含有生物活性物质的组合物及其制备和处理方法
阅读：1034发布：2020-07-23
专利汇可以提供含有生物活性物质的组合物及其制备和处理方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种提高在不利环境中 给药 的不稳定 生物 活性物质的存活 力 的方法，该方法包括形成生物活性物质和 哺乳动物 初乳的混合物，也包括一种不稳定生物活性物质的药用组合物，该组合物包含生物活性物质和哺乳动物初乳的混合物。，下面是含有生物活性物质的组合物及其制备和处理方法专利的具体信息内容。
1、一种提高不稳定的生物活性物质在人体胃部的存活能力的体外方法，其特征在于， 所述方法包含将不稳定的生物活性物质与哺乳动物初乳在体外制成混合物的步骤，所述不 稳定的生物活性物质包含如下组群物质中的至少一种：酶制剂、口服疫苗、感染性制剂、 用于直接抵抗疾病的抗体和其片断、用于直接抗致病性因素的抗体和其片断，所述不稳定 的生物活性物质，在不和哺乳动物初乳混合的情况下，在37℃的条件下、在含有0.32％ 的猪胃蛋白酶的0.03M的NaCl溶液中，以HCl调节pH至1.2，培养60分钟后，其功能 至少损失20％。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不稳定的生物活性物质选自酶制剂 和单克隆抗体。
3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不稳定的生物活性物质是一种口服 疫苗。
4、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不稳定的生物活性物质是一种酶制 剂。
5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不稳定的生物活性物质包含一种或 多种单克隆抗体、嵌合抗体、人源单克隆抗体和具有免疫活性片断的树枝状体或免疫活性 片断。
6、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不稳定的生物活性物质选自如下组 群：
(a)抗致病性生物体幽门螺旋杆菌、肠毒性大肠杆菌(ETEC)、细小核糖核酸病毒 的抗体或其片断；
(b)抗幽门螺旋杆菌、肠毒性大肠杆菌、炭疽、鼠疫杆菌所分泌的毒素的抗体或片 断和抗蓖麻毒素的抗体；和
(c)抗细小核糖核酸病毒的疫苗。
7、如权利要求书6所述的方法，其特征在于，所述生物活性物质选自抗幽门螺旋杆 菌或肠道病毒71的口服疫苗或抗体或抗体片断。
8、如权利要求书1所述的方法，其特征在于，其中初乳与活性物质的重量比大于0.5∶ 1。
9、如权利要求书8所述的方法，其特征在于，所述重量比大于2∶1。
10、如权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述混合物置于组合物中使用，所述 组合物包括一种或多种载体或适于口服或吸入使用的赋型剂。
11、如权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述的初乳包括取自于分娩后不超过 2天的牛的初乳。
12、如权利要求书11所述的方法，其特征在于，所述的牛初乳包括分娩后第一天所 获得的牛初乳。
13、如权利要求书1所述的方法，其特征在于，制成初乳和生物活性物质的液体混合 物，然后将液体混合物干燥为固体形式。
14、如权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物初乳是干燥的。
15、如权利要求书8所述的方法，其特征在于，免疫球蛋白占收集的所述初乳中的总 蛋白含量的比例不少于10％。
16、一种用于不稳定生物活性物质给药的组合物，其特征在于，该组合物包括一种由 生物活性物质和哺乳动物初乳组成的混合物，所述的生物活性物质包含至少一种选自以下 组群的物质：酶制剂、口服疫苗、感染性制剂、用于直接抵抗疾病的抗体和其片断、用于 直接抗致病性因素的抗体和其片断，所述不稳定的生物活性物质缺少和哺乳动物初乳混合 的情况下，在37℃的条件下、在含有0.32％的猪胃蛋白酶的0.03M的NaCl溶液中，以 HCl调节pH至1.2，培养60分钟后，其功能至少损失20％。
17、如权利要求书16所述的组合物，其特征在于，所述生物活性物质选自以下物质 组成的群组：
(a)抗致病性生物体幽门螺旋杆菌、肠毒性大肠杆菌(ETEC)和细小核糖核酸病毒 的抗体或其片断；
(b)抗幽门螺旋杆菌、肠毒性大肠杆菌、炭疽、鼠疫杆菌所分泌的毒素的抗体或片 断和抗蓖麻毒素的抗体；和
(c)抗幽门螺旋杆菌、肠毒性大肠杆菌和细小核糖核酸病毒的疫苗。
18、如权利要求书16所述的组合物，其特征在于，其中初乳与活性物质的重量比大 于2∶1。
19、如权利要求书16所述的组合物，其特征在于，所述的初乳包括取自于分娩后不 超过2天的牛的初乳。
20、如权利要求书16所述的组合物，其特征在于，所述初乳和/或生物活性物质为干 燥的形式，且生物活性物质和初乳在干燥过程之前、之中或之后进行彻底地混合。
21、一种由(a)直接作用于选自幽门螺旋杆菌和大肠菌群的致病微生物的疫苗和(b) 哺乳动物初乳组成的混合物用于制备治疗或预防病人肠道疾病的口服药物的应用。
22、哺乳动物初乳和一种在胃部不稳定的生物活性物质在生产用于治疗或预防肠道疾 病的药物中的应用，所述药物通过口服给药，其特征在于，牛初乳在体外与不稳定的生物 活性物质混合，所述的生物活性物质包含至少一种选自以下组群的物质：酶制剂、口服疫 苗、感染性制剂、用于直接抵抗疾病的抗体和其片断、用于直接抗致病性因素的抗体和其 片断，所述不稳定的生物活性物质缺少和哺乳动物初乳混合的情况下，在37℃的条件下、 在含有0.32％的猪胃蛋白酶的0.03M的NaCl溶液中，以HCl调节pH至1.2，培养60分 钟后，其功能至少损失20％。
技术领域
背景技术
生物活性物质，可能具有强烈的生理效应，往往对于不利的环境，例如哺乳动物胃的 环境、高温环境或高湿度环境，非常敏感。这往往限制了它们的使用，也即意味着，它们 不便于口服使用，也不便于存储，也不便于在暖和的生产线上实施。
生物活性物质可以选自由以下物质组成的群组：生长促进剂、抗肿瘤制剂、口服疫苗、 吸入剂、活的微生物(例如原生生物，诸如乳酸菌)、肽、多肽、核苷酸、聚核苷酸、核 苷、蛋白质、糖蛋白、糖和碳水化合物复合物、抗感染剂、抗菌剂、消毒剂、杀菌剂、抗 抑郁剂、心理活性剂、基因改造的生物体和感染性制剂，所述基因改造的生物体和感染性 制剂用作其它生物活性物质的载体，例如细菌载体(包括大肠杆菌、沙门氏菌、弧菌、乳 酸菌、杆菌、分枝杆菌、志贺氏菌)、病毒载体(包括腺病毒、痘病毒、杆状病毒、疱疹 病毒、肠道病毒、副粘病毒和正粘病毒)、植物载体(包括烟草、土豆、香蕉)、酵母载体、 免疫球蛋白或亲和纯化免疫球蛋白，包括抗疾病和疾病致病剂(例如，幽门螺旋杆菌、大 肠杆菌、杆菌、致病的耶尔森氏菌和过敏原)的抗体和含有上述任何生物活性物质的片断、 衍生物和复合物。
对生物活性物质的功能有害的不利环境例如：高酸环境或高碱环境、含有蛋白水解酶 的环境、会发生脱水的环境、高湿度的环境、高温环境、高压导致变性的环境例如压片机， 和含有DNA酶的环境。
一个特殊的损害生物活性物质功能的不利环境是哺乳动物的胃环境，它含有高酸性条 件，高温、高湿度、高浓度的蛋白水解酶和碳水化合物消化酶。
本发明的一个特殊的应用就是保护生物活性制剂，它们的生物功能在哺乳动物的胃环 境中会受到损害。
现有技术中已经知道有许多用于在哺乳动物胃环境中保持生物功能的方法。这些方法 包括：肠衣包裹、缓冲液保护、福尔马林稳定、添加抑制分泌的药物、将生物活性物质与 膳食相结合以及改变奶牛的免疫化学反应以使其将生物活性物质分泌到初乳中。
Feichel OL和Lippold BC(《国际药理学杂志》，2001年3月23日，216(1-2)：165-169) 建议使用肠衣包裹，包括甲羟基乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯，以提供包 衣来保护哺乳动物胃中活性物质的含量。
Tacket C等(《新英格兰药物杂志》，1986年5月12日，1240-1243)使用碳酸氢钠缓 冲液以降低人体胃中的蛋白水解作用。
Paliwal R和London E(《生物化学》，1996年2月20日，35(7)：2374-2379)描述了 使用福尔马林处理以稳定白喉类毒素的结构。
Asad M等(《生命科学》，2001年11月21日，70(1)：17-24)分别使用后叶催产 素和雷替尼丁来降低哺乳动物胃酸的分泌，以提高胃溃疡治愈率。
McClead和Gregory(《感染与免疫》44：474-478)已经证明：奶牛分泌在初乳中的 特定的蛋白质在胃环境中的稳定性比那些通过替代的方式生产的同等级蛋白所预期的更 高。Abbot在美国专利5260037中使用了这个保持生物活性功能的原理，他在收获牛初乳 之前，先对奶牛进行了免疫处理。免疫处理使得特定的抗体(如直接抗幽门螺旋杆菌)分 泌到了牛初乳(这被称为超免疫初乳)中。
国际专利申请PCT/AU94/00562中也指出：在高压环境下，例如压片机，超免疫牛初 乳在生物功能方面是稳定的。以下的文献也指导了超免疫牛初乳的使用：
·Mitra等，Acta Paediatrica，84：996-101，1995.Hyper immune cow colostrums reduces diarrhea due to rotavirus：a double blind，controlled clinical study.
·Nord等，AIDS，4，581-584，1990，Treatment with bovine hyperimmune colostrums of cryptosporidial diarrhea in AIDS patients.
·Tacket等，New England Journal of Medicine.Ma7 12，1988.Protection by milk immunoglobulin concentrate against oral challenge with enterotoxigenic E.coli.
·Tacket等，American Journal of Tropical Medical Hygiene.47(3)，276-283.1992. Efficacy of Bovine milk immunoglobulin concentrate in preventing illness after Shigella flexeri challenge.
在上述现有技术中，超免疫初乳是生物活性物质的来源，接下来的操作(如果有)包 括除去不需要的组分，如水、脂肪、细胞物质、细菌和乳糖。然而其中没有提及添加初乳 或初乳提取物或初乳组分以增强对处于不利环境中的生物活性物质的功能的保护。
与保持哺乳动物胃环境中的生物活性物质功能的方法相关的问题如下：
使用肠衣包裹的方法不适合用于那些在胃中作用的药物的给药。这特别限制了通过口 服疫苗和/或使用以被动免疫方式直接针对幽门螺旋杆菌的抗体控制幽门螺旋杆菌感染 (导致胃炎的主要原因)。
如果生物活性物质功能的丧失是由于酶(例如，肽酶、淀粉酶)的作用而造成的，则 使用缓冲液以降低哺乳动物胃中的蛋白水解作用的方法是不适合的。这些酶往往与蛋白疗 法和活体生物疗法中功能的丧失相关。而且，常规的缓冲液如碳酸氢钠的使用是不利的。
如果交联反应会破坏底物的结构和功能，则使用福尔马林处理(或其它的交联处理) 来保持处于不利环境下的生物活性功能往往是没有效果的。因为这个原因这种技术很少使 用，除非为了保存表面抗原以刺激免疫反应(例如，Petre等，Developmental Biological Standards，1996；87：125-134所讨论的白喉毒素)。
使用刺激奶牛向牛初乳中分泌生物活性物质的方法具有许多局限性。
有些生物活性物质由奶牛分泌到初乳中是非常困难，甚至是不可能的。
生物活性物质的量不稳定，而这在质量控制期间是不能接受的。
特定生物活性物质的最大量也是很低的，典型的是初乳中免疫球蛋白小于5％。一个 疗程的药片中可接受的最大体积为每片0.5立方厘米(每天2至3片是可接受的)。特定 抗体的低浓度严重限制了疗法的选择。
而且，被免疫的用以生产初乳的奶牛也生产供人们食用的牛奶，这给调节和食物安全 性的问题带来了困难。
此外，初乳只能每年一次从奶牛产犊中收获，这对于后勤和生产成本造成了困难，特 别是对于生物活性组分由奶牛向初乳中分泌的情况。
生物活性物质可以选自由以下物质组成的群组：生长促进剂、抗肿瘤制剂、口服疫苗、 吸入剂、活的微生物(例如原生生物，诸如乳酸菌)、肽、多肽、核苷酸、聚核苷酸、核 苷、蛋白质、糖蛋白、糖和碳水化合物复合物、抗感染剂、抗菌剂、消毒剂、杀菌剂、抗 抑郁剂、心理活性剂、基因改造的生物体和感染性制剂，所述基因改造的生物体和感染性 制剂用作其它生物活性物质的载体，例如细菌载体(包括大肠杆菌、沙门氏菌、弧菌、乳 酸菌、杆菌、分枝杆菌、志贺氏菌)、病毒载体(包括腺病毒、痘病毒、杆状病毒、疱疹 病毒、肠道病毒、副粘病毒和正粘病毒)、植物载体(包括烟草、土豆、香蕉)、酵母载体、 免疫球蛋白或亲和纯化免疫球蛋白，包括抗疾病和疾病致病剂(例如，幽门螺旋杆菌、大 肠杆菌、杆菌、致病的耶尔森氏菌和过敏原)的抗体和含有上述任何生物活性物质的片断、 衍生物和复合物。
对生物活性物质的功能有害的不利环境例如：高酸环境或高碱环境、含有蛋白水解酶 的环境、会发生脱水的环境、高湿度的环境、高温环境、高压导致变性的环境例如压片机， 和含有DNA酶的环境。
一个特殊的损害生物活性物质功能的不利环境是哺乳动物的胃环境，它含有高酸性条 件，高温、高湿度、高浓度的蛋白水解酶和碳水化合物消化酶。
本发明的一个特殊的应用就是保护生物活性制剂，它们的生物功能在哺乳动物的胃环 境中会受到损害。
现有技术中已经知道有许多用于在哺乳动物胃环境中保持生物功能的方法。这些方法 包括：肠衣包裹、缓冲液保护、福尔马林稳定、添加抑制分泌的药物、将生物活性物质与 膳食相结合以及改变奶牛的免疫化学反应以使其将生物活性物质分泌到初乳中。
Feichel OL和Lippold BC(《国际药理学杂志》，2001年3月23日，216(1-2)：165-169) 建议使用肠衣包裹，包括甲羟基乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯，以提供包 衣来保护哺乳动物胃中活性物质的含量。
Tacket C等(《新英格兰药物杂志》，1986年5月12日，1240-1243)使用碳酸氢钠缓 冲液以降低人体胃中的蛋白水解作用。
Paliwal R和London E(《生物化学》，1996年2月20日，35(7)：2374-2379)描述了 使用福尔马林处理以稳定白喉类毒素的结构。
Asad M等(《生命科学》，2001年11月21日，70(1)：17-24)分别使用后叶催产 素和雷替尼丁来降低哺乳动物胃酸的分泌，以提高胃溃疡治愈率。
McClead和Gregory(《感染与免疫》44：474-478)已经证明：奶牛分泌在初乳中的 特定的蛋白质在胃环境中的稳定性比那些通过替代的方式生产的同等级蛋白所预期的更 高。Abbot在美国专利5260037中使用了这个保持生物活性功能的原理，他在收获牛初乳 之前，先对奶牛进行了免疫处理。免疫处理使得特定的抗体(如直接抗幽门螺旋杆菌)分 泌到了牛初乳(这被称为超免疫初乳)中。
国际专利申请PCT/AU94/00562中也指出：在高压环境下，例如压片机，超免疫牛初 乳在生物功能方面是稳定的。以下的文献也指导了超免疫牛初乳的使用：
·Mitra等，Acta Paediatrica，84：996-101，1995.Hyper immune cow colostrums reduces diarrhea due to rotavirus：a double blind，controlled clinical study.
·Nord等，AIDS，4，581-584，1990，Treatment with bovine hyperimmune colostrums of cryptosporidial diarrhea in AIDS patients.
·Tacket等，New England Journal of Medicine.Ma7 12，1988.Protection by milk immunoglobulin concentrate against oral challenge with enterotoxigenic E.coli.
·Tacket等，American Journal of Tropical Medical Hygiene.47(3)，276-283.1992. Efficacy of Bovine milk immunoglobulin concentrate in preventing illness after Shigella flexeri challenge.
在上述现有技术中，超免疫初乳是生物活性物质的来源，接下来的操作(如果有)包 括除去不需要的组分，如水、脂肪、细胞物质、细菌和乳糖。然而其中没有提及添加初乳 或初乳提取物或初乳组分以增强对处于不利环境中的生物活性物质的功能的保护。
与保持哺乳动物胃环境中的生物活性物质功能的方法相关的问题如下：
使用肠衣包裹的方法不适合用于那些在胃中作用的药物的给药。这特别限制了通过口 服疫苗和/或使用以被动免疫方式直接针对幽门螺旋杆菌的抗体控制幽门螺旋杆菌感染 (导致胃炎的主要原因)。
如果生物活性物质功能的丧失是由于酶(例如，肽酶、淀粉酶)的作用而造成的，则 使用缓冲液以降低哺乳动物胃中的蛋白水解作用的方法是不适合的。这些酶往往与蛋白疗 法和活体生物疗法中功能的丧失相关。而且，常规的缓冲液如碳酸氢钠的使用是不利的。
如果交联反应会破坏底物的结构和功能，则使用福尔马林处理(或其它的交联处理) 来保持处于不利环境下的生物活性功能往往是没有效果的。因为这个原因这种技术很少使 用，除非为了保存表面抗原以刺激免疫反应(例如，Petre等，Developmental Biological Standards，1996；87：125-134所讨论的白喉毒素)。
使用刺激奶牛向牛初乳中分泌生物活性物质的方法具有许多局限性。
有些生物活性物质由奶牛分泌到初乳中是非常困难，甚至是不可能的。
生物活性物质的量不稳定，而这在质量控制期间是不能接受的。
特定生物活性物质的最大量也是很低的，典型的是初乳中免疫球蛋白小于5％。一个 疗程的药片中可接受的最大体积为每片0.5立方厘米(每天2至3片是可接受的)。特定 抗体的低浓度严重限制了疗法的选择。
而且，被免疫的用以生产初乳的奶牛也生产供人们食用的牛奶，这给调节和食物安全 性的问题带来了困难。
此外，初乳只能每年一次从奶牛产犊中收获，这对于后勤和生产成本造成了困难，特 别是对于生物活性组分由奶牛向初乳中分泌的情况。
发明内容
我们惊奇地发现，通过将不稳定的生物活性物质与哺乳动物的初乳或其组分在体外 (身体之外)进行混合可以保持生物活性物质的功能。哺乳动物初乳可以是加工形式的哺 乳动物初乳。
相应地，本发明公开了一种药用的不稳定生物活性物质的组合物，该组合物包含不稳 定生物活性物质和哺乳动物初乳的混合物。
不稳定生物活性物质是一种在其使用环境中功能容易损伤的生物活性物质，特别是在 不利的环境下，例如哺乳动物的胃和瘤胃、高温环境或高湿环境。
另一方面，本发明提供了一种使用不稳定生物活性物质(例如在哺乳动物胃或其它不 利条件下功能容易损伤的生物活性物质)的方法，包括制备生物活性物质和哺乳动物初乳 的混合物的方法，以及在生物活性物质通常不稳定的环境，例如胃环境或其它不利环境中 使用该混合物的方法。
优选的，该组合物是口服的。
本发明进一步提供了一种使用不稳定生物活性物质的方法，包括将治疗物质与哺乳动 物初乳或其组分进行混合，所述不稳定生物活性物质在哺乳动物胃或其它不利环境中，以 及在治疗或预防疾病的可吸收的药物的生产中功能容易受到损伤。
尽管许多工人已经注意到，上述组合物比奶牛分泌到初乳中的物质的预期的稳定性更 高，但是，并没有人建议可以将初乳或加工的初乳加入到生物活性物质中，以保护它们在 胃或瘤胃或其它不利环境中的功能。
优选的，所述生物活性物质是一种能够使生物体的生理或药理参数发生可测量的变化 的物质。
在一个特别优选的实施例中，所述生物活性物质是一种抗生素。相应地，本发明提供 了一种抗生素组合物，包括一种抗生素、哺乳动物初乳和选择性的赋型剂。
另一方面，本发明提供了一种原生生物的组合物，包括原生菌如乳酸菌，和哺乳动物 初乳。
本发明优选的使用一种生物活性物质，其在37℃条件下，在含有0.32％的猪胃蛋白 酶溶液的0.03M的NaCl溶液(使用HCl调节pH至1.2)中培养60分钟后显示，功能至 少降低20％。
优选的，哺乳动物初乳是母牛分娩后的头4天内收获的牛初乳；更优选的，是母牛分 娩后的头2天内收获的牛初乳；更优选是母牛分娩后的第一天收获的牛初乳，最优选的， 是母牛分娩后第一次挤奶所收获牛初乳。
这里所使用的术语“初乳”包括初乳、加工的初乳(例如经过加工部分或全部去除一 种或多种脂肪、细胞碎片、乳糖和酪蛋白的初乳)、经干燥的初乳或加工的初乳，比如经 过冷冻干燥、喷雾干燥或其它现有技术已知的方法干燥的初乳或加工的初乳。初乳通常取 自分娩后五天内的哺乳动物例如奶牛。
哺乳动物初乳优选的是经过脱脂工艺加工的，更优选的，是经过脱脂和脱除细胞碎片 工艺加工的，更优选的，是经过脱脂、脱除细胞碎片和脱除盐分、糖类、其它低分子量物 质和部分水的工艺加工的。
初乳和/或生物活性物质可以是干燥的形式。组合物可以是在干燥过程之前、之中或 之后进行彻底地混合。
优选的，生物活性物质和哺乳动物初乳是相互混合的，且混合物是水相混合物，可以 进行干燥，优选的是采用冻干法。
在一个优选的实施例中，生物活性物质和初乳提取物的混合物予以冻干，并且至少一 半重量的冻干物为所添加的初乳或加工的初乳。在另一个优选的实施例中，至少四分之三 重量的冻干物为初乳或加工的初乳。
优选的，从奶牛身上收集的牛初乳含有至少4％(重量百分比)的总蛋白，更优选的 是5％；更优选的是至少8％；更优选的是至少10％。
优选的，从奶牛身上收集的初乳中，IgG占总蛋白的比例至少为10％，更优选的为 20％。
优选的，所述生物活性物质选自以下物质组成的群组：生长促进剂、抗肿瘤制剂、口 服疫苗、吸入剂、活的微生物(例如原生生物，诸如乳酸菌)、肽、多肽、核苷酸、聚核 苷酸、核苷、蛋白质、糖蛋白、糖和碳水化合物复合物、抗感染剂、抗菌剂、消毒剂、杀 菌剂、抗抑郁剂、心理活性剂、基因改造的生物体和感染性制剂，所述基因改造的生物体 和感染性制剂用作其它生物活性物质的载体，例如细菌载体(包括大肠杆菌、沙门氏菌、 弧菌、乳酸菌、杆菌、分枝杆菌、志贺氏菌)、病毒载体(包括腺病毒、痘病毒、杆状病 毒、疱疹病毒、肠道病毒、副粘病毒和正粘病毒)、植物载体(包括烟草、土豆、香蕉)、 酵母载体、免疫球蛋白或亲和纯化免疫球蛋白，包括抗疾病和疾病致病剂(例如，幽门螺 旋杆菌、大肠杆菌、杆菌、致病的耶尔森氏菌和过敏原)的抗体和含有上述任何生物活性 物质的片断、衍生物和复合物。
特别优选的，所述生物活性物包括单克隆或多克隆免疫球蛋白，或嵌合单克隆抗体， 或人源的单克隆抗体，或具有免疫活性片断的树枝状体，或免疫活性片断例如F(ab)和 F(ab)2片断，重组免疫活性片断，或亲和纯化的免疫球蛋白，或它们的免疫活性片断。这 些免疫球蛋白或它们的片断可以结合致病生物体，这致病生物体包括幽门杆菌、肠产毒性 大肠杆菌、鼠疫杆菌、肠道病毒71。
本发明的组合物中的初乳和生物活性物质的比例取决于活性物质的性质，以及其对胃 环境的敏感程度。典型的初乳与活性物质的重量比是大于0.5∶1，更好的是大于2∶1， 更好的是大于5∶1。所加入的初乳组分的上限受到治疗物质能够方便地给药的实际限量 的限制。
本发明的组合物的给药形式可以是如胶囊、粉末压片的片剂、喷剂、糖浆、液体或其 它现有技术已知的形式。组合物可以进一步包括适合于肠胃使用的载体或赋型剂。载体和 赋型剂的例子包括：硅土、滑石、二氧化钛、矾土、淀粉、高岭土、粉末状的纤维素、微 晶纤维素、支链淀粉N、蔗糖、乳糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、羟基丙基纤维素、甲基 纤维素、羟基乙基纤维素、羧甲基纤维素、柠檬酸、碳酸氢钠、硬脂酸镁、虫胶、醋酸纤 维素、醋酸十六烷酯、枸橼酸三乙酯、聚乙二醇。
在另一个特定的优选实施例中，生物活性物质包括免疫原性蛋白质、糖蛋白或疫苗组 分或表达疫苗组分的生物体。疫苗可以是针对致病生物体，例如幽门螺杆菌、肠产毒性大 肠杆菌、鼠疫杆菌。
在一个特别的优选的实施例中，生物活性物质选自以下群组：
(a)抗致病性生物体幽门螺旋杆菌、肠毒性大肠杆菌(ETEC)、细小核糖核酸病毒， 特别是肠道病毒、轮状病毒、炭疽和鼠疫杆菌的抗体或其片断；
(b)抗幽门螺旋杆菌、肠毒性大肠杆菌、炭疽、鼠疫杆菌所分泌的毒素的抗体或其片 断和抗蓖麻毒的抗体；和
(c)抗幽门螺旋杆菌、肠毒性大肠杆菌、细小核糖核酸病毒，特别是肠道病毒、轮状 病毒、炭疽和鼠疫杆菌的口服疫苗和吸入疫苗。
在一个特定的优选实施例中，本发明提供了一种治疗或预防病人的胃肠疾病的方法， 包括对病人使用一种组合物，该组合物包括(a)直接作用于选自幽门螺杆菌和大肠杆菌的 致病微生物的疫苗和(b)哺乳动物初乳。通常使用足够量的初乳以提高疫苗在胃环境中的 活性。
在另一个特定的优选实施例中，本发明提供了一种治疗或预防病人的胃溃疡或幽门螺 杆菌感染的方法，包括对病人使用一种组合物，该组合物包括一种直接作用于幽门螺杆菌 的结合蛋白并进一步包括哺乳动物初乳。
在一个优选实施例中，免疫球蛋白或其片断源于鸡蛋，优选的是以灭活的对抗病原的 疫苗免疫的母鸡的鸡蛋。
本发明对于在胃中起作用的生物活性药物的给药特别有用。例如对于抗幽门螺旋杆菌 感染的药物。然而，当置于模拟胃液或其它不利环境中时，即使是吸入喷剂形式的用于控 制呼吸道病原体的生物活性物质，也会丧失活性。初乳或加工初乳可以保护它们以免功能 丧失，当生物活性物质以吸入喷剂给药时，这种保护效果预期是有利的。
本发明对于保护生物活性物质防止酶作用引起的蛋白水解和低pH条件引起的蛋白水 解是有用的。
在过去的十年中，原生生物领域发展迅速。原生生物包括有益菌，它们可以彻底驱除 胃肠道中的有害菌。有益菌的消化不良抑制了乳酸菌的存在。并且在澳大利亚，双歧杆菌 是重要的用于市售原生生物的细菌。这些细菌生产的乳酸抑制了在酸性条件下不能迅速繁 殖有害菌。乳酸菌也可以用来生产特定的抗生素。例如嗜酸乳酸菌生产嗜酸菌素，保加利 亚乳酸菌生产保加利亚菌素。双歧杆菌也可以用作原生生物体。据报道，原生生物能够帮 助消化，协助肠的清洁，促进肠的经常性运动，破坏霉菌、病毒和寄生虫，并平衡肠道的 pH。
原生生物用于治疗和预防由于胃肠道中酸的积累和内毒素的产生而引发酸肠综合症 也是有效的。
口服原生生物将导致严重的活性丧失，因为原生生物要经历胃中苛刻的条件。我们发 现，如果按照本发明的方法服用，原生生物的活性能够保持在更高的水平。
原生生物可以含有赋型剂和佐剂，可以是片剂、粉末、胶囊或液体形式。本发明进一 步提供了一种治疗和预防胃肠功能紊乱的方法，包括使用一种由生物活性物质如乳酸菌和 哺乳动物初乳组成的组合物。
细菌的剂量依赖于病人的情况和功能紊乱的性质，但是，典型的是每天最少105CFU 乳酸菌。
本发明对于保持非交联生物活性物质的功能是有效的。
本发明提供了治疗药物的配方，其在以下各个方面显著优于超免疫初乳：
生物活性物质的数量可以控制在严格的限制内。
生物活性物质是独立于初乳制备的，生物活性物质的量不再受制于奶牛免疫活性 物质生产的变化。从质量控制的观点来看，这是非常有利的。
与超免疫初乳可能产生的量相比，在给定体积内可产生的生物活性物质的量能够 提高的倍数大于4。例如，从鸟类的蛋，特别是免疫母鸡的蛋黄，中得到的超免疫免疫球 蛋白可以被亲和纯化，并得到F(ab)2片断。这显著的扩展了治疗的选择。
本发明可以允许生产治疗药而无需破坏供人们食用的奶制品的完整性。例如生物 活性物质可以在实验室制备，而初乳则在正常奶牛身上收获。
牛初乳提取物是药用物品管理局名列上的物品，在澳大利亚作为补充药品使用， 因此以口服治疗方式使用初乳非常方便。
以下结合具体实施例对本发明进行描述。应该明白，这些实施例是用于说明本发明， 并非用于限制本发明的范围。
附图说明
许多所讨论的实施例参考附图中所示的结果，其中：
图1为实施例1中初乳保护的脲酶活性的示意图。
图2为实施例3中初乳保护的抗体活性的示意图。
图3为实施例4中初乳保护的植物乳酸菌存活示意图。
图4为实施例6中初乳保护的红霉素活性的示意图。
图5为实施例7中初乳保护的干酪乳酸菌的存活示意图。
图6为实施例8中初乳保护的霍乱毒素活性的示意图。
图7为实施例9中初乳保护的植物乳酸菌的示意图。
相应地，本发明公开了一种药用的不稳定生物活性物质的组合物，该组合物包含不稳 定生物活性物质和哺乳动物初乳的混合物。
不稳定生物活性物质是一种在其使用环境中功能容易损伤的生物活性物质，特别是在 不利的环境下，例如哺乳动物的胃和瘤胃、高温环境或高湿环境。
另一方面，本发明提供了一种使用不稳定生物活性物质(例如在哺乳动物胃或其它不 利条件下功能容易损伤的生物活性物质)的方法，包括制备生物活性物质和哺乳动物初乳 的混合物的方法，以及在生物活性物质通常不稳定的环境，例如胃环境或其它不利环境中 使用该混合物的方法。
优选的，该组合物是口服的。
本发明进一步提供了一种使用不稳定生物活性物质的方法，包括将治疗物质与哺乳动 物初乳或其组分进行混合，所述不稳定生物活性物质在哺乳动物胃或其它不利环境中，以 及在治疗或预防疾病的可吸收的药物的生产中功能容易受到损伤。
尽管许多工人已经注意到，上述组合物比奶牛分泌到初乳中的物质的预期的稳定性更 高，但是，并没有人建议可以将初乳或加工的初乳加入到生物活性物质中，以保护它们在 胃或瘤胃或其它不利环境中的功能。
优选的，所述生物活性物质是一种能够使生物体的生理或药理参数发生可测量的变化 的物质。
在一个特别优选的实施例中，所述生物活性物质是一种抗生素。相应地，本发明提供 了一种抗生素组合物，包括一种抗生素、哺乳动物初乳和选择性的赋型剂。
另一方面，本发明提供了一种原生生物的组合物，包括原生菌如乳酸菌，和哺乳动物 初乳。
本发明优选的使用一种生物活性物质，其在37℃条件下，在含有0.32％的猪胃蛋白 酶溶液的0.03M的NaCl溶液(使用HCl调节pH至1.2)中培养60分钟后显示，功能至 少降低20％。
优选的，哺乳动物初乳是母牛分娩后的头4天内收获的牛初乳；更优选的，是母牛分 娩后的头2天内收获的牛初乳；更优选是母牛分娩后的第一天收获的牛初乳，最优选的， 是母牛分娩后第一次挤奶所收获牛初乳。
这里所使用的术语“初乳”包括初乳、加工的初乳(例如经过加工部分或全部去除一 种或多种脂肪、细胞碎片、乳糖和酪蛋白的初乳)、经干燥的初乳或加工的初乳，比如经 过冷冻干燥、喷雾干燥或其它现有技术已知的方法干燥的初乳或加工的初乳。初乳通常取 自分娩后五天内的哺乳动物例如奶牛。
哺乳动物初乳优选的是经过脱脂工艺加工的，更优选的，是经过脱脂和脱除细胞碎片 工艺加工的，更优选的，是经过脱脂、脱除细胞碎片和脱除盐分、糖类、其它低分子量物 质和部分水的工艺加工的。
初乳和/或生物活性物质可以是干燥的形式。组合物可以是在干燥过程之前、之中或 之后进行彻底地混合。
优选的，生物活性物质和哺乳动物初乳是相互混合的，且混合物是水相混合物，可以 进行干燥，优选的是采用冻干法。
在一个优选的实施例中，生物活性物质和初乳提取物的混合物予以冻干，并且至少一 半重量的冻干物为所添加的初乳或加工的初乳。在另一个优选的实施例中，至少四分之三 重量的冻干物为初乳或加工的初乳。
优选的，从奶牛身上收集的牛初乳含有至少4％(重量百分比)的总蛋白，更优选的 是5％；更优选的是至少8％；更优选的是至少10％。
优选的，从奶牛身上收集的初乳中，IgG占总蛋白的比例至少为10％，更优选的为 20％。
优选的，所述生物活性物质选自以下物质组成的群组：生长促进剂、抗肿瘤制剂、口 服疫苗、吸入剂、活的微生物(例如原生生物，诸如乳酸菌)、肽、多肽、核苷酸、聚核 苷酸、核苷、蛋白质、糖蛋白、糖和碳水化合物复合物、抗感染剂、抗菌剂、消毒剂、杀 菌剂、抗抑郁剂、心理活性剂、基因改造的生物体和感染性制剂，所述基因改造的生物体 和感染性制剂用作其它生物活性物质的载体，例如细菌载体(包括大肠杆菌、沙门氏菌、 弧菌、乳酸菌、杆菌、分枝杆菌、志贺氏菌)、病毒载体(包括腺病毒、痘病毒、杆状病 毒、疱疹病毒、肠道病毒、副粘病毒和正粘病毒)、植物载体(包括烟草、土豆、香蕉)、 酵母载体、免疫球蛋白或亲和纯化免疫球蛋白，包括抗疾病和疾病致病剂(例如，幽门螺 旋杆菌、大肠杆菌、杆菌、致病的耶尔森氏菌和过敏原)的抗体和含有上述任何生物活性 物质的片断、衍生物和复合物。
特别优选的，所述生物活性物包括单克隆或多克隆免疫球蛋白，或嵌合单克隆抗体， 或人源的单克隆抗体，或具有免疫活性片断的树枝状体，或免疫活性片断例如F(ab)和 F(ab)2片断，重组免疫活性片断，或亲和纯化的免疫球蛋白，或它们的免疫活性片断。这 些免疫球蛋白或它们的片断可以结合致病生物体，这致病生物体包括幽门杆菌、肠产毒性 大肠杆菌、鼠疫杆菌、肠道病毒71。
本发明的组合物中的初乳和生物活性物质的比例取决于活性物质的性质，以及其对胃 环境的敏感程度。典型的初乳与活性物质的重量比是大于0.5∶1，更好的是大于2∶1， 更好的是大于5∶1。所加入的初乳组分的上限受到治疗物质能够方便地给药的实际限量 的限制。
本发明的组合物的给药形式可以是如胶囊、粉末压片的片剂、喷剂、糖浆、液体或其 它现有技术已知的形式。组合物可以进一步包括适合于肠胃使用的载体或赋型剂。载体和 赋型剂的例子包括：硅土、滑石、二氧化钛、矾土、淀粉、高岭土、粉末状的纤维素、微 晶纤维素、支链淀粉N、蔗糖、乳糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、羟基丙基纤维素、甲基 纤维素、羟基乙基纤维素、羧甲基纤维素、柠檬酸、碳酸氢钠、硬脂酸镁、虫胶、醋酸纤 维素、醋酸十六烷酯、枸橼酸三乙酯、聚乙二醇。
在另一个特定的优选实施例中，生物活性物质包括免疫原性蛋白质、糖蛋白或疫苗组 分或表达疫苗组分的生物体。疫苗可以是针对致病生物体，例如幽门螺杆菌、肠产毒性大 肠杆菌、鼠疫杆菌。
在一个特别的优选的实施例中，生物活性物质选自以下群组：
(a)抗致病性生物体幽门螺旋杆菌、肠毒性大肠杆菌(ETEC)、细小核糖核酸病毒， 特别是肠道病毒、轮状病毒、炭疽和鼠疫杆菌的抗体或其片断；
(b)抗幽门螺旋杆菌、肠毒性大肠杆菌、炭疽、鼠疫杆菌所分泌的毒素的抗体或其片 断和抗蓖麻毒的抗体；和
(c)抗幽门螺旋杆菌、肠毒性大肠杆菌、细小核糖核酸病毒，特别是肠道病毒、轮状 病毒、炭疽和鼠疫杆菌的口服疫苗和吸入疫苗。
在一个特定的优选实施例中，本发明提供了一种治疗或预防病人的胃肠疾病的方法， 包括对病人使用一种组合物，该组合物包括(a)直接作用于选自幽门螺杆菌和大肠杆菌的 致病微生物的疫苗和(b)哺乳动物初乳。通常使用足够量的初乳以提高疫苗在胃环境中的 活性。
在另一个特定的优选实施例中，本发明提供了一种治疗或预防病人的胃溃疡或幽门螺 杆菌感染的方法，包括对病人使用一种组合物，该组合物包括一种直接作用于幽门螺杆菌 的结合蛋白并进一步包括哺乳动物初乳。
在一个优选实施例中，免疫球蛋白或其片断源于鸡蛋，优选的是以灭活的对抗病原的 疫苗免疫的母鸡的鸡蛋。
本发明对于在胃中起作用的生物活性药物的给药特别有用。例如对于抗幽门螺旋杆菌 感染的药物。然而，当置于模拟胃液或其它不利环境中时，即使是吸入喷剂形式的用于控 制呼吸道病原体的生物活性物质，也会丧失活性。初乳或加工初乳可以保护它们以免功能 丧失，当生物活性物质以吸入喷剂给药时，这种保护效果预期是有利的。
本发明对于保护生物活性物质防止酶作用引起的蛋白水解和低pH条件引起的蛋白水 解是有用的。
在过去的十年中，原生生物领域发展迅速。原生生物包括有益菌，它们可以彻底驱除 胃肠道中的有害菌。有益菌的消化不良抑制了乳酸菌的存在。并且在澳大利亚，双歧杆菌 是重要的用于市售原生生物的细菌。这些细菌生产的乳酸抑制了在酸性条件下不能迅速繁 殖有害菌。乳酸菌也可以用来生产特定的抗生素。例如嗜酸乳酸菌生产嗜酸菌素，保加利 亚乳酸菌生产保加利亚菌素。双歧杆菌也可以用作原生生物体。据报道，原生生物能够帮 助消化，协助肠的清洁，促进肠的经常性运动，破坏霉菌、病毒和寄生虫，并平衡肠道的 pH。
原生生物用于治疗和预防由于胃肠道中酸的积累和内毒素的产生而引发酸肠综合症 也是有效的。
口服原生生物将导致严重的活性丧失，因为原生生物要经历胃中苛刻的条件。我们发 现，如果按照本发明的方法服用，原生生物的活性能够保持在更高的水平。
原生生物可以含有赋型剂和佐剂，可以是片剂、粉末、胶囊或液体形式。本发明进一 步提供了一种治疗和预防胃肠功能紊乱的方法，包括使用一种由生物活性物质如乳酸菌和 哺乳动物初乳组成的组合物。
细菌的剂量依赖于病人的情况和功能紊乱的性质，但是，典型的是每天最少105CFU 乳酸菌。
本发明对于保持非交联生物活性物质的功能是有效的。
本发明提供了治疗药物的配方，其在以下各个方面显著优于超免疫初乳：
生物活性物质的数量可以控制在严格的限制内。
生物活性物质是独立于初乳制备的，生物活性物质的量不再受制于奶牛免疫活性 物质生产的变化。从质量控制的观点来看，这是非常有利的。
与超免疫初乳可能产生的量相比，在给定体积内可产生的生物活性物质的量能够 提高的倍数大于4。例如，从鸟类的蛋，特别是免疫母鸡的蛋黄，中得到的超免疫免疫球 蛋白可以被亲和纯化，并得到F(ab)2片断。这显著的扩展了治疗的选择。
本发明可以允许生产治疗药而无需破坏供人们食用的奶制品的完整性。例如生物 活性物质可以在实验室制备，而初乳则在正常奶牛身上收获。
牛初乳提取物是药用物品管理局名列上的物品，在澳大利亚作为补充药品使用， 因此以口服治疗方式使用初乳非常方便。
以下结合具体实施例对本发明进行描述。应该明白，这些实施例是用于说明本发明， 并非用于限制本发明的范围。
附图说明
许多所讨论的实施例参考附图中所示的结果，其中：
图1为实施例1中初乳保护的脲酶活性的示意图。
图2为实施例3中初乳保护的抗体活性的示意图。
图3为实施例4中初乳保护的植物乳酸菌存活示意图。
图4为实施例6中初乳保护的红霉素活性的示意图。
图5为实施例7中初乳保护的干酪乳酸菌的存活示意图。
图6为实施例8中初乳保护的霍乱毒素活性的示意图。
图7为实施例9中初乳保护的植物乳酸菌的示意图。
具体实施方式
实施例1以胃环境中初乳保护的酶的活性作为生物活性蛋白保护的例子
介绍：
使用脲酶研究了在胃环境中，牛初乳作为生物活性蛋白活性的保护剂所起的作用。为 了研究初乳的保护特性，分别在有牛初乳和无牛初乳存在的条件下比较了模拟胃液对脲酶 活性的作用。
材料和方法：
试剂
脲酶：以Sigma公司的III型刀豆脲酶(Cat No U-1500)作为酶的来源。将冻干的脲酶 (标示的酶活为16u/mg；在pH7.0和25℃条件下，1u每分钟从尿素释放1.0μmol的氨) 溶解于MilliQ水至浓度为0.3u/μl(约21mg/ml)，冰冻保存备用。
模拟胃液(SGF)：(根据Hilger等2001的方法修改)。在0.03M的NaCl溶液中制备 0.32％的Sigma公司的猪胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液，以HCl调节pH至 1.2。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛，以MilliQ水重新配成300mg/ml贮备。见实施例2关于牛初乳提取物的制备 方法。
以模拟胃液(SGF)处理脲酶
通过将等分的脲酶溶液与等体积的重新配制的初乳或MilliQ水混合，制备培养混合物 一式四份。同时制备对照的初乳和水的混合物(一式两份)。
培养混合物1-4：100μl脲酶+100μlMilliQ水
培养混合物5-8：100μl脲酶+100μl初乳
培养混合物9-10：100μl初乳+100μlMilliQ水
混合物在37℃的水浴中预热5分钟，然后向1，2，5，6和9号试管中加入50μl SGF。 向3，4，7，8和10号试管中加入50μl 0.03M的NaCl以启动模拟实验。样品在37℃培养 15分钟，然后向每个试管中加入0.25体积冷冻的160mM Na2CO3终止反应。然后试管在 Eppendorf离心机5417C中以20,800g的离心力离心3分钟，然后冰冻保存。上清液用于 脲酶的活性测定。
脲酶测定
脲酶活性的测定使用耦合酶测定法以提高灵敏度(对1966年的Kaltwasser和Schlegel 方法的修改)。在这个反应中，脲酶催化尿素的水解：
尿素+H2O+2H+→2NH4++CO2
通过氨产物与谷氨酸脱氢酶的耦合反应进行测定：
2NH4++2α-酮戊二酸+2NADH→2谷氨酸+2NAD++2H2O
这个反应伴随着NADH氧化为NAD的反应。
最终的1ml测试体积中含有在50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中终浓度为1.6mM 的α-酮戊二酸(Beohringer Mannheim公司，Cat No.127 205)，1.5mM NADH(Sigma公 司，Cat No.G-4387)、10mM尿素(Beohringer Mannheim公司、Cat No.100 164)和1mM 的硫化钠(Sigma公司，Cat No.S-4766)。这些试剂在路径长度为1cm的聚苯乙烯池(Sarstedt 公司，Cat No.67.742)中混合，接着在室温下于Beckman DU70记录分光光度计中平衡数 分钟。在加入样品前，使用上述混合物将分光光度计调零。
从每一培养混合物中取10μl上清液样品加入到测试混合物中开始测试。在室温下于 340nm波长每10秒钟记录一次反应率，直至4分钟。反应率通过曲线的线性部分(通常 为反应1-2分钟以后)计算，脲酶活性以每毫克蛋白每分钟水解的尿素的微摩尔数表示。
结果
由上表的结果以及图1所示，将模拟胃液加入至稀释后的脲酶溶液中，导致了酶的不 可逆的变性，随之而来的是活性的丧失。加入模拟胃液后所剩余的酶活性与对照的单独的 初乳(没有脲酶)中的酶活性相当。注：“模拟实验”处理是在实验的处理中使用生理盐 水而不是人工胃液。
相比之下，向脲酶溶液中加入初乳为脲酶提供了保护，使之免受胃蛋白酶和酸的作用。 在初乳存在的条件下，受保护的脲酶保留了约80％的模拟实验处理的脲酶/初乳混合物的 活性。使用这种酶模式，牛初乳被证明能够在模拟胃环境中为蛋白活性提供保护。
参考文献：
Hilger C，Grigioni F，De Beaufort，Michel G，Freilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin，Clin Exp Immunol，123：389-394.
Kaltwasser H and Schelgel HG(1966).NADH-dependent coupled enzyme assay for urease and other ammonia-producing systems.Analytical Biochem，16：132-138.
Scott DR，Weeks D，Hong C，Postius S，Melchers K and Sachs S(1998).The role of internal urease in acid resistance of Helicobacter pylori.Gastroenterology，114：58-70.
实施例2：加工的牛初乳粉末的制备方法
以下的流程图显示了获得初乳以及将其转化为加工的形式的原理。
最优选的未加工初乳是牛奶场的奶牛在产犊以后第一次挤奶所收获的初乳。初乳在农 场以4℃保存，然后保存于-20℃长途运输或直接送至牛奶加工。
初乳粗品被加热至约37℃，然后使用旋转牛奶脱脂器除去脂肪。得到的液体进行巴 氏消毒或用7-10微米的陶瓷过滤系统进行微滤(除去细菌和碎片)。然后将液体进行超滤 (例如使用Abcor 10m2超滤设备)以除去大部分的水、乳糖和电解质，留下高蛋白的浓 缩物。得到的高蛋白浓缩物进行进一步的加工，优选的为冻干(冷冻干燥)或喷雾干燥。
通过上述方法得到具有以下特性的加工的牛初乳粉末。以下所描述的产品属于澳大利 亚药用物品管理局所列的适用于包含在药用物品内的物质。
表观：散粒，浅黄色粉末。
性质：在水中可分散，受潮后有淡淡的牛奶味。
湿度：范围在2-5％m/m AS 2300.1.1(1988)
脂肪：范围在1-4％m/m AS 2300.1.3(1988)
灰分(在550℃条件下)：不大于8％m/m AS 2300.1.5(1988)
总氮含量(TN)：用于报告**AS 2300.1.2(1991)
非蛋白的氮含量(NPN)：用于报告**AS 2300.1.2.2(1988)
纯粹蛋白质：不少于60％m/m(TN-NPN)％×6.38
蛋白质：不少于60％m/m AS 2300.1.2(1991)
乳糖(一水合物)：不大于15％m/m
依据酶解和氧化进行的紫外测定(Boehringer Mannheim)
总免疫球蛋白：不少于20％m/m
放射性免疫扩散测定
(m/m代表组合物的总质量中组分的质量)
微生物限制：符合TGA的指导方针
残留物：重金属农业和兽用化学品
符合奶制品的ANZFA食品标准规则。如没有可适用的食品标准，则使用用于重金属 的BP试验(2ppm，以铅计算)和用于杀虫剂残留的BP要求。
**用于计算纯粹蛋白质的值
‘AS’指的是澳大利亚标准组织系列的‘澳大利亚标准’的文献一在此处指的是用 于奶制品质量和组分测试的标准化的方法。
实施例3：酸/胃蛋白酶处理过程中初乳对抗体活性的保护
使用抗体模型研究了牛初乳作为保护剂对处于胃环境中的蛋白质活性的作用。为了研 究初乳的保护特性，比较了在牛初乳存在和不存在的条件下，模拟胃液对流感病毒特异性 单克隆抗体的生物活性的影响。
材料和方法：
试剂：
流感病毒和特异性单克隆抗体：本研究中所使用的A型流感病毒是Mem71H-BelN (H3N3)。所使用的抗体是Mem71H-BelN特异性IgG2a单克隆(Mab 36/2)，以1∶10稀释 于磷酸盐缓冲液。
模拟胃液(SGF)：(根据2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制 备0.32％的Sigma公司的猪胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液，以HCl调节pH 至1.2。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛，以MilliQ水重新配成300mg/ml贮备。
用模拟胃液处理单克隆抗体36/2
将等分试样的抗体以磷酸缓冲液1∶10稀释，然后与等体积的重新配制的初乳或MilliQ 水进行混合以制备培养混合物。同时制备对照的初乳和水的混合物。
培养混合物1-2：100μl Mab 36/2+100μl MilliQ水
培养混合物3-4：100μl Mab 36/2+100μl初乳
培养混合物5-6：100μl初乳+100μl MilliQ水
混合物在37℃的水浴中预热5分钟，然后向1，3和5号试管中加入50μl的SGF。向 2，4和6号试管中加入50μl 0.03M的NaCl以启动模拟实验。所有样品在37℃培养15分 钟，然后向每个试管中加入0.25体积冷冻的160mM的Na2CO3以终止反应。然后试管在 Eppendorf离心机5415D中以16,100g的离心力离心3分钟，冰冻保存。上清液抗体活性 的测定。
血细胞凝集抑制测试
以血细胞凝集抑制(HI)测试对抗体的活性进行测定。血细胞凝集滴定和HI测试以 96孔U型底的微孔板(Sarstedt Group公司，SA，澳大利亚)和1％(v/v)小鸡红血球按 照标准程序进行。血细胞凝集测试是用来测定用于HI测定的病毒的血细胞凝集单位 (HAU)的数量。每个培养混合物用PBS以1∶3.2进行稀释，这将使得Mab 36/2的起始 的浓度为1∶100。在微孔板上，以一式双孔的方式，对培养混合物进行连续的双倍稀释， 每孔的最终体积为25μl。然后每孔中加入浓度为4HAU的等体积的病毒，在室温下将抗体 和病毒培养30分钟。30分钟后，在每孔中加入25μl的小鸡红血球(1％v/v，于PBS中)， 并培养30分钟。HI滴定浓度作为相应的抑制4HAU的病毒的最高抗体滴定浓度。测试以 一式两孔重复两次。
结果
如上表的结果和图2所示，以模拟胃液处理Mab 36/2，处理后抗体的血细胞凝集抑制 活性降低了6倍。
相比之下，在制备的抗体中加入初乳可以保护抗体免受胃蛋白酶和酸的作用。在初乳 存在的情况下，被保护的抗体显示活性没有降低。
使用这个抗体模型，牛初乳被证明能够保护模拟胃环境中的抗体的活性。
参考文献
Hilger C，Grigioni F，De Beaufort C，Michel G，Freilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin Clin Exp Immunol，123：387-394.
Deliyannis G Jackson D，Dyer w，Bates J，Coulter A，Harling-McNabb L，Brow L，(1998). Immunopotentiation of humoral and cellular responses to inactivated influenza vaccines by two different-adjuvants with potential for human use.vaccine，16：2058-2068.
Anders EM，Hartley C，Jackson D(1990).Bovine and mouse serum βinhibitors of influenza A viruses are mannose-binding lectins.Proc Natl Acad USA，87：4485-4489.
实施例4：在酸/胃蛋白酶处理过程中，初乳对植物乳酸杆菌存活力的保护
介绍
使用乳酸杆菌的活菌平板计数分析，研究了在胃环境中牛初乳对细菌存活的保护作 用。为了研究初乳的保护特性，在牛初乳存在和不存在的条件下比较了模拟胃液对植物乳 酸杆菌的影响。
材料和方法
试剂
植物乳酸杆菌：本研究所使用的植物乳酸杆菌菌株是在原生生物中所使用的菌株，该 菌株取至于维多利亚派克维尔的皇家儿童医院微生物研究室的培养收集物，并根据16S测 序(对核糖体亚基的DNA测序)进行分类。该菌株在马血琼脂(HBA)平板上，在37 ℃条件下于二氧化碳培养箱中培养48至72小时。从HBA平板上挑取至少2个菌落制备 乳酸杆菌接种体，并接种2ml生理盐水以达到与0.5McFarland标准相同的浊度。然后在 所有的处理中使用这个接种体。
模拟胃液(SGF)：(根据2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制 备0.32％的Sigma公司的猪胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液，以HCl调节pH 至1.2。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛并经过辐射处理。以MilliQ水重新配成300mg/ml贮备。
使用模拟胃液处理乳酸杆菌
将等分试样的植物乳酸杆菌接种体与等体积的重新配制的初乳或MilliQ水进行混合 制备培养混合物。同时制备对照的初乳和水的混合物。
培养混合物1-2：100μl植物乳酸杆菌+100μl MilliQ水
培养混合物3-4：100μl植物乳酸杆菌+100μl初乳
培养混合物5-6：100μl初乳+100μl MilliQ水
混合物在37℃的水浴中预热5分钟，然后向1，3和5试管中加入50μl的SGF。向2， 4和6号试管中加入50μl 0.03M的NaCl启动模拟实验。所有样品在37℃培养15分钟， 向每个试管中加入0.25体积的冷冻的160mM的Na2CO3终止反应。
乳酸杆菌活菌平板计数
使用活菌平板计数技术测定处理后的乳酸杆菌的存活情况。处理后立即在生理盐水中 制备10倍稀释的培养混合物。每种稀释物取100μl涂布在一式双份的平板上。平板培养 48小时，计算每个平板上菌落的数量。将稀释系数乘以稀释后悬浮液的cfu/ml的数目， 计算培养混合物中每毫升的菌落形成单位(cfu)的数目。测试以双份重复两次。
结果
如上表的结果和图3所示，以模拟胃液处理乳酸杆菌的接种体，处理后乳酸杆菌的存 活率降低了1000倍。
相比之下，在乳酸杆菌的接种体中加入初乳能够保护细菌免受胃蛋白酶和酸的作用。 在初乳存在的情况下，被保护的乳酸杆菌存活率没有降低。使用这种活菌平板计数技术， 牛初乳被证明能够保护模拟胃环境中原生生物的存活率。
参考文献
Hilger C，Grigioni F，De Beaufort C，Michel G，Freilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin Clin Exp Immunol，123：387-394.
Miles A，Misra S(1938).The estimation of the bactericidal power of the blood.J Hyg，38：732-749.
实施例6：在酸/胃蛋白酶处理过程中，初乳对红霉素活性的保护
介绍
使用抗生素模型研究了牛初乳对处于胃环境中的生物活性分子的活性的保护作用。为 了研究初乳的保护特性，在牛初乳存在和不存在的条件下，比较了模拟胃液对红霉素活性 的影响。
材料和方法
试剂
红霉素：使用Boehringer Mannheim公司的红霉素(C37H57NO13)作为抗生素的来源， 以95％的乙醇溶解红霉素，配成1mg/ml的贮存溶液，于4℃贮存。对于本研究，以MilliQ 水稀释红霉素贮存溶液至100μg/ml，冰冻保存直至使用。
模拟胃液(SGF)：(根据2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制 备0.32％的Sigma公司的猪胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液，以HCl调节pH 至1.2。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛，以MilliQ水重新配成300mg/ml贮备。
以模拟胃液处理红霉素
将等分试样的红霉素与等体积的重新配制的初乳或MilliQ水进行混合制备培养混合 物。同时制备对照的初乳和水的混合物。
培养混合物1-2：100μl红霉素+100μl MilliQ水
培养混合物3-4：100μl红霉素+100μl初乳
培养混合物5-6：100μl初乳+100μl MilliQ水
混合物在37℃的水浴中预热5分钟，然后向1，3和5号试管中加入50μl的SGF。向 2，4和6号试管中加入50μl 0.03M的NaCl启动模拟实验。所有样品在37℃孵育15分钟， 然后向每个试管中加入0.25体积冷冻的160mM的Na2CO3终止反应。试管在Eppendorf 离心机5415D中以16,100g的离心力离心3分钟，冰冻保存。上清液用于红霉素活性的测 定。
红霉素的敏感性测定
使用枯草芽孢杆菌的圆片扩散敏感性实验对红霉素的活性进行测定。从在马血琼脂上 (HBA)培养过夜的培养物上挑取至少2个菌落以制备枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)的接 种体，并接种2ml生理盐水以达到与0.5McFarland标准相同的浊度。使用灭菌的接种针 对需要测试的HBA平板进行划线接种，将接种针蘸入标准溶液中，然后在整个平板的表 面上在三个方向上均匀地划线，以获得均匀的接种。在使用圆片之前，将平板干燥3至5 分钟。
每次处理是以MilliQ水1∶2连续稀释，每个稀释6次。从每一稀释液取20μl加在一 式双份的空白敏感性圆片上(英国汉普郡Oxoid公司产品)。在置于一式双份的平板上之 前，这些圆片至少干燥30分钟。对应于单个处理的六次稀释，每个平板含有六片平均分 隔的圆片。将未处理的红霉素以MilliQ水稀释至与处理样品相同的浓度以作为对照，用以 获得标准曲线。平板在37℃培养16-18小时。
培养16-18小时后，通过测定圆片周围出现的抑菌圈的直径以测定枯草芽孢杆菌对 红霉素的敏感度。这些抑菌圈是由于圆片中的抗生素扩散进入周围的琼脂中而产生。依据 作为对照的未处理的连续稀释的红霉素的抑菌圈的直径，绘制标准曲线。依据测试样品抑 菌圈的直径可以获得处理后的红霉素相对未处理的红霉素的残留活性的百分比。测试一式 双份重复三次。
结果
如上表的结果和图4所示，向100μg/ml的红霉素溶液中加入模拟胃液，导致红霉素 的活性降低92％。
相比之下，向红霉素溶液中添加初乳可以保护红霉素免受胃蛋白酶和酸的作用。在初 乳存在的条件下，被保护的红霉素保留了100％活性，与未处理的空白对照(见图1和图 2)相比，其实际上提高了红霉素的活性。这提高了的活性也可以从模拟实验的红霉素溶 液和初乳得到证明。单独的初乳显示没有背景抗生素活性，所以加入初乳带来的增强的活 性不能解释为初乳中背景红霉素的活性。使用这种抗生素模型，牛初乳被证明出可以在模 拟胃环境中保护抗生素的活性。
参考文献
Hilger C，Grigioni F，De Beaufort C，Michel G，Freilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin Clin Exp Immunol，123：387-394.
Barry AL and Thornsberry C(1991).Susceptibility of tests：diffusion test procedures.In Balos A，Hauser WU， Herman KL，Isenberg HD，and Shadomy HJ.Manual of Clinical Microbiology 5th Edition，American Society for Microbiology，Washington，pp1177-1125.
The British Society for Antimicrobial Chemotherapy(1991)A Guide to Sensitivity Testing.The British Society for Antimicrobial Chemothreapy，San Diego.
实施例7：初乳对处于酸/胃蛋白酶处理过程中的养乐多代田菌存活的保护
介绍
通过使用乳酸菌活菌平板计数测试，研究了牛初乳对于处于胃环境中的原生生物存活 力的保护作用。为了研究初乳的保护作用，在牛初乳存在和不存在的条件下，比较了模拟 胃液对于从Yakult发酵液中分离的养乐多代田菌的影响。
材料和方法
试剂
养乐多代田菌：本研究所使用的养乐多代田菌是从原生生物产品-Yakult中分离得到 的。将该菌株在马血琼脂(HBA)平板上，于37℃条件二氧化碳培养箱中培养48至72 小时。从HBA培养板上挑取至少2个菌落制备乳酸菌接种体，并接种2ml生理盐水以达 到与0.5McFarland标准相同的浊度。然后这个接种体用于所有处理。
模拟胃液(SGF)：(根据2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制 备0.32％的Sigma公司的猪胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液，以HCl调节pH 至1.2。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛，以MilliQ水重新配成300mg/ml贮备。
以模拟胃液处理乳酸菌
将等分试样的养乐多代田菌与等体积的重新配制的初乳或MilliQ水进行混合制备培 养混合物。同时制备对照的初乳和水的混合物。
培养混合物1-2：100μl乳酸菌+100μl MilliQ水
培养混合物3-4：100μl乳酸菌+100μl初乳
培养混合物5-6：100μl初乳+100μl MilliQ水
混合物在37℃的水浴中预热5分钟，然后向1，3和5号试管中加入50μl的SGF。向 2，4和6号试管中加入50μl 0.03M的NaCl启动模拟实验。所有样品在37℃培养15分钟， 然后向每个试管中加入0.25体积冷冻的160mM的Na2CO3终止反应。
乳酸菌活菌平板计数
使用活菌平板计数技术测定处理后的乳酸菌的存活情况。处理后立即在生理盐水中制 备10倍稀释的培养混合物。每种稀释物取100μl涂布在一式双份的平板上。平板培养48 小时，计算每个平板上菌落的数量。将稀释系数乘以稀释后悬浮液的cfu/ml的数目，计算 培养混合物中每毫升的菌落形成单位(cfu)的数目。测试以双份重复两次。
结果
如上表的结果和图5所示，以模拟胃液处理干酪乳酸菌的接种体，处理后乳酸菌的存 活率至少降低了10000倍。
相比之下，在乳酸菌的接种体中加入初乳可以保护原生细菌免受胰蛋白酶和酸的作 用。在初乳存在的情况下，被保护的乳酸菌存活率显示没有降低。使用这种活菌平板计数 技术，牛初乳被证明能够保护模拟胃环境中的原生生物的存活力。
参考文献
Hilger C，Grigioni F，De Beaufort C，Michel G，Freilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin Clin Exp Immunol，123：387-394.
Miles A，Misra S(1938).The estimation of the bactericidal power of the blood.J Hyg，38：732-749.
实施例8：酸/胃蛋白酶处理过程中，初乳对霍乱毒素活性的保护
介绍
通过使用黏膜辅剂，研究了牛初乳对于处于胃环境中的辅剂活性的保护作用。为了研 究初乳的保护作用，在牛初乳存在和不存在的条件下，比较了模拟胃液对于霍乱毒素的活 性的影响。
材料与方法
试剂
霍乱毒素和Y1肾上腺细胞：以Sigma公司的霍乱弧菌的霍乱毒素(Cat No C-8052) 作为辅剂的来源。以MilliQ水将霍乱毒素稀释至3.12μg/ml，冰冻保存直至使用。将Y1 鼠肾上腺细胞以每孔2×104个细胞的浓度接种在96孔微孔板中，孔中的培养基为添加了 10％胎牛血清(FCS)和庆大霉素的DMEM培养基。
模拟胃液(SGF)：(根据2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制 备0.32％的Sigma公司的猪胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液，以HCl调节pH 至1.2。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛，以MilliQ水重新配成300mg/ml贮备。
以模拟胃液处理霍乱毒素
将等分试样的3.12μg/ml的霍乱毒素贮存液与等体积的重新配制的初乳或MilliQ水进 行混合制备培养混合物。同时制备对照的初乳与水的混合物。
培养混合物1-2：100μl霍乱毒素+100μl MilliQ水
培养混合物3-4：100μl霍乱毒素+100μl初乳
培养混合物5-6：100μl初乳+100μl MilliQ水
混合物在37℃的水浴中预热5分钟，然后向1，3和5号试管中加入50μl的SGF。向 2，4和6号试管中加入50μl 0.03M的NaCl启动模拟实验。所有样品在37℃培养15分钟， 然后向每个试管中加入0.25体积冷冻的160mM的Na2CO3终止反应。试管在Eppendorf 离心机5415D中以16,100g的离心力离心3分钟，冰冻保存。上清液过滤除菌后用于霍乱 毒素的活性测定。
Y1肾上腺细胞的生物学测定
使用Y1肾上腺细胞生物学测定法测定霍乱毒素的活性。Y1鼠肾上腺细胞以2×104 个细胞的浓度接种在96孔微孔板中。48小时后，细胞用PBS冲洗三次。生长培养基以含 有1％FCS和庆大霉素(100μl)的DMEM培养基替代，其中含有经过处理的试管的一式 双份的样品，样品在最初的1∶10稀释后，连续地被2倍稀释。霍乱毒素使得Y1肾上腺 细胞从通常的伸展形态转变为更圆的形态。这些变化是浓度依赖型的。细胞培养18小时 后，用相差显微镜检查典型的细胞成圆。测试的终点是最高稀释的样品，其显示的细胞成 圆率超过50％。测试以两份重复两次。以同样的微孔板对起始浓度为10ng/ml的霍乱毒素 的两倍稀释液进行测试，所得到的结果用于检查测定的灵敏度。
结果
如上表的结果和图6所示，以模拟胃液处理霍乱毒素导致霍乱毒素的生物活性完全丧 失。
相比之下，向霍乱毒素中添加初乳可以保护霍乱毒素免受胃蛋白酶和酸的作用。在初 乳存在的情况下，被保护的霍乱毒素没有显示活性的降低。使用这种霍乱毒素测定，牛初 乳被证明能够在模拟胃环境中为黏膜辅剂提供保护。
参考文献
Hilger C，Grigioni F，De Beaufort C，Michel G，Freilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin Clin Exp Immunol，123：387-394.
Taushek M，Gorrell R，Strugnell R，Robins-Browne R(2002).Identification of a protein secretorypathway for the secretion of het-labile enterotoxin by an enterotoxigenic strain of Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA，99：7066-7071.
实施例9：小鼠体内模型中初乳对植物乳酸杆菌的保护
介绍
使用小鼠体内模型研究了在胃环境中牛初乳对原生生物存活力的保护。为了研究初乳 的保护作用，对小鼠喂食含有初乳的植物乳酸杆菌和不含有初乳的植物乳酸杆菌，或作为 阳性对照，喂食碳酸氢钠。
材料与方法
试剂
植物乳酸杆菌：本研究中使用的植物乳酸杆菌菌株是实施例4的菌株。该菌株在牛血 琼脂(HBA)平板上，于37℃、二氧化碳培养箱中培养48至72小时。从至少两块平板 上收获汇合菌苔制备乳酸杆菌接种体，并接种50ml的生理盐水以达到与McFarland 4标 准相同的浊度。将细菌造粒，弃去上清液。然后，细菌颗粒在2.5ml的生理盐水中重新悬 浮。将接种体以1∶1的比例与生物保护物、碳酸氢钠或生理盐水混合以使细菌终浓度为 1×109cfu/ml。
初乳提取物(也被称为生物保护物)：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的 “Gastran”Batch G01)来源于非免疫的奶牛并经紫外线照射。以MilliQ水重新配成20， 40和100mg/ml的样品。
碳酸氢钠：用MilliQ水将碳酸氢钠也重新配成浓度为20，40和100mg/ml。
以乳酸杆菌感染小鼠
在对小鼠接种乳酸杆菌之前，对小鼠禁食3小时以使小鼠的胃为空。以填喂法对小鼠 接种100μl制备的样品，接种量约为1×108cfu乳酸杆菌(每个样品中乳酸杆菌的实际数 量通过活菌平板计数法进行测定)。共7组小鼠，每组3只，对小鼠给予以下样品：
乳酸杆菌+生理盐水
乳酸杆菌+20mg/ml生物保护物
乳酸杆菌+40mg/ml生物保护物
乳酸杆菌+100mg/ml生物保护物
乳酸杆菌+20mg/ml碳酸氢钠
乳酸杆菌+40mg/ml碳酸氢钠
乳酸杆菌+100mg/ml碳酸氢钠
由于实验的原因，小鼠被禁食但是允许随意进食经高压灭菌的水。乳酸杆菌体内保护 作用的测定通过计算3小时后对殖根在大肠的植物乳酸杆菌的数量来实现。在无菌条件 下，割取小鼠的大肠(盲肠和结肠)转入2ml无菌生理盐水中。样品被称量并被匀化，然 后在生理盐水中十倍稀释。从每一稀释液取100μl涂布于乳酸杆菌的选择性培养基上(含 有10μg/ml万古霉素和12.5μg/ml多粘菌素B的马血琼脂)。平板于5％二氧化碳条件下培 养48小时，计算每个平板上的菌落数。由于植物乳酸杆菌的白色不透明的外观，因而很 容易将植物乳酸杆菌从小鼠的通常细菌群落中常见的其它的乳酸杆菌之中分辨出。计算每 克肠体的菌落形成单元(cfu)的数目。
结果
如图7所示，在生物保护物和碳酸氢钠共同存在的条件下，植物乳酸杆菌的存活率增 加了。更高的生物保护物或碳酸氢钠的浓度可以提高存活率，因而具有更好的保护作用。
实施例10：潮湿环境中初乳对植物乳酸杆菌存活的保护
介绍
使用乳酸杆菌活菌平板计数法研究了在不同的湿度条件下，牛初乳提取物对原生生物 存活力的保护作用。为了研究初乳提取物的保护特性，比较了在3种恒定湿度的环境中贮 存14天后的植物乳酸杆菌的存活率。
材料与方法
试剂
植物乳酸杆菌：本研究中使用的植物乳酸杆菌菌株是实施例4的菌株。该菌株在牛血 琼脂(HBA)平板上，于37℃、二氧化碳培养箱中培养48至72小时。从HBA平板上挑 取至少2个菌落制备乳酸杆菌接种体，并接种2ml生理盐水以达到与0.5McFarland标准 相同的浊度。然后接种体在所有处理中使用。
冻干培养基：本实验所使用的冻干培养基(FDM)是衍生于Conrad等的方法(2002)。 使用40％w/v的α，α-海藻糖二水合物(Sigma公司)和5.7％w/v的十水四硼酸钠(Sigma) 于无菌的0.6mM磷酸钾中配制2×浓缩的FDM，pH7.2。开始时，使用固体柠檬酸(Sigma) 调节FDM的pH到6.5，接着使用氢氧化铵(Sigma，29.5％)调节pH至8.5。然后用0.22μm 的膜将这2×浓缩的FDM过滤除菌。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛，重新配制成在2×浓缩的FDM中40mg/ml贮存。
样品制备：冷冻干燥前，制备以下混合物的每种四份的等分样品：
(a)植物乳酸杆菌+2×FDM(0.5ml+0.5ml)
(b)植物乳酸杆菌+2×FDM中的40mg/ml初乳(0.5ml+0.5ml)
将样品混合后于室温下培养1小时，然后使用干冰冷冻。然后样品冻干过夜。
不同湿度下植物乳酸杆菌的稳定性
使用含有不同溶液的密闭的盒子建立三种恒定湿度的容器。LiCl(Sigma)饱和溶液 维持相对湿度(RH)在11.3％(水活度aw＝0.113)。80w/w的丙三醇水溶液(BDH Analar) 产生50％相对湿度(aw＝0.50)和KCl饱和溶液(BDH Analar)维持85％相对湿度(aw ＝0.85)(参考Forney&Brandl 1992和Merck Index)。干燥后，使用研钵和杵轻柔地将每 个样品碾成细粉。每个容器中两个样品(植物乳酸杆菌+FDM和植物乳酸杆菌+FDM中 的初乳)，于敞开的广口瓶中，20℃培养14天。每个混合物的对照样品于20℃贮于闭口 瓶中。
乳酸杆菌的活菌平板计数
使用活菌平板计数技术测定在不同的相对湿度下培养后的乳酸杆菌的存活情况。在含 有0.05％的表面活性剂吐温-20的生理盐水中制备10倍稀释的培养混合物。从每一稀释液 取100μl涂布在两块平板上。平板培养48小时后计算每块平板的菌落数。通过将稀释悬 浮液的cfu/ml数目与稀释系数相乘，得到每毫升培养混合物的菌落形成单元(cfu)数目。 这些计数的结果表示为占对照样品的百分数。
结果
相对湿度 试样 植物乳酸杆菌的存活率 11.3％ 植物乳酸杆菌+FDM+初乳 100％ 11.3％ 植物乳酸杆菌+FDM 99.3％ 50％ 植物乳酸杆菌+FDM+初乳 61.3％ 50％ 植物乳酸杆菌+FDM 36.7％ 85％ 植物乳酸杆菌+FDM+初乳 18.1％ 85％ 植物乳酸杆菌+FDM 8.5％
在暴露于培养基和高湿条件下，牛初乳提取物提高了被冻干的原生生物，植物乳酸杆 菌，的存活率。
参考文献
Conrad PB，Miller DP，Cielenski PR and de Pablo JJ(2000).Stabilization and Preservation of Lactobacillus acidophilus in Saccharide Matrices.Cryobiology 41：17-24.
Fornery CF and Brandl DG(1992).Control of Humidity in Small Controlled-environment Chambers using Glycerol-Water Solutions.HortTechnology Jan/Mar 2(1)：52-54.
Merck Index：Misc-98”saturated Solutions”and Misc-103“Constant Humidity Solutions”.
最后，容易理解，在不脱离本发明此处所描述的要义的基础上，各种其它的变形和/ 或替换是可能的。
介绍：
使用脲酶研究了在胃环境中，牛初乳作为生物活性蛋白活性的保护剂所起的作用。为 了研究初乳的保护特性，分别在有牛初乳和无牛初乳存在的条件下比较了模拟胃液对脲酶 活性的作用。
材料和方法：
试剂
脲酶：以Sigma公司的III型刀豆脲酶(Cat No U-1500)作为酶的来源。将冻干的脲酶 (标示的酶活为16u/mg；在pH7.0和25℃条件下，1u每分钟从尿素释放1.0μmol的氨) 溶解于MilliQ水至浓度为0.3u/μl(约21mg/ml)，冰冻保存备用。
模拟胃液(SGF)：(根据Hilger等2001的方法修改)。在0.03M的NaCl溶液中制备 0.32％的Sigma公司的猪胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液，以HCl调节pH至 1.2。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛，以MilliQ水重新配成300mg/ml贮备。见实施例2关于牛初乳提取物的制备 方法。
以模拟胃液(SGF)处理脲酶
通过将等分的脲酶溶液与等体积的重新配制的初乳或MilliQ水混合，制备培养混合物 一式四份。同时制备对照的初乳和水的混合物(一式两份)。
培养混合物1-4：100μl脲酶+100μlMilliQ水
培养混合物5-8：100μl脲酶+100μl初乳
培养混合物9-10：100μl初乳+100μlMilliQ水
混合物在37℃的水浴中预热5分钟，然后向1，2，5，6和9号试管中加入50μl SGF。 向3，4，7，8和10号试管中加入50μl 0.03M的NaCl以启动模拟实验。样品在37℃培养 15分钟，然后向每个试管中加入0.25体积冷冻的160mM Na2CO3终止反应。然后试管在 Eppendorf离心机5417C中以20,800g的离心力离心3分钟，然后冰冻保存。上清液用于 脲酶的活性测定。
脲酶测定
脲酶活性的测定使用耦合酶测定法以提高灵敏度(对1966年的Kaltwasser和Schlegel 方法的修改)。在这个反应中，脲酶催化尿素的水解：
尿素+H2O+2H+→2NH4++CO2
通过氨产物与谷氨酸脱氢酶的耦合反应进行测定：
2NH4++2α-酮戊二酸+2NADH→2谷氨酸+2NAD++2H2O
这个反应伴随着NADH氧化为NAD的反应。
最终的1ml测试体积中含有在50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中终浓度为1.6mM 的α-酮戊二酸(Beohringer Mannheim公司，Cat No.127 205)，1.5mM NADH(Sigma公 司，Cat No.G-4387)、10mM尿素(Beohringer Mannheim公司、Cat No.100 164)和1mM 的硫化钠(Sigma公司，Cat No.S-4766)。这些试剂在路径长度为1cm的聚苯乙烯池(Sarstedt 公司，Cat No.67.742)中混合，接着在室温下于Beckman DU70记录分光光度计中平衡数 分钟。在加入样品前，使用上述混合物将分光光度计调零。
从每一培养混合物中取10μl上清液样品加入到测试混合物中开始测试。在室温下于 340nm波长每10秒钟记录一次反应率，直至4分钟。反应率通过曲线的线性部分(通常 为反应1-2分钟以后)计算，脲酶活性以每毫克蛋白每分钟水解的尿素的微摩尔数表示。
结果
由上表的结果以及图1所示，将模拟胃液加入至稀释后的脲酶溶液中，导致了酶的不 可逆的变性，随之而来的是活性的丧失。加入模拟胃液后所剩余的酶活性与对照的单独的 初乳(没有脲酶)中的酶活性相当。注：“模拟实验”处理是在实验的处理中使用生理盐 水而不是人工胃液。
相比之下，向脲酶溶液中加入初乳为脲酶提供了保护，使之免受胃蛋白酶和酸的作用。 在初乳存在的条件下，受保护的脲酶保留了约80％的模拟实验处理的脲酶/初乳混合物的 活性。使用这种酶模式，牛初乳被证明能够在模拟胃环境中为蛋白活性提供保护。
参考文献：
Hilger C，Grigioni F，De Beaufort，Michel G，Freilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin，Clin Exp Immunol，123：389-394.
Kaltwasser H and Schelgel HG(1966).NADH-dependent coupled enzyme assay for urease and other ammonia-producing systems.Analytical Biochem，16：132-138.
Scott DR，Weeks D，Hong C，Postius S，Melchers K and Sachs S(1998).The role of internal urease in acid resistance of Helicobacter pylori.Gastroenterology，114：58-70.
实施例2：加工的牛初乳粉末的制备方法
以下的流程图显示了获得初乳以及将其转化为加工的形式的原理。
最优选的未加工初乳是牛奶场的奶牛在产犊以后第一次挤奶所收获的初乳。初乳在农 场以4℃保存，然后保存于-20℃长途运输或直接送至牛奶加工。
初乳粗品被加热至约37℃，然后使用旋转牛奶脱脂器除去脂肪。得到的液体进行巴 氏消毒或用7-10微米的陶瓷过滤系统进行微滤(除去细菌和碎片)。然后将液体进行超滤 (例如使用Abcor 10m2超滤设备)以除去大部分的水、乳糖和电解质，留下高蛋白的浓 缩物。得到的高蛋白浓缩物进行进一步的加工，优选的为冻干(冷冻干燥)或喷雾干燥。
通过上述方法得到具有以下特性的加工的牛初乳粉末。以下所描述的产品属于澳大利 亚药用物品管理局所列的适用于包含在药用物品内的物质。
表观：散粒，浅黄色粉末。
性质：在水中可分散，受潮后有淡淡的牛奶味。
湿度：范围在2-5％m/m AS 2300.1.1(1988)
脂肪：范围在1-4％m/m AS 2300.1.3(1988)
灰分(在550℃条件下)：不大于8％m/m AS 2300.1.5(1988)
总氮含量(TN)：用于报告**AS 2300.1.2(1991)
非蛋白的氮含量(NPN)：用于报告**AS 2300.1.2.2(1988)
纯粹蛋白质：不少于60％m/m(TN-NPN)％×6.38
蛋白质：不少于60％m/m AS 2300.1.2(1991)
乳糖(一水合物)：不大于15％m/m
依据酶解和氧化进行的紫外测定(Boehringer Mannheim)
总免疫球蛋白：不少于20％m/m
放射性免疫扩散测定
(m/m代表组合物的总质量中组分的质量)
微生物限制：符合TGA的指导方针
残留物：重金属农业和兽用化学品
符合奶制品的ANZFA食品标准规则。如没有可适用的食品标准，则使用用于重金属 的BP试验(2ppm，以铅计算)和用于杀虫剂残留的BP要求。
**用于计算纯粹蛋白质的值
‘AS’指的是澳大利亚标准组织系列的‘澳大利亚标准’的文献一在此处指的是用 于奶制品质量和组分测试的标准化的方法。
实施例3：酸/胃蛋白酶处理过程中初乳对抗体活性的保护
使用抗体模型研究了牛初乳作为保护剂对处于胃环境中的蛋白质活性的作用。为了研 究初乳的保护特性，比较了在牛初乳存在和不存在的条件下，模拟胃液对流感病毒特异性 单克隆抗体的生物活性的影响。
材料和方法：
试剂：
流感病毒和特异性单克隆抗体：本研究中所使用的A型流感病毒是Mem71H-BelN (H3N3)。所使用的抗体是Mem71H-BelN特异性IgG2a单克隆(Mab 36/2)，以1∶10稀释 于磷酸盐缓冲液。
模拟胃液(SGF)：(根据2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制 备0.32％的Sigma公司的猪胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液，以HCl调节pH 至1.2。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛，以MilliQ水重新配成300mg/ml贮备。
用模拟胃液处理单克隆抗体36/2
将等分试样的抗体以磷酸缓冲液1∶10稀释，然后与等体积的重新配制的初乳或MilliQ 水进行混合以制备培养混合物。同时制备对照的初乳和水的混合物。
培养混合物1-2：100μl Mab 36/2+100μl MilliQ水
培养混合物3-4：100μl Mab 36/2+100μl初乳
培养混合物5-6：100μl初乳+100μl MilliQ水
混合物在37℃的水浴中预热5分钟，然后向1，3和5号试管中加入50μl的SGF。向 2，4和6号试管中加入50μl 0.03M的NaCl以启动模拟实验。所有样品在37℃培养15分 钟，然后向每个试管中加入0.25体积冷冻的160mM的Na2CO3以终止反应。然后试管在 Eppendorf离心机5415D中以16,100g的离心力离心3分钟，冰冻保存。上清液抗体活性 的测定。
血细胞凝集抑制测试
以血细胞凝集抑制(HI)测试对抗体的活性进行测定。血细胞凝集滴定和HI测试以 96孔U型底的微孔板(Sarstedt Group公司，SA，澳大利亚)和1％(v/v)小鸡红血球按 照标准程序进行。血细胞凝集测试是用来测定用于HI测定的病毒的血细胞凝集单位 (HAU)的数量。每个培养混合物用PBS以1∶3.2进行稀释，这将使得Mab 36/2的起始 的浓度为1∶100。在微孔板上，以一式双孔的方式，对培养混合物进行连续的双倍稀释， 每孔的最终体积为25μl。然后每孔中加入浓度为4HAU的等体积的病毒，在室温下将抗体 和病毒培养30分钟。30分钟后，在每孔中加入25μl的小鸡红血球(1％v/v，于PBS中)， 并培养30分钟。HI滴定浓度作为相应的抑制4HAU的病毒的最高抗体滴定浓度。测试以 一式两孔重复两次。
结果
如上表的结果和图2所示，以模拟胃液处理Mab 36/2，处理后抗体的血细胞凝集抑制 活性降低了6倍。
相比之下，在制备的抗体中加入初乳可以保护抗体免受胃蛋白酶和酸的作用。在初乳 存在的情况下，被保护的抗体显示活性没有降低。
使用这个抗体模型，牛初乳被证明能够保护模拟胃环境中的抗体的活性。
参考文献
Hilger C，Grigioni F，De Beaufort C，Michel G，Freilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin Clin Exp Immunol，123：387-394.
Deliyannis G Jackson D，Dyer w，Bates J，Coulter A，Harling-McNabb L，Brow L，(1998). Immunopotentiation of humoral and cellular responses to inactivated influenza vaccines by two different-adjuvants with potential for human use.vaccine，16：2058-2068.
Anders EM，Hartley C，Jackson D(1990).Bovine and mouse serum βinhibitors of influenza A viruses are mannose-binding lectins.Proc Natl Acad USA，87：4485-4489.
实施例4：在酸/胃蛋白酶处理过程中，初乳对植物乳酸杆菌存活力的保护
介绍
使用乳酸杆菌的活菌平板计数分析，研究了在胃环境中牛初乳对细菌存活的保护作 用。为了研究初乳的保护特性，在牛初乳存在和不存在的条件下比较了模拟胃液对植物乳 酸杆菌的影响。
材料和方法
试剂
植物乳酸杆菌：本研究所使用的植物乳酸杆菌菌株是在原生生物中所使用的菌株，该 菌株取至于维多利亚派克维尔的皇家儿童医院微生物研究室的培养收集物，并根据16S测 序(对核糖体亚基的DNA测序)进行分类。该菌株在马血琼脂(HBA)平板上，在37 ℃条件下于二氧化碳培养箱中培养48至72小时。从HBA平板上挑取至少2个菌落制备 乳酸杆菌接种体，并接种2ml生理盐水以达到与0.5McFarland标准相同的浊度。然后在 所有的处理中使用这个接种体。
模拟胃液(SGF)：(根据2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制 备0.32％的Sigma公司的猪胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液，以HCl调节pH 至1.2。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛并经过辐射处理。以MilliQ水重新配成300mg/ml贮备。
使用模拟胃液处理乳酸杆菌
将等分试样的植物乳酸杆菌接种体与等体积的重新配制的初乳或MilliQ水进行混合 制备培养混合物。同时制备对照的初乳和水的混合物。
培养混合物1-2：100μl植物乳酸杆菌+100μl MilliQ水
培养混合物3-4：100μl植物乳酸杆菌+100μl初乳
培养混合物5-6：100μl初乳+100μl MilliQ水
混合物在37℃的水浴中预热5分钟，然后向1，3和5试管中加入50μl的SGF。向2， 4和6号试管中加入50μl 0.03M的NaCl启动模拟实验。所有样品在37℃培养15分钟， 向每个试管中加入0.25体积的冷冻的160mM的Na2CO3终止反应。
乳酸杆菌活菌平板计数
使用活菌平板计数技术测定处理后的乳酸杆菌的存活情况。处理后立即在生理盐水中 制备10倍稀释的培养混合物。每种稀释物取100μl涂布在一式双份的平板上。平板培养 48小时，计算每个平板上菌落的数量。将稀释系数乘以稀释后悬浮液的cfu/ml的数目， 计算培养混合物中每毫升的菌落形成单位(cfu)的数目。测试以双份重复两次。
结果
如上表的结果和图3所示，以模拟胃液处理乳酸杆菌的接种体，处理后乳酸杆菌的存 活率降低了1000倍。
相比之下，在乳酸杆菌的接种体中加入初乳能够保护细菌免受胃蛋白酶和酸的作用。 在初乳存在的情况下，被保护的乳酸杆菌存活率没有降低。使用这种活菌平板计数技术， 牛初乳被证明能够保护模拟胃环境中原生生物的存活率。
参考文献
Hilger C，Grigioni F，De Beaufort C，Michel G，Freilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin Clin Exp Immunol，123：387-394.
Miles A，Misra S(1938).The estimation of the bactericidal power of the blood.J Hyg，38：732-749.
实施例6：在酸/胃蛋白酶处理过程中，初乳对红霉素活性的保护
介绍
使用抗生素模型研究了牛初乳对处于胃环境中的生物活性分子的活性的保护作用。为 了研究初乳的保护特性，在牛初乳存在和不存在的条件下，比较了模拟胃液对红霉素活性 的影响。
材料和方法
试剂
红霉素：使用Boehringer Mannheim公司的红霉素(C37H57NO13)作为抗生素的来源， 以95％的乙醇溶解红霉素，配成1mg/ml的贮存溶液，于4℃贮存。对于本研究，以MilliQ 水稀释红霉素贮存溶液至100μg/ml，冰冻保存直至使用。
模拟胃液(SGF)：(根据2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制 备0.32％的Sigma公司的猪胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液，以HCl调节pH 至1.2。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛，以MilliQ水重新配成300mg/ml贮备。
以模拟胃液处理红霉素
将等分试样的红霉素与等体积的重新配制的初乳或MilliQ水进行混合制备培养混合 物。同时制备对照的初乳和水的混合物。
培养混合物1-2：100μl红霉素+100μl MilliQ水
培养混合物3-4：100μl红霉素+100μl初乳
培养混合物5-6：100μl初乳+100μl MilliQ水
混合物在37℃的水浴中预热5分钟，然后向1，3和5号试管中加入50μl的SGF。向 2，4和6号试管中加入50μl 0.03M的NaCl启动模拟实验。所有样品在37℃孵育15分钟， 然后向每个试管中加入0.25体积冷冻的160mM的Na2CO3终止反应。试管在Eppendorf 离心机5415D中以16,100g的离心力离心3分钟，冰冻保存。上清液用于红霉素活性的测 定。
红霉素的敏感性测定
使用枯草芽孢杆菌的圆片扩散敏感性实验对红霉素的活性进行测定。从在马血琼脂上 (HBA)培养过夜的培养物上挑取至少2个菌落以制备枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)的接 种体，并接种2ml生理盐水以达到与0.5McFarland标准相同的浊度。使用灭菌的接种针 对需要测试的HBA平板进行划线接种，将接种针蘸入标准溶液中，然后在整个平板的表 面上在三个方向上均匀地划线，以获得均匀的接种。在使用圆片之前，将平板干燥3至5 分钟。
每次处理是以MilliQ水1∶2连续稀释，每个稀释6次。从每一稀释液取20μl加在一 式双份的空白敏感性圆片上(英国汉普郡Oxoid公司产品)。在置于一式双份的平板上之 前，这些圆片至少干燥30分钟。对应于单个处理的六次稀释，每个平板含有六片平均分 隔的圆片。将未处理的红霉素以MilliQ水稀释至与处理样品相同的浓度以作为对照，用以 获得标准曲线。平板在37℃培养16-18小时。
培养16-18小时后，通过测定圆片周围出现的抑菌圈的直径以测定枯草芽孢杆菌对 红霉素的敏感度。这些抑菌圈是由于圆片中的抗生素扩散进入周围的琼脂中而产生。依据 作为对照的未处理的连续稀释的红霉素的抑菌圈的直径，绘制标准曲线。依据测试样品抑 菌圈的直径可以获得处理后的红霉素相对未处理的红霉素的残留活性的百分比。测试一式 双份重复三次。
结果
如上表的结果和图4所示，向100μg/ml的红霉素溶液中加入模拟胃液，导致红霉素 的活性降低92％。
相比之下，向红霉素溶液中添加初乳可以保护红霉素免受胃蛋白酶和酸的作用。在初 乳存在的条件下，被保护的红霉素保留了100％活性，与未处理的空白对照(见图1和图 2)相比，其实际上提高了红霉素的活性。这提高了的活性也可以从模拟实验的红霉素溶 液和初乳得到证明。单独的初乳显示没有背景抗生素活性，所以加入初乳带来的增强的活 性不能解释为初乳中背景红霉素的活性。使用这种抗生素模型，牛初乳被证明出可以在模 拟胃环境中保护抗生素的活性。
参考文献
Hilger C，Grigioni F，De Beaufort C，Michel G，Freilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin Clin Exp Immunol，123：387-394.
Barry AL and Thornsberry C(1991).Susceptibility of tests：diffusion test procedures.In Balos A，Hauser WU， Herman KL，Isenberg HD，and Shadomy HJ.Manual of Clinical Microbiology 5th Edition，American Society for Microbiology，Washington，pp1177-1125.
The British Society for Antimicrobial Chemotherapy(1991)A Guide to Sensitivity Testing.The British Society for Antimicrobial Chemothreapy，San Diego.
实施例7：初乳对处于酸/胃蛋白酶处理过程中的养乐多代田菌存活的保护
介绍
通过使用乳酸菌活菌平板计数测试，研究了牛初乳对于处于胃环境中的原生生物存活 力的保护作用。为了研究初乳的保护作用，在牛初乳存在和不存在的条件下，比较了模拟 胃液对于从Yakult发酵液中分离的养乐多代田菌的影响。
材料和方法
试剂
养乐多代田菌：本研究所使用的养乐多代田菌是从原生生物产品-Yakult中分离得到 的。将该菌株在马血琼脂(HBA)平板上，于37℃条件二氧化碳培养箱中培养48至72 小时。从HBA培养板上挑取至少2个菌落制备乳酸菌接种体，并接种2ml生理盐水以达 到与0.5McFarland标准相同的浊度。然后这个接种体用于所有处理。
模拟胃液(SGF)：(根据2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制 备0.32％的Sigma公司的猪胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液，以HCl调节pH 至1.2。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛，以MilliQ水重新配成300mg/ml贮备。
以模拟胃液处理乳酸菌
将等分试样的养乐多代田菌与等体积的重新配制的初乳或MilliQ水进行混合制备培 养混合物。同时制备对照的初乳和水的混合物。
培养混合物1-2：100μl乳酸菌+100μl MilliQ水
培养混合物3-4：100μl乳酸菌+100μl初乳
培养混合物5-6：100μl初乳+100μl MilliQ水
混合物在37℃的水浴中预热5分钟，然后向1，3和5号试管中加入50μl的SGF。向 2，4和6号试管中加入50μl 0.03M的NaCl启动模拟实验。所有样品在37℃培养15分钟， 然后向每个试管中加入0.25体积冷冻的160mM的Na2CO3终止反应。
乳酸菌活菌平板计数
使用活菌平板计数技术测定处理后的乳酸菌的存活情况。处理后立即在生理盐水中制 备10倍稀释的培养混合物。每种稀释物取100μl涂布在一式双份的平板上。平板培养48 小时，计算每个平板上菌落的数量。将稀释系数乘以稀释后悬浮液的cfu/ml的数目，计算 培养混合物中每毫升的菌落形成单位(cfu)的数目。测试以双份重复两次。
结果
如上表的结果和图5所示，以模拟胃液处理干酪乳酸菌的接种体，处理后乳酸菌的存 活率至少降低了10000倍。
相比之下，在乳酸菌的接种体中加入初乳可以保护原生细菌免受胰蛋白酶和酸的作 用。在初乳存在的情况下，被保护的乳酸菌存活率显示没有降低。使用这种活菌平板计数 技术，牛初乳被证明能够保护模拟胃环境中的原生生物的存活力。
参考文献
Hilger C，Grigioni F，De Beaufort C，Michel G，Freilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin Clin Exp Immunol，123：387-394.
Miles A，Misra S(1938).The estimation of the bactericidal power of the blood.J Hyg，38：732-749.
实施例8：酸/胃蛋白酶处理过程中，初乳对霍乱毒素活性的保护
介绍
通过使用黏膜辅剂，研究了牛初乳对于处于胃环境中的辅剂活性的保护作用。为了研 究初乳的保护作用，在牛初乳存在和不存在的条件下，比较了模拟胃液对于霍乱毒素的活 性的影响。
材料与方法
试剂
霍乱毒素和Y1肾上腺细胞：以Sigma公司的霍乱弧菌的霍乱毒素(Cat No C-8052) 作为辅剂的来源。以MilliQ水将霍乱毒素稀释至3.12μg/ml，冰冻保存直至使用。将Y1 鼠肾上腺细胞以每孔2×104个细胞的浓度接种在96孔微孔板中，孔中的培养基为添加了 10％胎牛血清(FCS)和庆大霉素的DMEM培养基。
模拟胃液(SGF)：(根据2001年Hilger等人的方法修改)在0.03M的NaCl溶液中制 备0.32％的Sigma公司的猪胃蛋白酶(Cat No P-7012源自胃粘膜)溶液，以HCl调节pH 至1.2。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛，以MilliQ水重新配成300mg/ml贮备。
以模拟胃液处理霍乱毒素
将等分试样的3.12μg/ml的霍乱毒素贮存液与等体积的重新配制的初乳或MilliQ水进 行混合制备培养混合物。同时制备对照的初乳与水的混合物。
培养混合物1-2：100μl霍乱毒素+100μl MilliQ水
培养混合物3-4：100μl霍乱毒素+100μl初乳
培养混合物5-6：100μl初乳+100μl MilliQ水
混合物在37℃的水浴中预热5分钟，然后向1，3和5号试管中加入50μl的SGF。向 2，4和6号试管中加入50μl 0.03M的NaCl启动模拟实验。所有样品在37℃培养15分钟， 然后向每个试管中加入0.25体积冷冻的160mM的Na2CO3终止反应。试管在Eppendorf 离心机5415D中以16,100g的离心力离心3分钟，冰冻保存。上清液过滤除菌后用于霍乱 毒素的活性测定。
Y1肾上腺细胞的生物学测定
使用Y1肾上腺细胞生物学测定法测定霍乱毒素的活性。Y1鼠肾上腺细胞以2×104 个细胞的浓度接种在96孔微孔板中。48小时后，细胞用PBS冲洗三次。生长培养基以含 有1％FCS和庆大霉素(100μl)的DMEM培养基替代，其中含有经过处理的试管的一式 双份的样品，样品在最初的1∶10稀释后，连续地被2倍稀释。霍乱毒素使得Y1肾上腺 细胞从通常的伸展形态转变为更圆的形态。这些变化是浓度依赖型的。细胞培养18小时 后，用相差显微镜检查典型的细胞成圆。测试的终点是最高稀释的样品，其显示的细胞成 圆率超过50％。测试以两份重复两次。以同样的微孔板对起始浓度为10ng/ml的霍乱毒素 的两倍稀释液进行测试，所得到的结果用于检查测定的灵敏度。
结果
如上表的结果和图6所示，以模拟胃液处理霍乱毒素导致霍乱毒素的生物活性完全丧 失。
相比之下，向霍乱毒素中添加初乳可以保护霍乱毒素免受胃蛋白酶和酸的作用。在初 乳存在的情况下，被保护的霍乱毒素没有显示活性的降低。使用这种霍乱毒素测定，牛初 乳被证明能够在模拟胃环境中为黏膜辅剂提供保护。
参考文献
Hilger C，Grigioni F，De Beaufort C，Michel G，Freilinger J and Hentges F(2001).Differential binding of IgG and IgA antibodies to antigenic determinants of bovine serum albumin Clin Exp Immunol，123：387-394.
Taushek M，Gorrell R，Strugnell R，Robins-Browne R(2002).Identification of a protein secretorypathway for the secretion of het-labile enterotoxin by an enterotoxigenic strain of Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA，99：7066-7071.
实施例9：小鼠体内模型中初乳对植物乳酸杆菌的保护
介绍
使用小鼠体内模型研究了在胃环境中牛初乳对原生生物存活力的保护。为了研究初乳 的保护作用，对小鼠喂食含有初乳的植物乳酸杆菌和不含有初乳的植物乳酸杆菌，或作为 阳性对照，喂食碳酸氢钠。
材料与方法
试剂
植物乳酸杆菌：本研究中使用的植物乳酸杆菌菌株是实施例4的菌株。该菌株在牛血 琼脂(HBA)平板上，于37℃、二氧化碳培养箱中培养48至72小时。从至少两块平板 上收获汇合菌苔制备乳酸杆菌接种体，并接种50ml的生理盐水以达到与McFarland 4标 准相同的浊度。将细菌造粒，弃去上清液。然后，细菌颗粒在2.5ml的生理盐水中重新悬 浮。将接种体以1∶1的比例与生物保护物、碳酸氢钠或生理盐水混合以使细菌终浓度为 1×109cfu/ml。
初乳提取物(也被称为生物保护物)：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的 “Gastran”Batch G01)来源于非免疫的奶牛并经紫外线照射。以MilliQ水重新配成20， 40和100mg/ml的样品。
碳酸氢钠：用MilliQ水将碳酸氢钠也重新配成浓度为20，40和100mg/ml。
以乳酸杆菌感染小鼠
在对小鼠接种乳酸杆菌之前，对小鼠禁食3小时以使小鼠的胃为空。以填喂法对小鼠 接种100μl制备的样品，接种量约为1×108cfu乳酸杆菌(每个样品中乳酸杆菌的实际数 量通过活菌平板计数法进行测定)。共7组小鼠，每组3只，对小鼠给予以下样品：
乳酸杆菌+生理盐水
乳酸杆菌+20mg/ml生物保护物
乳酸杆菌+40mg/ml生物保护物
乳酸杆菌+100mg/ml生物保护物
乳酸杆菌+20mg/ml碳酸氢钠
乳酸杆菌+40mg/ml碳酸氢钠
乳酸杆菌+100mg/ml碳酸氢钠
由于实验的原因，小鼠被禁食但是允许随意进食经高压灭菌的水。乳酸杆菌体内保护 作用的测定通过计算3小时后对殖根在大肠的植物乳酸杆菌的数量来实现。在无菌条件 下，割取小鼠的大肠(盲肠和结肠)转入2ml无菌生理盐水中。样品被称量并被匀化，然 后在生理盐水中十倍稀释。从每一稀释液取100μl涂布于乳酸杆菌的选择性培养基上(含 有10μg/ml万古霉素和12.5μg/ml多粘菌素B的马血琼脂)。平板于5％二氧化碳条件下培 养48小时，计算每个平板上的菌落数。由于植物乳酸杆菌的白色不透明的外观，因而很 容易将植物乳酸杆菌从小鼠的通常细菌群落中常见的其它的乳酸杆菌之中分辨出。计算每 克肠体的菌落形成单元(cfu)的数目。
结果
如图7所示，在生物保护物和碳酸氢钠共同存在的条件下，植物乳酸杆菌的存活率增 加了。更高的生物保护物或碳酸氢钠的浓度可以提高存活率，因而具有更好的保护作用。
实施例10：潮湿环境中初乳对植物乳酸杆菌存活的保护
介绍
使用乳酸杆菌活菌平板计数法研究了在不同的湿度条件下，牛初乳提取物对原生生物 存活力的保护作用。为了研究初乳提取物的保护特性，比较了在3种恒定湿度的环境中贮 存14天后的植物乳酸杆菌的存活率。
材料与方法
试剂
植物乳酸杆菌：本研究中使用的植物乳酸杆菌菌株是实施例4的菌株。该菌株在牛血 琼脂(HBA)平板上，于37℃、二氧化碳培养箱中培养48至72小时。从HBA平板上挑 取至少2个菌落制备乳酸杆菌接种体，并接种2ml生理盐水以达到与0.5McFarland标准 相同的浊度。然后接种体在所有处理中使用。
冻干培养基：本实验所使用的冻干培养基(FDM)是衍生于Conrad等的方法(2002)。 使用40％w/v的α，α-海藻糖二水合物(Sigma公司)和5.7％w/v的十水四硼酸钠(Sigma) 于无菌的0.6mM磷酸钾中配制2×浓缩的FDM，pH7.2。开始时，使用固体柠檬酸(Sigma) 调节FDM的pH到6.5，接着使用氢氧化铵(Sigma，29.5％)调节pH至8.5。然后用0.22μm 的膜将这2×浓缩的FDM过滤除菌。
初乳：脱脂、冻干的牛初乳提取物(Anadis公司的“Gastran”Batch G01)来源于非 免疫的奶牛，重新配制成在2×浓缩的FDM中40mg/ml贮存。
样品制备：冷冻干燥前，制备以下混合物的每种四份的等分样品：
(a)植物乳酸杆菌+2×FDM(0.5ml+0.5ml)
(b)植物乳酸杆菌+2×FDM中的40mg/ml初乳(0.5ml+0.5ml)
将样品混合后于室温下培养1小时，然后使用干冰冷冻。然后样品冻干过夜。
不同湿度下植物乳酸杆菌的稳定性
使用含有不同溶液的密闭的盒子建立三种恒定湿度的容器。LiCl(Sigma)饱和溶液 维持相对湿度(RH)在11.3％(水活度aw＝0.113)。80w/w的丙三醇水溶液(BDH Analar) 产生50％相对湿度(aw＝0.50)和KCl饱和溶液(BDH Analar)维持85％相对湿度(aw ＝0.85)(参考Forney&Brandl 1992和Merck Index)。干燥后，使用研钵和杵轻柔地将每 个样品碾成细粉。每个容器中两个样品(植物乳酸杆菌+FDM和植物乳酸杆菌+FDM中 的初乳)，于敞开的广口瓶中，20℃培养14天。每个混合物的对照样品于20℃贮于闭口 瓶中。
乳酸杆菌的活菌平板计数
使用活菌平板计数技术测定在不同的相对湿度下培养后的乳酸杆菌的存活情况。在含 有0.05％的表面活性剂吐温-20的生理盐水中制备10倍稀释的培养混合物。从每一稀释液 取100μl涂布在两块平板上。平板培养48小时后计算每块平板的菌落数。通过将稀释悬 浮液的cfu/ml数目与稀释系数相乘，得到每毫升培养混合物的菌落形成单元(cfu)数目。 这些计数的结果表示为占对照样品的百分数。
结果
相对湿度 试样 植物乳酸杆菌的存活率 11.3％ 植物乳酸杆菌+FDM+初乳 100％ 11.3％ 植物乳酸杆菌+FDM 99.3％ 50％ 植物乳酸杆菌+FDM+初乳 61.3％ 50％ 植物乳酸杆菌+FDM 36.7％ 85％ 植物乳酸杆菌+FDM+初乳 18.1％ 85％ 植物乳酸杆菌+FDM 8.5％
在暴露于培养基和高湿条件下，牛初乳提取物提高了被冻干的原生生物，植物乳酸杆 菌，的存活率。
参考文献
Conrad PB，Miller DP，Cielenski PR and de Pablo JJ(2000).Stabilization and Preservation of Lactobacillus acidophilus in Saccharide Matrices.Cryobiology 41：17-24.
Fornery CF and Brandl DG(1992).Control of Humidity in Small Controlled-environment Chambers using Glycerol-Water Solutions.HortTechnology Jan/Mar 2(1)：52-54.
Merck Index：Misc-98”saturated Solutions”and Misc-103“Constant Humidity Solutions”.
最后，容易理解，在不脱离本发明此处所描述的要义的基础上，各种其它的变形和/ 或替换是可能的。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种全自动单胃动物仿生消化系统 | 2020-05-12 | 310 |
| 一种全自动单胃动物仿生消化仪 | 2020-05-12 | 936 |
| 具有有机酸和脂肪酸的基质嵌入型组合物 | 2020-05-15 | 821 |
| 一种胃食管喉气管反流动物模型的制备方法 | 2020-05-13 | 741 |
| 一种利用农作物秸秆制备单胃动物能量饲料的方法 | 2020-05-13 | 88 |
| 一种单胃动物用复合微生态制剂及其制备方法 | 2020-05-13 | 197 |
| 单胃动物饲料 | 2020-05-11 | 218 |
| 免疫调节转基因植物及相关方法 | 2020-05-15 | 543 |
| 一种全自动单胃动物仿生消化仪 | 2020-05-13 | 51 |
| 马属动物的胃部投药装置 | 2020-05-13 | 269 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈