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用于生产特定长度脂肪醇及相关化合物的微生物和方法
申请号 CN201380065497.9 申请日 2013-10-14 公开(公告)号 CN104884629A 公开(公告)日 2015-09-02
申请人 基因组股份公司; 发明人 罗宾·E·奥斯特豪特; A·P·博加德;
摘要 本 发明 提供含有脂肪醇、脂肪 醛 或 脂肪酸 途径的非天然存在的 微 生物 ，其中所述微生物选择性产生具有特定长度的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。另外还提供的是具有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的非天然存在的微生物，其中所述微生物还包括乙酰-CoA途径。在有些方面，本发明的微生物具有增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产的选择基因破坏或酶衰减。本发明另外还提供使用上述微生物生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的方法。
权利要求

1.非天然存在的微生物，其具有丙二酰-CoA非依赖性脂肪酰-CoA延长(MI-FAE)循环和/或丙二酰-CoA依赖性脂肪酰-CoA延长(MD-FAE)循环与终止途径的组合，
其中所述MI-FAE循环包含一种或多种硫解酶、一种或多种3-氧代酰基-CoA还原酶、一种或多种3-羟基酰基-CoA脱水酶及一种或多种烯酰-CoA还原酶，
其中所述MD-FAE循环包含一种或多种延长酶、一种或多种3-氧代酰基-CoA还原酶、一种或多种3-羟基酰基-CoA脱水酶及一种或多种烯酰-CoA还原酶，
其中所述终止途径包含选自以下的途径：
(1)1H；
(2)1K和1L；
(3)1E和1N；
(4)1K,1J和1N；
(5)1E；
(6)1K和1J；
(7)1H和1N；
(8)1K,1L和1N；
(9)1E和1F；
(10)1K,1J和1F；
(11)1H,1N和1F；
(12)1K,1L,1N和1F；和
(13)1G,
其中1E是酰基-CoA还原酶(醛形成)，其中1F是醇脱氢酶，其中1G是酰基-CoA还原酶(醇形成)，其中1H是酰基-CoA水解酶、酰基-CoA转移酶或酰基-CoA合酶，其中1J是酰基-ACP还原酶，其中1K是酰基-CoA:ACP酰基转移酶，其中1L是硫酯酶，其中1N是醛脱氢酶(酸形成)或羧酸还原酶，
其中所述MI-FAE循环、MD-FAE循环或终止途径的酶由至少一种外源核酸编码且以足以产生式(I)的化合物的量表达：
其中R1为C1-24直链烷基；R2为CH2OH、CHO或COOH；R3为H、OH或氧代(＝O)；且代表单键或双键，前提条件是R3所连接的碳原子的化合价为四价，
其中该MI-FAE循环、MD-FAE循环和该终止途径的所述酶中的每一种酶的底物独立地选自式(II)的化合物、丙二酰-CoA、丙酰-CoA或乙酰-CoA：
其中R1为C1-24直链烷基；R3为H、OH或氧代(＝O)；R4为S-CoA、ACP、OH或H；且代表单键或双键，前提条件是R3所连接的碳原子的化合价为四价；
其中该MI-FAE循环的所述一种或多种酶各自对R1上的碳原子数不大于所述式(I)化合物的R1上的碳原子数的式(II)化合物具有选择性，
其中该MD-FAE循环的所述一种或多种酶各自对R1上的碳原子数不大于所述式(I)化合物的R1上的碳原子数的式(II)化合物具有选择性，和
其中该终止途径的所述一种或多种酶各自对R1上的碳原子数不小于所述式(I)化合物的R1上的碳原子数的式(II)化合物具有选择性。
2.权利要求1的非天然存在的微生物，其中R1为C1-17直链烷基。
3.权利要求2的非天然存在的微生物，其中R1为C9直链烷基、C10直链烷基、C11直链烷基、C12直链烷基或C13直链烷基。
4.权利要求1的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含二、三或四种外源核酸，各自编码所述MI-FAE循环或所述MD-FAE循环的酶。
5.权利要求1的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含二、三或四种外源核酸，各自编码所述终止途径的酶。
6.权利要求3的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含编码选自(1)-(13)的途径中的至少一种途径的各种酶的外源核酸。
7.权利要求1的非天然存在的微生物，其中所述至少一种外源核酸是异源核酸。
8.权利要求1的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物是在基本上厌氧的培养基中。
9.权利要求1的非天然存在的微生物，其中该MI-FAE循环、MD-FAE循环或终止途径的所述酶以足以产生选自式(III)-(VI)的化合物的量表达：
其中R1为C1-17直链烷基。
10.权利要求9的非天然存在的微生物，其中R1为C9直链烷基、C10直链烷基、C11直链烷基、C12直链烷基或C13直链烷基。
11.权利要求1的非天然存在的微生物，其中所述微生物还包含乙酰-CoA途径和至少一种编码以足以产生乙酰-CoA的量表达的乙酰-CoA途径酶的外源核酸，其中所述乙酰-CoA途径包含选自以下的途径：
(1)2A和2B；
(2)2A,2C和2D；
(3)2H；
(4)2G和2D；
(5)2E,2F和2B；
(6)2E和2I；
(7)2J,2F和2B；
(8)2J和2I；
(9)3A,3B和3C；
(10)3A,3B,3J,3K和3D；
(11)3A,3B,3G和3D；
(12)3A,3F和3D；
(13)3N,3H,3B和3C；
(14)3N,3H,3B,3J,3K和3D；
(15)3N,3H,3B,3G和3D；
(16)3N,3H,3F和3D；
(17)3L,3M,3B和3C；
(18)3L,3M,3B,3J,3K和3D；
(19)3L,3M,3B,3G和3D；
(20)3L,3M,3F和3D；
(21)4A,4B,4D,4H,4I和4J；
(22)4A,4B,4E,4F,4H,4I和4J；
(23)4A,4B,4E,4K,4L,4H,4I和4J；
(24)4A,4C,4D,4H和4J；
(25)4A,4C,4E,4F,4H和4J；
(26)4A,4C,4E,4K,4L,4H和4J；
(27)5A,5B,5D和5G；
(28)5A,5B,5E,5F和5G；
(29)5A,5B,5E,5K,5L和5G；
(30)5A,5C和5D；
(31)5A,5C,5E和5F；和
(32)5A,5C,5E,5K和5L,
其中2A是丙酮酸氧化酶(乙酸形成)，其中2B是乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA连接酶或乙酰-CoA转移酶，其中2C是乙酸激酶，其中2D是磷酸转乙酰酶，其中2E是丙酮酸脱羧酶，其中2F是乙醛脱氢酶，其中2G是丙酮酸氧化酶(乙酰-磷酸形成)，其中2H是丙酮酸脱氢酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸:NAD(P)H氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合酶，其中2I是乙醛脱氢酶(酰基化)，其中2J是苏氨酸醛缩酶，其中3A是磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶或PEP羧激酶，其中3B是草酰乙酸脱羧酶，其中3C是丙二酸半醛脱氢酶(乙酰基化)，其中3D是乙酰-CoA羧化酶或丙二酰-CoA脱羧酶，其中3F是草酰乙酸脱氢酶或草酰乙酸氧化还原酶，其中3G是丙二酸半醛脱氢酶(酰基化)，其中3H是丙酮酸羧化酶，其中3J是丙二酸半醛脱氢酶，其中3K是丙二酰-CoA合成酶或丙二酰-CoA转移酶，其中3L是苹果酸酶，其中3M是苹果酸脱氢酶或苹果酸氧化还原酶，其中3N是丙酮酸激酶或PEP磷酸酶，其中4A是柠檬酸合酶，其中4B是柠檬酸转运体，其中4C是柠檬酸/苹果酸转运体，其中
4D是ATP柠檬酸裂合酶，其中4E是柠檬酸裂合酶，其中4F是乙酰-CoA合成酶或乙酰-CoA转移酶，其中4H是细胞溶质苹果酸脱氢酶，其中4I是苹果酸转运体，其中4J是线粒体苹果酸脱氢酶，其中4K是乙酸激酶，其中4L是磷酸转乙酰酶，其中5A是柠檬酸合酶，其中5B是柠檬酸转运体，其中5C是柠檬酸/草酰乙酸转运体，其中5D是ATP柠檬酸裂合酶，其中5E是柠檬酸裂合酶，其中5F是乙酰-CoA合成酶或乙酰-CoA转移酶，其中5G是草酰乙酸转运体，其中5K是乙酸激酶，和其中5L是磷酸转乙酰酶。
12.权利要求11的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含二、三、四、五、六、七或八种外源核酸，各自编码乙酰-CoA途径酶。
13.权利要求12的非天然存在的微生物，其中所述微生物包含编码选自(1)-(32)的途径中的至少一种途径的各种乙酰-CoA途径酶的外源核酸。
14.权利要求1的非天然存在的微生物，其还包含一个或多个基因破坏，所述一个或多个基因破坏在编码参与以下的蛋白质或酶的内源基因中出现：由所述微生物天然产生乙醇、甘油、乙酸、甲酸、乳酸、CO2、脂肪酸或丙二酰-CoA；途径中间体向除细胞溶质以外的细胞区室转移；或由所述微生物天然降解MI-FAE循环中间体、MD-FAE循环中间体或终止途径中间体，其中所述一个或多个基因破坏使得所述微生物中的该式(I)化合物的产生增加。
15.权利要求14的非天然存在的微生物，其中所述蛋白质或酶选自由脂肪酸合酶、乙酰-CoA羧化酶、生物素:脱辅基酶连接酶、酰基载体蛋白、硫酯酶、酰基转移酶、ACP丙二酰基转移酶、脂肪酸延长酶、酰基-CoA合成酶、酰基-CoA转移酶、酰基-CoA水解酶、丙酮酸脱羧酶、乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、酸形成醛脱氢酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、丙酮酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸磷酸酶、线粒体丙酮酸载体、过氧化物酶体脂肪酸转运体、过氧化物酶体酰基-CoA转运体、过氧化物酶体肉毒碱/酰基肉毒碱转移酶、酰基-CoA氧化酶和酰基-CoA结合蛋白组成的组。
16.权利要求1的非天然存在的微生物，其中该MI-FAE循环、MD-FAE循环或该终止途径的一种或多种酶优先与NADH辅因子反应或者就与NAD(P)H辅因子反应而言具有减少的优先性，其中该MI-FAE循环或MD-FAE循环的所述一种或多种酶是3-酮酰基-CoA还原酶或烯酰-CoA还原酶，和其中该终止途径的所述一种或多种酶选自酰基-CoA还原酶(醛形成)、醇脱氢酶、酰基-CoA还原酶(醇形成)、醛脱羰基酶、酰基-ACP还原酶、醛脱氢酶(酸形成)和羧酸还原酶。
17.权利要求1的非天然存在的微生物，其还包含一个或多个基因破坏，所述一个或多个基因破坏在编码蛋白质或酶的基因中出现，该蛋白质或酶导致存在于所述微生物的细胞溶质中的NAD(P)H与NAD(P)的比率在所述破坏之后增加。
18.权利要求17的非天然存在的微生物，其中所述基因编码导致存在于所述微生物的细胞溶质中的NAD(P)H与NAD(P)的比率在所述破坏之后增加的蛋白质或酶，该蛋白质或酶选自由NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸磷酸酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、醛脱氢酶(酸形成)、乳酸脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸:
醌氧化还原酶、苹果酸酶和苹果酸脱氢酶组成的组。
19.权利要求14或17的非天然存在的生物体，其中所述一个或多个基因破坏包含所述一个或多个基因的缺失。
20.权利要求1的非天然存在的微生物，其中所述微生物是克拉布特里阳性的且是在包含过量葡萄糖的培养基中，从而增加存在于所述微生物的细胞溶质中的NAD(P)H与NAD(P)的比率。
21.权利要求1的非天然存在的微生物，其还包含至少一种编码式(I)的化合物的细胞外转运体或细胞外转运系统的外源核酸。
22.权利要求1的非天然存在的微生物，其中一种或多种参与以下的内源酶具有衰减的酶活性或表达水平：由所述微生物天然产生乙醇、甘油、乙酸、甲酸、乳酸、CO2、脂肪酸或丙二酰-CoA；途径中间体向除细胞溶质以外的细胞区室转移；或由所述微生物天然降解MI-FAE循环中间体、MD-FAE循环中间体或终止途径中间体。
23.权利要求22的非天然存在的微生物，其中所述酶选自由脂肪酸合酶、乙酰-CoA羧化酶、生物素:脱辅基酶连接酶、硫酯酶、酰基载体蛋白、硫酯酶、酰基转移酶、ACP丙二酰基转移酶、脂肪酸延长酶、酰基-CoA合成酶、酰基-CoA转移酶、酰基-CoA水解酶、丙酮酸脱羧酶、乳酸脱氢酶、短链醇脱氢酶、酸形成醛脱氢酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、丙酮酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸磷酸酶、线粒体丙酮酸载体、过氧化物酶体脂肪酸转运体、过氧化物酶体酰基-CoA转运体、过氧化物酶体肉毒碱/酰基肉毒碱转移酶、酰基-CoA氧化酶和酰基-CoA结合蛋白组成的组。
24.权利要求1的非天然存在的微生物，其中一种或多种参与NAD(P)H或NADH氧化的内源酶具有衰减的酶活性或表达水平。
25.权利要求24的非天然存在的微生物，其中所述一种或多种内源酶选自由NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸磷酸酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、醛脱氢酶(酸形成)、乳酸脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸:醌氧化还原酶、苹果酸酶和苹果酸脱氢酶组成的组。
26.用于生产式(I)的化合物的方法：
其中R1为C1-24直链烷基；R2为CH2OH、CHO或COOH；R3为H、OH或氧代(＝O)；且代表单键或双键，前提条件是R3所连接的碳原子的化合价为四价，包括将权利要求1-25中任一项的非天然存在的微生物在足以产生所述式(I)的化合物的条件下培养足够的时间周期。
27.权利要求26的方法，其中所述方法还包括将该式(I)的化合物与培养物中的其它组分分离开。
28.权利要求27的方法，其中所述分离包括萃取、连续液-液萃取、渗透蒸发、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换层析、吸附层析或超滤。
29.培养基，包含生物来源的式(I)的化合物：
其中R1为C1-24直链烷基；R2为CH2OH、CHO或COOH；R3为H、OH或氧代(＝O)；且代表单键或双键，前提条件是R3所连接的碳原子的化合价为四价，其中所述生物来源的化合物具有反映大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。
30.权利要求29的培养基，其中将所述培养基与具有丙二酰-CoA非依赖性脂肪酰-CoA延长(MI-FAE)循环和/或丙二酰-CoA依赖性脂肪酰-CoA延长(MD-FAE)循环与终止途径组合的非天然存在的微生物分离开。
31.生物来源的式(I)的化合物：
其中R1为C1-24直链烷基；R2为CH2OH、CHO或COOH；R3为H、OH或氧代(＝O)；且代表单键或双键，前提条件是R3所连接的碳原子的化合价为四价，其具有反映大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。
32.权利要求31的生物来源的化合物，其中所述生物来源的化合物的Fm值为至少
80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。
33.根据权利要求26-28中任一项的方法生产的生物来源的化合物。
34.组合物，包含权利要求31-33中任一项的生物来源的化合物和除所述生物来源的化合物以外的化合物。
35.权利要求34的组合物，其中所述的除所述生物来源的化合物以外的化合物是具有丙二酰-CoA非依赖性脂肪酰-CoA延长(MI-FAE)循环和/或丙二酰-CoA依赖性脂肪酰-CoA延长(MD-FAE)循环与终止途径组合的非天然存在的微生物的痕量细胞部分。
36.组合物，包含权利要求31-33中任一项的生物来源的化合物或其细胞溶解物或培养物上清液。
37.生物基产品，包含权利要求31-33中任一项的生物来源的化合物，其中所述生物基产品是生物燃料、化学品、聚合物、表面活性剂、皂、洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、香料、调味物质或丙烯酸酯。
38.权利要求37的生物基产品，包含至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少
40％或至少50％的所述生物来源的化合物。
39.权利要求37或38的生物基产品，其中所述生物基产品包含所述生物来源的化合物的一部分作为重复单元。
40.通过模制权利要求37-39中任一项的生物基产品获得的模制产品，生物基产品是聚合物。
41.用于生产权利要求37-39中任一项生物基产品的工艺，包括使所述生物来源的化合物在生产所述生物基产品的反应中与其自身或另一种化合物发生化学反应。
说明书全文

用于生产特定长度脂肪醇及相关化合物的微生物和方法

[0001] 本申请要求2012年10月15日申请的美国临时申请顺序号61/714,144的优先权的权益，该美国临时申请的全部内容通过引用结合到本文中。
[0002] 发明背景
[0003] 本发明总的来讲涉及生物合成过程，更准确地讲涉及具有特定长度脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成能力的生物体。
[0004] 伯醇是一类具有多种工业应用的化合物产品，其包括多种生物燃料和特殊化学品。伯醇也可以用于制造许多其它工业产品，包括聚合物和表面活性剂。例如，高级伯醇
(也称为脂肪醇(C4-C24))及其乙氧基化物在世界范围内用作许多家用洗涤剂、清洁产品和
个人护理产品(例如洗衣粉和洗衣液、洗碟液和硬面清洁剂)中的表面活性剂。它们也用
于制造多种工业化学品及用于润滑油添加剂。特定长度脂肪醇(例如辛醇和己醇)具有适
用的感官特性且已长期用作香料和调味物质。较小链长C4-C8醇(例如丁醇)用作用于生
产油漆、涂料和胶粘剂应用中的衍生物(例如丙烯酸酯)的化学中间体。
[0005] 脂肪醇目前由例如脂肪酸加氢、末端烯烃加氢甲酰化、正石蜡部分氧化和乙烯的Al催化聚合来生产。遗憾的是，直接由基于石油的直链烃(正石蜡)氧化来生产脂肪醇在
商业上不可行。此不切实际是因为正石蜡氧化主要产生仲醇、叔醇或酮或这些化合物的混
合物，但不产生高收率的脂肪醇。另外，目前已知的用于生产脂肪醇的方法受以下缺陷的困
扰：其限于相对昂贵的原料，尤其是经由石油热裂解来生产的乙烯。另外，目前的方法需要
若干步骤和若干催化剂类型。
[0006] 通过微生物的脂肪醇生产涉及脂肪酸合成，继而酰基还原步骤。已研究在大多数细胞中存在的通用脂肪酸生物合成途径用于生产脂肪醇和其它脂肪酸衍生物。目前可实现
大量改良以向脂肪醇生产提供更有效的生物合成途径，并使得理论产物和能量产率显著更
高。
[0007] 因此，存在对有效生产商业数量的脂肪醇的替代方法的需求。本发明满足了这种需求，也提供了有关优势。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明提供含有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的非天然存在的微生物(non-naturally occurring microbial organisms)。在有些实施方案中，本发明的非天然
存在的微生物具有如图1、图6和图7中所描绘的丙二酰-CoA非依赖性脂肪酰-CoA延长
(MI-FAE)循环和/或丙二酰-CoA依赖性脂肪酰-CoA延长(MD-FAE)循环与终止途径的组
合，其中所述MI-FAE循环、MD-FAE循环或终止途径的酶由至少一种外源核酸编码且以足以
产生式(I)的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的量表达：
[0010]
[0011] 其中R1为C1-24直链烷基；R2为CH2OH、CHO或COOH；R3为H、OH或氧代(＝O)；且代表单键或双键，前提条件是R3所连接的碳原子的化合价为四价，其中该MI-FAE循
环、该MD-FAE循环和该终止途径的所述酶中的每一种酶的底物独立地选自式(II)的化合
物、丙二酰-CoA、丙酰-CoA或乙酰-CoA：
[0012]
[0013] 其中R1为C1-24直链烷基；R3为H、OH或氧代(＝O)；R4为S-CoA、ACP、OH或H；且代表单键或双键，前提条件是R3所连接的碳原子的化合价为四价；其中该MI-FAE循
环的所述一种或多种酶各自对R1上的碳原子数不大于所述式(I)化合物的R1上的碳原子
数的式(II)化合物具有选择性，其中该MD-FAE循环的所述一种或多种酶各自对R1上的碳
原子数不大于所述式(I)化合物的R1上的碳原子数的式(II)化合物具有选择性，和其中
该终止途径的所述一种或多种酶各自对R1上的碳原子数不小于所述式(I)化合物的R1上
的碳原子数的式(II)化合物具有选择性。
[0014] 在有些实施方案中，本发明提供具有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的非天然存在的微生物，其中所述微生物还包括乙酰-CoA途径和至少一种编码以足以产生乙酰-CoA的
量表达的乙酰-CoA途径酶的外源核酸，其中所述乙酰-CoA途径包括图2、3、4或5中所示
的途径。
[0015] 在有些实施方案中，本发明提供具有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的非天然存在的微生物，其中所述微生物具有一个或多个基因破坏，其中所述一个或多个基因破坏在编
码参与以下的蛋白质或酶的内源基因中出现：由所述微生物天然产生乙醇、甘油、乙酸、甲
酸、乳酸、CO2、脂肪酸或丙二酰-CoA；途径中间体向除细胞溶质(cytosol)以外的细胞区室
转移；或由该微生物天然降解MI-FAE循环中间体、MD-FAE循环中间体或终止途径中间体，
所述一个或多个基因破坏使得该微生物中的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的产生增加。
[0016] 在有些实施方案中，本发明提供具有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的非天然存在的微生物，其中该MI-FAE循环、该MD-FAE循环或该终止途径的一种或多种酶优先与NADH
辅因子反应或就与NAD(P)H辅因子反应而言具有减少的优先性。
[0017] 在有些实施方案中，本发明提供具有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的非天然存在的微生物，其中所述微生物在编码蛋白质或酶的基因中具有一个或多个基因破坏，该蛋白
质或酶导致存在于该微生物的细胞溶质中的NAD(P)H与NAD(P)的比率在该破坏之后增加。
[0018] 在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物是克拉布特里(Crabtree)阳性的且是在包含过量葡萄糖的培养基中。在这样的条件下。如本文中所述，该微生物能导
致增加存在于该微生物的细胞溶质中的NAD(P)H与NAD(P)的比率。
[0019] 在有些实施方案中，本发明提供具有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的非天然存在的微生物，其中所述微生物具有至少一种编码本发明的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的细胞外
转运体或细胞外转运系统的外源核酸。
[0020] 在有些实施方案中，本发明提供具有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的非天然存在的微生物，其中所述微生物就参与以下的一种或多种内源酶而言具有衰减的酶活性或表达
水平：由所述微生物天然产生乙醇、甘油、乙酸、甲酸、乳酸、CO2、脂肪酸或丙二酰-CoA；途径
中间体向除细胞溶质以外的细胞区室转移；或由所述微生物天然降解MI-FAE循环中间体、
MD-FAE循环中间体或终止途径中间体。
[0021] 在有些实施方案中，本发明提供具有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的非天然存在的微生物，其中所述微生物就参与NAD(P)H或NADH氧化的一种或多种内源酶而言具有衰减
的酶活性或表达水平。
[0022] 本发明另外还提供使用上述微生物生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的方法，即将含有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的非天然存在的微生物在足以产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪
酸的条件下培养足够的时间周期。
[0023] 附图简述
[0024] 图1显示用于由MI-FAE循环或MD-FAE循环的酰基-CoA中间体产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的示例性MI-FAE循环和/或MD-FAE循环与终止途径的组合。酶是：A.硫解酶；
B.3-氧代酰基-CoA还原酶；C.3-羟基酰基-CoA脱水酶；D.烯酰-CoA还原酶；E.酰基-CoA
还原酶(醛形成)；F.醇脱氢酶；G.酰基-CoA还原酶(醇形成)；H.酰基-CoA水解酶、转
移酶或合酶(synthase)；J.酰基-ACP还原酶；K.酰基-CoA:ACP酰基转移酶；L.硫酯酶；
N.醛脱氢酶(酸形成)或羧酸还原酶；和O.延长酶(Elongase)。
[0025] 图2显示用于由丙酮酸或苏氨酸产生细胞溶质乙酰-CoA的示例性途径。酶是：A.丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；B.乙酰-CoA合成酶(synthetase)、连接酶或转移酶；C.乙
酸激酶；D.磷酸转乙酰酶；E.丙酮酸脱羧酶；F.乙醛脱氢酶；G.丙酮酸氧化酶(乙酰-磷
酸形成)；H.丙酮酸脱氢酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸:NAD(P)H氧化还原酶
或丙酮酸甲酸裂合酶；I.乙醛脱氢酶(酰基化)；和J.苏氨酸醛缩酶。
[0026] 图3显示用于由磷酸烯醇丙酮酸(PEP)产生乙酰-CoA的示例性途径。酶是：A.PEP羧化酶或PEP羧激酶；B.草酰乙酸脱羧酶；C.丙二酸半醛脱氢酶(乙酰基化)；D.乙酰-CoA
羧化酶或丙二酰-CoA脱羧酶；F.草酰乙酸脱氢酶或草酰乙酸氧化还原酶；G.丙二酸半醛
脱氢酶(酰基化)；H.丙酮酸羧化酶；J.丙二酸半醛脱氢酶；K.丙二酰-CoA合成酶或转移
酶；L.苹果酸酶；M.苹果酸脱氢酶或氧化还原酶；和N.丙酮酸激酶或PEP磷酸酶。
[0027] 图4显示用于使用柠檬酸和苹果酸转运体由线粒体乙酰-CoA产生细胞溶质乙酰-CoA的示例性途径。酶是：A.柠檬酸合酶；B.柠檬酸转运体；C.柠檬酸/苹果酸转运体；
D.ATP柠檬酸裂合酶；E.柠檬酸裂合酶；F.乙酰-CoA合成酶或转移酶；H.细胞溶质苹果酸
脱氢酶；I.苹果酸转运体；J.线粒体苹果酸脱氢酶；K.乙酸激酶；和L.磷酸转乙酰酶。
[0028] 图5显示用于使用柠檬酸和草酰乙酸转运体由线粒体乙酰-CoA产生细胞溶质乙酰-CoA的示例性途径。酶是：A.柠檬酸合酶；B.柠檬酸转运体；C.柠檬酸/草酰乙酸转运
体；D.ATP柠檬酸裂合酶；E.柠檬酸裂合酶；F.乙酰-CoA合成酶或转移酶；G)草酰乙酸转
运体；K)乙酸激酶；和L)磷酸转乙酰酶。
[0029] 图6显示用于延长R1的直链烷基的示例性MI-FAE循环和/或MD-FAE循环。酶是：A.硫解酶；B.3-酮酰基-CoA还原酶；C.3-羟基酰基-CoA脱水酶；D.烯酰-CoA还原酶；
和E.延长酶。
[0030] 图7显示用于由图6的MI-FAE循环中间体或MD-FAE循环中间体中的任一个产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的示例性终止循环。酶是：E.MI-FAE/MD-FAE中间体-CoA还原
酶(醛形成)；F.醇脱氢酶；G.MI-FAE/MD-FAE中间体-CoA还原酶(醇形成)；H.MI-FAE/
MD-FAE中间体-CoA水解酶、转移酶或合酶；J.MI-FAE/MD-FAE中间体-ACP还原酶；
K.MI-FAE/MD-FAE中间体-CoA:ACP酰基转移酶；L.硫酯酶；和N.醛脱氢酶(酸形成)或羧
酸还原酶。R1为C1-24直链烷基；R3为H、OH或氧代(＝O)；且 代表单键或双键，前
提条件是R3所连接的碳原子的化合价为四价。
[0031] 图8显示可使用图6中描绘的循环和图7中描绘的终止途径由四种MI-FAE或MD-FAE循环中间体产生的示例性化合物。R为C1-24直链烷基。
[0032] 图9描绘在用包含编码各种MI-FAE循环和终止途径酶的基因的质粒转化的酿酒酵母(S.cerevisiae)中在有或无pflAV或PDH旁路的情况下1,3-丁二醇(图9A)或乙醇
(图9B)的产生，如实施例X中所提供。
[0033] 图10描绘在用包含编码各种MI-FAE循环和终止途径酶的基因的质粒转化的酿酒酵母中在有或无pflAV或PDH旁路的情况下丙酮酸(图10A)、琥珀酸(图12B)、乙酸(图
12C)或葡萄糖(图12D)的产生，如实施例X中所提供。
[0034] 图11描绘在用包含编码各种MI-FAE循环和终止途径酶的基因的质粒转化的酿酒酵母中在有或无pflAV或PDH旁路的情况下1,3-丁二醇的产生，如实施例X中所提供。
[0035] 图12描绘五种硫解酶对大肠杆菌(E.coli)中的乙酰-CoA缩合活性的估计比活性，如实施例XI中所提供。
[0036] 图13描绘具有1495(3-羟基丁酰-CoA脱氢酶)的双启动子酵母载体中克隆的两种硫解酶(1491和560)对大肠杆菌中的乙酰-CoA缩合活性的估计比活性，如实施例XI中
所提供。
[0037] 图14描绘NADH氧化的荧光检测的时程，其用于测量通过3-羟基丁酰-CoA脱氢酶由乙酰乙酰-CoA到3-羟基丁酰-CoA的代谢，如实施例XI中所提供。通过3-羟基丁
酰-CoA脱氢酶将乙酰乙酰-CoA代谢为3-羟基丁酰-CoA。该反应需要NADH的氧化，其可
通过在340nm的激发波长和在460nm的发射波长下的荧光来监测。氧化形式NAD+不发荧
光。1495，即来自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的Hbd在含有1491(载体id＝
pY3Hd17)或560(载体id＝pY3Hd16)的双启动子酵母载体中进行测定。
[0038] 图15描绘在1或5ug/ml NADH或1或5ug/ml NADPH存在下NAD(P)H氧化的水平，并且显示相对于NADPH，Hbd较偏好NADH，如实施例XI中所提供。
[0039] 图16描绘将3-羟基丁酰-CoA转变成3-羟基丁醛且需要NAD(P)H氧化的醛还原酶的粗裂解物(crude lysate)的活性数据，该NAD(P)H氧化可用于监测酶活性，如实施例
XI中所提供。将来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的Ald(基因ID 707)克隆于含
有来自糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)的醇脱氢酶(基
因ID 28)的双载体中。将这两种酶克隆于含有Leu标记的另一双启动子酵母载体中。将
来自大肠杆菌的707裂解物用作标准品。
[0040] 图17描绘ADH(基因28)在具有ALD(基因707)的双启动子载体中的评估，其中丁醛为3-羟基丁醛的替代底物。1,3-BDO由醇脱氢酶(Adh)形成，该醇脱氢酶(Adh)在
NAD(P)H存在下还原3-羟基丁醛，且用NAD(P)H的氧化监测该反应。
[0041] 发明详述
[0042] 如本文所用的，术语“非天然存在的”当用于涉及本发明的微生物时，意指该微生物具有至少一个在正常情况下在参考菌种的天然存在的菌株(包括参考菌种的野生型菌
株)中不存在的遗传改变。遗传改变包括例如引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其
它核酸添加、核酸缺失和/或微生物遗传材料的其它功能破坏。这样的修饰包括例如参考
菌种的异源多肽、同源多肽或者异源多肽和同源多肽二者的编码区及其功能片段。另外的
修饰包括例如其中修饰改变了基因或操纵子的表达的非编码调节区。示例性的代谢多肽包
括脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成途径内的酶或蛋白质。
[0043] 代谢修饰是指自其天然存在的状态被改变的生物化学反应。因此，非天然存在的微生物可具有针对编码代谢多肽的核酸或其功能片段的遗传修饰。在本文中公开了示例性
的代谢修饰。
[0044] 如本文所用的，术语“分离的”当用于涉及微生物时，意指基本上不含随该参考微生物在自然界中发现的至少一种组分的生物体。该术语包括去除了随该微生物在其天然环
境中被发现的某些或所有组分的微生物。该术语也包括去除了随该微生物在非天然存在
的环境中被发现的某些或所有组分的微生物。因此，分离的微生物与随其在自然界中被发
现或者随其在非天然存在的环境中生长、贮存或生存时被发现的其它物质部分或完全分离
开。分离的微生物的具体实例包括部分纯的微生物、相当纯的微生物和在培养基即非天然
存在的环境中培养的微生物。
[0045] 如本文所用的，术语“微生物”意指作为用显微镜可看见的细胞存在的任何生物体，它被包括在古细菌(archaea)、细菌(bacteria)或真核微生物(eukarya)的范围内。因
此，该术语预计包括具有用显微镜可看见的大小的原核或真核细胞或者原核或真核生物，
并且包括所有菌种的细菌、古细菌和真细菌以及真核微生物(例如酵母和真菌)。该术语也
包括可以进行培养以用于生物化学品生产的任何菌种的细胞培养物。
[0046] 如本文所用的，术语“CoA”或“辅酶A”意指有机辅因子或辅基(prostheticgroup)(酶的非蛋白质部分)，其存在为许多酶(脱辅基酶)的活性所必需以形成活性酶系
统。辅酶A在某些缩合酶中发挥功能，在乙酰基或其它酰基基团转移中和在脂肪酸合成和
氧化、丙酮酸氧化中和在其它乙酰化中起作用。
[0047] 如本文所用的，术语“ACP”或“酰基载体蛋白(acyl carrier protein)”是指与许多生物体(从细菌到植物)的脂肪酸合酶系统相关的任何相对较小的酸性蛋白质。ACPs
可以含有一个通过磷酸酯键与丝氨酸残基的羟基基团共价结合的4′-磷酸泛酰巯基乙胺
(4′-phosphopantetheine)辅基。4′-磷酸泛酰巯基乙胺部分的巯基基团在脂肪酸合成
期间充当酰基中间体被(硫)酯化的锚定物。ACP的一个实例是大肠杆菌ACP，一种单独的
单一蛋白质，含有77个氨基酸残基(8.85kDa)，其中磷酸泛酰巯基乙胺基团与丝氨酸36相
连。
[0048] 如本文所用的，术语“基本上厌氧的”当用于涉及培养或生长条件时，意指氧的量小于液体培养基中溶解氧饱和度的约10％。该术语也预计包括用小于约1％氧的气氛维持
的液体或固体培养基的密闭室。
[0049] “外源的”当它被用在本文中时意指参考分子或参考活性被引入到宿主微生物中。该分子可以例如通过将编码核酸引入到宿主遗传材料中，例如通过整合到宿主染色体或作
为非染色体遗传材料例如质粒而引入。因此，该术语当用于涉及编码核酸的表达时，是指将
编码核酸以可表达形式引入到微生物中。当用于涉及生物合成活性时，该术语是指被引入
到宿主参比生物体中的活性。来源可以是例如在引入到宿主微生物之后表达参考活性的同
源或异源编码核酸。因此，术语“内源的”是指宿主体内存在的参考分子或活性。类似地，
该术语当用于涉及编码核酸的表达时，是指微生物体内所含有的编码核酸的表达。术语“异
源的”是指从不是参考物种的来源获得的分子或活性，而“同源的”是指来源于宿主微生物
的分子或活性。因此，本发明的编码核酸的外源表达可以利用异源或同源编码核酸中的任
何一个或二者。
[0050] 应当理解，当在微生物中包括超过一种外源核酸时，超过一种外源核酸是指如上所论述的参考编码核酸或生物合成活性。还应当理解，正如本文所公开的，这样的超过一种
外源核酸可以在独立的核酸分子上、在多顺反子核酸分子上或其组合上引入到宿主微生物
中，并且仍然被视为超过一种外源核酸。例如，如本文所公开的，微生物可以经过工程改造
以表达编码所需途径酶或蛋白质的两种或两种以上外源核酸。在将编码所需活性的两种外
源核酸引入到宿主微生物的情况下，应当理解，这两种外源核酸可以作为一种核酸(例如
在单个质粒上、在独立的质粒上)被引入，可以整合到宿主染色体的单个位点或多个位点
上，并且仍然被视为两种外源核酸。类似地，应当理解，超过两种外源核酸可以以任何所需
组合(例如在单个质粒上、在独立的质粒上)引入到宿主生物中，可以整合到宿主染色体的
单个位点或多个位点上，并且仍然被视为两种或两种以上外源核酸，例如三种外源核酸。因
此，参考外源核酸或生物合成活性的数目是指编码核酸的数目或生物合成活性的数目，而
不是被引入到宿主生物中的独立核酸的数目。
[0051] 如本文所用的，术语“基因破坏”或其语法等价物意指使得所编码的基因产物无活性或衰减的遗传改变。遗传改变可以是例如整个基因的缺失、转录或翻译所需要的调节序
列的缺失、导致产生截短的基因产物的一部分基因的缺失或使所编码的基因产物失活或衰
减的各种突变策略中的任一种。一种特别有用的基因破坏方法是完整基因缺失，这是因为
它减少或消除了本发明的非天然存在的微生物中遗传逆转(genetic reversion)的发生。
基因破坏也包括无效突变(null mutation)，无效突变是指基因或含有基因的区域内的突
变，其导致基因不转录为RNA和/或不翻译为功能性基因产物。这样的无效突变可由许多
类型的突变产生，该突变包括例如使点突变失活、一部分基因缺失、整个基因缺失或染色体
区段缺失。
[0052] 如本文所用的，术语“生长耦合的(growth-coupled)”当用于涉及生物化学产物的产生时意指参考生物化学产物的生物合成在微生物的生长期期间产生。在一个特定的实施
方案中，生长耦合产生可以是专性的，意味着所参考生物化学的生物合成是在微生物生长
期期间产生的专性产物。
[0053] 如本文所用的，术语“衰减”或其语法等价物意指减弱、降低或减小酶或蛋白质的活性或量。如果酶或蛋白质的活性或量的衰减致使活性或量下降到给定途径起作用所需的
临界水平以下，则该衰减可模拟完全破坏。然而，模拟一种途径的完全破坏的酶或蛋白质的
活性或量的衰减仍可足以使另一途径继续起作用。例如，内源酶或蛋白质的衰减可足以模
拟用于生产本发明的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产物的相同酶或蛋白质的完全破坏，但酶或
蛋白质的剩余活性或量仍可足以维持其它途径，例如对宿主微生物存活、繁殖或生长至关
重要的途径。酶或蛋白质的衰减也可以足以增加本发明的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产物的
产率但不一定模拟酶或蛋白质的完全破坏的量减弱、降低或减小酶或蛋白质的活性或量。
[0054] 如本文所用的术语“脂肪醇”意指含有一个或多个羟基基团且含有4个或4个以上碳原子的链的脂族化合物。脂肪醇具备基团-CH2OH，其可经氧化以便形成具有相同碳
原子数目的相应醛或酸。脂肪醇也可以为饱和脂肪醇、不饱和脂肪醇、1,3-二醇或3-氧
代-烷-1-醇。示例性的脂肪醇包括式(III)-(VI)的化合物：
[0055]
[0056] 其中R1为C1-24直链烷基。
[0057] 如本文所用的术语“脂肪醛”意指含有醛(CHO)基团且含有4个或4个以上碳原子的链的脂族化合物。脂肪醛可经还原形成具有相同碳原子数目的相应醇或经氧化形成具
有相同碳原子数目的相应羧酸。脂肪醛也可以为饱和脂肪醛、不饱和脂肪醛、3-羟基醛或
3-氧代醛。示例性的脂肪醛包括式(VII)-(X)的化合物：
[0058]
[0059] 其中R1为C1-24直链烷基。
[0060] 如本文所用的术语“脂肪酸”意指含有羧酸基团且含有4个或4个以上碳原子的链的脂族化合物。脂肪酸可以经还原形成具有相同碳原子数目的相应醇或醛。脂肪酸也可以
为饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、3-羟基酸或3-氧代酸。示例性的脂肪酸包括式(XI)-(XIV)
的化合物：
[0061]
[0062] 其中R1为C1-24直链烷基。
[0063] 术语“烷基”是指直链饱和单价烃。烷基可以为具有1至24(C1-24)、1至17(C1-17)或9至13(C9-13)个碳原子的直链饱和单价烃。烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、丙
基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。举例来说，C9-13烷基是
指9至13个碳原子的直链饱和单价烃。
[0064] 本文中所公开的发明至少部分基于能够使用丙二酰-CoA非依赖性脂肪酸延长(MI-FAE)循环和/或丙二酰-CoA依赖性脂肪酸延长循环(MD-FAE)循环与终止途径的组合
合成脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的重组微生物。在有些实施方案中，本发明的微生物可以利用
与酰基-CoA终止途径偶联的异源MI-FAE循环和/或MD-FAE循环来形成脂肪醇、脂肪醛或
脂肪酸。MI-FAE循环可包括硫解酶、3-氧代酰基-CoA还原酶、3-羟基酰基-CoA脱水酶和
烯酰-CoA还原酶。MD-FAE循环可包括延长酶、3-氧代酰基-CoA还原酶、3-羟基酰基-CoA
脱水酶和烯酰-CoA还原酶。通过MI-FAE循环和/或MD-FAE循环的每一次传代导致与进入
延长循环的酰基-CoA底物相比，延长单一两个碳单元的酰基-CoA的形成。产物可为偶数或
奇数链长，取决于进入酰基-CoA延长途径的初始底物，即两个乙酰-CoA底物、丙二酰-CoA
或一个乙酰-CoA底物与一个丙酰-CoA底物组合。两个乙酰-CoA底物或丙二酰-CoA的延
长产生偶数链长产物，而用丙酰-CoA底物延长产生奇数链长产物。终止途径催化MI-FAE
中间体和/或MD-FAE中间体(例如酰基-CoA)转变成其相应的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产
物。MI-FAE循环、MD-FAE循环和终止途径酶可以在该微生物的一个或多个区室中表达。例
如，在一个实施方案中，所有MI-FAE循环和终止途径酶都在细胞溶质中表达。在另一个实
施方案中，所有MD-FAE循环和终止途径酶都在细胞溶质中表达。另外，本发明的微生物可
以经工程改造以任选地将所需产物分泌到培养基或发酵肉汤(fermentation broth)中用
于进一步操作或分离。
[0065] 本发明的产物包括衍生自MI-FAE循环和/或MD-FAE循环的中间体的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。例如，醇产物可包括饱和脂肪醇、不饱和脂肪醇、1,3-二醇和3-氧
代-烷-1-醇。醛产物可包括饱和脂肪醛、不饱和脂肪醛、3-羟基醛和3-氧代醛。酸产物
可包括饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、3-羟基酸和3-氧代酸。这些产物可通过化学或酶促手
段进一步转变成衍生物，例如脂肪酯。用于将脂肪醇转变成脂肪酯的方法是本领域众所周
知的。
[0066] 本发明亦涵盖与宿主菌株工程改造策略结合的脂肪醇、脂肪醛和脂肪酸链长控制策略，以使得本发明的非天然存在的微生物有效地指导碳和还原当量(reducing
equivalents)朝向特定链长的发酵产物。
[0067] 本发明的重组微生物可生产商业数量的链长范围为四个碳原子(C4)至二十四个碳原子(C24)或更多个碳原子的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。本发明的微生物可生产对于特别
链长具有至少50％、60％、70％、75％、85％、90％、95％或95％以上选择性的所需产物。产
物的碳链长度受到MI-FAE循环的一种或多种酶(图6的步骤A/B/C/D)和/或MD-FAE循
环的一种或多种酶(图6的步骤E/B/C/D)与一种或多种终止途径酶(图7的步骤E-N)的
组合控制。可以在延长循环期间通过对于碳原子数目不大于所需产物大小的MI-FAE循环
底物表现出选择性的一种或多种MI-FAE循环酶(硫解酶、3-氧代酰基-CoA还原酶、3-羟
基酰基-CoA脱水酶和/或烯酰-CoA还原酶)将链长封端。或者或另外，可以在延长循环
期间通过一种或多种MD-FAE循环酶(延长酶、3-氧代酰基-CoA还原酶、3-羟基酰基-CoA
脱水酶和/或烯酰-CoA还原酶)将链长封端。可以通过催化MI-FAE循环中间体转变成脂
肪醇、脂肪醛或脂肪酸产物的一种或多种酶进一步约束链长，以使得一种或多种终止酶仅
与碳原子数目不小于所需脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产物的底物反应。
[0068] 催化MI-FAE-CoA中间体或MD-FAE-CoA中间体转变成脂肪醇的终止途径酶可包括脂肪酰-CoA还原酶(醇或醛形成)、脂肪醛还原酶、酰基-ACP还原酶、酰基-CoA:ACP酰基
转移酶、硫酯酶、酰基-CoA水解酶和/或羧酸还原酶的组合(图7的途径G；E/F；K/J/F；H/
N/F；或K/L/N/F)。用于将MI-FAE-CoA中间体或MD-FAE-CoA中间体转变成脂肪酸的终止
途径酶可包括硫酯酶、CoA水解酶、酰基-CoA:ACP酰基转移酶、醛脱氢酶和/或酰基-ACP
还原酶的组合(图7的途径H；K/L；E/N；K/J/N)。为了生产脂肪醛，终止途径酶可包括脂肪
酰-CoA还原酶(醛形成)、酰基-ACP还原酶、酰基-CoA:ACP酰基转移酶、硫酯酶、酰基-CoA
水解酶和/或羧酸还原酶的组合(图7的途径E；K/J；H/N；或K/L/N)。
[0069] 本发明的非天然存在的微生物也可以有效地引导细胞资源(包括碳、能量和还原当量)产生脂肪醇、脂肪醛和脂肪酸，从而导致相对于天然存在的生物体，产率、生产力和/
或效价得到改进。在一个实施方案中，所述微生物经修饰以增加细胞溶质乙酰-CoA水平。
在另一个实施方案中，所述微生物经修饰以有效地指导细胞溶质酰基-CoA成为脂肪醇、脂
肪醛或脂肪酸而非其它副产物或细胞过程。可导致副产物形成的酶或途径可衰减或缺失。
示例性的副产物包括但不限于乙醇、甘油、乳酸、乙酸、酯和二氧化碳。另外的副产物可包括
脂肪-酰基-CoA衍生物，例如醇、烯烃、烷烃、酯、酸和醛。因此，副产物可包括来自所关注
产物转移碳和/或还原当量的任何发酵产物。
[0070] 在另一个实施方案中，还原当量的可利用性(availability)或氧化还原比增加。在又一个实施方案中，使该微生物的辅因子需求平衡，以使得在碳同化和中心代谢期间产
生的相同还原型辅因子为MI-FAE循环、MD-FAE循环和/或终止途径酶所利用。在又一个
实施方案中，产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生物体表达从细胞输出脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸
的转运体。
[0071] 能够生产脂肪醇的微生物在本文中参考酿酒酵母(Saccharomyces cerevisaie)遗传背景举例说明。然而，在现在可得到数千个物种的完整基因组序列(其中超过一半可
在公共数据库(例如NCBI)上获得)的情况下，一种或多种基因的替代性物种同源物(包
括例如直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换)的鉴别；及真核生物之间的遗传
改变的互换为常规的且为本领域所熟知。因此，允许本文中参考特定生物体(例如酿酒酵
母)所述的脂肪醇生产的代谢改变可容易地应用于其它微生物。考虑到本文提供的教导和
指导，本领域技术人员理解，在一种生物体中例示的代谢改变可同等地适用于其它生物体。
[0072] 本发明的方法适用于各种原核生物和真核生物，例如细菌、酵母和真菌。例如，酵母可 包括酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)和少根根 霉(Rhizopus
arrhizus)。示例性的真核生物也可包括克拉布特里(Crabtree)阳性和阴性酵母；及
酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)或毕
赤酵母属(Pichia)中的酵母。更多示例性的真核菌种包括选自以下的那些：粟酒裂殖
酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克
斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉
(Aspergillus niger)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、白色
假丝酵母(Candida albicans)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、萨纳瑞西斯假丝酵
母(Candida sonorensis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia
lipolytica)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。另外，来自较大型真核生物的所选
细胞也适用于本发明的方法。示例性的细菌包括选自以下的菌种：大肠杆菌(Escherichia
coli)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum
succiniciproducens)、琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥珀酸
曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、豆根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草芽孢
杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡
糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球
菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌
(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、荧光假单胞
菌(Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
[0073] 在本发明的有些方面，通过本文公开的MI-FAE循环和终止途径生产脂肪醇、脂肪醛和脂肪酸特别有用，这是因为该循环和途径导致比起通过天然存在的生物合成途径例如
众所周知的丙二酰-CoA依赖性脂肪酸合成途径，或在有些方面丙二酰-ACP依赖性脂肪酸
合成途径具有更高产物和ATP产率。例如，使用乙酰-CoA作为C2延伸单元(例如步骤A，
图1)替代丙二酰-酰基载体蛋白(丙二酰-ACP)使得每单位通量进入MI-FAE循环的乙
酰-CoA节约一个ATP分子。MI-FAE循环导致产生酰基-CoA而非酰基-ACP，并且可在乙
酰-CoA用作延伸单元时排除需要消耗ATP的酰基-CoA合酶反应来产生辛醇和其它脂肪
醇、脂肪醛或脂肪酸。本发明的生产脂肪醇、脂肪醛和脂肪酸的生物体可另外允许使用生物
合成过程来转变低成本可再生原料以便制造化学产品。
[0074] 本发明的真核生物可经进一步工程改造以代谢和/或共同利用多种原料，包括葡萄糖、木糖、果糖、合成气、甲醇等。
[0075] 可使用高度活性酶与适用于所需脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成的合适底物范围的组合达成链长控制。可使用MI-FAE循环、MD-FAE循环或终止途径的一种或多种酶来控
制产物的链长。如本文中所述，可在MI-FAE循环期间通过一种或多种MI-FAE循环酶(硫
解酶、3-氧代酰基-CoA还原酶、3-羟基酰基-CoA脱水酶和/或烯酰-CoA还原酶)且在
MD-FAE循环的情况下通过一种或多种MD-FAE循环酶(延长酶、3-氧代酰基-CoA还原酶、
3-羟基酰基-CoA脱水酶和/或烯酰-CoA还原酶)将链长封端，所述酶表现出对碳原子数
目不大于所需产物大小的MI-FAE和/或MD-FAE循环底物具有选择性。由于酶是可逆的，
因此延长途径酶中的任何一个可具有此能力。选择具有宽底物范围但规定链长边界的酶使
得能够使用单种酶催化多个延长循环，同时赋予产物特异性。为了进一步增强特异性和防
止较短副产物的累积，通过产物形成终止酶进一步约束选择性，以使得一种或多种酶对酰
基-CoA或碳原子数目不小于所需链长的其它终止途径底物具有选择性。产生不同链长产
物的内源途径酶的缺失或衰减可进一步增强产物特异性。
[0076] 使用本文中概述的方法，本领域技术人员可自文献选择具有经表征的底物范围、选择性生产特定链长的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产物的酶。为了选择性生产所需长度的脂
肪醇、脂肪醛或脂肪酸，可以利用文献中如上所述的具有不同选择性范围的已知酶的组合。
例如，生产C16脂肪醇的非天然存在的微生物可表达仅接受至多长度C16的底物的酶，例如褐
家鼠(Rattus norvegicus)Acaa1硫解酶和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的
烯酰-CoA还原酶。将一种或两种链延长酶与C16-C18脂肪酰-CoA还原酶(醇或醛形成)(例
如霍霍巴(Simmondsia chinensis)的FAR)联合通过减少较短醇产物的合成进一步增加产
物特异性。作为另一个实例，本发明的非天然存在的微生物可通过将拟南芥(Arabidopsis
thaliana)的3-羟基酰基-CoA脱水酶与不动杆菌菌株M-1(Acinetobacter sp.Strain
M-1)的酰基-CoA还原酶Acr1组合而选择性生产长度C14的醇。为了生产长度C14的3-氧代
酸，可以例如将将大鼠硫解酶与番茄(Solanum lycopersicum)的3-氧代酰基-CoA水解酶
组合。作为再一个实例，为了生产C18脂肪酸，可以将肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)
fadE烯酰-CoA还原酶与大肠杆菌(E.coli)的tesB硫酯酶组合。在又一个实例中，选择性
生产C6醇通过将来自富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)的paaH1硫解酶与雷弗森
菌S749(Leifsonia sp.S749)醇脱氢酶lsadh组合而形成。
[0077] 示例性的MI-FAE循环、MD-FAE循环和终止途径酶在实施例I中有详细描述。本文描述的生物合成酶表现出不同程度的底物特异性。在文献中表征的酶的示例性底物范围
见下表并且在实施例I中有更详细描述。
[0078]
[0079]
[0080]
[0081] 考虑到各酶在MI-FAE循环或MD-FAE循环中的链长特异性差异，本领域技术人员可选择一种或多种酶用于催化各延长循环反应步骤(图6的步骤A-D或步骤E/B/C/D)。例
如，就MI-FAE循环的硫解酶步骤而言，一些硫解酶(例如富养罗尔斯通氏菌的bktB)催化
短链和中链酰基-CoA中间体(C6-C8)的延长，而其它硫解酶(例如褐家鼠(R.norvegicus)
的Acaa1a)对较长链底物(C10-C16)有活性。因此，产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的微生物可包
含硫解酶、延长酶、3-氧代酰基-CoA还原酶、3-羟基酰基-CoA脱水酶和/或烯酰-CoA还
原酶的一、二、三、四种或四种以上变异体。
[0082] 酶的链长特异性可通过本领域众所周知的方法进行测定(例如Wrensford等人,Anal Biochem 192:49-54(1991))。生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的酶的底物范围可通
过本领域众所周知的方法进一步延伸或变窄。生物学存在的酶的变异体可例如通过如本文
描述的合理和定向进化、诱变和酶改组来产生。作为一个实例，用于改变链长特异性的合理
工程改造方法由Denic和Weissman进行(Denic和Weissman,Cell 130:663-77(2008))。
Denic和Weissman将负责链长的酵母延长酶蛋白质ELOp的区域作图，并且引入突变以改变
脂肪酸产物的长度。在此情况下，疏水底物口袋的几何形状设定链长的上边界。类似的方
法可用于改变MI-FAE循环、MD-FAE循环和/或终止途径的酶的链长特异性。
[0083] 酶诱变、在宿主中的表达及针对脂肪醇生产的筛选是用于产生具有所需应用的改进特性的酶变异体的另一适用方法。例如，美国专利申请2012/0009640列举出栖藻海杆菌
(Marinobacter algicola)和水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)FAR酶的具有优于野
生型酶的改进活性且改变产物分布型(profiles)的数百种变异体。
[0084] 酶诱变(随机或定向)并结合选择平台是另一适用方法。例如，Machado及合作者开发出目的在于增加酰基-CoA延长循环酶对较长链长底物的活性的选择平台(Machado
等人,Met Eng in press(2012))。Machado等人鉴定出其途径(3-羟基酰基-CoA脱氢酶)
的链长限制步骤且使用厌氧生长拯救平台使其进化以获得对C6-C8底物的改进活性。可用
于生产脂肪醇的酶的其它变异体列于下表。
[0085]
[0086] 本领域技术人员应当理解，遗传改变，包括本文例举的代谢修饰，可参照合适的宿主生物(例如大肠杆菌或酿酒酵母)和它们的相应代谢反应或者所需遗传材料(例如所
需代谢途径的基因)的合适来源生物体进行描述。然而，考虑到各种生物体的完整基因组
测序和基因组学领域中技巧的高水平，本领域技术人员将能够容易地将本文提供的教导和
指导应用到基本上所有的其它生物体。例如，本文例举的代谢改变可以通过掺入来自参
考物种以外的其它物种的相同或类似编码核酸而容易地应用到其它物种。这样的遗传改
变一般包括例如物种同源物(species homologs)的遗传改变，和具体包括例如直系同源
物(orthologs)、旁系同源物(paralogs)或非直系同源基因置换(nonorthologous gene
displacements)的遗传改变。
[0087] 直系同源物是有垂直亲缘(vertical descent)关系的并且在不同生物体中负责基本相同功能或完全相同功能的一个或多个基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人环氧化
物水解酶可以因为环氧化物水解的生物功能而被视为直系同源物。当某些基因共享足够数
量的序列相似性以表明它们是同源的，或者是从共同的祖先进化而有亲缘关系时，它们有
垂直亲缘关系。如果某些基因共享三维结构但不一定共享足够数量的序列相似性以表明它
们是从共同的祖先进化到一级序列相似性是不可辨识的程度，那么它们也可被视为直系同
源物。作为直系同源的基因可以编码具有约25％至100％氨基酸序列同一性的序列相似性
的蛋白质。编码共享氨基酸相似性小于(less that)25％的蛋白质的基因也可被视为因有
垂直亲缘关系而提升，如果它们的三维结构也显示很高相似性的话。酶的丝氨酸蛋白酶家
族成员，包括组织纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶，都被视为因来自共同的祖先而有垂直亲
缘关系而提升。
[0088] 直系同源物包括通过例如进化而在结构或总体活性上趋异的基因或它们的编码基因产物。例如，当一个物种编码表现出两种功能的基因产物并且当这样的功能已在第二
个物种中分离到截然不同的基因上时，这三个基因及其相应的产物被视为直系同源物。为
了生物化学产品的生产，本领域技术人员应当理解，为了构建非天然存在的微生物，必须对
带有代谢活性的要被引入或破坏的直系同源基因进行选择。表现出可分离活性的直系同源
物的一个实例是当截然不同的活性已在两个或两个以上物种之间或者在单一物种内分离
到截然不同的基因产物上。一个具体的例子是弹性蛋白酶蛋白水解和纤溶酶原蛋白水解
(丝氨酸蛋白酶活性的两种类型)已经作为纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶分离成为两个截
然不同的分子。第二个例子是支原体5’-3’外切核酸酶和果蝇(Drosophila)DNA聚合酶
III活性的分离。来自第一个物种的DNA聚合酶可被视为来自第二个物种的外切核酸酶或
聚合酶中任一个或二者的直系同源物，反之亦然。
[0089] 相比之下，旁系同源物是因为例如复制后再进化趋异而有亲缘关系的同源物并且具有相似或共同的但不完全相同的功能。旁系同源物可起源于或来源于例如相同的物种或
来自不同的物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水
解酶(环氧化物水解酶II)可被视为旁系同源物，因为它们代表了两种独特的酶，从共同的
祖先共进化而来，它们催化不同的反应且在相同的物种中具有不同的功能。旁系同源物是
来自相同的物种并且彼此具有显著序列相似性的蛋白质，提示它们是同源的，或者通过从
共同的祖先共进化而有亲缘关系。旁系同源蛋白质家族的组包括HipA同源物、萤光素酶基
因、肽酶等。
[0090] 非直系同源基因置换是来自一个物种的非直系同源基因，它可以在不同的物种中取代参考基因功能。取代包括例如，与在不同的物种中的参考功能相比，能够在原始的物种
中执行基本上相同或相似的功能。虽然一般而言，非直系同源基因置换将根据与编码参考
功能的已知基因在结构上相关性而可鉴别，但是尽管如此，结构上相关性较少但功能上相
似的基因及其相应基因产物将仍然落入该术语的含义之内，正如本文中使用的。与编码待
取代的功能的基因相比，在非直系同源基因产物的活性位点或结合区中，功能相似性需要
例如至少某些结构相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源物(paralog)或无亲
缘关系的基因(unrelated gene)。
[0091] 因此，在鉴定和构建本发明的具有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成能力的非天然存在的微生物中，本领域技术人员应当知道将本文提供的教导和指导应用到某个具体的
物种时，代谢修饰的鉴定可包括直系同源物的鉴定和纳入(inclusion)或失活。达到这种
程度以致在编码催化相似或基本上相似代谢反应的酶的参考微生物中存在旁系同源物和/
或非直系同源基因置换，本领域技术人员也可利用这些进化上相关的基因。类似地就基因
破坏而言，也可以在宿主微生物中破坏或缺失进化上相关基因以减少或消除靶向破坏的酶
促活性的功能冗余。
[0092] 直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换可以通过本领域技术人员熟知的方法进行测定。例如，对于两种多肽，核酸或氨基酸序列的检查将揭示出比较序列之间的
序列同一性和相似性。基于这样的相似性，本领域技术人员可以确定相似性是否足够高以
表明蛋白质是来自共同的祖先通过进化相关的。本领域技术人员熟知的算法，例如Align、
BLAST、Clustal W等算法比较并测定原序列的相似性或同一性，并且也测定可比对权重或
评分的序列中空位(gaps)的存在或显著性。这样的算法也是本领域已知的并且可同样用
于测定核苷酸序列相似性或同一性。具有足够的相似性以确定相关性(relatedness)的参
数可基于熟知的方法输入计算机以计算统计相似性，或者在随机多肽中找到相似匹配的机
会，并且测定匹配的显著性。两个或两个以上序列的计算机比较也可以(如果需要)由本
领域技术人员用肉眼最优化。预期有相关性的基因产物或蛋白质可具有高度相似性，例如
25％至100％序列同一性。无相关性的蛋白质可具有与预期偶然发生基本上相同的同一性，
如果对足够大小的数据库扫描(约5％)的话。5％和24％之间的序列可能代表或不代表
足够的同源性以得出结论是被比较序列是相关的。可以进行另外的统计分析以确定给出数
据集大小的这类匹配的显著性，从而确定这些序列的关系。
[0093] 运用BLAST算法来测定两个或两个以上序列的相关性(relatedness)的示例性参数例如可以如下所示。简而言之，氨基酸序列比对可以使用BLASTP 2.0.8版本(1999年1
月5日)和以下参数进行：矩阵(matrix)：0BLOSUM62；空位开放(gap open)：11；空位延伸
(gap extension)：1；x_dropoff：50；期望值(expect)：10.0；字大小(wordsize)：3；过滤
器(filter)：开(on)。核酸序列比对可以使用BLASTN 2.0.6版本(1998年9月16日)和
以下参数进行：匹配(match)：1；错配(mismatch)：-2；空位开放(gapopen)：5；空位延伸
(gap extension)：2；x_dropoff：50；期望值(expect)：10.0；字大小(wordsize)：11；过滤
器(filter)：关(off)。本领域技术人员将会知道对以上参数可以做出什么修改以或者增
加或者减少例如比较的严格性和测定两个或两个以上序列的相关性。
[0094] 在有些实施方案中，本发明提供具有MI-FAE循环或MD-FAE循环与终止途径组合的非天然存在的微生物，其中所述MI-FAE循环包括一种或多种硫解酶、一种或多种3-氧代
酰基-CoA还原酶、一种或多种3-羟基酰基-CoA脱水酶及一种或多种烯酰-CoA还原酶，其
中所述MD-FAE循环包括一种或多种延长酶、一种或多种3-氧代酰基-CoA还原酶、一种或
多种3-羟基酰基-CoA脱水酶及一种或多种烯酰-CoA还原酶，其中所述终止途径包括图1、
图6或图7中所示的途径，选自：(1)1H；(2)1K和1L；(3)1E和1N；(4)1K,1J和1N；(5)1E；
(6)1K和1J；(7)1H和1N；(8)1K,1L和1N；(9)1E和1F；(10)1K,1J和1F；(11)1H,1N和1F；
(12)1K,1L,1N和1F；和(13)1G，其中1E是酰基-CoA还原酶(醛形成)，其中1F是醇脱氢
酶，其中1G是酰基-CoA还原酶(醇形成)，其中1H是酰基-CoA水解酶、酰基-CoA转移酶
或酰基-CoA合酶，其中1J是酰基-ACP还原酶，其中1K是酰基-CoA:ACP酰基转移酶，其中
1L是硫酯酶，其中1N是醛脱氢酶(酸形成)或羧酸还原酶，其中所述MI-FAE循环、MD-FAE
循环或终止途径的酶由至少一种外源核酸编码且以足以产生式(I)的化合物的量表达：
[0095]
[0096] 其中R1为C1-24直链烷基；R2为CH2OH、CHO或COOH；R3为H、OH或氧代(＝O)；且代表单键或双键，前提条件是R3所连接的碳原子的化合价为四价，其中该MI-FAE循
环、MD-FAE循环和该终止途径的所述酶中的每一种酶的底物独立地选自式(II)的化合物、
丙二酰-CoA、丙酰-CoA或乙酰-CoA：
[0097]
[0098] 其中R1为C1-24直链烷基；R3为H、OH或氧代(＝O)；R4为S-CoA、ACP、OH或H；且代表单键或双键，前提条件是R3所连接的碳原子的化合价为四价；其中该MI-FAE循
环的所述一种或多种酶各自对R1上的碳原子数不大于所述式(I)化合物的R1上的碳原子
数的式(II)化合物具有选择性，其中该MD-FAE循环的所述一种或多种酶各自对R1上的碳
原子数不大于所述式(I)化合物的R1上的碳原子数的式(II)化合物具有选择性，和其中
该终止途径的所述一种或多种酶各自对R1上的碳原子数不小于所述式(I)化合物的R1上
的碳原子数的式(II)化合物具有选择性。
[0099] 在本发明的有些方面，本发明的非天然存在的微生物可产生式(I)的化合物，其中R1为C1-17直链烷基。在本发明的另一个方面，式(I)的化合物的R1是C1直链烷基、C2直
链烷基、C3直链烷基、C4直链烷基、C5直链烷基、C6直链烷基、C7直链烷基、C8直链烷基、C9
直链烷基、C10直链烷基、C11直链烷基、C12直链烷基或C13直链烷基、C14直链烷基、C15直链烷
基、C16直链烷基、C17直链烷基、C18直链烷基、C19直链烷基、C20直链烷基、C21直链烷基、C22
直链烷基、C23直链烷基或C24直链烷基。
[0100] 在本发明的有些方面，所述微生物包括二、三或四种外源核酸，各自编码该MI-FAE循环或该MD-FAE循环的酶。在本发明的有些方面，所述微生物包括二、三或四种外源核酸，
各自编码该终止途径的酶。在本发明的有些方面，所述微生物包括编码选自(1)-(13)的途
径中的至少一种途径的各种酶的外源核酸。在有些方面，所述至少一种外源核酸是异源核
酸。在有些方面，所述非天然存在的微生物是在基本上厌氧的培养基中。
[0101] 在有些实施方案中，本发明提供非天然存在的微生物，其中所述MI-FAE循环、MD-FAE循环或终止途径的一种或多种酶以足以产生选自式(III)-(VI)的脂肪醇的量表
达：
[0102]其中R1为C1-24直链烷基，或者R1为C1-17直链烷基，或者R1为C9-13
直链烷基。在本发明的有些方面，R1为C1直链烷基、C2直链烷基、C3直链烷基、C4直链烷基、
C5直链烷基、C6直链烷基、C7直链烷基、C8直链烷基、C9直链烷基、C10直链烷基、C11直链烷
基、C12直链烷基或C13直链烷基、C14直链烷基、C15直链烷基、C16直链烷基、C17直链烷基、C18
直链烷基、C19直链烷基、C20直链烷基、C21直链烷基、C22直链烷基、C23直链烷基或C24直链
烷基。
[0103] 在有些实施方案中，本发明提供非天然存在的微生物，其中所述MI-FAE循环、MD-FAE循环或终止途径的一种或多种酶以足以产生选自式(VII)-(X)的脂肪醛的量表达：
[0104]其中R1为C1-24直链烷基，或者R1为C1-17直链烷基，或者R1为C9-13
直链烷基。在本发明的有些方面，R1为C1直链烷基、C2直链烷基、C3直链烷基、C4直链烷基、
C5直链烷基、C6直链烷基、C7直链烷基、C8直链烷基、C9直链烷基、C10直链烷基、C11直链烷
基、C12直链烷基或C13直链烷基、C14直链烷基、C15直链烷基、C16直链烷基、C17直链烷基、C18
直链烷基、C19直链烷基、C20直链烷基、C21直链烷基、C22直链烷基、C23直链烷基或C24直链
烷基。
[0105] 在有些实施方案中，本发明提供非天然存在的微生物，其中所述MI-FAE循环、MD-FAE循环或终止途径的一种或多种酶以足以产生选自式(XI)-(XIV)的脂肪酸的量表
达：
[0106]其中R1为C1-24直链烷基，或者R1为C1-17直链烷基，或者R1为C9-13
直链烷基。在本发明的有些方面，R1为C1直链烷基、C2直链烷基、C3直链烷基、C4直链烷基、
C5直链烷基、C6直链烷基、C7直链烷基、C8直链烷基、C9直链烷基、C10直链烷基、C11直链烷
基、C12直链烷基或C13直链烷基、C14直链烷基、C15直链烷基、C16直链烷基、C17直链烷基、C18
直链烷基、C19直链烷基、C20直链烷基、C21直链烷基、C22直链烷基、C23直链烷基或C24直链
烷基。
[0107] 在有些实施方案中，本发明提供如本文描述的非天然存在的微生物，其中所述微生物还包括乙酰-CoA途径和至少一种编码以足以产生乙酰-CoA的量表达的乙酰-CoA途
径酶的外源核酸，其中所述乙酰-CoA途径包括图2、3、4或5中所示的途径，选自：(1)2A
和2B；(2)2A,2C和2D；(3)2H；(4)2G和2D；(5)2E,2F和2B；(6)2E和2I；(7)2J,2F和2B；
(8)2J 和 2I；(9)3A,3B 和 3C；(10)3A,3B,3J,3K 和 3D；(11)3A,3B,3G 和 3D；(12)3A,3F
和 3D；(13)3N,3H,3B 和 3C；(14)3N,3H,3B,3J,3K 和 3D；(15)3N,3H,3B,3G 和 3D；
(16)3N,3H,3F和 3D；(17)3L,3M,3B和 3C；(18)3L,3M,3B,3J,3K和 3D；(19)3L,3M,3B,3G
和 3D；(20)3L,3M,3F 和 3D；(21)4A,4B,4D,4H,4I 和 4J；(22)4A,4B,4E,4F,4H,4I 和
4J；(23)4A,4B,4E,4K,4L,4H,4I 和 4J；(24)4A,4C,4D,4H 和 4J；(25)4A,4C,4E,4F,4H
和 4J；(26)4A,4C,4E,4K,4L,4H 和 4J；(27)5A,5B,5D 和 5G；(28)5A,5B,5E,5F 和 5G；
(29)5A,5B,5E,5K,5L和5G；(30)5A,5C和5D；(31)5A,5C,5E和5F；和(32)5A,5C,5E,5K和
5L，其中2A是丙酮酸氧化酶(乙酸形成)，其中2B是乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA连接酶
或乙酰-CoA转移酶，其中2C是乙酸激酶，其中2D是磷酸转乙酰酶，其中2E是丙酮酸脱羧
酶，其中2F是乙醛脱氢酶，其中2G是丙酮酸氧化酶(乙酰-磷酸形成)，其中2H是丙酮酸
脱氢酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸:NAD(P)H氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合
酶，其中2I是乙醛脱氢酶(酰基化)，其中2J是苏氨酸醛缩酶，其中3A是磷酸烯醇丙酮酸
(PEP)羧化酶或PEP羧激酶，其中3B是草酰乙酸脱羧酶，其中3C是丙二酸半醛脱氢酶(乙
酰基化)，其中3D是乙酰-CoA羧化酶或丙二酰-CoA脱羧酶，其中3F是草酰乙酸脱氢酶或
草酰乙酸氧化还原酶，其中3G是丙二酸半醛脱氢酶(酰基化)，其中3H是丙酮酸羧化酶，其
中3J是丙二酸半醛脱氢酶，其中3K是丙二酰-CoA合成酶或丙二酰-CoA转移酶，其中3L是
苹果酸酶，其中3M是苹果酸脱氢酶或苹果酸氧化还原酶，其中3N是丙酮酸激酶或PEP磷酸
酶，其中4A是柠檬酸合酶，其中4B是柠檬酸转运体，其中4C是柠檬酸/苹果酸转运体，其中
4D是ATP柠檬酸裂合酶，其中4E是柠檬酸裂合酶，其中4F是乙酰-CoA合成酶或乙酰-CoA
转移酶，其中4H是细胞溶质苹果酸脱氢酶，其中4I是苹果酸转运体，其中4J是线粒体苹果
酸脱氢酶，其中4K是乙酸激酶，其中4L是磷酸转乙酰酶，其中5A是柠檬酸合酶，其中5B是
柠檬酸转运体，其中5C是柠檬酸/草酰乙酸转运体，其中5D是ATP柠檬酸裂合酶，其中5E
是柠檬酸裂合酶，其中5F是乙酰-CoA合成酶或乙酰-CoA转移酶，其中5G是草酰乙酸转运
体，其中5K是乙酸激酶，和其中5L是磷酸转乙酰酶。
[0108] 在有些方面，本发明的微生物可包括二、三、四、五、六、七或八种外源核酸，各自编码乙酰-CoA途径酶。在有些方面，所述微生物包括编码选自(1)-(32)的途径中的至少一
种途径的各种乙酰-CoA途径酶的外源核酸。
[0109] 在一个另外的实施方案中，本发明提供具有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的非天然存在的微生物，其中所述非天然存在的微生物包含至少一种外源核酸，其编码选自由
将以下的底物转变成以下的产物组成的组的酶或蛋白质：两个乙酰-CoA分子至3-酮酰
基-CoA，乙酰-CoA加上丙酰-CoA至酮酰基-CoA，丙二酰-CoA至3-酮酰基-CoA，3-酮酰
基-CoA至3-羟基酰基-CoA，3-羟基酰基-CoA至烯酰-CoA，烯酰-CoA至酰基-CoA，酰
基-CoA加上乙酰-CoA至3-酮酰基-CoA，酰基-CoA加上丙二酰-CoA至3-酮酰基-CoA，酰
基-CoA至脂肪醛，脂肪醛至脂肪醇，酰基-CoA至脂肪醇，酰基-CoA至酰基-ACP，酰基-ACP
至脂肪酸，酰基-CoA至脂肪酸，酰基-ACP至脂肪醛，脂肪酸至脂肪醛，脂肪醛至脂肪酸，丙
酮酸至乙酸，乙酸至乙酰-CoA，丙酮酸至乙酰-CoA，丙酮酸至乙醛，苏氨酸至乙醛，乙醛至
乙酸，乙醛至乙酰-CoA，丙酮酸至乙酰-磷酸，乙酸至乙酰-磷酸，乙酰-磷酸至乙酰-CoA，
磷酸烯醇丙酮酸(PEP)至丙酮酸，丙酮酸至苹果酸，苹果酸至草酰乙酸，丙酮酸至草酰乙
酸，PEP至草酰乙酸，草酰乙酸至丙二酸半醛，草酰乙酸至丙二酰-CoA，丙二酸半醛至丙二
酸，丙二酸至丙二酰-CoA，丙二酸半醛至丙二酰-CoA，丙二酰-CoA至乙酰-CoA，丙二酸半醛
至乙酰-CoA，草酰乙酸加上乙酰-CoA至柠檬酸，柠檬酸至草酰乙酸加上乙酰-CoA，柠檬酸
至草酰乙酸加上乙酸，和草酰乙酸至苹果酸。本领域技术人员将会理解这些仅仅是示例性
的，并且根据本文的教导，本领域技术人员可以容易地确定适合于生产所需产物及适用于
适当活性为将底物转变成产物所需要的本文公开的底物-产物对中的任何一个。因此，本
发明提供含有至少一种编码酶或蛋白质的外源核酸的非天然存在的微生物，其中该酶或蛋
白质使脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径(例如图1-8所示的途径)的底物和产物发生转变。
[0110] 尽管本文一般性描述为含有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的微生物，但是应当理解，本发明另外还提供包含至少一种外源核酸的非天然存在的微生物，该外源核酸编码以
足以产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的中间体的量表达的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径
酶或蛋白质。例如，正如本文所公开的，脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径在图1-7中举例说明。
因此，除了含有产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的微生物以
外，本发明另外还提供包含至少一种编码脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径酶的外源核酸的非
天然存在的微生物，其中所述微生物产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体，例如，3-酮
酰基-CoA、3-羟基酰基-CoA、烯酰-CoA、酰基-CoA、酰基-ACP、乙酸、乙醛、乙酰-磷酸、草
酰乙酸、苹果酸(matate)、丙二酸半醛、丙二酸、丙二酰-CoA、乙酰-CoA或柠檬酸。
[0111] 应当理解，本文公开的任何途径，如在实施例中描述的和在附图中例举的，包括图1-7的途径，都可以用于产生非天然存在的微生物，该微生物按需要产生任何途径中间体或
产物。正如本文所公开的，这样一种产中间体的微生物可以与表达下游途径酶以产生所需
产物的其它微生物联合使用。然而，应当理解，产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体的非
天然存在的微生物可以用于生产作为所需产物的中间体。
[0112] 本文中一般参照代谢反应、其反应物或产物，或具体参照编码与参考代谢反应、反应物或产物相关的酶、或催化参考代谢反应、反应物或产物的酶、或与参考代谢反应、反应
物或产物相关的蛋白质的一种或多种核酸或基因，对本发明进行了描述。除非本文另有明
确的表述，否则本领域技术人员应当理解，参照反应也构成参照反应的反应物和产物。类似
地，除非本文另有明确的表述，否则参照反应物或产物也参照反应，和参照这些代谢组分中
的任何一个也参照编码催化参考反应、反应物或产物的酶或参与参考反应、反应物或产物
的蛋白质的一个或多个基因。类似地，考虑到代谢生物化学、酶学和基因组学的公知领域，
本文参照基因或编码核酸也构成参照相应的编码酶和它所催化的反应或与反应相关的蛋
白质以及反应的反应物和产物。
[0113] 本发明的非天然存在的微生物可以通过引入编码一种或多种参与一种或多种脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成途径的酶或蛋白质的可表达核酸来产生。根据生物合成所
选出的宿主微生物，可以表达具体的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成途径中的某些或全
部的核酸。例如，如果所选宿主在所需生物合成途径的一种或多种酶或蛋白质中是有缺陷
的，那么可以将这种有缺陷的酶或蛋白质的可表达核酸导入宿主中用于后续的外源表达。
或者，如果所选宿主表现出某些途径基因的内源表达，但是其它的是有缺陷的，那么对于这
种有缺陷的酶或蛋白质来说，需要编码核酸才能实现脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成。因
此，本发明的非天然存在的微生物可以通过引入外源酶或蛋白质活性以获得所需生物合成
途径来产生，或者所需生物合成途径可以通过引入一种或多种外源酶或蛋白质活性来获
得，连同一种或多种内源酶或蛋白质，产生所需产物，例如脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。
[0114] 宿主微生物可选自以下及在以下中产生的非天然存在的微生物：例如，细菌、酵母、真菌，或可应用于或适合于发酵过程中的各式各样的其它微生物中的任何一种。
示例性的细菌包括选自以下目、科、属的任何菌种：肠杆菌目(Enterobacteriales)，
肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，包括埃希氏菌属(Escherichia)和克雷伯氏菌属
(Klebsiella)；气单胞菌目(Aeromonadales)，琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)，
包括厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)；巴斯德氏菌目(Pasteurellales)，巴斯
德氏菌科(Pasteurellaceae)，包括放线杆菌属(Actinobacillus)和曼氏杆菌属
(Mannheimia)；根瘤菌目(Rhizobiales)，慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)，包括根
瘤菌属(Rhizobium)；芽孢杆菌目(Bacillales)，芽孢杆菌科(Bacillaceae)，包括芽孢
杆菌属(Bacillus)；放线菌目(Actinomycetales)，棒杆菌科(Corynebacteriaceae)
和链霉菌科(Streptomycetaceae)，分别包括棒杆菌属(Corynebacterium)和链霉菌
属(Streptomyces)；红螺菌目(Rhodospirillales)，醋杆菌科(Acetobacteraceae)，
包括葡糖杆菌属(Gluconobacter)；鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)，鞘脂单胞菌科
(Sphingomonadaceae)，包括发酵单胞菌属(Zymomonas)；乳杆菌目(Lactobacillales)，
乳杆菌科(Lactobacillaceae)和链球菌科(Streptococcaceae)，分别包括乳杆菌
属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)；梭菌目(Clostridiales)，梭菌科
(Clostridiaceae)，梭菌属(Clostridium)；和假单胞菌目(Pseudomonadales)，假单胞菌
科(Pseudomonadaceae)，包括假单胞菌属(Pseudomonas)。宿主细菌的非限制性菌种包
括大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、产琥珀酸厌
氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus
succinogenes)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、豆根瘤菌
(Rhizobium etli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium
glutamicum)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas
mobilis)、乳 酸 乳 球 菌 (Lactococcus lactis)、植 物 乳 杆 菌 (Lactobacillus
plantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium
acetobutylicum)、荧光 假单 胞菌(Pseudomonas fluorescens)和 恶臭假 单胞 菌
(Pseudomonas putida)。
[0115] 类似地，示例性的酵母或真菌菌种包括选自以下目、科、属的任何菌种：酵母目(Saccharomycetales)，酵母科(Saccaromycetaceae)，包括酵母属(Saccharomyces)、克
鲁维酵母属(Kluyveromyces)和毕赤酵母属(Pichia)；酵母目(Saccharomycetales)，
双 足 囊 菌 科(Dipodascaceae)，包 括 耶 氏 酵 母 属(Yarrowia)；裂 殖 酵 母 目
(Schizosaccharomycetales)，裂殖酵母科(Schizosaccaromycetaceae)，包括裂殖酵母属
(Schizosaccharomyces)；散囊菌目(Eurotiales)，发菌科(Trichocomaceae)，包括曲霉属
(Aspergillus)；毛霉目(Mucorales)，毛霉科(Mucoraceae)，包括根霉属(Rhizopus)。宿
主酵母或真菌的非限制性菌种包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母
(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维
酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus
niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、米根霉
(Rhizobus oryzae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等。大肠杆菌是一种特别有用
的宿主生物，这是因为它适用于遗传工程改造的经充分表征的微生物。其它特别有用的宿
主生物包括酵母，例如酿酒酵母。应当理解，任何合适的微生物宿主生物都可以用于引入代
谢和/或遗传修饰以产生所需产物。
[0116] 根据所选宿主微生物的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成途径组分，本发明的非天然存在的微生物将包括一种或多种脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成途径的至少一种外
源表达的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径编码核酸和多达所有的编码核酸。例如，可以在途径
酶或蛋白质中有缺陷的宿主中通过相应编码核酸的外源表达来建立脂肪醇、脂肪醛或脂肪
酸生物合成。在脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的所有酶或蛋白质中有缺陷的宿主中，可以包
括所有酶或蛋白质在该途径中的外源表达，虽然应当理解，某一途径的所有酶或蛋白质可
以表达，即使该宿主含有途径酶或蛋白质中的至少一个。例如，可以包括所有酶或蛋白质
在产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的途径中的外源表达，例如，硫解酶、3-氧代酰基-CoA还原
酶、3-羟基酰基-CoA脱水酶、烯酰-CoA还原酶(redutase)、酰基-CoA还原酶(醛形成)
和醇脱氢酶，以用于生产脂肪醇。
[0117] 考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员应当理解，以可表达形式引入的编码核酸的数目将至少平行于所选宿主微生物的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径缺陷。因此，
本发明的非天然存在的微生物可具有一、二、三、四、五、六、七或八种，乃至多达所有编码本
文公开的构成脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成途径的酶或蛋白质的核酸。在有些实施方
案中，该非天然存在的微生物也可包括其它遗传修饰，该遗传修饰促进或最优化脂肪醇、脂
肪醛或脂肪酸生物合成或者赋予宿主微生物其它有用的功能。一种这样的其它功能性可
包括例如加强脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径前体中的一种或多种前体例如乙酰-CoA、丙二
酰-CoA或丙酰-CoA的合成。
[0118] 一般而言，对宿主微生物进行选择使得它产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的前体，该前体或者作为天然产生的分子或者作为工程产物，以或者提供所需前体的从头(de
novo)产生或使由宿主微生物天然产生的前体的产生增加。例如，乙酰-CoA是在宿主生物
(例如大肠杆菌)中天然产生的。宿主生物可以经过工程改造以增加前体的产生，正如本文
所公开的。另外，经过了工程改造以产生所需前体的微生物可以用作宿主生物并且经过进
一步工程改造以表达脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的酶或蛋白质。
[0119] 在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物从含有合成脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的酶促能力的宿主中产生。在这个具体的实施方案中，它可用于增加脂肪醇、脂肪醛
或脂肪酸途径产物的合成或累积，以例如驱动脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径反应朝向脂肪
醇、脂肪醛或脂肪酸生产。可以通过例如编码上述脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径酶或蛋白质
中的一种或多种的核酸的过量表达来完成增加的合成或累积。例如，通过一个或多个内源
基因的外源表达，或者通过一个或多个异源基因的外源表达，可以发生脂肪醇、脂肪醛或脂
肪酸途径的一种或多种酶和/或一种或多种蛋白质的过量表达。因此，天然存在的生物体
可以容易地产生出本发明的非天然存在的微生物，例如产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的非天
然存在的微生物，即通过一、二、三、四、五、六、七或八种，乃至多达所有编码脂肪醇、脂肪醛
或脂肪酸生物合成途径酶或蛋白质的核酸的过量表达。另外，非天然存在的生物体可以通
过内源基因的诱变导致脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成途径中酶的活性增加来产生。
[0120] 在特别有用的实施方案中，采用了编码核酸的外源表达。外源表达赋予宿主定制表达和/或调节元件的能力并且用于达到由使用者控制的所需表达水平。然而，内源表达
也可以用于其它的实施方案中，例如通过去除负调节效应子或者当与诱导性启动子或其它
调节元件连接时诱导基因的启动子。因此，具有天然存在的诱导性启动子的内源基因可以
通过提供适宜的诱导剂而上调，或者内源基因的调节区可以经过工程改造以掺入诱导性调
节元件，从而允许在所需时间调节内源基因的表达增加。类似地，可以包括诱导性启动子作
为调节元件以将外源基因引入到非天然存在的微生物中。
[0121] 应当理解，在本发明的方法中，可以将任何一种或多种外源核酸引入到某种微生物中以产生本发明的非天然存在的微生物。所述核酸可以被引入以例如赋予所述微生物
脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成途径。或者，为了赋予脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成
能力，编码核酸可以被引入以产生具有生物合成能力以催化某些所需反应的中间微生物。
例如，具有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成途径的非天然存在的微生物可包含至少两种
编码所需酶或蛋白质的外源核酸，例如硫解酶和酰基-CoA还原酶的组合(醇形成)，或者
2-氧代酰基-CoA还原酶和酰基-CoA水解酶的组合，或者烯酰-CoA还原酶和酰基-CoA还
原酶的组合(醛形成)，等等。因此，应当理解，本发明的非天然存在的微生物中可包括生物
合成途径的两种或两种以上酶或蛋白质的任何组合。类似地，应当理解，本发明的非天然存
在的微生物中根据需要可包括生物合成途径的三种或三种以上酶或蛋白质的任何组合，例
如，硫解酶、烯酰-CoA还原酶和醛脱氢酶的组合(酸形成)，或者3-羟基酰基-CoA脱水酶、
酰基-CoA:ACP酰基转移酶和硫酯酶的组合，或者3-氧代酰基-CoA还原酶、酰基-CoA水解
酶和羧酸还原酶的组合，等等，只要所需生物合成途径的酶和/或蛋白质的组合可以导致
产生相应的所需产物即可。类似地，本发明的非天然存在的微生物中根据需要可包括如本
文公开的生物合成途径的四、五、六、七、八种或八种以上酶或蛋白质的任何组合，只要所需
生物合成途径的酶和/或蛋白质的组合可以导致产生相应的所需产物即可。
[0122] 除了如本文描述的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生物合成以外，本发明的非天然存在的微生物和方法还可以彼此和/或与本领域熟知的其它微生物和方法以各种组合使用
以达到产物通过其它路径的生物合成。例如，不使用脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产者来生产
脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的一种替代方法是通过加入另一种能够将脂肪醇、脂肪醛或脂肪
酸途径中间体转变成脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的微生物。一种这样的程序包括例如生产脂
肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体微生物的发酵。然后，脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间
体可以用作第二种微生物的底物，从而将脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体转变成脂肪
醇、脂肪醛或脂肪酸。可以将脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体直接加入到第二种生物体
的另一种培养物中，或者脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体生产者的原始培养物可以通
过例如细胞分离来清除掉这些微生物，然后可以向发酵肉汤中后续添加第二种生物体用于
生产最终产物而无需中间纯化步骤。
[0123] 在其它实施方案中，本发明的非天然存在的微生物和方法可以按各种各样的亚途径装配以实现例如脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生物合成。在这些实施方案中，本发明所需产
物的生物合成途径可以分离在不同的微生物中，并且这些不同的微生物可以共培养以产生
最终产物。在这样一种生物合成方案中，一种微生物的产物是第二种微生物的底物直到最
终产物被合成。例如，脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生物合成可以通过构建含有将一种途径中
间体转变成另一种途径中间体或产物的生物合成途径的微生物来完成。或者，脂肪醇、脂肪
醛或脂肪酸也可以通过在同一容器中使用两种生物体的共培养或共发酵由微生物经生物
合成生产，其中第一种微生物生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸中间体，而第二种微生物将此中
间体转变成脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。
[0124] 考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员将会理解，存在着本发明的非天然存在的微生物和方法与其它微生物、与具有亚途径的其它非天然存在的微生物的共培养
物和与本领域熟知的生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的其它化学和/或生物化学方法步骤的
组合一起的各种组合和排列。
[0125] 类似地，本领域技术人员应当理解，宿主生物可基于引入一个或多个基因破坏以增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的产生所需要的特征进行选择。因此，应当理解，如果将遗传
修饰引入到宿主生物中以破坏基因，则可以类似地破坏催化相似但不完全相同代谢反应的
任何同源物、直系同源物或旁系同源物以确保所需代谢反应受到充分破坏。因为不同生物
体之间在代谢网络中存在某些差异，所以本领域技术人员应当理解，给定生物体中被破坏
的实际基因可能在生物体间不相同。然而，考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员
也将理解，本发明的方法可应用于任何合适的宿主微生物以鉴别构建将增加脂肪醇、脂肪
醛或脂肪酸生物合成的所关注物种中的生物体所需要的关联代谢改变。在一个特定的实施
方案中，增加的生产将脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生物合成与生物体的生长耦合，且如果需
要和正如本文所公开的，可将脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生产与生物体的生长强制耦合。
[0126] 脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径酶或蛋白质的编码核酸的来源可包括例如其中所编码的基因产物能够催化参考反应的任何物种。这样的物种既包括原核生物又包括真核生
物，包括但不限于细菌，包括古细菌(archaea)和真细菌(eubacteria)；和真核生物
(eukaryotes)，包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物，包括人。这些来源的示例性物种包
括 例 如 大 肠 杆 菌(Escherichia coli)、255956237 产 黄 青 霉 菌 威 斯 康 辛
54-1255(255956237Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255)、巴 斯德 醋杆 菌
(Acetobacter pasteurians)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、贝氏不动
杆菌(Acinetobacter bayliyi)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、不动
杆菌ADP1(Acinetobacter sp.ADP1)、不动杆菌菌株M-1(Acinetobacter sp.Strain M-1)、
琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、根癌土壤
杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、产金属嗜碱菌QYMF(Alkaliphilus metalliredigens
QYMF)、奥伦兰嗜碱菌OhILAs(Alkaliphilus oremlandii OhILAs)、多变鱼腥藻(Anabaena
variabilis)ATCC 29413、 产 琥 珀 酸 厌 氧 螺 菌 (Anaerobiospirillum
succiniciproducens)、冈比亚疟蚊菌株PEST(Anopheles gambiae str.PEST)、蜜蜂(Apis
mellifera)、风产液菌(Aquifex aeolicus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、闪烁古生球
菌(Archaeoglobus fulgidus)、闪烁古生球菌DSM 4304(Archaeoglobus fulgidus DSM
4304)、猪 蛔 虫 (Ascaris suum)、烟 曲 霉 (Aspergillus fumigatus)、构 巢 曲 霉
(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉CBS 513.88(Aspergillus
niger CBS 513.88)、土曲霉NIH2624(Aspergillus terreus NIH2624)、棕色固氮菌
DJ(Azotobacter vinelandii DJ)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、巨大芽孢杆菌
(Bacillus megaterium)、甲醇芽孢杆菌MGA3(Bacillus methanolicus MGA3)、甲醇芽孢杆
菌PB1、芽孢杆菌菌种SG-1(Bacillus sp.SG-1)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、韦
氏芽孢杆菌KBAB4(Bacillus weihenstephanensis KBAB4)、脆弱拟杆菌(Bacteroides
fragilis)、家蚕(Bombyx mori)、牛(Bos taurus)、日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium
japonicum)、日本慢生根瘤菌USDA110(Bradyrhizobium japonicum USDA110)、欧洲油菜
(Brassica napsus)、不明确伯克霍尔德氏菌AMMD(Burkholderia ambifaria AMMD)、多噬
伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)ATCC 17616、瘤状伯克霍尔德氏菌
(Burkholderia phymatum)、稳定伯克霍尔德氏菌(Burkholderia stabilis)、产丁酸菌
L2-50(butyrate-producing bacterium L2-50)、 布 里 吉 沙 耶 隐 杆 线 虫
AF16(Caenorhabditis briggsae AF16)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、空肠
弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、白色假丝酵母(Candida albicans)、博伊丁假丝酵母
(Candida boidinii)、甲基假丝酵母(Candida methylica)、近平滑假丝酵母(Candida
parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、热带假丝酵母MYA-3404、变形虫原
厚垣假丝酵母(Candidatus Protochlamydia amoebophila)、犬科—家犬(Canis lupus
familiaris)(狗)、生氢氧化羧基嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、红花
(Carthamus tinctorius)、莱 茵 衣 藻(Chlamydomonas reinhardtii)、泥 生 绿 菌
(Chlorobium limicola)、微温绿菌(Chlorobium tepidum)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus
aurantiacus)、香橙(Citrus junos)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、氨基
丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、拜氏
梭菌NCIMB 8052、嗜一氧化碳梭菌P7(Clostridium carboxidivorans P7)、克鲁维氏梭菌
(Clostridium kluyveri)、克鲁维 氏梭菌DSM 555、巴 斯德氏梭 菌(Clostridium
pasteurianum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、共生梭
菌(Clostridium symbiosum)、破伤风梭菌E88(Clostridium tetani E88)、冷红科尔韦尔
氏 菌 34H(Colwellia psychrerythraea 34H)、谷 氨 酸 棒 杆 菌 (Corynebacterium
glutamicum)、新型隐球菌变种(Cryptococcus neoformans var)、小隐孢子虫Iowa
II(Cryptosporidium parvum Iowa II)、萼距花(Cuphea hookeriana)、湿地萼距花
(Cuphea palustris)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、台湾贪铜菌(Cupriavidus
taiwanensis)、蓝 菌属PCC7001(Cyanobium PCC7001)、蓝丝菌 (Cyanothece sp.)PCC
7425、斑马鱼(Danio rerio)、食烯烃脱硫杆菌AK-01(Desulfatibacillum alkenivorans
AK-01)、食 油脱 硫 球菌Hxd3(Desulfococcus oleovorans Hxd3)、非洲 脱硫 弧 菌
(Desulfovibrio africanus)、盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)、盘基网柄菌
AX4(Dictyostelium discoideum AX4)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、赤杆菌
(Erythrobacter sp.)NAP1、大肠杆菌K-12 MG1655、纤细裸藻(Euglena gracilis)、黄杆菌
(Flavobacteria bacterium)BAL38、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、嗜热脱氮土
芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)、流感嗜血菌(Haemophilus influenza)、
死海盐盒菌(Haloarcula marismortui)、死海盐盒菌(Haloarcula marismortui)ATCC
43049、盐单胞菌HTNK1(Halomonas sp.HTNK1)、向日葵(Helianthus annuus)、幽门螺杆菌
(Helicobacter pylori)、幽门螺 杆菌26695、智人(Homo sapiens)、嗜热氢杆 菌
(Hydrogenobacter thermophilus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、乳酸克鲁
维酵 母(Kluyveromyces lactis)、乳 酸克 鲁维 酵母NRRL Y-1140、干酪 乳杆 菌
(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌
(Lactobacillus reuteri)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、雷弗森菌S749(Leifsonia
sp.S749)、肠系膜样明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、鞘丝藻(Lyngbya sp.)PCC
8106、猕猴(Macaca mulatta)、超磁螺菌(Magnetospirillum magneticum)AMB-1、产琥珀酸
曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、海洋γ变型杆菌HTCC2080(marine gamma
proteobacterium HTCC2080)、水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)、水油海杆菌
VT8(Marinobacter aquaeolei VT8)、大黍(Megathyrsus maximus)、百脉根中间根瘤菌
(Mesorhizobium loti)、瑟杜生金属球菌(Metallosphaera sedula)、嗜热甲烷八叠球菌
(Methanosarcina thermophila)、热 自 养 甲 烷 热 杆 菌 (Methanothermobacter
thermautotrophicus)、外链甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、短颈单领藻
(Monosiga brevicollis)MX1、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热醋穆尔氏菌
ATCC 39073、小家鼠(Mus musculus)、鸟分枝杆菌副结核亚种K-10(Mycobacterium avium
subsp.paratuberculosis K-10)、牛分枝杆菌BCG(Mycobacterium bovis BCG)、海分枝杆
菌M(Mycobacterium marinum M)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、耻垢分枝杆
菌MC2 155、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)(菌株JLS)、分枝杆菌MCS、分枝杆菌菌株JLS、
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)DK
1622、星状海葵(Nematostella vectensis)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)OR74A、烟草
(Nicotiana tabacum)、巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)、皮疽诺卡氏菌(Nocardia
farcinica)IFM 10152、艾 奥 瓦 诺 卡 氏 菌(Nocardia iowensis)、泡 沫 节 球 藻
CCY9414(Nodularia spumigena CCY9414)、厚壁孢子念珠藻(Nostoc azollae)、念珠藻
(Nostoc sp.)PCC 7120、丰祐菌(Opitutaceae bacterium)TAV2、脱氮副球菌(Paracoccus
denitrificans)、产 黄青 霉(Penicillium chrysogenum)、海 洋帕 金虫 (Perkinsus
marinus)ATCC 50983、明亮 发 光 杆 菌(Photobacterium phosphoreum)、发 光 杆 菌
(Photobacterium sp.)SKA34、北美云杉(Picea sitchensis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia
pastoris)、巴斯德毕赤酵母GS115、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、牙龈卟啉单胞
菌(Porphyromonas gingivalis)、牙 龈 卟 啉 单 胞 菌W83、海 洋 原 绿 球 藻 MIT
9312(Prochlorococcus marinus MIT 9312)、中度产丙酸菌(Propionigenium modestum)、
绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、绿脓假单胞菌PAO1、荧光假单胞菌
(Pseudomonas fluorescens)、荧光假单胞菌Pf0-1、克氏假单胞菌(Pseudomonas
knackmussii)、克氏假单胞菌(B13)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、恶臭假单胞菌
GB-1、假单胞菌(Pseudomonas sp)、假单胞菌CF600、施氏假单胞菌(Pseudomonas
stutzeri)、施氏假单胞菌A1501、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、好氧火棒菌
(Pyrobaculum aerophilum)菌株IM2、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、耐金属罗
尔斯通氏菌(Ralstonia metallidurans)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、吉祥草(Reinekea
sp.)MED297、豆根瘤菌CFN 42(Rhizobium etli CFN 42)、豌豆根瘤菌(Rhizobium
leguminosarum)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、红平红球菌(Rhodococcus
erythropolis)、红球菌(Rhodococcus sp.)、沼泽红假单胞 菌(Rhodopseudomonas
palustris)、卡氏玫瑰弯菌(Roseiflexus castenholzii)、玫瑰变色菌(Roseovarius sp.)
HTCC2601、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、酿酒酵母s288c、肠道沙门氏菌
(Salmonella enteric)、肠道沙门氏菌鼠伤寒肠道亚种血清型变种菌株LT2(Salmonella
enterica subsp.enterica serovar Typhimurium str.LT2)、鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌
(Salmonella typhimurium)、鼠伤寒沙门氏菌LT2、树干谢尔壶菌(Scheffersomyces
stipitis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、痢疾志贺氏菌(Shigella
dysenteriae)、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、霍霍巴(Simmondsia chinensis)、番茄
(Solanum lycopersicum)、大 孢 粪 壳(Sordaria macrospora)、金 黄 色 葡 萄 球 菌
(Staphylococcus aureus)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、突变链
球菌(Streptococcus mutans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、血链球菌
(Streptococcus sanguinis)、环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)、阿维链霉菌
(Streptomyces avermitillis)、肉桂色链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)、天蓝色链
霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌灰色亚种NBRC 13350(Streptomyces
griseus subsp.griseus NBRC 13350)、苍黄链霉菌(Streptomyces luridus)、链霉菌
(Streptomyces sp)CL190、链 霉 菌 (Streptomyces sp.)KO-3988、绿 紫 链 霉 菌
(Streptomyces viridochromogenes)、威德摩尔链霉菌(Streptomyces wedmorensis)、紫
海 胆 (Strongylocentrotus purpuratus)、 嗜 酸 热 硫 化 叶 菌 (Sulfolobus
acidocaldarius)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、托氏硫化叶菌
(Sulfolobus tokodaii)、地下硫氢菌(Sulfurihydrogenibium subterraneum)、脱氮硫单
胞菌(Sulfurimonas denitrificans)、野猪(Sus scrofa)、细长聚球藻(Synechococcus
elongatus)PCC 6301、细长聚球藻PCC 7942、聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 7002、弗氏
互营杆菌(Syntrophobacter fumaroxidans)、酸养互养菌(Syntrophus aciditrophicus)、
黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)、嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter
ethanolicus)JW 200、嗜热厌氧假乙醇杆菌(Thermoanaerobacter pseudethanolicus)
ATCC 33223、海滨热球菌(Thermococcus litoralis)、嗜中性热变形菌(Thermoproteus
neutrophilus)、海栖热 孢菌(Thermotoga maritime)、齿 垢密螺旋 体(Treponema
denticola)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)G3、
小麦(Triticum aestivum)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma
cruzi)菌株CL Brener、微变束村氏菌(Tsukamurella paurometabola)DSM 20162、加州月
桂(Umbellularia California)、小韦荣氏球菌(Veillonella parvula)、霍乱弧菌(Vibrio
cholerae)V51、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、
玉蜀黍(Zea mays)、生枝动胶菌(Zoogloea ramiger)、运动发酵单胞菌(Zymomonas
mobilis)、运动发酵单胞菌运动亚种ZM4(Zymomonas mobilis subsp.mobilis ZM4)以及
本文公开的或作为相应基因的来源生物体可获得的其它示例性物种。然而，在现在可得到
超过550个物种的完整基因组序列(其中超过一半可在公共数据库(例如NCBI)上获得)
(包括395种微生物基因组和多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组)的情况下，编码近缘
或远缘物种中的一种或多种基因所必需的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成活性的基因
(包括例如已知基因的同源物、直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换)的鉴别；
以及生物体之间的遗传改变的互换为常规的且为本领域所熟知。因此，允许本文中参考特
定生物体(例如大肠杆菌)所描述的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成的代谢改变可容易
地应用于其它微生物，同样包括原核生物和真核生物。考虑到本文提供的教导和指导，本领
域技术人员将会知道，在一种生物体中例示的代谢改变可同等地适用于其它生物体。
[0127] 在有些情况下，例如当无亲缘关系的物种中存在替代脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成途径时，脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成可通过例如来自无亲缘关系的物种的催
化相似、但非完全相同的代谢反应以替代参考反应的一种或多种旁系同源物的外源表达而
被赋予宿主物种。因为不同的生物体之间在代谢网络中存在某些差异，所以，本领域技术人
员应当理解，在不同的生物体之间的实际基因使用可能不同。然而，考虑到本文提供的教导
和指导，本领域技术人员也应当理解，采用本文例举的那些的关联(cognate)代谢改变以
在目标物种中构建将合成脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的微生物，本发明的教导和方法可适用
于所有的微生物。编码本发明的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径酶或蛋白质的核酸分子也可
以包括与本文中利用SEQ ID NO、GenBank和/或GI编号所公开的核酸杂交的核酸分子；或
与编码本文中利用SEQ ID NO、GenBank和/或GI编号所公开的氨基酸序列的核酸分子杂
交的核酸分子。杂交条件可包括高度严格、中等严格或低严格杂交条件，这是本领域技术人
员众所周知的，例如本文描述的那些。类似地，可用于本发明的核酸分子可描述为与本文中
利用SEQ ID NO、GenBank和/或GI编号所公开的核酸或者与编码本文中利用SEQ ID NO、
GenBank和/或GI编号所公开的氨基酸序列的核酸分子杂交的核酸分子具有某一百分序
列同一性。例如，核酸分子可以与本文描述的核酸具有至少65％、70％、75％、80％、85％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0128] 严格杂交是指在所杂交的多核苷酸处于稳定时的条件。正如本领域技术人员所知，所杂交的多核苷酸的稳定性以杂交体的解链温度(Tm)反映。一般而言，所杂交多核苷
酸的稳定性是盐浓度(例如钠离子浓度)和温度的函数。杂交反应可以在较低严格性的
条件下进行，随后进行具有不同但较高严格性的洗涤。提及杂交严格性涉及这样的洗涤条
件。高度严格杂交包括仅允许在65℃下在0.018M NaCl中形成稳定杂交的多核苷酸的那
些核酸序列杂交的条件，例如，如果杂交体在65℃下在0.018M NaCl中不稳定，那么其在如
本文考虑的高严格性条件下将不稳定。高严格性条件可例如通过以下方式来提供：在42℃
下在50％甲酰胺、5X Denhart氏溶液、5X SSPE、0.2％SDS中杂交，随后在65℃下在0.1X
SSPE和0.1％SDS中洗涤。也可以使用不同于高度严格杂交条件的杂交条件来描述本文
公开的核酸序列。例如，短语中等严格杂交是指相当于以下的条件：在42℃下在50％甲酰
胺、5X Denhart氏溶液、5X SSPE、0.2％SDS中杂交，随后在42℃下在0.2X SSPE、0.2％SDS
中洗涤。短语低严格杂交是指相当于以下的条件：在22℃下在10％甲酰胺、5X Denhart氏
溶液、6X SSPE、0.2％SDS中杂交，随后在37℃下在1X SSPE、0.2％SDS中洗涤。Denhart
氏溶液含有1％Ficoll、1％聚乙烯吡咯烷酮和1％牛血清白蛋白(BSA)。20X SSPE(氯
化钠、磷酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA))含有3M氯化钠、0.2M磷酸钠和0.025M(EDTA)。其
它合适的低、中等和高严格性杂交缓冲液和条件是本领域技术人员众所周知的并且描述
于Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring
Harbor Laboratory,New York(2001)；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular
Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)。
[0129] 编码本发明的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径酶或蛋白质的核酸分子可与本文公开的核苷酸序列具有至少某一序列同一性。因此，在本发明的有些方面，编码脂肪醇、脂肪醛
或脂肪酸途径酶或蛋白质的核酸分子具有这样的核苷酸序列：与在本文中利用SEQ ID NO、
GenBank和/或GI编号所公开的核酸或与编码在本文中利用SEQ ID NO、GenBank和/或
GI编号所公开的氨基酸序列的核酸分子杂交的核酸分子有至少65％同一性、至少70％同
一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同
一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同
一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。
[0130] 序列同一性(也称为同源性或相似性)是指两个核酸分子之间或两个多肽之间的序列相似性。可通过比较各序列中的位置来确定同一性，该位置可进行比对用于比较目的。
当所比较序列中的位置被相同碱基或氨基酸占据时，则此分子在该位置上完全相同。序列
之间的同一性程度随着序列所共享的匹配或同源位置数目而变化。测定其百分序列同一性
的两个序列之间的比对可以使用本领域已知的软件程序来进行，该软件程序例如在以下文
献中描述的那些：Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley
and Sons,Baltimore,MD(1999)。优选地，使用默认参数进行比对。本领域众所周知的可使
用的一种比对程序是设定了默认参数的BLAST。具体地说，程序是BLASTN和BLASTP，使用
下列默认参数：遗传密码＝标准品；过滤器＝无；股数＝两股；截止值(cutoff)＝60；期望
值(expect)＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高分值；数据库＝非
冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程
序的详情可以在美国国家生物技术信息中心(the National Center for Biotechnology
Information)获得。
[0131] 用于构建非天然存在的产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸宿主并测试其表达水平的方法可以例如通过本领域众所周知的重组和检测方法来实施。这样的方法可以在例如以下文献
中找到：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring
Harbor Laboratory,New York(2001)；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular
Biology,John Wiley和Sons,Baltimore,MD(1999)。
[0132] 采用本领域众所周知的技术，包括但不限于接合、电穿孔、化学转化、转导、转染和超声转化，可以将参与产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的途径的外源核酸序列稳定地或
瞬时地导入宿主细胞中。对于在大肠杆菌或其它原核细胞中的外源表达，真核生物核酸
的基因或cDNA中的某些核酸序列可以编码靶向信号，例如N-端线粒体靶向信号或其它
靶向信号，这些靶向信号可以在转化到原核宿主细胞之前去除掉(如果需要的话)。例
如，线粒体前导序列的去除导致在大肠杆菌中的表达增加(Hoffmeister等人,J.Biol.
Chem.280:4329-4338(2005))。对于在酵母或其它真核细胞中的外源表达，基因可以在细胞
溶质中表达而无需添加前导序列，或者可以靶向线粒体或其它细胞器，或者通过添加合适
的靶向序列例如适合宿主细胞的线粒体靶向信号或分泌信号而靶向分泌。因此，应当理解，
为了去除或包括靶向序列而对核酸序列的适宜修饰可以被掺入到外源核酸序列中以带来
所需要的特性。此外，基因可以用本领域众所周知的技术进行密码子最优化以达到蛋白质
的最佳表达。
[0133] 正如本文例举的，可以构建一种或多种表达载体以包括一种或多种脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成途径编码核酸，该编码核酸与宿主生物中有功能的表达调控序列操作
性连接。适用于本发明的微生物宿主生物的表达载体包括例如质粒、噬菌体载体、病毒载
体、附加体(episomes)和人工染色体，包括可操作用于稳定整合到宿主染色体中的载体和
选择序列或标记。另外，表达载体可包括一个或多个选择标记基因和适宜的表达调控序列。
也可包括例如提供对抗生素或毒素的抗性、代偿营养缺陷型缺乏或者供给培养基中没有的
关健营养物的选择标记基因。表达调控序列可包括组成性和诱导性启动子、转录增强子、
转录终止子等，这些都是本领域众所周知的。当两种或两种以上外源编码核酸必须共表达
时，可以将两种核酸例如插入到一个表达载体中或者插入到独立的表达载体中。对于单个
载体表达，编码核酸可以与一个共同的表达调控序列操作性连接或者与不同的表达调控序
列(例如一个诱导性启动子和一个组成性启动子)操作性连接。参与代谢或合成途径的外
源核酸序列的转化可以使用本领域众所周知的方法来证实。这样的方法包括例如核酸分析
法，例如mRNA的RNA印迹法或聚合酶链式反应(PCR)扩增法，或用于基因产物表达的免疫
印迹法，或测试引入的核酸序列或其相应基因产物表达的其它合适分析方法。本领域技术
人员应当理解，外源核酸以足以产生所需产物的量进行表达，本领域技术人员还应当理解，
可以采用本领域众所周知的和本文公开的方法对表达水平进行最优化以获得足够的表达。
[0134] 在有些实施方案中，本发明提供用于生产式(I)的化合物的方法：
[0135]
[0136] 其中R1为C1-24直链烷基；R2为CH2OH、CHO或COOH；R3为H、OH或氧代(＝O)；且代表单键或双键，前提条件是R3所连接的碳原子的化合价为四价，包括将非天然存
在的微生物在足以产生式(I)的化合物的条件下培养足够的时间周期，其中所述非天然存
在的微生物具有MI-FAE循环和/或MD-FAE循环与终止途径的组合，其中所述MI-FAE循
环包括一种或多种硫解酶、一种或多种3-氧代酰基-CoA还原酶、一种或多种3-羟基酰
基-CoA脱水酶及一种或多种烯酰-CoA还原酶，其中所述MD-FAE循环包括一种或多种延
长酶、一种或多种3-氧代酰基-CoA还原酶、一种或多种3-羟基酰基-CoA脱水酶及一种
或多种烯酰-CoA还原酶，其中所述终止途径包括图1、6或7中所示的途径，选自：(1)1H；
(2)1K和1L；(3)1E和1N；(4)1K,1J和1N；(5)1E；(6)1K和1J；(7)1H和1N；(8)1K,1L和
1N；(9)1E和1F；(10)1K,1J和1F；(11)1H,1N和1F；(12)1K,1L,1N和1F；和(13)1G，其中
1E是酰基-CoA还原酶(醛形成)，其中1F是醇脱氢酶，其中1G是酰基-CoA还原酶(醇形
成)，其中1H是酰基-CoA水解酶、酰基-CoA转移酶或酰基-CoA合酶，其中1J是酰基-ACP
还原酶，其中1K是酰基-CoA:ACP酰基转移酶，其中1L是硫酯酶，其中1N是醛脱氢酶(酸
形成)或羧酸还原酶，其中所述MI-FAE循环、MD-FAE循环或终止途径的酶由至少一种外源
核酸编码且以足以产生式(I)的化合物的量表达，其中该MI-FAE循环、MD-FAE循环和该终
止途径的所述酶中的每一种酶的底物独立地选自式(II)的化合物、丙二酰-CoA、丙酰-CoA
或乙酰-CoA：
[0137]
[0138] 其中R1为C1-24直链烷基；R3为H、OH或氧代(＝O)；R4为S-CoA、ACP、OH或H；且代表单键或双键，前提条件是R3所连接的碳原子的化合价为四价；其中该MI-FAE循
环的所述一种或多种酶各自对R1上的碳原子数不大于所述式(I)化合物的R1上的碳原子
数的式(II)化合物具有选择性，其中该MD-FAE循环的所述一种或多种酶各自对R1上的碳
原子数不大于所述式(I)化合物的R1上的碳原子数的式(II)化合物具有选择性，和其中
该终止途径的所述一种或多种酶各自对R1上的碳原子数不小于所述式(I)化合物的R1上
的碳原子数的式(II)化合物具有选择性。
[0139] 在有些实施方案中，本发明提供用于生产式(I)的化合物的方法，其中R1为C1-17直链烷基。在本发明的另一个方面，该式(I)的化合物的R1是C1直链烷基、C2直链烷基、C3
直链烷基、C4直链烷基、C5直链烷基、C6直链烷基、C7直链烷基、C8直链烷基、C9直链烷基、
C10直链烷基、C11直链烷基、C12直链烷基或C13直链烷基、C14直链烷基、C15直链烷基、C16直
链烷基、C17直链烷基、C18直链烷基、C19直链烷基、C20直链烷基、C21直链烷基、C22直链烷基、
C23直链烷基或C24直链烷基。
[0140] 在本发明的有些方面，本发明的方法中使用的微生物包括二、三或四种外源核酸，各自编码该MI-FAE循环或该MD-FAE循环的酶。在本发明的有些方面，本发明的方法中使
用的微生物包括二、三或四种外源核酸，各自编码该终止途径的酶。在本发明的有些方面，
本发明的方法中使用的微生物包括编码选自(1)-(13)的途径中的至少一种途径的各种酶
的外源核酸。在有些方面，所述至少一种外源核酸是异源核酸。在有些方面，本发明的方法
中使用的非天然存在的微生物是在基本上厌氧的培养基中。
[0141] 在有些实施方案中，本发明提供用于生产选自式(III)-(VI)的脂肪醇的方法：
[0142]其中R1为C1-24直链烷基，或者R1为C1-17直链烷基，或者R1为C9-13
直链烷基。在本发明的有些方面，R1为C1直链烷基、C2直链烷基、C3直链烷基、C4直链烷基、
C5直链烷基、C6直链烷基、C7直链烷基、C8直链烷基、C9直链烷基、C10直链烷基、C11直链烷
基、C12直链烷基或C13直链烷基、C14直链烷基、C15直链烷基、C16直链烷基、C17直链烷基、C18
直链烷基、C19直链烷基、C20直链烷基、C21直链烷基、C22直链烷基、C23直链烷基或C24直链
烷基。
[0143] 在有些实施方案中，本发明提供用于生产选自式(VII)-(X)的脂肪醛的方法：
[0144]其中R1为C1-24直链烷基，或者R1为C1-17直链烷基，或者R1为C9-13
直链烷基。在本发明的有些方面，R1为C1直链烷基、C2直链烷基、C3直链烷基、C4直链烷基、
C5直链烷基、C6直链烷基、C7直链烷基、C8直链烷基、C9直链烷基、C10直链烷基、C11直链烷
基、C12直链烷基或C13直链烷基、C14直链烷基、C15直链烷基、C16直链烷基、C17直链烷基、C18
直链烷基、C19直链烷基、C20直链烷基、C21直链烷基、C22直链烷基、C23直链烷基或C24直链
烷基。
[0145] 在有些实施方案中，本发明提供用于生产选自式(XI)-(XIV)的脂肪酸的方法：
[0146]其中R1为C1-24直链烷基，或者R1为C1-17直链烷基，或者R1为C9-13
直链烷基。在本发明的有些方面，R1为C1直链烷基、C2直链烷基、C3直链烷基、C4直链烷基、
C5直链烷基、C6直链烷基、C7直链烷基、C8直链烷基、C9直链烷基、C10直链烷基、C11直链烷
基、C12直链烷基或C13直链烷基、C14直链烷基、C15直链烷基、C16直链烷基、C17直链烷基、C18
直链烷基、C19直链烷基、C20直链烷基、C21直链烷基、C22直链烷基、C23直链烷基或C24直链
烷基。
[0147] 在有些实施方案中，用于生产本文描述的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的方法包括使用具有乙酰-CoA途径和至少一种编码以足以产生乙酰-CoA的量表达的乙酰-CoA途径酶
的外源核酸的非天然存在的微生物，其中所述乙酰-CoA途径包括图2、3、4或5中所示的途
径，选自：(1)2A和2B；(2)2A,2C和2D；(3)2H；(4)2G和2D；(5)2E,2F和2B；(6)2E和2I；
(7)2J,2F和2B；(8)2J和2I；(9)3A,3B和3C；(10)3A,3B,3J,3K和3D；(11)3A,3B,3G和3D；
(12)3A,3F和3D；(13)3N,3H,3B和3C；(14)3N,3H,3B,3J,3K和3D；(15)3N,3H,3B,3G和3D；
(16)3N,3H,3F和 3D；(17)3L,3M,3B和 3C；(18)3L,3M,3B,3J,3K和 3D；(19)3L,3M,3B,3G
和 3D；(20)3L,3M,3F 和 3D；(21)4A,4B,4D,4H,4I 和 4J；(22)4A,4B,4E,4F,4H,4I 和
4J；(23)4A,4B,4E,4K,4L,4H,4I 和 4J；(24)4A,4C,4D,4H 和 4J；(25)4A,4C,4E,4F,4H
和 4J；(26)4A,4C,4E,4K,4L,4H 和 4J；(27)5A,5B,5D 和 5G；(28)5A,5B,5E,5F 和 5G；
(29)5A,5B,5E,5K,5L和5G；(30)5A,5C和5D；(31)5A,5C,5E和5F；和(32)5A,5C,5E,5K和
5L，其中2A是丙酮酸氧化酶(乙酸形成)，其中2B是乙酰-CoA合成酶、乙酰-CoA连接酶
或乙酰-CoA转移酶，其中2C是乙酸激酶，其中2D是磷酸转乙酰酶，其中2E是丙酮酸脱羧
酶，其中2F是乙醛脱氢酶，其中2G是丙酮酸氧化酶(乙酰-磷酸形成)，其中2H是丙酮酸
脱氢酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸:NAD(P)H氧化还原酶或丙酮酸甲酸裂合
酶，其中2I是乙醛脱氢酶(酰基化)，其中2J是苏氨酸醛缩酶，其中3A是磷酸烯醇丙酮酸
(PEP)羧化酶或PEP羧激酶，其中3B是草酰乙酸脱羧酶，其中3C是丙二酸半醛脱氢酶(乙
酰基化)，其中3D是乙酰-CoA羧化酶或丙二酰-CoA脱羧酶，其中3F是草酰乙酸脱氢酶或
草酰乙酸氧化还原酶，其中3G是丙二酸半醛脱氢酶(酰基化)，其中3H是丙酮酸羧化酶，其
中3J是丙二酸半醛脱氢酶，其中3K是丙二酰-CoA合成酶或丙二酰-CoA转移酶，其中3L是
苹果酸酶，其中3M是苹果酸脱氢酶或苹果酸氧化还原酶，其中3N是丙酮酸激酶或PEP磷酸
酶，其中4A是柠檬酸合酶，其中4B是柠檬酸转运体，其中4C是柠檬酸/苹果酸转运体，其中
4D是ATP柠檬酸裂合酶，其中4E是柠檬酸裂合酶，其中4F是乙酰-CoA合成酶或乙酰-CoA
转移酶，其中4H是细胞溶质苹果酸脱氢酶，其中4I是苹果酸转运体，其中4J是线粒体苹果
酸脱氢酶，其中4K是乙酸激酶，其中4L是磷酸转乙酰酶，其中5A是柠檬酸合酶，其中5B是
柠檬酸转运体，其中5C是柠檬酸/草酰乙酸转运体，其中5D是ATP柠檬酸裂合酶，其中5E
是柠檬酸裂合酶，其中5F是乙酰-CoA合成酶或乙酰-CoA转移酶，其中5G是草酰乙酸转运
体，其中5K是乙酸激酶，和其中5L是磷酸转乙酰酶。
[0148] 在有些方面，本发明的方法中使用的微生物包括二、三、四、五、六、七或八种外源核酸，各自编码乙酰-CoA途径酶。在有些方面，本发明的方法中使用的微生物包括编码选
自(1)-(32)的途径中的至少一种途径的各种乙酰-CoA途径酶的外源核酸。
[0149] 可以采用众所周知的方法进行合适的纯化和/或测定以测试脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生产。对于每个待测的工程菌株，可以让合适的重复例如一式三份的培养物生长。
例如，可以监测工程生产宿主中产物和副产物的形成。通过诸如HPLC(高效液相层析)、
GC-MS(气相层析-质谱法)和LC-MS(液相层析-质谱法)的方法或者采用本领域众所周知
的常规程序的其它合适分析方法，可以对最终产物和中间体、和其它有机化合物进行分析。
发酵肉汤中产物的释放也可以用培养物上清液进行测试。采用例如折射率检测器(对于葡
萄糖和醇)和UV检测器(对于有机酸)(Lin等人,Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005))
或本领域众所周知的其它合适的测定和检测方法，副产物和残留葡萄糖可以通过HPLC进
行定量。来自外源DNA序列的个体酶或蛋白质活性也可以用本领域众所周知的方法进行测
定。
[0150] 采用本领域众所周知的各种方法，可以将脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸与培养物中的其它组分分离开来。这样的分离方法包括例如萃取程序以及包括连续液-液萃取、渗透蒸
发、膜过滤、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、萃取过滤、离子交换层析、大小排阻
层析、吸附层析和超滤的方法。所有的上述方法都是本领域众所周知的。
[0151] 本文描述的任何非天然存在的微生物可以进行培养以产生和/或分泌本发明的生物合成产物。例如，脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产者可以进行培养以经生物合成生产脂肪
醇、脂肪醛或脂肪酸。因此，在有些实施方案中，本发明提供具有本文描述的脂肪醇、脂肪醛
或脂肪酸途径中间体的培养基。在有些方面，所述培养基也可以与产生脂肪醇、脂肪醛或脂
肪酸途径中间体的本发明的非天然存在的微生物分离开。用于将微生物与培养基分离的方
法是本领域众所周知的。示例性的方法包括过滤、絮凝、沉淀、离心、沉降等。
[0152] 为了生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸，将重组菌株在含碳源和其它必需营养物的培养基中进行培养。有时较为理想且可能为十分理想的是在发酵罐中维持厌氧条件以降低总
过程的成本。这样的条件可以用下述方法获得：例如，首先在培养基中充入氮气，然后将带
有隔片和皇冠盖(crimp-cap)的烧瓶密封。对于其中在厌氧条件下未观察到生长的菌株来
说，可以采用微好氧条件或基本上厌氧条件，即在隔片上钻小洞供有限通气。示例性的厌氧
条件先前已有描述并且是本领域众所周知的。示例性的好氧和厌氧条件描述于例如于2007
年8月10日申请的美国专利申请2009/0047719。发酵可按本文公开的分批方式、补料-分
批方式或连续方式进行。发酵也可以分两个阶段进行，如果需要的话。第一个阶段可以是好
氧的以允许高生长并因此有高生产率，后接高的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产量的厌氧阶段。
[0153] 如有需要，可以将培养基的pH维持在所需要的pH，特别是中性pH，例如pH约为7，即通过按需要加入碱(例如NaOH或其它碱)或酸以将培养基维持在所需要的pH。生长速
率可以通过使用分光光度计(600nm)测量光密度来测定，葡萄糖摄取速率可以通过监测碳
源随时间的消耗量来测定。
[0154] 生长培养基可包括例如可以给所述非天然存在的微生物供应碳源的任何碳水化合物来源。这样的来源包括例如糖，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、
蔗糖和淀粉；或甘油，且应当理解，可使用单独作为唯一碳源或与本文描述的或本领域已
知的其它碳源组合的碳源。碳水化合物的其它来源包括例如可再生贮存物(renewable
feedstocks)和生物质(biomass)。在本发明的方法中可用作贮存物的示例性生物质类型
包括纤维素类生物质、半纤维素类生物质和木质素贮存物或贮存物部分。这样的生物质类
贮存物含有例如可用作碳源的碳水化合物底物例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露
糖、果糖和淀粉。考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员将会理解，除了以上例举
的那些以外的可再生贮存物和生物质也可以用来培养本发明的微生物以生产脂肪醇、脂肪
醛或脂肪酸。
[0155] 除了可再生贮存物例如以上例举的那些以外，本发明的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸微生物也可以进行修饰以在作为其碳源的合成气上进行生长。在这个具体的实施方案中，
使一种或多种蛋白质或酶在产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生物体中进行表达以提供利用合
成气或其它气体碳源的代谢途径。
[0156] 合成气体(synthesis gas)，也称为合成气(syngas)或发生炉煤气(producergas)，是煤的气化和含碳材料例如生物质材料(包括农作物和残留物)的气化的主要产物。
合成气是主要为H2和CO的混合物并且可以得自任何有机贮存物，包括但不限于煤、煤油、
天然气、生物质和废有机物质的气化。气化一般在高燃料/氧比率下进行。尽管主要是H2
和CO，但是合成气也可包括较少量的CO2和其它气体。因此，合成气体提供了一种成本有效
的气体碳源例如CO，另外还有CO2。
[0157] Wood-Ljungdahl途径催化CO和H2转变成乙酰-CoA和其它产物(例如乙酸盐(酯)(acetate))。能够利用CO和合成气的生物体一般也具有通过Wood-Ljungdahl途
径所包括的一组相同的基础酶和转化作用来利用CO2和CO2/H2混合物的能力。由微生
物将CO2经H2依赖性转变成乙酸在揭示出CO也可以被相同的生物体所利用并且涉及
相同的途径之前不久就被认识到。许多产乙酸菌(acetogen)已显示能在CO2存在下生
长并产生诸如乙酸盐的化合物，只要有氢存在以供给必需的还原当量即可(参见例如，
Drake,Acetogenesis,pp.3-60 Chapman and Hall,New York,(1994))。这可以用以下反应
式概述：
[0158] 2CO2+4H2+n ADP+n Pi→CH3COOH+2H2O+n ATP
[0159] 因此，具备Wood-Ljungdahl途径的非天然存在的微生物也可以利用CO2和H2混合物来产生乙酰-CoA和其它所需产物。
[0160] Wood-Ljungdahl途径是本领域众所周知的并且由12个反应组成，这12个反应可分成两支：(1)甲基支和(2)羰基支。甲基支将合成气转变成甲基-四氢叶酸(甲基-THF)，
而羰基支将甲基-THF转变成乙酰-CoA。甲基支中的反应由以下酶或蛋白质按顺序催化：
铁氧还蛋白氧化还原酶、甲酸脱氢酶、甲酰基四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化脱水
酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。羰基支中的反应由以下酶或蛋白质
按顺序催化：甲基四氢叶酸:类咕啉(corrinoid)蛋白甲基转移酶(例如AcsE)、类咕啉
铁-硫蛋白、镍蛋白装配蛋白(例如AcsF)、铁氧还蛋白、乙酰-CoA合酶、一氧化碳脱氢酶
和镍蛋白装配蛋白(例如CooC)。根据本文提供的用于引入足够数目的编码核酸以产生
脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的教导和指导，本领域技术人员应当理解，就至少导入在宿主
生物中不存在的编码Wood-Ljungdahl酶或蛋白质的核酸而论，也可以进行相同的工程设
计。因此，将一种或多种编码核酸导入到本发明的微生物中使得经修饰的生物体含有完全
Wood-Ljungdahl途径将会赋予合成气利用能力。
[0161] 另外，还原性(反向)三羧酸循环结合一氧化碳脱氢酶和/或加氢酶活性也可以用于将CO、CO2和/或H2转变成乙酰-CoA和其它产物(例如乙酸盐(酯))。通过还原性
TCA途径能够固定碳的生物体可以利用下列酶中的一种或多种：ATP柠檬酸-裂合酶、柠檬
酸裂合酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、琥珀酰-CoA
合成酶、琥珀酰-CoA转移酶、延胡索酸还原酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、NAD(P)H:铁氧
还蛋白氧化还原酶、一氧化碳脱氢酶和加氢酶。具体地讲，通过一氧化碳脱氢酶和加氢酶从
CO和/或H2萃取的还原当量(reducing equivalents)用于通过还原性TCA循环将CO2固
定成为乙酰-CoA或乙酸盐(酯)。乙酸盐(酯)可通过例如乙酰-CoA转移酶、乙酸激酶/
磷酸转乙酰酶和乙酰-CoA合成酶等酶转变成乙酰-CoA。乙酰-CoA可通过丙酮酸:铁氧还
蛋白氧化还原酶和糖异生作用(gluconeogenesis)的酶转变成脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸前
体，3-磷酸甘油醛、磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸。根据本文提供的用于引入足够数目的编码核
酸以产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的教导和指导，本领域技术人员应当理解，就至少导
入在宿主生物中不存在的编码还原性TCA途径酶或蛋白质的核酸而论，也可以进行相同的
工程设计。因此，将一种或多种编码核酸导入到本发明的微生物中使得经修饰的生物体含
有还原性TCA途径可以赋予合成气利用能力。
[0162] 因此，考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员应当理解，非天然存在的微生物当在碳源(例如碳水化合物)上生长时就可以产生并分泌本发明的生物合成化合
物。这样的化合物包括例如脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸和在脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中
的中间代谢物中的任一种。唯一需要的是对一种或多种所需酶或蛋白质活性进行工程改
造以达到所需化合物或中间体(包括例如脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成途径中的某些
或全部)的生物合成。因此，本发明提供非天然存在的微生物，当在碳水化合物或其它碳
源上生长时能产生和/或分泌脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸并且当在碳水化合物或其它碳源上
生长时能产生和/或分泌脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中所示的中间代谢物的任何一个。
本发明的产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的微生物可以从例如以下的中间体开始合成：3-酮酰
基-CoA、3-羟基酰基-CoA、烯酰-CoA、酰基-CoA、酰基-ACP、乙酸、乙醛、乙酰-磷酸、草酰
乙酸、苹果酸(matate)、丙二酸半醛、丙二酸、丙二酰-CoA、乙酰-CoA或柠檬酸。
[0163] 使用本领域众所周知的方法(如本文例举的方法)构建本发明的非天然存在的微生物以外源性表达至少一种编码脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径酶或蛋白质的核酸，其表达
量足以产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。应当理解，本发明的微生物在足以产生脂肪醇、脂肪
醛或脂肪酸的条件下进行培养。根据本文提供的教导和指导，本发明的非天然存在的微生
物可以实现生物合成脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸，导致胞内浓度在约0.1-200mM之间或200mM
以上。一般而言，脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的胞内浓度是在约3-150mM之间，特别是在约
5-125mM约之间，和更特别是在约8-100mM之间，包括约10mM、20mM、50mM、80mM或80mM以
上。在这些示例性范围中的每一个范围内或者高于它们的胞内浓度也可以由本发明的非天
然存在的微生物实现。
[0164] 在有些实施方案中，培养条件包括厌氧或基本上厌氧的生长或维持条件。示例性的厌氧条件先前已有描述并且是本领域众所周知的。用于发酵过程的示例性厌氧条件在本
文中有描述并且描述于2007年8月10日申请的美国专利公布2009/0047719。这些条件中
的任何一个都可以与所述非天然存在的微生物以及本领域众所周知的其它厌氧条件一起
使用。在这样的厌氧或基本上厌氧的条件下，脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产者可以合成脂肪
醇、脂肪醛或脂肪酸，达到胞内浓度为5-10mM或10mM以上以及本文例举的所有其它浓度。
应当理解，即使上述描述指的是胞内浓度，但是产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸微生物可以在细
胞内产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸和/或将该产物分泌到培养基中。
[0165] 示例性的发酵过程包括但不限于补料-分批发酵和分批分离；补料-分批发酵和连续分离；和连续发酵和连续分离。在示例性的分批发酵方案中，使生产用生物体在大小合
适的通入适当气体的生物反应器中生长。在厌氧条件下，培养物中通入惰性气体或例如氮
气、N2/CO2混合气、氩气、氦气等气体的组合。随着细胞生长和利用碳源，将另外的碳源和/
或其它营养物以大致平衡碳源和/或营养物消耗的速率投入生物反应器中。生物反应器的
温度维持在所需要的温度，一般在22-37摄氏度的范围内，但是也可根据生产用生物体的
生长特性和/或发酵过程的所需条件将温度维持在较高或较低温度下。生长持续一段所需
时间周期以达到发酵罐中培养物的所需特征，例如细胞密度、产物浓度等。在分批发酵过程
中，发酵的时间周期一般是在几小时到几天，例如8至24小时，或1、2、3、4或5天，或长达一
周的范围内，这取决于所需要的培养条件。可视需要控制或不控制pH，在此情况下，其中不
控制pH的培养物在运行结束时典型地将降低至pH 3-6。在培养期完成时，可使发酵罐内容
物通过细胞分离单元(例如离心机、过滤单元及其类似单元)以移除细胞和细胞碎片。在
所需产物在细胞内表达的情况下，可视需要在自发酵肉汤分离细胞之前或之后以酶促方式
或以化学方式溶解或破坏细胞，以便释放另外的产物。可以将发酵肉汤转移到产物分离单
元。产物的分离通过本领域使用的标准分离程序进行以自稀的水溶液分离所需产物。这样
的方法包括但不限于适当时使用水不混溶有机溶剂(例如，甲苯或其它合适的溶剂，包括
但不限于乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲
基叔丁基醚(MTBE)、二噁烷、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)等)进行液-液萃取以
提供产物的有机溶液；标准蒸馏方法；及类似方法，这取决于发酵过程的产物的化学特征。
[0166] 在示例性的完全连续发酵方案中，生产用生物体一般是首先以分批模式生长以便达到所需细胞密度。当碳源和/或其它营养物耗尽时，以所需速率连续供应相同组成的投
料培养基，且以相同速率取出发酵液。在这样的条件下，生物反应器中的产物浓度以及细胞
密度一般保持恒定。发酵罐的温度维持在所需温度下，如上所论述。在连续发酵阶段期间，
一般理想的是维持合适的pH范围以实现最优化生产。pH可使用常规方法监测并维持，该
方法包括添加合适的酸或碱以维持所需pH范围。适当的时候且必要时，生物反应器连续地
操作延长的时间周期，一般至少一周到几周，和长达一个月，或更长时间。发酵液和/或培
养物视需要定期进行监测，包括多达每天取样，以确保产物浓度和/或细胞密度的一致性。
在连续模式中，随着新投料培养基的供应，连续移除发酵罐内容物。一般对含有细胞、培养
基和产物的出口流(exit stream)进行连续产物分离程序，视需要移除或不移除细胞和细
胞碎片。本领域所用的连续分离方法可用于自稀的水溶液分离产物，包括但不限于使用水
不混溶有机溶剂(例如，甲苯或其它合适的溶剂，包括但不限于乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃
(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、二噁烷、二甲基
甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)等)进行连续液-液萃取；标准连续蒸馏方法等或其它本
领域众所周知的方法。
[0167] 除了本文公开的培养和发酵条件以外，用于实现脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成的生长条件还可包括往培养条件中添加渗透保护剂。在某些实施方案中，本发明的非
天然存在的微生物可以在渗透保护剂存在下按本文所述方法进行保持、培养或发酵。简
而言之，渗透保护剂是指起到渗透质(osmolyte)的作用并且有助于本文所述微生物在渗
透胁迫下存活的化合物。渗透保护剂包括但不限于甜菜碱、氨基酸和糖(如海藻糖)。这
类渗透保护剂的非限制性实例有甘氨酸甜菜碱、果仁糖甜菜碱、二甲基噻亭、二甲基磺酸
基(slfonio)丙酸盐、3-二甲基磺酸基(sulfonio)-2-甲基丙酸盐、哌啶甲酸(pipecolic
acid)、二甲基磺酸基乙酸盐、胆碱、L-肉毒碱和(S)-2-甲基-1,4,5,6-四氢甲基嘧
啶-4-羧酸(ectoine)。在一个方面，所述渗透保护剂是甘氨酸甜菜碱。本领域普通技术人
员应当理解，适合保护本文所述微生物免于渗透胁迫的渗透保护剂的含量和类型将取决于
所使用的微生物。渗透保护剂在培养条件下的含量可以是例如不超过约0.1mM、不超过约
0.5mM、不超过约1.0mM、不超过约1.5mM、不超过约2.0mM、不超过约2.5mM、不超过约3.0mM、
不超过约5.0mM、不超过约7.0mM、不超过约10mM、不超过约50mM、不超过约100mM或不超过
约500mM。
[0168] 在有些实施方案中，可以选择所述碳贮存物和其它细胞摄取来源例如磷酸酯、氨、硫酸酯、氯化物和其它卤素来改变脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或任何脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸
途径中间体中存在的原子的同位素分布。以上列举的各种碳贮存物和其它摄取来源在本文
中将统称为“摄取来源(uptake sources)”。摄取来源可提供产物脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸
或脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体中存在的任何原子的同位素富集，或者来自脂肪醇、
脂肪醛或脂肪酸途径以外的不同的反应中产生的副产物的同位素富集。可以对包括例如
碳、氢、氧、氮、硫、磷、氯或其它卤素的任何靶原子实现同位素富集。
[0169] 在有些实施方案中，所述摄取来源可以进行选择以改变碳-12、碳-13和碳-14比率(ratios)。在有些实施方案中，所述摄取来源可以进行选择以改变氧-16、氧-17和氧-18
比率。在有些实施方案中，所述摄取来源可以进行选择以改变氢、氘和氚(tritium)比率。
在有些实施方案中，所述摄取来源可以进行选择以改变氮-14和氮-15比率。在有些实施
方案中，所述摄取来源可以进行选择以改变硫-32、硫-33、硫-34和硫-35比率。在有些实
施方案中，所述摄取来源可以进行选择以改变磷-31、磷-32和磷-33比率。在有些实施方
案中，所述摄取来源可以进行选择以改变氯-35、氯-36和氯-37比率。
[0170] 在有些实施方案中，靶原子的同位素比率(isotopic ratio)可以通过选择一种或多种摄取来源改变到所需比率。摄取来源可以从天然来源获取，如自然界中发现的或来
自人造来源的，本领域技术人员可以选择天然来源、人造来源或它们的组合，以达到靶原子
的所需同位素比率。人造摄取来源的一个实例包括例如至少部分来源于化学合成反应的摄
取来源。这样的同位素富集的摄取来源可以从市场上购买或者在实验室中制备得到和/或
任选与摄取来源的天然来源混合以达到所需的同位素比率。在有些实施方案中，摄取来源
的靶原子同位素比率可以通过选择摄取来源(如自然界中发现的)的所需来源来达到。例
如，如本文讨论的，天然来源可以是衍生自生物体或由生物体合成的生物基的(biobased)
或者诸如基于石油的产物或大气的来源。在一些这样的实施方案中，例如，碳的来源可选自
化石燃料来源的碳源，它可以相对耗竭碳-14；或者环境或大气碳源，例如CO2，它可比其石
油来源的对应物具有更大量的碳-14。
[0171] 不稳定的碳同位素碳-14或放射性碳在地球大气中大致占到1/1012碳原子，其半14
衰期约为5700年。碳的贮量因为核反应而充满上层大气，包括宇宙射线和普通的氮( N)。
化石燃料不含有碳-14，因为在很久以前它就衰减了。化石燃料的燃烧降低了大气碳-14分
数，所谓的“休斯效应(Suess effect)”。
[0172] 测定化合物中各原子的同位素比率的方法是本领域技术人员众所周知的。同位素富集可以容易地采用本领域已知的技术例如加速质谱法(accelerated
mass spectrometry,AMS)、稳定同位素比率质谱仪(Stable Isotope Ratio Mass
Spectrometry,SIRMS)和点特异性天然同位素分馏核磁共振技术(Site-Specific Natural
Isotopic Fractionation by Nuclear Magnetic Resonance,SNIF-NMR)通过质谱法来评
价。这样的质谱技术可以与分离技术例如液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)和/或
气相色谱法等结合在一起。
[0173] 就碳而论，ASTM D6866在美国被开发出来作为一种标准化分析方法，国际上由美国试验及材料标准学会(the American Society for Testing and Materials,ASTM)采
用放射性碳年代测定法(radiocarbon dating)测定固体、液体和气体样品的生物基含量
(biobased content)。该标准是基于采用放射性碳年代测定法测定产物的生物基含量。
ASTM D6866首先在2004年公布，该标准的现行版本是ASTM D6866-11(2011年4月1日生
效)。放射性碳年代测定技术是本领域技术人员众所周知的，包括本文描述的那些。
[0174] 化合物的生物基含量通过碳-14(14C)与碳-12(12C)的比率来估计。准确地讲，现代碳的份数(Fraction Modern,Fm)根据公式Fm＝(S-B)/(M-B)计算得出，式中B、S和M分
14 12
别代表空白、样品和现代参考物的 C/ C比率。Fraction Modern是来自“现代(Modern)”
14 12
的样品中的 C/ C比率偏差的度量。现代(Modern)定义为国家标准局(National Bureau
of Standards,NBS)草酸I(即，标准参考物质(SRM)4990b)的放射性碳浓度95％(在AD
13
1950中)归一化至δ CVPDB＝-19‰(Olsson,The use of Oxalic acid as a Standard(应
用草酸作为标准物质).载于Radiocarbon Variations and Absolute Chronology,Nobel
Symposium,12th Proc.,John Wiley&Sons,New York(1970))。例如通过ASM测量的质谱
13
结果运用国际上同意的根据0.95乘以NBS草酸I(SRM 4990b)的比活归一化至δ CVPDB
14 12
＝-19‰的定义计算得出。这相当于绝对(AD 1950) C/ C比率为1.176±0.010x
-12
10 (Karlen等人,Arkiv Geofysik,4:465-471(1968))。标准计算考虑了一种同位素相对
12 13 14
于另一种同位素的差异摄取，例如生物系统中的优先摄取是C 优于C 优于C 并且这些校
13
正值反映为针对δ 校正过的Fm。
[0175] 草酸标准(SRM 4990b或HOx 1)由1955个糖用甜菜的集合制定。虽然有1000lbs要做，但是这种草酸标准不再是市售的。草酸II标准(HOx 2；N.I.S.T命名为
SRM 4990 C)由1977个法国甜菜糖蜜(French beet molasses)的集合制定。在1980年
代早期，一个由12个实验室组成的小组测量了这两个标准的比率。草酸II与1的活性比
率为1.2933±0.001(加权平均值)。HOx II的同位素比率为-17.8‰(-17.8per mil)。
ASTM D6866-11建议使用可获得的草酸II标准SRM 4990 C(Hox2)作为现行标准(参见
discussion of original vs.currently available oxalic acid standards in Mann,R
adiocarbon,25(2):519-527(1983))。Fm＝0％代表材料中碳-14原子的完全缺乏，因此表
明是一种化石(例如基于石油的)碳源。Fm＝100％，在用1950年代后将碳-14排放到
大气校正(来自核爆炸试验)之后，表明全部是现代碳源。如本文描述的，这样一种“现代
(modern)”来源包括生物基的来源。
[0176] 如ASTM D6866中所述，现代碳百分比(pMC)可大于100％，因为1950年代核试验计划(the 1950s nuclear testing programs)的继续但不断减小的效应，这导致了大气中
碳-14相当大的富集，如在ASTM D6866-11中所描述的。因为所有样品的碳-14活性都是
参照“原子弹爆炸前(pre-bomb)”标准，并且因为几乎所有的新的生物基产物都在原子弹爆
炸后(post-bomb)环境中产生，所以，所有的pMC值(在对同位素分数校正之后)必须乘以
0.95(截至2010年)以更好地反映出样品的真实生物基含量。大于103％的生物基含量提
示或者分析误差已发生，或者生物基碳的来源超过了数个年头。
[0177] ASTM D6866相对于材料的总有机物含量对生物基含量来定量并且不认为含有无机碳和其它非碳的物质存在。例如，根据ASTM D6866，50％基于淀粉的材料和50％水的产品
将被认为具有生物基含量＝100％(50％有机物含量，也就是说100％生物基的)。在另一
个实例中，50％基于淀粉的材料、25％基于石油的材料和25％水的产品将具有生物基含量
＝66.7％(75％有机物含量但是该产品仅50％是生物基的)。在另一个实例中，50％有机
碳且是石油基产物的产品将被认为具有生物基含量＝0％(50％有机碳但来自化石来源)。
因此，根据用于测定化合物或材料的生物基含量的众所周知的方法和已知的标准，本领域
技术人员可容易地确定具有所需生物基含量且为本发明所利用的生物基含量和/或制得
的下游产物。
[0178] 应用碳-14年代测定技术定量测定材料的生物基含量(bio-based content)是本领域已知的(Currie等人,Nuclear Instruments and Methods in Physics Research
B,172:281-287(2000))。例如，碳-14年代测定法已经用来对含有对苯二甲酸酯的材料中
的生物基含量进行定量(Colonna等人,Green Chemistry,13:2543-2548(2011))。值得注
意的是，衍生自可再生1,3-丙二醇和石油源性对苯二甲酸的聚对苯二甲酸丙二醇酯(PPT)
聚合物导致Fm值接近30％(即，由于聚合物碳的3/11来源于可再生的1,3-丙二醇和
8/11来源于化石终端成员对苯二甲酸)(Currie等人,同上,2000)。相反，衍生自可再生
的1,4-丁二醇和可再生的对苯二甲酸二者的聚对苯二甲酸丁二醇酯聚合物导致生物基含
量超过90％(Colonna等人,同上,2011)。
[0179] 因此，在有些实施方案中，本发明提供脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体，其碳-12、碳-13和碳-14比率反映出大气碳(也称为环境碳)摄取来
源。例如，在有些方面，所述脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体
可具有Fm值为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、
至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至
少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至多100％。在一些这样的实施方案中，所述摄
取来源是CO2。在有些实施方案中，本发明提供脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或脂肪醇、脂肪醛或
脂肪酸途径中间体，其碳-12、碳-13和碳-14比率反映出基于石油的碳摄取来源。在这个
方面，所述脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体可具有Fm值为
小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小
于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于
15％、小于10％、小于5％、小于2％或小于1％。在有些实施方案中，本发明提供脂肪醇、脂
肪醛或脂肪酸或脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体，其碳-12、碳-13和碳-14比率可通过
大气碳摄取来源与基于石油的摄取来源的组合获得。采用摄取来源的这样一种组合是一种
可以改变碳-12、碳-13和碳-14比率的一种方式，并且相应的比率将反映出摄取来源的比
例。
[0180] 进一步，本发明涉及如本文公开的生物学法生产的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体，和由其衍生的产物，其中所述脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸
或脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体具有碳-12、碳-13和碳-14同位素比率约与环境中
存在的CO2的值相同。例如，在有些方面，本发明提供：生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸
或生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体，其碳-12对碳-13对碳-14同位素比率
约与环境中存在的CO2的值相同或为本文公开的任何其它比率。应当理解，正如本文所公
开的，产物可具有碳-12对碳-13对碳-14的同位素比率约与环境中存在的CO2的值相同
或为本文公开的任何其它比率。其中所述产物由如本文公开的生物来源的脂肪醇、脂肪醛
或脂肪酸或生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体产生，其中所述生物来源的产
物经化学改性得到最终产物。将脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或其中间体的生物来源的产物经
化学改性得到所需产物的方法是本领域技术人员众所周知的，正如本文所描述的。本发明
还提供生物燃料、化学品、聚合物、表面活性剂、皂、洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、香料、
调味物质或丙烯酸酯，其碳-12对碳-13对碳-14同位素比率约与环境中存在的CO2的值
相同，其中所述生物燃料、化学品、聚合物、表面活性剂、皂、洗涤剂、洗发香波、润滑油添加
剂、香料、调味物质或丙烯酸酯直接由如本文公开的生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或
生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体或者与其组合来生产。
[0181] 脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸是用于商业和工业应用的化学品。这类应用的非限制性实例包括生物燃料、化学品、聚合物、表面活性剂、皂、洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、香
料、调味物质和丙烯酸酯的生产。因此，在有些实施方案中，本发明提供生物基生物燃料、化
学品、聚合物、表面活性剂、皂、洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、香料、调味物质和丙烯酸
酯，其包含通过本发明的非天然存在的微生物生产的或使用本文公开的方法生产的一种或
多种生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间
体。
[0182] 如本文所用的，术语“生物来源的(bioderived)”意指来源于生物体的或者由生物体合成的，并且因为它可以由生物体产生而可以被认为是一种可再生资源。这样一种生物
体，特别是本文公开的本发明微生物可以利用由农业、植物、细菌或动物来源获得的贮存物
或生物质，例如糖类或碳水化合物。或者，所述生物体可以利用大气碳。如本文所用的，术
语“生物基的(biobased)”意指全部或部分由本发明的生物来源的化合物组成的如上所述
的产品。生物基的或生物来源的产品是与石油来源的产品相反的，其中这样一种产品由石
油或石油化学贮存物获得或者由石油或石油化学贮存物合成。
[0183] 在有些实施方案中，本发明提供包含生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体的生物燃料、化学品、聚合物、表面活性剂、皂、
洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、香料、调味物质或丙烯酸酯，其中所述生物来源的脂肪
醇、脂肪醛或脂肪酸或生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体包括生物燃料、化学
品、聚合物、表面活性剂、皂、洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、香料、调味物质或丙烯酸酯
生产中使用的全部或部分脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体。
例如，最终的生物燃料、化学品、聚合物、表面活性剂、皂、洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、
香料、调味物质或丙烯酸酯可含有在制造所述生物燃料、化学品、聚合物、表面活性剂、皂、
洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、香料、调味物质或丙烯酸酯中使用的生物来源的脂肪醇、
脂肪醛或脂肪酸、脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体或其部分。这样的制造可包括使生
物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体在生
产最终生物燃料、化学品、聚合物、表面活性剂、皂、洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、香料、
调味物质或丙烯酸酯的反应中与其自身或另一种化合物发生化学反应(例如化学转变、化
学官能化、化学偶联、氧化、还原、聚合、共聚合等)。因此，在有些方面，本发明提供生物基
的生物燃料、化学品、聚合物、表面活性剂、皂、洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、香料、调味
物质或丙烯酸酯，其包含至少2％、至少3％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至
少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少
90％、至少95％、至少98％或100％如本文公开的生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或生
物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体。在有些方面，当产物是包括或得自本文描述
的生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或者脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体的生物基
聚合物时，所述生物基聚合物可以使用本领域众所周知的方法来模制。因此，在有些实施方
案中，本文提供的是包含本文描述的生物基聚合物的模制产品。
[0184] 另外，在有些实施方案中，本发明提供组合物，其具有本文公开的生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体及除生物来源的脂肪醇、脂肪醛
或脂肪酸或脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体以外的化合物。例如，在有些方面，本发明
提供生物基生物燃料、化学品、聚合物、表面活性剂、皂、洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、
香料、调味物质或丙烯酸酯，其中用于其生产的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或脂肪醇、脂肪醛
或脂肪酸途径中间体是生物来源的和石油来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或脂肪醇、脂肪
醛或脂肪酸途径中间体的组合。例如，生物基生物燃料、化学品、聚合物、表面活性剂、皂、
洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、香料、调味物质或丙烯酸酯可使用50％生物来源的脂肪
醇、脂肪醛或脂肪酸和50％石油来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸或其它所需比率例如60％
/40％、70％/30％、80％/20％、90％/10％、95％/5％、100％/0％、40％/60％、30％/70％、
20％/80％、10％/90％的生物来源的/石油来源的前体来生产，只要至少一部分产物包含
由本文公开的微生物生产的生物来源的产物即可。应当理解，使用本发明的生物来源的脂
肪醇、脂肪醛或脂肪酸或生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径中间体生产生物燃料、化
学品、聚合物、表面活性剂、皂、洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、香料、调味物质或丙烯酸
酯的方法是本领域众所周知的。
[0185] 本发明进一步提供组合物，其包含生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸和除生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸以外的化合物。除生物来源的产物以外的化合物可以是在
本发明的具有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径的非天然存在的微生物的存在下生产的细胞部
分(例如，痕量的细胞部分)或者可以是发酵肉汤或培养基或其纯化或部分纯化部分。当
通过如本文公开的具有降低副产物形成的生物体生产时，所述组合物可包含例如降低水平
的副产物。所述组合物可包含例如本发明的微生物的生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸
或细胞溶解物或培养物上清液。
[0186] 在某些实施方案中，本文提供的是组合物，其包含本文提供的生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸，例如，通过培养如本文提供的具有MI-FAE循环和/或MD-FAE循环与终止
途径组合的非天然存在的微生物生产的生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。在有些实施
方案中，该组合物还包含除所述生物来源的生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸以外的化
合物。在某些实施方案中，除所述生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸以外的化合物是具有
MI-FAE循环和/或MD-FAE循环与终止途径组合的非天然存在的微生物的痕量的细胞部分。
[0187] 在有些实施方案中，本文提供的是生物基产品，其包含本文提供的生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。在某些实施方案中，所述生物基产品是生物燃料、化学品、聚合物、
表面活性剂、皂、洗涤剂、洗发香波、润滑油添加剂、香料、调味物质或丙烯酸酯。在某些实施
方案中，所述生物基产品包含至少5％生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。在某些实施方
案中，所述生物基产品包含至少10％生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。在有些实施方案
中，所述生物基产品包含至少20％生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。在其它实施方案
中，所述生物基产品包含至少30％生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。在有些实施方案
中，所述生物基产品包含至少40％生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。在其它实施方案
中，所述生物基产品包含至少50％生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。在一个实施方案
中，所述生物基产品包含一部分作为重复单元的所述生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。
在另一个实施方案中，本文提供的是通过模制本文提供的生物基产品获得的模制产品。在
其它实施方案中，本文提供的是用于生产本文提供的生物基产品的工艺，包括将所述生物
来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸与其自身或另一种化合物在生产所述生物基产品的反应中
发生化学反应。在某些实施方案中，本文提供的是包含生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸
或通过转变生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸获得的聚合物。在其它实施方案中，本文提
供的是用于生产聚合物的方法，包括将生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸经化学或酶促
转变成聚合物。在又一些实施方案中，本文提供的是包含生物来源的脂肪醇、脂肪醛或脂肪
酸或其细胞溶解物或培养物上清液的组合物。
[0188] 培养条件可包括例如液体培养程序以及发酵和其它大规模培养程序。如本文所述的，本发明的生物合成产物的特别有用的产率可以在厌氧或基本上厌氧培养条件下获得。
[0189] 如本文所述的，用于实现脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成的一种示例性生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物可以在厌
氧或基本上厌氧的条件下进行保持、培养或发酵。简而言之，厌氧条件是指无氧的环境。基
本上厌氧的条件包括例如培养、分批发酵或连续发酵使得培养基中的溶解氧浓度保持在0
和10％饱和之间。基本上厌氧的条件也包括密封室里面的液体培养基中或固体琼脂上的生
长细胞或静止细胞维持在小于1％氧的气氛下。氧的百分比可以通过例如在培养物中通入
N2/CO2混合气或其它合适的一种或多种非氧气体来维持。
[0190] 为了制备脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸，可以将本文所述的培养条件连续放大和生长。示例性生长程序包括例如补料-分批发酵和分批分离；补料-分批发酵和连续分离；或连
续发酵和连续分离。所有的这些过程都是本领域众所周知的。发酵程序特别适用于经生物
合成生产商业数量的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。一般而言，并根据非连续培养程序，脂肪醇、
脂肪醛或脂肪酸的连续和/或接近连续生产包括将本发明的非天然存在的产脂肪醇、脂肪
醛或脂肪酸生物体在足够的营养物和培养基中进行培养以保持和/或几乎保持处于指数
期的生长。在这样的条件下连续培养可以包括例如生长或培养1天，2、3、4、5、6或7天或更
长时间。另外，连续培养可包括1周、2、3、4或5周或更多周，甚至达到数月的较长时间周
期。或者，本发明的生物体可以培养数小时，如果适合具体应用的话。应当理解，连续和/
或接近连续培养条件也可包括在这些示例性周期之间以内的所有时间间隔。还应当理解，
本发明微生物的培养时间是产生足够量的产物用于所需目的的足够时间周期。
[0191] 发酵程序是本领域众所周知的。简而言之，用于生物合成性生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的发酵可用于例如补料-分批发酵和分批分离；补料-分批发酵和连续分离；或连
续发酵和连续分离。分批和连续发酵程序的实例是本领域众所周知的。
[0192] 除了使用本发明的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产者来连续生产相当大量的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的上述发酵程序以外，所述脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产者也可以例如
同时经历化学合成程序和/或酶促程序以将产物转变成其它化合物，或者产物可以从发酵
培养物中分离出来后再经历化学转变或酶促转变以将产物转变成其它化合物，如果需要的
话。
[0193] 为了产生更好的生产者，可以采用代谢建模来使生长条件最优化。建模也可用来设计另外最优化途径利用的基因敲除(gene knockout)(参见例如，美国专利公布US
2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、
US 2002/0168654和US 2004/0009466和美国专利第7,127,379号)。建模分析允许可靠
地预测对代谢朝着更有效产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸转换的细胞生长的影响。
[0194] 除了以高产率、高效价和高生产力生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的活性和选择性酶以外，可有效地将碳和还原当量定向至脂肪醇、脂肪醛和脂肪酸生物合成的稳固宿主生
物可以是有益的。本文描述的宿主修饰特别适用于与促进所需脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产
物形成的本文描述的选择性酶的组合。本文描述的若干宿主修饰需要将异源酶活性引入宿
主生物中。其它修饰涉及相对于野生型水平过量表达或升高酶活性。还有的其它修饰包括
破坏内源基因或使内源酶活性衰减。
[0195] 在本发明的一个实施方案中，所述微生物有效地将碳源和能量来源定向至生产乙酰-CoA，该乙酰-CoA用作MI-FAE循环中的引物和延伸单元。在本发明的一个实施方案中，
所述微生物有效地将碳源和能量来源定向至生产丙二酰-CoA，该丙二酰-CoA用作MD-FAE
循环中的引物和延伸单元。在未经修饰的微生物中，细胞溶质中的脂肪醇、脂肪醛和脂肪酸
生产依赖于天然细胞机器以提供必需前体。因此，高浓度的细胞溶质乙酰-CoA和/或丙二
酰-CoA对促进采用起源于乙酰-CoA或丙二酰-CoA的细胞溶质脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生
产途径是理想的。本文公开了用于增加细胞溶质乙酰-CoA和丙二酰-CoA的代谢工程改造
策略。
[0196] 由于许多真核生物在依赖葡萄糖生长期间在线粒体中合成其大部分乙酰-CoA，因此增加细胞溶质中乙酰-CoA的可利用性可以通过引入细胞溶质乙酰-CoA生物合成途径而
获得。因此，本文描述了乙酰-CoA生物合成途径。在一个实施方案中，利用图2中所示的
途径，乙酰-CoA可以在细胞溶质中自丙酮酸或苏氨酸前体合成。在其它的实施方案中，乙
酰-CoA可以在细胞溶质中自磷酸烯醇丙酮酸(PEP)或丙酮酸合成(图3)。在又一个实施
方案中，乙酰-CoA可以在细胞区室中合成并转运至细胞溶质。例如，一种机制涉及将线粒
体乙酰-CoA转变成代谢中间体(例如柠檬酸或柠苹酸(citramalate))，将那些中间体转运
至细胞溶质，然后使乙酰-CoA再生(参见图4和图5)。示例性的乙酰-CoA途径和相应的
酶在实施例II-IV中作了进一步描述。
[0197] 在另一个实施方案中，增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成的细胞溶质乙酰-CoA可利用性是破坏或衰减利用乙酰-CoA或其前体的竞争酶和途径。示例性的竞争酶
活性包括但不限于丙酮酸脱羧酶、乳酸脱氢酶、短链醛和醇脱氢酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰
酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶和乙酰-CoA羧化酶。其破坏或衰减可改进脂肪
醇、脂肪醛或脂肪酸生产的示例性乙酰-CoA消耗途径包括线粒体TCA循环、脂肪酸生物合
成、乙醇产生和氨基酸生物合成。这些酶和途径在本文中作了进一步描述。
[0198] 用于增加细胞溶质乙酰-CoA生产的又一个策略是增加细胞质中可获得的CoA库(pool)。这可以通过在细胞溶质中过量表达CoA生物合成酶来实现。具体地说，可使用泛
酸激酶(EC 2.7.1.33)的表达。这种酶催化CoA生物合成的第一步骤和限速酶。对CoA反
馈抑制具有抗性的示例性泛酸激酶变异体是本领域众所周知的(Rock等人,J Bacteriol
185:3410-5(2003))并且描述于下表中。
[0199]蛋白质 登录# GI编号 生物体
coaA AAC76952 1790409 大肠杆菌
CAB1 NP_010820.3 398366683 酿酒酵母
KLLA0C00869g XP_452233.1 50304555 乳酸克鲁维酵母
YALI0D25476g XP_503275.1 50551601 解脂耶氏酵母
ANI_1_3272024 XP_001400486.2 317028058 黑曲霉
[0200] 也可以使自本发明的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产递送酰基-CoA底物的竞争酶和途径衰减或破坏。用于衰减的示例性酶包括MI-FAE循环、MD-FAE循环或终止途径酶的
酰基转移酶、肉毒碱穿梭酶和负调节物。
[0201] 将酰基部分自CoA转移至其它受体(例如ACP、甘油、乙醇等)的酰基转移酶的破坏或衰减可增加用于脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产的酰基-CoA的可利用性。例如，酰
基-CoA:ACP转酰基酶(EC 2.3.1.38；2.3.1.39)酶(例如大肠杆菌的fabH(KASIII))
将酰基部分自CoA转移至ACP。FabH对乙酰-CoA和丁酰-CoA有活性(Prescott等
人,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol,36:269-311(1972))。来自恶性疟原虫(Plasmodium
falciparum)和阿维链霉菌(Streptomyces avermitillis)的乙酰-CoA:ACP转酰基酶
已在大肠杆菌中异源表达(Lobo等人,Biochem 40:11955-64(2001))。在fabH缺陷型
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)宿主中表达的来自恶性疟原虫(P.falciparum)的合
成KASIII(FabH)能够补充天然fadH活性(Du等人,AEM 76:3959-66(2010))。来自菠菜
(Spinacia oleracea)的乙酰-CoA:ACP转酰基酶接受其它酰基-ACP分子作为底物，包括丁
酰-ACP(Shimakata等人,Methods Enzym 122:53-9(1986))。丙二酰-CoA:ACP转酰基酶包
括大肠杆菌和欧洲油菜的FabD(Verwoert等人,J Bacteriol,174:2851-7(1992)；Simon等
人,FEBS Lett 435:204-6(1998))。欧洲油菜(B.napsus)的FabD能够补充fabD缺陷型大
肠杆菌。多功能真核脂肪酸合酶复合体(本文描述的)也催化这种活性。其它示例性的酰基
转移酶包括二酰基甘油酰基转移酶，例如酿酒酵母的LRO1和DGA1及解脂耶氏酵母的DGA1
和DGA2；甘油脂质酰基转移酶，例如大肠杆菌的plsB(GenBank:AAC77011.2,GI:87082362；
Heath和Rock,J Bacteriol 180:1425-30(1998))；固醇酰基转移酶，例如酿酒酵母的ARE1
和ARE2；乙醇酰基转移酶(EEB1,EHT1)；推定的酰基转移酶(YMR210W)等。
[0202]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
fabH AAC74175.1 1787333 大肠杆菌
fadA NP_824032.1 29829398 阿维链霉菌
fabH AAC63960.1 3746429 恶性疟原虫
合成构建体 ACX34097.1 260178848 恶性疟原虫
fabH CAL98359.1 124493385 乳酸乳球菌
fabD AAC74176.1 1787334 大肠杆菌
fabD CAB45522.1 5139348 欧洲油菜
LRO1 NP_014405.1 6324335 酿酒酵母
DGA1 NP_014888.1 6324819 酿酒酵母
DGA1 CAG79269.1 49649549 解脂耶氏酵母
DGA2 XP_504700.1 50554583 解脂耶氏酵母
ARE1 NP_009978.1 6319896 酿酒酵母
ARE2 NP_014416.1 6324346 酿酒酵母
EEB1 NP_015230.1 6325162 酿酒酵母
EHT1 NP_009736.3 398365307 酿酒酵母
YMR210W NP_013937.1 6323866 酿酒酵母
ALE1 NP_014818.1 6324749 酿酒酵母
[0203] 增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产可使参与将乙酰-CoA和酰基-CoA分子自生物体的细胞溶质运输至其它区室(例如线粒体、内质网、脂蛋白体和过氧物酶体)的酶破坏或
衰减成为必要。在这些区室中，酰基-CoA中间体可降解或用作结构模块(building block)
以合成脂肪酸、辅因子和其它副产物。
[0204] 定位于细胞溶质的乙酰-CoA和酰基-CoA分子可借助于载体分子肉毒碱经由肉毒碱穿梭而转运至其它细胞区室中(van Roermund等人,EMBO J 14:3480-86(1995))。细胞
区室之间的酰基-肉毒碱穿梭已在酵母(例如白色假丝酵母)中表征(Strijbis等人,J
Biol Chem 285:24335-46(2010))。在这些穿梭中，酰基-CoA的酰基部分通过酰基肉毒碱
转移酶可逆地转移至肉毒碱。乙酰基肉毒碱可随后通过细胞器特异性酰基肉毒碱/肉毒碱
移位酶跨膜转运。移位后，酰基-CoA通过乙酰基肉毒碱转移酶再生。适合于破坏或衰减的
酶包括肉毒碱酰基转移酶、酰基肉毒碱移位酶、酰基肉毒碱载体蛋白和参与肉毒碱生物合
成的酶。
[0205] 肉毒碱乙酰基转移酶(CAT,EC 2.3.1.7)将来自乙酰-CoA的乙酰基单元可逆地连接至载体分子肉毒碱。白色假丝酵母编码三种CAT同工酶(isozyme)：Cat2、Yat1和
Yat2(Strijbis等人,J Biol Chem 285:24335-46(2010))。Cat2在线粒体和过氧物酶
体中表达，而Yat1和Yat2在细胞溶质中表达。Cat2转录物含有在不同碳源条件下调节
的两个起始密码子。较长转录物含有线粒体靶向序列，而较短转录物靶向过氧物酶体。
酿酒酵母的Cat2和构巢曲霉的AcuJ利用双定位的类似机制(Elgersma等人,EMBO J
14:3472-9(1995)；Hynes等人,Euk Cell 10:547-55(2011))。构巢曲酶(A.nidulans)的
细胞溶质CAT由facC编码。其它示例性的CAT酶在褐家鼠和智人中被发现(Cordente等
人,Biochem 45:6133-41(2006))。示例性的肉毒碱酰基转移酶(EC 2.3.1.21)是褐家鼠的
Cpt1和Cpt2基因产物(de Vries等人,Biochem 36:5285-92(1997))。
[0206]蛋白质 登录# GI编号 生物体
Cat2 AAN31660.1 23394954 白色假丝酵母
Yat1 AAN31659.1 23394952 白色假丝酵母
Yat2 XP_711005.1 68490355 白色假丝酵母
Cat2 CAA88327.1 683665 酿酒酵母
Yat1 AAC09495.1 456138 酿酒酵母
Yat2 NP_010941.1 6320862 酿酒酵母
AcuJ CBF69795.1 259479509 构巢曲霉
FacC AAC82487.1 2511761 构巢曲霉
Crat AAH83616.1 53733439 褐家鼠
Crat P43155.5 215274265 智人
Cpt1 AAB48046.1 1850590 褐家鼠
Cpt2 AAB02339.1 1374784 褐家鼠
[0207] 肉毒碱-酰基肉毒碱移位酶可催化肉毒碱和肉毒碱-脂肪酸复合体的双向转运。Cact基因产物提供跨线粒体膜的转运酰基-肉毒碱底物的机制(Ramsay等
人,Biochim Biophys Acta 1546:21-42(2001))。类似的蛋白质已在人类中进行了研
究(Sekoguchi等人,J Biol Chem 278:38796-38802(2003))。酿酒酵母线粒体肉毒碱
载体是Crc1(van Roermund等人,同上；Palmieri等人,Biochimica et Biophys Acta
1757:1249-62(2006))。人肉毒碱移位酶能够补充酿酒酵母的Crc1-缺陷型菌株(van
Roermund等人,同上)。在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和秀丽隐杆线虫
(Caenorhabditis elegans)中发现的另外两种肉毒碱移位酶也能够补充Crc1-缺陷型酵
母(Oey等人,Mol Genet Metab 85:121-24(2005))。基于与酵母和人转运体的序列同
源性在布氏锥虫中鉴定出四种线粒体肉毒碱/乙酰基肉毒碱载体(Colasante等人,Mol
Biochem Parasit 167:104-117(2009))。通过序列同源性也鉴定出白色假丝酵母的肉毒碱
转运体。另外一种线粒体肉毒碱转运体是构巢曲霉的acuH基因产物，其只定位于线粒体膜
(Lucas等人,FEMS Microbiol Lett 201:193-8(2006))。
[0208]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Cact P97521.1 2497984 褐家鼠
Cacl NP_001034444.1 86198310 智人
CaO19.2851 XP_715782.1 68480576 白色假丝酵母
Crc1 NP_014743.1 6324674 酿酒酵母
Dif-1 CAA88283.1 829102 秀丽隐杆线虫
colt CAA73099.1 1944534 黑腹果蝇
Tb11.02.2960 EAN79492.1 70833990 布氏锥虫
Tb11.03.0870 EAN79007.1 70833505 布氏锥虫
Tb11.01.5040 EAN80288.1 70834786 布氏锥虫
Tb927.8.5810 AAX69329.1 62175181 布氏锥虫
acuH CAB44434.1 5019305 构巢曲霉
[0209] 肉毒碱和酰基肉毒碱跨过氧化物酶体膜的转运尚未充分表征。酵母中的特异性过氧化物酶体酰基肉毒碱载体蛋白迄今尚未鉴定。然而，线粒体肉毒碱移位酶也可以在肉毒
碱和乙酰基肉毒碱的过氧化物酶体转运中发挥功能。实验证据提示小家鼠(Mus musculus)
的OCTN3蛋白是过氧化物酶体肉毒碱/酰基肉毒碱移位酶。
[0210] 又一个可能性是酰基-CoA或酰基-肉毒碱通过酰基-CoA转运体(例如酿酒酵母的Pxa1和Pxa2ABC转运体或智人的ALDP ABC转运体)跨越过氧化物酶体或线粒体膜转运
(van Roermund等人,FASEB J 22:4201-8(2008))。Pxa1和Pxa2(Pat1和Pat2)在过氧化
物酶体膜中形成杂二聚体复合体并且催化脂肪酰-CoA酯ATP-依赖性转运至过氧物酶体中
(Verleur等人,Eur J Biochem 249:657-61(1997))。pxa1/pxa2缺陷型酵母的突变表型可
由ALDP异源表达拯救，该ALDP显示转运一系列酰基-CoA底物(van Roermund等人,FASEB
J 22:4201-8(2008))。Pxa12转运系统的缺失与过氧化物酶体脂肪酰-CoA合成酶(Faa2)
的缺失连在一起废除酿酒酵母中的过氧化物酶体β-氧化。用于减少途径中间体或产物转
运至过氧物酶体中的又一个策略是通过干扰参与过氧化物酶体生物发生(biogenesis)的
系统而衰减或消除过氧化物酶体功能。示例性的靶是解脂耶氏酵母的Pex10及同源物。
[0211]蛋白质 登录# GI编号 生物体
OCTN3 BAA78343.1 4996131 小家鼠
Pxa1 AAC49009.1 619668 酿酒酵母
Pxa2 AAB51597.1 1931633 酿酒酵母
Faa2 NP_010931.3 398364331 酿酒酵母
ALDP NP_000024.2 7262393 智人
Pex10 BAA99413.1 9049374 解脂耶氏酵母
[0212] 肉毒碱生物合成途径酶也是用于破坏或衰减的合适候选者。在白色假丝酵母中，例如，肉毒碱在四个酶促步骤中自三甲基-L-赖氨酸合成(Strijbis等人,FASEB J
23:2349-59(2009))。肉毒碱途径前体三甲基赖氨酸(TML)在蛋白质降解期间产生。TML双
加氧酶(CaO13.4316)使TML羟基化以形成3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸。5’-磷酸吡哆醛
依赖性醛缩酶(CaO19.6305)随后使HTML裂解生成4-三甲基氨基丁醛。该4-三甲基氨基
丁醛随后由脱氢酶(CaO19.6306)氧化生成4-三甲基氨基丁酸。在最后的步骤中，4-三甲
基氨基丁酸由CaO19.7131的基因产物羟基化形成肉毒碱。通过肉毒碱生物合成途径的通
量受到途径底物的可利用性限制，并且极低水平的肉毒碱似乎对正常肉毒碱穿梭活性是足
够的(Strejbis等人,IUBMB Life 62:357-62(2010))。
[0213]蛋白质 登录# GI编号 生物体
CaO19.4316 XP_720623.1 68470755 白色假丝酵母
CaO19.6305 XP_711090.1 68490151 白色假丝酵母
CaO19.6306 XP_711091.1 68490153 白色假丝酵母
CaO19.7131 XP_715182.1 68481628 白色假丝酵母
[0214] 朝向脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产的碳通量可通过缺失或衰减竞争途径来改进。酵母的典型发酵产物包括乙醇、甘油和CO2。这些副产物的消除或减少可通过本文描述的方
法来实现。例如，可减少因呼吸所致的碳损失。其它潜在的副产物包括乳酸、乙酸、甲酸、脂
肪酸和氨基酸。
[0215] 乙酰-CoA转变成乙醇对于脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生产有害，因为此转变过程可使碳和还原当量自MI-FAE循环、MD-FAE循环和终止途径离开。乙醇可在由丙酮酸脱羧
酶和乙醇脱氢酶催化的两个酶促步骤中由丙酮酸形成。酿酒酵母具有三种丙酮酸脱羧酶
(PDC1、PDC5和PDC6)。PDC1是主要的同工酶并且在有活性的发酵细胞中强表达。PDC5也
在糖酵解发酵期间发挥作用，但仅在不存在PDC1时或在硫胺限制条件下表达。PDC6在不
可发酵碳源上生长期间发挥作用。缺失PDC1和PDC5可显著地减少乙醇产生；然而这些
缺失可导致产生具有增加的PDC6表达的突变体。所有三种的缺失完全消除乙醇形成但
是也可以引起生长缺陷，因为细胞无能力形成足够的乙酰-CoA用于生物质形成。然而，
这可以通过使细胞在减少量的C2碳源(乙醇或乙酸)存在下进化来克服(van Maris等
人,AEM 69:2094-9(2003))。也有报道指出，丙酮酸脱羧酶PDC1和PDC5的正调节因子
PDC2的缺失使乙醇形成减少至野生型制造的乙醇的～10％(Hohmann等人,Mol Gen Genet
241:657-66(1993))。PDC酶的蛋白质序列和标识符列于实施例II。
[0216] 或者，将乙醛转变成乙醇的醇脱氢酶和/或其它短链醇脱氢酶可被破坏或衰减以提供碳和还原当量用于MI-FAE循环、MD-FAE或终止途径。迄今为止，已报道在酿酒酵
母中的七种醇脱氢酶ADHI-ADHVII(de Smidt等人,FEMS Yeast Res 8:967-78(2008))。
ADH1(GI:1419926)是负责在细胞溶质中在厌氧条件下将乙醛还原成乙醇的关键酶。已报
道，ADH1中有缺陷的酵母菌株在厌氧时不能生长，这是因为活性呼吸链是用于使NADH再生
且导致ATP净增益的唯一替代路径(Drewke等人,J Bacteriol 172:3909-17(1990))。这
种酶是用于下调以限制乙醇产生的理想候选者。ADH2在葡萄糖存在下受到严重阻抑。在
乳酸克鲁维酵母(K.lactis)中，两种NAD-依赖性细胞溶质醇脱氢酶已进行了鉴定和表征。
这些基因也显示对其它脂族醇的活性。基因ADH1(GI:113358)和ADHII(GI:51704293)优
先在葡萄糖生长细胞中表达(Bozzi等人,Biochim Biophys Acta 1339:133-142(1997))。
细胞溶质醇脱氢酶由白色假丝酵母(C.albicans)中的ADH1(GI:608690)、粟酒裂
殖酵 母(S.pombe) 中的 ADH1(GI:3810864)、解 脂 耶 氏 酵母 (Y.lipolytica)中 的
ADH1(GI:5802617)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)或树干谢尔壶菌(Scheffersomyces
stipiti)中 的 ADH1(GI:2114038)和ADHII(GI:2143328) 编 码 (Passoth等 人 ,Yeast
14:1311-23(1998))。候选醇脱氢酶见下表。
[0217]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
SADH BAA24528.1 2815409 近平滑假丝酵母
ADH1 NP_014555.1 6324486 酿酒酵母s288c
ADH2 NP_014032.1 6323961 酿酒酵母s288c
ADH3 NP_013800.1 6323729 酿酒酵母s288c
ADH4 NP_011258.2 269970305 酿酒酵母s288c
ADH5(SFA1) NP_010113.1 6320033 酿酒酵母s288c
ADH6 NP_014051.1 6323980 酿酒酵母s288c
ADH7 NP_010030.1 6319949 酿酒酵母s288c
adhP CAA44614.1 2810 乳酸克鲁维酵母
ADH1 P20369.1 113358 乳酸克鲁维酵母
ADH2 CAA45739.1 2833 乳酸克鲁维酵母
[0218]ADH3 P49384.2 51704294 乳酸克鲁维酵母
ADH1 CAA57342.1 608690 白色假丝酵母
ADH2 CAA21988.1 3859714 白色假丝酵母
SAD XP_712899.1 68486457 白色假丝酵母
ADH1 CAA21782.1 3810864 粟酒裂殖酵母
ADH1 AAD51737.1 5802617 解脂耶氏酵母
ADH2 AAD51738.1 5802619 解脂耶氏酵母
ADH3 AAD51739.1 5802621 解脂耶氏酵母
AlcB AAX53105.1 61696864 黑曲霉
ANI_1_282024 XP_001399347.1 145231748 黑曲霉
ANI_1_126164 XP_001398574.2 317037131 黑曲霉
ANI_1_1756104 XP_001395505.2 317033815 黑曲霉
ADH2 CAA73827.1 2143328 树干谢尔壶菌
[0219] 一种或多种甘油-3-磷酸酶或甘油-3-磷酸(G3P)脱氢酶的衰减或破坏可消除或减少甘油的形成，从而保留碳和还原当量用于脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产。
[0220] G3P磷酸酶催化G3P水解成甘油。具有这种活性的酶包括酿酒酵母(GPP1和GPP2)、白色假丝酵母和巴夫杜氏藻(Dunaleilla parva)的甘油-1-磷酸酶(EC 3.1.3.21)
酶(Popp等人,Biotechnol Bioeng 100:497-505(2008)；Fan等人,FEMS Microbiol Lett
245:107-16(2005))。巴夫杜氏藻(D.parva)基因迄今尚未鉴定。这些和另外的G3P磷酸
酶见下表。
[0221]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
GPP1 DAA08494.1 285812595 酿酒酵母
GPP2 NP_010984.1 6320905 酿酒酵母
GPP1 XP_717809.1 68476319 白色假丝酵母
KLLA0C08217g XP_452565.1 50305213 乳酸克鲁维酵母
KLLA0C11143g XP_452697.1 50305475 乳酸克鲁维酵母
ANI_1_380074 XP_001392369.1 145239445 黑曲霉
ANI_1_444054 XP_001390913.2 317029125 黑曲霉
[0222] 酿酒酵母具有由细胞溶质中的GPD1和GDP2和线粒体中的GUT2编码的三种G3P脱氢酶。已知GPD2编码负责大多数甘油形成的酶并且负责维持在厌氧条件下的氧化还
原平衡。GPD1主要负责酿酒酵母对渗透胁迫的适应(Bakker等人,FEMS Microbiol Rev
24:15-37(2001))。GPD1、GPD2和/或GUT2的衰减将减少甘油形成。GPD1和GUT2编码解脂
耶氏酵母中的G3P脱氢酶(Beopoulos等人,AEM 74:7779-89(2008))。GPD1和GPD2编码粟
酒裂殖酵母中的G3P脱氢酶。类似地，G3P脱氢酶在热带假丝酵母(Candida tropicalis)
中由CTRG_02011编码，且在白色假丝酵母中由GI:20522022所表示的基因编码。
[0223]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
GPD1 CAA98582.1 1430995 酿酒酵母
GPD2 NP_014582.1 6324513 酿酒酵母
GUT2 NP_012111.1 6322036 酿酒酵母
GPD1 CAA22119.1 6066826 解脂耶氏酵母
GUT2 CAG83113.1 49646728 解脂耶氏酵母
GPD1 CAA22119.1 3873542 粟酒裂殖酵母
GPD2 CAA91239.1 1039342 粟酒裂殖酵母
ANI_1_786014 XP_001389035.2 317025419 黑曲霉
ANI_1_1768134 XP_001397265.1 145251503 黑曲霉
KLLA0C04004g XP_452375.1 50304839 乳酸克鲁维酵母
CTRG_02011 XP_002547704.1 255725550 热带假丝酵母
GPD1 XP_714362.1 68483412 白色假丝酵母
GPD2 XP_713824.1 68484586 白色假丝酵母
[0224] 形成酸副产物(例如乙酸、甲酸和乳酸)的酶也可以衰减或破坏。这样的酶包括乙酸激酶、磷酸转乙酰酶和丙酮酸氧化酶。丙酮酸甲酸裂合酶和甲酸脱氢酶的破坏或衰减
能限制甲酸和二氧化碳的形成。这些酶在实施例II中作了进一步详细描述。
[0225] 将丙酮酸转变成乳酸的醇脱氢酶也是破坏或衰减的候选者。乳酸脱氢酶包括大肠杆菌的ldhA和来自富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)的ldh(Steinbuchel和
Schlegel,Eur.J.Biochem.130:329-334(1983))。以上列举出的其它醇脱氢酶也可表现出
LDH活性。
[0226]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
ldhA NP_415898.1 16129341 大肠杆菌
Ldh YP_725182.1 113866693 富养罗尔斯通氏菌
[0227] 下调线粒体丙酮酸脱氢酶复合体的活性将限制通向线粒体TCA循环的通量。在厌氧条件下且在培养基中的葡萄糖浓度较高的条件下，这种线粒体酶的能力非常有限并且不
存在通过其的显著通量。然而，在有些实施方案中，这种酶可以破坏或衰减以增加脂肪醇、
脂肪醛或脂肪酸生产。示例性的丙酮酸脱氢酶基因包括PDB1、PDA1、LAT1和LPD1。登录号
和同源物列于实施例II中。
[0228] 减少通向TCA循环的通量的另一策略是通过下调或缺失线粒体丙酮酸载体来限制丙酮酸转运至线粒体。在酿酒酵母中丙酮酸转运至线粒体通过由MPC1和MPC2编
码的杂复合体催化(Herzig等人,Science 337:93-6(2012)；Bricker等人,Science
337:96-100(2012))。酿酒酵母编码另外五种推定的一元羧酸转运体(MCH1-5)，其中有
几种可定位至线粒体膜(Makuc等人,Yeast 18:1131-43(2001))。NDT1是另一种推定
的丙酮酸转运体，尽管该蛋白质的作用在文献中有争议(Todisco等人,J Biol Chem
20:1524-31(2006))。示例性的丙酮酸和一元羧酸转运体见下表：
[0229]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
MPC1 NP_011435.1 6321358 酿酒酵母
MPC2 NP_012032.1 6321956 酿酒酵母
MPC1 XP_504811.1 50554805 解脂耶氏酵母
MPC2 XP_501390.1 50547841 解脂耶氏酵母
MPC1 XP_719951.1 68471816 白色假丝酵母
MPC2 XP_716190.1 68479656 白色假丝酵母
MCH1 NP_010229.1 6320149 酿酒酵母
MCH2 NP_012701.2 330443640 酿酒酵母
MCH3 NP_014274.1 6324204 酿酒酵母
MCH5 NP_014951.2 330443742 酿酒酵母
NDT1 NP_012260.1 6322185 酿酒酵母
ANI_1_1592184 XP_001401484.2 317038471 黑曲霉
CaJ7_0216 XP_888808.1 77022728 白色假丝酵母
YALI0E16478g XP_504023.1 50553226 解脂耶氏酵母
KLLA0D14036g XP_453688.1 50307419 乳酸克鲁维酵母
[0230] 合成丙二酰-CoA和脂肪酸的酶的破坏或衰减可增加可用于自乙酰-CoA的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成的碳的供应。用于破坏或衰减的示例性酶包括脂肪酸合酶、乙
酰-CoA羧化酶、生物素:脱辅基酶连接酶、酰基载体蛋白、硫酯酶、酰基转移酶、ACP丙二酰
基转移酶、脂肪酸延长酶、酰基-CoA合成酶、酰基-CoA转移酶和酰基-CoA水解酶。
[0231] 减少脂肪酸生物合成的另一策略是表达或过量表达阻抑脂肪酸形成基因的调节蛋白。乙酰-CoA羧化酶(EC 6.4.1.2)在许多生物体中催化脂肪酸生物合成的第一步骤：
乙酰-CoA ATP-依赖性羧化生成丙二酰-CoA。这种酶利用生物素作为辅因子。示例性的
ACC酶由大肠杆菌的accABCD(Davis等人,J Biol Chem 275:28593-8(2000))、酿酒酵母的
ACC1和同源物(Sumper等人,Methods Enzym 71:34-7(1981))编码。酿酒酵母的线粒体乙
酰-CoA羧化酶由HFA1编码。乙酰-CoA羧化酶全酶形成需要由生物素:脱辅基蛋白连接
酶(例如酿酒酵母的BPL1)连接生物素。
[0232]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
ACC1 CAA96294.1 1302498 酿酒酵母
KLLA0F06072g XP_455355.1 50310667 乳酸克鲁维酵母
ACC1 XP_718624.1 68474502 白色假丝酵母
YALI0C11407p XP_501721.1 50548503 解脂耶氏酵母
ANI_1_1724104 XP_001395476.1 145246454 黑曲霉
accA AAC73296.1 1786382 大肠杆菌
accB AAC76287.1 1789653 大肠杆菌
accC AAC76288.1 1789654 大肠杆菌
accD AAC75376.1 1788655 大肠杆菌
HFA1 NP_013934.1 6323863 酿酒酵母
BPL1 NP_010140.1 6320060 酿酒酵母
[0233] 参与脂肪酸合成的蛋白质示于下文。酵母的脂肪酸合酶复合体由FAS1和FAS2两个多功能亚基组成，这两个亚基一起催化乙酰-CoA和丙二酰-CoA净转变成脂肪酸
(Lomakin等人,Cell 129:319-32(2007))。另外与线粒体脂肪酸合成相关的蛋白质包括
OAR1、Mct1、ETR1、ACP1和PPT2。ACP1是线粒体酰基载体蛋白，且PPT2编码磷酸泛酰巯基
乙胺转移酶，该酶使线粒体ACP泛酰巯基乙胺化并且是线粒体中的脂肪酸生物合成所需的
(Stuible等人,J Biol Chem:273:22334-9(1998))。用于降低脂肪酸合酶活性的一种非遗
传策略是添加抑制剂(例如浅蓝菌素(cerulenin))。也可改变脂质生物合成的全局调节物
以在长链醇或相关产物生产期间下调内源脂肪酸生物合成途径。示例性的全局调节物是解
脂耶氏酵母和酿酒酵母的SNF1。
[0234]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
FAS1 NP_012739.1 6322666 酿酒酵母
FAS2 NP_015093.1 6325025 酿酒酵母
FAS1 XP_451653.1 50303423 乳酸克鲁维酵母
FAS2 XP_452914.1 50305907 乳酸克鲁维酵母
FAS1 XP_716817.1 68478392 白色假丝酵母
FAS2 XP_723014.1 68465892 白色假丝酵母
FAS1 XP_500912.1 50546885 解脂耶氏酵母
FAS2 XP_501096.1 50547253 解脂耶氏酵母
FAS1 XP_001393490.2 317031809 黑曲霉
FAS2 XP_001388458.1 145228299 黑曲霉
[0235]OAR1 NP_012868.1 6322795 酿酒酵母
MCT1 NP_014864.4 398365823 酿酒酵母
ETR1 NP_009582.1 6319500 酿酒酵母
ACP1 NP_012729.1 6322656 酿酒酵母
PPT2 NP_015177.2 37362701 酿酒酵母
SNF1 CAG80498.1 49648180 解脂耶氏酵母
SNF1 P06782.1 134588 酿酒酵母
[0236] 将酰基-CoA底物转变成较长链长脂肪酸的延长酶的破坏或衰减也可以用于增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产。延长酶在例如线粒体、内质网、脂蛋白体和过氧物酶体等
区室中被发现。例如，一些酵母(例如酿酒酵母)能够通过接受外源或内源酰基-CoA底
物的线粒体延长酶来合成链长C16及C16以上的长链脂肪酸(Bessoule等人,FEBS Lett
214:158-162(1987))。这个系统需要ATP以达成活性。内质网也具有用于合成来自不同
长度的酰基-CoA底物的极长链脂肪酸(C18+)的延长酶系统(Kohlwein等人,Mol Cell
Biol 21:109-25(2001))。参与这个系统的基因包括TSC13、ELO2和ELO3。ELO1催化C12
酰基-CoA延长生成C16-C18脂肪酸。
[0237]蛋白质 登录# GI编号 生物体
ELO2 NP_009963.1 6319882 酿酒酵母
ELO3 NP_013476.3 398366027 酿酒酵母
TSC13 NP_010269.1 6320189 酿酒酵母
ELO1 NP_012339.1 6322265 酿酒酵母
[0238] 将酰基-CoA途径中间体转变成酸副产物的天然酶也可以降低脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产率。例如，CoA水解酶、转移酶和合成酶可作用于酰基-CoA中间体以形成短链、中
链或长链酸。内源CoA水解酶、CoA转移酶(transerases)和/或可逆性CoA合成酶的破
坏或衰减可用于增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产率。示例性的(Exempalry)酶见下表。
[0239]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Tes1 NP_012553.1 6322480 酿酒酵母s288c
ACH1 NP_009538.1 6319456 酿酒酵母s288c
EHD3 NP_010321.1 6320241 酿酒酵母s288c
YALI0F14729p XP_505426.1 50556036 解脂耶氏酵母
YALI0E30965p XP_504613.1 50554409 解脂耶氏酵母
KLLA0E16523g XP_454694.1 50309373 乳酸克鲁维酵母
KLLA0E10561g XP_454427.1 50308845 乳酸克鲁维酵母
[0240]ACH1 P83773.2 229462795 白色假丝酵母
CaO19.10681 XP_714720.1 68482646 白色假丝酵母
ANI_1_318184 XP_001401512.1 145256774 黑曲霉
ANI_1_1594124 XP_001401252.2 317035188 黑曲霉
tesB NP_414986.1 16128437 大肠杆菌
tesB NP_355686.2 159185364 根癌土壤杆菌
atoA 2492994 P76459.1 大肠杆菌
atoD 2492990 P76458.1 大肠杆菌
[0241] 有利于产物、MI-FAE循环中间体、MD-FAE循环中间体(intermeidates)或终止途径中间体降解的酶也可以破坏或衰减。实例包括醛脱氢酶、醛脱羰基酶、氧化醇脱氢酶和不
可逆脂肪酰-CoA降解酶。
[0242] 为了生产本发明的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸，非特异性醛脱氢酶的缺失或衰减能改进产率。为了生产脂肪酸，这样的酶的表达可改进产物形成。这样的酶可以例如将乙
酰-CoA转变成乙醛、脂肪醛转变成脂肪酸或者脂肪醇转变成脂肪酸。使醛脱氢酶酰化描述
于实施例I。酸形成醛脱氢酶描述于实施例III和IX。
[0243] 有利于逆方向的途径酶也可以破坏或衰减，如果它们对脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产有害的话。一个实例是有利于氧化方向的长链醇脱氢酶(EC 1.1.1.192)。示例性的长
链醇脱氢酶是嗜热脱氮土芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)的ADH1和ADH2，
其氧化链长长达C30的醇(Liu等人,Physiol Biochem 155:2078-85(2009))。这些和其它
示例性的脂肪醇脱氢酶列于实施例I和II中。如果形成醇的酰基-CoA还原酶被用于脂肪
醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成，那么内源脂肪醇脱氢酶的缺失将实质上减少回通量。
[0244] β-氧化酶可以是可逆的并且以酰基-CoA合成方向操作。然而，如果它们是不可逆的或强烈有利于降解方向，那么它们是用于破坏或衰减的候选者。落入该目录的一种酶
包括酿酒酵母的FOX2，一种具有3-羟基酰基-CoA脱氢酶和烯酰-CoA水合酶活性的多功能
酶(Hiltunen等人,J Biol Chem 267:6646-6653(1992))。另外的基因包括利用除NAD(P)
H(例如EC 1.3.8.-)以外的辅因子(例如大肠杆菌的fadE)的降解性硫解酶，例如POT1和
酰基-CoA脱氢酶。
[0245]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
POT1 NP_012106.1 6322031 酿酒酵母
FOX2 NP_012934.1 6322861 酿酒酵母
fadE AAC73325.2 87081702 大肠杆菌
[0246] 脂肪酰-CoA氧化酶(例如酿酒酵母的POX1)催化脂肪酰-CoA底物的氧-依赖性氧化。具有这种活性的酶可以破坏或衰减，如果它们在脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产条
件下表达的话。POX1(EC 1.3.3.6)基因和同源物见下表。POX1经受被OAF1调节，OAF1
也使参与过氧化物酶体β-氧化、组构和生物发生的基因活化(Luo等人,J Biol Chem
271:12068-75(1996))。具有类似于OAF1和过氧化物酶体脂肪酸转运体PXA1和PXA2的功
能的调节物也是用于缺失的候选者。
[0247]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
POX1 NP_011310.1 6321233 酿酒酵母
OAF1 NP_009349.3 330443370 酿酒酵母
PXA1 NP_015178.1 6325110 酿酒酵母
PXA2 NP_012733.1 6322660 酿酒酵母
YALI0F10857g XP_505264.1 50555712 解脂耶氏酵母
YALI0D24750p XP_503244.1 50551539 解脂耶氏酵母
YALI0E32835p XP_504703.1 50554589 解脂耶氏酵母
YALI0E06567p XP_503632.1 50552444 解脂耶氏酵母
YALI0E27654p XP_504475.1 50554133 解脂耶氏酵母
YALI0C23859p XP_502199.1 50549457 解脂耶氏酵母
POX XP_455532.1 50311017 乳酸克鲁维酵母
POX104 XP_721610.1 68468582 白色假丝酵母
POX105 XP_717995.1 68475844 白色假丝酵母
POX102 XP_721613.1 68468588 白色假丝酵母
[0248] 用于破坏或衰减的另一候选者是酰基-CoA结合蛋白。酿酒酵母的酰基结合蛋白ACB1例如结合酰基-CoA酯且将其穿梭移动至酰基-CoA利用过程(Schjerling等
人,J Biol Chem 271:22514-21(1996))。这种蛋白质的缺失不影响生长速率且不导
致较长链酰基-CoA分子的累积增加。酰基-CoA酯参与多种细胞过程，包括脂质生物
合成和内稳态(homeostatis)、信号转导、生长调节和细胞分化(Rose等人,PNAS USA
89:11287-11291(1992))。
[0249]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
ACB1 P31787.3 398991 酿酒酵母
KLLA0B05643g XP_451787.2 302309983 乳酸克鲁维酵母
YALI0E23185g XP_002143080.1 210076210 解脂耶氏酵母
ANI_1_1084034 XP_001390082.1 145234867 黑曲霉
[0250] 为达到脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的高产率，理想的是宿主生物可以充足量供应MI-FAE循环、MD-FAE和/或终止途径所需要的辅因子。在若干生物体中，特别是在真核生物
(例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、
曲霉属(Aspergillus)和耶氏酵母属(Yarrowia)的若干菌种)中，NADH在细胞溶质中由
于其由糖酵解大量产生而比NADPH更丰富。甚至可通过细胞溶质中的异源或天然NAD-依
赖性酶(例如NAD-依赖性丙酮酸脱氢酶、NAD-依赖性甲酸脱氢酶、NADH:铁氧还蛋白氧化
还原酶或NAD-依赖性酰基化乙酰基醛脱氢酶)将丙酮酸转变成乙酰-CoA来使NADH更丰
富。考虑到大多数生物体的细胞溶质中NADH的丰度，它对于MI-FAE循环、MD-FAE循环和/
或终止途径的所有还原步骤均优先接受NADH作为还原剂而优于其它还原剂(例如NADPH)
是有益的。脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的高产率可通过例如以下方式来完成：1)鉴别和执行
对NADH比对其它还原当量(例如NADPH)优先性更强的内源或外源MI-FAE循环、MD-FAE循
环和/或终止途径酶；2)使贡献NADPH-依赖性还原活性的一种或多种内源MI-FAE循环、
MD-FAE循环或终止途径酶衰减；3)改变内源或外源MI-FAE循环、MD-FAE循环或终止途径
酶的辅因子特异性，致使其对NADH比对其天然形式更强的优先性；或4)改变内源或外源
MI-FAE循环、MD-FAE循环或终止途径酶的辅因子特异性，致使其对NADPH比对其天然形式
更弱的优先性。
[0251] 用于工程改造有利于NADH的MI-FAE循环、MD-FAE循环和/或终止途径的策略在实施例V中作了进一步详细描述。用于改变酶的辅因子特异性的方法是本领域众所周知
的，且在实施例VI中描述了一个实例。
[0252] 如果MI-FAE循环、MD-FAE循环和/或终止途径酶中的一种或多种利用NADPH作为辅因子，则对增加宿主生物中NADPH的产生是有益的。具体地说，如果在宿主生物的细胞
溶质中存在MI-FAE循环、MD-FAE循环和/或终止途径，则用于增加细胞溶质中的NADPH产
生的方法可以是有益的。可以实施用于增加细胞溶质的NADPH产生的若干方法，包括引导
相对于野生型增加量的通量通过戊糖磷酸途径的氧化分支、引导相对于野生型增加量的通
量通过Entner Doudoroff途径、引入可溶性或膜结合的转氢酶以将NADH转变成NADPH或
者采用下列酶的NADP-依赖性形式：磷酸化或非磷酸化甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱氢
酶、甲酸脱氢酶或酰基化乙酰基醛脱氢酶。这些活性可通过破坏或衰减天然NAD-依赖性酶
包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、甲酸脱氢酶或酰基化乙酰基醛脱氢酶而加强。
在实施例VII中描述了用于工程改造增加的NADPH可利用性的策略。
[0253] 细胞溶质中脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的合成可依赖于足够碳和还原当量的可利用性。因此，虽然不受任何具体操作理论的束缚，但是增加NAD(P)H与NAD(P)的氧化还原比
率可帮助以向前方向驱动MI-FAE循环、MD-FAE循环和/或终止途径。用于增加NAD(P)H与
NAD(P)的氧化还原比率的方法包括限制呼吸，衰减或破坏产生还原的副产物(例如乙醇和
甘油)的竞争途径，衰减或消除NADH被NADH脱氢酶利用，或衰减或消除区室之间的氧化还
原穿梭。
[0254] 一种提供增加数目的还原当量(例如NAD(P)H)用于形成脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的示例性方法是约束在呼吸期间这样的还原当量的使用。呼吸可通过以下方式来限制：减
少氧的可利用性，衰减NADH脱氢酶和/或细胞色素氧化酶活性，衰减G3P脱氢酶，和/或向
克拉布特里阳性生物体提供过量的葡萄糖。
[0255] 通过在发酵罐中培养非天然存在的真核生物而限制氧可利用性是限制呼吸且从而增加NAD(P)H与NAD(P)比率的一个实例。NAD(P)H/NAD(P)的比率随培养条件变得更厌
氧而增加，其中完全厌氧条件提供最高的还原型辅因子与氧化型辅因子比率。例如，已报
道，在大肠杆菌中，NADH/NAD的比率在好氧条件下＝0.02，在厌氧条件下＝0.75(de Graes
等人,J Bacteriol 181:2351-57(1999))。
[0256] 呼吸也可以通过在好氧条件下在细胞中减少NADH脱氢酶和/或细胞色素氧化酶的表达或活性来限制。在这种情况下，呼吸可通过电子传递链的能力来限制。这样的方法已
用于使大肠杆菌在完全好氧条件下能够厌氧代谢(Portnoy等人,AEM 74:7561-9(2008))。
酿酒酵母可使用由NDE1和NDE2编码的外部NADH脱氢酶直接使细胞溶质NADH氧化。
一种这样的NADH脱氢酶在解脂耶氏酵母中由NDH2编码(Kerscher等人,J Cell Sci
112:2347-54(1999))。这些和其它NADH脱氢酶列于下表。
[0257]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
NDE1 NP_013865.1 6323794 酿酒酵母s288c
NDE2 NP_010198.1 6320118 酿酒酵母s288c
NDH2 AJ006852.1 3718004 解脂耶氏酵母
ANI_1_610074 XP_001392541.2 317030427 黑曲霉
ANI_1_2462094 XP_001394893.2 317033119 黑曲霉
KLLA0E21891g XP_454942.1 50309857 乳酸克鲁维酵母
KLLA0C06336g XP_452480.1 50305045 乳酸克鲁维酵母
NDE1 XP_720034.1 68471982 白色假丝酵母
NDE2 XP_717986.1 68475826 白色假丝酵母
[0258] 酿酒酵母的细胞色素氧化酶包括COX基因产物。COX1-3是由线粒体基因组编码的三个核心亚基，而COX4-13由核基因编码。衰减或破坏细胞色素基因中的任何一个都导致
呼吸生长的减少或阻断(Hermann和Funes,Gene 354:43-52(2005))。其它生物体中的细胞
色素氧化酶基因可通过序列同源性推断。
[0259]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
COX1 CAA09824.1 4160366 酿酒酵母s288c
COX2 CAA09845.1 4160387 酿酒酵母s288c
COX3 CAA09846.1 4160389 酿酒酵母s288c
COX4 NP_011328.1 6321251 酿酒酵母s288c
COX5A NP_014346.1 6324276 酿酒酵母s288c
COX5B NP_012155.1 6322080 酿酒酵母s288c
COX6 NP_011918.1 6321842 酿酒酵母s288c
COX7 NP_013983.1 6323912 酿酒酵母s288c
COX8 NP_013499.1 6323427 酿酒酵母s288c
COX9 NP_010216.1 6320136 酿酒酵母s288c
COX12 NP_013139.1 6323067 酿酒酵母s288c
COX13 NP_011324.1 6321247 酿酒酵母s288c
[0260] 细胞溶质NADH也可以通过呼吸链经由G3P脱氢酶穿梭来氧化，G3P脱氢酶穿梭由细胞溶质NADH-连接的G3P脱氢酶和膜结合的G3P:泛醌氧化还原酶组成。G3P脱氢酶的缺
失或衰减也防止NADH氧化用于呼吸。本文描述了编码这些酶的候选酶。
[0261] 另外，在克拉布特里阳性生物体中，发酵代谢可以在过量的葡萄糖存在下实现。例如，酿酒酵母甚至在好氧条件下制造乙醇。通过向克拉布特里阳性生物体投入过量的葡萄
糖而将克拉布特里阳性生物体中乙醇和甘油的形成减少/消除且替换为脂肪醇、脂肪醛或
脂肪酸的生产。在另一个方面，本文提供的是用于生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的方法，包
括将非天然存在的真核生物在足以产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的条件下培养足够的时间
周期，其中所述真核生物是包含至少一种编码MI-FAE循环、MD-FAE循环和/或终止途径酶
的外源核酸的克拉布特里阳性生物体，和其中所述真核生物是在包含过量葡萄糖的培养基
中。
[0262] 防止还原的发酵副产物的形成将增加碳和还原当量的可利用性用于脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产。在厌氧和微好氧条件下的两种关键还原副产物是乙醇和甘油。乙醇典
型地在由丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶催化的两个酶促步骤中自丙酮酸形成。甘油通过甘
油-3-磷酸脱氢酶和甘油-3-磷酸磷酸酶的酶自糖酵解中间体二羟基丙酮磷酸酯形成。这
些酶活性中的一种或多种的衰减将增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的产率。本文描述了用于
减少或消除乙醇和甘油形成的菌株工程改造策略。
[0263] 酵母(例如酿酒酵母)可产生甘油以允许NAD(P)在厌氧条件下再生。减少或消除甘油产生的另一方式是通过限氧培育(Bakker等人,同上)。甘油形成仅在细胞的特异
性氧摄取速率降低至低于生物合成中形成的NADH再氧化所需要的速率开始。
[0264] 除了以上列出的氧化还原吸收(sinks)之外，苹果酸脱氢酶当其以还原方向发挥功能时可潜在地引开还原当量。相信在酿酒酵母中发挥功能的若干氧化还原穿梭利用这种
酶转移在细胞溶质和线粒体之间的还原当量。这种氧化还原转移可通过衰减苹果酸脱氢酶
和/或苹果酸酶活性而预防。可通过mdh衰减而阻断的氧化还原穿梭包括(i)苹果酸-天
冬氨酸穿梭，(ii)苹果酸-草酰乙酸穿梭，和(iii)苹果酸-丙酮酸穿梭。编码苹果酸脱
氢酶和苹果酸酶的基因列于下表。
[0265]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
MDH1 NP_012838.1 6322765 酿酒酵母
MDH2 NP_014515.2 116006499 酿酒酵母
MDH3 NP_010205.1 6320125 酿酒酵母
MAE1 NP_012896.1 6322823 酿酒酵母
MDH1 XP_722674.1 68466384 白色假丝酵母
MDH2 XP_718638.1 68474530 白色假丝酵母
MAE1 XP_716669.1 68478574 白色假丝酵母
KLLA0F25960g XP_456236.1 50312405 乳酸克鲁维酵母
KLLA0E18635g XP_454793.1 50309563 乳酸克鲁维酵母
KLLA0E07525g XP_454288.1 50308571 乳酸克鲁维酵母
YALI0D16753p XP_502909.1 50550873 解脂耶氏酵母
YALI0E18634p XP_504112.1 50553402 解脂耶氏酵母
ANI_1_268064 XP_001391302.1 145237310 黑曲霉
ANI_1_12134 XP_001396546.1 145250065 黑曲霉
ANI_1_22104 XP_001395105.2 317033225 黑曲霉
[0266] 总的来说，以上提及的氧化还原吸收(sink)单独或与其它氧化还原吸收组合的破坏或衰减可消除或降低呼吸或副产物形成的还原能力的使用。已报道，外部NADH脱氢酶
(NDE1和NDE2)和线粒体G3P脱氢酶(GUT2)的缺失几乎完全消除了酿酒酵母中的细胞溶质
NAD+再生(Overkamp等人,J Bacteriol 182:2823-30(2000))。
[0267] 本发明的微生物产生脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸并且任选地将所产生的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸分泌到到培养基中。带有异源脂肪醇形成活性的酿酒酵母、解脂耶氏酵母和
大肠杆菌在细胞内积聚脂肪醇；然而在培养基中检测不到脂肪醇(Behrouzian等人,美国
专利申请20100298612)。引入具有改进活性的脂肪酰-CoA还原酶导致较高水平的脂肪醇
分泌到培养基中。或者，引入脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸转运体或转运系统可改进脂肪醇、脂
肪醛或脂肪酸的细胞外累积。示例性的转运体列于下表。
[0268]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Fatp NP_524723.2 24583463 黑腹果蝇
AY161280.1:45..1757 AAN73268.1 34776949 红平红球菌
acrA CAF23274.1 46399825 变形虫原厚垣假丝酵母
acrB CAF23275.1 46399826 变形虫原厚垣假丝酵母
CER5 AY734542.1 52354013 拟南芥
AmiS2 JC5491 7449112 红球菌
ANI_1_1160064 XP_001391993.1 145238692 黑曲霉
YALI0E16016g XP_504004.1 50553188 解脂耶氏酵母
[0269] 因此，在有些实施方案中，本发明提供如本文公开的具有一个或多个基因破坏的非天然存在的微生物，其中所述一个或多个基因破坏在编码参与以下的蛋白质或酶的内
源基因中出现：由所述微生物天然产生乙醇、甘油、乙酸、甲酸、乳酸、CO2、脂肪酸或丙二
酰-CoA；途径中间体向除细胞溶质以外的细胞区室转移；或由该微生物天然降解MI-FAE
循环中间体、MD-FAE循环中间体或终止途径中间体，所述一个或多个基因破坏使得该微生
物中的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的产生增加。因此，所述蛋白质或酶可以是脂肪酸合酶、乙
酰-CoA羧化酶、生物素:脱辅基酶连接酶、酰基载体蛋白、硫酯酶、酰基转移酶、ACP丙二酰
基转移酶、脂肪酸延长酶、酰基-CoA合成酶、酰基-CoA转移酶、酰基-CoA水解酶、丙酮酸脱
羧酶、乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、酸形成醛脱氢酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、丙酮酸氧化酶、甘
油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸磷酸酶、线粒体丙酮酸载体、过氧化物酶体脂肪酸转运体、
过氧化物酶体酰基-CoA转运体、过氧化物酶体肉毒碱/酰基肉毒碱转移酶、酰基-CoA氧化
酶或酰基-CoA结合蛋白。在有些方面，所述一个或多个基因破坏包括一个或多个基因的缺
失。
[0270] 在有些实施方案中，本发明提供如本文描述的非天然存在的微生物，其中该MI-FAE循环、该MD-FAE循环或该终止途径的一种或多种酶优先与NADH辅因子反应或者就
与NAD(P)H辅因子反应而言具有减少的优先性。例如，该MI-FAE循环的一种或多种酶可以
是3-酮酰基-CoA还原酶或烯酰-CoA还原酶。对于终止途径，所述一种或多种酶可以是酰
基-CoA还原酶(醛形成)、醇脱氢酶、酰基-CoA还原酶(醇形成)、醛脱羰基酶、酰基-ACP
还原酶、醛脱氢酶(酸形成)或羧酸还原酶。
[0271] 在有些实施方案中，本发明提供如本文描述的非天然存在的微生物，所述微生物在编码蛋白质或酶的基因中具有一个或多个基因破坏，该蛋白质或酶导致存在于该微生物
的细胞溶质中的NAD(P)H与NAD(P)的比率在该破坏之后增加。因此，编码导致存在于该微
生物的细胞溶质中的NAD(P)H与NAD(P)的比率在该破坏之后增加的蛋白质或酶的基因可
以是NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶、G3P脱氢酶、G3P磷酸酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、醛脱
氢酶(酸形成)、乳酸脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸:醌氧化还原酶、苹果酸
酶和苹果酸脱氢酶。在有些方面，所述一个或多个基因破坏包括一个或多个基因的缺失。
[0272] 在有些实施方案中，本发明的非天然存在的微生物是克拉布特里阳性的且是在包含过量葡萄糖的培养基中。在这样的条件下，如本文中所述，该微生物能导致增加存在于该
微生物的细胞溶质中的NAD(P)H与NAD(P)的比率。
[0273] 在有些实施方案中，本发明提供如本文描述的非天然存在的微生物，其具有至少一种编码用于本发明的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的细胞外转运体或细胞外转运系统的外源
核酸。
[0274] 在有些实施方案中，本发明提供如本文描述的非天然存在的微生物，其中一种或多种参与以下的内源酶具有衰减的酶活性或表达水平：由所述微生物天然产生乙醇、甘油、
乙酸、甲酸、乳酸、CO2、脂肪酸或丙二酰-CoA；途径中间体向除细胞溶质以外的细胞区室转
移；或由所述微生物天然降解MI-FAE循环中间体、MD-FAE循环中间体或终止途径中间体。
因此，所述内源酶可以是脂肪酸合酶、乙酰-CoA羧化酶、生物素:脱辅基酶连接酶、酰基
载体蛋白、硫酯酶、酰基转移酶、ACP丙二酰基转移酶、脂肪酸延长酶、酰基-CoA合成酶、酰
基-CoA转移酶、酰基-CoA水解酶、丙酮酸脱羧酶、乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、酸形成醛脱氢酶、
乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、丙酮酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸磷酸酶、线粒
体丙酮酸载体、过氧化物酶体脂肪酸转运体、过氧化物酶体酰基-CoA转运体、过氧化物酶
体肉毒碱/酰基肉毒碱转移酶、酰基-CoA氧化酶或酰基-CoA结合蛋白。
[0275] 在有些实施方案中，本发明提供如本文描述的非天然存在的微生物，其中一种或多种参与NAD(P)H或NADH氧化的内源酶具有衰减的酶活性或表达水平。因此，所述一种或
多种内源酶可以是NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶、G3P脱氢酶、G3P磷酸酶、醇脱氢酶、丙酮
酸脱羧酶、醛脱氢酶(酸形成)、乳酸脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸:醌氧化
还原酶、苹果酸酶和苹果酸脱氢酶。
[0276] 本发明的非天然存在的微生物可含有稳定的遗传改变，它是指可培养五代以上而没有遗传改变损失的微生物。一般而言，稳定的遗传改变包括持续10代以上的修饰，具体
地说，稳定的修饰将持续超过约25代，和更具体地说，稳定的遗传修饰将是多于50代，包括
无限期地。
[0277] 就基因破坏而言，特别有用的稳定的遗传改变是基因缺失。应用基因缺失引入稳定的遗传改变对于降低向遗传改变之前的表型逆转的可能性特别有用。例如，生物化学物
质的稳定生长耦合生产可例如通过编码催化一组代谢修饰内的一个或多个反应的酶的基
因缺失来实现。生物化学物质的生长耦合生产的稳定性可通过多个缺失来进一步增强，从
而显著地降低对于各破坏活性而言发生多个代偿逆转的可能性。
[0278] 也提供的是产生具有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的稳定生长耦合生产的非天然存在的微生物的方法。该方法可包括计算机模拟(in silico)鉴别增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪
酸生产的一组代谢修饰，例如在指数生长期间增加生产的代谢修饰；遗传修饰生物体以含
有一组增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产的代谢修饰；和培养经遗传修饰的生物体。如果需
要，培养可包括经遗传修饰的生物体在需要脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产的条件下适应性
进化。本发明的方法适用于如本文公开的细菌、酵母和真菌以及多种其它细胞和微生物。
[0279] 因此，本发明提供非天然存在的微生物，其包含一个或多个基因破坏，使得脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生产增加。在一个实施方案中，所述一个或多个基因破坏赋予脂肪
醇、脂肪醛或脂肪酸的生长耦合生产，并且可例如赋予脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的稳定生长
耦合生产。在另一个实施方案中，所述一个或多个基因破坏可赋予脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸
生产与该微生物生长的专性耦合。这样的一个或多个基因破坏降低相应的一种或多种编码
酶的活性。
[0280] 所述非天然存在的微生物可具有编码本文公开的酶或蛋白质的基因中所包括的一个或多个基因破坏。如本文公开的，所述一个或多个基因破坏可以是缺失。本发明的此
种非天然存在的微生物包括如本文公开的细菌、酵母、真菌或适用于发酵过程的多种其它
微生物中的任何一种。
[0281] 因此，本发明提供非天然存在的微生物，包含一个或多个基因破坏，其中所述一个或多个基因破坏在编码蛋白质或酶的基因中出现，其中所述一个或多个基因破坏使得所述
生物体中脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生产增加。脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生产可以是生长
耦合的或不是生长耦合的。在一个特定的实施方案中，脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生产可以
与如本文公开的生物体生长专性耦合。
[0282] 本发明提供非天然存在的微生物，具有增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产(例如脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生长耦合生产)的遗传改变(例如基因破坏)。产物生产可以
例如通过遗传改变如本文公开的细胞的代谢途径而强制性地与该微生物的指数生长期相
关联。所述遗传改变可增加所需产物的生产或甚至使得所需产物成为在生长期期间的专性
产物。本文举例说明了导致脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生物合成的生产增加或水平提高的代
谢改变或转化。各改变对应于应该在功能上受到破坏的必要代谢反应。在一种或多种途径
(pathwyas)内所有反应的功能破坏都能够通过在生长期期间工程改造菌株而导致脂肪醇、
脂肪醛或脂肪酸的生产增加。
[0283] 这些非天然存在的改变中的每一个都导致与不含有这类代谢改变的菌株相比，在适当的培养条件下，例如在该微生物的指数生长期期间，脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产增加
及水平提高。适当的条件包括例如本文公开的那些，包括例如特定碳源或反应物可利用性
和/或适应性进化等条件。
[0284] 考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员应当理解，为了引入代谢改变(例如酶的衰减)，可能必需破坏参与反应的一种或多种酶的催化活性。或者，代谢改变可
包括破坏酶活性或最大活性所必需的调节蛋白或辅因子的表达。此外，酶促反应所必需的
辅因子的遗传损失也可以具有与编码该酶的基因的破坏相同的作用。破坏可通过多种方法
进行，包括例如缺失编码基因或在一种或多种编码基因序列中掺入遗传改变。靶向破坏的
编码基因可以是编码参与催化活性的酶的基因中的一个、一些或全部。例如，在单种酶参与
靶向的催化活性的情况下，破坏可通过减少或消除所编码基因产物的催化活性的遗传改变
来进行。类似地，在该单种酶是多聚体的(包括杂聚体的)的情况下，破坏可通过减少或破
坏所编码基因产物的一个或所有亚基的功能的遗传改变来进行。活性的破坏可以通过使形
成活性复合体所需要的一个或多个亚基的结合活性损失、通过破坏多聚体的复合体的催化
亚基或通过两者来完成。也可以靶向多聚体蛋白缔合和活性的其它功能以便破坏本发明的
代谢反应。这样的其它功能是本领域技术人员众所周知的。类似地，靶酶活性可以通过破坏
修饰和/或激活靶酶的蛋白质或酶(例如，将脱辅基酶转变成全酶所需要的分子)的表达
进行减少或消除。此外，根据本发明所述可以破坏单一多肽或多聚体的复合体的一些或所
有功能以减少或废除参与本发明的反应或代谢修饰的一种或多种酶的催化活性。类似地，
可以破坏参与本发明的反应或代谢修饰的一些或所有酶，只要所靶向的反应得以减少或消
除即可。
[0285] 考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员也将理解，可以通过减少或消除由共同基因和/或通过由表现出相似或实质上相同活性的基因的一种或多种直系同源物
编码的反应，破坏酶促反应。减少共同基因和所有直系同源物可导致所靶向反应的任何催
化活性的完全废除。然而，共同基因或一种或多种直系同源物的破坏可导致足以促进生长
与产物生物合成耦合的所靶向反应的催化活性减少。本文中举例说明的是编码多种代谢修
饰的催化活性的共同基因以及它们的直系同源物。本领域技术人员应当理解，编码所靶向
代谢反应的酶的一些或所有基因的破坏可以在本发明的方法中予以实践并且掺入到本发
明的非天然存在的微生物中以便达到脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产或生长耦合产物生产增
加。
[0286] 考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员也将理解酶促活性或表达可以使用所熟知的方法进行衰减。减少酶的活性或量可以模拟基因的完全破坏，如果减少引起酶
的活性下降到发挥功能的途径所正常需要的临界水平以下。通过各种技术而不是使用基因
破坏减少酶促活性对于生物体的活力可以是重要的。减少导致基因破坏的相似或完全相
同作用的酶促活性的方法包括但不限于：减少基因转录或翻译；使mRNA、蛋白质或催化RNA
去稳定化；和使影响酶活性或动力学的基因发生突变(参见，Sambrook等人,Molecular
Cloning:A Laboratory Manual, 第 三 版 ,Cold Spring Harbor Laboratory,New
York(2001)；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley
和Sons,Baltimore,MD(1999)。天然或施加的调节控制也可以实现酶衰减，包括：启动
子置换(参见，Wang等人,Mol.Biotechnol.52(2):300-308(2012))；转录因子的损失或
改变(Dietrick等人,Annu.Rev.Biochem.79:563-590(2010)；和Simicevic等人,Mol.
Biosyst.6(3):462-468(2010))；引入抑制性RNA或肽，例如siRNA、反义RNA、RNA或肽/小
分子结合适体(aptamer)、核酶(ribozyme)、适体酶(aptazyme)和核糖开关(riboswitch)
(Wieland 等 人 ,Methods 56(3):351-357(2012)；O’Sullivan,Anal.Bioanal.
Chem.372(1):44-48(2002)；和Lee等人,Curr.Opin.Biotechnol.14(5):505-511(2003))；
和添加减少或破坏酶促活性的药物或其它化学品(例如酶抑制剂、抗生素或靶特异性药
物)。
[0287] 本领域技术人员也将理解并认识到，酶的衰减可以在不同的水平上进行。例如，在基因水平上，引起部分或完全失效表型的突变(例如基因破坏)或引起上位
(epistatic)遗传效应以遮蔽基因产物活性的突变(Miko,Nature Education 1(1)
(2008))可用于使酶衰减。在基因表达水平上，用于衰减的方法包括：使转录与内源或
外源诱导物例如异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)偶联，然后在生产阶段期间添加少
量的诱导物或不添加诱导物(Donovan等人,J.Ind.Microbiol.16(3):145-154(1996)；
和Hansen等 人,Curr.Microbiol.36(6):341-347(1998))；引入 或 修 饰 基 因 的 正
或负调节因子；修饰在基因经整合的真核染色体区域中的组蛋白乙酰化/脱乙酰
化 (Yang 等 人 ,Curr.Opin.Genet.Dev.13(2):143-153(2003) 和 Kurdistani 等
人,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4(4):276-284(2003))；引 入 转 位 以 破 坏 启 动 子 或
调 节 基 因 (Bleykasten-Brosshans 等 人 ,C.R.Biol.33(8-9):679-686(2011)；和
McCue等人,PLoS Genet.8(2):e1002474(2012))；翻转转位元件或启动子区域的取
向以便调节相邻基因的基因表达(Wang等人,Genetics 120(4):875-885(1988)；
Hayes,Annu.Rev.Genet.37:3-29(2003)；在二 倍体 生物 体中，缺失 一个 导致 杂
合 性 损 失 的 等 位 基 因 (Daigaku 等 人 ,Mutation Research/Fundamental and
Molecular Mechanisms of Mutagenesis 600(1-2)177-183(2006))； 引 入 增
加RNA 降 解 的 核 酸(Houseley 等 人 ,Cell,136(4):763-776(2009)；或 在 细 菌
中，例如，引入转移信使RNA(tmRNA)标签(tag)，其导致RNA降解和核糖体失速
(stalling)(Sunohara 等 人 ,RNA 10(3):378-386(2004)；和 Sunohara 等 人 ,J.
Biol.Chem.279:15368-15375(2004))。在翻译水平上，衰减可包括：引入罕用密码
子以限制翻译(Angov,Biotechnol.J.6(6):650-659(2011))；引入阻断翻译的RNA
干 扰 分 子 (Castel 等 人 ,Nat.Rev.Genet.14(2):100-112(2013)；和 Kawasaki 等
人,Curr.Opin.Mol.Ther.7(2):125-131(2005)；修 饰 编 码 序 列 以 外 的 区 域，例
如在非翻译区(UTR)中引入二级结构以阻断翻译或降低翻译效率(Ringnér等
人,PLoS Comput.Biol.1(7):e72(2005))；添加用于快速转录物降解的RNA酶位
点 (Pasquinelli,Nat.Rev.Genet.13(4):271-282(2012)； 和 Arraiano 等 人 ,FEMS
Microbiol.Rev.34(5):883-932(2010)；引入反义RNA寡聚体或反义转录物(Nashizawa
等人,Front.Biosci.17:938-958(2012))；引入RNA或肽适体、核酶、适体酶、核糖
开 关 (Wieland 等 人 ,Methods 56(3):351-357(2012)；O’Sullivan,Anal.Bioanal.
Chem.372(1):44-48(2002)；和Lee等人,Curr.Opin.Biotechnol.14(5):505-511(2003))；
或引入涉及RNA结构的翻译调节元件，其可防止或减少可受小分子存在或不存在所控制
的翻译(Araujo等人,Comparative and Functional Genomics,Article ID 475731,8
页(2012))。在酶定位和/或寿命的水平上，酶衰减可包括：添加用于更快蛋白质周转
(turnover)的降解标签(Hochstrasser,Annual Rev.Genet.30:405-439(1996)；和Yuan
等人,PLoS One 8(4):e62529(2013))；或添加定位标签，其导致酶在真核细胞中分泌或定
位于亚细胞区室，在该亚细胞区室中酶将不能与其正常底物反应(Nakai等人,Genomics
14(4):897-911(1992)；和Russell等人,J.Bact.189(21)7581-7585(2007))。在翻译后
调节水平上，酶衰减可包括：增加已知抑制剂的胞内浓度；或修饰翻译后修饰位点(Mann等
人,Nature Biotech.21:255-261(2003))。在酶活性水平上，酶衰减可包括：添加内源或外
源抑制剂(例如酶抑制剂、抗生素或靶特异性药物)以减少酶活性；限制必要辅因子(例如
维生素B12)对需要辅因子的酶的可利用性；使酶活性所需要的金属离子螯合；或引入显性
阴性突变。以上描述的衰减技术的适用性可依赖于给定宿主微生物是原核生物还是真核生
物，且应当理解，对于给定宿主来说什么是适当技术的确定可以由本领域技术人员容易地
做出。
[0288] 在有些实施方案中，微好氧设计可以基于所需产物的生长耦合形成来使用。为了检查这一点，可通过在网络中可行的不同的生物质形成速率下首先将产物产率最大化且随
后最小化来针对各策略构建生产锥体。如果突变网络的所有可能表型的最右边界为单一
点，则意味着在网络中可能的最大生物质形成速率下存在独特的最佳产物产率。在其它情
况下，可行表型的最右边界为垂直线，表明在最大生物质的点上，网络可产生在计算范围内
产物的任何量，包括在垂直线的最底点处的最低量。给予这样的设计低优先性。
[0289] 可以破坏本文公开的各表中鉴别的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产策略以增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生产。因此，本发明也提供具有将脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产与生
物体的生长耦合的代谢修饰的非天然存在的微生物，其中代谢修饰包括一个或多个基因的
破坏，该基因选自编码本文公开的各表中所示的蛋白质和/或酶。
[0290] 如果确定菌株设计不足以增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产和/或将产物形成与生物质形成耦合，则菌株中的每一个都可以补充另外的缺失。或者，已知在生长条件下不具
备显著活性的一些其它酶可以由于适应性进化或随机诱变而变得有活性。这样的活性也可
以敲除。然而，本文公开的基因缺失清单允许构建表现出高产率脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生
产(包括脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生长耦合生产)的菌株。
[0291] 在有些实施方案中，本发明提供用于生产式(I)的化合物的方法：
[0292]
[0293] 其中R1为C1-24直链烷基；R2为CH2OH、CHO或COOH；R3为H、OH或氧代(＝O)；且代表单键或双键，前提条件是R3所连接的碳原子的化合价为四价，包括将本文描述
的非天然存在的微生物在足以产生所述式(I)的化合物的条件下培养足够的时间周期，其
中所述非天然存在的微生物具有一个或多个基因破坏，其中所述一个或多个基因破坏在编
码参与以下的蛋白质或酶的内源基因中出现：由所述微生物天然产生乙醇、甘油、乙酸、甲
酸、乳酸、CO2、脂肪酸或丙二酰-CoA；途径中间体向除细胞溶质以外的细胞区室转移；或由
该微生物天然降解MI-FAE循环中间体、MD-FAE循环中间体或终止途径中间体，所述一个或
多个基因破坏使得该微生物中的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的产生增加。因此，所述蛋白质或
酶可以是脂肪酸合酶、乙酰-CoA羧化酶、生物素:脱辅基酶连接酶、酰基载体蛋白、硫酯酶、
酰基转移酶、ACP丙二酰基转移酶、脂肪酸延长酶、酰基-CoA合成酶、酰基-CoA转移酶、酰
基-CoA水解酶、丙酮酸脱羧酶、乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、酸形成醛脱氢酶、乙酸激酶、磷酸转
乙酰酶、丙酮酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸磷酸酶、线粒体丙酮酸载体、过
氧化物酶体脂肪酸转运体、过氧化物酶体酰基-CoA转运体、过氧化物酶体肉毒碱/酰基肉
毒碱转移酶、酰基-CoA氧化酶或酰基-CoA结合蛋白。在有些方面，所述一个或多个基因破
坏包括一个或多个基因的缺失。
[0294] 在有些实施方案中，本发明提供使用如本文描述的非天然存在的微生物生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的方法，其中该MI-FAE循环、MD-FAE循环或该终止途径的一种或多种
酶优先与NADH辅因子反应或者就与NAD(P)H辅因子反应而言具有减少的优先性。例如，该
MI-FAE循环或MD-FAE循环的一种或多种酶可以是3-酮酰基-CoA还原酶或烯酰-CoA还原
酶。对于该终止途径，所述一种或多种酶可以是酰基-CoA还原酶(醛形成)、醇脱氢酶、酰
基-CoA还原酶(醇形成)、醛脱羰基酶、酰基-ACP还原酶、醛脱氢酶(酸形成)或羧酸还原
酶。
[0295] 在有些实施方案中，本发明提供使用如本文描述的非天然存在的微生物生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的方法，该微生物在编码蛋白质或酶的基因中具有一个或多个基因破
坏，该蛋白质或酶导致存在于该微生物的细胞溶质中的NAD(P)H与NAD(P)的比率在该破坏
之后增加。因此，编码导致存在于该微生物的细胞溶质中的NAD(P)H与NAD(P)的比率在
该破坏之后增加的蛋白质或酶的基因可以是NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶、甘油-3-磷酸
(G3P)脱氢酶、甘油-3-磷酸(G3P)磷酸酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、醛脱氢酶(酸形成)、
乳酸脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸:醌氧化还原酶、苹果酸酶和苹果酸脱氢
酶。在有些方面，所述一个或多个基因破坏包括一个或多个基因的缺失。
[0296] 在有些实施方案中，本发明提供使用本发明的非天然存在的微生物生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的方法，该微生物是克拉布特里阳性的且是在包含过量葡萄糖的培养基
中。在这样的条件下，如本文中所述，该微生物能导致增加存在于该微生物的细胞溶质中的
NAD(P)H与NAD(P)的比率。
[0297] 在有些实施方案中，本发明提供使用如本文描述的非天然存在的微生物生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的方法，该微生物具有至少一种编码本发明的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸
的细胞外转运体或细胞外转运系统的外源核酸。
[0298] 在有些实施方案中，本发明提供使用如本文描述的非天然存在的微生物生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的方法，其中一种或多种参与以下的内源酶具有衰减的酶活性或表达
水平：由所述微生物天然产生乙醇、甘油、乙酸、甲酸、乳酸、CO2、脂肪酸或丙二酰-CoA；途径
中间体向除细胞溶质以外的细胞区室转移；或由所述微生物天然降解MI-FAE循环中间体、
MD-FAE循环中间体或终止途径中间体。因此，所述内源酶可以是脂肪酸合酶、乙酰-CoA羧
化酶、生物素:脱辅基酶连接酶、酰基载体蛋白、硫酯酶、酰基转移酶、ACP丙二酰基转移酶、
脂肪酸延长酶、酰基-CoA合成酶、酰基-CoA转移酶、酰基-CoA水解酶、丙酮酸脱羧酶、乳酸
脱氢酶、醇脱氢酶、酸形成醛脱氢酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、丙酮酸氧化酶、甘油-3-磷
酸脱氢酶、甘油-3-磷酸磷酸酶、线粒体丙酮酸载体、过氧化物酶体脂肪酸转运体、过氧化
物酶体酰基-CoA转运体、过氧化物酶体肉毒碱/酰基肉毒碱转移酶、酰基-CoA氧化酶和酰
基-CoA结合蛋白。
[0299] 在有些实施方案中，本发明提供使用如本文描述的非天然存在的微生物生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的方法，其中一种或多种参与NAD(P)H或NADH氧化的内源酶具有衰减
的酶活性或表达水平。因此，所述一种或多种内源酶可以是NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶、
甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸磷酸酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、醛脱氢酶(酸形成)、
乳酸脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸:醌氧化还原酶、苹果酸酶和苹果酸脱氢
酶。
[0300] 如本文所公开的，脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸可以在该微生物培养期间例如在连续和/或接近连续培养期中的任何时间点收获或分离。一般而言，微生物在连续和/或接近
连续生长期维持得愈久，可生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的量按比例如愈大。
[0301] 因此，本发明另外还提供用于生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的方法，包括培养如本文公开的具有一个或多个基因破坏的非天然存在的微生物。该破坏可在编码增加脂肪醇、
脂肪醛或脂肪酸生产的酶的一个或多个基因中出现，包括当基因破坏减少或消除酶活性
时，任选地将脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产与该微生物生长耦合。例如，该破坏可对所述非
天然微生物赋予脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的稳定生长耦合生产。
[0302] 在有些实施方案中，该基因破坏可包括完整基因缺失。在有些实施方案中，破坏基因的其它方法包括例如省略或添加寡核苷酸或通过致使基因不可操作的突变进行框移
(frameshifting)。本领域技术人员将认识到基因缺失的优势，然而，因为稳定性，其使得非
天然存在的生物体不会回复为未发生基因破坏的亲本表型。具体地说，所述基因破坏选自
如本文公开的基因组。
[0303] 一旦计算预测由用于破坏以增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产的基因组构成，则可以对菌株进行构建、进化和测试。将基因破坏(包括基因缺失)通过本领域众所周知的
方法引入宿主生物中。如本文所公开，用于基因破坏的一种特别有用的方法是通过同源重
组。
[0304] 工程改造菌株可通过测量生长速率、底物摄取速率和/或产物/副产物分泌速率来表征。培养物可以生长并用作新鲜分批培养物的接种物，在指数生长期间对其进行测量。
生长速率可以通过使用分光光度计(A600)测量光密度来确定。培养物上清液中葡萄糖和
其它有机酸副产物的浓度可以通过适合于如本文公开的所需产物分析的熟知方法(例如
HPLC、GC-MS或其它熟知分析方法)来测定，且用于计算摄取和分泌速率。
[0305] 含有基因破坏的菌株可表现出次最佳生长速率直到它们的代谢网络已根据它们的缺失功能性进行调节。为了帮助这种调节。可使菌株进行适应性进化。通过使菌
株适应性进化，细胞生长速率变为主要选择压力，且迫使突变细胞重新配置其代谢通量
以便增强其生长速率。近来已证明几种大肠杆菌突变体的此代谢重程序化，该突变体
已在各种底物上适应性进化以达到由计算机模拟模型(in silico model)预测的生
长速率(Fong和Palsson,Nat.Genet.36:1056-1058(2004))。由适应性进化带来的生
长改进可伴随有脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产速率提高。菌株一般重复地进行适应性
进化，平行操作，以解决可由宿主生物表现出的进化模式差异(Fong和Palsson,Nat.
Genet.36:1056-1058(2004)；Fong等 人,J.Bacteriol.185:6400-6408(2003)；Ibarra 等
人,Nature 420:186-189(2002))，其可潜在地导致产生具有优于其它菌株的优越生产品质
的一种菌株。进化可操作一段时间，典型地2-6周，这取决于所达到的生长速率改进。一般
而言，一旦获得稳定的表型，即停止进化。
[0306] 在适应性进化过程之后，再次通过测量生长速率、底物摄取速率和产物/副产物分泌速率来表征新菌株。通过将实际生长和生产产率与来自代谢建模的生产包络线
(envelope)一起绘制曲线来将这些结果与理论预测进行比较。选出最成功的设计/进化
组合以进一步继续且在实验室规模分批和连续发酵中进行表征。本文公开的方法(例如
OptKnock方法)背后的生长耦合生物化学生产概念也导致遗传稳定过度生产者的产生。因
此，以连续模式维持培养物一段延长时间周期(例如一个月或一个月以上)以评估长期稳
定性。可取周期性样品以确保维持产率和生产力。
[0307] 适应性进化是一项可用于增加突变或或工程改造微生物菌株或者在非天然环境条件下生长的野生型菌株的生长速率的强大技术。对于通过导致生长耦合产物形成的方法
例如OptKnock设计的菌株尤其有用。因此，朝向最佳生长菌株的进化也将间接地使生产最
优化。通过基因敲除(gene knockout)和适应性进化产生大肠杆菌K-12 MG1655的独特菌
株(Fong和Palsson,Nat.Genet.36:1056-1058(2004))。在此项工作中，所有适应性进化
培养物都通过在达到稳定期之前将分批培养物系列传代至新鲜培养基中而维持在延长的
指数生长，因此使得生长速率为主要的选择压力。构建敲除菌株并在补充不同碳底物(每
个敲除菌株四种)的基本培养基上进化。进化培养物以一式两份或一式三份进行，得到总
共50个进化敲除菌株。将进化培养物维持在指数生长直到达到稳定的生长速率。在所检
查的50例中的38例中，计算预测值在预测敲除菌株的进化后生长速率方面为精确的(在
10％以内)。此外，OptKnock设计与适应性进化的组合已导致改良乳酸生产菌株。(Fong等
人,Biotechnol.Bioeng.91:643-648(2005))。相似的方法可应用于本文公开的菌株且应用
于各种宿主菌株。
[0308] 存在多种已开发技术用于进行适应性进化。本文公开了示例性的方法。在有些实施方案中，本发明的非天然存在的生物体的最优化包括利用适应性进化技术增加生产菌株
的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产和/或稳定性。
[0309] 连续培养涉及将小体积的生长培养物反复转移到大得多的含有新鲜生长培养基的容器中。当在新容器中培养的生物体生长至饱和时，重复该过程。这种方法已在文献
(Lenski和Travisano,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6808-6814(1994))中在清楚地证明
在一年内繁殖速率的一致改良的实验中达到持续培养物的最长久证明。典型地，培养物的
转移通常在指数期期间进行，因此每天精确计算转移体积以维持贯穿下一个24小时周期
的指数生长。人工系列稀释成本低且易于平行化。
[0310] 在连续培养物中，恒化器中的细胞生长代表保留极高分率细胞群体的极端稀释情况。随着培养物生长且变得饱和，以新鲜培养基替代小比例的生长培养物，从而允许培
养物以接近于其最大群体大小连续生长。恒化器已用于证明繁殖速率的短期快速改进
(Dykhuizen,Methods Enzymol.613-631(1993))。这些装置的潜在有用性被认识到，但传统
恒化器由于稀释抗性(静态)变异体的非期望选择而不能维持长期的选择来达成增加的
繁殖速率。这些变异体能够通过粘附于恒化器的表面而抵抗稀释，且藉此胜过粘着性较小
的个体，包括具有较高繁殖速率的个体，因此妨碍该装置的预期目的(Chao和Ramsdell,J.
Gen.Microbiol 20:132-138(1985))。一种克服此缺点的可行方法是构建具有两个生长
腔室的装置，其如先前所述定期地经历短暂灭菌阶段(Marliere和Mutzel,美国专利第
6,686,194号)。
[0311] EvolugatorTM是 由Evolugate,LLC(Gainesville,FL) 开 发 的 连 续 培 养 装置，且表现出相对于传统进化技术明显省时省力(de Crecy等人,Appl.Microbiol.
Biotechnol.77:489-496(2007))。细胞在达到稳定期之前通过将分批培养物连续传代到新
TM
鲜培养基中而维持在延长的指数生长。通过自动化光密度测量和液体处理，Evolugator
可使用大培养物体积以高速率进行系列转移，因此接近恒化器在细胞拟合进化中的效率。
例如，翻译器的组件中有缺陷且具有严重受妨碍生长的不动杆菌(Acinetobacter sp)ADP1
的突变体在200代中进化至野生型生长速率的80％。然而，与将细胞在单一容器中维持的
恒化器相反，该机器通过在管线轴的再分区域中自一个“反应器”移动至下一个中来操作，
因此消除关于壁生长的任何选择。转移体积是可调节的，且通常设定为约50％。该装置的
一个缺点是其较大且成本高，因此平行操作较大数目的进化不实际。此外，在当前装置配置
下，气体添加未得到良好调节，且严格厌氧条件不能维持。尽管如此，这是使生产菌株适应
性进化的一种替代方法。
[0312] 正如本文所公开的，可以将编码脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径所需活性的核酸导入宿主生物中。在有些情况下，可能理想的是改变脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径酶或蛋白质
的活性以增加脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生产。例如，可以将增加蛋白质或酶活性的已知突
变引入到编码核酸分子中。另外，最优化方法可以用来增加酶或蛋白质的活性和/或减少
抑制活性，例如减少负调节物的活性。
[0313] 一种这样的最优化方法是定向进化(directed evolution)。定向进化是一种十分有效的方法，包括引入靶向特定基因的突变以便改进和/或改变酶的特性。经改进和/
或改变的酶可以通过灵敏的高通量筛选测定的开发和实施来进行鉴别，该测定允许许多
4
酶变异体(例如，>10)的自动化筛选。通常要进行多轮重复的诱变和筛选才能获得具有
最优化特性的酶。能够有助于鉴定诱变用基因的区域的计算算法也已经开发出来并且可
以明显地减少需要产生和筛选的酶变异体数目。已开发出多项定向进化技术(关于综述
参见Hibbert等人,Biomol.Eng 22:11-19(2005)；Huisman和Lalonde,Biocatalysis in
the pharmaceutical and Biotechnology industries(制药工业和生物技术工业中的生
物催化),第717-742页(2007),Patel(编著),CRC Press；Otten和Quax.Biomol.Eng
22:1-9(2005)；和Sen等人,Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223(2007))以在产生多
样性变异体文库上有效，并且这些方法已经成功地应用于横跨许多酶类别的多个特性的改
进。已通过定向进化技术改进和/或改变的酶特征包括例如：选择性/特异性，用于非天然
底物的转变；温度稳定性，用于严酷高温加工；pH稳定性，用于在较低或较高pH条件下的生
物加工；底物或产物耐受性，使得可以达到高的产物效价；结合(Km)，包括拓宽底物结合以
包括非天然底物；抑制(Ki)，以去除被产物、底物或关键中间体抑制；活性(kcat)，以提高
酶促反应速率从而达到所需通量；表达水平，以增加蛋白质产率和总体途径通量；氧稳定
性，用于在好氧条件下空气敏感酶的操作；和厌氧活性，用于在氧不存在时需氧酶的操作。
[0314] 下文更详细描述的是已经开发出来用于靶向特定酶所需特性的基因的诱变和多样化的示例性方法。这样的方法都是本领域技术人员众所周知的。这些方法中的任何一个
都可以用于改变和/或最优化脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径酶或蛋白质的活性。
[0315] EpPCR(Pritchard等人,J Theor.Biol.234:497-509(2005))通过以下方式来引2+
入随机点突变：通过添加Mn 离子降低PCR反应中DNA聚合酶的保真度；偏重dNTP浓度；或
其它条件变化。将诱变限于所关注靶基因的五步克隆过程涉及：1)所关注基因的易错PCR
扩增；2)限制酶消化；3)所需DNA片段的凝胶纯化；4)连接到载体中；5)基因变异体转化
到合适宿主并且筛选文库用于改良性能。这种方法可在单一基因中同时产生多个突变，其
可适用于筛选较大数目的具有所需活性的潜在变异体。可通过EpPCR产生高数目的突变
体，因此，例如使用机器人的高通量筛选测定或选择方法可用于鉴定具有理想特征的那些。
[0316] 易错滚环扩增(Error-prone Rolling Circle Amplification,epRCA)(Fujii等人,Nucleic Acids Res.32:e145(2004)；和Fujii等人,Nat.Protoc.1:2493-2497(2006))
具有许多与epPCR相同的元件，只是使用完全环状质粒作为模板，且使用在最后2个核苷酸
上具有外切核酸酶抗性硫代磷酸酯键的随机6-聚体来扩增质粒，随后将其转化到细胞中，
2+
在转化的细胞中，质粒在串联重复上被重新环化。调节Mn 浓度可稍微改变突变速率。这
项技术使用一种简单易错、单步骤方法以产生具有3-4个突变/kbp的质粒的完整拷贝。不
需要限制酶消化或特异性引物。另外，这种方法典型地以商业上可获得的试剂盒形式可获
得。
[0317] DNA或 家 族 改 组 (Family Shuffling)(Stemmer,Proc Natl Acad Sci USA91:10747-10751(1994))；和Stemmer,Nature 370:389-391(1994))通常包括用核酸酶(例
如Dnase I或EndoV)消化两种或两种以上变异基因以产生随机片段库，该随机片段库可
在DNA聚合酶存在下通过退火和延伸的多次循环进行重新装配以产生嵌合基因文库。片段
彼此引发且当一个拷贝引发另一个拷贝(模板转换)时发生重组。这种方法可以与>1kbp
DNA序列一起使用。除了通过片段重新装配产生的突变重组体以外，这种方法还在延伸步骤
中以类似于易错PCR的速率引入点突变。该方法可用于移除有害、随机和中性突变。
[0318] 交 错 延 伸 (Staggered Extension,StEP)(Zhao 等 人 ,Nat.Biotechnol.16:258-261(1998))需要模板引导，随后经过2步PCR的重复循环，并且经变性
和非常短持续时间的退火/延伸(短至5秒)。生长片段退火至不同模板并进一步延伸，将
其重复直到产生全长序列为止。模板转换意味着大多数所得片段具有多个亲本。低保真度
聚合酶(Taq和Mutazyme)的组合因相反突变谱而减小易错偏倚。
[0319] 在随机引导重组(Random Priming Recombination,RPR)中，使用随机序列引物来产生大量互补于模板不同区段(segment)的短DNA片段(Shao等人,Nucleic Acids Res
26:681-683(1998))。碱基错误掺入和通过epPCR的错误引发得到点突变。短DNA片段基
于同源性彼此引发且通过重复热循环重组和重新装配成全长。在这个步骤之前移除模板可
确保低亲本重组体。这种方法像大多数其它方法一样，可经历多个反覆来进行以进化区别
特征。这项技术避免了序列偏倚，不依赖于基因长度且需要极少亲本DNA供应用。
[0320] 在异源双链体重组(Heteroduplex Recombination)中，使用线性化质粒DNA来形成被错配修复所修复的异源双链体(Volkov等人,Nucleic Acids Res.27:e18(1999)；和
Volkov等人,Methods Enzymol.328:456-463(2000))。错配修复步骤至少稍微诱发突变。
异源双链体比线性同双链体更有效地转化。这种方法适合于大基因和整个操纵子。
[0321] 过 渡 模 板 随 机 嵌 合 生 长 (Random Chimeragenesis on TransientTemplates,RACHITT)(Coco 等 人 ,Nat.Biotechnol.19:354-359(2001)) 使 用 单 链
DNA(ssDNA)的Dnase I片段化和大小分级分离。同源片段在不存在聚合酶时与互补ssDNA
骨架杂交。任何重叠未杂交的片段末端均通过外切核酸酶修剪。填平片段之间的缺口，然
后连接以得到全长与骨架杂交的全长多样化链库，其含有U以排除扩增。随后破坏骨架并
且通过PCR扩增以与多样化链互补的一条新链替代。该方法涉及仅来自一个亲本的一条链
(骨架)，而引发片段来源于其它基因，且针对亲本骨架进行选择。因此，不发生亲本片段再
退火。重叠片段用外切核酸酶修剪。另外，这在概念上类似于DNA改组和StEP。因此，应该不
存在同辈份物(siblings)、存在极少无活性物且不存在未改组亲本。这项技术的优势在于
产生极少或不产生亲本基因且相对于标准DNA改组可得到多得多的交换体(crossovers)。
[0322] 截短模板重组延伸(Recombined Extension on Truncated templates,RETT)需要在用作模板库的单向ssDNA片段存在下模板转换来自引物的单向生长链(Lee等人,J.
Molec.Catalysis 26:119-129(2003))。不使用DNA内切核酸酶。单向ssDNA由使用随机
引物的DNA聚合酶或使用外切核酸酶的系列缺失产生。单向ssDNA仅为模板且不为引物。
随机引发和外切核酸酶不引入序列偏倚作为DNA改组/RACHITT的酶促裂解的真相。RETT
因为其使用正常PCR条件而非极短延伸，所以比StEP更易最佳化。重组作为PCR步骤的分
项出现，即无直接改组。这种方法也可由于不存在暂停而比StEP更随机。
[0323] 在 简 并 寡 核 苷 酸 基 因 改 组 (Degenerate Oligonucleotide GeneShuffling,DOGS)中，使用简并引物来控制分子之间的重组；(Bergquist和Gibbs,Methods
Mol.Biol 352:191-204(2007)；Bergquist等人,Biomol.Eng 22:63-72(2005)；Gibbs等
人,Gene 271:13-20(2001))这可用于控制其它方法(例如DNA改组)使亲本基因再生的
趋势。这种方法可以与所选基因区段的随机诱变(epPCR)组合。这可以是阻断亲本序列
再形成的良好方法。不需要内切核酸酶。通过调节所产生区段的输入浓度，可向所需骨架
(backbone)偏倚。这种方法允许在无限制酶消化的情况下自无关亲本进行DNA改组并且允
许选择随机诱变方法。
[0324] 用渐增截短法产生杂合酶(Incremental Truncation for the Creation ofHybrid Enzymes,ITCHY)产生具有所关注基因或基因片段的1个碱基对缺失的组合文库
(Ostermeier等 人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:3562-3567(1999)；和Ostermeier 等
人,Nat.Biotechnol.17:1205-1209(1999))。在2种不同基因碎片上以相反的方向引入截
短。将这些连接在一起并将融合物克隆。这项技术不需要2个亲本基因之间的同源性。当
ITCHY与DNA改组组合时，将该系统称为SCRATCHY(参见下文)。两者的主要优势是不需要
亲本基因之间的同源性；例如，通过ITCHY产生了大肠杆菌基因和人基因之间的功能融合
物。当产生ITCHY文库时，所有可能的交换体均被捕获。
[0325] 用硫代渐增截短法产生杂合酶(Thio-Incremental Truncation for theCreation of Hybrid Enzymes,THIO-ITCHY)类似于ITCHY，只是使用硫代磷酸酯dNTPs产
生截短物(Lutz等人,Nucleic Acids Res 29:E16(2001))。相对于ITCHY，THIO-ITCHY可
以更易于最优化，提供更多再现性及可调节性。
[0326] SCRATCHY将ITCHY和DNA改组这两种重组基因的方法结合起来(Lutz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:11248-11253(2001))。SCRATCHY将ITCHY和DNA改组的最佳特征
结合起来。首先，使用ITCHY在基因的片段之间以DNA同源性非依赖性方式产生综合融合
物组。这种人工家族然后经受DNA-改组步骤以增大交换体数目。可将计算预测值用于最
佳化。当序列同一性在80％以下时，SCRATCHY比DNA改组更有效。
[0327] 在随机漂移诱变(Random Drift Mutagenesis,RNDM)中，通过epPCR产生突变，然后进行筛选/选择并将有可利用活性的那些保留下来(Bergquist等人,Biomol.
Eng.22:63-72(2005))。然后，将这些用于DOGS以产生具有在多种活性突变体之间或在活
性突变性和一些其它所需亲本之间的融合物的重组体。经设计以促进中性突变的分离；其
目的是针对保留的催化活性进行筛选，无论这种活性比是高于还是低于原始基因中的活
性。当筛选能够检测到超过背景的活性时，RNDM在高通量测定中很有用。RNDM已在产生多
样性中用作DOGS的前端。该技术强加在改组或其它后续步骤之前的活性要求；表明导致中
性漂移文库自较小文库产生活性的较高/较快改进。尽管公开使用epPCR，但是这项技术可
应用于其它大规模诱变方法。
[0328] 序列饱和诱变(Sequence Saturation Mutagenesis,SeSaM)是一种随机诱变方法，其：1)使用随机掺入硫代磷酸酯核苷酸并裂解来产生随机长度片段库；该库用作模板
以2)在“通用”碱基(例如肌苷)存在下延伸；3)含肌苷的互补随机复制得到碱基掺入
并因此发生诱变(Wong等人,Biotechnol.J.3:74-82(2008)；Wong等人,Nucleic Acids
Res.32:e26(2004)；和Wong等人,Anal.Biochem.341:187-189(2005))。使用这项技术，可
能在2至3天内使用简单方法产生大的突变体文库。这项技术与DNA聚合酶的突变偏倚相
比是非定向的。这种方法中的差异使得这项技术与epPCR互补(或为其替代方法)。
[0329] 在合成改组(Synthetic Shuffling)中，重叠寡核苷酸经设计以编码“靶标中的所有遗传多样性”并且允许经改组的子代的非常高多样性(Ness等人,Nat.
Biotechnol.20:1251-1255(2002))。在这项技术中，可设计待改组的片段。这有助于提高
子代的所得多样性。可设计序列/密码子偏倚以制造更多远缘相关序列以接近更密切相关
序列所观察到的速率的速率重组。另外，该技术不需要物理上具有模板基因。
[0330] 核苷酸交换和切除技术(Nucleotide Exchange and Excision Technology,NexT)利用dUTP掺入随后相继用尿嘧啶DNA糖基化酶及哌啶处理的组合以进行终点DNA片段化
(Muller等人,Nucleic Acids Res.33:e117(2005))。基因使用内部PCR引物延伸与校对
(proofreading)聚合酶进行重新装配。改组尺寸可使用不同dUPT::dTTP比率直接控制。
这是使用尿嘧啶掺入和裂解的简单方法的终点反应。其它核苷酸类似物(例如8-氧代-鸟
嘌呤)可以与这种方法一起使用。另外，该技术用非常短的片段(86bp)良好工作且错误率
低。这项技术中使用的DNA的化学裂解导致产生极少未改组的克隆。
[0331] 在不依赖序列同源性的蛋白质重组(Sequence Homology-Independent ProteinRecombination,SHIPREC)中，使用接头(linker)来促进两个远缘基因或无亲缘关系的基
因之间的融合。使用核酸酶处理在这两种基因之间产生一系列嵌合体。这些融合导致产生
单交换杂合体文库(Sieber等人,Nat.Biotechnol.19:456-460(2001))。这产生了有限类
型的改组且需要一种独立过程用于诱变。另外，由于不需要同源性，因此这项技术可产生具
有不同分数的两种无亲缘关系的亲本基因中每一种基因的嵌合体的文库。SHIPREC用与哺
乳动物CP450的N-末端区域融合的细菌CP450的血色素-结合结构域进行了测试；这在溶
解性较高的酶中产生了哺乳动物活性。
[0332] 在基因位点饱和诱变TM(Gene Site Saturation MutagenesisTM,GSSMTM)中，起始材料是含有插入片段和两种引物的超螺旋双链DNA(dsDNA)质粒，其在所要突变位点处发
生简并(Kretz等人,Methods Enzymol.388:3-11(2004))。携带所关注突变的引物退火至
DNA相反链上的相同序列。该突变是典型地在引物中间且在每一侧侧接正确序列的大约20
个核苷酸。该引物中的序列是NNN或NNK(编码)和MNN(非编码)(N＝所有4个，K＝G、
T，M＝A、C)。在延伸之后，用DpnI消化dam甲基化DNA以消除野生型模板。这项技术探索
在给定基因座(即，一个密码子)的所有可能氨基酸取代。该技术有助于在没有无义密码
子的单一位点上产生所有可能置换且导致以相等至接近相等的程度呈现最有可能的等位
基因。这项技术不需要靶酶的结构、机制或结构域的先前知识。如果随后进行改组或基因
重新装配，则这项技术产生含有单一位点向上突变(single-site up-mutations)的所有可
能组合的重组体的多样化文库。已证明这项技术组合适用于超过50种不同酶的成功进化，
以及给定酶中的超过一种特性。
[0333] 组合盒式诱变(Combinatorial Cassette Mutagenesis,CCM)涉及使用短寡核苷酸盒以替代具有大量可能氨基酸序列改变的限制区域(Reidhaar-Olson等人,Methods
Enzymol.208:564-586(1991)；和Reidhaar-Olson等人,Science 241:53-57(1988))。使
用这项技术在两个或三个位点处同时取代是可能的。另外，该方法测试在有限范围的位点
处可能序列变化的较大多重性。这项技术已用于探索λ阻抑因子DNA-结合结构域的信息
含量。
[0334] 组合多重盒式诱变(Combinatorial Multiple Cassette Mutagenesis,CMCM)基本上类似于CCM，只是它用作较大程序的组成部分：1)以高突变率使用epPCR以2)鉴
定热点和热区域，且然后3)通过CMCM延伸以覆盖蛋白质序列空间的限定区域(Reetz
等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.40:3589-3591(2001))。如用CCM，这种方法可测试
覆盖靶区域上的事实上所有可能的改变。如果与产生随机突变和改组基因的方法一
起使用，则它提供产生多样性、改组蛋白质的优异方式。这种方法将酶的对映选择性
(enantioselectivity)成功增加51倍。
[0335] 在致突变菌株技术(Mutator Strains technique)中，条件性ts致突变质粒在选择期间使随机和天然突变频率增加20-4000倍，而当不需要选择时阻断缺失突变的累积
(Selifonova等人,Appl.Environ.Microbiol.67:3645-3649(2001))。这项技术基于质粒
衍生的mutD5基因，该基因编码DNA聚合酶III的突变亚基。该亚基与内源DNA聚合酶III
结合且在带有该质粒的任何菌株中损害聚合酶III的校对能力。发生各种碱基取代和框移
突变。为了有效使用，致突变质粒一旦达到所需表型就应该立即移除；这通过温度敏感性
(ts)复制起点来完成，该温度敏感性(ts)复制起点使得质粒在41℃下固化。应该注意到，
已探索致突变菌株很长时间(参见Low等人,J.Mol.Biol.260:359-3680(1996))。在这项
技术中，观察到非常高的自发突变速率。条件特性将非所要背景突变减到最小。这项技术
可与适应性进化组合以提高诱变速率并且更快速达到所需表型。
[0336] 精 细诱 变 (Look-through Mutagenesis,LTM)是 评估 和 最 优 化 所 选 氨基酸的组合突变的一种多维诱变方法(Rajpal等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
102:8466-8471(2005))。不以所有可能的氨基酸变化使各位点饱和，选择一组九个变化以
覆盖氨基酸R基团化学结构的范围。每个位点较少变化允许多个位点经受此诱变类型。通
过这种方法已达到了从低摩尔浓度到皮克摩尔浓度的抗体的结合亲和力增加>800倍。这
是将随机组合的数目降到最低的合理方法并且可通过大大减少待筛选的克隆数目来增加
发现改良性状的能力。这已应用于抗体工程改造，特别是增加结合亲和力和/或降低解离。
该技术可以与筛选或选择结合起来。
[0337] 基因重新装配(Gene Reassembly)是一种DNA改组方法，可一度应用到多基因TM TM
或用来产生单一基因的嵌合体的大文库(多个突变)(Tunable GeneReassembly (TGR )
Technology supplied by Verenium Corporation)。典型地，这项技术与超高通量筛选组
合以查询所需改进的所代表序列空间。这项技术允许不依赖同源性的多基因重组。交换事
件的精确数目和位置可以使用通过生物信息分析设计的片段来预先确定。这项技术导致产
TM
生非常高水平的多样性(事实上无亲本基因重新形成)和低水平的无活性基因。与GSSM
组合，可以测试较大突变范围的改良活性。该方法允许DNA改组的“掺混”和“精细调节”，
例如，密码子使用可经最优化。
[0338] 计算机模拟蛋白质设计自动化(in Silico Protein Design Automation,PDA)是一种最优化算法，可锚定具有特殊折叠的结构确定的蛋白质骨架，并检索可以稳定折叠和
总体蛋白质动能学的用于氨基酸取代的序列空间(Hayes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
99:15926-15931(2002))。这项技术使用基于计算机模拟结构的熵预测以便检索针对蛋白
质氨基酸变异的结构耐受性。应用统计力学(Statistical mechanics)来计算每个位置的
偶联相互作用。针对氨基酸取代的结构耐受性是偶联的一种度量。最终，这项技术经设计
以在维持结构特征完整性的同时产生蛋白质特性的所需修饰。该方法利用计算方法评估并
50
且允许过滤非常大量的可能序列变异体(10 )。选择待测序列变异体与基于最有利热动力
学的预测相关。表面上只有稳定性或与稳定性有关的特性可用此项技术有效解决。该方法
已成功地应用于一些治疗蛋白质，尤其是应用于工程改造免疫球蛋白。计算机模拟预测避
免了测试超常规大量的潜在变异体。基于现有三维结构的预测比基于假设结构的预测更有
可能成功。这项技术可容易地预测并且允许多个同时突变的靶向筛选，由于此筛选因数目
的指数增大有时不可能用纯粹实验技术实现。
[0339] 迭代 饱 和诱 变(Iterative Saturation Mutagenesis,ISM) 涉及：1)利 用结构/功能知识来挑选用于酶改进的最可能位点；2)使用诱变方法例如Stratagene
QuikChange(Stratagene；San Diego CA)在所选位点上进行饱和诱变；3)筛选/选择所
需特性；和4)使用改进的克隆，在另一个位点上重新开始并且继续重复直到获得所需要
的活性(Reetz等人,Nat.Protoc.2:891-903(2007)；和Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed
Engl.45:7745-7751(2006))。这是一种经证明的方法，其确保产生在给定位置上的所有可
能置换用于筛选/选择。
[0340] 任何上述用于诱变的方法可以单独使用或者以任何组合使用。另外，定向进化方法的任何一个或组合可以结合本文所述的适应性进化技术使用。
[0341] 应当理解，基本上不影响本发明各种实施方案的活性的修改也在本文提供的本发明定义内提供。因此，以下实施例意在说明而不是限制本发明。
[0342] 实施例I
[0343] 通过MI-FAE循环、MD-FAE循环和酰基-CoA终止途径生产脂肪醇和脂肪醛
[0344] 下文进一步举例说明了可用作赋予宿主微生物脂肪醇和脂肪醛生产能力的来源的编码核酸和物种。
[0345] 多酶复合体
[0346] 在一个示例性的实施方案中，基因fadA和fadB编码表现出丙二酰-CoA非依赖性FAS途径的三组分活性即酮酰基-CoA硫解酶、3-羟基酰基-CoA脱氢酶和烯
酰-CoA水合酶活性的多酶复合体(Nakahigashi,K.和H.Inokuchi,Nucleic Acids
Research 18:4937(1990)；Yang等人,Journal of Bacteriology 173:7405-7406(1991)；
Yang 等 人 ,Journal of Biological Chemistry 265:10424-10429(1990)；Yang 等
人,Biochemistry 30:6788-6795(1990))。fadI和fadJ基因编码类似活性，其可取代以
上丙二酰-CoA非依赖性FAS赋予的基因fadA和fadB。大肠杆菌的酰基-CoA脱氢酶由
fadE编码(Campbell等人,J Bacteriol 184:3759-64))。这种酶催化β-氧化的限速步
骤(O’Brien等人,J Bacteriol 132:532-40(1977))。各种以上fad基因的核酸序列是本
领域众所周知的并且可以在公共数据库(例如Genbank)中使用以下登录号登录。
[0347]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
fadA YP_026272.1 49176430 大肠杆菌
fadB NP_418288.1 16131692 大肠杆菌
fadI NP_416844.1 16130275 大肠杆菌
fadJ NP_416843.1 16130274 大肠杆菌
fadR NP_415705.1 16129150 大肠杆菌
fadE AAC73325.2 87081702 大肠杆菌
[0348] 步骤A.硫解酶
[0349] 在本文(图1A和图6A)中描述了适合于脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产的硫解酶，也称为β-酮硫解酶、酰基-CoA C-乙酰基转移酶、酰基-CoA:乙酰-CoA C-酰基
转移酶、3-氧代酰基-CoA硫解酶、3-酮酰基-CoA硫解酶、β-酮酰基-CoA硫解酶和酰
基-CoA硫解酶。示例性的乙酰乙酰-CoA硫解酶包括来自大肠杆菌的atoB和同源性
qeF(Martin等人,Nat.Biotechnol 21:796-802(2003))、来自丙酮丁醇梭菌的thlA和
thlB(Hanai等人,Appl Environ Microbiol 73:7814-7818(2007)；Winzer等人,J.Mol.
Microbiol Biotechnol 2:531-541(2000))和来自酿酒酵母的ERG10(Hiser等人,J.
Biol.Chem.269:31383-31389(1994))的基因产物。酿酒酵母的降解性硫解酶由POT1编
码。另一种候选硫解酶是富养罗尔斯通氏菌(R.eutropha)的phaA基因产物(Jenkins等
人,Journal of Bacteriology 169:42-52(1987))。来自生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)
的乙酰乙酰-CoA硫解酶在生物合成方向上是不可逆的并且其晶体结构是可获得的
(Merilainen等人,Biochem 48:11011-25(2009))。在以下表格中包括了这些硫解酶和同
源物的登录号。
[0350]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
atoB NP_416728 16130161 大肠杆菌
yqeF NP_417321.2 90111494 大肠杆菌
thlA NP_349476.1 15896127 丙酮丁醇梭菌
[0351]thlB NP_149242.1 15004782 丙酮丁醇梭菌
ERG10 NP_015297 6325229 酿酒酵母
POT1 NP_012106.1 6322031 酿酒酵母
phaA YP_725941 113867452 富养罗尔斯通氏菌
phbA P07097.4 135759 生枝动胶菌
h16_A1713 YP_726205.1 113867716 富养罗尔斯通氏菌
pcaF YP_728366.1 116694155 富养罗尔斯通氏菌
h16_B1369 YP_840888.1 116695312 富养罗尔斯通氏菌
h16_A0170 YP_724690.1 113866201 富养罗尔斯通氏菌
h16_A0462 YP_724980.1 113866491 富养罗尔斯通氏菌
h16_A1528 YP_726028.1 113867539 富养罗尔斯通氏菌
h16_B0381 YP_728545.1 116694334 富养罗尔斯通氏菌
h16_B0662 YP_728824.1 116694613 富养罗尔斯通氏菌
h16_B0759 YP_728921.1 116694710 富养罗尔斯通氏菌
h16_B0668 YP_728830.1 116694619 富养罗尔斯通氏菌
h16_A1720 YP_726212.1 113867723 富养罗尔斯通氏菌
h16_A1887 YP_726356.1 113867867 富养罗尔斯通氏菌
bktB YP_002005382.1 194289475 台湾贪铜菌
Rmet_1362 YP_583514.1 94310304 耐金属罗尔斯通氏菌
Bphy_0975 YP_001857210.1 186475740 瘤状伯克霍尔德氏菌
[0352] 许多硫解酶催化较长链酰基-CoA产物的形成。示例性的硫解酶包括例如3-氧代己二酰-CoA硫解酶(EC 2.3.1.174)和酰基-CoA硫解酶(EC 2.3.1.16)。3-氧代己二
酰-CoA硫解酶将琥珀酰-CoA和乙酰-CoA转变成3-氧代己二酰-CoA，并且是芳香族化合
物降解的β-酮己二酸途径的一个关键酶。该酶广泛分布于土壤细菌和真菌包括恶臭假
单胞菌(Harwood等人,J Bacteriol.176:6479-6488(1994))和醋酸钙不动杆菌(Doten等
人,J Bacteriol.169:3168-3174(1987))中。由假单胞菌B13菌株中的pcaF(Kaschabek
等人,J Bacteriol.184:207-215(2002))、恶臭假单胞菌U中的phaD(Olivera等人,Proc.
Natl.Acad.Sci U.S.A 95:6419-6424(1998))、荧光假单胞菌ST中的paaE(Di等人,Arch.
Microbiol 188:117-125(2007))和来自大肠杆菌的paaJ(Nogales等人,Microbiology
153:357-365(2007))编码的基因产物也催化这种转化。若干β-酮硫解酶表现出以形成
氧代己二酰-CoA的方向有显著性和选择性活性，包括来自恶臭假单胞菌的bkt、来自绿脓
假单胞菌PAO1的pcaF和bkt、来自不明确伯克霍尔德氏菌AMMD的bkt、来自大肠杆菌的
paaJ和来自恶臭假单胞菌的phaD。富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)(旧称真
养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus))的两种基因产物由基因bktB和bktC编码，催化
3-氧代庚二酰-CoA的形成(Slater等人,J.Bacteriol.180:1979-1987(1998)；Haywood等
人,FEMS Microbiology Letters 52:91-96(1988))。BktB的蛋白质序列是已知的；然而，
BktC的蛋白质序列尚未报道。BktB对长度C6和C8的底物也有活性(Machado等人,Met
Eng in press(2012))。沼泽红假单胞菌的pim操纵子也编码β-酮硫解酶，由pimB编码，
经预测在苯甲酰-CoA降解期间以降解方向催化这种转化(Harrison等人,Microbiology
151:727-736(2005))。通过与bktB的序列同源性鉴定出酸养互养菌(S.aciditrophicus)
中的一个β-酮硫解酶候选者(43％同一性,e值＝1e-93)。
[0353]基因名称 GI# GenBank登录# 生物体
paaJ 16129358 NP_415915.1 大肠杆菌
pcaF 17736947 AAL02407 克氏假单胞菌(B13)
phaD 3253200 AAC24332.1 恶臭假单胞菌
pcaF 506695 AAA85138.1 恶臭假单胞菌
pcaF 141777 AAC37148.1 醋酸钙不动杆菌
paaE 106636097 ABF82237.1 荧光假单胞菌
bkt 115360515 YP_777652.1 不明确伯克霍尔德氏菌AMMD
bkt 9949744 AAG06977.1 绿脓假单胞菌PAO1
pcaF 9946065 AAG03617.1 绿脓假单胞菌PAO1
bktB YP_725948 11386745 富养罗尔斯通氏菌
pimB CAE29156 39650633 沼泽红假单胞菌
syn_02642 YP_462685.1 85860483 酸养互养菌
[0354] 参与脂肪酸降解的β-氧化循环的酰基-CoA硫解酶(EC 2.3.1.16)酶表现出对不同链长的宽范围的酰基-CoA底物具有活性。示例性的酰基-CoA硫解酶在拟南芥
(Cruz等人,Plant Physiol 135:85-94(2004))、智人(Mannaerts等人,Cell Biochem
Biphys 32:73-87(2000))、向 日 葵(Helianthus annuus)(Schiedel等 人 ,Prot Expr
Purif 33:25-33(2004))中被发现。硫解酶的链长特异性可通过本领域众所周知的方
法来测定(Wrensford等人,Anal Biochem 192:49-54(1991))。大鼠肝脏中发现的过
氧化物酶体硫解酶催化来自辛酰-CoA的较长链酰基-CoA产物的乙酰-CoA依赖性形成
(Horie等人,Arch Biochem Biophys 274:64-73(1989)；Hijikata等人,J Biol Chem
265,4600-4606(1990))。
[0355]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
AY308827.1:1..1350AAQ77242.1 34597334 向日葵
KAT2 Q56WD9.2 73919871 拟南芥
KAT1 Q8LF48.2 73919870 拟南芥
[0356]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
KAT5 Q570C8.2 73919872 拟南芥
ACAA1 P09110.2 135751 智人
LCTHIO AAF04612.1 6165556 野猪
Acaa1a NP_036621.1 6978429 褐家鼠
Acaa1b NP_001035108.1 90968642 褐家鼠
Acaa2 NP_569117.1 18426866 褐家鼠
[0357] 乙酰乙酰-CoA也可以通过乙酰乙酰-CoA合酶(EC 2.3.1.194)由乙酰-CoA和丙二酰-CoA合成。这种酶(FhsA)已在土壤细菌链霉菌CL190中进行了表征，在该菌中它参
与甲羟戊酸生物合成(Okamura等人,PNAS USA 107:11265-70(2010))。因为这种酶催化基
本上不可逆的反应，所以它对过量产生由乙酰乙酰-CoA(例如长链醇)衍生的代谢物、燃料
或化学品的代谢工程应用特别有用。其它乙酰乙酰-CoA合酶基因可通过与fhsA的序列同
源性进行标识。酰基-CoA合酶(例如fhsA)和同源物可通过本领域已知的方法经工程改
造或进化以接受较长酰基-CoA底物。
[0358]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
fhsA BAJ83474.1 325302227 链霉菌CL190
AB183750.1:11991..12971 BAD86806.1 57753876 链霉菌KO-3988
epzT ADQ43379.1 312190954 肉桂色链霉菌
ppzT CAX48662.1 238623523 环圈链霉菌
O3I_22085 ZP_09840373.1 378817444 巴西诺卡氏菌
[0359] 以上描述的所选硫解酶的链长选择性概述于下表。
[0360]链长 基因 生物体
C4 atoB 大肠杆菌
C6 phaD 恶臭假单胞菌
C6-C8 bktB 富养罗尔斯通氏菌
C10-C16 Acaa1a 褐家鼠
[0361] 步骤B. 3-氧代酰基-CoA还原酶
[0362] 3-氧代酰基-CoA还原酶(也称为3-羟基酰基-CoA脱氢酶、3-酮酰基-CoA还原酶、β-酮酰基-CoA还原酶、β-羟基酰基-CoA脱氢酶、羟基酰基-CoA脱氢酶和
酮酰基-CoA还原酶)催化3-氧代酰基-CoA底物还原成3-羟基酰基-CoA产物(图
1B和图6B)。这些酶经常参与脂肪酸β-氧化和芳香族降解途径。例如，在大肠杆菌
中，由fadB和fadJ编码的两个脂肪酸氧化复合体的亚基，作为3-羟基酰基-CoA脱
氢酶发挥功能(Binstock等人,Methods Enzymol.71 Pt C:403-411(1981))。可以利
用敲除由fadR编码的负调节物来激活fadB基因产物(Sato等人,J Biosci.Bioeng
103:38-44(2007))。来自大肠杆菌的另一种3-羟基酰基-CoA脱氢酶是paaH(Ismail
等人,European Journal of Biochemistry 270:3047-3054(2003))。另外的3-氧代
酰基-CoA酶包括恶臭假单胞菌中的phaC(Olivera等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A
95:6419-6424(1998))和荧光假单胞菌中的paaC(Di等人,188:117-125(2007))的基
因产物。这些酶在苯乙酸或苯乙烯的分解代谢期间催化3-羟基己二酰-CoA可逆性氧
化成3-氧代己二酰-CoA。其它合适的酶候选者包括来自纤细裸藻(E.gracilis)的
AAO72312.1(Winkler等人,Plant Physiology 131:753-762(2003))和来自恶臭假单胞菌
的paaC(Olivera等人,PNAS USA 95:6419-6424(1998))。催化乙酰乙酰-CoA还原成3-羟
基丁酰-CoA的酶包括的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的hbd(Youngleson
等人,J Bacteriol.171:6800-6807(1989))、来自生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)的
phbB(Ploux等人,Eur.J Biochem.174:177-182(1988))、来自类球红细菌(Rhodobacter
sphaeroides)的phaB(Alber等人,Mol.Microbiol 61:297-309(2006))和富养罗尔斯
通氏菌(Ralstonia eutropha)的paaH1(Machado等人,Met Eng,In Press(2012))。生
枝动胶菌(Z.ramigera)酶是NADPH-依赖性的并且也接受3-氧代丙酰-CoA作为底
物(Ploux等人,Eur.J Biochem.174:177-182(1988))。另外的基因包括脱氮副球菌
(Paracoccus denitrificans)中的phaB、克鲁维氏梭菌(Clostridium kluyveri)中
的Hbd1(C-末端结构域)和Hbd2(N-末端结构域)(Hillmer和Gottschalk,Biochim.
Biophys.Acta 3334:12-23(1974))和牛(Bos taurus)中的HSD17B10(Wakil等人,J Biol.
Chem.207:631-638(1954))。这种来自脱氮副球菌的酶已在大肠杆菌中进行了功能性表
达和表征(Yabutani等人,FEMS Microbiol Lett.133:85-90(1995))。许多相似的酶已
在梭菌属(Clostridia)的其它菌种和在瑟杜生金属球菌(Metallosphaera sedula)中
被发现(Berg等人,Science.318:1782-1786(2007))。这种来自热带假丝酵母(Candida
tropicalis)的酶是过氧化物酶体脂肪酸β-氧化多功能酶类型2(MFE-2)的组分。这
种蛋白质的脱氢酶B结构域对乙酰乙酰-CoA具有催化活性。该结构域已在大肠杆菌中
进行了功能性表达，其晶体结构是可获得的，并且催化机制十分清楚明白(Ylianttila
等人,Biochem Biophys Res Commun 324:25-30(2004)；Ylianttila等人,J Mol Biol
358:1286-1295(2006))。接受较长酰基-CoA底物的3-羟基酰基-CoA脱氢酶(例如
EC 1.1.1.35)通常参与β-氧化。一个实例是牛中的HSD17B10(Wakil等人,J Biol.
Chem.207:631-638(1954))。猪肝脏酶优先对短链和中链酰基-CoA底物具有活性，而心脏
酶选择性较低(He等人,Biochim Biophys Acta 1392:119-26(1998))。酿酒酵母酶FOX2
在β-降解途径中有活性并且也具有烯酰-CoA水合酶活性(Hiltunen等人,J Biol Chem
267:6646-6653(1992))。
[0363]蛋白质 Genbank ID GI编号 生物体
fadB P21177.2 119811 大肠杆菌
fadJ P77399.1 3334437 大肠杆菌
paaH NP_415913.1 16129356 大肠杆菌
Hbd2 EDK34807.1 146348271 克鲁维氏梭菌
Hbd1 EDK32512.1 146345976 克鲁维氏梭菌
phaC NP_745425.1 26990000 恶臭假单胞菌
paaC ABF82235.1 106636095 荧光假单胞菌
HSD17B10 O02691.3 3183024 牛
phbB P23238.1 130017 生枝动胶菌
phaB YP_353825.1 77464321 类球红细菌
paaH1 CAJ91433.1 113525088 富养罗尔斯通氏菌
phaB BAA08358 675524 脱氮副球菌
Hbd NP_349314.1 15895965 丙酮丁醇梭菌
Hbd AAM14586.1 20162442 拜氏梭菌
Msed_1423 YP_001191505 146304189 瑟杜生金属球菌
Msed_0399 YP_001190500 146303184 瑟杜生金属球菌
Msed_0389 YP_001190490 146303174 瑟杜生金属球菌
Msed_1993 YP_001192057 146304741 瑟杜生金属球菌
Fox2 Q02207 399508 热带假丝酵母
HSD17B10 O02691.3 3183024 牛
HADH NP_999496.1 47523722 牛
3HCDH AAO72312.1 29293591 纤细裸藻
FOX2 NP_012934.1 6322861 酿酒酵母
[0364] 所选羟基酰基-CoA脱氢酶的链长特异性如下所示。定向进化可提高酶对较长链底物的选择性。例如，Machado及合作者开发了一种选择平台用于定向进化有利于较长酰
基-CoA底物的链延长酶。此研究小组使富养罗尔斯通氏菌的paaH1进化以达成对3-氧
代-己酰-CoA具有改进的活性(Machado等人,Met Eng,In Press(2012))。
[0365]链长 基因 生物体
C4 hbd 丙酮丁醇梭菌
C5 phbB 生枝动胶菌
C4-C6 paaH1 富养罗尔斯通氏菌
[0366]链长 基因 生物体
C4-C10 HADH 野猪
C4-C18 fadB 大肠杆菌
[0367] 步骤C. 3-羟基酰基-CoA脱水酶
[0368] 3-羟基酰 基-CoA脱水 酶(例如EC 4.2.1.17，也称为 烯酰-CoA水 合酶)催化一系列3-羟基酰基-CoA底物的脱水(Roberts等人,Arch.Microbiol
117:99-108(1978)；Agnihotri 等 人 ,Bioorg.Med.Chem.11:9-20(2003)；Conrad 等
人,J Bacteriol.118:103-111(1974))并且可用于将3-羟基酰基-CoA转变成烯
酰-CoA(图1C和图6C)。恶臭假单胞菌的ech基因产物催化3-羟基丁酰-CoA转变成
巴豆酰-CoA(Roberts等人,Arch.Microbiol 117:99-108(1978))。这种转化也由丙酮
丁醇梭菌的crt基因产物、克鲁维氏梭菌(C.kluyveri)的crt1基因产物和其它梭菌
(clostridial)生物体催化(Atsumi等人,Metab Eng 10:305-311(2008)；Boynton等
人,J Bacteriol.178:3015-3024(1996)；Hillmer等人,FEBS Lett.21:351-354(1972))。
另外的烯酰-CoA水合酶候选者是恶臭假单胞菌的phaA和phaB，和来自荧光假单胞
菌 (P.fluorescens) 的 paaA 和 paaB(Olivera 等 人 ,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A
95:6419-6424(1998))。预 测在 沼泽 红假 单胞菌 (Rhodopseudomonas palustris)
中pimF的基因产物编码参与庚二酰-CoA降解的烯酰-CoA水合酶(Harrison等
人,Microbiology 151:727-736(2005))。最后，多种大肠杆菌基因已显示证明烯酰-CoA
水合酶功能性，包括maoC(Park等人,J Bacteriol.185:5391-5397(2003))、paaF(Ismail
等 人 ,Eur.J Biochem.270:3047-3054(2003)；Park 等 人 ,Appl.Biochem.Biotechnol
113-116:335-346(2004)；Park 等 人 ,Biotechnol Bioeng 86:681-686(2004)) 和
paaG(Ismail 等 人 ,Eur.J Biochem.270:3047-3054(2003)；Park 和 Lee,Appl.
Biochem.Biotechnol 113-116:335-346(2004)；Park 和 Yup,Biotechnol Bioeng
86:681-686(2004))。酿酒酵母中具有3-羟基酰基-CoA脱水酶活性的酶包括PHS1和FOX2。
[0369]基因 GenBank登录号 GI编号 生物体
ech NP_745498.1 26990073 恶臭假单胞菌
crt NP_349318.1 15895969 丙酮丁醇梭菌
crt1 YP_001393856 153953091 克鲁维氏梭菌
phaA ABF82233.1 26990002 恶臭假单胞菌
phaB ABF82234.1 26990001 恶臭假单胞菌
paaA NP_745427.1 106636093 荧光假单胞菌
paaB NP_745426.1 106636094 荧光假单胞菌
pimF CAE29158.1 39650635 沼泽红假单胞菌
[0370]maoC NP_415905.1 16129348 大肠杆菌
paaF NP_415911.1 16129354 大肠杆菌
paaG NP_415912.1 16129355 大肠杆菌
FOX2 NP_012934.1 6322861 酿酒酵母
PHS1 NP_012438.1 6322364 酿酒酵母
[0371] 参与β-氧化的烯酰-CoA水合酶也可以用于脂肪醇、脂肪醛和脂肪酸生物合成途径。例如，拟南芥的多功能MFP2基因产物表现出选择性针对链长小于或等于
C14的烯酰-CoA还原酶活性(Arent等人,J Biol Chem 285:24066-77(2010))。或
者，fadA和fadB的大肠杆菌基因产物编码参与脂肪酸氧化的多酶复合体，该多酶复
合体表现出烯酰-CoA水合酶活性(Yang等人,Biochemistry 30:6788-6795(1991)；
Yang,J Bacteriol.173:7405-7406(1991)；Nakahigashi 等 人 ,Nucleic Acids
Res.18:4937(1990))。fadI和fadJ基因编码类似的功能并且在厌氧条件下天然表达
(Campbell等人,Mol.Microbiol 47:793-805(2003))。
[0372]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
MFP2 AAD18042.1 4337027 拟南芥
fadA YP_026272.1 49176430 大肠杆菌
fadB NP_418288.1 16131692 大肠杆菌
fadI NP_416844.1 16130275 大肠杆菌
fadJ NP_416843.1 16130274 大肠杆菌
fadR NP_415705.1 16129150 大肠杆菌
[0373] 所选择的3-羟基酰基-CoA脱水酶的链长特异性如下所示。
[0374]链长 基因 生物体
C4-C6 crt 丙酮丁醇梭菌
C4-C7 pimF 沼泽红假单胞菌
C4-C14 MFP2 拟南芥
[0375] 步骤D.烯酰-CoA还原酶
[0376] 烯酰-CoA还原酶(也称为酰基-CoA脱氢酶、反式-2-烯酰-CoA还原酶或酰基-CoA氧化还原酶)催化烯酰-CoA转变成酰基-CoA(图1和图6的步骤D)。示例性的
酰基-CoA脱氢酶或烯酰-CoA还原酶(ECR)酶是大肠杆菌和肠道沙门氏菌的fadE的基因
产物(Iram等人,J Bacteriol 188:599-608(2006))。来自丙酮丁醇梭菌的bcd基因产物
(Atsumi等人,10:305-311(2008)；Boynton等人,J Bacteriol.178:3015-3024(1996))催
化巴豆酰-CoA还原成丁酰-CoA(EC 1.3.99.2)。这种酶在梭菌(Clostridial species)
中参与生成丁酸的乙酰-CoA发酵途径(Jones等人,Microbiol Rev.50:484-524(1986))。
丁酰-CoA还原酶的活性可被表达bcd结合丙酮丁醇梭菌etfAB基因(它编码电子传
递黄素蛋白)的表达来增强。烯酰-CoA还原酶步骤的另外一个候选者是来自纤细裸
藻(E.gracilis)的烯酰-CoA还原酶(EC 1.3.1.44)TER(Hoffmeister等人,J Biol.
Chem 280:4329-4338(2005))。由该序列衍生的并在去除了它的线粒体靶向前导序列之后
得到的构建体在大肠杆菌中进行了克隆，导致产生活性酶。来自原核生物齿垢密螺旋体
(Treponema denticola)的由TDE0597编码的ECR蛋白质的近亲同源物(close homolog)，
也在大肠杆菌中进行了克隆和表达(Tucci等人,FEBS Lett,581:1561-1566(2007))。酸养
互养菌(Syntrophus aciditrophicus)中的六个基因已根据序列同源性鉴定为丙酮丁醇梭
菌bcd基因产物。酸养互养菌(S.aciditrophicus)基因syn_02637和syn_02636与丙酮
丁醇梭菌的etfAB基因携带高度序列同源性，预测它们编码电子传递黄素蛋白的α亚基和
β亚基。
[0377]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
fadE AAC73325.2 87081702 大肠杆菌
fadE YP_005241256.1 379699528 肠道沙门氏菌
bcd NP_349317.1 15895968 丙酮丁醇梭菌
etfA NP_349315.1 15895966 丙酮丁醇梭菌
etfB NP_349316.1 15895967 丙酮丁醇梭菌
TER Q5EU90.1 62287512 纤细裸藻
TER NP_612558.1 19924091 褐家鼠
TDE0597 NP_971211.1 42526113 齿垢密螺旋体
syn_02587 ABC76101 85721158 酸养互养菌
syn_02586 ABC76100 85721157 酸养互养菌
syn_01146 ABC76260 85721317 酸养互养菌
syn_00480 ABC77899 85722956 酸养互养菌
syn_02128 ABC76949 85722006 酸养互养菌
syn_01699 ABC78863 85723920 酸养互养菌
syn_02637 ABC78522.1 85723579 酸养互养菌
syn_02636 ABC78523.1 85723580 酸养互养菌
[0378] 另外的烯酰-CoA还原酶候选酶在降解芳香族化合物的生物体中被发现。沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，苯甲酸降解的一种模型生物体，具有经由庚二
酰-CoA的β-氧化降解庚二酸的酶促能力。pim操纵子中的相邻基因，pimC和pimD，携
带与丙酮丁醇梭菌bcd的序列同源性并预测它们编码含有黄素(flavin)的庚二酰-CoA
脱氢酶(Harrison等人,151:727-736(2005))。固氮大豆共生生物(symbiont)日本慢
生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的基因组也含有pim操纵子，其由与沼泽红假
单胞菌(R.palustris)的pimC和pimD具有高度序列相似性的基因组成(Harrison和
Harwood,Microbiology 151:727-736(2005))。
[0379]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
pimC CAE29155 39650632 沼泽红假单胞菌
pimD CAE29154 39650631 沼泽红假单胞菌
pimC BAC53083 27356102 日本慢生根瘤菌
pimD BAC53082 27356101 日本慢生根瘤菌
[0380] 另外一个候选者是2-甲基-支链烯酰-CoA还原酶(EC 1.3.1.52和EC1.3.99.12)，一种催化空间位阻的反式-烯酰-CoA底物还原的酶。该酶参与线虫猪蛔
虫(Ascaris suum)中的支链脂肪酸合成并且能够还原各种各样的直链和支链底物，包括
2-甲基戊酰-CoA、2-甲基丁酰-CoA、2-甲基戊酰-CoA、辛酰-CoA和戊酰-CoA(Duran等
人,268:22391-22396(1993))。该酶中由基因acad1和acad编码的两个同工酶(isoform)
已进行了表征。
[0381]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
acad1 AAC48316.1 2407655 猪蛔虫
acad AAA16096.1 347404 猪蛔虫
[0382] 在纤细裸藻中至少存在三种线粒体烯酰-CoA还原酶并且都可应用于本发明。纤细裸藻的三种线粒体烯酰-CoA还原酶(ECR1-3)表现出不同的链长优先性(Inui
等人,European Journal of Biochemistry 142:121-126(1984))，其对于指示所需
脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产物的链长特别有用。EST's ELL00002199、ELL00002335和
ELL00002648(它们全都注解为线粒体反式-2-烯酰-CoA还原酶)可用于通过本领域已知
的方法将这些另外的烯酰-CoA还原酶分离出来。来自大鼠肝脏微粒体的两种ECR酶也表
现出不同的底物特异性(Nagi等人,Arch Biochem Biophys 226:50-64(1983))。这些酶的
序列迄今尚未鉴定。耻垢分枝杆菌烯酰-CoA还原酶接受链长在C10-C16之间的酰基-CoA
底物(Shimakata等人,J Biochem 89:1075-80(1981))。
[0383] 烯酰-CoA还原酶及其链长特异性见下表。
[0384]链长 基因 生物体
C4-C6 ECR1 纤细裸藻
C6-C8 ECR3 纤细裸藻
[0385]链长 基因 生物体
C8-10 ECR2 纤细裸藻
C8-C16 长链ECR 褐家鼠
C10-C16 ECR 耻垢分枝杆菌
C2-C18 fadE 肠道沙门氏菌
[0386] 步骤E.酰基-CoA还原酶(醛形成)
[0387] 酰基-CoA还原成脂肪醇由表现出酰基-CoA还原酶和醇脱氢酶活性的单种酶或一对酶催化。将酰基-CoA还原成其相应的醛的酰基-CoA脱氢酶包括脂肪酰-CoA还原酶(EC
1.2.1.42,1.2.1.50)、琥珀酰-CoA还原酶(EC 1.2.1.76)、乙酰-CoA还原酶、丁酰-CoA还
原酶和丙酰-CoA还原酶(EC 1.2.1.3)。经证明对酰基-CoA、3-羟基酰基-CoA和3-氧代
酰基-CoA底物具有活性的形成醛的酰基-CoA还原酶在文献中是已知的。若干酰基-CoA
还原酶对3-羟基酰基-CoA底物具有活性。例如，一些来自梭菌属(Clostridial)生物体
的丁酰-CoA还原酶对3-羟基丁酰-CoA具有活性，而来自罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)的丙
酰-CoA还原酶对3-羟基丙酰-CoA具有活性。将3-氧代酰基-CoA底物转变成它们的相
应醛的酶是丙二酰-CoA还原酶。在这一类别中证明对烯酰-CoA底物具有活性的酶迄今尚
未鉴定。对特定底物的特异性可采用本领域已知的进化或酶工程方法来完善。
[0388] 示 例 性 的 脂 肪 酰-CoA还 原 酶 由 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 (Acinetobactercalcoaceticus)(Reiser,Journal of Bacteriology 179:2969-2975(1997))
和 不 动 杆 菌 M-1(Acinetobacter sp.M-1)(Ishige 等 人 ,Appl.Environ.
Microbiol.68:1192-1195(2002))的acr1编码。来自结核分枝杆菌的两种基因产物接受长
度C16-C18的较长链脂肪酰-CoA底物(Harminder Singh,U.Central Florida(2007))。又
一种脂肪酰-CoA还原酶是明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)的LuxC(Lee等
人,Biochim Biohys Acta 1388:215-22(1997))。具有琥珀酰-CoA还原酶活性的酶由克鲁
维氏梭菌(Clostridium kluyveri)的sucD(Sohling,J.Bacteriol.178:871-880(1996))
和 牙 龈 卟 啉 单 胞 菌 (P.gingivalis) 的 sucD(Takahashi,J.Bacteriol
182:4704-4710(2000))编码。另外的琥珀酰-CoA还原酶参与了嗜热古细菌(thermophilic
archaea)包 括 瑟 杜 生 金 属 球 菌(Metallosphaera sedula)(Berg 等 人 ,Science
318:1782-1786(2007))和嗜中性热变形菌(Thermoproteus neutrophilus)(Ramos-Vera
等人,J Bacteriol,191:4286-4297(2009))的3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环。瑟杜生
金属球菌(M.sedula)酶，由Msed_0709编码，是严格地依赖NADPH的并且也具有丙二
酰-CoA还原酶活性。嗜中性热变形菌(T.neutrophilus)酶对NADPH和NADH二者均具有
活性。在假单胞菌(Pseudomonas sp)中，由bphG编码的酶—酰基化乙醛脱氢酶是又一种
乙醛脱氢酶，已经证明该酶将乙醛、丙醛、丁醛、异丁醛和甲醛氧化和酰化(Powlowski,J.
Bacteriol.175:377-385(1993))。除将乙酰-CoA还原成乙醇以外，由肠系膜样明串珠菌
(Leuconostoc mesenteroides)中的adhE编码的酶已显示将支链化合物异丁醛氧化成异
丁酰-CoA(Kazahaya,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972)；和Koo等人,Biotechnol
Lett.27:505-510(2005))。在产溶剂生物体(solventogenic organism)例如糖乙酸多丁
醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)中，丁醛脱氢酶催化类似的反应，即
使丁酰-CoA转变成丁醛(Kosaka等人,Biosci Biotechnol Biochem.,71:58-68(2007))。
示例性的丙酰-CoA还原酶包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)LT2的
pduP(Leal,Arch.Microbiol.180:353-361(2003))和来自大肠杆菌的eutE(Skraly,WO
Patent No.2004/024876)。鼠伤寒沙门氏菌LT2的丙酰-CoA还原酶，它天然地将丙酰-CoA
转变成丙醛，也催化5-羟基戊酰-CoA还原成5-羟基戊醛(WO 2010/068953A2)。罗伊氏乳
杆菌(Lactobacillus reuteri)的丙醛脱氢酶PduP具有宽的底物范围，包括丁醛、戊醛和
3-羟基丙醛(Luo等人,Appl Microbiol Biotech,89:697-703(2011)。另外，一些酰基-ACP
还原酶例如细长聚球藻PCC7942的orf1594基因产物也表现出形成醛的酰基-CoA还原酶
活性(Schirmer等人,Science,329:559-62(2010))。酰基-ACP还原酶和同源物在实施例
IX中有进一步详细描述。
[0389]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
acr1 YP_047869.1 50086359 醋酸钙不动杆菌
acr1 AAC45217 1684886 贝氏不动杆菌
acr1 BAB85476.1 18857901 不动杆菌菌株M-1
Rv1543 NP_216059.1 15608681 结核分枝杆菌
Rv3391 NP_217908.1 15610527 结核分枝杆菌
LuxC AAT00788.1 46561111 明亮发光杆菌
Msed_0709 YP_001190808.1 146303492 瑟杜生金属球菌
Tneu_0421 ACB39369.1 170934108 嗜中性热变形菌
sucD P38947.1 172046062 克鲁维氏梭菌
sucD NP_904963.1 34540484 牙龈卟啉单胞菌
bphG BAA03892.1 425213 假单胞菌
adhE AAV66076.1 55818563 肠系膜样明串珠菌
bld AAP42563.1 31075383 糖乙酸多丁醇梭菌
pduP NP_460996 16765381 鼠伤寒沙门氏菌LT2
eutE NP_416950 16130380 大肠杆菌
[0390]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
pduP CCC03595.1 337728491 罗伊氏乳杆菌
[0391] 将酰基-CoA转变成它的相应醛的另外一种酶类型是丙二酰-CoA还原酶，丙二酰-CoA还原酶将丙二酰-CoA转化成丙二酸半醛。丙二酰-CoA还原酶是嗜热嗜酸古细菌
(thermoacidophilic archaeal bacteria)中经由3-羟基丙酸循环的自养生物的碳固定
(autotrophic carbon fixation)的一种关键酶(Berg,Science 318:1782-1786(2007)；
和Thauer,Science 318:1732-1733(2007))。该酶利用NADPH作为辅因子并且已在金属
球菌属(Metallosphaera)和硫化叶菌(Sulfolobus sp.)中进行了表征(Alber等人,J.
Bacteriol.188:8551-8559(2006)；和Hugler,J.Bacteriol.184:2404-2410(2002))。 该
酶在瑟杜生金属球菌(Metallosphaera sedula)中由Msed_0709编码(Alber等人,J.
Bacteriol.188:8551-8559(2006)；和Berg,Science 318:1782-1786(2007))。 将 来 自
托氏硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)的编码丙二酰-CoA还原酶的基因在大肠杆菌
(E.coli)中进行了克隆和异源性表达(Alber等人,J.Bacteriol 188:8551-8559(2006)。
该酶也已显示催化将甲基丙二酰-CoA转变成它的相应醛(WO2007141208(2007))。虽
然这些酶的醛脱氢酶功能性类似于来自橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的
双功能脱氢酶，但是有很小的序列相似性。两种候选的丙二酰-CoA还原酶与天冬氨
酸-半醛脱氢酶(一种催化天冬氨酰-4-磷酸还原成天冬氨酸半醛并且使其同时脱磷酸
的酶)具有高度序列相似性，另外的候选基因可以在其它生物体(包括硫磺矿硫化叶菌
(Sulfolobus solfataricus)和嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius))中通过
与蛋白质的序列同源性而被发现并且在下文列出。针对CoA-酰基化醛脱氢酶的又一个
候选者是来自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的ald基因(Toth,Appl.Environ.
Microbiol.65:4973-4980(1999)。据报道，该酶使乙酰-CoA和丁酰-CoA还原成它们的相
应醛。这个基因与编码鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(E.coli)
的乙醛脱氢酶的eutE非常类似(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)。
[0392]基因 GenBank ID GI编号 生物体
Msed_0709 YP_001190808.1 146303492 瑟杜生金属球菌
mcr NP_378167.1 15922498 托氏硫化叶菌
asd-2 NP_343563.1 15898958 硫磺矿硫化叶菌
Saci_2370 YP_256941.1 70608071 嗜酸热硫化叶菌
Ald AAT66436 49473535 拜氏梭菌
eutE AAA80209 687645 鼠伤寒沙门氏菌
[0393]基因 GenBank ID GI编号 生物体
eutE NP_416950 16130380 大肠杆菌
[0394] 所选择的形成醛的酰基-CoA还原酶的链长特异性范围见下表。
[0395]链长 基因 生物体
C2-C4 bphG 假单胞菌
C4 Bld 糖乙酸多丁醇梭菌
C12-C20 ACR 醋酸钙不动杆菌
C14-C18 Acr1 不动杆菌菌株M-1
C16-C18 Rv1543,Rv3391 结核分枝杆菌
[0396] 步骤G.酰基-CoA还原酶(醇形成)
[0397] 双功能形成醇的酰基-CoA还原酶催化图1和图6的步骤G(即步骤E和F)。具有这种活性的酶包括大肠杆菌的adhE(Kessler等人,FEBS.Lett.281:59-63(1991)))和丙
酮丁醇梭菌的adhE2(Fontaine等人,J.Bacteriol.184:821-830(2002)))。大肠杆菌酶对
C2底物有活性，而丙酮丁醇梭菌酶具有跨越C2-C8的宽底物范围(Dekishima等人,J Am
Chem Soc 133:11399-11401(2011))。由bdh I和bdh II编码的丙酮丁醇梭菌酶(Walter
等人,J.Bacteriol.174:7149-7158(1992))将乙酰-CoA和丁酰-CoA分别还原成乙醇和丁
醇。来自肠系膜样明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的adhE基因产物对乙酰-CoA
和异丁酰-CoA有活性(Kazahaya等人,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972)；Koo等
人,Biotechnol Lett,27:505-510(2005))。其它生物体包括卡氏玫瑰弯菌(Roseiflexus
castenholzii)、赤杆菌(Erythrobacter sp.)NAP1和海洋γ变型杆菌(marine gamma
proteobacterium)HTCC2080中的候选酶可以通过序列相似性进行推断。较长链酰基-CoA
分子可以通过例如编码醇-形成脂肪酰基-CoA还原酶的霍霍巴(Simmondsia chinensis)
FAR等酶被还原成它们的相应醇。它在大肠杆菌中的过量表达导致FAR活性和C16-C18
脂肪醇的累积(Metz等人,Plant Physiol,122:635-644(2000))。拟南芥中的FAR酶包
括At3g11980和At3g44560的基因产物(Doan等人,J Plant Physiol 166(2006))。双
功能原核FAR酶在水油海杆菌VT8(Hofvander等人,FEBS Lett 3538-43(2011))、栖藻海
杆菌(Marinobacter algicola)和海洋杆菌属(Oceanobacter)菌株RED65(美国专利申
请20110000125)中被发现。其它合适的酶包括来自家蚕(Bombyx mori)的bfar、来自
小家鼠的mfar1和mfar2；来自小家鼠的mfar2；来自不动杆菌M1的acrM1；和来自智人
(H.sapiens)的hfar。
[0398]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
adhE NP_415757.1 16129202 大肠杆菌
adhE2 AAK09379.1 12958626 丙酮丁醇梭菌
bdh I NP_349892.1 15896543 丙酮丁醇梭菌
bdh II NP_349891.1 15896542 丙酮丁醇梭菌
adhE AAV66076.1 55818563 肠系膜样明串珠菌
mcr AAS20429.1 42561982 橙色绿屈挠菌
Rcas_2929 YP_001433009.1 156742880 卡氏玫瑰弯菌
NAP1_02720 ZP_01039179.1 85708113 赤杆菌NAP1
MGP2080_00535 ZP_01626393.1 119504313 海洋γ变型杆菌HTCC2080
FAR AAD38039.1 5020215 霍霍巴
At3g11980 NP_191229.1 15228993 拟南芥
At3g44560 NP_190042.2 145339120 拟南芥
FAR YP_959486.1 120555135 水油海杆菌
bfar Q8R079 81901336 家蚕
[0399] 所选择的形成醇的酰基-CoA还原酶的链长特异性范围见下表。
[0400]链长 基因 生物体
C2 adhE 大肠杆菌
C2-C8 adhe2 丙酮丁醇梭菌
C14-C16 At3g11980 拟南芥
C16 At3g44560 拟南芥
C16-C18 FAR 霍霍巴
C14-C18 FAR 水油海杆菌
[0401] 步骤F.脂肪醛还原酶
[0402] 编码催化醛转变成醇的酶(即，醇脱氢酶或等同于醛还原酶)的示例性基 因 包 括编 码C2-C14的 中 链醇 脱 氢 酶的 alrA(Tani等人 ,Appl.Environ.
Microbiol.66:5231-5235(2000))、来自 大 肠 杆 菌 的yqhD和fucO(Sulzenbacher 等
人,342:489-502(2004))和 来 自 丙 酮 丁 醇 梭 菌 (C.acetobutylicum)的bdh I 和
bdh II(它使丁醛转变成丁醇)(Walter等人,J Bacteriol 174:7149-7158(1992))。
alrA基因产物显示对长于C14的醛无活性并且有利于还原方向(Tani等人,同
上)。YqhD使用NADPH作为辅因子催化多种醛的还原，其中链长度比C(3)长的优
先 (Sulzenbacher 等 人 ,J Mol Biol 342:489-502(2004)；Perez 等 人 ,J Biol.
Chem.283:7346-7353(2008))。已经证明来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的
adhA基因产物对包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛和丙烯醛在内的多种醛具有活性(Kinoshita
等人,Appl Microbiol Biotechnol 22:249-254(1985))。另外的候选醛还原酶由糖乙酸
多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)中的bdh和拜氏梭菌(C.Beijerinckii)
中的Cbei_1722、Cbei_2181和Cbei_2421编码。来自雷弗森菌S749的醇脱氢酶显示
对长度C6-C7的中等链长底物有最大活性(Inoue等人,AEM 71:3633-3641(2005)。恶
臭假单胞菌的adh基因产物对长度C3-C10的底物有活性(Nagashima等人,J Ferment
Bioeng 82:328-33(1996))。嗜热脱氮土芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)
的醇脱氢酶ADH1和ADH2将长达C30链长的醇氧化(Liu等人,Physiol Biochem
155:2078-85(2009))。
[0403]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
alrA BAB12273.1 9967138 不动杆菌菌株M-1
ADH2 NP_014032.1 6323961 酿酒酵母
yqhD NP_417484.1 16130909 大肠杆菌
fucO NP_417279.1 16130706 大肠杆菌
bdh I NP_349892.1 15896543 丙酮丁醇梭菌
bdh II NP_349891.1 15896542 丙酮丁醇梭菌
adhA YP_162971.1 56552132 运动发酵单胞菌
bdh BAF45463.1 124221917 糖乙酸多丁醇梭菌
Cbei_1722 YP_001308850 150016596 拜氏梭菌
Cbei_2181 YP_001309304 150017050 拜氏梭菌
Cbei_2421 YP_001309535 150017281 拜氏梭菌
lsadh BAD99642.1 67625613 雷弗森菌S749
adh 恶臭假单胞菌
[0404] 天然醇脱氢酶也将醛底物转变成醇产物。迄今为止，ADHI-ADHVII等七种醇脱氢酶在酿酒酵母中已有报道(de Smidt等人,FEMS Yeast Res 8:967-78(2008))。
ADH1(GI:1419926)是负责在细胞溶质中在厌氧条件下将乙醛还原成乙醇的关键酶。在乳酸
克鲁维酵母中，两种NAD-依赖性细胞溶质醇脱氢酶进行了鉴定和表征。这些基因也显示对
其它脂族醇有活性。基因ADH1(GI:113358)和ADHII(GI:51704293)优先在葡萄糖生长细
胞中表达(Bozzi等人,Biochim Biophys Acta 1339:133-142(1997))。细胞溶质醇脱氢
酶由白色假丝酵母中的ADH1(GI:608690)、粟酒裂殖酵母中的ADH1(GI:3810864)、解脂耶
氏酵母中的ADH1(GI:5802617)、树干毕赤酵母或树干谢尔壶菌中的ADH1(GI:2114038)和
ADHII(GI:2143328)编码(Passoth等人,酵母14:1311-23(1998))。候选醇脱氢酶见下表。
[0405]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
SADH BAA24528.1 2815409 近平滑假丝酵母
[0406]ADH1 NP_014555.1 6324486 酿酒酵母s288c
ADH2 NP_014032.1 6323961 酿酒酵母s288c
ADH3 NP_013800.1 6323729 酿酒酵母s288c
ADH4 NP_011258.2 269970305 酿酒酵母s288c
ADH5(SFA1) NP_010113.1 6320033 酿酒酵母s288c
ADH6 NP_014051.1 6323980 酿酒酵母s288c
ADH7 NP_010030.1 6319949 酿酒酵母s288c
adhP CAA44614.1 2810 乳酸克鲁维酵母
ADH1 P20369.1 113358 乳酸克鲁维酵母
ADH2 CAA45739.1 2833 乳酸克鲁维酵母
ADH3 P49384.2 51704294 乳酸克鲁维酵母
ADH1 YP_001126968.1 138896515 嗜热脱氮土芽孢杆菌
ADH2 YP_001125863.1 138895410 嗜热脱氮土芽孢杆菌
[0407] 所选醇脱氢酶的底物特异性范围见下表。
[0408]链长 基因 生物体
C6-C7 lsadh 雷弗森菌S749
C2-C8 yqhD 大肠杆菌
C3-C10 Adh 恶臭假单胞菌
C2-C14 alrA 不动杆菌菌株M-1
C2-C30 ADH1 嗜热脱氮土芽孢杆菌
[0409] 步骤O.延长酶
[0410] 延长酶(ELO)酶利用丙二酰-CoA将C2单元添加到生长中的酰基-CoA链上。这个过程也涉及脱羧并因此基本上不可逆。已知布氏锥虫(一种真核人类寄生虫)使用延
长酶系统产生长链脂肪酸。该过程由丁酰-CoA引发。具体地说，ELO系统使生长脂肪酸链
酯化成CoA中间体而不是ACP中间体，如细菌和其它微生物对应物(counterparts)(Lee等
人,Cell 126,691-699,2006；Cronan,Cell,126,2006)。这与典型细菌脂肪酸延长形成对
比，典型细菌脂肪酸延长在自丙二酰-ACP形成乙酰乙酰基酰基-ACP之后引发。迄今为止，
在布氏锥虫(T.brucei)中发现了与其动物对应物同源的四种ELO(由ELO1–4编码)(Lee
等人,Nature Reviews Microbiology,第5卷,287-297,2007)。ELO1–3一起造成至多链
长C18的饱和脂肪酸的合成。ELO1将C4转变成C10，ELO2将链长自C10延长至肉豆蔻酸
(C14)，ELO3将肉豆蔻酸延长至C18。在ELO特异性方面存在一些重叠；例如，ELO1可将C10
引物延长至C12，尽管活性低。ELO4是对多不饱和脂肪酸(PUFAs)有特异性的ELO的一个
实例。它将花生四烯酸(C20:4)延长两个碳原子。几种另外的ELO酶可通过序列同源性发
现(参见Lee等人,Nature Reviews Microbiology,第5卷,287-297,2007)。
[0411] 延长酶在包括线粒体、内质网、脂蛋白体和过氧物酶体在内的几种区室中被发现。例如，一些酵母(例如酿酒酵母)能够通过接受外源或内源酰基-CoA底物的线粒体延长酶
合成链长C16和C16以上的长链脂肪酸(Bessoule等人,FEBS Lett 214:158-162(1987))。
这个系统需要ATP以达成活性。内质网也具有延长酶系统以自不同长度的酰基-CoA底物
合成极长链脂肪酸(C18+)(Kohlwein等人,Mol Cell Biol 21:109-25(2001))。参与该系
统的基因包括TSC13、ELO2和ELO3。ELO1催化C12酰基-CoA延长至C16-C18脂肪酸。
[0412]蛋白质 登录# GI编号 生物体
ELO2 NP_009963.1 6319882 酿酒酵母
ELO3 NP_013476.3 398366027 酿酒酵母
TSC13 NP_010269.1 6320189 酿酒酵母
ELO1 NP_012339.1 6322265 酿酒酵母
ELO1 AAX70671.1 62176566 布氏锥虫
ELO2 AAX70672.1 62176567 布氏锥虫
ELO3 AAX70673.1 62176568 布氏锥虫
ELO4 AAX70768.1 62176665 布氏锥虫
ELO4 AAX69821.1 62175690 布氏锥虫
[0413] 本领域技术人员也可通过使用来自可获得来源的已知序列克隆来获得编码任何或所有丙二酰-CoA非依赖性FAS途径或酰基-还原途径酶的核酸。例如，丙二酰-CoA非依
赖性FAS途径的任何或所有编码核酸可以使用本领域众所周知的方法从纤细裸藻容易获
得，因为该途径在这种生物体中充分表征。纤细裸藻编码核酸可以使用已知序列的探针从
例如纤细裸藻cDNA文库中分离。探针可以经设计具有全部或部分来自以下EST序列的DNA
序列，来自公共可获得的序列数据库TBestDB(http://tbestdb.bcm.umontreal.ca)。可以
将由这个过程产生的核酸插入到适当的表达载体中并转化到大肠杆菌或其它微生物中以
产生本发明的产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生物体。
[0414] 硫解酶(图1A)：ELL00002550，ELL00002493，ELL00000789
[0415] 3-羟基酰基-CoA脱氢酶(图1B)：ELL00000206，ELL00002419，ELL00006286，ELL00006656
[0416] 烯 酰 -CoA 水 合 酶 ( 图 1C)：ELL00005926，ELL00001952，ELL00002235，ELL00006206
[0417] 烯酰-CoA还原酶(图1D)：ELL00002199，ELL00002335，ELL00002648
[0418] 酰基-CoA还原酶(图1E；1E/F)：ELL00002572，ELL00002581，ELL00000108
[0419] 或者，以上EST序列可用于通过BLAST检索鉴别GenBank中的同源多肽。所得同源多肽及其相应基因序列提供另外的编码核酸用于转化到大肠杆菌或其它微生物中以产
生本发明的产脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的生物体。下面列举的是适用于本发明的非天然存
在的生物体的示例性同源多肽及其在GenBank中的基因登录号。
[0420] 酮酰基-CoA酰基转移酶(或酮酰基-CoA硫解酶)
[0421]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Dole_2160 YP_001530041 158522171 食油脱硫球菌Hxd3
DalkDRAFT_1939 ZP_02133627 163726110 食烯烃脱硫杆菌AK-01
BSG1_09488 ZP_01860900 149182424 芽孢杆菌种SG-1
[0422] 3-羟基酰基-CoA脱氢酶
[0423]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
AaeL_AAEL002841 XP_001655993 157132312 埃及伊蚊
hadh NP_001011073 58331907 热带爪蟾
hadh NP_001003515 51011113 斑马鱼
[0424] 烯酰-CoA水合酶
[0425]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Tb927.3.4850 XP_844077 72387305 布氏锥虫
Tc00.1047053509701.10 XP_802711 71399112 克氏锥虫菌株CL Brener
PputGB1_3629 YP_001669856 167034625 恶臭假单胞菌GB-1
[0426] 烯酰-CoA还原酶
[0427]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
mecr XP_642118 66816217 盘基网柄菌AX4
NEMVEDRAFT_v1g228294 XP_001639469 156402181 星状海葵
AaeL_AAEL003995 XP_001648220 157104018 埃及伊蚊
[0428] 除了以上示例性的编码核酸以外，也可以将除本发明的MI-FAE循环、MD-FAE和/或终止途径内的核酸以外的核酸导入宿主生物中用于进一步生产脂肪醇、脂肪醛或脂肪
酸。例如，富养罗尔斯通氏菌BktB和PhbB基因催化丁酰-CoA和乙酰-CoA的缩合以形
成β-酮基-己酰-CoA以及β-酮基-己酰-CoA还原成3-羟基-己酰-CoA(Fukui等
人,Biomacromolecules 3:618-624(2002))。为了改进脂肪醇的生产，可以在所关注生产
宿主中表达编码这些特异性酶的外源DNA序列。此外，以上描述的酶可以经受定向进化以
产生这些酶中具有高活性和高底物特异性的改进形式。类似的方法也可以与本发明的脂肪
醇、脂肪醛或脂肪酸生产途径中的任何或所有其它酶促步骤一起使用以例如改进酶促活性
和/或特异性和/或以产生一种或多种预定链长的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸。
[0429] 实施例II
[0430] 自细胞溶质丙酮酸生产细胞溶质乙酰-CoA的途径
[0431] 以下实施例描述了如图2中所示的将细胞溶质丙酮酸和苏氨酸转变成细胞溶质乙酰-CoA的示例性途径。
[0432] 将细胞溶质丙酮酸和苏氨酸转变成细胞溶质乙酰-CoA的途径可使得能够采用来源于乙酰-CoA的细胞溶质脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产途径。用于将细胞溶质丙酮酸转变
成细胞溶质乙酰-CoA的几种途径示于图2。丙酮酸直接转变成乙酰-CoA可以由丙酮酸脱
氢酶、丙酮酸甲酸裂合酶、丙酮酸:NAD(P)氧化还原酶或丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶催
化。如果利用丙酮酸甲酸裂合酶，则甲酸副产物可通过甲酸脱氢酶或甲酸氢裂合酶进一步
转变成CO2。
[0433] 丙酮酸间接转变成乙酰-CoA可通过几个替代路径进行。丙酮酸可以通过丙酮酸脱羧酶转变成乙醛。乙醛然后可以通过酰基化(CoA-依赖性)乙醛脱氢酶转变成乙酰-CoA。
或者，由丙酮酸脱羧酶产生的乙醛可以通过“PDH旁路”途径转变成乙酰-CoA。在这个途径
中，乙醛通过乙醛脱氢酶氧化成乙酸，乙酸然后通过CoA连接酶、合成酶或转移酶转变成乙
酰-CoA。在另一个实施方案中，乙酸中间体通过乙酸激酶转变成乙酰-磷酸，乙酰-磷酸
然后通过磷酸转乙酰酶转变成乙酰-CoA。在又一个实施方案中，丙酮酸通过丙酮酸氧化酶
(乙酰-磷酸形成)直接转变成乙酰-磷酸。丙酮酸转变成乙酸也由乙酸形成丙酮酸氧化
酶催化。
[0434] 细胞溶质乙酰-CoA也可以通过表达天然或异源苏氨酸醛缩酶自苏氨酸合成(图5J)(van Maris等人,AEM 69:2094-9(2003))。苏氨酸醛缩酶将苏氨酸转变成乙醛和甘氨
酸。乙醛产物随后通过以上描述的各种途径转变成乙酰-CoA。
[0435] 下文描述了图2中所示的用于形成乙酰-CoA的酶的候选基因。
[0436] 丙酮酸氧化酶(乙酸形成)(图2A)或丙酮酸:醌氧化还原酶(PQO)可使用泛醌(EC 1.2.5.1)或醌(EC 1.2.2.1)作为电子受体催化丙酮酸氧化脱羧生成乙酸。大肠
杆菌酶PoxB定位于内膜上(Abdel-Hamid等人,Microbiol 147:1483-98(2001))。该酶
具有硫胺焦磷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子(Koland和Gennis,Biochemistry
21:4438-4442(1982))；O'Brien 等 人 ,Biochemistry 16:3105-3109(1977)；O'Brien 和
Gennis,J.Biol.Chem.255:3302-3307(1980))。PoxB与酿酒酵母和运动发酵单胞菌的丙酮
酸脱羧酶具有相似性。谷氨酸棒杆菌的pqo转录物编码醌依赖性和乙酸形成丙酮酸氧化还
原酶(Schreiner等人,J Bacteriol 188:1341-50(2006))。相似的酶可以通过序列同源性
推断。
[0437]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
poxB NP_415392.1 16128839 大肠杆菌
pqo YP_226851.1 62391449 谷氨酸棒杆菌
poxB YP_309835.1 74311416 索氏志贺氏菌
poxB ZP_03065403.1 194433121 痢疾志贺氏菌
[0438] 乙酸酰基化生成乙酰-CoA(图2B)可以由具有乙酰-CoA合成酶、连接酶或转移酶活性的酶催化。可催化这一反应的两种酶是AMP形成乙酰-CoA合成酶或连接酶(EC
6.2.1.1)和ADP形成乙酰-CoA合成酶(EC 6.2.1.13)。AMP形成乙酰-CoA合成酶(ACS)
是将乙酸活化生成乙酰-CoA的主要酶。示例性的ACS酶在大肠杆菌(Brown等人,J.
Gen.Microbiol.102:327-336(1977))、富养罗尔斯通氏菌(Priefert和Steinbuchel,J.
Bacteriol.174:6590-6599(1992))、热自养甲烷热杆菌(Ingram-Smith和Smith,Archaea
2:95-107(2007))、肠道沙门氏菌(Gulick等人,Biochemistry 42:2866-2873(2003))
和酿酒酵母(Jogl和Tong,Biochemistry 43:1425-1431(2004))中被发 现。ADP形
成乙酰-CoA合成酶是一般具有宽的底物范围的可逆酶(Musfeldt和Schonheit,J.
Bacteriol.184:636-644(2002))。ADP形成乙酰-CoA合成酶的两种同工酶在闪烁古生
球菌基因组中由AF1211和AF1983编码(Musfeldt和Schonheit,同上(2002))。来自
死海盐盒菌的酶(注解为琥珀酰-CoA合成酶)也接受乙酸作为底物且该酶的可逆性被
证明(Brasen和Schonheit,Arch.Microbiol.182:277-287(2004))。来自超嗜热泉古生
菌(hyperthermophilic crenarchaeon)需氧热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)的由
PAE3250编码的ACD显示出所有被表征ACD的最宽的底物范围，与乙酸、异丁酰-CoA(优
选的底物)和苯基乙酰-CoA反应(Brasen和Schonheit,同上(2004))。可使用定向进
化或工程改造来对该酶进行修饰以在宿主生物的生理温度下操作。来自闪烁古生球菌
(A.fulgidus)、死海盐盒菌(H.marismortui)和需氧热棒菌(P.aerophilum)的酶已全部在
大肠杆菌中进行了克隆、功能性表达和表征(Brasen和Schonheit,同上(2004)；Musfeldt
和Schonheit,同上(2002))。另外一个候选者是由大肠杆菌中的sucCD编码的琥珀酰-CoA
合成酶(Buck等人,Biochemistry 24:6245-6252(1985))和来自恶臭假单胞菌的酰基-CoA
连接酶(Fernandez-Valverde等人,Appl.Environ.Microbiol.59:1149-1154(1993))。以
上提及的蛋白质如下所示。
[0439]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
acs AAC77039.1 1790505 大肠杆菌
acoE AAA21945.1 141890 富养罗尔斯通氏菌
acs1 ABC87079.1 86169671 热自养甲烷热杆菌
acs1 AAL23099.1 16422835 肠道沙门氏菌
ACS1 Q01574.2 257050994 酿酒酵母
AF1211 NP_070039.1 11498810 闪烁古生球菌
AF1983 NP_070807.1 11499565 闪烁古生球菌
scs YP_135572.1 55377722 死海盐盒菌
PAE3250 NP_560604.1 18313937 好氧火棒菌菌株IM2
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
[0440] 乙酸酰基化生成乙酰-CoA也可以由CoA转移酶催化(图2B)。众多酶使用乙酸作为CoA受体，导致乙酰-CoA的形成。示例性的CoA转移酶是由大肠杆菌atoA(α亚基)
和atoD(β亚基)基因编码的乙酰乙酰-CoA转移酶(Korolev等人,Acta Crystallogr.
D.Biol.Crystallogr.58:2116-2121(2002)；Vanderwinkel 等 人 ,33:902-908(1968))。
这种酶具有宽的底物范围(Sramek等人,Arch Biochem Biophys 171:14-26(1975))并
且已显示将CoA部分自多种支链和直链酰基-CoA底物转移至乙酸，该底物包括异丁酸
(Matthies等人,Appl Environ.Microbiol 58:1435-1439(1992))、戊酸(Vanderwinkel
等 人 ,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968)) 和 丁 酸 (Vanderwinkel 等
人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968))。 相似 的 酶存 在 于谷 氨 酸
棒杆 菌ATCC 13032(Duncan等人,68:5186-5190(2002))、丙酮 丁醇 梭菌(Cary 等
人 ,Appl Environ Microbiol 56:1576-1583(1990)；Wiesenborn 等 人 ,Appl Environ
Microbiol 55:323-329(1989))和糖乙酸多丁醇梭菌(Kosaka等人,Biosci.Biotechnol
Biochem.71:58-68(2007))中。
[0441]基因 GI# 登录号 生物体
atoA 2492994 P76459.1 大肠杆菌
atoD 2492990 P76458.1 大肠杆菌
actA 62391407 YP_226809.1 谷氨酸棒杆菌
cg0592 62389399 YP_224801.1 谷氨酸棒杆菌
ctfA 15004866 NP_149326.1 丙酮丁醇梭菌
ctfB 15004867 NP_149327.1 丙酮丁醇梭菌
ctfA 31075384 AAP42564.1 糖乙酸多丁醇梭菌
ctfB 31075385 AAP42565.1 糖乙酸多丁醇梭菌
[0442] 乙酸激酶(EC 2.7.2.1)可催化乙酸可逆性ATP-依赖性磷酸化生成乙酰磷酸(图2C)。示例性的乙酸激酶已经在包括大肠杆菌、丙酮丁醇梭菌和嗜热甲烷八叠球菌在
内的许多生物体中表征(Ingram-Smith等人,J.Bacteriol.187:2386-2394(2005)；Fox
和 Roseman,J.Biol.Chem.261:13487-13497(1986)；Winzer 等 人 ,Microbioloy 143(Pt
10):3279-3286(1997))。乙酸激酶活性也在大肠杆菌purT的基因产物中得到了证明
(Marolewski等人,Biochemistry 33:2531-2537(1994)。一些丁酸激酶(EC 2.7.2.7)，
例如来自丙酮丁醇梭菌的buk1和buk2，也接受乙酸作为底物(Hartmanis,M.G.,J.Biol.
Chem.262:617-621(1987))。同源物存在于包括肠道沙门氏菌和莱茵衣藻在内的若干其它
生物体中。
[0443]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
ackA NP_416799.1 16130231 大肠杆菌
Ack AAB18301.1 1491790 丙酮丁醇梭菌
Ack AAA72042.1 349834 嗜热甲烷八叠球菌
purT AAC74919.1 1788155 大肠杆菌
buk1 NP_349675 15896326 丙酮丁醇梭菌
buk2 Q97II1 20137415 丙酮丁醇梭菌
ackA NP_461279.1 16765664 鼠伤寒沙门氏菌
ACK1 XP_001694505.1 159472745 莱茵衣藻
ACK2 XP_001691682.1 159466992 莱茵衣藻
[0444] 自乙酰-磷酸形成乙酰-CoA可以由磷酸转乙酰酶(EC 2.3.1.8)催化(图2D)。来自大肠杆菌的pta基因编码将乙酰-CoA可逆地转变成乙酰-磷酸的
酶(Suzuki,T.,Biochim.Biophys.Acta 191:559-569(969))。另外的乙酰基转移酶
已经 在枯 草芽 孢 杆菌(Rado和 Hoch,Biochim.Biophys.Acta 321:114-125(1973)、
克鲁维氏梭菌(Stadtman,E.,Methods Enzymol.1:5896-599(1955)和海栖热袍 菌
(Thermotoga maritima)(Bock等 人,J.Bacteriol.181:1861-1867(1999)) 中 进 行 了
表征。该反应也可以由一些磷酸转丁酰酶(EC 2.3.1.19)催化，包括来自丙酮丁醇梭
菌的 ptb基 因产 物(Wiesenborn 等人 ,App.Environ.Microbiol.55:317-322(1989)；
Walter等人,Gene 134:107-111(1993))。另外的ptb基因在产丁酸菌L2-50(Louis
等人,J.Bacteriol.186:2099-2106(2004)和 巨 大芽 孢杆 菌(Vazquez等人 ,Curr.
Microbiol.42:345-349(2001)中被发现。大肠杆菌pta基因的同源物存在于包括肠道沙门
氏菌和莱茵衣藻在内的若干其它生物体中。
[0445]
[0446] 丙酮酸脱羧酶(PDC)是醇发酵中的一个关键酶，催化丙酮酸脱羧生成乙醛(图2E)。来自酿酒酵母的PDC1酶已经进行了广泛深入的研究(Killenberg-Jabs等人,Eur.
J.Biochem.268:1698-1704(2001)；Li 等 人 ,Biochemistry.38:10004-10012(1999)；
ter Schure等人,Appl.Environ.Microbiol.64:1303-1307(1998))。其它充分表征的
PDC酶在运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilus)(Siegert等人,Protein Eng Des Sel
18:345-357(2005))、巴斯德醋杆菌(Chandra等人,176:443-451(2001))和乳酸克鲁
维酵母(Krieger等人,269:3256-3263(2002))中被发现。酿酒酵母的PDC1和PDC5
酶受到PDC2的正向转录调节(Hohmann等人,Mol Gen Genet 241:657-66(1993))。
在由热带假丝酵母中的CTRG_03826(GI:255729208)、乳酸克鲁维酵母中的PDC1(GI
No.:1226007)、解脂耶氏酵母中的YALI0D10131g(GI:50550349)、巴斯德毕赤酵母中的
PAS_chr3_0188(GI:254570575)、粟酒裂殖酵母中的丙酮酸脱羧酶(GI:GI:159883897)、
黑 曲 霉 中 的 ANI_1_1024084(GI:145241548)、ANI_1_796114(GI:317034487)、
ANI_1_936024(GI:317026934)和ANI_1_2276014(GI:317025935)编码的蛋白质中也具有
丙酮酸脱羧酶活性。
[0447]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
pdc P06672.1 118391 运动发酵单胞菌
pdc1 P06169 30923172 酿酒酵母
Pdc2 NP_010366.1 6320286 酿酒酵母
Pdc5 NP_013235.1 6323163 酿酒酵母
CTRG_03826 XP_002549529 255729208 热带假丝酵母,
CU329670.1:585597.587312 CAA90807 159883897 粟酒裂殖酵母
YALI0D10131g XP_502647 50550349 解脂耶氏酵母
PAS_chr3_0188 XP_002492397 254570575 巴斯德毕赤酵母
pdc Q8L388 20385191 巴斯德醋杆菌
pdc1 Q12629 52788279 乳酸克鲁维酵母
ANI_1_1024084 XP_001393420 145241548 黑曲霉
ANI_1_796114 XP_001399817 317026934 黑曲霉
ANI_1_936024 XP_001396467 317034487 黑曲霉
ANI_1_2276014 XP_001388598 317025935 黑曲霉
[0448] EC 1.2.1类中的醛脱氢酶催化乙醛氧化成乙酸(图2F)。上文描述了编码这种活性的示例性基因。将乙醛氧化成乙酸也可以由具有乙醛氧化酶活性的醛氧化酶催化。这
样的酶可以将乙醛、水和O2转变成乙酸和过氧化氢。已显示催化这种转化的示例性醛氧化
酶可以在牛和小家鼠中被发现(Garattini等人,Cell Mol Life Sci 65:1019-48(2008)；
Cabre等人,Biochem Soc Trans 15:882-3(1987))。另外的醛氧化酶基因候选者包括由
玉蜀黍的zmAO-1和zmAO-2编码的两种含有黄素和钼的醛氧化酶(Sekimoto等人,J Biol
Chem 272:15280-85(1997))。
[0449]基因 GenBank登录号 GI编号 生物体
zmAO-1 NP_001105308.1 162458742 玉蜀黍
zmAO-2 BAA23227.1 2589164 玉蜀黍
Aox1 O54754.2 20978408 小家鼠
XDH DAA24801.1 296482686 牛
[0450] 丙酮酸氧化酶(乙酰-磷酸形成)可催化丙酮酸、氧和磷酸转变成乙酰-磷酸和过氧化氢(图2G)。这种丙酮酸氧化酶类型是可溶的并且需要辅因子硫胺二磷酸
和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。形成乙酰-磷酸的丙酮酸氧化酶可以在乳酸细菌德氏
乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中
被 发 现(Lorquet等 人,J Bacteriol 186:3749-3759(2004)；Hager 等 人 ,Fed Proc
13:734-38(1954))。植物乳杆菌(L.plantarum)酶的晶体结构已被解析(Muller等
人,(1994))。在血链球菌(Streptococcus sanguinis)和肺炎链球菌(Streptococcus
pneumonia)中，形成乙酰-磷酸的丙酮酸氧化酶由spxB基因编码(Spellerberg等人,Mol
Micro 19:803-13(1996)；Ramos-Montanez等人,Mol Micro 67:729-46(2008))。已显示
SpxR在肺炎链球菌(S.pneumoniae)中正调节spxB的转录(Ramos-Montanez等人,同上)。
血链球菌(S.sanguinis)中的类似调节物通过序列同源性鉴别。过氧化氢酶活性的引入或
修饰可减少过氧化氢产物的累积。
[0451]基因 GenBank登录号 GI编号 生物体
poxB NP_786788.1 28379896 植物乳杆菌
spxB L39074.1 1161269 肺炎链球菌
Spd_0969(spxR) YP_816445.1 116517139 肺炎链球菌
spxB ZP_07887723.1 315612812 血链球菌
spxR ZP_07887944.1GI: 315613033 血链球菌
[0452] 丙酮酸脱氢酶(PDH)复合体催化将丙酮酸转变成乙酰-CoA(图2H)。大肠杆菌PDH复合体由基因aceEF和lpdA编码。酶工程改造成就改进在厌氧条件下大肠杆菌
PDH酶活性(Kim等人,J.Bacteriol.190:3851-3858(2008)；Kim等人,Appl.Environ.
Microbiol.73:1766-1771(2007)；Zhou等人,Biotechnol.Lett.30:335-342(2008))。与
大肠杆菌PDH相反，枯草芽胞杆菌(B.subtilis)复合体在厌氧条件下有活性并且是生长
所需要的(Nakano等人,179:6749-6755(1997))。在甘油上生长期间表征的肺炎克雷伯氏
菌PDH在厌氧条件下也有活性(Menzel等人,56:135-142(1997))。来自牛肾的酶复合体
(Zhou等人,98:14802-14807(2001))和来自棕色固氮菌的E2催化结构域的晶体结构是可
获得的(Mattevi等人,Science.255:1544-1550(1992))。一些哺乳动物PDH酶复合体可
以在替代底物例如2-氧代丁酸上反应。褐家鼠PDH和BCKAD的比较动力学表明BCKAD对
2-氧代丁酸作为底物具有较高活性(Paxton等人,Biochem.J.234:295-303(1986))。酿酒
酵母PDH复合体由结合E1(PDA1,PDB1)、E3(LPD1)和蛋白质X(PDX1)组分的E2(LAT1)核心
组成(Pronk等人,Yeast 12:1607-1633(1996))。酿酒酵母的PDH复合体由涉及PKP1(PDH
激酶I)、PTC5(PDH磷酸酶I)、PKP2和PTC6的E1的磷酸化来调节。这些调节物的修饰也可
以增强PDH活性。脂酰连接酶(大肠杆菌的LplA和酿酒酵母中的AIM22)与PDH在细胞溶
质中的共表达对于激活PDH酶复合体可能是必需的。通过修饰代谢途径或用脂酸进行培养
基补充增加细胞溶质脂酸的供应也可以改进PDH活性。
[0453]基因 登录号 GI编号 生物体
aceE NP_414656.1 16128107 大肠杆菌
aceF NP_414657.1 16128108 大肠杆菌
lpd NP_414658.1 16128109 大肠杆菌
lplA NP_418803.1 16132203 大肠杆菌
pdhA P21881.1 3123238 枯草芽孢杆菌
pdhB P21882.1 129068 枯草芽孢杆菌
pdhC P21883.2 129054 枯草芽孢杆菌
pdhD P21880.1 118672 枯草芽孢杆菌
aceE YP_001333808.1 152968699 肺炎克雷伯氏菌
aceF YP_001333809.1 152968700 肺炎克雷伯氏菌
lpdA YP_001333810.1 152968701 肺炎克雷伯氏菌
Pdha1 NP_001004072.2 124430510 褐家鼠
Pdha2 NP_446446.1 16758900 褐家鼠
Dlat NP_112287.1 78365255 褐家鼠
Dld NP_955417.1 40786469 褐家鼠
LAT1 NP_014328 6324258 酿酒酵母
PDA1 NP_011105 37362644 酿酒酵母
PDB1 NP_009780 6319698 酿酒酵母
LPD1 NP_116635 14318501 酿酒酵母
PDX1 NP_011709 6321632 酿酒酵母
AIM22 NP_012489.2 83578101 酿酒酵母
[0454] 作为以上描述的大型多酶PDH复合体的替代物，一些生物体利用2-酮酸氧化还原酶家族(OFOR)中的酶催化2-酮-酸的酰基化氧化脱羧。与PDH复合体不一
样，PFOR酶含有铁-硫聚簇，利用不同的辅因子和使用铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白
作为电子受体代替NAD(P)H。丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)可催化丙酮酸
的氧化以形成乙酰-CoA(图2H)。来自非洲脱硫弧菌(Desulfovibrio africanus)
的PFOR已在大肠杆菌中进行了克隆和表达，导致在氧存在下稳定数天的活性重组
酶(Pieulle等人,J Bacteriol.179:5684-5692(1997))。氧稳定性在PFOR中相对罕
见，且相信由非洲脱硫弧菌(D.africanus)酶的多肽链中的60个残基延伸所赋予。热
醋穆尔氏菌(M.thermoacetica)PFOR也进行了充分表征(Menon等人,Biochemistry
36:8484-8494(1997))并且甚至显示在丙酮酸合成的方向上在自养生长期间具有高活
性(Furdui等人,J Biol Chem.275:28494-28499(2000))。此外，大肠杆菌具有未经
表征的开放读框(open reading frame)ydbK，其编码与热醋穆尔氏菌PFOR有51％同
一性的蛋白质。大肠杆菌中丙酮酸氧化还原酶活性的证据已有描述(Blaschkowski等
人,Eur.J Biochem.123:563-569(1982))。几种另外的PFOR酶描述于Ragsdale,Chem.
Rev.103:2333-2346(2003)。最后，黄素氧还蛋白还原酶(例如，来自幽门螺杆菌
(Helicobacter pylori)或空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的fqrB(St Maurice等
人,J.Bacteriol.189:4764-4773(2007)))或Rnf型蛋白(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.
Sci.U S.A.105:2128-2133(2008)；Herrmann等人,J.Bacteriol.190:784-791(2008))提
供自由PFOR产生的还原型铁氧还蛋白产生NADH或NADPH的方式。这些蛋白质在下文进行
了标识。
[0455]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Por CAA70873.1 1770208 非洲脱硫弧菌
Por YP_428946.1 83588937 热醋穆尔氏菌
ydbK NP_415896.1 16129339 大肠杆菌
fqrB NP_207955.1 15645778 幽门螺杆菌
fqrB YP_001482096.1 157414840 空肠弯曲杆菌
RnfC EDK33306.1 146346770 克鲁维氏梭菌
RnfD EDK33307.1 146346771 克鲁维氏梭菌
RnfG EDK33308.1 146346772 克鲁维氏梭菌
RnfE EDK33309.1 146346773 克鲁维氏梭菌
RnfA EDK33310.1 146346774 克鲁维氏梭菌
RnfB EDK33311.1 146346775 克鲁维氏梭菌
[0456] 丙酮酸甲酸-裂合酶(PFL,EC 2.3.1.54)(图2H)，由大肠杆菌中的pflB编码，可将丙酮酸转变成乙酰-CoA和甲酸。PFL的活性可通过由pflA编码的活化酶而增强(Knappe
等 人 ,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 81:1332-1335(1984)；Wong 等 人 ,Biochemistry
32:14102-14110(1993))。酮-酸甲酸-裂合酶(EC2.3.1.-)，也称为2-酮丁酸甲酸-裂合
酶(KFL)和丙酮酸甲酸-裂合酶4，是大肠杆菌中tdcE的基因产物。这种酶在厌氧苏氨酸
降解期间催化将2-酮丁酸转变成丙酰-CoA和甲酸并且也可以在厌氧分解代谢中取代丙酮
酸甲酸-裂合酶(Simanshu等人,J Biosci.32:1195-1206(2007))。该酶是氧敏感性的，并
同PflB一样，可能需要由PFL-AE翻译后修饰以激活活性位点中的甘氨酰基团(Hesslinger
等人,Mol.Microbiol 27:477-492(1998))。来自闪烁古生球菌的由pflD编码的丙酮酸
甲酸-裂合酶已经在大肠杆菌中进行了克隆、表达和表征(Lehtio等人,Protein Eng
Des Sel 17:545-552(2004))。闪烁古生球菌和大肠杆菌酶的晶体结构已被解析(Lehtio
等人,J Mol.Biol.357:221-235(2006)；Leppanen等人,Structure.7:733-744(1999))。
另外的PFL和PFL-AE候选者在乳酸乳球菌(Melchiorsen等人,Appl Microbiol
Biotechnol 58:338-344(2002)) 和 突 变 链 球 菌 (Takahashi-Abbe 等 人 ,Oral.
Microbiol Immunol.18:293-297(2003))、莱茵衣藻(Hemschemeier等人,Eukaryot.Cell
7:518-526(2008b)；Atteia等人,J.Biol.Chem.281:9909-9918(2006))和巴斯德氏梭菌
(Weidner等人,J Bacteriol.178:2440-2444(1996))中被发现。
[0457]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
pflB NP_415423 16128870 大肠杆菌
pflA NP_415422.1 16128869 大肠杆菌
tdcE AAT48170.1 48994926 大肠杆菌
pflD NP_070278.1 11499044 闪烁古生球菌
pfl CAA03993 2407931 乳酸乳球菌
pfl BAA09085 1129082 突变链球菌
PFL1 XP_001689719.1 159462978 莱茵衣藻
pflA1 XP_001700657.1 159485246 莱茵衣藻
pfl Q46266.1 2500058 巴斯德氏梭菌
act CAA63749.1 1072362 巴斯德氏梭菌
[0458] 如果利用丙酮酸甲酸裂合酶将丙酮酸转变成乙酰-CoA，则甲酸脱氢酶或甲酸氢裂合酶的共表达会将甲酸转变成二氧化碳。甲酸脱氢酶(FDH)催化来自甲酸的
电子可逆转移至受体上。具有FDH活性的酶使用各种不同的电子载体，例如NADH(EC
1.2.1.2)、NADPH(EC 1.2.1.43)、醌醇(EC 1.1.5.6)、细胞色素(EC 1.2.2.3)和氢化酶
(EC 1.1.99.33)。FDH酶已经自热醋穆尔氏菌表征(Andreesen和Ljungdahl,J Bacteriol
116:867-873(1973)；Li等人,J Bacteriol 92:405-412(1966)；Yamamoto等人,J Biol
Chem.258:1826-1832(1983)。基因座Moth_2312负责编码甲酸脱氢酶的α亚基，而β亚基
由Moth_2314编码(Pierce等人,Environ Microbiol(2008))。另一组编码甲酸脱氢酶活性
(具有CO2还原倾向)的基因由弗氏互营杆菌中的Sfum_2703至Sfum_2706编码(de Bok等
人,Eur J Biochem.270:2476-2485(2003))；Reda等人,PNAS 105:10654-10658(2008))。
据推测实现相同功能的一组类似基因由生氢氧化羧基嗜热菌(C.hydrogenoformans)中的
CHY_0731、CHY_0732和CHY_0733编码(Wu等人,PLoS Genet 1:e65(2005))。甲酸脱氢酶
也在许多另外的生物体包括嗜一氧化碳梭菌P7(C.carboxidivorans P7)、甲醇芽孢杆菌
(Bacillus methanolicus)、稳定伯克霍尔德氏菌(Burkholderia stabilis)、热醋穆尔氏
菌ATCC 39073、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、甲基假丝酵母(Candida methylica)
和酿酒酵母S288c中被发现。
[0459]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
[0460]Moth_2312 YP_431142 148283121 热醋穆尔氏菌
Moth_2314 YP_431144 83591135 热醋穆尔氏菌
Sfum_2703 YP_846816.1 116750129 弗氏互营杆菌
Sfum_2704 YP_846817.1 116750130 弗氏互营杆菌
Sfum_2705 YP_846818.1 116750131 弗氏互营杆菌
Sfum_2706 YP_846819.1 116750132 弗氏互营杆菌
CHY_0731 YP_359585.1 78044572 生氢氧化羧基嗜热菌
CHY_0732 YP_359586.1 78044500 生氢氧化羧基嗜热菌
CHY_0733 YP_359587.1 78044647 生氢氧化羧基嗜热菌
CcarbDRAFT_0901 ZP_05390901.1 255523938 嗜一氧化碳梭菌P7
CcarbDRAFT_4380 ZP_05394380.1 255527512 嗜一氧化碳梭菌P7
fdhA,MGA3_06625 EIJ82879.1 387590560 甲醇芽孢杆菌MGA3
fdhA,PB1_11719 ZP_10131761.1 387929084 甲醇芽孢杆菌PB1
fdhD,MGA3_06630 EIJ82880.1 387590561 甲醇芽孢杆菌MGA3
fdhD,PB1_11724 ZP_10131762.1 387929085 甲醇芽孢杆菌PB1
fdh ACF35003. 194220249 稳定伯克霍尔德氏菌
FDH1 AAC49766.1 2276465 博伊丁假丝酵母
fdh CAA57036.1 1181204 甲基假丝酵母
FDH2 P0CF35.1 294956522 酿酒酵母S288c
FDH1 NP_015033.1 6324964 酿酒酵母S288c
[0461] 或者，甲酸氢裂合酶可用于将甲酸转变成二氧化碳和氢。示例性的甲酸氢裂合酶可以在大肠杆菌中被发现。大肠杆菌甲酸氢裂合酶由氢化酶3和甲酸脱氢酶-H组
成(Maeda等人,Appl Microbiol Biotechnol 77:879-890(2007))。它由fhlA的基因
产物激活(Maeda等人,Appl Microbiol Biotechnol 77:879-890(2007))。已显示向发
酵肉汤中添加痕量元素硒、镍和钼可增强甲酸氢裂合酶活性(Soini等人,Microb.Cell
Fact.7:26(2008))。下文显示了各种氢化酶3、甲酸脱氢酶和转录活化基因。甲酸氢裂
合酶也存在于超嗜热泉古生菌(hyperthermophilic archaeon)、海滨热球菌(Takacs等
人,BMC.Microbiol 8:88(2008))中。另外的甲酸氢裂合酶系统已在鼠伤寒沙门氏菌、肺
炎克雷伯氏菌、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium
formicicum)中被发现(Vardar-Schara等人,微生物Biotechnology 1:107-125(2008))。
[0462]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
hycA NP_417205 16130632 大肠杆菌K-12 MG1655
hycB NP_417204 16130631 大肠杆菌K-12 MG1655
hycC NP_417203 16130630 大肠杆菌K-12 MG1655
[0463]hycD NP_417202 16130629 大肠杆菌K-12 MG1655
hycE NP_417201 16130628 大肠杆菌K-12 MG1655
hycF NP_417200 16130627 大肠杆菌K-12 MG1655
hycG NP_417199 16130626 大肠杆菌K-12 MG1655
hycH NP_417198 16130625 大肠杆菌K-12 MG1655
hycI NP_417197 16130624 大肠杆菌K-12 MG1655
fdhF NP_418503 16131905 大肠杆菌K-12 MG1655
fhlA NP_417211 16130638 大肠杆菌K-12 MG1655
mhyC ABW05543 157954626 海滨热球菌
mhyD ABW05544 157954627 海滨热球菌
mhyE ABW05545 157954628 海滨热球菌
myhF ABW05546 157954629 海滨热球菌
myhG ABW05547 157954630 海滨热球菌
myhH ABW05548 157954631 海滨热球菌
fdhA AAB94932 2746736 海滨热球菌
fdhB AAB94931 157954625 海滨热球菌
[0464] 丙酮酸:NADP氧化还原酶(PNO)催化将丙酮酸转变成乙酰-CoA。这种酶由单一基因编码并且该活性酶是同二聚体，这与以上描述的多亚基PDH酶复合体相反。来自
纤细裸藻的酶由其辅因子硫胺焦磷酸稳定化(Nakazawa等人,Arch Biochem Biophys
411:183-8(2003))。应该移除这种酶的线粒体靶向序列用于在细胞溶质中表达。纤细裸藻
蛋白质和其它NADP-依赖性丙酮酸:NADP+氧化还原酶的PNO蛋白列于下表。
[0465]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
PNO Q94IN5.1 33112418 纤细裸藻
cgd4_690 XP_625673.1 66356990 小隐孢子虫Iowa II
TPP_PFOR_PNO XP_002765111.11 294867463 海洋帕金虫ATCC 50983
[0466] 乙醛NAD(P)+依赖性氧化成乙酰-CoA(图2I)可以由酰基化乙醛脱氢酶(EC1.2.1.10)催化。大肠杆菌的酰基化乙醛脱氢酶由adhE、eutE和mhpF编码(Ferrandez等
人,J Bacteriol 179:2573-81(1997))。由dmpF编码的假单胞菌CF600酶参与间位-裂
解途径并且与4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶形成复合体(Shingler等人,J Bacteriol
174:711-24(1992))。产溶剂性生物体(例如丙酮丁醇梭菌)编码具有醇脱氢酶和乙醛脱
氢酶活性的双功能酶。双功能丙酮丁醇梭菌酶由bdh I和adhE2编码(Walter等人,J.
Bacteriol.174:7149-7158(1992)；Fontaine 等 人 ,J.Bacteriol.184:821-830(2002))。
酰基化乙醛脱氢酶的又一个候选者是来自拜氏梭菌的ald基因(Toth,Appl.Environ.
Microbiol.65:4973-4980(1999)。这个基因非常类似于鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的eutE
乙醛脱氢酶基因(Toth,Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)。
[0467]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
adhE NP_415757.1 16129202 大肠杆菌
mhpF NP_414885.1 16128336 大肠杆菌
dmpF CAA43226.1 45683 假单胞菌CF600
adhE2 AAK09379.1 12958626 丙酮丁醇梭菌
bdh I NP_349892.1 15896543 丙酮丁醇梭菌
Ald AAT66436 49473535 拜氏梭菌
eutE NP_416950 16130380 大肠杆菌
eutE AAA80209 687645 鼠伤寒沙门氏菌
[0468] 苏氨酸醛缩酶(EC 4.1.2.5)催化苏氨酸裂解生成甘氨酸和乙醛(图2J)。酿酒酵母和白色假丝酵母酶由GLY1编码(Liu等人,Eur J Biochem 245:289-93(1997)；McNeil
等人,Yeast 16:167-75(2000))。大肠杆菌的ltaE和glyA基因产物也编码具有这种活性
的酶(Liu等人,Eur J Biochem 255:220-6(1998))。
[0469]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
GLY1 NP_010868.1 6320789 酿酒酵母
GLY1 AAB64198.1 2282060 白色假丝酵母
ltaE AAC73957.1 1787095 大肠杆菌
glyA AAC75604.1 1788902 大肠杆菌
[0470] 实施例III
[0471] 自PEP和丙酮酸生产乙酰-CoA的途径
[0472] 用于将细胞溶质磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和丙酮酸转变成细胞溶质乙酰-CoA的途径也能够采用来自乙酰-CoA的细胞溶质脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产途径。图3显示用于
将PEP和丙酮酸转变成乙酰-CoA的多个途径。
[0473] 将PEP转变成草酰乙酸在一、二或三个酶促步骤中催化。草酰乙酸通过丙二酸半醛或丙二酰-CoA中间体进一步转变成乙酰-CoA。在一种途径中，PEP羧化酶或PEP羧激酶
将PEP转变成草酰乙酸(步骤A)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转变成丙二酸(步骤B)；和
丙二酸半醛脱氢酶(乙酰基化)将丙二酸半醛转变成乙酰-CoA(步骤C)。在另一种途径
中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶将PEP转变成丙酮酸(步骤N)；丙酮酸羧化酶将丙酮酸转变成
(步骤H)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转变成丙二酸(步骤B)；和丙二酸半醛脱氢酶(乙
酰基化)将丙二酸半醛转变成乙酰-CoA(步骤C)。在另一种途径中，丙酮酸激酶或PEP磷
酸酶将PEP转变成丙酮酸(步骤N)；苹果酸酶将丙酮酸转变成苹果酸(步骤L)；苹果酸脱
氢酶或氧化还原酶将苹果酸转变成草酰乙酸(步骤M)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转变成
丙二酸(步骤B)；和丙二酸半醛脱氢酶(乙酰基化)将丙二酸半醛转变成乙酰-CoA(步骤
C)。在另一种途径中，PEP羧化酶或PEP羧激酶将PEP转变成草酰乙酸(步骤A)；草酰乙
酸脱羧酶将草酰乙酸转变成丙二酸半醛(步骤B)；丙二酰-CoA还原酶将丙二酸半醛转变
成丙二酰-CoA(步骤G)；和丙二酰-CoA脱羧酶将丙二酰-CoA转变成乙酰-CoA(步骤(D)。
在另一种途径中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶将PEP转变成丙酮酸(步骤N)；丙酮酸羧化酶
将丙酮酸转变成草酰乙酸(步骤H)；(草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转变成丙二酸半醛(步
骤B)；丙二酰-CoA还原酶将丙二酸半醛转变成丙二酰-CoA(步骤G)；和丙二酰-CoA脱羧
酶将丙二酰-CoA转变成乙酰-CoA(步骤(D)。在另一种途径中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶
将PEP转变成丙酮酸(步骤N)；苹果酸酶将丙酮酸转变成苹果酸(步骤L)；苹果酸脱氢酶
或氧化还原酶将苹果酸转变成草酰乙酸(步骤M)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转变成丙二
酸半醛(步骤B)；丙二酰-CoA还原酶将丙二酸半醛转变成丙二酰-CoA(步骤G)；和丙二
酰-CoA脱羧酶将丙二酰-CoA转变成乙酰-CoA(步骤(D)。在另一种途径中，PEP羧化酶
或PEP羧激酶将PEP转变成草酰乙酸(步骤A)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转变成丙二酸
半醛(步骤B)；丙二酸半醛脱氢酶将丙二酸半醛转变成丙二酸(步骤J)；丙二酰-CoA合
成酶或转移酶将丙二酸转变成丙二酰-CoA(步骤K)；和丙二酰-CoA脱羧酶将丙二酰-CoA
转变成乙酰-CoA(步骤D)。在另一种途径中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶将PEP转变成丙酮
酸(步骤N)；丙酮酸羧化酶将丙酮酸转变成草酰乙酸(步骤H)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙
酸转变成丙二酸半醛(步骤B)；丙二酸半醛脱氢酶将丙二酸半醛转变成丙二酸(步骤J)；
丙二酰-CoA合成酶或转移酶将丙二酸转变成丙二酰-CoA(步骤K)；和丙二酰-CoA脱羧酶
将丙二酰-CoA转变成乙酰-CoA(步骤D)。在另一种途径中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶将
PEP转变成丙酮酸(步骤N)；苹果酸酶将丙酮酸转变成苹果酸(步骤L)；苹果酸脱氢酶或
氧化还原酶将苹果酸转变成草酰乙酸(步骤M)；草酰乙酸脱羧酶将草酰乙酸转变成丙二酸
半醛(步骤B)；丙二酸半醛脱氢酶将丙二酸半醛转变成丙二酸(步骤J)；丙二酰-CoA合成
酶或转移酶将丙二酸转变成丙二酰-CoA(步骤K)；和丙二酰-CoA脱羧酶将丙二酰-CoA转
变成乙酰-CoA(步骤D)。在另一种途径中，PEP羧化酶或PEP羧激酶将PEP转变成草酰乙
酸(步骤A)；草酰乙酸脱氢酶或草酰乙酸氧化还原酶将草酰乙酸转变成丙二酰-CoA(步骤
F)；和丙二酰-CoA脱羧酶将丙二酰-CoA转变成乙酰-CoA(步骤D)。在另一种途径中，丙
酮酸激酶或PEP磷酸酶将PEP转变成丙酮酸(步骤N)；丙酮酸羧化酶将丙酮酸转变成草酰
乙酸(步骤H)；草酰乙酸脱氢酶或草酰乙酸氧化还原酶将草酰乙酸转变成丙二酰-CoA(步
骤F)；和丙二酰-CoA脱羧酶将丙二酰-CoA转变成乙酰-CoA(步骤D)。在另一种途径中，
丙酮酸激酶或PEP磷酸酶将PEP转变成丙酮酸(步骤N)；苹果酸酶将丙酮酸转变成苹果酸
(步骤L)；苹果酸脱氢酶或氧化还原酶将苹果酸转变成草酰乙酸(步骤M)；草酰乙酸脱氢
酶或草酰乙酸氧化还原酶将草酰乙酸转变成丙二酰-CoA(步骤F)；和丙二酰-CoA脱羧酶
将丙二酰-CoA转变成乙酰-CoA(步骤D)。
[0474] 下文描述了用于图3中所示的反应的候选酶。
[0475]1.1.n.a 氧化还原酶(醇至氧代) M
1.1.1.d 苹果酸酶 L
1.2.1.a 氧化还原酶(醛至酸) J
1.2.1.b 氧化还原酶(酰基-CoA至醛) G
1.2.1.f 氧化还原酶(酰基-CoA脱羧至醛) C
2.7.2.a 激酶 N
2.8.3.a CoA转移酶 K
3.1.3.a 磷酸酶 N
4.1.1.a 脱羧酶 A,B,D
6.2.1.a CoA合成酶 K
6.4.1.a 羧化酶 D,H
[0476] 图3中的一些酶的候选酶在本文中别处有描述。这些包括乙酰-CoA羧化酶、乙酰乙酰-CoA合酶、乙酰乙酰-CoA硫解酶、丙二酰-CoA还原酶(也称为丙二酸半醛脱氢酶(酰
基化)、苹果酸脱氢酶。
[0477] 1.1.n.a氧化还原酶(醇至氧代)
[0478] 苹果酸脱氢酶或氧化还原酶催化苹果酸氧化成草酰乙酸。不同的载体可充当此类中酶的电子受体。苹果酸脱氢酶利用NADP或NAD作为电子受体。以上在实施
例1(表7、23)中描述了候选苹果酸脱氢酶(步骤M)酶。苹果酸:醌氧化还原酶(EC
1.1.5.4)是膜缔合的并且利用醌、黄素蛋白或维生素K作为电子受体。大肠杆菌、幽门螺
杆菌和丁香假单胞菌的苹果酸:醌氧化还原酶由mqo编码(Kather等人,J Bacteriol
182:3204-9(2000)；Mellgren等人,J Bacteriol 191:3132-42(2009))。谷氨酸棒杆菌
(C.gluamicum)的Cgl2001基因也编码MQO酶(Mitsuhashi等人,Biosci Biotechnol
Biochem 70:2803-6(2006))。
[0479]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
mqo NP_416714.1 16130147 大肠杆菌
mqo NP_206886.1 15644716 幽门螺杆菌
mqo NP_790970.1 28868351 丁香假单胞菌
Cgl2001 NP_601207.1 19553205 谷氨酸棒杆菌
[0480] 1.1.1.d苹果酸酶
[0481] 苹果酸酶(苹果酸脱氢酶)催化丙酮酸可逆氧化羧化生成苹果酸。大肠杆菌编码两种苹果酸酶MaeA和MaeB(Takeo,J.Biochem.66:379-387(1969))。虽然
典型地设想苹果酸酶在自苹果酸形成丙酮酸的方向上操作，但是已经证明由maeA
编码的NAD-依赖性酶在碳固定方向上操作(Stols和Donnelly,Appl.Environ.
Microbiol.63(7)2695-2701(1997))。在大肠杆菌中过量表达来自猪蛔虫(Ascaris
suum)的苹果酸酶时得到类似的观察结果(Stols等人,Appl.Biochem.Biotechn
ol.63-65(1),153-158(1997))。由maeB编码的第二种大肠杆菌苹果酸酶是依赖NADP的并
且使草酰乙酸和其它α-酮酸脱羧(Iwakura等人,J.Biochem.85(5):1355-65(1979))。
另一合适的候选酶是来自玉蜀黍的me1(Furumoto等人,Plant Cell Physiol
41:1200-1209(2000))。
[0482]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
maeA NP_415996 90111281 大肠杆菌
maeB NP_416958 16130388 大肠杆菌
NAD-ME P27443 126732 猪蛔虫
Me1 P16243.1 126737 玉蜀黍
[0483] 1.2.1.a氧化还原酶(醛至酸)
[0484] 丙二酸半醛氧化成丙二酸由丙二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.15)催化。这种酶在绿脓假单胞菌中进行了表征(Nakamura等人,Biochim Biophys Acta50:147-52(1961))。
纤细裸藻(Euglena gracilas)的NADP和NAD-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶接受丙二酸
半醛作为底物(Tokunaga等人,Biochem Biophys Act 429:55-62(1976))。编码这些
酶的基因迄今尚未鉴定。来自真核生物体例如酿酒酵母、白色假丝酵母、解脂耶氏酵母
和黑曲霉(A.niger)的醛脱氢酶典型地具有宽的底物特异性并且是合适的候选者。这
些酶和其它形成酸的醛脱氢酶和醛氧化酶较早前已有描述并且列于表9和表30中。另
外的候选MSA脱氢酶包括NAD(P)+-依赖性醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)。在人肝脏中发现
的两种醛脱氢酶ALDH-1和ALDH-2对于多种脂族、芳香族和多环醛均具有宽的底物范
围(Klyosov,Biochemistry 35:4457-4467(1996a))。活性ALDH-2已使用GroEL蛋白
作为伴侣蛋白(chaperonins)在大肠杆菌中有效表达(Lee等人,Biochem.Biophys.
Res.Commun.298:216-224(2002))。大鼠线粒体醛脱氢酶也具有宽的底物范围(Siew等
人,Arch.Biochem.Biophys.176:638-649(1976))。大肠杆菌基因astD和aldH编码
NAD+-依赖性醛脱氢酶。AstD对琥珀酸半醛有活性(Kuznetsova等人,FEMS Microbiol Rev
29:263-279(2005))，aldH对宽范围的芳香族和脂族底物有活性(Jo等人,Appl Microbiol
Biotechnol 81:51-60(2008))。
[0485]基因 GenBank登录号 GI编号 生物体
astD P76217.1 3913108 大肠杆菌
aldH AAC74382.1 1787558 大肠杆菌
ALDH-2 P05091.2 118504 智人
ALDH-2 NP_115792.1 14192933 褐家鼠
[0486] 1.2.1.f氧化还原酶(酰基-CoA脱羧生成醛)
[0487] 丙二酸半醛脱氢酶(乙酰基化)(EC 1.2.1.18)催化丙二酸半醛氧化脱羧生成乙酰-CoA。示例性的酶由盐单胞菌HTNK1的ddcC(Todd等人,Environ Microbiol
12:237-43(2010))和干酪乳杆菌的IolA(Yebra等人,AEM73:3850-8(2007))编码。
DdcC酶具有黑曲霉和白色假丝酵母中的同源物，见下表。褐家鼠中的丙二酸半醛脱氢
酶Mmsdh也将丙二酸半醛转变成乙酰-CoA(US 8048624)。丙二酸半醛脱氢酶(乙酰基
化)酶也在荧光假单胞菌中进行了表征，虽然基因迄今尚未鉴定(Hayaishi等人,J Biol
Chem 236:781-90(1961))。甲基丙二酸半醛脱氢酶(乙酰基化)酶(EC 1.2.1.27)也
是合适的候选者，因为该类中的若干酶接受丙二酸半醛作为底物，包括枯草芽孢杆菌的
Msdh(Stines-Chaumeil等人,Biochem J 395:107-15(2006))和褐家鼠的甲基丙二酸半醛
脱氢酶(Kedishvii等人,Methods Enzymol 324:207-18(2000))。
[0488]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
ddcC ACV84070.1 258618587 盐单胞菌HTNK1
ANI_1_1120014 XP_001389265.1 145229913 黑曲霉
ALD6 XP_710976.1 68490403 白色假丝酵母
YALI0C01859g XP_501343.1 50547747 解脂耶氏酵母
mmsA_1 YP_257876.1 70734236 荧光假单胞菌
mmsA_2 YP_257884.1 70734244 荧光假单胞菌
PA0130 NP_248820.1 15595328 绿脓假单胞菌
Mmsdh Q02253.1 400269 褐家鼠
[0489]msdh NP_391855.1 16081027 枯草芽孢杆菌
IolA ABP57762.1 145309085 干酪乳杆菌
[0490] 2.7.2.a激酶
[0491] 丙酮酸激酶(步骤10N)，也称为磷酸烯醇丙酮酸合酶(EC 2.7.9.2)，将丙酮酸和ATP转变成PEP和AMP。这种酶由酿酒酵母中的PYK1(Burke等人,J.Biol.
Chem.258:2193-2201(1983))和PYK2(Boles等人,J.Bacteriol.179:2987-2993(1997))基
因编码。在大肠杆菌中，这种活性由pykF和pykA的基因产物催化。所选择的酿酒酵母酶
的同源物也示于下表。
[0492]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
PYK1 NP_009362 6319279 酿酒酵母
PYK2 NP_014992 6324923 酿酒酵母
pykF NP_416191.1 16129632 大肠杆菌
pykA NP_416368.1 16129807 大肠杆菌
KLLA0F23397g XP_456122.1 50312181 乳酸克鲁维酵母
CaO19.3575 XP_714934.1 68482353 白色假丝酵母
CaO19.11059 XP_714997.1 68482226 白色假丝酵母
YALI0F09185p XP_505195 210075987 解脂耶氏酵母
ANI_1_1126064 XP_001391973 145238652 黑曲霉
[0493] 2.8.3.a CoA转移酶
[0494] 丙二酸活化成丙二酰-CoA由EC 2.8.3.a类中的CoA转移酶催化。丙二酰-CoA:乙酸CoA转移酶(EC 2.8.3.3)酶已在包括荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌在内的假单胞菌
菌种进行了表征(Takamura等人,Biochem Int 3:483-91(1981)；Hayaishi等人,J Biol
Chem 215:125-36(1955))。与这些酶相关的基因迄今尚未鉴定。褐家鼠肝脏中发现的
线粒体CoA转移酶也催化这个反应并且能够利用一定范围的CoA供体和受体(Deana等
人,Biochem Int 26:767-73(1992))。以上描述的几种CoA转移酶也可以适用于催化图10
的步骤K。这些酶包括乙酰-CoA转移酶(表26)、3-HB CoA转移酶(表8)、乙酰乙酰-CoA
转移酶(表55)、SCOT(表56)和其它CoA转移酶(表57)。
[0495] 3.1.3.a磷酸酶
[0496] 磷酸烯醇丙酮酸磷酸酶(EC 3.1.3.60，步骤10N)催化PEP水解生成丙酮酸和磷酸。多种磷酸酶催化这种活性，包括碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)、酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)、
磷酸甘油酸磷酸酶(EC 3.1.3.20)和PEP磷酸酶(EC 3.1.3.60)。PEP磷酸酶已在植物
例如绿豆(Vignia radiate)、海莲(Bruguiera sexangula)和甘蓝(Brassica nigra)
中进行了表征。来自烟曲霉(Aspergillus fumigates)的植酸酶、来自智人的酸性磷酸
酶和大肠杆菌的碱性磷酸酶也催化PEP水解成丙酮酸(Brugger等人,Appl Microbiol
Biotech 63:383-9(2004)；Hayman 等 人 ,Biochem J 261:601-9(1989)；等 人 ,The
Enzymes,第3版,4:373-415(1971)))。相似的酶已在空肠弯曲杆菌(van Mourik等
人,Microbiol.154:584-92(2008))、酿酒酵母(Oshima等人,Gene 179:171-7(1996))和金
黄色葡萄球菌(Shah和Blobel,J.Bacteriol.94:780-1(1967))中进行了表征。酶工程改
造和/或移除靶向序列可为碱性磷酸酶在细胞质中发挥功能所需。
[0497]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
phyA O00092.1 41017447 烟曲霉
Acp5 P13686.3 56757583 智人
phoA NP_414917.2 49176017 大肠杆菌
phoX ZP_01072054.1 86153851 空肠弯曲杆菌
PHO8 AAA34871.1 172164 酿酒酵母
SaurJH1_2706 YP_001317815.1 150395140 金黄色葡萄球菌
[0498] 4.1.1.a脱羧酶
[0499] 图10中的若干反应由EC 4.1.1类中的脱羧酶包括草酰乙酸脱羧酶(步骤B)、丙二酰-CoA脱羧酶(步骤D)和丙酮酸羧化酶或羧激酶(步骤A)催化。
[0500] 磷酸烯醇丙酮酸羧化生成草酰乙酸由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC4.1.1.31)催化。示例性 的PEP羧化酶由大 肠杆菌中的ppc(Kai等 人,Arch.
Biochem.Biophys.414:170-179(2003)、外链甲基杆菌AM1中的ppcA(Arps等人,J.
Bacteriol.175:3776-3783(1993)和谷氨酸棒杆菌中的ppc(Eikmanns等人,Mol.Gen.
Genet.218:330-339(1989)编码。
[0501]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Ppc NP_418391 16131794 大肠杆菌
ppcA AAB58883 28572162 外链甲基杆菌
Ppc ABB53270 80973080 谷氨酸棒杆菌
[0502] 用于将磷酸烯醇丙酮酸羧化生成草酰乙酸的一种替代酶是PEP羧激酶(EC4.1.1.32,4.1.1.49)，其同时形成ATP或GTP。在大多数生物体中，PEP羧激酶具有
糖异生功能，在消耗一个ATP的情况下将草酰乙酸转变成PEP。酿酒酵母是一种这
样的生物体，其天然PEP羧激酶PCK1起到糖异生的作用(Valdes-Hevia等人,FEBS
Lett.258:313-316(1989)。大肠杆菌是另一种这样的生物体，因为相信PEP羧激酶
在产生草酰乙酸中的作用当与PEP羧化酶相比时微小(Kim等人,Appl.Environ.
Microbiol.70:1238-1241(2004))。尽管如此，来自PEP的天然大肠杆菌PEP羧激酶针
对草酰乙酸的活性最近已经在大肠杆菌K-12的ppc突变体中得到证明(Kwon等人,J.
Microbiol.Biotechnol.16:1448-1452(2006))。这些菌株没有表现出生长缺陷并且在高
NaHCO3浓度下增加了琥珀酸产生。在适应性进化后，大肠杆菌的突变菌株可采用Pck作为固
定CO2的主要酶(Zhang等人,2009)。在一些生物体、特别是瘤胃细菌中，PEP羧激酶在由PEP
产生草酰乙酸并产生ATP中是十分有效的。已克隆到大肠杆菌中的PEP羧激酶基因的实例
包括来自产琥珀酸曼氏杆菌(Lee等人,Biotechnol.Bioprocess Eng.7:95-99(2002)))、
产琥珀酸厌氧螺菌(Laivenieks等人,Appl.Environ.Microbiol.63:2273-2280(1997)和
琥珀酸放线杆菌(Kim等人.同上)的那些。由流感嗜血菌编码的PEP羧激酶在由PEP形成
草酰乙酸时是有效的。另一合适的候选者是来自大黍的PEPCK酶，其对于CO2(一种被认为
是大肠杆菌酶中限速的底物)具有低Km(Chen等人,Plant Physiol 128:160-164(2002)；
Cotelesage等人,Int.J Biochem.Cell Biol.39:1204-1210(2007))。来自钩虫贪铜菌的
GTP-依赖性pepck基因产物的动力学有利于草酰乙酸形成(US8048624和Lea等人,Amino
Acids 20:225-41(2001))。
[0503]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
PCK1 NP_013023 6322950 酿酒酵母
pck NP_417862.1 16131280 大肠杆菌
pckA YP_089485.1 52426348 产琥珀酸曼氏杆菌
pckA O09460.1 3122621 产琥珀酸厌氧螺菌
pckA Q6W6X5 75440571 琥珀酸放线杆菌
pckA P43923.1 1172573 流感嗜血菌
AF532733.1:1..1929 AAQ10076.1 33329363 大黍
pepck YP_728135.1 113869646 钩虫贪铜菌
[0504] 草酰乙酸脱羧酶催化草酰乙酸脱羧生成丙二酸半醛。催化这个反应的酶包括结核分枝杆菌的kgd(GenBank ID:O50463.4,GI:160395583)。对草酰乙酸具有改进活性和/或
底物特异性的自kgd进化的酶也有描述(美国专利8048624)。另外的可用于催化这个反应
的酶包括下表中所示的酮-酸脱羧酶。
[0505]EC编号 名称
4.1.1.1 丙酮酸脱羧酶
4.1.1.7 苯甲酰甲酸脱羧酶
4.1.1.40 羟基丙酮酸脱羧酶
[0506]4.1.1.43 酮苯基丙酮酸脱羧酶
4.1.1.71 α-酮戊二酸脱羧酶
4.1.1.72 支链酮-酸脱羧酶
4.1.1.74 吲哚丙酮酸脱羧酶
4.1.1.75 2-酮精氨酸脱羧酶
4.1.1.79 磺基丙酮酸脱羧酶
4.1.1.80 羟基苯基丙酮酸脱羧酶
4.1.1.82 膦酰丙酮酸脱羧酶
[0507] 酮-酸的脱羧由具有不同底物特异性的多种酶包括丙酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.1)、苯甲酰甲酸脱羧酶(EC 4.1.1.7)、α-酮戊二酸脱羧酶和支链α-酮酸脱羧酶催化。丙
酮酸脱羧酶(PDC)，也称为酮-酸脱羧酶，是醇发酵中的一个关键酶，催化丙酮酸脱羧
生成乙醛。来自酿酒酵母的PDC1酶对脂族2-酮酸包括2-酮丁酸、2-酮戊酸、3-羟基
丙酮酸和2-苯基丙酮酸(22)具有宽的底物范围。这种酶已在大肠杆菌中进行了广泛
深入研究、工程改造以达成改变的活性并且功能性表达(Killenberg-Jabs等人,Eur.
J.Biochem.268:1698-1704(2001)；Li 等 人 ,Biochemistry.38:10004-10012(1999)；
terSchure等 人,Appl.Environ.Microbiol.64:1303-1307(1998))。 来 自 运 动 发 酵
单胞菌(Zymomonas mobilus)的由pdc编码的PDC也具有宽的底物范围并且经过
定向工程改造研究以改变对不同底物的亲和力(Siegert等人,Protein Eng Des
Sel 18:345-357(2005))。这种酶的晶体结构是可获得 的(Killenberg-Jabs等
人,Eur.J.Biochem.268:1698-1704(2001))。其它充分表征的PDC候选者包括来自
巴斯德醋杆菌(Chandra等人,176:443-451(2001))和乳酸克鲁维酵母(Krieger等
人,269:3256-3263(2002))的酶。
[0508]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
pdc P06672.1 118391 运动发酵单胞菌
pdc1 P06169 30923172 酿酒酵母
pdc Q8L388 20385191 巴斯德醋杆菌
pdc1 Q12629 52788279 乳酸克鲁维酵母
[0509] 像PDC一样，苯甲酰甲酸脱羧酶(EC 4.1.1.7)具有宽的底物范围并且一直是酶工程改造研究的靶标。来自恶臭假单胞菌的酶已进行了广泛深入的研究且这
种酶的晶体结构是可获得的(Polovnikova等人,42:1820-1830(2003)；Hasson等
人,37:9918-9930(1998))。在恶臭假单胞菌酶的活性位点中的两个残基的位点定向
诱变改变了天然和非天然存在的底物的亲和力(Km)(Siegert等人,Protein Eng Des
Sel 18:345-357(2005))。这种酶的特性已通过定向工程改造进一步修饰(Lingen等
人 ,Chembiochem.4:721-726(2003)；Lingen 等 人 ,Protein Eng 15:585-593(2002))。
来自绿脓假单胞菌的由mdlC编码的酶也通过实验进行了表征(Barrowman等
人,34:57-60(1986))。另外的来自施氏假单胞菌、荧光假单胞菌和其它生物体的候选基因
可通过序列同源性推断或使用在恶臭假单胞菌中开发的生长选择系统来鉴定(Henning等
人,Appl.Environ.Microbiol.72:7510-7517(2006))。
[0510]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
mdlC P20906.2 3915757 恶臭假单胞菌
mdlC Q9HUR2.1 81539678 绿脓假单胞菌
dpgB ABN80423.1 126202187 施氏假单胞菌
ilvB-1 YP_260581.1 70730840 荧光假单胞菌
[0511] 能够使2-氧代酸脱羧的第三种酶是α-酮戊二酸脱羧酶(KGD,EC 4.1.1.71)。该类酶的底物范围迄今尚未研究。一种示例性的KDC由结核分枝杆菌中的kad编码
(Tian等人,PNAS 102:10670-10675(2005))。KDC酶活性已经也在根瘤菌(rhizobia)
包括日本慢生根瘤菌和百脉根中间根瘤菌等几种菌种进行了检测(Green等人,J
Bacteriol 182:2838-2844(2000))。虽然尚未在这些生物体中分离出编码KDC的基因，
但是其基因组序列是可获得的并且各基因组中的几个基因注解为推定的KDC。来自纤
细裸藻的KDC也进行了表征，但是与这种活性相关的基因迄今尚未鉴定(Shigeoka等
人,Arch.Biochem.Biophys.288:22-28(1991))。自N-端开始的前二十个氨基酸经测序为
MTYKAPVKDVKFLLDKVFKV(Shigeoka和 Nakano,Arch.Biochem.Biophys.288:22-28(1991))。
该基因可通过测试含有该N-端序列的候选基因的KDC活性而鉴别。最近在蓝细菌(例
如聚球藻PCC 7002)及同源物中鉴定出一类新的AKG脱羧酶(Zhang和Bryant,Science
334:1551-3(2011))。
[0512]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
kgd O50463.4 160395583 结核分枝杆菌
kgd NP_767092.1 27375563 日本慢生根瘤菌USDA110
kgd NP_105204.1 13473636 百脉根中间根瘤菌
ilvB ACB00744.1 169887030 聚球藻PCC 7002
[0513] 用于催化这个反应的第四种候选酶是支链α-酮酸脱羧酶(BCKA)。已显示这类酶作用于链长3至6个碳的多种化合物(Oku等人,J Biol Chem.263:18386-18396(1988)；
Smit 等 人 ,Appl Environ Microbiol 71:303-311(2005))。 乳 酸 乳 球 菌 中 的
酶已在多种支链和直链底物包括2-氧代丁酸、2-氧代己酸、2-氧代戊酸、3-甲
基-2-氧代丁酸、4-甲基-2-氧代丁酸和异已酸上进行了表征(Smit等人,Appl
Environ Microbiol 71:303-311(2005))。 该 酶 在 结 构 上 进 行 了 表 征(Berg 等
人,Science.318:1782-1786(2007))。乳酸乳球菌酶和运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶之
间的序列比对表明催化和底物识别残基几乎完全相同(Siegert等人,Protein Eng Des
Sel 18:345-357(2005))，所以这种酶将是定向工程改造的有前景的候选者。酿酒酵母的
几种酮酸脱羧酶催化支链底物包括ARO10、PDC6、PDC5、PDC1和THI3的脱羧(Dickenson等
人,J Biol Chem 275:10937-42(2000))。又一个BCKAD酶由结核分枝杆菌的rv0853c编
码(Werther等人,J Biol Chem 283:5344-54(2008))。这种酶通过α-酮酸底物经历变
构活化。在枯草芽孢杆菌中检测到α-酮戊二酸通过BCKA脱羧；然而，这种活性相对于对
其它支链底物的活性较低(5％)(Oku和Kaneda,J Biol Chem.263:18386-18396(1988))
并且编码这种酶的基因迄今尚未鉴定。另外的BCKA基因候选者可通过与乳酸乳球菌蛋
白质序列的同源性鉴别。针对这种酶的高打分(high-scoring)BLASTp命中(hits)中有
许多注解为吲哚丙酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.74)。吲哚丙酮酸脱羧酶(IPDA)是在植物和植
物细菌中催化吲哚丙酮酸脱羧生成吲哚乙醛的一种酶。来自智人和牛的衍生自线粒体支
链酮酸脱氢酶复合体的E1亚基的重组支链α-酮酸脱羧酶已在大肠杆菌中进行了克隆
和功能性表达(Davie等人,J.Biol.Chem.267:16601-16606(1992)；Wynn等人,J.Biol.
Chem.267:12400-12403(1992)；Wynn等人,J.Biol.Chem.267:1881-1887(1992))。在这些
研究中，作者发现伴侣蛋白GroEL和GroES的共表达使脱羧酶的比活性增大了500倍(Wynn
等人,J.Biol.Chem.267:12400-12403(1992))。这些酶由两个α和两个β亚基组成。
[0514]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
kdcA AAS49166.1 44921617 乳酸乳球菌
PDC6 NP_010366.1 6320286 酿酒酵母
PDC5 NP_013235.1 6323163 酿酒酵母
PDC1 P06169 30923172 酿酒酵母
ARO10 NP_010668.1 6320588 酿酒酵母
THI3 NP_010203.1 6320123 酿酒酵母
rv0853c O53865.1 81343167 结核分枝杆菌
BCKDHB NP_898871.1 34101272 智人
BCKDHA NP_000700.1 11386135 智人
BCKDHB P21839 115502434 牛
BCKDHA P11178 129030 牛
[0515] 3-膦酰丙酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.82)催化3-膦酰丙酮酸脱羧生成2-膦酰乙醛。示例性的膦酰丙酮酸脱羧酶由苍黄链霉菌(Streptomyces luridus)的dhpF、绿紫
链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的ppd、威德摩尔链霉菌(Streptomyces
wedmorensis) 的 fom2和 吸 水 链 霉 菌 (Streptomyces hygroscopius) 的 bcpC 编
码 (Circello 等 人 ,Chem Biol 17:402-11(2010)；Blodgett 等 人 ,FEMS Microbiol
Lett 163:149-57(2005)；Hidaka 等 人 ,Mol Gen Genet 249:274-80(1995)；Nakashita
等人,Biochim Biophys Acta 1490:159-62(2000))。由aepY编 码的脆 弱拟杆 菌
(Bacteroides fragilis)酶也使丙酮酸和磺基丙酮酸脱羧(Zhang等人,J Biol Chem
278:41302-8(2003))。
[0516]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
dhpF ACZ13457.1 268628095 苍黄链霉菌
Ppd CAJ14045.1 68697716 绿紫链霉菌
Fom2 BAA32496.1 1061008 威德摩尔链霉菌
aepY AAG26466.1 11023509 脆弱拟杆菌
[0517] 许多草酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.3)(例如大肠杆菌中的eda基因产物)作用于草酰乙酸的末端酸以形成丙酮酸。因为3-酮酸位置上的脱羧与2-酮-酸位置上形成丙二酸
半醛的脱羧竞争，所以在具有丙二酸半醛中间体之前的途径的宿主菌株中可以将这种酶活
性敲除。
[0518] 丙二酰-CoA脱羧酶(EC 4.1.1.9)催化丙二酰-CoA脱羧生成乙酰-CoA。该酶已在豌豆根瘤菌和醋酸钙不动杆菌中进行了表征(An等人,Eur J Biochem
257:395-402(1998)；Koo 等 人 ,Eur J Biochem 266:683-90(1999))。 相 似 的 酶 已
在红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus)中进行了表征(Hunaiti等人,Arch
Biochem Biophys 229:426-39(1984))。重组人丙二酰-CoA脱羧酶在大肠杆菌
中过量表达(Zhou等人,Prot Expr Pur 34:261-9(2004))。将丙二酰-CoA脱羧
的甲基丙二酰-CoA脱羧酶也是合适的候选者。例如，小韦荣氏球菌酶接受丙二
酰-CoA作为底物(Hilpert等人,Nature 296:584-5(1982))。大肠杆菌酶由ygfG编
码 (Benning 等 人 ,Biochemistry.39:4630-4639(2000)；Haller 等 人 ,Biochemist
ry.39:4622-4629(2000))。大肠杆菌酶的立体特异性尚未报道，但是中度产丙酸菌(Bott
等人,Eur.J.Biochem.250:590-599(1997))和小韦荣氏球菌(Huder等人,J.Biol.
Chem.268:24564-24571(1993))中的酶催化甲基丙二酰-CoA的(S)-立体异构体的脱羧
(Hoffmann等人,FEBS.Lett.220:121-125(1987))。来自中度产丙酸菌(P.modestum)和小
韦荣氏球菌(V.parvula)的酶由多个亚基组成，不仅使(S)-甲基丙二酰-CoA脱羧，而且产
生跨细胞膜转运钠离子的泵作为产生能量的一种方式。
[0519]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
YgfG NP_417394 90111512 大肠杆菌
matA Q9ZIP6 75424899 豌豆根瘤菌
mdcD AAB97628.1 2804622 醋酸钙不动杆菌
mdcE AAF20287.1 6642782 醋酸钙不动杆菌
mdcA AAB97627.1 2804621 醋酸钙不动杆菌
mdcC AAB97630.1 2804624 醋酸钙不动杆菌
mcd NP_036345.2 110349750 智人
mmdA CAA05137 2706398 中度产丙酸菌
mmdD CAA05138 2706399 中度产丙酸菌
mmdC CAA05139 2706400 中度产丙酸菌
mmdB CAA05140 2706401 中度产丙酸菌
mmdA CAA80872 415915 小韦荣氏球菌
mmdC CAA80873 415916 小韦荣氏球菌
mmdE CAA80874 415917 小韦荣氏球菌
mmdD CAA80875 415918 小韦荣氏球菌
mmdB CAA80876 415919 小韦荣氏球菌
[0520] 6.2.1.a CoA合成酶
[0521] 丙二酸活化成丙二酰-CoA由EC 6.2.1.a类中的CoA合成酶催化。催化这个反应的CoA合成酶迄今为止在文献中未有描述。以上描述的几种CoA合成酶也可以适用于催化
图10的步骤K。这些酶包括乙酰-CoA合成酶(表16、表25)和ADP形成CoA合成酶(表
17)。
[0522] 6.4.1.a羧化酶
[0523] 丙酮酸羧化酶(EC 6.4.1.1)在消耗一个ATP的情况下将丙酮酸转变成草酰乙酸(步骤H)。示例性的丙酮酸羧化酶由酿酒酵母中的PYC1(Walker等人,Biochem.Biophys.
Res.Commun.176:1210-1217(1991)和PYC2(Walker等人,同上)和耻垢分枝杆菌中的
pyc(Mukhopadhyay和Purwantini,Biochim.Biophys.Acta 1475:191-206(2000))编码。
[0524]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
PYC1 NP_011453 6321376 酿酒酵母
PYC2 NP_009777 6319695 酿酒酵母
Pyc YP_890857.1 118470447 耻垢分枝杆菌
[0525] 实施例IV
[0526] 自线粒体乙酰-CoA生产细胞溶质乙酰-CoA的途径
[0527] 将来自线粒体的乙酰-CoA转运至细胞溶质中的机制可促进采用来源于乙酰-CoA的细胞溶质脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸生产途径。用于输出乙酰-CoA的示例性机制包括图4
和图5中描绘的那些，其可在线粒体中自乙酰-CoA和草酰乙酸形成柠檬酸，将来自线粒体
的柠檬酸输出到细胞溶质中并将柠檬酸转变成草酰乙酸，和乙酸或乙酰-CoA。在某些实施
方案中，本文提供的是用于工程改造真核生物以通过引入能够实现图4和图5中的任何一
个所描绘的转化的酶增加其细胞溶质乙酰-CoA的可利用性的方法。本文也公开了能够实
现所需要转化的示例性酶。
[0528] 自线粒体乙酰-CoA生产细胞溶质乙酰-CoA可以通过多种途径(例如，在三个至五个酶促步骤中)完成。在一个示例性的途径中，将线粒体乙酰-CoA和草酰乙酸通过柠檬
酸合酶组合成柠檬酸，然后通过柠檬酸或柠檬酸/草酰乙酸转运体将柠檬酸输出到线粒体
外部。柠檬酸在细胞溶质中的酶促转变导致产生细胞溶质乙酰-CoA和草酰乙酸。细胞溶质
草酰乙酸然后可以任选地通过草酰乙酸转运体和/或柠檬酸/草酰乙酸转运体反向转运进
入线粒体中。在另一示例性的途径中，细胞溶质草酰乙酸首先在细胞溶质中经酶促转变成
苹果酸，然后通过苹果酸转运体和/或苹果酸/柠檬酸转运体任选地转移到线粒体中。线
粒体苹果酸可随后使用线粒体苹果酸脱氢酶转变成草酰乙酸。
[0529] 在又一个示例性的途径中，线粒体乙酰-CoA可以通过柠苹酸中间体转变成细胞溶质乙酰-CoA。例如，线粒体乙酰-CoA和丙酮酸通过柠苹酸合酶转变成柠苹酸。柠苹酸然
后可以通过柠苹酸或二羧酸转运体转运到细胞溶质中。细胞溶质乙酰-CoA和丙酮酸然后
由柠苹酸直接或间接再生，丙酮酸可以再进入线粒体中
[0530] 沿着这些线路，用于自线粒体乙酰-CoA生产细胞溶质乙酰-CoA的几种示例性乙酰-CoA途径如图4和图5所示。在一个实施方案中，将线粒体草酰乙酸与线粒体乙酰-CoA
组合以通过柠檬酸合酶形成柠檬酸。柠檬酸通过柠檬酸转运体、柠檬酸/草酰乙酸转运体
或柠檬酸/苹果酸转运体转运到线粒体外部。细胞溶质柠檬酸通过ATP柠檬酸裂合酶转变
成细胞溶质乙酰-CoA和草酰乙酸。在另一种途径中，细胞溶质柠檬酸通过柠檬酸裂合酶
转变成乙酸和草酰乙酸。乙酸然后可以通过乙酰-CoA合成酶或转移酶转变成细胞溶质乙
酰-CoA。或者，乙酸可以通过乙酸激酶转变成乙酰磷酸，乙酰磷酸可以通过磷酸转乙酰酶转
变成细胞溶质乙酰-CoA。下文描述了用于乙酰-CoA途径酶的示例性候选酶。
[0531] 草酰乙酸和线粒体乙酰-CoA的转变由柠檬酸合酶催化(图4和图5，步骤A)。在某些实施方案中，所述柠檬酸合酶在本文提供的非天然存在的真核生物的线粒体中表达。
[0532]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
CIT1 NP_014398.1 6324328 酿酒酵母S288c
CIT2 NP_009931.1 6319850 酿酒酵母S288c
CIT3 NP_015325.1 6325257 酿酒酵母S288c
YALI0E02684p XP_503469.1 50551989 解脂耶氏酵母
YALI0E00638p XP_503380.1 50551811 解脂耶氏酵母
ANI_1_876084 XP_001393983.1 145242820 黑曲霉CBS 513.88
ANI_1_1474074 XP_001393195.2 317030721 黑曲霉CBS 513.88
ANI_1_2950014 XP_001389414.2 317026339 黑曲霉CBS 513.88
ANI_1_1226134 XP_001396731.1 145250435 黑曲霉CBS 513.88
gltA NP_415248.1 16128695 大肠杆菌K-12 MG1655
[0533] 柠檬酸自线粒体转运到细胞溶质可以通过几种转运蛋白来实现。这样的蛋白质或将柠檬酸直接(即，柠檬酸转运体，图4和图5，步骤B)输出到细胞溶质中，或者在将来自细
胞溶质的分子例如苹果酸(即，柠檬酸/苹果酸转运体，图4，步骤C)或草酰乙酸(即，柠檬
酸/草酰乙酸转运体，图5，步骤C)同时转运到线粒体的同时将柠檬酸输出到细胞溶质中，
如图4和图5所示。在下表中提供了实现这些转化的示例性转运酶。
[0534]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
CTP1 NP_009850.1 6319768 酿酒酵母S288c
YALI0F26323p XP_505902.1 50556988 解脂耶氏酵母
ATEG_09970 EAU29419.1 114187719 土曲霉NIH2624
KLLA0E18723g XP_454797.1 50309571 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
CTRG_02320 XP_002548023.1 255726194 热带假丝酵母MYA-3404
ANI_1_1474094 XP_001395080.1 145245625 黑曲霉CBS 513.88
YHM2 NP_013968.1 6323897 酿酒酵母S288c
DTC CAC84549.1 19913113 拟南芥
DTC1 CAC84545.1 19913105 烟草
DTC2 CAC84546.1 19913107 烟草
DTC3 CAC84547.1 19913109 烟草
DTC4 CAC84548.1 19913111 烟草
DTC AAR06239.1 37964368 香橙
[0535] ATP柠檬酸裂合酶(ACL,EC 2.3.3.8，图4和图5，步骤D)，也称为ATP柠檬酸合酶，催化柠檬酸ATP-依赖性裂解生成草酰乙酸和乙酰-CoA。在某些实施方案中，ATP柠
檬酸裂合酶在真核生物的细胞溶质中表达。ACL是已在绿色硫细菌泥生绿菌(Chlorobium
limicola)和微温绿菌(Chlorobium tepidum)中研究的RTCA循环的酶。来自泥生
绿菌的α(4)β(4)杂聚体的酶在大肠杆菌中进行了克隆和表征(Kanao等人,Eur.
J.Biochem.269:3409-3416(2002)。由aclAB编码的泥生绿菌(C.limicola)酶是不可
逆的并且该酶的活性通过ADP/ATP比率调节。在阐明α和β亚基在催化机制中的作
用的研究中，来自微温绿菌的重组ACL也在大肠杆菌中表达，且全酶在体外复原(Kim和
Tabita,J.Bacteriol.188:6544-6552(2006)。ACL酶也在无机营养产水菌(Balnearium
lithotrophicum)、地下硫氢菌(Sulfurihydrogenibium subterraneum)和细菌门产水菌门
(Aquificae)的其它成员中鉴定(Hugler等人,Environ.Microbiol.9:81-92(2007))。这
种活性也在一些真菌中有报道。示例性的生物体包括大孢粪壳(Nowrousian等人,Curr.
Genet.37:189-93(2000))、构巢曲霉和解脂耶氏酵母(Hynes和Murray,Eukaryotic
Cell,July:1039-1048,(2010) 和 黑 曲 霉 (Meijer 等 人 ,J.Ind.Microbiol.
Biotechnol.36:1275-1280(2009)。其它候选者可以基于序列同源性发现。与这些酶相关
的信息列表如下。
[0536]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
aclA BAB21376.1 12407237 泥生绿菌
aclB BAB21375.1 12407235 泥生绿菌
aclA AAM72321.1 21647054 微温绿菌
aclB AAM72322.1 21647055 微温绿菌
aclB ABI50084.1 114055039 地下硫氢菌
aclA AAX76834.1 62199504 脱氮硫单胞菌
aclB AAX76835.1 62199506 脱氮硫单胞菌
acl1 XP_504787.1 50554757 解脂耶氏酵母
acl2 XP_503231.1 50551515 解脂耶氏酵母
SPBC1703.07 NP_596202.1 19112994 粟酒裂殖酵母
SPAC22A12.16 NP_593246.1 19114158 粟酒裂殖酵母
acl1 CAB76165.1 7160185 大孢粪壳
acl2 CAB76164.1 7160184 大孢粪壳
aclA CBF86850.1 259487849 构巢曲霉
aclB CBF86848 259487848 构巢曲霉
[0537] 在一些生物体中，将柠檬酸转变成草酰乙酸和乙酰-CoA通过柠檬酰-CoA中间体进行并且由两种独立的酶即柠檬酰-CoA合成酶(EC 6.2.1.18)和柠檬酰-CoA裂合酶
(EC 4.1.3.34)催化(Aoshima,M.,Appl.Microbiol.Biotechnol.75:249-255(2007)。柠
檬酰-CoA合成酶催化柠檬酸活化成柠檬酰-CoA。嗜热氢杆菌酶由分别由ccsA和ccsB
编码的大亚基和小亚基组成(Aoshima等人,Mol.Micrbiol.52:751-761(2004))。风
产液菌的柠檬酰-CoA合成酶由由sucC1和sucD1编码的α和β亚基组成(Hugler
等人,Environ.Microbiol.9:81-92(2007))。柠檬酰-CoA裂合酶将柠檬酰-CoA裂
解成草酰乙酸和乙酰-CoA。这种酶是由嗜热氢杆菌中的ccl(Aoshima等人,Mol.
Microbiol.52:763-770(2004))和风产液菌中的aq_150(Hugler等人,同上(2007))编码
的同三聚体。最近也在微温绿菌中报道了用于将柠檬酸转变成草酰乙酸和柠檬酰-CoA的
该机制的基因(Eisen等人,PNAS 99(14):9509-14(2002))。
[0538]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
ccsA BAD17844.1 46849514 嗜热氢杆菌
ccsB BAD17846.1 46849517 嗜热氢杆菌
sucC1 AAC07285 2983723 风产液菌
sucD1 AAC07686 2984152 风产液菌
ccl BAD17841.1 46849510 嗜热氢杆菌
aq_150 AAC06486 2982866 风产液菌
CT0380 NP_661284 21673219 微温绿菌
CT0269 NP_661173.1 21673108 微温绿菌
CT1834 AAM73055.1 21647851 微温绿菌
[0539] 柠檬酸裂合酶(EC 4.1.3.6，图4和图5，步骤E)催化一系列反应，导致柠檬酸裂解成乙酸和草酰乙酸。在某些实施方案中，柠檬酸裂合酶在真核生物的细胞溶质中表
达。该酶在厌氧条件下有活性并且由酰基-载体蛋白(ACP,γ)、ACP转移酶(α)和酰
基裂合酶(β)三种亚基组成。酶活化使用不常用辅基2’-(5”-磷酸核糖基)-3-‘-脱
磷酸-CoA(在结构上其与乙酰-CoA相似)的共价结合和乙酰化。酰基化由CitC(一
种柠檬酸裂合酶合成酶)催化。使用两种另外的蛋白质CitG和CitX将apo酶转变成
活性全酶(Schneider等人,Biochemistry 39:9438-9450(2000))。野生型大肠杆菌不
具有柠檬酸裂合酶活性；然而，钼辅因子合成中有缺陷的突变体具有活性柠檬酸裂合酶
(Clark,FEMS Microbiol.Lett.55:245-249(1990))。大肠杆菌酶由citEFD编码，柠檬酸裂
合酶合成酶由citC编码(Nilekani和SivaRaman,Biochemistry 22:4657-4663(1983))。
肠系膜样明串珠菌柠檬酸裂合酶已在大肠杆菌中克隆、表征和表达(Bekal等人,J.
Bacteriol.180:647-654(1998))。柠檬酸裂合酶也已在利用柠檬酸作为碳源和能量
来源的肠细菌(包括鼠伤寒沙门氏菌和肺炎克雷伯氏菌)中鉴定出来(Bott,Arch.
Microbiol.167:78-88(1997)；Bott和Dimroth,Mol.Microbiol.14:347-356(1994))。以上
提及的蛋白质列表如下。
[0540]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
citF AAC73716.1 1786832 大肠杆菌
cite AAC73717.2 87081764 大肠杆菌
citD AAC73718.1 1786834 大肠杆菌
citC AAC73719.2 87081765 大肠杆菌
citG AAC73714.1 1786830 大肠杆菌
citX AAC73715.1 1786831 大肠杆菌
citF CAA71633.1 2842397 肠系膜样明串珠菌
citE CAA71632.1 2842396 肠系膜样明串珠菌
citD CAA71635.1 2842395 肠系膜样明串珠菌
citC CAA71636.1 3413797 肠系膜样明串珠菌
citG CAA71634.1 2842398 肠系膜样明串珠菌
citX CAA71634.1 2842398 肠系膜样明串珠菌
citF NP_459613.1 16763998 鼠伤寒沙门氏菌
citE AAL19573.1 16419133 鼠伤寒沙门氏菌
citD NP_459064.1 16763449 鼠伤寒沙门氏菌
citC NP_459616.1 16764001 鼠伤寒沙门氏菌
citG NP_459611.1 16763996 鼠伤寒沙门氏菌
citX NP_459612.1 16763997 鼠伤寒沙门氏菌
citF CAA56217.1 565619 肺炎克雷伯氏菌
citE CAA56216.1 565618 肺炎克雷伯氏菌
citD CAA56215.1 565617 肺炎克雷伯氏菌
citC BAH66541.1 238774045 肺炎克雷伯氏菌
citG CAA56218.1 565620 肺炎克雷伯氏菌
citX AAL60463.1 18140907 肺炎克雷伯氏菌
[0541] 乙酸酰基化生成乙酰-CoA由具有乙酰-CoA合成酶活性的酶催化(图4和图5，步骤F)。在某些实施方案中，乙酰-CoA合成酶在真核生物的细胞溶质中表达。催化这个
反应的两种酶是AMP形成乙酰-CoA合成酶(EC 6.2.1.1)和ADP形成乙酰-CoA合成酶
(EC 6.2.1.13)。AMP形成乙酰-CoA合成酶(ACS)是用于将乙酸活化成乙酰-CoA的主要
酶。示例性的ACS酶在大肠杆菌(Brown等人,J.Gen.Microbiol.102:327-336(1977))、富
养罗尔斯通氏菌(Priefert和Steinbuchel,J.Bacteriol.174:6590-6599(1992))、热自养
甲烷热杆菌(Ingram-Smith和Smith,Archaea 2:95-107(2007))、肠道沙门氏菌(Gulick
等人,Biochemistry 42:2866-2873(2003))和酿酒酵母(Jogl和Tong,Biochemistry
43:1425-1431(2004))中被发现。
[0542]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
acs AAC77039.1 1790505 大肠杆菌
acoE AAA21945.1 141890 富养罗尔斯通氏菌
acs1 ABC87079.1 86169671 热自养甲烷热杆菌
acs1 AAL23099.1 16422835 肠道沙门氏菌
ACS1 Q01574.2 257050994 酿酒酵母
[0543] ADP形成乙酰-CoA合成酶(ACD,EC 6.2.1.13)是将酰基-CoA酯转变成它们的相应酸与同时合成ATP相偶联的另一候选酶。在文献中描述了具有宽底物特异性的几种
酶。来自闪烁古生球菌的由AF1211编码的ACD I显示作用于多种直链和支链底物，包括
乙酰-CoA、丙酰-CoA、丁酰-CoA、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、琥珀酸、延胡索酸、苯
乙酸、吲哚乙酸(Musfeldt等人,J.Bacteriol.184:636-644(2002))。来自死海盐盒菌的
酶(注解为琥珀酰-CoA合成酶)接受丙酸、丁酸和支链酸(异戊酸和异丁酸)作为底物
并且显示在正方向和反方向上操作(Brasen等人,Arch.Microbiol.182:277-287(2004))。
来自超嗜热泉古生菌(hyperthermophilic crenarchaeon)需氧热棒菌(Pyrobaculum
aerophilum)的由PAE3250编码的ACD显示所有经表征的ACD的最宽底物范围，与乙
酰-CoA、异丁酰-CoA(优选的底物)和苯基乙酰-CoA反应(Brasen等人,同上(2004))。
来自闪烁古生球菌、死海盐盒菌和需氧热棒菌的酶已在大肠杆菌中克隆、功能性表达和表
征(Musfeldt等人,同上；Brasen等人,同上(2004))。另外的候选者包括由大肠杆菌
中的sucCD编码的琥珀酰-CoA合成酶(Buck等人,Biochemistry 24:6245-6252(1985))
和来自恶臭假单胞菌的酰基-CoA连接酶(Fernandez-Valverde等人,Appl.Environ.
Microbiol.59:1149-1154(1993))。与这些蛋白质和基因相关的信息如下所示。
[0544]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
AF1211 NP_070039.1 11498810 闪烁古生球菌DSM 4304
AF1983 NP_070807.1 11499565 闪烁古生球菌DSM 4304
scs YP_135572.1 55377722 死海盐盒菌ATCC 43049
PAE3250 NP_560604.1 18313937 好氧火棒菌菌株IM2
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
[0545] 将CoA部分添加到乙酸上的一种替代方法是应用一对酶，例如转磷酸的酰基转移酶和乙酸激酶(图4和图5，步骤F)。这种活性使得在同时消耗一个ATP时净生成乙酰-CoA。
在某些实施方案中，磷酸转乙酰酶在真核生物的细胞溶质中表达。示例性的转磷酸的酰基
转移酶是由pta编码的磷酸转乙酰酶。来自大肠杆菌的pta基因编码可将乙酰-CoA转变
成乙酰-磷酸的酶，反之亦然(Suzuki,T.Biochim.Biophys.Acta 191:559-569(1969))。这
种酶在该过程中也可以利用丙酰-CoA替代形成丙酸的乙酰-CoA(Hesslinger等人,Mol.
Microbiol 27:477-492(1998))。同源物存在于包括肠道沙门氏菌和莱茵衣藻在内的若干
其它生物体中。
[0546]
[0547] 示例性的乙酸激酶是由ackA编码的大肠杆菌乙酸激酶(Skarstedt和Silverstein J.Biol.Chem.251:6775-6783(1976))。同源物存在于包括肠道沙门氏菌和莱
茵衣藻在内的若干其它生物体中。与这些蛋白质和基因相关的信息如下所示：
[0548]
[0549] 在有些实施方案中，细胞溶质草酰乙酸通过草酰乙酸转运体转运回到线粒体中。转运回到线粒体中的草酰乙酸然后可以用于本文描述的乙酰-CoA途径中。草酰乙酸自细
胞溶质转运到线粒体中可以通过几种转运蛋白质实现。这样的蛋白质或者直接(即，草酰
乙酸转运体)将草酰乙酸输入到线粒体中或者在将来自线粒体的分子例如柠檬酸(即，柠
檬酸/草酰乙酸转运体)同时转运到细胞溶质中的同时将草酰乙酸输入到细胞溶质中，如
图5所示。实现这些转化的示例性转运酶在下表中提供。
[0550]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
OAC1 NP_012802.1 6322729 酿酒酵母S288c
KLLA0B12826g XP_452102.1 50304305 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
[0551]YALI0E04048g XP_503525.1 50552101 解脂耶氏酵母
CTRG_02239 XP_002547942.1 255726032 热带假丝酵母MYA-3404
DIC1 NP_013452.1 6323381 酿酒酵母S288c
YALI0B03344g XP_500457.1 50545838 解脂耶氏酵母
CTRG_02122 XP_002547815.1 255725772 热带假丝酵母MYA-3404
PAS_chr4_0877 XP_002494326.1 254574434 巴斯德毕赤酵母GS115
DTC CAC84549.1 19913113 拟南芥
DTC1 CAC84545.1 19913105 烟草
DTC2 CAC84546.1 19913107 烟草
DTC3 CAC84547.1 19913109 烟草
DTC4 CAC84548.1 19913111 烟草
DTC AAR06239.1 37964368 香橙
[0552] 在有些实施方案中，细胞溶质草酰乙酸首先通过细胞溶质苹果酸脱氢酶转变成苹果酸(图4，步骤H)。细胞溶质苹果酸通过苹果酸转运体或柠檬酸/苹果酸转运体转运到线
粒体中(图4，步骤I)。线粒体苹果酸然后通过线粒体苹果酸脱氢酶转变成草酰乙酸(图
4，步骤J)。线粒体草酰乙酸然后可以用于本文描述的乙酰-CoA途径。这些酶中的每一个
的示例性实例在下文提供。
[0553] 草酰乙酸通过苹果酸脱氢酶转变成苹果酸(EC 1.1.1.37，图4，步骤H)。当苹果酸是自细胞溶质转运到线粒体中的二羧酸时，可以使用细胞溶质和线粒体两种形式的
苹果酸脱氢酶的表达，例如，如图3中所示。酿酒酵母具有苹果酸脱氢酶的三个拷贝：
MDH1(McAlister-Henn 和 Thompson,J.Bacteriol.169:5157-5166(1987)、MDH2(Minard
和 McAlister-Henn,Mol.Cell.Biol.11:370-380(1991)；Gibson 和 McAlister-Henn,J.
Biol.Chem.278:25628-25636(2003)) 和 MDH3(Steffan 和 McAlister-Henn,J.Biol.
Chem.267:24708-24715(1992))，它们分别定位于线粒体、细胞溶质和过氧物酶体。来自酿
酒酵母的与细胞溶质苹果酸脱氢酶MDH2密切相关的同源物在包括乳酸克鲁维酵母和热带
假丝酵母在内的一些生物体中被发现。已知大肠杆菌也具有由mdh编码的活性苹果酸脱氢
酶。
[0554]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
MDH1 NP_012838 6322765 酿酒酵母
MDH2 NP_014515 116006499 酿酒酵母
MDH3 NP_010205 6320125 酿酒酵母
Mdh NP_417703.1 16131126 大肠杆菌
KLLA0E07525p XP_454288.1 50308571 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
[0555]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
YALI0D16753g XP_502909.1 50550873 解脂耶氏酵母
CTRG_01021 XP_002546239.1 255722609 热带假丝酵母MYA-3404
[0556] 苹果酸自细胞溶质转运到线粒体可以通过几种转运蛋白质来实现。这样的蛋白质或者直接(即，苹果酸转运体)将苹果酸输入到线粒体中或者在将来自线粒体的分子例如
柠檬酸(即，柠檬酸/苹果酸转运体)同时转运到细胞溶质中的同时将苹果酸输入到细胞
溶质中，如图4中所示。实现这些转化的示例性转运酶在下表中提供。
[0557]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
OAC1 NP_012802.1 6322729 酿酒酵母S288c
KLLA0B12826g XP_452102.1 50304305 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
YALI0E04048g XP_503525.1 50552101 解脂耶氏酵母
CTRG_02239 XP_002547942.1 255726032 热带假丝酵母MYA-3404
DIC1 NP_013452.1 6323381 酿酒酵母S288c
YALI0B03344g XP_500457.1 50545838 解脂耶氏酵母
CTRG_02122 XP_002547815.1 255725772 热带假丝酵母MYA-3404
PAS_chr4_0877 XP_002494326.1 254574434 巴斯德毕赤酵母GS115
DTC CAC84549.1 19913113 拟南芥
DTC1 CAC84545.1 19913105 烟草
DTC2 CAC84546.1 19913107 烟草
DTC3 CAC84547.1 19913109 烟草
DTC4 CAC84548.1 19913111 烟草
DTC AAR06239.1 37964368 香橙
[0558] 苹果酸可以通过苹果酸脱氢酶转变成草酰乙酸(EC 1.1.1.37，图4，步骤J)。当苹果酸是自细胞溶质转运到线粒体中的二羧酸时，在某些实施方案中，表达细胞溶质和线粒
体两种形式的苹果酸脱氢酶，如图3和图4中所示。酿酒酵母具有苹果酸脱氢酶的三个拷
贝：MDH1(McAlister-Henn和Thompson,J.Bacteriol.169:5157-5166(1987)、MDH2(Minard
和 McAlister-Henn,Mol.Cell.Biol.11:370-380(1991)；Gibson 和 McAlister-Henn,J.
Biol.Chem.278:25628-25636(2003)) 和 MDH3(Steffan 和 McAlister-Henn,J.Biol.
Chem.267:24708-24715(1992))，它们分别定位于线粒体、细胞溶质和过氧物酶体。与来自
酿酒酵母的线粒体苹果酸脱氢酶MDH1密切相关的同源物在包括乳酸克鲁维酵母、解脂耶
氏酵母、热带假丝酵母在内的一些生物体中被发现。已知大肠杆菌也具有由mdh编码的活
性苹果酸脱氢酶。
[0559]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
MDH1 NP_012838 6322765 酿酒酵母
MDH2 NP_014515 116006499 酿酒酵母
MDH3 NP_010205 6320125 酿酒酵母
Mdh NP_417703.1 16131126 大肠杆菌
KLLA0F25960g XP_456236.1 50312405 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
YALI0D16753g XP_502909.1 50550873 解脂耶氏酵母
CTRG_00226 XP_002545445.1 255721021 热带假丝酵母MYA-3404
[0560] 实施例V
[0561] 利用对NADH具有优先性的途径酶
[0562] 自葡萄糖产生乙酰-CoA最多可产生呈NADH形式的四个还原当量。使还原当量的产率最大化的直接和能量有效方式是利用Embden-Meyerhof-Parnas糖酵解途径(EMP途
径)。在许多利用碳水化合物的生物体中，各甘油醛-3-磷酸分子通过甘油醛-3-磷酸脱氢
酶的每一次氧化产生一个NADH分子。假定通过EMP途径代谢的每个葡萄糖分子产生两个
甘油醛-3-磷酸分子，可由葡萄糖转变成丙酮酸获得两个NADH分子。
[0563] 假定通过EMP途径代谢的每个葡萄糖分子产生两个丙酮酸分子，可由丙酮酸转变成乙酰-CoA获得两个额外NADH分子。这可通过采用将丙酮酸转变成乙酰-CoA的以下酶
或酶组中的任何一个来进行：
[0564] I. NAD-依赖性丙酮酸脱氢酶；
[0565] II.丙酮酸甲酸裂合酶和NAD-依赖性甲酸脱氢酶；
[0566] III.丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和NADH:铁氧还蛋白氧化还原酶；
[0567] IV.丙酮酸脱羧酶和NAD-依赖性酰基化乙酰基醛脱氢酶；
[0568] V.丙酮酸脱羧酶、NAD-依赖性酰基化乙醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶；和
[0569] VI.丙酮酸脱羧酶、NAD-依赖性酰基化乙醛脱氢酶和乙酰-CoA合成酶。
[0570] 总的来说，每个代谢的葡萄糖分子可获得四个NADH分子。在一个方面，脂肪醇途径需要来自乙酰-CoA的三个还原步骤。因此，很可能这三个还原步骤中的每一个都将利用
NADPH或NADH作为还原剂，进而将这些分子分别转变成NADP或NAD。因此，在有些方面，可
能理想的是所有还原步骤都是NADH-依赖性的以便将脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸的产率最大
化。脂肪醇、脂肪醛和脂肪酸的高产率可以通过以下方式来完成：
[0571] 鉴别和实施对NADH比对其它还原当量(例如NADPH)优先性更强的内源或外源脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径酶，
[0572] I.衰减有助于NADPH-依赖性还原活性的一种或多种内源脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径酶，
[0573] II.改变内源或外源脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径酶的辅因子特异性，致使其对NADH比对其天然形式具有更强的优先性，或
[0574] III.改变内源或外源脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸途径酶的辅因子特异性，致使其对NADPH比对其天然形式具有更弱的优先性。
[0575] 来自内源或外源DNA序列的个别酶或蛋白质活性可使用本领域众所周知的方法进行测定。例如，可使基因在大肠杆菌中表达，并且可使用细胞提取物测量其所编码蛋白质
的活性。或者，酶可使用本领域众所周知的标准程序进行纯化并测定活性。基于分光光度
的测定特别有效。
[0576] 改变酶的辅因子特异性的若干实例和方法是本领域已知的。例如，Khoury等人(Protein Sci.2009年10月；18(10):2125–2138)创建了对NADH具有增加的亲和
力且对NADPH具有减少的亲和力的几种木糖还原酶。Ehsani等人(Biotechnology and
Bioengineering,第104卷,第2期,第381–389页,2009年10月1日)急剧地减少
了2,3-丁二醇脱氢酶对NADH的活性，同时增加了对NADPH的活性。Machielsen等人
(Engineering in Life Sciences,第9卷,第1期,第38–44页,2009年2月)急剧地
增加了醇脱氢酶对NADH的活性。Khoury等人(Protein Sci.2009年10月；18(10):2125–
2138)在表I中列出了成功改变超过25种其它酶的辅因子优先性的几个在先实例。另外
的描述可以在以下文献中找到：Lutz等人,Protein Engineering Handbook,第1卷和第2
卷,2009,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA，特别是第31章:Altering Enzyme Substrate
and Cofactor Specificity via Protein Engineering(通过蛋白质工程改变酶底物和辅
因子特异性)。
[0577] 实施例VI
[0578] 测定途径酶的辅因子优先性
[0579] 本实施例描述了用于测定酶的辅因子优先性的实验方法。
[0580] 酶对各途径步骤的辅因子优先性可以通过克隆质粒上位于组成性或诱导性启动子之后的个体基因并转化到宿主生物(例如大肠杆菌)中进行测定。例如，编码来自以下
的催化途径步骤的酶的基因可如下所述组装在基于pZ的表达载体上：1)乙酰乙酰-CoA至
3-羟基丁酰-CoA，2)3-羟基丁酰-CoA至3-羟基丁醛，3)3-羟基丁醛至1,3-丁二醇(其
中R1为C1；R3为OH)。
[0581] 基于pZ的表达载体中的填充片段的置换。载体骨架得自Expressys(http://www.expressys.de/)的Rolf Lutz博士。载体和菌株基于由Lutz和Bujard开发的pZ表达系统
(Nucleic Acids Res 25,1203-1210(1997))。pZE13luc、pZA33luc、pZS*13luc和pZE22luc
含有萤光素酶基因作为填充片段。为了用侧接适当限制酶位点的lacZ-α片段置换萤光素
酶填充片段，萤光素酶填充片段通过用EcoRI和XbaI消化而从各载体中去除。用以下引物，
lacZ-α片段从pUC19进行PCR扩增：
[0582] lacZα-RI
[0583] 5’GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC3’(SEQID NO:)
[0584] lacZα3'BB
[0585] 5’-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGCAGA-3’(SEQ ID NO:)
[0586] 这产生具有EcoRI位点、NheI位点、核糖体结合位点、SalI位点和起始密码子的5’末端的片段。在片段的3’末端上是终止密码子、XbaI、HindIII和AvrII位点。PCR产
物用EcoRI和AvrII消化并连接到用EcoRI和XbaI消化的基础载体中(XbaI和AvrII具
有相容的末端并生非位点)。因为NheI和XbaI限制酶位点产生可连接在一起的相容末
端(但产生在连接之后不被任一酶消化的位点)，所以克隆到载体中的基因可“生物砖化
(Biobricked)”在一起(http://openwetware.org/wiki/Synthetic_Biology:BioBricks)。
简而言之，这种方法使用相同的2个限制位点使得有限数目的基因连接到载体中(只要位
点不出现在基因内部)，这是因为基因之间的位点在每次添加后受到破坏。这些载体可以随
后使用 位点-定向诱变试剂盒(NEB,Ipswich,MA,USA)进行修饰以在EcoRI和
NheI位点之间插入间隔序列AATTAA。这消除结合RBS和起始密码子的RNA中的推定茎环
结构。
[0587] 所有载体具有pZ命名，后面为字母及编号，表示复制起点、抗生素抗性标记和启动子/调节单元。复制起点为第二个字母并且对于ColE1用E表示、对于p15A用A表示和
对于基于pSC101的来源用S表示(以及较低拷贝数形式的pSC101命名为S*)。第一个编
号代表抗生素抗性标记(1代表氨苄西林，2代表卡那霉素，3代表氯霉素)。最后一个编号
定义调节所关注基因的启动子(1代表PLtetO-1，2代表PLlacO-1和3代表PA1lacO-1)。
对于本文讨论的工作，我们采用了三种基础载体pZS*13S、pZA33S和pZE13S，经修饰用于如
上讨论的生物砖(biobricks)插入。
[0588] 含有编码途径酶的基因的质粒然后可以转化到含有lacIQ的宿主菌株中，其允许通过添加异丙基β-D-l-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG)可诱导表达。在体外测定(in vitro
assays)中，使用菌株大肠杆菌MG1655lacIQ作为含有途径基因的质粒构建体的宿主，对异
源酶的活性进行了测试。让细胞在含有各构建体的适当抗生素的LB培养基(Difco)中在
好氧条件下生长，且在光密度(OD600)达到大约0.5时，通过添加1mM的IPTG诱导。可在
6小时之后收获细胞，且如下文所论述进行酶测定。
[0589] 体外酶测定。为了获得用于活性测定的粗提取物，通过在4,500rpm(Beckman-Coulter,Allegera X-15R)下离心10min收获细胞。将沉淀重悬浮于0.3mL含有核酸酶
(benzonase)和溶菌酶的BugBuster(Novagen)试剂中，并在室温下在轻轻振荡下裂解进行
约15分钟。通过在14,000rpm(Eppendorf离心机5402)下于4℃离心30min，获得无细胞
裂解物。使用Bradford等人,Anal.Biochem.72:248-254(1976)的方法测定样品中的细胞
蛋白质，如下所述进行特异性酶测定。活性报告为单位/mg蛋白质，其中活性单位定义为在
室温下在1分钟内转变1微摩尔底物所需要的酶量。
[0590] 可使用自若干文献来源(Durre等人,FEMS Microbiol.Rev.17:251-262(1995)；Palosaari和 Rogers,Bacteriol.170:2971-2976(1988)和 Welch等 人 ,Arch.Biochem.
Biophys.273:309-318(1989)改编的程序，在还原方向上测定途径步骤。NADH或NADPH的
氧化可以在室温下持续总共240秒每隔四秒读取340nM下的吸光度。可在100mM MOPS(用
KOH调整到pH 7.5)、0.4mM NADH或0.4mM NADPH和1至50μmol的细胞提取物中进行还原
测定。对于羧酸还原酶样酶，也可以在饱和浓度下加入ATP。可加入以下试剂使反应开始：
100μmol的100mM乙酰乙酰-CoA、3-羟基丁酰-CoA、3-羟基丁酸或3-羟基丁醛。使分光
光度计快速空白，且随后开始动力学读数。可使用340nM下的吸光度每分钟降低所得的斜
率以及NAD(P)H在340nM下的摩尔消光系数(6000)及提取物的蛋白质浓度来测定比活性。
[0591] 实施例VII
[0592] 增加NADPH可利用性的方法
[0593] 在本发明的有些方面，可能有利的是使用NADPH作为还原剂，使用具有活性的途径酶。例如，NADPH-依赖性途径酶对于MI-FAE循环、MD-FAE循环和/或终止途径中间体可
具有高度特异性并且使用NADPH作为底物可具有有利的动力学特性。如果一种或多种途径
步骤是NADPH依赖性的，那么可使用增加NADPH可利用性的几种替代方法。这些包括：
[0594] 1)通过戊糖磷酸途径包含葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(脱羧)的氧化分支，相对于野生型增加通量。这将每个代谢的葡萄
糖-6-磷酸产生2个NADPH分子。然而，脱羧步骤将降低1,3-丁二醇的最大理论产率。
[0595] 2)通过包含葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷酸葡糖酸脱水酶和2-酮基-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶的Entner Doudoroff途径，相对于野生型增加通量。
[0596] 3)引入可溶性转氢酶将NADH转变成NADPH。
[0597] 4)引入膜结合的转氢酶将NADH转变成NADPH。
[0598] 5)采用NADP-依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
[0599] 6)采用下列酶或酶组中的任何一个将丙酮酸转变成乙酰-CoA
[0600] a)NADP-依赖性丙酮酸脱氢酶；
[0601] b)丙酮酸甲酸裂合酶和NADP-依赖性甲酸脱氢酶；
[0602] c)丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和NADPH:铁氧还蛋白氧化还原酶；
[0603] d)丙酮酸脱羧酶和NADP-依赖性酰基化乙酰基醛脱氢酶；
[0604] e)丙酮酸脱羧酶、NADP-依赖性乙醛脱氢酶、乙酸激酶和磷酸转乙酰酶；和
[0605] f)丙酮酸脱羧酶、NADP-依赖性乙醛脱氢酶和乙酰-CoA合成酶；和任选地使这些酶的NAD-依赖性形式衰减。
[0606] 7)改变天然甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、甲酸脱氢酶或酰基化乙酰基醛脱氢酶的辅因子特异性以使对NADPH比对其天然形式具有更强的优先性。
[0607] 8)改变天然甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、甲酸脱氢酶或酰基化乙酰基醛脱氢酶的辅因子特异性以使对NADH比对其天然形式具有更弱的优先性。
[0608] 来自内源或外源DNA序列的个体酶或蛋白质活性可以使用本领域众所周知的方法进行测定。例如，基因可以在大肠杆菌中表达并且如先前实施例中描述的方法，可使用细
胞提取物测量其所编码蛋白质的活性。或者，可使用本领域众所周知的标准程序将酶纯化
并且测定活性。基于分光光度的测定特别有效。
[0609] 改变酶的辅因子特异性的若干实例和方法是本领域已知的。例如，Khoury等人(Protein Sci.2009年10月；18(10):2125–2138)创建了对NADH具有增加的亲和
力且对NADPH具有减少的亲和力的几种木糖还原酶。Ehsani等人(Biotechnology and
Bioengineering,第104卷,第2期,第381–389页,110月2009)急剧地减少2,3-丁二醇
脱氢酶对NADH的活性，同时增加对NADPH的活性。Machielsen等人(Engineering in Life
Sciences,第9卷,第1期,第38–44页,2009年2月)急剧地增加醇脱氢酶对NADH的
活性。Khoury等人(Protein Sci.2009年10月；18(10):2125–2138)在表I中列出了成功
改变超过25种其它酶的辅因子优先性的几个在先实例。另外的描述可以在以下文献中找
到：Lutz等人,Protein Engineering Handbook,第1卷和第2卷,2009,Wiley-VCH Verlag
GmbH&Co.KGaA,特别是第31章:Altering Enzyme Substrate and Cofactor Specificity
via Protein Engineering(通过蛋白质工程改变酶底物和辅因子特异性)。
[0610] 下文提供了用于这些步骤的候选酶。
[0611] 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
[0612]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
ZWF1 NP_014158.1 6324088 酿酒酵母S288c
ZWF1 XP_504275.1 50553728 解脂耶氏酵母
Zwf XP_002548953.1 255728055 热带假丝酵母MYA-3404
Zwf XP_001400342.1 145233939 黑曲霉CBS 513.88
KLLA0D19855g XP_453944.1 50307901 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
[0613] 6-磷酸葡糖酸内酯酶
[0614]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
SOL3 NP_012033.2 82795254 酿酒酵母S288c
SOL4 NP_011764.1 6321687 酿酒酵母S288c
YALI0E11671g XP_503830.1 50552840 解脂耶氏酵母
YALI0C19085g XP_501998.1 50549055 解脂耶氏酵母
ANI_1_656014 XP_001388941.1 145229265 黑曲霉CBS 513.88
CTRG_00665 XP_002545884.1 255721899 热带假丝酵母MYA-3404
CTRG_02095 XP_002547788.1 255725718 热带假丝酵母MYA-3404
KLLA0A05390g XP_451238.1 50302605 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
KLLA0C08415g XP_452574.1 50305231 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
[0615] 6-磷酸葡糖酸脱氢酶(脱羧)
[0616]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
GND1 NP_012053.1 6321977 酿酒酵母S288c
GND2 NP_011772.1 6321695 酿酒酵母S288c
ANI_1_282094 XP_001394208.2 317032184 黑曲霉CBS 513.88
ANI_1_2126094 XP_001394596.2 317032939 黑曲霉CBS 513.88
YALI0B15598g XP_500938.1 50546937 解脂耶氏酵母
CTRG_03660 XP_002549363.1 255728875 热带假丝酵母MYA-3404
[0617]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
KLLA0A09339g XP_451408.1 50302941 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
[0618] 磷酸葡糖酸脱水酶
[0619]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Edd AAC74921.1 1788157 大肠杆菌K-12 MG1655
Edd AAG29866.1 11095426 运动发酵单胞菌运动亚种ZM4
Edd YP_350103.1 77460596 荧光假单胞菌Pf0-1
ANI_1_2126094 XP_001394596.2 317032939 黑曲霉CBS 513.88
YALI0B15598g XP_500938.1 50546937 解脂耶氏酵母
CTRG_03660 XP_002549363.1 255728875 热带假丝酵母MYA-3404
KLLA0A09339g XP_451408.1 50302941 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
[0620] 2-酮基-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶
[0621]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Eda NP_416364.1 16129803 大肠杆菌K-12 MG1655
Eda Q00384.2 59802878 运动发酵单胞菌运动亚种ZM4
Eda ABA76098.1 77384585 荧光假单胞菌Pf0-1
[0622] 可溶性转氢酶
[0623]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
SthA NP_418397.2 90111670 大肠杆菌K-12 MG1655
SthA YP_002798658.1 226943585 棕色固氮菌DJ
SthA O05139.3 11135075 荧光假单胞菌
[0624] 膜结合的转氢酶
[0625]
[0626] NADP-依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶
[0627]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
gapN AAA91091.1 642667 突变链球菌
NP-GAPDH AEC07555.1 330252461 拟南芥
GAPN AAM77679.2 82469904 小麦
gapN CAI56300.1 87298962 丙酮丁醇梭菌
NADP-GAPDH 2D2I_A 112490271 细长聚球藻PCC 7942
[0628]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
NADP-GAPDH CAA62619.1 4741714 细长聚球藻PCC 7942
GDP1 XP_455496.1 50310947 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
HP1346 NP_208138.1 15645959 幽门螺杆菌26695
[0629] NAD-依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶
[0630]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
TDH1 NP_012483.1 6322409 酿酒酵母s288c
TDH2 NP_012542.1 6322468 酿酒酵母s288c
TDH3 NP_011708.1 632163 酿酒酵母s288c
KLLA0A11858g XP_451516.1 50303157 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
KLLA0F20988g XP_456022.1 50311981 乳酸克鲁维酵母NRRL Y-1140
ANI_1_256144 XP_001397496.1 145251966 黑曲霉CBS 513.88
YALI0C06369g XP_501515.1 50548091 解脂耶氏酵母
CTRG_05666 XP_002551368.1 255732890 热带假丝酵母MYA-3404
[0631] 来自大肠杆菌K-12 MG1655的突变型LpdA，描述于Biochemistry,1993,32(11),第2737–2740页：
[0632] MSTEIKTQVVVLGAGPAGYSAAFRCADLGLETVIVERYNTLGGVCLNVGCIPSKALLHVAKVIEEAKALAEHGIVFGEPKTDIDKIRTWKEKVINQLTGGLAGMAKGRKVKVVNGLGKFTGANTLEVEGENGKTVINFDNAIIAAG
SRPIQLPFIPHEDPRIWDSTDALELKEVPERLLVMGGGIIGLEMGTVYHALGSQIDVVVRKHQVIRAADKDIVKVFT
KRISKKFNLMLETKVTAVEAKEDGIYVTMEGKKAPAEPQRYDAVLVAIGRVPNGKNLDAGKAGVEVDDRGFIRVDKQ
LRTNVPHIFAIGDIVGQPMLAHKGVHEGHVAAEVIAGKKHYFDPKVIPSIAYTEPEVAWVGLTEKEAKEKGISYETA
TFPWAASGRAIASDCADGMTKLIFDKESHRVIGGAIVGTNGGELLGEIGLAIEMGCDAEDIALTIHAHPTLHESVGL
AAEVFEGSITDLPNPKAKKK(SEQ ID NO:)
[0633] 来自大肠杆菌K-12 MG1655的突变型LpdA，描述于Biochemistry,1993,32(11),第2737–2740页：
[0634] MSTEIKTQVVVLGAGPAGYSAAFRCADLGLETVIVERYNTLGGVCLNVGCIPSKALLHVAKVIEEAKALAEHGIVFGEPKTDIDKIRTWKEKVINQLTGGLAGMAKGRKVKVVNGLGKFTGANTLEVEGENGKTVINFDNAIIAAG
SRPIQLPFIPHEDPRIWDSTDALELKEVPERLLVMGGGIIALEMATVYHALGSQIDVVVRKHQVIRAADKDIVKVFT
KRISKKFNLMLETKVTAVEAKEDGIYVTMEGKKAPAEPQRYDAVLVAIGRVPNGKNLDAGKAGVEVDDRGFIRVDKQ
LRTNVPHIFAIGDIVGQPMLAHKGVHEGHVAAEVIAGKKHYFDPKVIPSIAYTEPEVAWVGLTEKEAKEKGISYETA
TFPWAASGRAIASDCADGMTKLIFDKESHRVIGGAIVGTNGGELLGEIGLAIEMGCDAEDIALTIHAHPTLHESVGL
AAEVFEGSITDLPNPKAKKK(SEQ ID NO:)
[0635] NADP-依赖性甲酸脱氢酶
[0636]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
fdh ACF35003. 194220249 稳定伯克霍尔德氏菌
fdh ABC20599.2 146386149 热醋穆尔氏菌ATCC 39073
[0637] 突变体博伊丁假丝酵母酶，描 述于Journal of Molecular CatalysisB:Enzymatic,第61卷,第3-4期,2009年12月,第157-161页:
[0638] MKIVLVLYDAGKHAADEEKLYGCTENKLGIANWLKDQGHELITTSDKEGETSELDKHIPDADIIITTPFHPAYITKERLDKAKNLKLVVVAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNVVSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQII
NHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYQRQALPKEAEEKVGARRVENIEELVAQAD
IVTVNAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGAWLVNTARGAICVAEDVAAALESGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRN
KYGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRYAEGTKNILESFFTGKFDYRPQDIILLNGEYVTKAYGKHDKK(SEQ ID NO:)
[0639] 突变体博伊丁假丝酵母酶，描 述于Journal of Molecular CatalysisB:Enzymatic,第61卷,第3-4期,2009年12月,第157-161页:
[0640] MKIVLVLYDAGKHAADEEKLYGCTENKLGIANWLKDQGHELITTSDKEGETSELDKHIPDADIIITTPFHPAYITKERLDKAKNLKLVVVAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNVVSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQII
NHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYSPQALPKEAEEKVGARRVENIEELVAQAD
IVTVNAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGAWLVNTARGAICVAEDVAAALESGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRN
KYGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRYAEGTKNILESFFTGKFDYRPQDIILLNGEYVTKAYGKHDKK(SEQ ID NO:)
[0641] 突变体酿酒酵母酶，描述于Biochem J.2002年11月,1:367(Pt.3):841-847:
[0642] MSKGKVLLVLYEGGKHAEEQEKLLGCIENELGIRNFIEEQGYELVTTIDKDPEPTSTVDRELKDAEIVITTPFFPAYISRNRIAEAPNLKLCVTAGVGSDHVDLEAANERKITVTEVTGSNVVSVAEHVMATILVLIRNYNGGHQQ
AINGEWDIAGVAKNEYDLEDKIISTVGAGRIGYRVLERLVAFNPKKLLYYARQELPAEAINRLNEASKLFNGRGDIV
QRVEKLEDMVAQSDVVTINCPLHKDSRGLFNKKLISHMKDGAYLVNTARGAICVAEDVAEAVKSGKLAGYGGDVWDK
QPAPKDHPWRTMDNKDHVGNAMTVHISGTSLDAQKRYAQGVKNILNSYFSKKFDYRPQDIIVQNGSYATRAYGQKK(
SEQ ID NO:)。
[0643] NADPH:铁氧还蛋白氧化还原酶
[0644]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
petH YP_171276.1 56750575 细长聚球藻PCC 6301
fpr NP_457968.1 16762351 肠道沙门氏菌
fnr1 XP_001697352.1 159478523 莱茵衣藻
rfnr1 NP_567293.1 18412939 拟南芥
aceF NP_414657.1 6128108 大肠杆菌K-12 MG1655
[0645] NADP-依赖性酰基化乙酰基醛脱氢酶
[0646]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
adhB AAB06720.1 1513071 嗜热厌氧假乙醇杆菌ATCC 33223
TheetDRAFT_0840 ZP_08211603. 326390041 嗜热厌氧乙醇杆菌JW 200
Cbei_3832 YP_001310903.1 150018649 拜氏梭菌NCIMB 8052
Cbei_4054 YP_001311120.1 150018866 拜氏梭菌NCIMB 8052
[0647]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
Cbei_4045 YP_001311111.1 150018857 拜氏梭菌NCIMB 8052
[0648] 编码丙酮酸脱氢酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸甲酸裂合酶、丙酮酸脱羧酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶和乙酰-CoA合成酶的示例性基因以上在实施例II中予以
描述。
[0649] 实施例VIII
[0650] 用于化学生产的工程酿酒酵母
[0651] 真核宿主相对于原核系统具有几个优点。它们能够支持翻译后修饰和宿主膜锚定及细胞器特异性酶。真核生物中的基因典型地具有内含子，其可影响基因表达的定时和蛋
白质结构。
[0652] 良好适用于工业化学品生产的示例性真核生物是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。这种生物体经充分表征、遗传上易控制且工业上稳固。基因可使用本领域
已知的方法容易地插入、缺失、置换、过量表达或表达不足。一些方法是基于质粒的，而另
一些方法修饰染色体(Guthrie和Fink.Guide to Yeast Genetics and Molecular and
Cell Biology,第B部分, 第350卷,Academic Press(2002)；Guthrie和 Fink,Guide
to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology,第C部分,第351卷,Academic
Press(2002))。
[0653] 质粒介导的基因表达通过酵母附加型质粒(YEps)实现。YEps允许高水平的表达；然而，它们非常不稳定并且它们需要在选择培养基中进行培养。它们也使宿主代谢具有高
维护成本。可以使用使用营养缺陷型(例如，URA3、TRP1、HIS3、LEU2)或抗生素选择标记
R R
(例如，Zeo或Kan )的高拷贝数质粒，通常具有强组成性启动子(例如PGK1或ACT1)和转
录终止子-聚腺苷酸区(例如来自CYC1或AOX的那些)。许多实例对精通此项技术的技术
人员来说是可获得的。这些包括pVV214(具有URA3选择标记的2微米质粒)和pVV200(具
有TRP1选择标记的2微米质粒)(Van等人,Yeast20:739-746(2003))。或者，可以使用低
拷贝质粒，例如着丝粒质粒或CEN质粒。再者，许多实例对精通此项技术的技术人员来说是
可获得的。这些包括pRS313和pRS315(Sikorski和Hieter,Genetics 122:19-27(1989)，
它们两者都需要添加启动子(例如，PGK1或ACT1)和终止子(例如，CYC1、AOX)。
[0654] 对于工业应用，基因的染色体过量表达对质粒介导的过量表达来说较佳。Mikkelsen及合作者鉴定了染色体X、XI和XII上酿酒酵母基因组的高度表达区域的11个
整合位点(Mikkelsen等人,Met Eng 14:104-11(2012))。这些位点被必需基因分隔开，使
位点之间的重组可能性减到最小。
[0655] 用于将基因插入到真核生物(例如酿酒酵母)中的工具是本领域已知的。特别有用的工具包括酵母整合质粒(YIps)、酵母人工染色体(YACS)和基因打靶/同源重组。注
意，这些工具也可以用于插入、缺失、置换、表达不足或以其他方式改变宿主的基因组。
[0656] 酵母整合质粒(YIps)利用天然酵母同源重组系统将DNA有效地整合到染色体中。这些质粒不含有复制起点并因此可仅在染色体整合后维持。示例性的构建体包括启
动子、所关注基因、终止子和具有启动子、侧接FRT位点、loxP位点的选择标记，或使得抗性
标记能够移除及再循环的定向重复序列。该方法需要用合适的引物合成和扩增所关注基
因，然后该基因在独特限制位点(例如由EcoRI和XhoI酶产生的限制位点)上进行消化
(Vellanki等人,Biotechnol Lett.29:313-318(2007))。将所关注基因在EcoRI和XhoI
位点插入启动子下游的合适表达载体中。基因插入通过PCR和DNA序列分析验证。然后使
用适当的转化方法将重组质粒线性化并且在所需位点整合到酿酒酵母的染色体DNA中。将
细胞平板接种在具有适当选择标记的YPD培养基上并孵育2-3天。通过集落PCR(colony
PCR)分析转化体的必要基因插入物。为了去除来自侧接loxP位点的构建体的抗生素标记，
引入含有Cre重组酶的质粒。Cre重组酶促进侧接loxP位点的序列的切除(Gueldener等
人,Nucleic Acids Res 30:e23(2002))。通过在不存在任何抗生素的培养基上成功培养使
所得菌株不含Cre质粒。或者，Cre重组酶质粒具有URA选择标记，并且通过细胞在充当URA
的反选择的5-FOA上生长而有效地去除质粒。这种方法也可以用于无疤痕整合而不使用
loxP。本领域技术人员可使用URA作为标记进行整合，通过在无URA板上生长而对整合进行
选择，然后通过在5-FOA板上生长对URA突变体进行选择。5-FOA通过URA基因产物转变成
有毒的5-氟尿嘧啶。或者，FLP-FRT系统可用于将基因整合到染色体中。该系统包括通过
衍生自酵母酿酒酵母的2μ质粒的Flipase重组酶(FLP)使在短Flipase识别靶(FRT)位
点之间的序列重组(Sadowski,P.D.,Prog.Nucleic.Acid.Res.Mol.Biol.51:53-91(1995)；
Zhu和Sadowski,J.Biol.Chem.270:23044-23054(1995))。类似地，基因缺失方法如以下
文献中所述进行：Baudin等人,Nucleic.Acids Res.21:3329-3330(1993)；Brachmann等
人,Yeast 14:115-132(1998)；Giaever等人,Nature 418:387-391(2002)；Longtine等
人,Yeast 14:953-961(1998)Winzeler等人,Science 285:901-906(1999)。
[0657] 用于操作酵母染色体的另一种方法是基因打靶。这种方法利用酵母中的双链DNA断裂通过同源重组修复的事实。侧接靶向序列的线性DNA片段可因此使用天然同源重组机
器有效地整合到酵母基因组中。除了插入基因的应用以外，基因打靶方法还可用于基因组
DNA操作，例如缺失基因、在基因、其启动子或其它调节元件中引入突变或在基因中添加标
签。
[0658] 酵母人工染色体(YACs)是可用于途径构建和装配的人工染色体。YACs能够表达含有多个基因的DNA(100-3000kB)的大序列。YACs的应用最近应用于工程改造酵母中的类
黄酮(flavenoid)生物合成(Naesby等人,Microb Cell Fact 8:49-56(2009))。在这种方
法中，YACs用于快速测试随机装配的途径基因以找到最佳组合。
[0659] 基因的表达水平可以通过改变基因和/或其调节区的序列来调节。这样的基因调节区包括例如启动子、增强子、内含子和终止子。负调节元件(例如阻遏元件和/或沉默元
件)的功能破坏也可以用于增强基因表达。基于RNA的工具也可以用于调节基因表达。这
样的工具包括RNA适体、核糖开关(riboswitch)、反义RNA、核酶和核糖开关。
[0660] 为了通过其启动子改变基因的表达，不同强度的组成性和诱导性启动子的文库是可获得的。强组成性启动子包括pTEF1、pADH1和衍生自糖酵解途径基因的启动子。pGAL启
动子是经充分研究的被半乳糖活化且被葡萄糖阻遏的诱导性启动子。另一个常用的诱导性
启动子是铜诱导性启动子pCUP1(Farhi等人,Met Eng 13:474-81(2011))。启动子强度的
进一步变异可通过诱变或改组方法引入。例如，易错PCR可以应用于产生合成启动子文库，
如Alper和colleagues所示(Alper等人,PNAS 102:12678-83(2005))。启动子强度可以
通过报道蛋白(例如β-半乳糖苷酶、荧光蛋白和萤光素酶)表征。
[0661] 基因组中所插入基因的位置可以改变其表达水平。例如，所整合基因的过量表达可通过将基因整合到重复DNA元件(例如核糖体DNA或长末端重复序列)中而实现。
[0662] 对于酵母或其它真核细胞中的外源表达，基因可以在细胞溶质中表达而无需添加前导序列，或者可以靶向线粒体或其它细胞器，或者通过添加合适的靶向序列例如适合于
宿主细胞的线粒体靶向或分泌信号而靶向分泌。因此，应当理解，对核酸序列进行适当修饰
以去除或包括靶向序列可以掺入到外源核酸序列中以赋予所需特性。也可以进行遗传修饰
以增强多肽合成。例如，通过用最佳或共有序列取代核糖体结合位点和/或改变基因序列
以添加或去除二级结构来提高翻译效率。也可以通过用另一个编码序列取代一个编码序列
以更好匹配宿主的密码子优先性来增加翻译速率。
[0663] 实施例IX
[0664] 用于制备脂肪醇、脂肪醛和脂肪酸的终止途径
[0665] 本实施例描述了将MI-FAE循环或MD-FAE循环的中间体转变成所关注产物(例如脂肪醇、脂肪醛和脂肪酸)的酶。途径示于图1和图7。在实施例I中公开了用于催化步骤
A-G的酶。本实施例描述了适合于催化步骤H-N的酶。
[0666] 酶包括：A.硫解酶，B.3-酮酰基-CoA还原酶，C.β-羟基l-ACP脱水酶，D.烯酰-CoA还原酶，E.酰基-CoA还原酶(醛形成)，F.醇脱氢酶，G.酰基-CoA还原酶(醇形
成)，H.酰基-CoA水解酶、转移酶或合成酶，J.酰基-ACP还原酶，K.酰基-CoA:ACP酰基
转移酶，L.硫酯酶，N.醛脱氢酶(酸形成)或羧酸还原酶。
[0667] 用于将MI-FAE循环中间体转变成脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产物的途径见下表。这些途径在本文中也称为“终止途径”。
[0668]产物 来自图1的终止途径酶
酸 H
K/L
E/N
K/J/N
醛 E
K/J
H/N
K/L/N
醇 E/F
K/J/F
H/N/F
K/L/N/F
G
[0669] 产物特异性可以使用图1和图6中所示的一种或多种酶进行精细调节。通过延长途径的一种或多种酶并结合如上所述的终止途径的一种或多种酶来控制链长。产物的结构
通过终止途径的一种或多种酶来控制。与各种途径中间体反应的所选终止途径酶实例见下
表。本文描述了另外的实例。
[0670]
[0671]
[0672] 步骤H.酰基-CoA水解酶、转移酶或合酶
[0673] 酰基-CoA水解酶、转移酶和合酶将酰基-CoA部分转变成它们的相应酸。这样的酶可以用于例如将脂肪酰-CoA转变成脂肪酸、将3-羟基酰基-CoA转变成3-羟基酸、将
3-氧代酰基-CoA转变成3-氧代酸或将烯酰-CoA转变成烯酸。
[0674] 3.1.2家族中的CoA水解酶或硫酯酶将酰基-CoA分子水解成它们的相应酸。具有不同底物范围的几种CoA水解酶适合于将酰基-CoA、3-羟基酰基-CoA、3-氧代酰
基-CoA和烯酰-CoA底物水解成它们的相应酸。例如，来自褐家鼠脑的由acot12编码的
酶(Robinson等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.71:959-965(1976))可与丁酰-CoA、己
酰-CoA和丙二酰-CoA反应。由acot8编码的人类二羧酸硫酯酶表现出对戊二酰-CoA、己
二酰-CoA、庚二酰-CoA、癸二酰-CoA和十二烷二酰-CoA有活性(Westin等人,J.Biol.
Chem.280:38125-38132(2005))。与这种酶最接近的大肠杆菌同源物tesB也可以水解
一系列CoA硫酯(Naggert等人,J Biol Chem 266:11044-11050(1991))。相似的酶也
在大鼠肝脏中进行了表征(Deana R.,Biochem Int 26:767-773(1992))。大肠杆菌中具
有水解酶活性的另外的酶包括ybgC、paaI和ybdB(Kuznetsova等人,FEMS Microbiol
Rev,2005,29(2):263-279；Song等人,J Biol Chem,2006,281(16):11028-38)。尽管其
序列尚未报道，但是来自豌豆叶线粒体的酶具有宽的底物特异性，已证明对乙酰-CoA、丙
酰-CoA、丁酰-CoA、棕榈酰-CoA、油酰-CoA、琥珀酰-CoA和巴豆酰-CoA有活性(Zeiher
等人,Plant.Physiol.94:20-27(1990))。来自酿酒酵母的乙酰-CoA水解酶ACH1代表
另一种候选水解酶(Buu等人,J.Biol.Chem.278:17203-17209(2003))。另外的具有芳
基-CoA水解酶活性的酶包括结核分枝杆菌的棕榈酰-CoA水解酶(Wang等人,Chem.
Biol.14:543-551(2007))和大肠杆菌中由entH编码的酰基-CoA水解酶(Guo等
人,Biochemistry 48:1712-1722(2009))。另外的CoA水解酶如上所述。
[0675]基因名称 GenBank登录#GI# 生物体
[0676]acot12 NP_570103.1 18543355 褐家鼠
tesB NP_414986 16128437 大肠杆菌
acot8 CAA15502 3191970 智人
acot8 NP_570112 51036669 褐家鼠
tesA NP_415027 16128478 大肠杆菌
ybgC NP_415264 16128711 大肠杆菌
paaI NP_415914 16129357 大肠杆菌
ybdB NP_415129 16128580 大肠杆菌
ACH1 NP_009538 6319456 酿酒酵母
Rv0098 NP_214612.1 15607240 结核分枝杆菌
entH AAC73698.1 1786813 大肠杆菌
[0677] 对3-羟基酰基-CoA、3-氧代酰基-CoA和烯酰-CoA中间体有活性的CoA水解酶也是本领域众所周知的。例如，用于将烯酰-CoA底物转变成它们的相应酸的酶是来
自发酵氨基酸球菌的戊烯二酸CoA-转移酶。这种酶通过位点-定向诱变转化成对戊
二酰-CoA、乙酰-CoA和3-丁烯酰-CoA有活性的酰基-CoA水解酶(Mack等人,FEBS.
Lett.405:209-212(1997))。另一种合适的酶是大肠杆菌的fadM硫酯酶III。这种
酶参与油酸β-氧化且优选的底物是3,5-十四碳二烯酰-CoA(Nie等人,Biochem
47:7744-51(2008))。
[0678]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
gctA CAA57199.1 559392 发酵氨基酸球菌
gctB CAA57200.1 559393 发酵氨基酸球菌
gctA ACJ24333.1 212292816 共生梭菌
gctB ACJ24326.1 212292808 共生梭菌
gctA NP_603109.1 19703547 具核梭杆菌
gctB NP_603110.1 19703548 具核梭杆菌
fadM NP_414977.1 16128428 大肠杆菌
[0679] 3-羟基异丁酰-CoA水解酶对3-羟基酰基-CoA底物有活性(Shimomura等人,JBiol Chem.269:14248-14253(1994))。编码这种酶的基因包括褐家鼠(Shimomura等
人,Methods Enzymol.324:229-240(2000))和智人(Shimomura等人,同上)的hibch。
相似的候选基因也可以通过序列同源性鉴定，包括酿酒酵母的hibch和蜡样芽孢杆菌的
BC_2292。示例性的3-氧代酰基-CoA水解酶是番茄的MKS2(Yu等人,Plant Physiol
154:67-77(2010))。这种酶的天然底物是3-氧代-肉豆蔻酰-CoA，其产生C14链长产物。
[0680]基因名称 GenBank登录#GI# 生物体
[0681]fadM NP_414977.1 16128428 大肠杆菌
hibch Q5XIE6.2 146324906 褐家鼠
hibch Q6NVY1.2 146324905 智人
hibch P28817.2 2506374 酿酒酵母
BC_2292 AP09256 29895975 蜡样芽孢杆菌
MKS2 ACG69783.1 196122243 番茄
[0682] CoA转移酶催化CoA部分从一个分子可逆转移到另一个分子上。若干转化需要CoA转移酶将羧酸活化成它们的相应酰基-CoA衍生物。CoA转移酶已在公开文献中有描述并且
代表这些步骤的合适候选者。下文描述了这些酶。
[0683] 已显示克鲁维氏梭菌的cat1、cat2和cat3的基因产物分别表现出琥珀酰-CoA、4-羟基丁酰-CoA和丁酰-CoA转移酶活性(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A
105:2128-2133(2008)；Sohling等人,J Bacteriol.178:871-880(1996))。相似的CoA转移
酶活性也存在于阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、
氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas
gingivalis)中(Riviere等人,J.Biol.Chem.279:45337-45346(2004)；van Grinsven等
人,J.Biol.Chem.283:1411-1418(2008))。
[0684]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
cat1 P38946.1 729048 克鲁维氏梭菌
cat2 P38942.2 172046066 克鲁维氏梭菌
cat3 EDK35586.1 146349050 克鲁维氏梭菌
TVAG_395550 XP_001330176 123975034 阴道毛滴虫G3
Tb11.02.0290 XP_828352 71754875 布氏锥虫
cat2 CAB60036.1 6249316 氨基丁酸梭菌
cat2 NP_906037.1 34541558 牙龈卟啉单胞菌W83
[0685] 利用乙酰-CoA作为CoA供体的脂肪酰-CoA转移酶是由大肠杆菌atoA(α亚基)和atoD(β亚基)基因编码的乙酰乙酰-CoA转移酶(Korolev等人,Acta
Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.58:2116-2121(2002)；Vanderwinkel 等
人,33:902-908(1968))。这种酶对链长C3-C6的底物具有宽的底物范围(Sramek等
人,Arch Biochem Biophys 171:14-26(1975))并且已显示将CoA部分自多种支链和
直链3-氧代和酰基-CoA底物转移至乙酸，该底物包括异丁酸(Matthies等人,Appl
Environ.Microbiol 58:1435-1439(1992))、 戊 酸 (Vanderwinkel 等 人 ,Biochem.
Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968)) 和 丁 酸 (Vanderwinkel 等 人 ,Biochem.
Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968))。这种酶在转录水平上被乙酰乙酸诱导，
所以调节控制的修饰对于工程改造这种酶至途径中可能是必需的(Pauli等人,Eur.
J Biochem.29:553-562(1972))。相似的酶存在于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Duncan
等人,68:5186-5190(2002))、丙酮丁醇梭菌(Cary等人,Appl Environ Microbiol
56:1576-1583(1990)；Wiesenborn等人,Appl Environ Microbiol 55:323-329(1989))和
糖乙酸多丁醇梭菌(Kosaka等人,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007))中。
[0686]基因 GI# 登录号 生物体
atoA 2492994 P76459.1 大肠杆菌
atoD 2492990 P76458.1 大肠杆菌
actA 62391407 YP_226809.1 谷氨酸棒杆菌
cg0592 62389399 YP_224801.1 谷氨酸棒杆菌
ctfA 15004866 NP_149326.1 丙酮丁醇梭菌
ctfB 15004867 NP_149327.1 丙酮丁醇梭菌
ctfA 31075384 AAP42564.1 糖乙酸多丁醇梭菌
ctfB 31075385 AAP42565.1 糖乙酸多丁醇梭菌
[0687] β-酮己二酰-CoA转移酶，也称为琥珀酰-CoA:3:氧代酸-CoA转移酶，对3-氧代酰基-CoA底物有活性。这种酶由恶臭假单胞菌中的pcaI和pcaJ编码(Kaschabek
等人,J Bacteriol.184:207-215(2002))。相似的酶在不动杆菌ADP1(Kowalchuk等
人,Gene 146:23-30(1994))、天蓝色链霉菌和克氏假单胞菌(旧称sp.B13)(Gobel等人,J
Bacteriol.184:216-223(2002)；Kaschabek 等 人 ,J Bacteriol.184:207-215(2002))
中被发现。另外的示例性琥珀酰-CoA:3:氧代酸-CoA转移酶已在幽门螺杆菌
(Corthesy-Theulaz等人,J Biol.Chem.272:25659-25667(1997))、枯草芽孢杆菌(Stols
等 人 ,Protein Expr.Purif.53:396-403(2007))和 智 人 (Fukao,T. 等 人 ,Genomics
68:144-151(2000)；Tanaka,H.等人,Mol Hum Reprod 8:16-23(2002))中进行了表征。与
这些基因相关的Genbank信息概述如下。
[0688]基因 GI# 登录号 生物体
pcaI 24985644 AAN69545.1 恶臭假单胞菌
pcaJ 26990657 NP_746082.1 恶臭假单胞菌
pcaI 50084858 YP_046368.1 不动杆菌ADP1
pcaJ 141776 AAC37147.1 不动杆菌ADP1
pcaI 21224997 NP_630776.1 天蓝色链霉菌
pcaJ 21224996 NP_630775.1 天蓝色链霉菌
catI 75404583 Q8VPF3 克氏假单胞菌
[0689]catJ 75404582 Q8VPF2 克氏假单胞菌
HPAG1_0676 108563101 YP_627417 幽门螺杆菌
HPAG1_0677 108563102 YP_627418 幽门螺杆菌
ScoA 16080950 NP_391778 枯草芽孢杆菌
ScoB 16080949 NP_391777 枯草芽孢杆菌
OXCT1 NP_000427 4557817 智人
OXCT2 NP_071403 11545841 智人
[0690] 将酰基-CoA底物转变成它们的酸产物可以由酶的6.2.1家族中的CoA酸-硫醇连接酶或CoA合成酶催化。将ATP转变成ADP(ADP形成)的CoA合酶是可逆的并且在
酸形成方向上反应。而形成AMP的酶仅催化酸活化成酰基-CoA。对于脂肪酸形成，形成
AMP的酶的缺失或衰减将减少回通量。形成ADP的乙酰-CoA合成酶(ACD,EC 6.2.1.13)
是将酰基-CoA酯转变成它们的相应酸与伴随合成ATP相偶联的酶。来自闪烁古生球
菌的由AF1211编码的ACD I显示作用于多种直链和支链底物(包括异丁酸、异戊酸和
延胡索酸)(Musfeldt等人,J Bacteriol.184:636-644(2002))。闪烁古生球菌中由
AF1983编码的第二种可逆性ACD也显示具有宽的底物范围(Musfeldt和Schonheit,J
Bacteriol.184:636-644(2002))。来自死海盐盒菌的酶(注解为琥珀酰-CoA合成酶)接
受丙酸、丁酸和支链酸(异戊酸和异丁酸)作为底物并且显示以正和反方向起作用(Brasen
等人,Arch Microbiol 182:277-287(2004))。来自超嗜热泉古生菌需氧热棒菌的由
PAE3250编码的ACD显示所有表征的ACD的最宽底物范围，与乙酰-CoA、异丁酰-CoA(优
选的底物)和苯基乙酰-CoA反应(Brasen等人,同上)。定向进化或工程改造可用于修
饰这种酶以在宿主生物的生理温度下操作。来自闪烁古生球菌、死海盐盒菌和需氧热棒
菌的酶全都在大肠杆菌中进行了克隆、功能性表达和表征(Brasen和Schonheit,同上；
Musfeldt和Schonheit,J Bacteriol.184:636-644(2002))。另外一种候选者是由大肠杆菌
的sucCD以及酿酒酵母的LSC1和LSC2基因编码的琥珀酰-CoA合成酶。这些酶在体内可逆
的反应中催化在伴随消耗一个ATP时自琥珀酸形成琥珀酰-CoA(Buck等人,Biochemistry
24:6245-6252(1985))。已证明来自恶臭假单胞菌的酰基CoA连接酶作用于若干脂族底物
包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸和辛酸并且作用于芳香族化合物例如苯基乙酸和苯
氧基乙酸(Fernandez-Valverde等人,Appl.Environ.Microbiol.59:1149-1154(1993))。
来自豌豆根瘤菌的相关酶—丙二酰CoA合成酶(6.3.4.9)可将若干二酸(即，乙基-、丙
基-、烯丙基-、异丙基-、二甲基-、环丙基-、环丙基亚甲基-、环丁基-和苄基-丙二酸)
转变成它们的相应单硫酯(Pohl等人,J.Am.Chem.Soc.123:5822-5823(2001))。
[0691]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
AF1211 NP_070039.1 11498810 闪烁古生球菌
AF1983 NP_070807.1 11499565 闪烁古生球菌
scs YP_135572.1 55377722 死海盐盒菌
PAE3250 NP_560604.1 18313937 好氧火棒菌菌株IM2
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
LSC1 NP_014785 6324716 酿酒酵母
LSC2 NP_011760 6321683 酿酒酵母
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
matB AAC83455.1 3982573 豌豆根瘤菌
[0692] 步骤J.酰基-ACP还原酶
[0693] 酰基-ACP还原成它的相应醛由酰基-ACP还原酶(AAR)催化。这样的转化描绘于图1和图7的步骤J。合适的候选酶包括细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC7942
的orf1594基因产物及其同源物(Schirmer等人,Science,329:559-62(2010))。细长聚
球藻(S.elongates)PCC7942酰基-ACP还原酶与似乎在大多数蓝细菌生物体中保守的操纵
子中的醛脱羰基酶共表达。这种酶与醛脱羰基酶一起在大肠杆菌中表达赋予产生烷烃的能
力。将海洋原绿球藻(P.marinus)AAR也克隆到大肠杆菌中，与脱羰基酶一起证明产生烷烃
(美国申请2011/0207203)。
[0694]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
orf1594 YP_400611.1 81300403 细长聚球藻PCC7942
PMT9312_0533 YP_397030.1 78778918 海洋原绿球藻MIT 9312
syc0051_d YP_170761.1 56750060 细长聚球藻PCC 6301
Ava_2534 YP_323044.1 75908748 多变鱼腥藻ATCC 29413
alr5284 NP_489324.1 17232776 念珠藻PCC 7120
Aazo_3370 YP_003722151.1 298491974 厚壁孢子念珠藻
Cyan7425_0399 YP_002481152.1 220905841 蓝丝菌PCC 7425
N9414_21225 ZP_01628095.1 119508943 泡沫节球藻CCY9414
L8106_07064 ZP_01619574.1 119485189 鞘丝藻PCC 8106
[0695] 步骤K.酰基-CoA:ACP酰基转移酶
[0696] 酰基-CoA转移至酰基-ACP由EC 2.3.1类中的酰基转移酶催化。具有这种活性的酶如上所述。
[0697] 步骤L.硫酯酶
[0698] 酰基-ACP硫酯酶将酰基-ACP转变成它的相应酸。图1的步骤L中需要这样的转化。示例性的酶包括拟南芥的FatA和FatB同等型(isoform)(Salas等人,Arch
Biochem Biophys 403:25-34(2002))。这两种蛋白质的活性随碳链长度而变化，其中FatA
优选油基-ACP(oleyl-ACP)，FatB优选棕榈酰-ACP。多种具有不同链长特异性的硫酯酶
列于WO 2008/113041中并且包括在下表中。例如，先前已显示中链植物硫酯酶(如来
自加州月桂(Umbellularia californica)的FatB)在大肠杆菌中的表达导致高水平的
中链脂肪酸、主要是月桂酸(C12:0)的累积。类似地，湿地萼距花(Cuphea palustris)
FatB1硫酯酶在大肠杆菌中的表达导致C8-10:0产物的累积(Dehesh等人,Plant Physiol
110:203-10(1996))。类似地，大肠杆菌中表达的红花(Carthamus tinctorius)硫酯酶导
致在C18:1链终止和释放为游离脂肪酸方面有>50倍提升(Knutzon等人,Plant Physiol
100:1751-58(1992))。用于改变硫酯酶底物特异性的方法也是本领域已知的(例如，
EP1605048)。
[0699]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
fatA AEE76980.1 332643459 拟南芥
fatB AEE28300.1 332190179 拟南芥
fatB2 AAC49269.1 1292906 萼距花
fatB3 AAC72881.1 3859828 萼距花
fatB1 AAC49179.1 1215718 湿地萼距花
M96568.1:94..1251 AAA33019.1 404026 红花
fatB1 Q41635.1 8469218 加州月桂
tesA AAC73596.1 1786702 大肠杆菌
[0700] 步骤N.醛脱氢酶(酸形成)或羧酸还原酶
[0701] 醛转变成酸由形成酸的醛脱氢酶催化。若干酿酒酵母酶催化醛氧化成酸，包括ALD1(ALD6)、ALD2 和ALD3(Navarro-Avino等 人 ,Yeast 15:829-42(1999)；Quash 等
人,Biochem Pharmacol 64:1279-92(2002))。线粒体蛋白质ALD4和ALD5催化类似的
转 化(Wang等 人,J Bacteriol 180:822-30(1998)；Boubekeur 等人 ,Eur J Biochem
268:5057-65(2001))。HFD1编码十六醛脱氢酶。示例性的形成酸的醛脱氢酶列于下表。
[0702]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
ALD2 NP_013893.1 6323822 酿酒酵母s288c
ALD3 NP_013892.1 6323821 酿酒酵母s288c
ALD4 NP_015019.1 6324950 酿酒酵母s288c
ALD5 NP_010996.2 330443526 酿酒酵母s288c
[0703]ALD6 NP_015264.1 6325196 酿酒酵母s288c
HFD1 NP_013828.1 6323757 酿酒酵母s288c
CaO19.8361 XP_710976.1 68490403 白色假丝酵母
CaO19.742 XP_710989.1 68490378 白色假丝酵母
YALI0C03025 CAG81682.1 49647250 解脂耶氏酵母
ANI_1_1334164 XP_001398871.1 145255133 黑曲霉
ANI_1_2234074 XP_001392964.2 317031176 黑曲霉
ANI_1_226174 XP_001402476.1 145256256 黑曲霉
ALDH P41751.1 1169291 黑曲霉
KLLA0D09999 CAH00602.1 49642640 乳酸克鲁维酵母
[0704] 酸转变成醛在热动力学上是不利的并且典型地需要富含能量的辅因子和多个酶促步骤。例如，在丁醇生物合成中，丁酸转变成丁醛通过CoA转移酶或连接酶将丁酸活化成
它的相应酰基-CoA，然后通过CoA-依赖性醛脱氢酶还原成丁醛来催化。或者，酸可以活化
为酰基-磷酸并随后通过磷酸还原酶还原。通过单一酶将酸直接转变成醛由1.2.1家族中
的双功能羧酸还原酶催化。催化这些转化的示例性酶包括羧酸还原酶、α-氨基己二酸还
原酶和视黄酸还原酶。
[0705] 艾奥瓦诺卡氏菌(Nocardia iowensis)中发现的羧酸还原酶(CAR)催化羧酸至它们的相应醛的镁、ATP和NADPH依赖性还原(Venkitasubramanian等人,J
Biol.Chem.282:478-485(2007))。这种酶的天然底物是苯甲酸并且该酶表现出芳香
族和脂族底物(包括长度C12-C18的脂肪酸)的宽的接受性(Venkitasubramanian
等 人 ,Biocatalysis in Pharmaceutical and Biotechnology Industries.CRC
press(2006)；WO 2010/135624)。CAR需要通过磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)将无
活性脱辅基酶转变成有活性全酶进行翻译后活化(Hansen等人,Appl.Environ.Microbiol
75:2765-2774(2009))。诺卡氏菌属(Nocardia)CAR酶在大肠杆菌中进行了克隆和功能性
表达(Venkitasubramanian等人,J Biol.Chem.282:478-485(2007))。编码特异性PPTase
的npt基因的共表达改进该酶的活性。来自分枝杆菌菌株JLS的相关酶催化长度C12-C16
的脂肪酸的还原。WO 2010/135624中描述了这种酶中对脂肪酸具有增强的活性的变异体。
α-氨基己二酸还原酶(AAR,EC1.2.1.31)参与一些真菌菌种中的赖氨酸生物合成途径。这
种酶将α-氨基己二酸天然地还原成α-氨基己二酸半醛。羧基基团首先通过腺苷酸的
ATP-依赖性形成活化，然后通过NAD(P)H还原得到醛和AMP。同CAR一样，这种酶利用镁并
且需要通过PPTase活化。AAR的候选酶及其相应PPTase在酿酒酵母(Morris等人,Gene
98:141-145(1991))、白色假丝酵母(Guo等人,Mol.Genet.Genomics 269:271-279(2003))
和粟酒裂殖酵母(Ford等人,Curr.Genet.28:131-137(1995))中被发现。来自粟酒裂殖酵
母的AAR当在大肠杆菌中表达时表现出显著活性(Guo等人,Yeast 21:1279-1288(2004))。
来自产黄青霉的AAR接受S-羧甲基-L-半胱氨酸作为替代底物，但不与己二酸、L-谷氨酸
或二氨基庚二酸反应(Hijarrubia等人,J Biol.Chem.278:8250-8256(2003))。编码产黄
青霉(P.chrysogenum)PPTase的基因迄今尚未鉴定并且高置信度命中通过序列比较同源
性检索尚未鉴定。
[0706]蛋白质 GenBank ID GI编号 生物体
car AAR91681.1 40796035 艾奥瓦诺卡氏菌
npt ABI83656.1 114848891 艾奥瓦诺卡氏菌
car YP_001070587.1 126434896 分枝杆菌菌株JLS
npt YP_001070355.1 126434664 分枝杆菌菌株JLS
LYS2 AAA34747.1 171867 酿酒酵母
LYS5 P50113.1 1708896 酿酒酵母
LYS2 AAC02241.1 2853226 白色假丝酵母
LYS5 AAO26020.1 28136195 白色假丝酵母
Lys1p P40976.3 13124791 粟酒裂殖酵母
Lys7p Q10474.1 1723561 粟酒裂殖酵母
Lys2 CAA74300.1 3282044 产黄青霉
[0707] 另外的car和npt基因可基于序列同源性进行标识。
[0708]
[0709]
[0710] 在灰色链霉菌(Streptomyces griseus)中发现的另外一种候选酶由griC和griD基因编码。相信这种酶因为缺失griC或griD而将3-氨基-4-羟基苯甲酸转变成3-氨
基-4-羟基苯甲醛导致细胞外3-乙酰基氨基-4-羟基苯甲酸(一种3-氨基-4-羟基苯甲
酸代谢的支路(shunt)产物)的累积(Suzuki等人,J.Antibiot.60(6):380-387(2007))。
griC和griD与SGR_665(一种在序列上类似于艾奥瓦诺卡氏菌npt的酶)的共表达可以是
有益的。
[0711]基因名称 GI编号 GenBank登录号 生物体
griC YP_001825755.1 182438036 灰色链霉菌灰色亚种NBRC 13350
griD YP_001825756.1 182438037 灰色链霉菌灰色亚种NBRC 13350
[0712] 实施例X
[0713] 在酿酒酵母中自葡萄糖产生1,3-丁二醇
[0714] 本实施例说明了在酿酒酵母中自葡萄糖产生1,3-BDO的构建和生物合成生产。
[0715] 用于1,3-BDO产生的途径包含两个MI-FAE循环酶(硫解酶和3-氧代酰基-CoA还原酶)，以及终止途径酶(酰基-CoA还原酶(醛形成)和醇脱氢酶)。经工程改造到酿
酒酵母中的1,3-BDO途径由将乙酰-CoA转化成1,3-BDO的四个酶促步骤组成。第一步骤
需要两个乙酰-CoA分子通过乙酰乙酰-CoA硫解酶(THL)缩合成乙酰乙酰-CoA。在第二步
骤中，乙酰乙酰-CoA通过乙酰乙酰-CoA还原酶(也称为3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(HBD))
还原成3-羟基丁酰-CoA。3-羟基丁酰-CoA还原酶(ALD)催化自酰基-CoA形成醛。3-羟
基丁醛进一步还原成1,3-BDO由1,3-BDO脱氢酶(ADH)催化。
[0716] 为了能够在细胞溶质中产生1,3-BDO，将形成两个乙酰-CoA的途径经工程改造到酿酒酵母中。第一途径需要通过丙酮酸脱羧酶(图2E)、乙醛脱氢酶(图2F)和乙酰-CoA
合成酶(图2B)将丙酮酸转变成乙酰-CoA。第二途径是丙酮酸甲酸裂合酶(图2H)。
[0717] 对于1,3-BDO途径的各酶促步骤，将一系列可应用基因装配以供确证。在该项研究中所克隆和评估的基因连同适当的参考文献及关于多肽序列的URL引用如下呈现于表1
中。
[0718] 表1
[0719]
[0720] 通过PCR自天然或野生型生物体的基因组DNA克隆基因。用于扩增途径基因的引物是(从5'到3'；加下划线序列是基因特异性的)：
[0721] Thl 1502:
[0722] FP:TCTAATCTAAGTTTTCTAGAACTAGTAAAGATGAGAGATGTAGTAATAGTAAGTGCTGTA(SEQID NO:)
[0723] RP:GATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCTTAGTCTCTTTCAACTACGAGAGCTGTT(SEQ IDNO:)
[0724] Thl 1491:
[0725] FP:TCTAATCTAAGTTTTCTAGAACTAGTAAAGATGAAAAATTGTGTCATCGTCAGTG(SEQ IDNO:11)
[0726] RP:GATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCTTAATTCAACCGTTCAATCACCATCGCAAT(SEQID NO:)
[0727] Thl 560:
[0728] FP:AATCTAAGTTTTCTAGAACTAGTAAAGATGAAAGAAGTTGTAATAGCTAGTGCAGTAA(SEQ IDNO:)
[0729] RP:TATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCTTAATGGTGATGGTGATGATGGCACTTTTCTA(SEQID NO:)
[0730] Thl 1512:
[0731] FP:TCTAATCTAAGTTTTCTAGAACTAGTAAAGATGAGCACCCCGTCCATCGTCA(SEQ ID NO:)
[0732] PR:GATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCCTAAAGGCTCTCGATGCACATCGCC(SEQ IDNO:)
[0733] Thl 1501:
[0734] FP:TAAGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGACTGACGTTGTCATCGTATCCGC(SEQ ID NO:)
[0735] RP:GCCTCTAGGAAGCTTTCTAGATTATTATTTGCGCTCGACTGCCAGC(SEQ ID NO:)
[0736] Hbd 1495:
[0737] FP:AAGCATACAATCAACTATCTCATATACAATGAAAAAGATTTTTGTACTTGGAGCA(SEQ IDNO:)
[0738] RP:AAAAATCATAAATCATAAGAAATTCGCTTATTTAGAGTAATCATAGAATCCTTTTCCTGA(SEQID NO:)
[0739] Ald 707:
[0740] FP:AATCTAAGTTTTCTAGAACTAGTAAAGATGAACACAGAAAACATTGAACAAGCCAT(SEQ IDNO:)
[0741] RP:TATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCCTAAGCCTCCCAAGTCCGTAATGAGAACCCTT(SEQID NO:)
[0742] Adh 28:
[0743] FP:CCAAGCATACAATCAACTATCTCATATACAATGGAGAATTTTAGATTTAATGCATATACA(SEQID NO:)
[0744] RP:AATAAAAATCATAAATCATAAGAAATTCGCTTAAAGGGACATTTCTAAAATTTTATATAC(SEQID NO:)
[0745] 1845A是野生型(1845)酶的序列变异体。该变异是由Starai及合作者描述的残基Leu-641(L641P)中的点突变(Starai等人,J Biol Chem 280:26200-5(2005))。突变的
功能例如是为了防止通过乙酰化的翻译后调节并将Acs酶以其活性状态维持。
[0746] 构建表2中所示的穿梭质粒用于酿酒酵母中异源基因的表达。质粒d9、d10和d11是分别具有Ura、His和Leu选择标记的空质粒对照。质粒d12或d13含有具有URA3选择
标记的单一ALD或ADH基因。质粒d14、d16和d17含有具有HIS3选择标记的hbd和thil
基因。
[0747] 表2
[0748]质粒 选择标记 基因
pESC-L URA3 NA
pESC-H HIS3 NA
pESC-U LEU2 NA
pY3Hd1 URA3 1799(pflA)-500(pflB)
pY3Hd2 HIS3 1799(pflA)-500(pflB)
pY3Hd3 LEU2 1799(pflA)-500(pflB)
pY3Hd4 URA3 1849(ALD6)-1845(Acs)
pY3Hd5 URA3 1849(ALD6)-1845A(Acsm)
pY3Hd6 URA3 1495(Hbd)-1491(Thl)
pY3Hd7 URA3 1495(Hbd)-560(Thl)
pY3Hd8 LEU2 28(ADH)-707(ALD)
pY3Hd9 URA3 NA
pY3Hd10 HIS3 NA
pY3Hd11 LEU2 NA
pY3Hd12 URA3 707(ALD)
pY3Hd13 URA3 28(ADH)
pY3Hd14 HIS3 1495(Hbd)-1502(Thl)
pY3Hd15 HIS3 1495(Hbd)-1512(Thl)
pY3Hd16 HIS3 1495(Hbd)-1491(Thl)
pY3Hd17 HIS3 1495(Hbd)-560(Thl)
[0749] 选择酵母宿主BY4741[MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0]作为宿主菌株用于本工作，作为具有适当营养缺陷型标记的野生型实验室菌株以寄主途径质粒。BY4741
用含有1,3-BDO途径基因的质粒单独地或连同含有PDH旁路基因或pflAB基因的质粒一
起转化。本实施例中使用的载体骨架包括p427TEF酵母表达载体、pY3H桥载体(Sunrise
Science)和pESC酵母表位标记(epitope tagging)载体(Agilent Technologies)。用来
自酿酒酵母的含有TEF1启动子、CYC终止子和URA3选择标记的pY3H载体构建具有不同选
择标记的双启动子质粒。将来自酿酒酵母的ADH1启动子和终止子序列插入到TEF1启动子
的上游，所以两个转录单元是处于背对背方向。SV40核定位信号序列在克隆过程期间被去
除。将所得质粒命名为pY3Hd9。为了构建具有不同选择标记的质粒，pY3Hd9中的URA3基因
用来自酿酒酵母的HIS3或LEU2基因置换，分别产生pY3Hd10和pY3Hd11。将四个1,3-BDO
途径基因中的两个--Hbd和Thl(关于基因编号参见表103)--克隆到具有HIS3标记的双
启动子质粒中以使得ADH1启动子控制Hbd基因的表达，同时TEF1启动子控制Thl基因的
表达(pY3Hd14～17)。将Ald和Adh基因克隆到具有LEU2选择标记的双启动子质粒中以
使得ADH1启动子驱动adh基因且TEF1启动子驱动ald基因(pY3Hd8)。将PflAB基因或
PDH旁路基因(ALD6和acs)克隆到具有URA3标记的双启动子质粒中，其中pflA或ALD6处
于ADH1启动子控制之下，pflB或acs处于TEF1启动子控制之下。使用Frozen-EZ酵母转
化法进行酵母转化(Zymo Research)。
[0750] 表3和表4显示所测试的质粒和实验条件的组合。
[0751] 表3
[0752]注释 EV2 EV2 BDO BDO BDO BDO BDO BDO BDO BDO EV3 EV3 BDO+pflAB BDO+pflAB
通气 厌氧 23G 厌氧 厌氧 23G 23G 厌氧 厌氧 23G 23G 厌氧 23G 厌氧 厌氧
6
基因 pflB pflB
5
基因 pflA pflA
4
基因 707 707 707 707 707 707 707 707 707 707
3
基因 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28
2
基因 1491 1491 1491 1491 560 560 560 560 1491 1491
1
基因 1495 1495 1495 1495 1495 1495 1495 1495 1495 1495
3
质粒 pESC-U pESC-U d1 d1
2
质粒 pESC-H pESC-H d16 d16 d16 d16 d17 d17 d17 d17 pESC-L pESC-L d16 d16
1
质粒 pESC-L pESC-L d8 d8 d8 d8 d8 d8 d8 d8 pESC-H pESC-H d8 d8
样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
BDO+pflAB BDO+pflAB BDO+pflAB BDO+pflAB BDO+pflAB BDO+pflAB BDO+PDH BDO+PDH BDO+PDH BDO+PDH BDO+PDH BDO+PDH BDO+PDH BDO+PDH
23G 23G 厌氧 厌氧 23G 23G 厌氧 厌氧 23G 23G 厌氧 厌氧 23G 23G
pflB pflB pflB pflB pflB pflB acsm acsm acsm acsm acsm acsm acsm acsm
pflA pflA pflA pflA pflA pflA ALD6 ALD6 ALD6 A1D6 ALD6 ALD6 ALD6 ALD6
707 707 707 707 707 707 707 707 707 707 707 707 707 707
28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28
1491 1491 560 560 560 560 1491 1491 1491 1491 560 560 560 560
1495 1495 1495 1495 1495 1495 1495 1495 1495 1495 1495 1495 1495 1495
d1 d1 d1 d1 d1 d1 d5 d5 d5 d5 d5 d5 d5 d5
d16 d16 d17 d17 d17 d17 d16 d16 d16 d16 d17 d17 d17 d17
d8 d8 d8 d8 d8 d8 d8 d8 d8 d8 d8 d8 d8 d8
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
[0753] 表4
[0754]质粒1质粒2质粒3基因1基因2基因3基因4基因5基因6 通气 注释
d9 d11 好氧 EVC
d8 d17 1495 560 28 707 好氧 BDO
d8 d17 d5 1495 560 28 707 1849 1845A 好氧 BDO+PDH
d8 d14 1495 1502 28 707 好氧 BDO
d8 d14 d5 1495 1502 28 707 1849 1845A 好氧 BDO+PDH
[0755] 在表3中，将菌落接种到5ml 2％葡萄糖培养基(有相应氨基酸漏失(dropout))并在30摄氏度下培养约48小时。将细胞短暂离心并重悬浮于添加了吐温-80和麦角固醇
的2ml新鲜2％葡萄糖培养基。将重悬浮的培养物加入到20ml培养瓶中的10ml新鲜葡萄
糖培养基中以获得起始OD为0.2。对于厌氧培养，将装有培养物的培养瓶抽真空后充填氮
气。对于微好氧生长，插入23G针。将所有培养物都在30摄氏度下振荡培养24小时。在
表4中，在96孔板中进行实验，将细胞在好氧条件下在具有不同葡萄糖和乙酸浓度(5％葡
萄糖、10％葡萄糖、5％葡萄糖+50mM乙酸和10％葡萄糖+50mM乙酸)的1.2ml培养基中生
长。
[0756] 使用HPX-87H柱(BioRad)通过HPLC测定培养物上清液中的葡萄糖、1,3-BDO、醇和其它有机酸副产物的浓度。
[0757] MI-FAE循环和终止途径基因在有或无pflAB或PDH旁路的情况下进行了测试。如图9-11所示，这些构建体在酵母酿酒酵母BY4741中产生0.3–3.35mM 1,3-BDO，并且在所
测试的被测样品中产生乙醇。PDH旁路(此处，ALD6和acs或acsm基因过量表达)改进了
1,3-BDO的生产。
[0758] 实施例XI
[0759] 1,3-丁二醇途径酶的酶促活性
[0760] 本实施例描述了使用体外测定检测1,3-BDO途径酶活性。
[0761] 在体外测定中，使用内部酵母菌株作为含有途径基因的质粒构建体的宿主，测试了异源酶的活性。将细胞在好氧条件下在含有适当氨基酸的酵母培养基中生长用于各构
建体。为了获得用于活性测定的粗提取物，通过离心收获细胞。将沉淀重悬浮于含有蛋
白酶抑制剂混合物(cocktail)的0.1mL100mM Tris pH 7.0缓冲液中。使用珠磨(bead
beating)3min的方法制备裂解物。珠磨之后，将溶液在14,000rpm(Eppendorf离心机5402)
下于4℃离心15min。使用Bradford等人,Anal.Biochem.72:248-254(1976)的方法测定
样品中的细胞蛋白质，并且如下所述进行特异性酶测定。
[0762] 硫解酶
[0763] 硫解酶催化两个乙酰-CoA的缩合形成乙酰乙酰-CoA。在该反应中，释放辅酶A(CoA)并且在与CoA反应时，可使用在410nm下吸收的5,5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸
(DTNB)检测游离CoA。测试了五种硫解酶(参见实施例X，表1)。大肠杆菌粗裂解物中的
估计比活性示于图12。
[0764] 在显示所表达蛋白质的Thl中，1512和1502证明针对大肠杆菌粗裂解物中的乙酰-CoA缩合活性有最高比活性。
[0765] 将1491和560均克隆到具有1495的双启动子酵母载体中，1495是3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(参见图13)。评估了这些硫解酶的乙酰-CoA缩合活性，数据示于图13。
结果表明，560和1491证明有初始活性爆发，该爆发太快速以致无法测量。然而，在初始酶
速率之后，560的缩合速率大于1491。因此，如粗裂解物中所观察到的活性硫解酶活性所指
示，在酵母双启动子载体的情况下存在蛋白质表达和活性酶。
[0766] 3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(Hbd)
[0767] 乙酰乙酰-CoA通过3-羟基丁酰-CoA脱氢酶代谢为3-羟基丁酰-CoA。该反应需要NADH的氧化，其可通过340nm下的激发波长和460nm下的发射波长的荧光来监测。氧化
形式NAD+不发荧光。这个检测策略用于所有的脱氢酶步骤。1495(来自拜氏梭菌的Hbd)
在含有1491(载体id＝pY3Hd17)或560(载体id＝pY3Hd16)的双启动子酵母载体中进
行了测定。有关各酶的GenBank标识符，参见表1。时程数据示于图14。
[0768] 含有560的1495的Hbd速率比1491快得多。图15中提供的结果显示Hbd对NADH优于对NADPH。在粗裂解物中的四种途径酶中，Hbd酶似乎展示最快的催化活性。Hbd酶，
即3-酮酰基-CoA还原酶，是优先与NADH辅因子反应的MI-FAE循环或MD-FAE循环酶的一
个实例。
[0769] 醛脱氢酶(Ald)
[0770] 醛还原酶将3-羟基丁酰-CoA转变成3-羟基丁醛。该反应需要NAD(P)H氧化，该氧化可用于监测酶活性。将来自短乳杆菌的Ald(基因ID 707)克隆到含有来自糖乙酸多
丁醇梭菌的醇脱氢酶(基因ID 28)的双载体中。将这两种酶克隆到含有Leu标记的另一
双启动子酵母载体中。
[0771] 粗裂解物的Ald活性数据示于图16中，其中来自大肠杆菌的707裂解物用作标准品。结果表明，707显示酵母裂解物中的酶活性与来自细菌的裂解物相当。另外，707基因
产物对NADH优于对NADPH作为辅因子。707基因产物，即酰基-CoA还原酶(醛形成)，是
优先与NADH辅因子反应的终止途径酶的一个实例。
[0772] 醇脱氢酶(Adh)
[0773] 1,3-BDO由醇脱氢酶(Adh)形成，醇脱氢酶(Adh)在NAD(P)H存在下将3-羟基丁醛还原。NAD(P)H的氧化可用于监测如上所述的反应。
[0774] 具有ALD(基因707)的双启动子载体中的ADH(基因28)与丁醛(3-羟基丁醛的一种替代底物)的评估示于图17。数据表明，基因28的Adh活性与具有丁醛和NADPH的无
插入对照(EV)相当。这很可能由于酵母中存在的可以与28相同能力发挥功能的内源ADH
酶所造成。
[0775] 总之，Thl、Hbd、Ald和Adh之用于产生1,3-BDO的候选者显示在酵母粗裂解物中对所构建的双启动子载体有酶活性。
[0776] 在本申请全文中，引用了各种出版物。这些出版物在其实体中的公开内容，包括发表的GenBank和GI编号，特此通过引用结合到本申请中，以便更全面地描述本发明所属领
域的现有状态。尽管本发明参照以上提供的实施例作了说明，但是应当理解，在不偏离本发
明的精神的情况下，可以进行各种修改。
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