一种制备动物脱细胞组织基质材料的方法及其制备的组织
基质材料
技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物组织处理和组织基质材料制备技术领域，具体涉及制备动物脱细胞组织基质材料的方法及其制备的脱细胞组织基质材料。
背景技术
[0002] 人体和许多动物组织器官的细胞外基质有极大的相似性和同源性。由同种异体或异种异体组织器官脱细胞制成的生物基质材料，已经成功地用于临床医学人体组织修补和修复。脱细胞的组织器官基质也广泛地应用于各种组织工程试验和再生医学研究，例如除去动物组织器官的原有细胞成分，在体外通过人
体细胞使具有三维
框架结构的组织器官基质再次细胞化和功能化，最终生产可移植到人体的组织器官。
[0003] 组织器官基质是由各种复杂的结构
蛋白质和功能蛋白质构成的三维立体框架，并含有许多有活性的其他复合物。主要成分包括胶原
纤维、糖蛋白、黏蛋白等，其他成分有
氨基葡聚糖（透明质酸、
硫酸软骨素）等糖类、一些脂质和生长因子。良好的组织器官基质具有合适的生物
力学强度，在植入宿主后，基质材料提供初始的生物力学支持，通过与宿主细胞相互作用来调节细胞的行为（如粘附，迁移，增殖和分化），随着宿主细胞的长入，组织器官基质本身逐步降解和转
化成新的组织。
[0004] 目前，全世界有近三十种组织器官衍生而来的基质材料已被用在组织修复和再生的各种临床医疗中。这些产品的组织器官原料来自人类和多种
哺乳动物的组织，包括血管，
心脏瓣膜，韧带，神经，
皮肤，小肠黏膜，前胃，心包，腹膜，肌
腱和膀胱等。
[0005] 制备组织器官基质的工艺流程十分复杂，包括组织器官的采集、保存、清洗、消毒、脱细胞、降低
抗原性、病毒灭活和终端灭菌等过程。现有的制备组织器官基质的方法有多种，根据其脱细胞的作用原理可分为物理、化学、酶学等方法。最常用的脱细胞方法是物理和化学处理相结合的方法。包括用搅拌或
超声波，机械按摩或加压，冻结和解冻来破坏细胞膜，使细胞成分释放出来，更利于后续的化学
洗涤剂的脱细胞清洗。物理方法本身一般不足以实现完全的脱细胞。酶学处理方法，如某些胰蛋白酶，可调节组织胞外基质的松紧度，切断细胞表面和组织胞外基质的联系。使用不同的工艺流程和方法，细胞去除效率和对组织器官基质的影响或损伤也不一样。组织器官的采集、保存、清洗、消毒和脱细胞处理工艺，除了方法本身直接对组织器官基质的损伤外，也还会影响到随后的加工过程。各项处理会不同程度地影响改变组织器官基质生物化学组成成分，三维立体框架的超微结构和生物力学性能，这些改变会影响宿主对植入基质材料的反应。临床前动物试验和人类临床应用证据表明，各种组织器官基质产品之间在组织修复和再生性能方面的差异很大，制备过程中组织器官基质特性的改变是导致各种产品临床效果差异的最主要原因之一。
发明内容
[0006] 本发明针对
现有技术中存在的上述
缺陷，一方面提供了一种制备动物脱细胞组织基质材料的方法，其包括如下步骤：
[0007] 1、收集动物组织原材料，清洗血液和其它污垢，切割成长、宽和高为所需规格尺寸的组织材料，低温保存；
[0008] 2、缓慢解冻，在含有庆大霉素的生理盐
水中复水；
[0009] 3、组织材料在中度
碱性溶液中消毒灭菌，无菌纯水漂洗，酸碱度调到中性；
[0010] 4、脱细胞，清洗；
[0011] 5、分解动物组织DNA成分，生理盐水漂洗；
[0012] 6、分解动物组织α-Gal抗原，高浓度
氯化钠溶液漂洗，生理盐水漂洗；
[0014] 8、无菌装袋，密封；
[0015] 9、终端灭菌处理。
[0016] 在该方法中，采用酶学方法去除细胞成分、去除α-Gal抗原和增进
支架柔韧性。
[0017] 在本发明的实施方案中，步骤1中的动物组织原材料选自皮肤，真皮，动脉，静脉，胃，软骨，半月板，小肠，大肠，隔膜，肌腱，韧带，神经组织，膀胱，尿道和输尿管。
[0018] 在本发明优选的实施方案中，步骤1中清洗血液和其它污垢采用纯净水，使用物理方法或
超声波进行洗涤。
[0019] 在制备组织基质材料的工艺方法中，涉及猪真皮原料低温保存的步骤，其中降温和升温的速度是非常重要的参数。降升温的速度过快或组织间不均匀，可导致组织局部地区出现微小裂痕，使用时组织基质容易撕裂。
[0020] 在本发明的实施方案中，步骤1中的组织材料优选在平均速率不大于每分钟1.0摄氏度降温至-40摄氏度以下进行保存，更加优选降温速度为每分钟0.5摄氏度。步骤2中低温保存的组织材料在5～12摄氏度环境下缓慢解冻，以避免因升温过快导致组织产生裂痕。待
冰全部溶化后，步骤2中融化的组织材料在每升含有100毫克庆大霉素的生理盐水中复水3～6小时。
[0021] 在本发明一个优选的实施方案中，步骤1中的低温保存为长期保存，其方法是将猪真皮材料平放在一
块面积稍大的
棉纱布、纸张、塑料膜、尼龙网或其它布织品保护层上，将真皮和上述保护层卷成一个多层同心卷或形成真皮和保护层交替的多层
包装形态，放入塑料袋中，密封后放入-80或-40摄氏度冻箱中保存。
[0022] 本发明的制备方法中，涉及猪真皮原料的初始消毒灭菌。现有的方法包括使用
次氯酸钠，过
氧乙酸，双氧水，碘溶液和高浓度氢氧化钠（酸碱度13以上）。这些溶液处理后，组织基质受到不同程度上的破坏，尤其是氢氧化钠、次氯化钠和碘溶液的影响更大。
[0023] 同已有方法中原材料消毒和灭菌技术不同。在本发明的实施方案中，步骤3中所述的中度碱性溶液是酸碱度为10.5—11.5的
碳酸氢钠或氢氧化钠或浓度为0.1%的氢氧化氨溶液，所述的消毒灭菌方法是将复水后的组织材料浸泡在上述中度碱性溶液中，缓慢摇动浸泡24～48小时，避免了组织基质的损伤。
[0024] 在本发明的实施方案中，步骤4中所述的脱细胞方法为经消毒灭菌和漂洗后的组织材料在2.0毫摩尔浓度氯化
钙，2.0毫摩尔浓度氯化镁和每升100毫克庆大霉素的生理盐水中在室温先漂洗1～3小时，然后加入分散酶溶液洗脱细胞。
[0025] 在一个优选的实施方案中，所述的分散酶溶液是中性分散酶溶液，每升含1—20毫摩尔的
氯化钙，1—20毫摩尔氯化镁和50—400单位的分散酶，所述分散酶溶液洗脱细胞的方法是把组织材料浸泡在所述分散酶溶液中，在37摄氏度缓慢摇动浸泡24～36小时。中性分散酶溶液中更加优选每升含2.0毫摩尔的氯化钙，2.0毫摩尔氯化镁和100—200单位的分散酶。
[0026] 在本发明的一个优选实施方案中，步骤4中完成脱细胞之后，进行清洗步骤。所述的清洗包括第一洗涤剂清洗和第二洗涤剂清洗，所述第一洗涤剂溶液是溶于羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液（酸碱度7.0～8.0）中的0.5%聚乙二醇辛基苯基醚，清洗方法是把组织材料浸泡在第一洗涤剂溶液中，在37摄氏度缓慢摇动浸泡12～18小时。所述第二洗涤剂溶液是溶于磷酸缓冲溶液（酸碱度7.2～7.8）中的1.0%脱氧胆酸钠溶液，清洗方法是把组织材料浸泡在二洗涤剂溶液中，在室温缓慢摇动浸泡24～36小时。同时，本发明也可采用其他合适的洗涤剂，如吐温-20、叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基
乙醇和3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸等。
[0027] 在本发明的实施方案中，在第一洗涤剂和第二洗涤剂浸泡后，在进行步骤5之前，采用20mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液（酸碱度7.0～8.0之间）在室温下漂洗三次，每次2～4小时。
[0028] 由于动物组织DNA的存在，组织基质在植入人体后容易引起
炎症反应。除人类和旧世纪猴外，其它哺乳动物的体内都含有由α-1,3-半乳糖残基[Galα(1,3)Gal]的双糖末端的糖蛋白或糖脂组成的α-Gal抗原。猪组织中的α-Gal抗原，会引起免疫排斥反应。消除或克服炎症反应和排斥反应的方法之一是使用特异性的酶学处理去除动物组织基质中DNA和α-Gal抗原。
[0029] 在本发明的实施方案中，步骤5中所述的分解动物组织DNA成分是通过加入脱氧核糖核酸酶溶液完成的，所述的脱氧核糖核酸酶溶液的配方是向每升100mM的三羟甲基氨基甲烷-
盐酸缓冲溶液（酸碱度7.2）中加入2.0毫摩尔浓度的氯化钙，2.0毫摩尔浓度氯化镁和5000酶单位脱氧核糖核酸酶，降解去除动物组织DNA的方法是把组织材料浸泡在上述脱氧核糖核酸酶溶液中，在37摄氏度缓慢摇动处理18～28小时，然后用放入生理盐水在室温漂洗两次，每次1～3小时。
[0030] 在本发明的实施方案中，步骤6中所述的分解动物组织α-Gal抗原是通过加入α-半乳糖苷酶溶液完成的，所述的α-半乳糖苷酶溶液的配方是向每升10mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液（酸碱度7.0～8.0之间）中加入2.0mM的氯化钙，2.0mM氯化镁和400GALU单位的α-半乳糖苷酶，分解动物组织α-Gal抗原的方法是把组织材料浸泡在上述α-半乳糖苷酶溶液中，在37摄氏度缓慢摇洗24～36小时。
[0031] 在制备可移植到人体的组织基质时，有必要去除各种酶的残留。为达到上述目的，在本发明的实施方案中，选用了盐析法进行清洗，步骤6中所述的高浓度氯化钠溶液是2—5%的氯化钠溶液，漂洗方法是把组织材料浸泡在上述氯化钠溶液中，在室温清洗两次，每次
2～4小时。在一个更加优选的实施方案中，高浓度氯化钠溶液优选3%的氯化钠溶液。此外，氯化钠溶液也可用其它中性盐溶液代替，如氯化
钾、氯化镁和氯化锂等。
[0032] 为了进一步增加产品的安全性，在本发明的优选实施方案中，还涉及病毒灭活处理，步骤（7）中所述的病毒灭活
试剂是双氧水和
过氧乙酸，方法是把组织材料浸泡在含有0.01～0.10%双氧水，0.05～0.50%乙酸和0.05～0.50%过氧乙酸的溶液中，在室温中缓慢摇洗2～3小时。在更加优选的方案中，选用含有0.02%双氧水、0.15%乙酸和0.10%过氧乙酸灭活病毒，2～3小时可以减少病毒数目10的6次方以上。双氧水、乙酸和过氧乙酸的浓度可以随细菌数量改变，增加或减少。
[0033] 在本发明的实施方案中，在步骤7的病毒灭活后，在室温下用中性磷酸缓冲液漂洗三次，每次2～4小时，以去除双氧水、乙酸和过氧乙酸的残留。
[0034] 组织产品的终端灭菌处理，常常是对组织材料破坏最大的步骤之一。为此，在本发明的实施方案中，步骤9中采用了低温
辐射进行处理。在本发明优选的实施方案中，在-40摄氏度条件下，采用10—50kGy伽玛射线进行产品的终端灭菌处理，大大减少了对组织材料的破环。在一些优选的实施方案中，
辐射剂量根据组织基质中细菌数量进行改变，增加或减少。在一个更加优选的实施方案中，采用20～30kGy的伽玛射线进行产品的终端灭菌处理。
[0035] 在一些替代性的实施方案中，除辐射终端灭菌方法外，本发明还可以将组织基质冻干，改用环氧乙烷气体进行灭菌。
[0036] 在本发明的一些优选实施方案中，步骤4（酶脱细胞）、步骤5（酶分解DNA）和步骤6（酶分解α-1,3-半乳糖残基抗原）的先后顺序可以根据实际需要进行调整变更。例如，可以先分解α-1,3-半乳糖残基抗原，然后脱细胞和分解动物DNA成分；或者先分解动物DNA，接着分解抗原和最后脱细胞处理。
[0037] 此外，在一些替代的实施方案中，如选用已用遗传工程改良的无α-Gal抗原的动物，只需使用脱氧核糖核酸酶。同时，为了减少不利的对细胞外基质蛋白
水解的作用，处理时对分散酶浓度，
温度和时间要加以监测和优化。在工艺流程中，还可以加入特定的酶
抑制剂，例如用
乙二胺四乙酸，用以抑制分散酶的活性。
[0038] 本发明另一方面还涉及由本发明上述方法制备得到的动物脱细胞组织基质材料，其中采用的动物真皮原材料可以包括带有基膜的真皮，也可以包括除去基膜的真皮。
[0039] 在本发明制备脱细胞组织基质材料的方法中，涉及一系列处理动物皮肤组织和制备组织器官基质的步骤以及多项生物化学溶液及配方。通过上述步骤和溶液所制备得到的真皮组织基质材料，保留了组织细胞外基质原有的基本支架结构、主要生物化学成分和生物力学强度；有效去除了动物组织中会引起人体免疫排异反应的抗原；改进了组织基质的柔韧性、悬垂性和伤口曲面整合性能，制备的动物真皮基质同人体皮肤相近，不会引起组织基质中
胶原蛋白和其他蛋白质交联、降解或变性，脱细胞的组织真皮保有天然真皮组织基质的生物完整性。
附图说明
[0042] B：处理后真皮基质HE染色切片；
[0043] C：新鲜猪真皮α-1,3半乳糖残基抗原免疫化学染色切片；
[0044] D：处理后真皮基质α-1,3半乳糖残基抗原免疫化学染色切片。
[0045] 图2：组织切片分析图。
[0046] A,B,C：I型胶原蛋白免疫化学染色切片；
[0047] D,E,F：III型胶原蛋白免疫化学染色切片；
[0048] A,D：负染；
[0049] B,E：未处理鲜猪真皮正染；
[0050] C,F：处理后组织真皮基质。
[0051] 图3：脱细胞组织基质在终端伽玛射线辐射灭菌后抗胶原蛋白酶水解的特性图。
[0052] 图4：脱细胞组织基质植入大鼠皮下两周后寄主细胞生长进入和新血管形成的HE染色图。
具体实施方式
[0053] 下面通过
实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0054] 实施例1：动物脱细胞组织基质材料的制备及性能检测
[0055] 1、制备
[0056] （1）组织器官的采集和保存
[0057] 从刚屠宰的猪体身上收集新鲜猪皮，临时保存在4摄氏度的
冰箱中。机械拔毛后，取猪皮分层为约1.0毫米厚真皮，在负20摄氏度冰冻保存。
[0058] （2）脱细胞
[0059] 真皮解冻后，先用生理盐水冲洗二次，每次30分钟。冲洗后的猪真皮浸泡在每升含100毫克庆大霉素的盐水溶液中，溶液中另加入2.0毫摩尔浓度的氯化钙，2.0毫摩尔浓度氯化镁和每升150单位的中性分散酶，在37摄氏度处理24小时。
[0060] （3）清洗
[0061] 庆大霉素浸泡后，用0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液清洗真皮16小时。脱细胞清洗后先用生理盐水冲洗二次，每次120分钟。
[0062] （4）分解DNA和去除α-1,3半乳糖残基抗原
[0063] 每升溶液中再加入2.0毫摩尔浓度的氯化钙，2.0毫摩尔浓度氯化镁，5000单位脱氧核糖核酸酶和两粒葛兰素史克比诺药片（含α-半乳糖苷酶），在室温中处理20小时。
[0064] （5）病毒灭活
[0065] 清洗后，用含有0.02%双氧水，0.15%乙酸和0.10%过氧乙酸的溶液杀菌和病毒灭活2小时。
[0066] （6）清洗和保存
[0067] 最后用无菌生理盐水冲洗至无聚乙二醇辛基苯基醚和酶残留。处理后的真皮基质暂时保存在6%的甘油溶液中。
[0068] 2、性能检测
[0069] 测定表明，材料的
抗拉强度为15.0±3.6兆帕斯卡（N=24）；缝线强度为56±13
牛顿（N=24）；每100克湿重真皮基质中含有24.2±2.9克真皮干物质材料（N=15）。差示扫描量热仪分析显示组织基质材料的起始变性温度为58.0±0.4摄氏度（N=5），
焓变值为每克干重61.6±2.1焦
耳（N=5），同真皮原材料中自然态的真皮基质无明显差别，整个工艺过程对真皮基质特性无明显改变和损伤。组织切片分析表明细胞成分（如脱氧核糖核酸DNA）和基质中的α-1,3半乳糖残基抗原去除的干净，具体参见图1。I型和III型胶原蛋白免疫化学染色分析也显示处理工艺对真皮基质中胶原蛋白无损害，具体参见图2。
[0070] 实施例2：清洗和消毒真皮的适宜条件的确定
[0071] 从猪体身上收集新鲜真皮，新鲜猪真皮分别在37摄氏度和酸碱度为10.6，11.5和11.8的氢氧化钠溶液中进行处理。每公斤猪皮4升氢氧化钠溶液，以磷酸缓冲液为对照。
24小时后，测定每毫升溶液中的菌落形成单位。磷酸缓冲液中含有10.3±1.3对数菌落形成单位（LogCFU）（N=3）；酸碱度为10.6，11.5和11.8的溶液中，对数菌落形成单位分别是
2.1±0.1，0和0。可见，中度碱液的消毒和杀菌作用明显。用差示扫描量热仪分析表明，酸碱度11.5以上损害组织基质，组织基质中蛋白质的
稳定性明显下降。高酸碱度对组织基质的损坏还表现在组织基质不可逆的吸涨和硬化。本实施例确定了较为合适的清洗和消毒真皮的条件是调整酸碱度到10.5～11.5之间。
[0072] 实施例3：动物脱细胞组织基质材料的制备及性能检测
[0073] 1、制备
[0074] （1）组织器官的采集和保存
[0075] 从刚屠宰的猪体身上收集新鲜猪皮，临时保存在4摄氏度的冰箱中。机械拔毛后，取猪皮分层为约1.0毫米厚真皮。
[0076] （2）收集和清洗
[0077] 1.0毫米厚的猪真皮在收集清洗后（见实施例一），暂存于负80摄氏度冻箱中。
[0078] （3）脱细胞
[0079] 解冻后用5mM的羟乙基哌嗪乙硫磺
酸溶液（pH7.4）冲洗，加入2.0mM氯化钙和每毫升0.2单位的中性分散酶后，在37摄氏度处理18小时。
[0080] （4）清洗
[0081] 用1.0%的脱氧胆酸钠溶液在37摄氏度清洗20小时。
[0082] （5）分解DNA和α-1,3半乳糖残基抗原
[0083] 用无菌生理盐水冲洗120分钟后，每升溶液中再加入2.0mM的氯化钙和2.0mM氯化镁，4000单位重组脱氧核糖核酸酶和200GALU单位绿色咖啡豆
种子中提取的α-半乳糖苷酶，在37摄氏度处理24小时。
[0084] （6）病毒灭活
[0085] 无菌生理盐水清洗后，用0.05%双氧水，0.30%乙酸和0.20%过氧乙酸杀菌2小时。
[0086] （7）清洗
[0087] 用无菌生理盐水冲洗至无脱氧胆酸钠，重组脱氧核糖核酸酶和α-半乳糖苷酶残留。
[0088] （8）终端灭菌处理
[0089] 处理后的真皮基质保存在含12%甘油的无菌生理盐水溶液中，用25kGy的伽玛射线灭细菌。
[0090] 2、性能检测
[0091] 经带有OO型探针的软硬度仪测定表明，未经处理的猪真皮的柔软度为40±8.6（N=24），脱细胞猪真皮的柔软度为13.0±4.0（N=25），人体真皮的柔软度为14.2±6.1（N=40）。表明相对于未经处理的猪真皮（硬得多），脱细胞处理后的猪真皮基质的柔软度同人体真皮组织在统计上无明显差异。表面本发明的方法改进了组织基质的柔韧性，悬垂性和伤口曲面整合性能。
[0092] 组织切片分析表明，生产的组织基质中的α-1,3半乳糖残基抗原已被干净的去除，染色成阴性，无抗原的表达。用QuantiT-PicoGreen
荧光染料法测定DNA含量，结果表明新鲜猪真皮每克含有约84.0±10.2微克DNA（N=3），清洗消毒后的猪真皮每克含有62.9±9.5微克DNA（N=3），脱细胞处理和清洗后组织基质每克只含有1.9±1.1微克DNA（N=3），动物DNA含量平均减少97.7%。差示扫描量热仪分析显示组织基质材料的起始变性温度为54.7±0.2摄氏度（N=3），焓变值为每克干重59.5±3.1焦耳（N=3）。同猪真皮原材料中自然态的真皮比，起始变性温度只下降3.3摄氏度，焓变值无明显差别，说明整个制备过程（包括终端伽玛射线辐射灭菌）对组织基质特性无明显改变和损伤。
[0093] 用羟脯氨酸法测定组织基质中胶原蛋白的含量，经终端伽玛射线辐射灭菌后的猪皮组织基质含有91.0±3.0%（N=6）的胶原蛋白。用Fastin染色法测定弹性蛋白含量，经终端伽玛射线辐射灭菌后的组织基质含有0.92±0.21%（N=6）的弹性蛋白，同未处理的猪真皮材料比，下降了71.4%。
[0094] 脱细胞组织基质抗胶原蛋白酶水解的特性，可用于研究在终端伽玛射线辐射灭菌后，本发明制备的脱细胞组织基质中胶原蛋白的稳定性。制备脱细胞组织基质放入每毫升含有5个胶原酶单位的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液中（10mM，酸碱度7.5），在37摄氏度中培养长达64小时。结果显示同未处理的猪真皮材料比，用本发明方法制备的脱细胞组织基质在终端伽玛射线辐射灭菌后，抗胶原蛋白酶水解的性能没有改变，具体参见附图3。
[0095] 用本发明方法制备的脱细胞组织基质的再细胞化特性，用大鼠（Rattus norvegicus Lewis）做了动物评估实验。大鼠（（8例）麻醉后，用电动
剪刀剃去背毛，用70％的酒精擦拭手术部位，在背面上下和左右切开个单独的切口，形成小口袋，大小以容纳1Χ1厘米的样品（～1毫米厚）为宜。将组织基质样品植入皮下。手术后，如果大鼠表现出
疼痛的迹象，用丁丙诺啡（0.05毫克/千克）止痛。两周后牺牲大鼠，取出植入的组织基质材料，用10%中性福尔
马林溶液固定。通过组织切片方法来观查大鼠寄主细胞进入和血管生长。结果表明两周内就有大量寄主细胞生长进入组织基质材料，并开始产生新血管，没有观查到不良反应，具体参见附图4。
