 较长第三胞浆内环。第三种受体(NTR3)从人脑cDNA文库克隆得到， 发现它与之前克隆的gp95/选蛋白相同。NTR3是仅有一个跨膜区域的非 G蛋白偶联分选蛋白(sorting protein)，。

作为内源性神经安定药的NT

几种不同的证据暗示了NT在精神分裂症中的病理生理学中的作用。 精神分裂症的多巴胺理论中的研究进展证明在中脑缘(mesolimbic)多巴 胺系统中的各种神经回路的汇集中的一个漏洞是引起该病症出现的原因。 NT系统的解剖定位使它与脑中的谷氨酰胺能系统、多巴胺能系统、GABA 能系统以及5-羟色胺能系统相互作用。具体而言，NT系统和多巴胺系统 在被认为引起妄想和错觉的脑区——伏核(nucleus accumben)内紧密相 关。与上述神经元系统密切相关的脑区——腹侧被盖区(ventral tegmental area)中NTR1受体密集。几乎90％的NT受体位于多巴胺能神经元，并 且脑内超过80％的多巴胺神经元表达NTR1。精神分裂症中所涉及的NT 系统和脑区的共区域化也暗示其参与。

神经降压肽及其生物活性

由于NT被推测为一种“内源性神经安定药”并且NT(8-13)被鉴 定为其活性片段，因此已作很多努力开发NT(8-13)衍生物作为可能的 抗精神病药物。两个小组—具体是Eisai制药公司(东京，日本)和 Richelson研究小组(Mayo Clinic，Jacksonville，FL)—已制备了多种 有望成为抗精神病药物的NT(8-13)类似物的衍生物。具体而言，在Arg8、 Arg9、Tyr11和Ile12的氨基酸取代已产生了几种类似物，这些类似物在外 周给药后在中枢起作用。

Eisai化合物(Eisai六肽)是外周给药后引起行为效应的第一个NT (8-13)类似物。但是，掺入该肽的各种修饰使得该肽对NTR1的亲和力 损失700倍。另外，该类似物口服给药后不能引发中枢活性。

近来，Richelson小组已开发出作为NT(8-13)类似物的NT69L， 该物质保持对NTR1的纳摩尔结合亲和力(Kd＝1.55nM)(55)，并且在注 射1mg/kg后表现出显著的低体温效应(-5.3℃，90min PI)。NT69L还 使由可卡因和d-苯异丙胺所诱导的过兴奋衰减。但是，在长期给予该化 合物后，观察到对其低体温效应以及对d-苯异丙胺所诱导的过兴奋的抑 制的耐受性。同Eisai六肽一样，NT69L在口服给药后仅产生轻微的低体 温反应。

本发明NT肽的神经学效应的总结

合成了根据本发明(参见上述概述和实例)制备的NT(8-13)的N 端α甲基α脱氨高赖氨酰(homolysyl)和鸟氨酰(orinthyl)类似物，并 在预测抗精神病潜能的多种行为分析中就其活性进行了筛选。口服给药后 这些肽以剂量依赖方式引起低体温。另外，口服给予这些肽显著减少了 d-苯异丙胺诱导的过度运动，该过度运动为已有的或潜在的APD的一个 量度。在这些分析中口服给药后引发显著反应的低剂量肽(10mg/kg)是 有意义的。该肽在重复给药后还表现出维持有效性的能力。事实上，它们 表现出在一段时间内增大最大低体温反应的能力，这表明重复给药实际上 提高了其CNS活性。因此，本发明的NT肽表现出与已知的天然存在的 肽NT相似的生物活性，并且更具有选择性。

这些效应的具体内容如下。

作为CNS活性的初筛的低体温

将NT直接给药至CNS时它可引起低体温。因此，所引起的低体温 可用于确定本发明的NT(8-13)肽在外周给药后穿过BBB的能力，并且 可用于间接确定其体内CNS活性。NT的低体温效应可归因于其对NTR1 的作用，该NTR1是在精神分裂症的病理生理学中最常涉及的NTR。因 此表明IP注射后引起低体温的NT(8-13)肽为抗精神病剂。显著的低体 温效应将证明该肽显著改善了血液稳定性和膜穿透性。

IP注射是确定神经降压肽类似物穿过BBB的程度的标准给药途径。 该方法和方案在实施例部分提供。IV给药产生完全可供全身循环的剂量。 相比而言，IP注射是更为严格的稳定性测试，因为该肽首先要面临肝脏 中的首过代谢。

5mg/kg IP注射后，肽28-30的低体温效应示于表2。每种肽均在5 小时内表现出显著效应。这三种肽的低体温结果表明α烷基基团对N端 胺基团(即α甲基基团)的取代并没有失去NT(8-13)肽的体内活性。 就用作抗精神分裂药物而言，评估了在口服给药后这些肽引发CNS活性 的能力。

                            表1

                    NT(8-13)类似物的氨基酸序列   肽                               氨基酸序列     ABS201   KH29   KH30     N端     CH3     CH3     CH3   8a   L-Hlys   7   9  9  L-Arg  L-Arg  L-Arg   10   L-Pro   L-Pro   L-Pro   11   L-Tyr   L-Tyr   L-Tyr     12     L-tLeu     L-tLeu     L-tLeu   13   L-Leu   L-Leu   L-Leu   C端   COOH   COOH   COOH

                        表2

    NT(8-13)和NT(8-13)类似物IP给药的低体温反应。   肽a     tmax(min)b Δin BT(℃)c   NT(8-13)   ABS201   KH29   KH30     90     150     150     300 -0.45±0.17d -2.51±0.17 -3.75±0.24 -3.84±0.20

a所有肽的IP剂量为5mg/kg。

btmax(min)＝温度下降最多时的时间。

cΔin BT(℃)＝在tmax测量的体温下降值

d全部肽均N＝5。

口服给药

开发作为抗精神分裂药物的NT(8-13)肽的目的在于确定其在口 服给药后引发CNS活性的能力。已知的NT肽、NT69L和Eisai六肽 在口服给药时在这方面不能引发中枢活性。因此，就N端甲基肽28-30 在口服给药后引起低体温的能力对其进行了测试。

本发明肽的一个实例ABS201表现出高于2℃的最大低体温反应 (表3)，并且其最大低体温效应与IP给药后的低体温效应相同(图9)， 这产生了约25％的口服生物利用度。虽然肽29和30也具有口服活性， 但是其口服活性与IP活性的比率不如ABS201的平衡。ABS201的口服 活性是支持其作为进一步评估抗精神病潜能的先导NT(8-13)类似物 的重要因子。

                表3

     长期IP给予ABS201的低体温反应   肽a   tmax(min)b   Δin BT(℃)c   盐水d   第1天   第2天   第3天   第4天   第5天   180   120   90   120   120   90   0.70±0.20   2.72±0.24   2.85±0.26   3.74±0.13   3.71±0.13   3.83±0.24

a全部天数的IP剂量为5mg/kg。

btmax(min)＝温度下降最多时的时间。

cΔin BT(℃)＝在tmax测量的体温下降值

d全部天数均N＝5。

             表4

IP给药后肽ABS201的最大低体温效应的比较   剂量     肽     ABS201a   0.1mg/kg   0.5mg/kg   1.0mg/kg   5.0mg/kg     -1.14±0.21     -1.92±0.12     -2.63±0.21     -3.61±0.22

a体温变化(℃)是每单次剂量所记录的最大下降值。

精神分裂症的研究

d-苯异丙胺(“DA激动剂”)所引起运动的阻断已成为已有的或潜 在的候选药物治疗精神分裂症的治疗效果的标准量度。该模型起作用是 基于这样的假设即对中脑缘DA系统中的DA受体的直接刺激可引起运 动反应。

啮齿类的通常被定义为紧张性不动状态的僵住状被认为与人的 EPSE(锥体外副作用)相似。因此，僵住状为成功的候选药物应避免 的副作用。同时，候选药物在大鼠中引起僵住状的程度可也用作与该具 体候选物相关的EPSE可能出现的一个预示。

低体温分析

为检测ABS201的抗精神病性质，制作了IP给药后诱导低体温的 剂量-反应曲线。另外，测量了口服给予ABS201(10mg/kg-30mg/kg) 所引发的低体温效应。还测量了IP和口服给药后ABS201减轻d-苯异 丙胺诱导过度运动的能力。为评价对ABS201延长治疗所引起的CNS 活性的影响，每日重复给药后测量了低体温和d-苯异丙胺诱导过度运动 的衰减。最后，用棒测试(bar test)测量作为人EPSE预示的僵住状。

IP注射后浓度在0.1-10mg/kg范围内的ABS201的剂量-反应曲线 (图11)给出一些矛盾的结果。首先，5mg/kg所引发的最大效应(-3.61 ±0.22℃，150min PI)完全高于初筛后所观察到的最大效应(-2.51± 0.17℃，150min PI)。这种偏差最可能是由于影响大鼠反应的环境因素(空 气温度、直肠探针、大鼠个头等)所引起的。最重要的是：即便有这些差 异，ABS201仍可继续引发显著的CNS效应。ABS201的ED50值为0.943 mg/kg，这有利地与具有CNS活性的其它NT(8-13)类似物相当(41，60)。

ABS201口服给药后也以剂量依赖方式引起低体温(图12)。显著低 体温效应被证明出现在10mg/kg，此为测试的最低剂量(-1.02±0.10℃， 150min PI)。口服给予ABS201的ED50值的得出是不实用的，这是由于 非常量的肽必需产生完整剂量-反应曲线。已作抗精神病化合物开发的以 前的NT(8-13)类似物含有Trp11取代。本申请中列出的研究证据支持 此修饰破坏了NT类似物的口服活性的理论。需要进一步研究确定Tyr11 在NT(8-13)类似物的口服生物利用度中起何具体作用。

d-苯异丙胺(“DA激动剂”)所引起运动的阻断已成为已有的或潜在 的精神分裂症候选药物的治疗效果的标准量度，并且目前作为候选物处于 研究中的NT(8-13)类似物已证明具有以剂量依赖方式降低d-苯异丙胺 诱导过兴奋的能力。声和光衰减运动盒(sound-and light-attenuated locomotor cage)可被用于测量潜在候选物降低d-苯异丙胺诱导过兴奋的 能力。

还检测了不同剂量ABS201对d-苯异丙胺诱导过兴奋的影响。所有 被测剂量的ABS201显著减轻了过度运动(未给出剂量3mg/kg和10 mg/kg的数据)。现有APD的另一个标志是减弱自发活动能力(locomotor activity)的能力。所有ABS201剂量组在药物阶段的反应显著低于盐水 组，这表明ABS201有减少自发活动的能力。

ABS201口服给药后也证明具有使d-苯异丙胺所诱导的过度运动衰 减的能力。在药物阶段，只有剂量10和30mg/kg减弱了自发活动能力。 剂量20mg/kg没有观察到显著性最大可能是由于该组大鼠反应的轻微变 异所引起的一个意外。但是，在基线相未检测到剂量的主要效应，这表明 不同剂量组之间基线活动没有显著差异。

每日重复给药后ABS201维持显著的CNS效应(表3)，并且在5天 时间段内绝对低体温反应增大。对第1天和第5天的ABS201所诱导低体 温进行了比较。第5天最大低体温反应的获得(90min)比第1天的(120 min)快。与第1天相比，第5天的最大低体温反应不能维持较长一段时 间，这表明尽管重复给药并不降低最大效应，但是它能减少低体温效应的 持续时间。每日重复给药对ABS201使d-苯异丙胺所诱导的过度运动衰 减的能力没有影响。急性给药组和长期给药组均降低了过兴奋，该过兴奋 的降低在苯异丙胺给药后几乎两个小时里是显著的。重要的是，ABS201 长期给药并不破坏其对自发活动能力的抑制效果。

僵住状分析

在实验室测试中，僵住状的特征在于动物被放置成为不自然的姿势时 它不能纠正其位置。僵住状测试受到多个变量的显著影响。这些变量包括 新环境引起的应激导致的僵住状的抑制作用和对同一动物反复测量后产 生的习得“假僵住状”作用。为设法避开这些可能的致混淆因素，仅在安 静受控环境中对动物进行一次测试。

外周给药后ABS201(5mg/kg)或生理盐水均不能引起僵住状。氟哌啶 醇是一种已知的能在大鼠中产生完全僵住状反应的典型抗精神分裂药物， 它引起持续超过30sec的僵住状。这些结果表明ABS201在外周给药后不 引起僵住状，这是目前具有临床有效的候选物的标志。

采用CACO-2细胞的生物利用度研究

来源于人结肠直肠癌的Caco-2细胞可自发分化成为具有发育良好的 微绒毛和刷状缘酶的极性细胞。这些特征使得该细胞成为极好的人小肠模 型。已经鉴定出Caco-2细胞模型中化合物的摄入和化合物的口服生物利 用度之间关系密切。

ABS201在大鼠血清中可稳定超过24小时，但是它在细胞中的稳定 性尚未确定。因此，确定摄入实验中完整肽进入Caco-2细胞中的能力将 给出口服生物利用度和细胞稳定性。反相HPLC是分析溶解的细胞组分 ABS201和ABS降解产物的理想方法。该分析将给出口服生物利用度和 细胞稳定性。可在既定间隔收集各流分并通过LSC对放射活性进行计数。 通过经标准梯度制定ABS201洗脱时间，在摄入实验后可对Caco-2细胞 的内容物进行直接比较。

为验证完整肽进入Caco-2细胞，并初步尝试评估细胞培养物中肽的 稳定性，在细胞摄入后进行了分析ABS201的RP-HPLC测定。孵育2min 后，使用HPLC技术可鉴定细胞内的完整ABS201。这些研究证明ABS201 可被Caco-2细胞大量摄入，由此表现出其口服生物利用度。

                         实施例

给出下列实施例和方案是为了给本领域的普通技术人员提供如何 制备和评估本申请所要求保护的化合物的完整公开和描述，纯粹是为了 举例说明本发明，无意于限制本发明人所认定的发明的范围。已努力确 保数字(例如量、温度等)的准确性，但还是应该考虑到一些错误和偏 差。除非另外指出，否则部分为重量份，温度为℃并为室温，压力为大 气压或约为大气压。

原材料：如果没有另外指出，溶剂购自Fisher Scientific(Pittsburgh， PA)，试剂购自Aldrich(Milwaukee，WI)。

缩略词：Trisyl-N3即2，4，6-三异丙基苯磺酰叠氮化物；Et3N即三乙胺； t-BuCOCl即三甲基乙酰氯；n-BuLi即正丁基锂；H2即氢气；Pd-C即活 性碳上的钯；Xps即(S)-(-)-4-苯甲基-2-噁唑烷二酮 ((S)-(-)-4-benzyl-2-oxazolidinone)；KHMDS即双(三甲基甲硅烷基)酰 胺钾；CH3I即甲基碘；H2O2即过氧化氢；LiOH即氢氧化锂；THF即四 氢呋喃；CH2Cl2即二氯甲烷；MgSO4即硫酸镁；Hex即己烷；EtOAc 即乙酸乙酯；NaHCO3即碳酸氢钠；HCl即盐酸；N2即氮气；H2O即蒸 馏水。

                             实施例1

(3(2S)，4S)-3-(2-甲基-5-溴-1-氧代戊酰)-4-(苯甲基)-2-噁唑烷二酮 ((3(2S)，4S)-3-(2-methyl-5-bromo-1-oxovaleryl)-4-(phenylmethyl)-2-oxazoli dinone)(24a)(图3)。按前人所述(57)制备中间体23a。将17.4ml(5 eq)双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾(KHMDS)溶液加入100ml无水四 氢呋喃(THF)中并在氮气(N2)正压下冷却至-78℃。将溶于10mL THF 中的23a(5.18g，15.23mmol)溶液在N2下冷却至-78℃并将管插入 KHMDS溶液中。在-78℃下将此混合物搅拌30min使得形成烯醇化物。 通过插管将甲基碘(CH3I)(1.90mL，2eq)加入溶液中并在-78℃搅拌1 hr，然后用4.09mL(5eq)冰醋酸终止反应。将溶液在搅拌条件下在两个 小时内加温至室温，真空除去THF。将得到的黄色浆体溶于200mL半饱 和盐水中并用CH2Cl2(3×100mL)萃取。合并CH2Cl2层，用无水硫酸镁 (MgSO4)干燥、过滤，并真空蒸发，得到黄色油状物。粗制油状物在 硅胶上用3∶1己烷∶乙酸乙酯(Hex∶EtOAC)洗脱纯化以得到2.81g(产率为 52％)纯26a。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.38-7.15(m，5H)，4.71-4.63(m， 1H)，4.18-4.15(d，J＝5.0Hz，2H)，3.71-3.65(m，1H)，3.41-3.33(m，2H)， 3.27-3.20(dd，J＝4.0，13.8Hz，1H)，2.89-2.81(dd，J＝10.0，14.2Hz，1H)， 1.90-1.55(m，4H)，1.24-1.20(d，J＝7.4，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ 176.8，153.2，135.2，129.6，129.1，127.6，66.4，55.6，38.3，37.6，33.8，32.2， 31.8，17.9。

                             实施例2

(3(2S)，4S)-3-(2-甲基-5-溴-1-氧代己酰)-4-(苯甲基)-2-噁唑烷二酮 ((3(2S)，4S)-3-(2-methyl-6-bromo-1-oxohexanyl)-4-(phenylmethyl)-2-oxazol idinone)(24b)。用稍作改动的方法获得24b。将KHMDS加入23b后， 紧随加入5eq CH3I，并且该反应在-78℃于氮气中搅拌1小时。用冰醋 酸终止反应以及随后的萃取和纯化的方案如24a所述。用100％CH2Cl2 洗脱的进一步硅胶纯化获得了纯24b(产率为10％)。1H NMR(400MHz， CDCl3)δ7.36-7.19(m，5H)，4.72-4.65(m，1H)，4.25-4.16(d J＝4.2Hz，2H)， 3.77-3.67(m，1H)，3.46-3.36(t，J＝7.0Hz，2H)，3.29-3.22(dd，J＝4.0，14.0Hz， 1H)，2.82-2.74(dd，J＝9.0，14.0Hz，1H)，1.92-1.74(m，3H)，1.50-1.42(m， 3H)，1.25-1.21(d，J＝7.2Hz，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ176.9， 153.2，135.3，129.6，129.1，66.4，55.6，38.1，37.8，34.1，32.8，32.5，26.1，18.7。

                             实施例3

(3(2S)，4S)-3-(2-甲基-7-溴-1-氧代庚基)-4-(苯甲基)-2-噁唑烷二酮 ((3(2S)，4S)-3-(2-methyl-7-bromo-1-oxoheptyl)-4-(phenylmethyl)-2-oxazo lidinone)(24c)。按照获得化合物26a所概括的方法由化合物23c制得24c (产率为56％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.41-7.22(m，5H)， 4.74-4.66(m，1H)，4.25-4.19(d，J＝4.0Hz，2H)，3.77-3.70(m，1H)，3.45-3.39 (t，J＝7.0Hz，2H)，3.31-3.23(dd，J＝3.7，13.7Hz，1H)，2.84-2.77(dd，J＝10.0， 12.5Hz，1H)，1.91-1.77(m，3H)，1.50-1.32(m，5H)，1.25-1.20(d，J＝7.0Hz， 3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ177.2，153.1，135.4，129.7，129.1，127.5， 66.4，55.7，38.2，37.9，34.3，33.4，32.8，28.4，27.7，17.8。

                             实施例4

2(S)-甲基-5-溴戊酸(2(S)-Methyl-5-bromovaleric acid)(25a)。将溶于 100mL THF和40mL H2O中的24a(10.41g，29.4mmol)溶液在搅拌条件 下冷却至0℃。向该溶液中加入12.12mL(3.5eq)30％过氧化氢(H2O2)， 然后加入2.41g(2eq)氢氧化锂(LiOH)，将此溶液在0℃搅拌50min。50 min后，加入94mL亚硫酸钠(0.183g/mL H2O)和288mL 0.5N碳酸氢钠 (NaHCO3)。真空除去THF，用CH2Cl2(3×100mL)萃取剩余水溶液。用 25％HCl将水层酸化至pH2，并用EtOAc(3×100mL)萃取。将EtOAc 部分合并，真空浓缩得到4.01g(产率为70％)苍色油状物27a。1H NMR (400MHz，CDCl3)δ3.46-3.38(t，J＝6.0Hz，2H)，2.56-2.46(m，1H)， 1.95-1.60(m，4H)，1.25-1.20(d，J＝7.0Hz，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3) δ183.1，38.9，33.6，32.1，30.5，17.3。

                           实施例5

2(S)-甲基-6-溴己酸(2(S)-Methyl-6-bromohexanoic acid)(25b)。按照 获得化合物25a所概括的方法由化合物24b制得25b(产率为77％)。1H NMR(400MHz CDCl3)δ3.45-3.38(t，J＝6.2Hz，2H)，2.55-2.45(m，1H)， 1.92-1.85(m，2H)，1.77-1.68(m，1H)，1.55-1.46(m，3H)，1.24-1.19(d，J＝7.8 Hz，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ183.5，39.5，33.8，32.9，32.7，26.0， 17.2。

                           实施例6

2(S)-甲基-7-溴庚酸(2(S)-(Methyl-7-bromoheptanoic acid)(25c)。按照 获得化合物25所概括的方法由化合物24c制得25c(产率为74％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.43-3.36(t，J＝6.8Hz，2H)，2.51-2.42(m，1H)， 1.90-1.64(m，3H)，1.49-1.32(m，5H)1.20-1.14(d，J＝7.0Hz，3H)；13C NMR (100MHz，CDCl3)δ183.6，39.5，34.1，33.5，32.7，28.2，26.6，17.1。

                           实施例7

α甲基α脱氨ωN-取代高赖氨酰和鸟氨酰(8)神经降压肽(8-13)

合成了α甲基α脱氨ωN-取代高赖氨酰和鸟氨酰(8)神经降压肽 (8-13)(图7)。如概述部分所述，使α-甲基溴代酸——27a和c与树脂结合 肽偶联。如下所述进行固态偶联。

将结合NαFmoc亮氨酸的树脂在DMF中溶胀，然后用哌啶(20％， 溶于DMF)进行Fmoc裂解。真空过滤除去哌啶溶液，用DMS和二氯 甲烷(各均为5×)洗涤树脂结合氨基酸。在DMF中用HOBt(4eq)PyBOP ((4eq)和DIPEA(10eq)将氨基酸活化并直接加至肽反应池中。将氨基酸 偶联6小时，用DMF和二氯甲烷洗涤树脂，并用Kaiser测试监测是否 存在游离胺。必要时将残基重偶联。用随后的氨基酸重复该过程，以获得 次末次肽序列(五聚体)。

然后如上所述将树脂结合五聚体的整分试样与适当的ω溴代羧酸偶 联，以获得N-ω溴代酰基五聚体。然后如这些实施例所述使N-ω酰基五 聚体与氨、二甲胺或三甲胺反应，以生成本发明的所需肽。用含恰当清除 剂的TFA溶液对侧链保护基团进行酸催化脱保护。

以15％至75％B的线性梯度、4mL/min恒定流速进行55min分钟 的RP-HPLC纯化得到纯的ω溴代肽53和54。这些溴代肽在40℃于乙 醇(EtOH)中与150eq氢氧化铵(29％，溶于H2O)、甲胺(40％，溶于 H2O)、二甲胺(40％，溶于H2O)或三甲胺(40％，溶于H2O)反应12hr。 真空除去溶剂，并将粗制肽溶于流动相，并用2％至50％B的线性梯度、 4mL/min的恒定流速进行65min的纯化。

对肽进行表征并通过MALDI-TOFMS在Voyager DE-STR System 4117质谱仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上分析纯度。活体内使 用纯度大于95％的肽。

                        实施例8

                NT(8-13)肽及其低体温生物活性

总体动物实验方案。雄性Sprague Dawley大鼠(250-350g)从Harlan (Indianapolis，IN)获得并被放入AAALAC认定的恒温恒湿动物房(colony room)。光照被控制为12hr光照：避光循环，并在0700hr给予光照。每 笼放两只动物并可使其自由接近食物和水。所有实验在光照循环期进行。

动物管束。将大鼠放入装有木钉的Plas-Labs塑料笼中以限制其运 动。将矿物油润滑的直肠温度探头(Physitemp，RET-2，Clifton，NJ)插入 每只动物的直肠中。将探头连接到与热电偶选择器(Physitemp，SWT-5) 连接的微探针温度计(Physitemp，BAT-12)上。先让大鼠在笼子里适应1 个小时，然后进行IP注射。

IP注射。将肽(5mg/kg)溶于盐水(1mL/kg)中。平衡期后，对大鼠进 行肽或盐水的IP注射。初始温度值是紧邻注射的前后大鼠平均温度。随 后的测量每30min进行一次，进行5小时。使用GraphPad Prism对每 种肽进行了单因素重复测量ANOVA(one-way repeated measures ANOVA)，然后进行了用于多重比较的Tukey’s事后检验(Tukey’s post hoc test)，以测量显著性。P＜0.05的结果被认为是显著的。

                        实施例9

             ABS201的神经检测的实验方案和结果

实验方案

低体温诱导的剂量-反应曲线。所有动物管束和低体温实验方案同上 文所述。使用GraphPad Prism得到变斜率剂量反应曲线和ED50值。

d-苯异丙胺诱导的过度运动。根据经验，如上文所述将I雄性 Sprague-Dawley大鼠放入笼中。测试前将大鼠处理三天，以使在测试日 实验者所引起的过度运动最小化。在实验中，声和光衰减的自动光电元件 光束活动盒(sound-and light-attenuated automated photocell beam activity chambers)(AccuScan Instruments，Inc.，Columbus，OH)用于测 量运动。将笼子连接到连有IBM计算机的VersaMax分析仪(AccuScan) 上，该IBM计算机使用VersaMax 1.80-0146软件(AccuScan)记录垂直活 动和水平活动。所记录的总活动值为垂直活动和水平活动的和。将大鼠放 入活动盒使其适应1小时并建立基线活动水平。1小时时，取出大鼠，IP 或口服给予肽(N＝7)或盐水(N＝8)，放回该盒中以确定该肽对自发活动水平 的影响。2小时时，取出大鼠并IP注射d-苯异丙胺(1mg/kg)，再放回 该盒中2小时以评估该肽对所诱导的过度运动的影响。

长期测试实验方案。对长期低体温测试而言，每日对大鼠IP注射一 次ABS201(5mg/kg)或盐水，连续进行五天。如上文所述对所诱导的 低体温进行监测并就显著性进行检验。为评估重复给药后ABS201降低 d-苯异丙胺诱导的过兴奋的能力，将大鼠分为三个剂量组：长期组、急性 组和对照组(所有组次N均等于7)。在第1-4天，长期组接受ABS201 (5mg/kg)IP注射，而给予急性组和对照组盐水。在测试日即第五日， 给予长期组和急性组动物ABS201(5mg/kg)，而给予对照组动物盐水。第 五日的测试方案如上所述。僵住状评估。将ABS201(5mg/kg)溶于盐水(1 ml/kg)中。将一直径为5mm的水平棒放在高于笼底7.5cm处。IP注射 给予大鼠肽、盐水或氟哌啶醇(1mg/kg)并将其前爪直接放于棒上。使 大鼠保持该姿势3秒，然后将其释放。测量并记录从被释放到前爪回到笼 底的时间。观察到30sec的截断时间(cut-off time)，这表明动物完全呈 僵住状。每30min重复该测量，持续4小时。

这些评估的结果如下。

剂量-反应曲线。图11示出了IP注射后浓度范围在0.1-10.0mg/kg 的ABS201的剂量-反应曲线。计算得到的ED50值为0.943mg/kg。图12 示出了口服给予浓度范围在10.0-30.0mg/kg的ABS201的低体温反应。

IP给药后d-苯异丙胺诱导过度运动的衰减。对此分析的每个不同时 间阶段进行了剂量×时间的独立两因素ANOVA。阶段由适应阶段(时间 点10-60)、药物阶段(时间点70-120)和苯异丙胺阶段(时间点130-240) 组成。在适应阶段是时间主效应[F(5,185)＝264.335(p＜0.001)]，这表明 不论剂量如何，在一段时间里活动水平逐渐下降。随剂量变化下跌 (collapse)的Tukey’s事后检验表明时间点10-30的活动水平显著高于时 间点40-60(p＜0.001)的。这些结果是由与新环境相关的初始自发探查 性活动所引起的。在药物阶段为时间主效应[F(5,185)＝12.336(p＜0.001)] 和剂量主效应[F(5,37)＝11.775(p＜0.001)]。时间主效应是由于相对于第 一时间点(70min)对于全部剂量，活动均减少所引起的。随剂量变化下 跌的Tukey’s事后检验表明全部剂量的反应显著不同于盐水组(p＜ 0.001)。在苯异丙胺阶段为剂量×时间相互作用[F(55,407)＝4.474(p＜ 0.001)]。Tukey’s事后检验显示：全部ABS201剂量组的活动能力在时间 点130-200被证明比盐水组有所减弱(p＜0.05)。

口服给药后d-苯异丙胺诱导过度运动的衰减。对此分析的每个不同 时间阶段进行剂量×时间的独立双因素ANOVA。阶段与上文所述一致。 在适应阶段是时间主效应[F(5,120)＝201.979(p＜0.001)]，这表明不论剂 量如何，在一段时间里活动水平逐渐下降。随剂量变化下跌的Tukey’s事 后检验表明在每个时间点活动水平显著降低。在药物阶段为剂量×时间相 互作用[F(15,120)＝11.584(p＜0.037)]。随时间变化下跌的Tukey’s事后检 验表明仅有10mg/kg和30mg/kg剂量组的反应显著不同于盐水组(p＜ 0.01)。在苯异丙胺阶段为剂量×时间相互作用[F(11,264)＝35.616(p＜ 0.001)]。Tukey’s事后检验显示：全部剂量组的活动能力在时间点140-180 被证明比盐水组有所减弱(p＜0.05)。另外，20mg/kg和30mg/kg剂量组 在时间点190-200的反应显著低于盐水组。

ABS201长期给药对低体温诱导的影响。每日重复给药后ABS201保 持着显著的CNS效应(表3)，在5天内绝对低体温反应增大。

重复给予ABS201对d-苯异丙胺诱导过兴奋的影响。对本实验的每个 不同时间阶段进行组次×时间的独立双因素ANOVA。阶段与上文所述一 致。在适应阶段是时间主效应[F(5,90)＝146.164(p＜0.001)]，这表明不管 组次如何，在一段时间里活动水平逐渐下降。随剂量变化下跌的Tukey’s 事后检验表明在时间点10-20的活动水平显著高于时间点30-60的(p＜ 0.001)。这些结果是由于大鼠对新环境的适应随时间变化。在药物阶段为 时间主效应[F(5,90)＝13.512(p＜0.001)]和组次主效应[F(2,18)＝4.37(p ＝0.028)]。时间主效应是由于相对于第一时间点(70min)所有剂量组的 活动减少。随时间下跌的Tukey’s事后检验表明在药物阶段仅急性组的反 应显著不同于盐水组(p＜0.05)。在苯异丙胺阶段为组次×时间相互作用 [F(22.198)＝4.069(p＜0.001)]。Tukey’s事后检验显示：急性组和长期组 的活动能力在时间点140-220均被证明较盐水组有所减弱(p＜0.05)。

僵住状评估。在外周给药后ABS201(5mg/kg)和盐水均不能引起僵住 状(N＝5)。氟哌啶醇是一种已知能在大鼠中引起完全僵住状反应的典型 APD，它可引起持续时间超过30秒的僵住状。

                        实施例10

         用于口服生物利用度研究的放射活性ABS201

Fmoc-脯氨酸-OH*的合成(图18)。将L-脯氨酸(20.7mg，0.18mmol) (Advanced Chemtech)溶于450μL 10％Na2CO3溶液中，该Na2CO3溶液 中加入了5mL含有250μCi L-[U-14C]egrada(Moravek，Brea，CA)的 EtOH∶H2O(2∶98)。将溶于3mL二甲氧基乙烷(DME)的Fmoc-N-羟基琥 珀酰亚胺(Fmoc-Osu)(100mg，1.5eq)滴加到搅拌之中的氨基酸溶液。室 温下使该反应搅拌12小时，真空去除DME。用10mL H2O稀释剩余水 溶液，并用饱和N-丁醇(4×10mL)萃取。将丁醇萃取物合并并浓缩得到 苍色油状物。在硅胶上用MeOH∶CH2Cl2(50∶50)洗脱除去残留的 Fmoc-Osu。粗制Fmoc-Proline-OH*无须进一步纯化用于肽合成。

                       实施例11

            ABS201口服生物利用度的方案和研究

Caco-2细胞模型

来源于人结肠直肠癌的Caco-2细胞可自发分化成为具有发育良好的 微绒毛和刷状缘酶的极性细胞(78)。这些特征使得该细胞成为极好的人 小肠模型。已经鉴定出Caco-2细胞模型中的摄入和口服生物利用度之间 关系密切(79)。致力于肽穿过Caco-2细胞的研究已将溶质-溶剂氢键确 定为肽穿透性的主要决定因子。非天然氨基酸技术可用于减少溶质-溶剂 相互作用，具体指通过氢键产生的水溶剂化作用，因此在Caco-2细胞中 本发明的修饰应赋予增强的肠吸收。下文所述研究旨在评估NT(8-13) 类似物的潜在口服生物利用度以及负责其摄入的转运机制。

ABS201是开发NT(8-13)类似物作为新APD的先导化合物。因此， ABS201可作为评估NT(8-13)类似物的细胞摄入原型起作用。液闪计 数(Liquid scintillation counting，LSC)是这些测试的优选分析方法，因 为无需从细胞单层提取该肽，并且溶解细胞组分可直接分析，无须因不准 确而致分析不一致的萃取方案。L-[U-14C]αegrada被用作这些研究的放 射标记。脯氨酸易于在用于肽合成的α-胺处用碱不稳定的Fmoc部分保 护。另外，Pro10尚未被鉴定为NT(8-13)的主要裂解位点。表现出抗精 神病潜能的NT(8-13)类似物并不包括Pro10修饰。

为研究NT(8-13)类似物的细胞摄入的现象和机制，可使用Caco-2 细胞——一种成熟的肠上皮模型。这些研究旨在深入了解这些肽类似物的 口服活性的潜能。如上所述，NT(8-13)类似物在口服给药后引发CNS活 性。它们是表现口服活性的首批NT(8-13)类似物，这些初步研究应该 提供有助于开发未来的口服活性增强的肽类似物的信息。

选择200μM作为用于这些摄入研究的ABS201的浓度有两个不同原 因。20mg/kg剂量的肽投入盐水(1mL/kg)的浓度为24mM。由于管饲 法给药可确保直接给药到胃，应在小肠观察到略低于24mM的浓度。因 此，加至Caco-2细胞的浓度明显低于理论上的体内观察值。另外，大鼠 中标准循环血液体积为64mL/kg(82)。管饲法给药后，20mg/kg剂量肽 循环遍及整只大鼠的浓度是377μM。基于这些原因，确定200μM为体 外研究ABS201摄入的生理相应浓度。

                        实施例12

                      化合物的结构

实施例12中评价的化合物含有一个非天然氨基酸(示意图1)或脱 氨酸(示意图2)。

示意图1.实施例12中使用的非天然氨基酸。

示意图2.实施例12中使用的脱氨烷基酸。

                        基准化合物

对约50个化合物进行初筛所得到的、在表5中所列出的化合物被选 用于作为精神病化合物进行进一步测试和开发。这些化合物以神经降压肽 片段NT(8-13)为基础。这些化合物具有如下有益的特征：均作为竞争 性激动剂在体外结合到NTR-1—涉及精神分裂症的脑神经降压肽受体， 均在IP注射大鼠时显示中枢活性，此时使用低体温作为中枢活性的指示 标准，它也通过NTR-1结合出现，并且在精神分裂症的大鼠行为模型中 引发恰当的活性。

           表5.以NT[8-13]为基础的肽的结构     肽#     结构1     NT(8-13)     ABS13     ABS41     ABS44     ABS46     ABS201     ABS202     ABS203     NH2-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-COOH     N3-L-高赖氨酸-Arg-Pro-Tyr-tertLeu-Leu-COOH     N3-13-Arg-Pro-Tyr-Ile-tertLeu-COOH     N3-7-Arg-Pro-Tyr-Ile-tertLeu-COOH     N3-9-Arg-Pro-Tyr-Ile-tertLeu-COOH     43-Arg-Pro-Tyr-Ile-tertLeu-COOH     28-Arg-Pro-Tyr-Ile-tertLeu-COOH     30-Arg-Pro-Tyr-Ile-tertLeu-COOH

1肽结构中的黑体数字指示意图1和2中所示非天然Arg和Lys残基。

为进一步表征这些化合物，口服给予和IP给予每个化合物评价低体 温诱导(NTR-1受体结合)活性。如表6所示，除ABS201外的所有化合物 表现出＜10％的口服活性。引人注意的是，与现有活性最强的化合物相比， ABS201口服活性升高了300％。另外，相比IP给药ABS201在口服给药 时反应更快。这在NT(8-13)衍生物中是独特的。

表6.IP和口服给药后NT(8-13)类似物的低体温效应。  肽         IP给药a tmax c(min) Δin BTd(℃)       口服给药b tmax c(min) Δin BTd(℃)    近似的    口服  盐水  ABS13  ABS31  ABS44  ABS46  ABS201  ABS202  ABS203 240        -0.60± 150        -4.26± 180        -6.87± 150        -5.07± 180        -4.68± 150        -2.51± 150        -3.75± 300        -3.84± 180        -0.64± 90         -1.66± 150        -1.05± 150        -1.58± 180        -2.03± 90         -2.49± 120        -1.09± 150        -1.30±    NA      NA          NA    NA

a所有肽的IP剂量为5mg/kg。

b所有肽的口服剂量为20mg/kg。

ctmax(min)＝温度下降最多时的时间。

dΔin BT(℃)＝在tmax测量的体温下降值

e表示显著反应(p＜0.05)。

f近似口服生物利用度可从每种给药方案的低体温曲线的相对面积计 算得到，并以所给予化合物的量进行校正。

gNA＝不明显(即口服给药相对于基线不显著)。

                     ABS201的行为效应

用于评价具有抗精神病潜能的分子的“黄金标准”动物模型是对苯异 丙胺诱导过度运动的抑制。不论是IP注射还是口服给药，ABS201具有 剂量依赖形式活性(图13和14)。ABS201的作用在IV和PO给药后是明 显的、剂量依赖的和长效的(给药后1小时即可观察到，并且至少在再一 小时内是明显的)。

在大鼠中检测了ABS201和氟哌啶醇对僵住状的影响。对大鼠 (N＝5)IP注射ABS201(5mg/kg)或氟哌啶醇(1mg/kg)。2小时后，使用水 平棒测试测量僵住状。数据为平均值+/-SEM(p＜0.01)。ABS201并不会 引起大鼠的僵住状态(图15)，不会对抗伤害感受，并且通过监测低体温或 对苯异丙胺诱导过度运动的抑制并没有发现对多次给药的耐受性(图16 和17)。因此，IV和PO给药后，ABS201确实在啮齿动物中引起了低体 温。ABS201的作用是：剂量依赖的，长效的，给药后3-4小时内可观察 到。产生低体温的剂量与逆转d-苯异丙胺反应的剂量即便不相同也是相 近的。

对3只雄性大鼠和3只雌性大鼠的口服给药和静脉内给药进行了观 察，给予每只大鼠溶于中性生理盐水的50mg/kg(IV)或250mg/kg(PO) ABS201 HCl。在给药后2和24小时临床观察期测量了核心体温。

在静脉内给予ABS201期间以及随后邻近时间内观察到如下现象：给 药期间(通过尾静脉慢推，＞1min＜2min)，给予ABS201 HCl的动物在 身体管束笼中变得显著安静；离开管束笼后，动物明显安静，缺乏自发的 桌面活动能力，处理后呈现为卷曲姿势，并表现出翻正反射严重受到损伤 或失去翻正反射；尽管如此，但不存在上睑下垂；没有弛缓性麻痹的迹象， 尽管肌紧张被显著降低；出现瞳孔反射；后肢收缩反应(pinch response) 受损或不存在；没有副交感反应例如自然排尿、排便、分泌唾液的迹象， 并且不能流泪；没有急性交感反应例如竖毛的迹象；没有强直性或阵挛性 癫痫发作的迹象。急性效应时间短暂，仅持续到在整个给药时期(约30 min)结束翻正反射得以恢复时。在给药后两小时观察期，尽管存在显著 的低体温，但是所有动物看上去十分正常。在给药后24小时观察期，不 存在低体温，所有的动物看上去十分正常。口服给予ABS201 HCl的动物 在所有时间点看上去都十分正常。因此，这些证据表明静脉内给予 ABS201 HCl(50mg/kg)后动物的急性行为表现和反应可直接归因于快速 显著的中枢神经系统效应。

ABS201的临床前研究

受体筛选

针对下述16种受体分别对三个不同浓度的ABS201(10-9，10-7 10-5M) 进行了筛选：肾上腺素能(α1、α2、β)、多巴胺、组胺(H1，H2，H3)、毒 蕈碱(中枢、外周)、烟碱、阿片样物质(非选择性)、孤肽、5-羟色胺(运载 体，非选择性)、单胺氧化酶(A、B)。未观察到受体的内源性底物的置换。 因此，ABS201似乎不与这其中的任何受体结合。相反，ABS201对靶受 体(NTR1)具有nM亲和力。

血液分布和代谢产物鉴定

将ABS201加入新鲜分离的大鼠全血中使其浓度为100μg/mL，使 其分配，离心除去细胞碎片。该浓度下的ABS201几乎均匀分布在细胞碎 片和血清部分之间。未检测到ABS201的代谢产物，这与先前证实血清/ 血浆的半衰期非常长的实验相一致。

最大耐受剂量

将ABS201给予大鼠，IV剂量最高达100mg/kg，口服剂量最高达 500mg/kg。给药后48小时后未观察到化合物的副作用(体重减轻、死亡、 一系列异常临床评估结果)。因此，这些实验确定了ABS201的MTD的 下限为抗精神病和其它反映大脑活性的测试中化合物的ED50的100倍。

ABS201的药物代谢动力学和脑分布

将ABS201以一个IV剂量(5mg/kg)或口服剂量(50mg/kg)给予大鼠。 在所选时间点取血或获取脑，确定化合物的浓度。证实了IV和口服给药 后最长达120分钟均能在血液和脑中检测到ABS201。脑中的量足以使 NTR-1饱和从而产生所观察到的行为效应。

向未禁食的大鼠IV给予1mg/kg、口服给予30mg/kgABS201后研 究了ABS201的血浆和脑药物代谢动力学。该研究的结果表明：IV给药 后ABS201快速从血浆中清除，t1/2为约5分钟；化合物的水平在45min 后下降至低于LLOD；口服给药后在所有时间ABS201的水平都低于 LLOD；IV和PO给药后在所有时间脑中ABS201的水平均低于LLOD。

还研究了ABS201的体外代谢和房室化以评价血液中ABS201的分布 情况、血浆中蛋白结合的程度，并获得血液和血浆中ABS201代谢的初步 评估。该研究的结果证实：37℃孵育5或30min后少有或没有ABS201 结合到血浆蛋白上；37℃孵育5或30min后全血或血浆中ABS201没有 代谢的迹象；和，全血与ABS201在37℃孵育5或30min时约33％的 ABS201快速分布到血液细胞组分中。

还评估了向禁食大鼠IV给予5mg/kg和PO给予50mg/kg ABS201 后ABS201的全血和脑药物代谢动力学。该研究的结果表明：ABS201分 两相(初始相和第二相)从全血中清除，其中IV给予5mg/kg后最长达 120分钟可检测到较低水平的化合物；口服给予化合物(50mg/kg)后在所 有时间全血中ABS201的水平低于LLOD；IV给药后在所有时间脑中 ABS201的水平低于LLOD；并且口服给予50mg/kg后15分钟在三分之 二动物的脑中检测到可测量量的ABS201。

总结

用甲基脱氨衍生物43(示意图2)取代ABS13N-端的高赖氨酸α叠 氮基基团(示意图1)生成ABS201可获得具有潜在抗精神病药物的重要 特征的分子。具体而言，口服给药时ABS201显示出升高300％的中枢活 性，并且相比于IV注射，口服获得更快的反应。这些独特的特征是由可 归因于脱氨修饰。

评估了ABS201的体外和体内药物代谢动力学、房室化和可能的代 谢。这些结果暗示很少或没有代谢以及复杂的药物代谢动力学，这表明该 化合物最初经历了快速从血液中清除，然后是持续时间较长的深度房室现 象。

此外，IV和PO给药后ABS201的药效反应是长效的(2-4hr)；IV ABS201的急性效应通过中枢神经系统调节；与血浆或全血一起孵育后， 该化合物似乎并不被代谢；在体外ABS201在水相和细胞相分配；全血中 ABS201的PK状况与两相清除过程相一致；并且所观察到的药效反应同 样也与两相清除过程相一致。

考虑到大鼠脑中ABS201的较长的明显的半衰期(给药后6小时仍可 检测)，以及药物在血液组分中形成储备(即药物缓释给药系统)的证据， 本发明的化合物例如半合成肽ABS201，可每天给予一次或两次。

本发明的其它优点一部分可从说明书中获悉，或者可通过本发明的实 施获知。本发明的优点可藉特别在所附权利要求书中所指出的元件和组合 实现和获得。

                     优先权的要求

本专利文件要求2004年6月17日提交的、系列号为60/581,333的 美国临时专利申请的优先权权益，该申请通过援引纳入本申请。

                        参考文献

下列文献提供了背景信息、合成信息、科学信息、实验方案和相关 公开。每一篇文献的全部内容如被完全重复那样被纳入本申请中作为本申 请的完整部分，并且本申请所引用的全部出版物、专利和专利申请通过援 引纳入本申请中。

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通篇申请中引用了出版物，这些出版物的公开通过援引在此全文纳 入本申请中，以更为充分地描述与本发明相关的现有技术。