一种副干酪乳杆菌及其应用
阅读：1031发布：2020-07-27
专利汇可以提供一种副干酪乳杆菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种副干 酪乳 杆菌及其应用，本 发明 提供的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)L267，保藏号为：CGMCC No.14868，来自于自然 发酵 的 青贮 饲料 中，属于 微 生物 领域。副干酪乳杆菌L267具有对抗胆盐和胃酸侵袭的能 力 ，有产蛋白酶的能力，对大肠杆菌菌群有抑制作用。更可调节免疫反应、适合用于食品、保健品、药品、食品补充剂等产品的制备。乳酸菌组合物可以在育肥猪用饲料中应用。对育肥猪进行饲喂后，以降低料肉比和死亡率，减少出栏天数，减少抗生素的使用。，下面是一种副干酪乳杆菌及其应用专利的具体信息内容。
1.一种副干酪乳杆菌，其特征在于：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)L267，保藏号为：CGMCC No.14868，保藏日期为2017年11月08日，保藏单位：中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心。
2.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌，其特征在于：所述的副干酪乳杆菌L267对胃酸和胆盐有耐受性。
3.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌，其特征在于：所述的副干酪乳杆菌L267有产蛋白酶的能力。
4.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌，其特征在于：所述的副干酪乳杆菌L267对大肠杆菌菌群有抑制作用。
5.一种大肠杆菌抑菌液的制备方法，其特征在于：将置于低温冰柜的如权利要求1所述的副干酪乳杆菌L267放到40～50℃水浴中解冻，在无菌条件下接种到9#液体培养基中，37℃恒温培养15h，活化2～3代；将活化好的副干酪乳杆菌L267发酵液采用低温离心的方法，制备上清液，得到大肠杆菌抑菌液。
6.一种食品，其特征在于，以权利要求1所述的CGMCC No.14868的副干酪乳杆菌进行制备。
7.一种乳酸菌组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.14868的副干酪乳杆菌和可接受的辅料。
8.如权利要求7所述的乳酸菌组合物，其特征在于，该乳酸菌组合物中还包括：嗜酸乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种和干酪乳杆菌；各组分的添加量为：副干酪乳杆菌：嗜酸乳杆菌：
动物双歧杆菌乳亚种：干酪乳杆菌＝2～6：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1。
9.如权利要求7所述的乳酸菌组合物，其特征在于，辅料选自乳糖、干燥淀粉、糊精、环糊精、羧甲基淀粉钠、羧基淀粉丙酸酯、微晶性纤维素、羧甲基纤维素、麦芽糊精、硬脂酸镁。
10.一种如权利要求7所述的乳酸菌组合物在育肥猪用饲料中的应用。
一种副干酪乳杆菌及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 目前，已知乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)是一群生活在机体内益于宿主健康的微生物，它维护人体健康和调节免疫功能的作用已被广泛认可。副干酪乳杆菌能促进机体微生物菌群和酶的平衡以及刺激特异性和非特异性的免疫机制，但当菌体耐酸，耐胆盐能力不足时进不到肠道，就会失去它的作用。
[0003] 现在生活节奏较快，人们通常都会选择见效速度较快的抗生素来提高人体或者畜产品的免疫力。但是抗生素类的频繁使用使得人体或者动物体内的消化道环境发生的变化，自我调节能力差并且微生物菌群失衡，长时间使用只会出现感染和更多潜在危害。因此，在营养研究和畜类繁殖中，人们更希望大力发展对人类和畜类无害的微生物产品。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题在于克服现有技术存在的不足，提供一种提取工艺简单，稳定性高，具有优异的产酸能力，对酸、胆盐有较好的耐受性，对大肠菌群有较强的抑制效果的副干酪乳杆菌，并相应的提供一种利用该副干酪乳杆菌制备的组合物及其应用。
[0005] 本发明一方面提供一种副干酪乳杆菌，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)L267，保藏号为：CGMCC No.14868，保藏日期为2017年11月08日，保藏单位：中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心。
[0006] 进一步，所述的副干酪乳杆菌L267对胃酸和胆盐有耐受性。
[0007] 进一步，所述的副干酪乳杆菌L267有产蛋白酶的能力。
[0008] 进一步，所述的副干酪乳杆菌L267对大肠杆菌菌群有抑制作用。进一步，pheS序列如SEQ ID NO.1所示，16SrRNA序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] 本发明另一方面提供一种大肠杆菌抑菌液的制备方法，将置于低温冰柜的副干酪乳杆菌L267放到40～50℃水浴中解冻，在无菌条件下接种到9#液体培养基中，37℃恒温培养15h，活化2～3代；将活化好的副干酪乳杆菌L267发酵液采用低温离心的方法，制备上清液，得到大肠杆菌抑菌液。
[0010] 本发明还提供一种食品，以CGMCC No.14868的副干酪乳杆菌进行制备。
[0011] 本发明还提供一种乳酸菌组合物，包含保藏编号为CGMCC No.14868的副干酪乳杆菌和可接受的辅料。
[0012] 进一步，该乳酸菌组合物中还包括：嗜酸乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种和干酪乳杆菌；各组分的添加量为：副干酪乳杆菌：嗜酸乳杆菌：动物双歧杆菌乳亚种：干酪乳杆菌＝2～6：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1。
[0014] 本发明还提供一种利用上述乳酸菌组合物在育肥猪用饲料中的应用。可用其对育肥猪进行饲喂，以降低料肉比和死亡率，减少出栏天数，减少抗生素的使用。
[0015] 作为同一技术构思，本发明还提供一种上述副干酪乳杆菌在大肠杆菌抑菌液、食品、食品补充剂、药品、保健品中的应用。
[0016] 本发明的有益效果体现在：
[0017] 1，本发明提供的一种副干酪乳杆菌，从自然发酵的青贮饲料中选育，经鉴定为副干酪乳杆菌；以上发明的得到的副干酪乳杆菌对人体肠胃环境有很好的耐受性，并且可以产蛋白酶帮助消化，发酵有较高的活菌量，减少了发酵成本。
[0018] 2，本发明提供的一种乳酸菌组合物在育肥猪中饲料中的应用，可用其对育肥猪进行饲喂，以降低料肉比和死亡率，减少出栏天数，减少抗生素的使用。
[0019] 3，本发明提供的副干酪乳杆菌L267对抗胆盐和胃酸侵袭的能力，更可调节免疫反应、适合用于食品、保健品、药品、食品补充剂等产品的制备。
[0020] 生物保藏说明
[0021] 分类命名：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)L267于2017年11月08日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.14868。附图说明
[0022] 下面结合附图对本发明做进一步详细的说明。
[0023] 图1是L267在发酵过程中pH的变化曲线图。
[0024] 图2是L267菌体形态示意图。
具体实施方式
[0025] 本发明公开了一种副干酪乳杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述副干酪乳杆菌已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0026] 本发明提供的一株副干酪乳杆菌L267，来自于自然发酵的青贮饲料中。副干酪乳杆菌L267的生理生化特性如下表1所示：
[0027] 表1生理生化特性
[0028]
[0029] 菌体形态如图2所示。
[0030] 发明人针对副干酪乳杆菌L267的产酸速率、耐酸、耐胆盐、大肠杆菌的抑制实验、代谢产物中蛋白酶活力测定实验及育肥猪饲喂做了如下实验：
[0031] 1.副干酪乳杆菌L267的产酸速率-高密度发酵
[0032] 要发挥微生物产品的益生作用，须首先能耐受人体胃肠的消化过程，能抵御胃液和胆汁对其杀灭的作用。Berrada等报导食物在胃中排空的时间是90min，胃内pH值为3.0，最低可达1.3，人体小肠胆汁液浓度在0.03％～0.3％之间。
[0033] 1.1实验材料
[0034] 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)本实验室分离保藏，编号L267。所用的发酵培养基及补料培养基配方如下：
[0035] 发酵培养基(9#培养基)：大豆蛋白胨5.0g～20.0g、牛肉膏5.0g～20.0g、酵母膏5.0g～20.0g、胰蛋白胨5.0g～20.0g、酪蛋白胨5.0g～20.0g、10％番茄汁10ml～100ml、K2HPO4 1.0g～5.0g、柠檬酸二胺1.0g～5.0g、乙酸钠1.0g～5.0g、葡萄糖5.0g～20.0g、麦芽糖5.0g～20.0g、低聚果糖5.0g～20g、Tween 80 0.5ml～2.0ml、MgSO4·7H2O 0.5g～1.0g、MnSO4·4H2O 0.1g～1.0g，用蒸馏水定容至1L，调节pH 5～8，100℃～125℃灭菌5min～
30min。
30min。
[0036] 补料培养基：葡萄糖5％～10％、麦芽糖5％～10％、低聚果糖5％～10％、10％番茄汁2％～5％、低聚果糖5％～10％、大豆蛋白胨5％～10％、牛肉膏5％～10％、酵母膏5％～10％、胰蛋白胨5％～10％、酪蛋白胨5％～10％、柠檬酸二铵2％～5％，配制300ml～800ml，调pH 5～8，100℃～125℃灭菌5min～30min。
[0037] 1.2试验方法
[0038] 1.2.1培养方法
[0040] 1.2.1.2种子培养；按2％的接种量，从活化菌液取适当量，接入装有500ml 9#培养基的1000ml的三角瓶中，37℃静置培养。
[0041] 1.2.1.3发酵培养；按2％的接种量，接入装有25L 9#培养基的30L的发酵罐中，37℃、转速50r/min培养。
[0042] 1.2.1.4补料调酸；于一定的发酵培养时间时(pH低于最适值时)，补料，并往发酵液中加碱，调节pH至6.5，继续培养。
[0043] 1.2.1.5出发酵；当菌株生长到对数期后期或平衡期前期时，将罐温降到20℃左右，并将pH值加碱调至6.5。
[0045] 1.2.2测定方法
[0046] 采用稀释倾注平板计数法检测菌体浓度。
[0047] 1.3结果与分析
[0048] 1.3.1培养过程pH值变化情况如表2所示。
[0049] 表2：1.副干酪乳杆菌L267在发酵过程中pH的变化
[0050]时间 pH
0h 6.86
2h 6.73
3.5h 6.47
5h 5.98
6h 5.74
7h 5.39
7.5h 6.5
10h 5.02
14h 4.61
15h 4.62
0h 6.86
2h 6.73
3.5h 6.47
5h 5.98
6h 5.74
7h 5.39
7.5h 6.5
10h 5.02
14h 4.61
15h 4.62
[0051] pH变化示意图参见附图1。
[0052] 1.3.2各组不同时段活菌数如表3所示。
[0053] 表3冷冻干燥前后活菌数对照
[0054]
[0055] 发酵后菌体通过离心收集，冷冻干燥前后补料与不补料相比，活菌数有所提高；通过镜检补料后菌体形态较好，着色均匀。
[0056] 2.对酸和胆盐的耐受
[0057] 2.1实验材料
[0058] 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)本实验室分离保藏，编号L267。
[0059] 9#培养基。
[0060] 2.2试验方法
[0061] 2.2.1胆盐耐受实验
[0062] 2.2.1.1菌种培养；将菌种于灭菌的9#培养基中37℃培养15h；
[0063] 2.2.1.2胆盐耐受；将活化菌株培养液以2％接种量接入含不同胆盐浓度的9#液体培养基中(胆盐浓度为0.2％、0.3％、0.5％、1.0％、1.6％)，同时以不含胆盐的9#培养液为对照。在37℃培养0h、2h、4h、6h、24h。
[0064] 2.2.1.3平板计数；采用稀释倾注平板计数法检测菌体浓度。
[0065] 2.2.2酸耐受实验
[0066] 2.2.2.1菌种培养；将菌种于灭菌的9#培养基中37℃培养15h。
[0067] 2.2.2.2酸耐受；将活化菌株培养液以2％接种量接入含不同pH值的9#液体培养基中(pH值分别为1.3、2.0、3.0)，同时以pH值为6.5的9#培养液为对照。在37℃培养0min、30min、60min、90min、120min。
[0068] 2.2.2.3平板计数；采用稀释倾注平板计数法检测菌体浓度。
[0069] 2.3结果与分析
[0070] 2.3.1耐胆盐结果
[0071] 副干酪乳杆菌L267对不同胆盐浓度的耐受性如表4所示：
[0072] 表4：耐胆盐结果
[0073]
[0074] 可以看出：盐浓度小于等于0.3％时对其无抑制作用，活菌数不断增加，在0.5％～1.6％的胆盐浓度中生长具有一定的耐受性。
[0075] 2.3.2耐酸结果
[0076] 副干酪乳杆菌L267在不同的酸性培养液中的活菌数变化如表5所示。
[0077] 表5：耐酸结果
[0078]
[0079] 可以看出，在pH＝2.0的条件下，培养2小时仍有大量活菌存在，说明该菌株对酸有很强的耐受性。
[0080] 本发明针对人体及动物肠胃的生理条件从自然发酵的青贮饲料中选育一株可以耐受人体及动物胃酸和胆盐浓度的副干酪乳杆菌，从而可以在人体及动物体内定植，发挥益生作用。同时，该菌株对大肠菌有较好的抑制作用，可起到调节肠道微生物菌群功能。
[0081] 3.对大肠杆菌的抑制
[0082] 3.1实验材料
[0083] 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)本实验室分离保藏，编号L267。大肠杆菌(来自于本实验室)，营养肉汤培养基，9#培养基。
[0084] 3.2实验方法
[0085] 3.2.1菌种活化；取甘油保藏菌种接种至9#液态试管中，37℃静置培养15h，活化2～3代。
[0086] 3.2.2大肠杆菌的活化；将置于冰箱内的大肠杆菌按照2％的接种量转接到液体营养肉汤培养基中，37℃恒温培养12h，活化两代。
[0087] 3.2.3涂布营养琼脂平皿；将活化好的大肠杆菌用涂布法均匀的涂布到营养琼脂平板上，要求涂布时的活菌量在106cfu/ml。
[0088] 3.2.4牛津杯法；将铺好的指示菌的营养琼脂平板自然干燥30min，再在无菌条件下将牛津杯(内径为6mm)均匀放置于平板上，稍微下压，使其与平板培养基接触面无空隙，然后吸取0.2ml发酵上清液于杯中，37℃恒温培养24h，观察抑菌圈的大小，并测定抑菌圈直径。每个样品做三个平行，结果取平均值。对照组在牛津杯中添加9#液体培养基0.2ml，培养条件相同。
[0089] 3.3实验结果
[0090] 实验结果显示：大部分乳杆菌对大肠菌群都有抑制作用，且副干酪乳杆菌L267对大肠杆菌的抑制尤为明显，抑菌圈达到20mm，远大于其他种乳酸菌，具体结果见下表6所示：
[0091] 表6副干酪乳杆菌L267、乳酸菌与大肠杆菌的拮抗试验
[0092]菌种名称 抑菌圈直径(mm)
副干酪乳杆菌L267 20
短双歧杆菌YDB08 16
青春双歧杆菌YDB121 16
青春双歧杆菌YDB155 13
两歧双歧杆菌YDB129 14
干酪乳杆菌YDL194 10
嗜酸乳杆菌YDL211 13
嗜酸乳杆菌YDL126 7
嗜酸乳杆菌YDL165 16
保加利亚乳杆菌YDL177 10
嗜酸乳杆菌YDL194 15
副干酪乳杆菌L267 20
短双歧杆菌YDB08 16
青春双歧杆菌YDB121 16
青春双歧杆菌YDB155 13
两歧双歧杆菌YDB129 14
干酪乳杆菌YDL194 10
嗜酸乳杆菌YDL211 13
嗜酸乳杆菌YDL126 7
嗜酸乳杆菌YDL165 16
保加利亚乳杆菌YDL177 10
嗜酸乳杆菌YDL194 15
[0093] 4.代谢产物中蛋白酶活力测定
[0094] 4.1实验材料
[0096] 4.2实验方法
[0097] 4.2.1酪氨酸标准曲线的制定；
[0098] 配制不同浓度的酪氨酸标准溶液(0、20、40、60、80、100ug/mL)，分别取不同浓度的酪氨酸标准溶液1.00ml，各加0.4mol/ml的碳酸钠溶液5.00ml、福林稀释液1.00ml,置于40℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计分别测定其吸光度OD660(以不含酪氨酸的管为空白)。不同浓度的酪氨酸标准溶液与OD660的变化关系见表7。
[0099] 表7：不同浓度的酪氨酸标准溶液与OD660的变化关系
[0100]酪氨酸浓度(ug/ml) 10 20 30 40 50 60 80
OD660 0.101 0.21 0.308 0.409 0.513 0.625 0.81
OD660 0.101 0.21 0.308 0.409 0.513 0.625 0.81
[0101] 以OD660值为横坐标，以酪氨酸的浓度为纵坐标绘制标准曲线，得标准曲线方程：y＝98.22x-0.3288(R2＝0.9994)
[0102] 4.2.2酶液制备；将37℃恒温发酵18h后的副干酪乳杆菌L267发酵液，于3500转离心20分钟，取上清即为粗酶液。
[0103] 4.2.3酪蛋白预热；将2％酪蛋白放入40℃恒温水域中，预热5分钟。
[0104] 4.2.4酶解反应；取1ml粗酶液，加预热后的酪蛋白1ml，摇匀，并在40℃下精确保温10分钟。
[0105] 4.2.5终止反应；加0.4mol/L三氯乙酸2ml，摇匀后继续水域放置20分钟以沉淀残留蛋白，3500转离心10分钟。取上清液1ml，于40℃下加0.4mol/L碳酸钠溶液5ml和1ml福林酚试剂，保温20分钟。
[0106] 4.2.6比色；在660nm波长下比色，测其吸光度。
[0107] 4.2.7空白对照；空白实验中，加酪蛋白与三氯乙酸的顺序相反。
[0108] 4.2.8计算公式
[0109] 蛋白酶酶活力(U/ml)＝(OD样品—OD空白)×K×4/10×N
[0110] 其中，K＝102.91
[0111] 4——4ml反应液取1ml测定；
[0112] N——酶液稀释倍数；
[0113] 10——反应10分钟；
[0114] 4.3实验结果
[0115] 副干酪乳杆菌L267代谢产物中蛋白酶活力＝5.2U/ml。
[0116] 5.副干酪乳杆菌L267在育肥猪饲喂中的应用。
[0117] 副干酪乳杆菌L267可应用于育肥猪饲喂中。以本发明的副干酪乳杆菌L267为主，和其他益生菌按一定比例进行组配后，加入到育肥猪饲料中，可降低育肥猪的料肉比和死亡率，减少抗生素的使用。其中各益生菌之间的组配比例为：副干酪乳杆菌：嗜酸乳杆菌：动物双歧杆菌乳亚种：干酪乳杆菌＝(2～6):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1)。
[0118] 5.1实验方法
[0119] 选择体重40kg左右的育肥猪20头，随机分成对照组和实验组，每组各10头，进行饲喂实验。其中对照组饲喂基础日粮；试验组饲喂基础日粮+1‰乳酸菌组合物。
[0120] 5.2实验结果
[0121] 试验结果表明，添加1‰的育肥猪专用乳酸菌组合物后：饲料的利用率得到提高，试验组比对照组的料重比降低了13.18％；死亡率降低，试验组比对照组的死亡率降低了87.5％；出栏提前，试验组比对照组出栏天数提前了9天。详细结果见下表8：
[0122] 表8：育肥猪饲喂试验结果
[0123] 试验组 对照组
出栏日龄(天) 168 177
死亡率(％) 2 16
料肉比 2.7:1 3.11:1
出栏日龄(天) 168 177
死亡率(％) 2 16
料肉比 2.7:1 3.11:1
[0124] 由上表8可以看出，育肥猪食用了本发明提供的乳酸菌组合物后，出栏时间有所提前，死亡率降低。说明乳酸菌组合物是一种健康的饲料。
[0125] 综上所述，本发明从自然发酵的青贮饲料中分离得到，经鉴定为副干酪乳杆菌L267。所述的副干酪乳杆菌L267经高密度发酵后有较高的活菌数，减少了发酵成本；对人体肠胃环境有很好的耐受性，并且可以产蛋白酶帮助消化；可在大肠杆菌抑菌液、食品、药品、保健品、食品补充剂中应用；加入到育肥猪饲料中可降低育肥猪的料肉比和死亡率，减少抗生素的使用。
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