结直肠癌的模型
阅读：367发布：2020-05-27
专利汇可以提供结直肠癌的模型专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了一种重演人 疾病 发病机制的 结直肠癌 模型。还提供了生成结直肠癌模型的方法，以及使用该模型来筛选抑制瘤发生的化合物的方法。，下面是结直肠癌的模型专利的具体信息内容。
1.一种啮齿动物，其在它的结肠粘膜表面上包含捐献者瘤发生性细胞植入物，其中植入不导致结肠壁破裂。
2.权利要求1的啮齿动物，其中所述捐献者瘤发生性细胞植入物能够进行穿过结肠壁到达结肠浆膜表面的侵入性生长。
3.权利要求2的啮齿动物，其中所述捐献者瘤发生性细胞植入物的侵入性生长特征在于肠淋巴结，肝，或肺中的转移。
4.权利要求1-3任一项的啮齿动物，其中所述啮齿动物在植入后不展现腹膜腔中可检测到的瘤形成。
5.权利要求1-4任一项的啮齿动物，其中所述捐献者瘤发生性细胞植入物包含癌细胞系的细胞。
6.权利要求5的啮齿动物，其中所述癌细胞系为结直肠癌(CRC)细胞系。
7.权利要求1-6任一项的啮齿动物，其中所述捐献者瘤发生性细胞植入物为完整瘤，或其碎片。
8.权利要求7的啮齿动物，其中所述完整瘤，或其碎片为完整恶性瘤，或其碎片。
9.权利要求7的啮齿动物，其中所述完整瘤，或其碎片为完整良性瘤，或其碎片。
10.权利要求7的啮齿动物，其中所述完整瘤，或其碎片为完整结直肠瘤，或其碎片。
11.权利要求7的啮齿动物，其中所述完整瘤，或其碎片为完整非结直肠瘤，或其碎片。
12.权利要求1-11任一项的啮齿动物，其中所述啮齿动物为小鼠。
13.权利要求12的啮齿动物，其中所述小鼠是免疫缺陷型的。
14.权利要求13的啮齿动物，其中所述免疫缺陷型小鼠为NOD/SCID小鼠或NOD/SCID/白介素-2受体伽马链缺无(NSG)型小鼠。
15.一种用于为结直肠癌生成啮齿动物模型的方法，该方法包括：
(a)外置宿主啮齿动物的结肠粘膜表面；
(b)将一个或多个瘤发生性细胞植入到所述结肠粘膜表面上；并
(c)将包含一个或多个植入的瘤发生性细胞的外置的结肠重插入到所述宿主啮齿动物中，
由此为结直肠癌生成啮齿动物模型。
16.权利要求15的方法，其中所述瘤发生性细胞能够进行穿过结肠壁到达结肠浆膜表面的侵入性生长。
17.权利要求15或16的方法，其中所述结直肠癌的啮齿动物模型特征在于肠淋巴结，肝，或肺中一个或多个植入的瘤发生性细胞的转移。
18.权利要求15-17任一项的方法，其中所述啮齿动物模型在植入后不展现腹膜腔中可检测到的瘤形成。
19.权利要求15-18任一项的方法，其中所述一个或多个瘤发生性细胞为一个或多个捐献者瘤发生性细胞。
20.权利要求15-19任一项的方法，其中所述一个或多个瘤发生性细胞在完整瘤，或其碎片中。
21.权利要求20的方法，其中所述一个或多个瘤发生性细胞来自癌细胞系。
22.权利要求15-21任一项的方法，其中所述啮齿动物为小鼠。
23.一种筛选抑制瘤发生性细胞生长的化合物的方法，该方法包括：
(a)使权利要求1的啮齿动物的捐献者瘤发生性细胞植入物与候选化合物在所述啮齿动物中接触；并
(b)测定所述候选化合物是否抑制所述瘤发生性细胞生长，
由此将所述候选化合物鉴定为抑制瘤发生性细胞生长的化合物。
24.一种筛选抑制瘤发生性细胞生长的辅药的方法，该方法包括：
(a)自权利要求1的啮齿动物的结肠粘膜表面取出捐献者瘤发生性细胞植入物；
(b)对所述啮齿动物施用候选化合物；并
(c)测定所述候选化合物是否抑制瘤发生性细胞生长，
由此将所述候选化合物鉴定为抑制瘤发生性细胞生长的辅药。
25.权利要求23或24的方法，其中测定所述候选化合物是否抑制瘤发生性细胞生长包括评估所述候选化合物引发选自下组的至少一种响应的能力：瘤发生性细胞数目的减少或稳定；瘤尺寸的缩小或稳定；瘤载荷的缩小或稳定；瘤发生性细胞侵入性的降低或稳定；和瘤转移的减少或稳定。
26.权利要求23-25任一项的方法，其中所述候选化合物为小分子，肽，多肽，抗体，抗体片段，或免疫缀合物。
27.权利要求23-26任一项的方法，其中所述捐献者瘤发生性细胞植入物能够进行穿过结肠壁到达结肠浆膜表面的侵入性生长。
28.权利要求23-27任一项的方法，其中所述捐献者瘤发生性细胞植入物的侵入性生长特征在于肠淋巴结，肝，或肺中的转移。
29.权利要求23-28任一项的方法，其中所述啮齿动物在植入后不展现腹膜腔中可检测到的瘤形成。
30.权利要求23-29任一项的方法，其中所述啮齿动物为小鼠。
结直肠癌的模型
发明领域
[0001] 一般而言，本发明涉及结直肠癌(CRC)的一种临床相关模型和使用该模型来筛选抑制瘤发生的化合物的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 结直肠癌(CRC)是全世界第三位最常见的癌和第四位最常见的死因。CRC占所有癌发病率的超过9％。在2013年，估计美国会诊断142,820例新CRC病例且50,830人会死于该病(American Cancer Society:Cancer Facts and Figures 2013.Atlanta,GA,2013)。CRC较差的存活对发病比至少部分由于高百分比的病例是在晚期诊断的。具有晚期转移性CRC的患者的总体五年相对存活处于12.5％(Howlader et al.SEER Cancer Statistics Review,1975-2010.NCI.Bethesda,MD,2013)。
[0004] 虽然已经开发了CRC的异种移植物模型，化学诱导模型，和遗传改造模型(例如小鼠模型)来研究CRC，但是这些模型的瘤未能可再现地转移至区域性肠淋巴结和肝，即与人CRC有关的靶器官。如此，开发能够重演人疾病发病机制的CRC模型的领域存在未满足的需要。这样的CRC模型会是用于测试治疗剂和开发新型治疗策略的有价值的工具。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明提供了一种重演人疾病发病机制的结直肠癌(CRC)模型，以及用于生成和使用该模型的方法。
[0007] 在第一个方面，本发明特征在于一种非人哺乳动物，其在结肠粘膜表面上包括捐献者瘤发生性细胞植入物，其中植入不导致结肠壁破裂(例如开口，撕裂，破裂，或刺穿)(即较深的结肠壁层的完整性得到维持)。在一个实施方案中，所述捐献者瘤发生性细胞植入物能够进行穿过结肠壁到达结肠浆膜表面的侵入性生长(例如导致穿透穿过外肌层的富含胶原IV的基底膜到达浆膜表面的生长)。在另一个实施方案中，所述捐献者瘤发生性细胞植入物的侵入性生长特征在于CRC(例如人CRC)的常见靶器官(即靶转移器官或转移组织)，诸如肠淋巴结，肝，或肺中的转移。在另一个实施方案中，所述非人哺乳动物在植入后不展现腹膜腔中可检测到的瘤形成(例如腹膜癌病)。在另一个实施方案中，所述捐献者瘤发生性细胞植入物包括癌细胞系的细胞。在一个实施方案中，所述癌细胞系为CRC细胞系(例如HCT116)。在另一个实施方案中，所述癌细胞系为非CRC细胞系(例如肺癌细胞系，肝癌细胞系，脑癌细胞系，淋巴结癌细胞系，肾癌细胞系，胃癌细胞系，卵巢癌细胞系，皮肤癌细胞系，胰腺癌细胞系，甲状腺癌细胞系，前列腺癌细胞系，或乳腺癌细胞系，例如MDA-231)。在另一个实施方案中，所述捐献者瘤发生性细胞植入物为完整瘤，或其碎片。在一个实施方案中，所述完整瘤，或其碎片可以是恶性的(例如转移性的，区域侵入性，和/或远程侵入性)。在另一个实施方案中，所述完整瘤，或其碎片可以是良性的(例如非转移和/或局部侵入性)。在一些实施方案中，所述完整瘤，或其碎片为完整CRC瘤，或其碎片。
在其它实施方案中，所述完整瘤，或其碎片为完整非CRC瘤，或其碎片(例如乳腺癌瘤，肺癌瘤，肝癌瘤，脑癌瘤，淋巴结癌瘤，肾癌瘤，胃癌瘤，卵巢癌瘤，皮肤癌瘤，胰腺癌瘤，甲状腺癌瘤，或前列腺癌瘤，或其碎片)。在另一个实施方案中，所述捐献者瘤发生性细胞植入物的细胞的子集(例如5％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，
21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，
60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多的)能够进行侵入性生长。在其它实施方案中，所述捐献者瘤发生性细胞植入物的每一个(即100％)细胞的生长可以特征在于侵入性生长。在另一个实施方案中，所述非人哺乳动物为啮齿动物，诸如小鼠或大鼠。在一些实施方案中，所述啮齿动物(例如小鼠或大鼠)可以是免疫缺陷型的或免疫受损型的。在某些实施方案中，免疫缺陷型小鼠可以为NOD/SCID小鼠或NOD/SCID白介素-2受体伽马链缺无(NSG)型小鼠。在其它实施方案中，所述非人哺乳动物是野生型的和/或免疫胜任型的(例如野生型或免疫胜任型啮齿动物，例如野生型或免疫胜任型小鼠或大鼠)。
在其它实施方案中，所述完整瘤，或其碎片为完整非CRC瘤，或其碎片(例如乳腺癌瘤，肺癌瘤，肝癌瘤，脑癌瘤，淋巴结癌瘤，肾癌瘤，胃癌瘤，卵巢癌瘤，皮肤癌瘤，胰腺癌瘤，甲状腺癌瘤，或前列腺癌瘤，或其碎片)。在另一个实施方案中，所述捐献者瘤发生性细胞植入物的细胞的子集(例如5％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，
21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，
60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多的)能够进行侵入性生长。在其它实施方案中，所述捐献者瘤发生性细胞植入物的每一个(即100％)细胞的生长可以特征在于侵入性生长。在另一个实施方案中，所述非人哺乳动物为啮齿动物，诸如小鼠或大鼠。在一些实施方案中，所述啮齿动物(例如小鼠或大鼠)可以是免疫缺陷型的或免疫受损型的。在某些实施方案中，免疫缺陷型小鼠可以为NOD/SCID小鼠或NOD/SCID白介素-2受体伽马链缺无(NSG)型小鼠。在其它实施方案中，所述非人哺乳动物是野生型的和/或免疫胜任型的(例如野生型或免疫胜任型啮齿动物，例如野生型或免疫胜任型小鼠或大鼠)。
[0008] 在第二个方面，本发明特征在于一种用于生成第一个方面(即CRC的非人哺乳动物(例如啮齿动物)模型)的非人哺乳动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的方法，该方法包括：外置宿主非人哺乳动物的结肠粘膜表面，将一个或多个瘤发生性细胞植入到所述结肠粘膜表面上，并将包含一个或多个植入的瘤发生性细胞的外置的结肠重插入到所述宿主非人哺乳动物中。
[0009] 在第三个方面，本发明特征在于一种筛选抑制瘤发生性细胞生长(例如将瘤发生性细胞的生长抑制至少20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多，例如与未处理或对照处理组相比)的化合物的方法，该方法包括：使本发明的非人哺乳动物的捐献者瘤发生性细胞植入物与候选化合物接触，并测定所述候选化合物是否抑制所述瘤发生性细胞生长，由此将所述候选化合物鉴定为抑制瘤发生性细胞生长的化合物。
[0010] 在第四个方面，本发明特征在于一种筛选抑制瘤发生性细胞生长(例如将瘤发生性细胞的生长抑制至少20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多，例如与未处理或对照处理组相比)的辅药的方法，该方法包括：自第一个方面的非人哺乳动物的结肠粘膜表面取出捐献者瘤发生性细胞植入物，对所述非人哺乳动物施用候选化合物，并测定所述候选化合物是否抑制瘤发生性细胞生长，由此将所述候选化合物鉴定为抑制瘤发生性细胞生长的辅药。
[0011] 在本发明的第三个或第四个方面的一个实施方案中，测定所述候选化合物是否抑制瘤发生性细胞生长的步骤包括评估所述候选化合物引发选自下组的至少一种响应(例如1，2，3，4，或5种响应)的能力：瘤发生性细胞数目的减少或稳定；瘤尺寸的缩小或稳定；瘤载荷的缩小或稳定；瘤发生性细胞侵入性的降低或稳定；和瘤转移的减少或稳定。在第三个或第四个方面的另一个实施方案中，所述候选化合物可以为小分子，肽，多肽，抗体，抗体片段，或免疫缀合物。在第三个或第四个方面的另一个实施方案中，所述捐献者瘤发生性细胞植入物可以能够进行穿过结肠壁到达结肠浆膜表面的侵入性生长(例如导致穿透穿过外肌层的富含胶原IV的基底膜到达浆膜表面的生长)。在第三个或第四个方面的其它实施方案中，所述瘤发生性细胞的侵入性生长可以特征在于CRC(例如人CRC)的一个或多个(例如1，2，或3或更多个)常见靶器官(即靶转移器官或转移组织)，诸如肠淋巴结，肝，或肺中的转移。在第三个或第四个方面的其它实施方案中，所述非人哺乳动物在植入后不展现腹膜腔中可检测到的瘤形成(例如腹膜癌病)。在第三个或第四个方面的另一个实施方案中，所述非人哺乳动物为啮齿动物，诸如小鼠或大鼠。
[0014] 图1A显示来自9周龄的捐献者ApcMin/+；Villin-Cre对照小鼠的结肠(顶部和中部小图)和肝(底部小图)的图像。纵向打开结肠，并对粘膜(顶部)和浆膜(中部)景象成像，其中肛门位于左边。箭指示结肠息肉。肝的标框区域有放大。
[0015] 图1B描绘来自9周龄的捐献者ApcMin/+；KrasLSLG12D/+；Villin-Cre小鼠的结肠(顶部和中部小图)和肝(底部小图)图像。纵向打开结肠，并对粘膜(顶部)和浆膜(中部)景象成像，其中肛门位于左边。箭指示结肠息肉。肝的标框区域有放大。
[0016] 图1C是 显 示6周 龄 的ApcMin/+；Villin-Cre(n＝ 5)和ApcMin/+；KrasLSLG12D/+；Villin-Cre(n＝4)小鼠中的内源结肠瘤负荷的一幅图。每个点代表来自小鼠个体的数据。
还显示了均值±s.e.m.。*P<0.05。
还显示了均值±s.e.m.。*P<0.05。
[0017] 图1D是显示ApcMin/+；Villin-Cre(n＝49)和ApcMin/+；KrasLSLG12D/+；Villin-Cre(n＝14)小鼠的Kaplan-Meier存活曲线的一幅图。HR＝危害比。
[0018] 图1E是来自已经接受内腔植入物的宿主野生型C57BL/6小鼠的一组大体(gross)结肠图像(顶部小图：粘膜景象；底部小图：浆膜景象)，所述内腔植入物是来自捐献者皮Min/+ LSLG12D/+下同种异基因移植物，在植入后9周收获的一个完整Apc ；Kras ；Villin-Cre结肠瘤碎片。结肠的标框区域在相应图像的右边有放大。比例尺代表3mm。
[0019] 图1F和1G是来自已经接受内腔植入物的两只宿主野生型C57BL/6小鼠的结肠(顶部和中部小图)和肝(底部小图)的图像，所述内腔植入物是在植入后63周(F；宿Min/+主小鼠#359；良性)或植入后79周(G；宿主小鼠#590；恶性)收获的一个完整Apc ；
LSLG12D/+
Kras ；Villin-Cre捐献者瘤。对结肠粘膜和/或浆膜景象成像，其中肛门位于左边。
箭指示植入的捐献者瘤。肝的标框区域有放大。在图1G中，结肠的标框区域有放大以突显淋巴结转移。
LSLG12D/+
Kras ；Villin-Cre捐献者瘤。对结肠粘膜和/或浆膜景象成像，其中肛门位于左边。
箭指示植入的捐献者瘤。肝的标框区域有放大。在图1G中，结肠的标框区域有放大以突显淋巴结转移。
[0020] 图1H是显示将一个完整ApcMin/+；KrasLSLG12D/+；Villin-Cre捐献者瘤内腔植入野生型C57BL/6宿主小鼠结肠后良性对恶性行进的发生率的一张表。
[0021] 图2是一幅示意图，有内腔植入技术的代表性图像。植入前：通过异氟烷吸入来麻醉小鼠，以仰卧位放置，并用胶带将四肢绑定至纱布覆盖的平台。止血钳插入：将钝止血钳插入肛门，并温和夹起粘膜。直肠脱垂诱导：自肛门收回止血钳，使得粘膜外置。瘤植入：将3
大约10mm的捐献者瘤缝合到外置的结肠的粘膜表面上。瘤缝合：剪断缝线末端，留下捐献者瘤稳固地附着至粘膜。直肠脱垂倒转：使用钝灌胃针将外置的结肠与缝合的捐献者瘤一起重插入，如此倒转直肠脱垂。
大约10mm的捐献者瘤缝合到外置的结肠的粘膜表面上。瘤缝合：剪断缝线末端，留下捐献者瘤稳固地附着至粘膜。直肠脱垂倒转：使用钝灌胃针将外置的结肠与缝合的捐献者瘤一起重插入，如此倒转直肠脱垂。
[0022] 图3A是将一个来自捐献者小鼠#4700-260的ApcMin/+；KrasLSLG12D/+；Villin-Cre结肠息肉内腔植入野生型C57BL/6宿主小鼠#344的结肠后的一系列内窥镜检查术图像，显示Min/+ LSLG12D/+了内腔植入的Apc ；Kras ；Villin-Cre结肠息肉保持良性。系列图像是在所示时间自宿主捕捉的。
[0023] 图3B是将来自捐献者小鼠#4700-260的一个ApcMin/+；KrasLSLG12D/+；Villin-Cre结肠息肉内腔植入野生型C57BL/6宿主小鼠#346的结肠后的一系列内窥镜检查术图像，显示Min/+ LSLG12D/+了内腔植入的Apc ；Kras ；Villin-Cre结肠息肉保持良性。系列图像是在所示时间自宿主捕捉的。
[0024] 图4A是显示内腔植入后大体结直肠瘤形成的时间过程的一系列图像。植入后0至7周以每周间隔自携带HCT116-DsRed内腔瘤的NOD/SCID小鼠收获结肠，纵向打开，并成像。顶部和底部小图分别显示结肠的粘膜和浆膜景象，其中肛门位于每幅小图的左边。
[0025] 图4B是HCT116-DsRed内腔植入后的一系列内窥镜检查术图像。系列图像是在植入后0至4周自相同宿主捕捉的。植入后2周时的点线指示植入的瘤的周长。
[0026] 图4C是显示内腔植入后的原发性瘤体积的一幅图。每个时间点的小鼠的数目：植入后0周(n＝3)，植入后1周(n＝3)，植入后2周(n＝6)，植入后3周(n＝6)，植入后4周(n＝11)，植入后5周(n＝15)，植入后6周(n＝11)，植入后7周(n＝18)。数据以均值和s.e.m代表。
[0028] 图4E是是植入有HCT116-DsRed捐献者瘤的宿主结肠在植入后1周时的一幅组织学图像，显示了胶原IV(Col IV；绿色)，DsRed(红色)，和4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；蓝色)染色。
[0029] 图4F是植入有HCT116-DsRed捐献者瘤的宿主结肠在植入后3周时的一幅组织学图像，显示了H&E染色。
[0030] 图4G-4I是图4F中所示位置的放大组织学图像，每幅显示Col IV(绿色)，DsRed(红色)和DAPI(蓝色)染色。
[0031] 图5A是内腔植入HCT116-DsRed瘤碎片后立即用苏木精和曙红(H&E)染色的来自NOD/SCID小鼠的结肠的一幅组织学图像。
[0032] 图5B和5C是图5A中所示位置的放大组织学图像，每幅显示H&E染色。
[0033] 图5D是内腔植入HCT116-DsRed瘤碎片后立即用Col IV(绿色)，DsRed(红色)和DAPI(蓝色)小鼠染色的来自NOD/SCID小鼠的结肠的一幅组织学图像。
[0034] 图5E和5F是图5D中所示位置的放大组织学图像，每幅显示Col IV(绿色)，DsRed(红色)，和DAPI(蓝色)染色。
[0035] 图5G是显示在移植后第1天检测不到的瘤细胞播散的一组图像和图。第0天，将HCT116-DsRed捐献者瘤碎片植入到宿主小鼠结肠的粘膜表面上(n＝2)。移植后第1天，实施内窥镜检查术，并捕捉移植的瘤的图像(顶部)。然后处死小鼠，收获肝，肺，肠血管+束，和血，并通过流式细胞术评估DsRed细胞。阴性对照由自野生型小鼠收获的组织样品+
组成。阳性对照由含有HCT116-DsRed瘤细胞的组织样品组成。通过流式细胞术评估平均
6 +
5x10个可存活细胞。建立门，使得相应阴性对照样品检测不到DsRed 细胞。门内的数目+
表示DsRed细胞的百分比。
组成。阳性对照由含有HCT116-DsRed瘤细胞的组织样品组成。通过流式细胞术评估平均
6 +
5x10个可存活细胞。建立门，使得相应阴性对照样品检测不到DsRed 细胞。门内的数目+
表示DsRed细胞的百分比。
[0036] 图6是来自携带HCT116-DsRed内腔瘤的NOD/SCID小鼠的结肠的一系列图像，显示了内腔植入后结直肠瘤形成的时间过程。植入后0至7周以每周间隔收获结肠，纵向打开，固定并切片，并通过H&E(左栏)或对Col IV(绿色)，DsRed(红色)，和DAPI(蓝色)(右栏)染色。在所有小图中，肛门位于左边，其中结肠的内腔朝向顶部。
[0037] 图7A是植入后7周时携带HCT116-DsRed内腔瘤的NOD/SCID小鼠的大体结肠的一组图像，其中箭指示区域性淋巴结转移；底部左边小图显示通过苏木精和曙红(H&E)进行的组织学染色；而蓝色和红色标框区域分别在底部中部和右边小图中放大显示，并对Col IV(绿色)，DsRed(红色)，和DAPI(蓝色)染色。
[0038] 图7B是植入后7周时携带HCT116-DsRed内腔瘤的NOD/SCID小鼠的肝的一组图像，其中箭指示转移；中部小图显示通过H&E进行的组织学染色，点线指示转移性节结的周长；而标框区域在右边小图中放大显示，并对Col IV(绿色)，DsRed(红色)，和DAPI(蓝色)染色。
[0039] 图7C是植入后7周时携带HCT116-DsRed内腔瘤的NOD/SCID小鼠的肺的一组图像，其中箭指示转移；中部小图显示通过H&E进行的组织学染色，箭指示转移性节结；而标框区域在右边小图中放大显示，并对Col IV(绿色)，DsRed(红色)，和DAPI(蓝色)染色。
[0040] 图7D是显示在NOD/SCID小鼠中内腔植入HCT116-DsRed瘤后肠淋巴结，肝，和肺内的宏观转移的数目的一幅图。每个时间点的小鼠的数目：植入后0周(n＝14)，植入后1周(n＝3)，植入后2周(n＝6)，植入后3周(n＝6)，植入后4周(n＝11)，植入后5周(n＝15)，植入后6周(n＝20)，植入后7周(n＝18)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。
[0041] 图7E是显示在NOD/SCID小鼠中内腔植入HCT116-DsRed瘤后肠淋巴结，肝，和肺6
内的DsRed阳性瘤细胞负荷的一幅图。数据表述成每1x10例可存活事件中DsRed阳性瘤细胞的数目。每个时间点的小鼠的数目：植入后0周(n＝14)，植入后1周(n＝3)，植入后2周(n＝3)，植入后3周(n＝3)，植入后4周(n＝8)，植入5后周(n＝8)，植入后6周(n＝13)，植入后7周(n＝14)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。
内的DsRed阳性瘤细胞负荷的一幅图。数据表述成每1x10例可存活事件中DsRed阳性瘤细胞的数目。每个时间点的小鼠的数目：植入后0周(n＝14)，植入后1周(n＝3)，植入后2周(n＝3)，植入后3周(n＝3)，植入后4周(n＝8)，植入5后周(n＝8)，植入后6周(n＝13)，植入后7周(n＝14)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。
[0042] 图7F是植入后3周时携带HCT116-DsRed内腔瘤的NOD/SCID小鼠的肝的一组图像，其中中部小图显示通过H&E进行的组织学染色，右边小图显示对Col IV(绿色)，DsRed(红色)，和DAPI(蓝色)的染色，而箭指示DsRed阳性播散的瘤细胞。
[0043] 图7G是植入后3周时携带HCT116-DsRed内腔瘤的NOD/SCID小鼠的肺的一组图像，其中中部小图显示通过H&E进行的组织学染色，右边小图显示对Col IV(绿色)，DsRed(红色)，和DAPI(蓝色)的染色，箭指示DsRed阳性播散的瘤细胞，而箭头指示自身发荧光的巨噬细胞。
[0044] 图8A是植入后6周时用H&E染色的来自携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠的结肠的一幅组织学图像，显示了内腔植入的结直肠瘤展现局部区域性传播以及造血/淋巴/神经周侵入，并生成宏观淋巴结转移。
[0045] 图8B是图8A中所示位置的放大组织学图像，用H&E染色，展现箭指示的远离原发性瘤的局部区域性传播。
[0046] 图8C是图8A中所示位置的放大组织学图像，用H&E染色，展现点线描画轮廓的瘤迁移前缘进入正常粘膜的局部区域性传播。
[0047] 图8D是图8A中所示位置的放大组织学图像，用H&E染色，展现外肌层穿透。
[0048] 图8E是图8A中所示位置的放大组织学图像，用H&E染色，展现原发性瘤存活力。
[0049] 图8F是图8A中所示位置的放大组织学图像，用H&E染色，展现箭指示的接近原发性瘤的局部区域性传播。
[0050] 图8G是图8A中所示位置的放大组织学图像，用H&E染色，展现箭指示的造血侵入。
[0051] 图8H是图8A中所示位置的放大组织学图像，用H&E染色，展现箭指示的神经周侵入。
[0052] 图8I是图8A中所示位置的放大组织学图像，用H&E染色，展现区域性淋巴结建群。
[0053] 图8J是图8A中所示位置的放大组织学图像，用H&E染色，展现箭指示的淋巴侵入。
[0054] 图9A是显示内腔植入后大体结直肠瘤形成的时间过程的一系列图像。植入后0至8周自携带LS174T-DsRed内腔瘤的NOD/SCID小鼠收获结肠，纵向打开，并成像。顶部和底部小图分别显示结肠的粘膜和浆膜景象，其中肛门位于每幅小图的左边。箭指示肠淋巴结转移。
[0055] 图9B是显示在NOD/SCID小鼠中内腔植入LS174T-DsRed瘤后的原发性瘤体积的一幅图。每个时间点的小鼠的数目：植入后0周(n＝9)，植入后1周(n＝3)，植入后2周(n＝3)，植入后3周(n＝3)，植入后4周(n＝3)，植入后5周(n＝3)，植入后6周(n＝3)，植入后7周(n＝4)，植入后8周(n＝12)。数据以均值和s.e.m.代表。
[0056] 图9C是植入后7周来自携带内腔植入的LS174T-DsRed瘤的小鼠的肝的图像。箭指示转移。
[0057] 图9D是植入后8周来自携带内腔植入的LS174T-DsRed瘤的小鼠的肺的图像。箭指示转移长出。
[0058] 图9E是显示在NOD/SCID小鼠中内腔植入LS174T-DsRed瘤后肠淋巴结，肝和肺内的宏观转移的数目的一幅图。每个时间点的小鼠的数目：植入后0周(n＝9)，植入后1周(n＝3)，植入后2周(n＝3)，植入后3周(n＝3)，植入后4周(n＝3)，植入后5周(n＝3)，植入后6周(n＝3)，植入后7周(n＝4)，植入后8周(n＝12)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。
[0059] 图10A是来自携带内腔植入的人II期患者结直肠瘤的小鼠的结肠的图像，显示了内腔植入的II期患者瘤保持非转移性和良性。
[0060] 图10B是来自携带内腔植入的人III期患者结直肠瘤的小鼠的结肠的图像，显示了内腔植入的III期患者瘤产生淋巴结转移。
[0061] 图10C是显示源自II期和III期捐献者瘤的宏观转移的数目的一幅图。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。****P<0.0001。
[0062] 图11A是显示在NOD/SCID或NSG小鼠中内腔或皮下植入HCT116-DsRed瘤后多种器官内的宏观转移的数目的一幅图。小鼠的数目：NOD/SCID内腔(n＝22，对于肝，肺，淋巴结；n＝4，对于肾上腺，肾，脾，脑)；NOD/SCID皮下(n＝10)；NSG内腔(n＝16)；NSG皮下(n＝10)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。*P<0.05；**p<0.01；**P<0.001；****P<0.0001。n.s.＝不显著。n.d.＝未测定。
[0063] 图11B是显示在NOD/SCID或NSG小鼠中内腔或皮下植入HCT116-DsRed瘤后多种6
器官内的DsRed阳性瘤细胞负荷的一幅图。数据表述为每1x10例可存活事件中DsRed阳性瘤细胞的数目。小鼠的数目：NOD/SCID内腔(n＝13，对于肝，肺，淋巴结；n＝4，对于肾上腺，肾，脾，脑，骨髓)；NOD/SCID皮下(n＝10)；NSG内腔(n＝7，对于肝，肺，淋巴结；n＝3，对于肾上腺，肾，脾，脑，骨髓)；NSG皮下(n＝10)。每个点代表来自小鼠个体的数据。
还显示了均值±s.e.m.。*P<0.05；*P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。n.s.＝不显著。
n.d.＝未测定。
器官内的DsRed阳性瘤细胞负荷的一幅图。数据表述为每1x10例可存活事件中DsRed阳性瘤细胞的数目。小鼠的数目：NOD/SCID内腔(n＝13，对于肝，肺，淋巴结；n＝4，对于肾上腺，肾，脾，脑，骨髓)；NOD/SCID皮下(n＝10)；NSG内腔(n＝7，对于肝，肺，淋巴结；n＝3，对于肾上腺，肾，脾，脑，骨髓)；NSG皮下(n＝10)。每个点代表来自小鼠个体的数据。
还显示了均值±s.e.m.。*P<0.05；*P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。n.s.＝不显著。
n.d.＝未测定。
[0064] 图11C是植入后7周时携带HCT116-DsRed内腔瘤的NSG小鼠的大体结肠的图像，其中箭指示原发性瘤和区域性淋巴结转移。
[0065] 图11D是植入后7周时携带HCT116-DsRed内腔瘤的NSG小鼠的结肠的一幅组织学图像，结肠用H&E染色，标框区域在右边小图中放大显示并对Col IV(绿色)，DsRed(红色)，和DAPI(蓝色)染色。箭指示区域性淋巴结转移。
[0066] 图11E是植入后7周时来自携带HCT116-DsRed内腔瘤的NSG小鼠的多种器官的图像，其中肝转移显而易见和箭指示肺转移。
[0067] 图11F是植入后7周时携带HCT116-DsRed内腔瘤的NSG小鼠的肝的一幅组织学图像，肝用H&E(左边小图)和对Col IV(绿色)，DsRed(红色)，和DAPI(蓝色)(右边小图)染色。点线指示肝转移性节结的周长。
[0068] 图11G是植入后7周时来自携带HCT116-DsRed内腔瘤的NSG小鼠的肺的一幅组织学图像，肺用H&E(左边小图)和对Col IV(绿色)，DsRed(红色)和DAPI(蓝色)(右边小图)染色。
[0069] 图11H是植入后7周时携带HCT116-DsRed皮下瘤的NSG小鼠的肝和肺的图像。
[0070] 图11I是图11H的NSG小鼠的相关原发性皮下瘤的图像。
[0071] 图11J是显示在NOD/SCID或NSG小鼠中内腔或皮下植入HCT116-DsRed瘤后植入6
后6-7周时循环中的瘤细胞数目的一幅图。数据以均值和s.e.m.代表，并表述为每1x10例可存活事件中血中DsRed阳性瘤细胞的数目。小鼠的数目：NOD/SCID内腔(n＝12)；NOD/SCID皮下(n＝9)；NSG内腔(n＝9)；NSG皮下(n＝10)。**P<0.01；***P<0.001。
后6-7周时循环中的瘤细胞数目的一幅图。数据以均值和s.e.m.代表，并表述为每1x10例可存活事件中血中DsRed阳性瘤细胞的数目。小鼠的数目：NOD/SCID内腔(n＝12)；NOD/SCID皮下(n＝9)；NSG内腔(n＝9)；NSG皮下(n＝10)。**P<0.01；***P<0.001。
[0073] 图12B是植入后7周时来自携带皮下植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠的肝和肺的图像。
[0074] 图12C是显示皮下植入HCT116-DsRed瘤细胞后的原发性瘤体积的一幅图(n＝10)。数据以均值±s.e.m.代表。
[0075] 图13A是植入后6周时内腔植入的HCT116-DsRed瘤的一幅组织学图像，用H&E染色。
[0076] 图13B是植入后6周时皮下植入的HCT116-DsRed瘤的一幅组织学图像，用H&E染色。
[0077] 图13C是植入后6周时内腔植入的HCT116-DsRed瘤的一幅组织学图像，用MECA-32(绿色)和DAPI(蓝色)染色。
[0078] 图13D是植入后6周时皮下植入的HCT116-DsRed瘤的一幅组织学图像，用MECA-32(绿色)和DAPI(蓝色)染色。
[0079] 图13E是显示植入后6周时内腔(n＝7)或皮下(n＝7)植入的HCT116-DsRed瘤的血管密度的一幅图。数据以均值和s.e.m.代表，并表述为MECA-32阳性血管面积对总DAPI阳性可存活瘤面积之比乘100。*P<0.05。
[0080] 图14A是显示植入后1-7周时携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠中淋巴结转移性负荷和肝转移性负荷之间的关联的多幅图。数据为宏观肝转移总数对宏观+淋巴结转移总数(顶部)或淋巴结内DsRed瘤细胞总数(底部)任一。
[0081] 图14B是显示植入后5-7周时携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NSG小鼠中淋巴结转移性负荷和肝转移性负荷之间的关联的多幅图。数据为宏观肝转移总数对宏观淋巴+结转移总数(顶部)或淋巴结内DsRed瘤细胞总数(底部)任一。
[0082] 图14C是植入后6-7周时指定抗体处理后携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠的结肠的大体图像。箭头指示肠淋巴结转移。
[0083] 图14D是显示植入后6-7周时指定抗体处理或无抗体处理后携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠的原发性瘤体积的一幅图。每种处理条件的小鼠的数目：未处理(n＝22)，抗VEGF-A(n＝9)，抗VEGF-C(n＝8)，抗VEGF-A/C(n＝10)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。n.s.＝不显著。
[0084] 图14E是显示植入后6-7周时指定抗体处理或无抗体处理后携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠中淋巴结宏观转移的数目的一幅图。每种处理条件的小鼠的数目：未处理(n＝22)，抗VEGF-A(n＝9)，抗VEGF-C(n＝8)，抗VEGF-A/C(n＝10)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。n.s.＝不显著。
[0085] 图14F是显示植入后6-7周时指定抗体处理或无抗体处理后携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠中肝宏观转移的数目的一幅图。每种处理条件的小鼠的数目：未处理(n＝22)，抗VEGF-A(n＝9)，抗VEGF-C(n＝8)，抗VEGF-A/C(n＝10)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。n.s.＝不显著。
[0086] 图14G是植入后6-7周时指定抗体处理后携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠的肝的一组大体图像。箭头指示肝转移。
[0087] 图14H是显示植入后6-7周时指定抗体处理或无抗体处理后携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠中肝内的DsRed阳性瘤细胞负荷连同来自非荷瘤小鼠的6
对照分析(n＝8)的一幅图，其中数据表述为每1x10例可存活事件中DsRed阳性瘤细胞的数目。每种处理条件的小鼠的数目：未处理(n＝13)，抗VEGF-A(n＝9)，抗VEGF-C(n＝8)，抗VEGF-A/C(n＝9)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。
*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。n.s.＝不显著。
对照分析(n＝8)的一幅图，其中数据表述为每1x10例可存活事件中DsRed阳性瘤细胞的数目。每种处理条件的小鼠的数目：未处理(n＝13)，抗VEGF-A(n＝9)，抗VEGF-C(n＝8)，抗VEGF-A/C(n＝9)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。
*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。n.s.＝不显著。
[0088] 图14I是比较植入后6-7周时有或无肝宏转移的携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠数目的偶然性分析，其中数据表述为每个范畴中的小鼠的百分比。每种处理条件的小鼠的数目：未处理(n＝13)，抗VEGF-A(n＝9)，抗VEGF-C(n＝8)，抗VEGF-A/C(n＝9)。还显示了均值±s.e.m.。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。n.s.＝不显著。
[0089] 图14J是比较在宏观转移表现之前，植入后3周时有或无肝微转移DsRed+细胞的携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠的数目的偶然性分析，其中数据表述为每个范畴中的小鼠的百分比。还显示了均值±s.e.m.。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。n.s.＝不显著。
[0090] 图14K是显示植入后8周时指定抗体处理或无抗体处理后携带内腔植入的LS174T-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠中淋巴结宏观转移的数目的一幅图。每种处理条件的小鼠的数目：未处理(n＝7)，抗VEGF-A(n＝3)，抗VEGF-C(n＝13)，抗VEGF-A/C(n＝5)。
每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。*P<0.05。n.s.＝不显著。
每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。*P<0.05。n.s.＝不显著。
[0091] 图14L是比较植入后8周时有或无肝宏转移的携带内腔植入的LS174T-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠数目的偶然性分析，其中数据表述为每个范畴中的小鼠的百分比。每种处理条件的小鼠的数目：未处理(n＝7)，抗VEGF-A(n＝3)，抗VEGF-C(n＝13)，抗VEGF-A/C(n＝5)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。**P<0.01。n.s.＝不显著。
[0092] 图15A是显示植入后6-7周时携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠中靶向血管发生和/或淋巴管发生对区域性淋巴结转移形成的影响的一幅图，其中淋巴3
结宏观转移的数目相对于原发性瘤体积标准化。数据表述为每1mm的原发性瘤中宏观转移的数目。每种处理条件的小鼠的数目：未处理(n＝22)，抗VEGF-A(n＝9)，抗VEGF-C(n＝8)，抗VEGF-A/C(n＝10)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。
*P<0.05；***P<0.001；****P<0.0001。n.s.＝不显著。
结宏观转移的数目相对于原发性瘤体积标准化。数据表述为每1mm的原发性瘤中宏观转移的数目。每种处理条件的小鼠的数目：未处理(n＝22)，抗VEGF-A(n＝9)，抗VEGF-C(n＝8)，抗VEGF-A/C(n＝10)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。
*P<0.05；***P<0.001；****P<0.0001。n.s.＝不显著。
[0093] 图15B是显示植入后6-7周时携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠中靶向血管发生和/或淋巴管发生对远程肝转移形成的影响的一幅图，其中肝宏观转移的数目相对于原发性瘤体积标准化。每种处理条件的小鼠的数目：未处理(n＝22)，抗VEGF-A(n＝9)，抗VEGF-C(n＝8)，抗VEGF-A/C(n＝10)。每个点代表来自小鼠个体的数据。还显示了均值±s.e.m.。*P<0.05；***P<0.001；****P<0.0001。n.s.＝不显著。
[0094] 发明详述
[0095] 本发明部分基于展现转移至临床相关部位的结直肠癌模型的生成。
[0096] 除非另有定义，本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员普遍理解相同的含义(Singleton et al.Dictionary of Microbiology and Molecular Biology.2nd Ed.J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994))。为了本发明的目的，下文定义了下述术语。
[0097] 定义
[0098] 术语“抗体”在本文中以最广义使用且指任何包含两条重链和两条轻链的免疫球蛋白(Ig)分子，和任何其片段，突变体，变体或衍生物，只要它们展现期望的生物学活性(例如表位结合活性)。抗体的例子包括单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体，和抗体片段。
[0099] 如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指自一个基本上同质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的抗体个体是相同的，除了可能的天然发生的突变，它们可以以微小量存在。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。而且，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体的优点在于它们可以在不受其它抗体污染的情况下合成。修饰语“单克隆”指出抗体是自一个基本上同质的抗体群体获得的特征，而且不要解读成要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，要依照本发明使用的单克隆抗体可以通过最初由Ohler et al.Nature.256:495(1975)描述的杂交瘤方法来生成，或者可以通过重组DNA方法来生成(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson et al.Nature.352:624-628(1991)和Marks et al.J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术自噬菌体抗体文库分离。
[0100] “抗体片段”指与完整抗体不同，包含完整抗体的一部分(诸如其抗原结合区或可变区)的分子。抗体片段的例子包括Fab，Fab’，F(ab’)2，和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和自抗体片段形成的多特异性抗体。在某些实施方案中，抗体片段结合与完整抗体结合的抗原相同的抗原。
[0101] 术语“癌”和“癌性”指或描述哺乳动物中典型情况下特征在于不受调节的细胞生长的生理疾患。癌的例子包括但不限于癌瘤，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤，和白血病。此类癌的更具体的例子包括鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，胃肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝瘤/肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌，唾液腺癌，肾癌(kidney cancer)，肾癌(renal cancer)，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头和颈癌。
[0102] “转移”表示癌自它的原发性部位传播至身体中的其它地方。癌细胞能脱离原发性瘤，穿透淋巴管和血管，经由血流循环，及在身体中的别处在正常组织中在远程病灶中生长(转移)。转移可以是局部的或远程的。转移可以表征为一个连续过程，视瘤细胞脱离原发性瘤，经由血流或淋巴管传播，并在远程部位停止而定。在瘤细胞来到另一部位休息之后，它们能重穿透血管或淋巴管壁，继续增殖，并最终形成另一瘤。在新部位，细胞建立血供且能生长形成危及生命的团块。在某些实施方案中，这个新瘤称作转移(或继发性)瘤。在某些实施方案中，术语转移性瘤指能够转移但尚未转移至身体中别处的组织或器官的瘤。在某些实施方案中，术语转移性瘤指已经转移至身体中别处的组织或器官的瘤。在某些实施方案中，转移性瘤由转移性瘤细胞构成。
[0103] “转移器官”或“转移组织”以最广义使用，指其中已经传播来自原发性瘤的癌细胞或来自身体另一部分的癌细胞的器官或组织。转移器官和转移组织的例子包括但不限于肺，肝，脑，卵巢，骨，骨髓，和淋巴结。关于结直肠癌(CRC)，主要的转移器官和转移组织为区域性肠淋巴结，肝，和肺。
[0104] “微转移”表示已经自原发性瘤传播至身体其它部分的少数细胞。微转移可以是或不是筛选或诊断测试中检测得到的。
[0105] “宏转移”表示可检测到的且已经自原发性瘤部位传播至身体其它部分的多数细胞。
[0106] “非转移性的”表示良性的或保持在原发性部位(例如局部侵入性癌)且尚未穿透淋巴管或血管系统或到达原发性部位以外的组织的癌。在某些实施方案中，非转移性癌为任何如下的癌，它是0，I，或II期癌。
[0107] 如本文中使用的，“侵入性”或“侵入性生长”指癌或瘤离开它起源的组织部位及行进至在身体的不同部位(例如附近或远程部位)增殖的能力。在一些实施方案中，癌可以是“局部侵入性的”且行进至在身体的附近部位(诸如周围组织)增殖。在其它实施方案中，癌可以是“区域性侵入性的”或“远程侵入性的”且行进至分别在身体的区域性或远程部位增殖。
[0108] 提到癌或瘤时的“0期”，“I期”，“II期”，“III期”，或“IV期”指出使用本领域已知的总体阶段分组或罗马数字定级方法对瘤或癌的分类。虽然癌的实际阶段取决于癌的类型，但是，一般而言，0期癌为原位损害，I期癌为小的局限性的瘤，II期为局部晚期瘤，III期癌为展现局部淋巴结累及的局部晚期瘤，而IV期癌代表转移性癌。熟练临床医生知道每种类型的瘤的具体阶段。
[0109] 如本文中使用的，“瘤”指任何赘生性细胞生长(无论恶性的或良性的)，及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌”，“癌性”，“细胞增殖性病症”，“增殖性病症”和“瘤”在本文中提到时并不互相排斥。瘤可以是实体瘤，诸如结肠瘤(CRC瘤)，或非实体瘤或软瘤，诸如白血病。软组织瘤的例子包括白血病(例如慢性髓性白血病，急性髓性白血病，成人急性成淋巴细胞性白血病，急性髓性白血病，成熟B细胞性急性成淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病，淋巴细胞性白血病，或毛细胞性白血病)，或淋巴瘤(例如非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤，皮肤T细胞性淋巴瘤，或霍奇金氏病)。实体瘤包括血，骨髓，或淋巴系统以外的身体组织的任何癌。实体瘤可以进一步分成上皮细胞起源的那些和非上皮细胞起源的那些。实体瘤的例子包括结肠，乳腺，前列腺，肺，肾，肝，胰腺，卵巢，头和颈，口腔，胃，十二指肠，小肠，大肠，胃肠道，肛门，胆囊，阴唇，鼻咽，皮肤，子宫，雄性生殖器官，泌尿器官，膀胱，和皮肤的瘤。非上皮起源的实体瘤包括肉瘤，脑瘤，和骨瘤。如本文中使用的，术语“瘤”还意图包含“息肉”。
[0110] “原发性瘤”或“原发性癌”表示最初的癌而非位于受试者身体中的另一组织，器官，或位置中的转移性损害。在某些实施方案中，原发性瘤由原发性瘤细胞构成。
[0111] “良性瘤”或“良性癌”表示保持位于初始部位且没有浸润，侵入，或转移至远程部位的能力的瘤。
[0112] 如本文中使用的，“瘤发生性细胞”指任何展现异常生长状态或能够将它们的正常生长状态变成异常生长状态(它们最终形成瘤)的细胞(例如癌细胞，例如人癌细胞或非人癌细胞)。瘤发生性细胞能够形成瘤，它们通常是不受控制的细胞生长的结果。可以基于它们的瘤形成表型来区分瘤发生性细胞与非瘤发生性细胞(参见例如Al-Hajrj et al.Proc Natl Acad Sci USA.100:3983-8,2003；美国公开文本No.2002/0119565；美国公开文本No.2004/0037815；美国公开文本No.2005/0232927；WO 05/005601；美国公开文本No.2005/0089518；美国申请No.10/864,207；Al-Hajj et al.Oncogene.23:7274,2004；和Clarke et al.Ann Ny Acad.Sci.1044:90,2005，通过援引将它们均完整收入本文用于所有目的)。瘤发生性细胞包括但不限于瘤细胞，胚胎细胞，改造成具有异常生长的细胞，癌细胞系，以及任何这些细胞类型的细胞团块。
[0113] 术语“植入物”及其变化指移植的细胞，例如导入接受者宿主中且在接受者中的移植部位保持实质性稳定建立的瘤发生性细胞(例如完整瘤，或其碎片)。
[0114] “捐献者”细胞，瘤，或瘤发生性细胞表示如下的细胞，瘤，或瘤发生性细胞，它并非衍生自接受者宿主生物体，但是可以是同基因的(其中捐献者和接受者在遗传上是相同的)，同种异基因的(其中捐献者和接受者是不同遗传起源的但是相同物种的)，或异种的(其中捐献者和接受者来自不同物种)。例如，捐献者细胞，瘤，或瘤发生性细胞可以衍生自人。如本文中使用的，“捐献者瘤发生性细胞植入物”指衍生自接受者生物体以外的来源的移植的瘤发生性细胞。
[0115] “瘤载荷”表示身体中癌的量。瘤载荷也称作瘤负荷，而且可以是瘤数目和瘤尺寸的函数。
[0117] “小分子”在本文中定义为具有约500道尔顿以下的分子量。
[0118] “免疫缀合物”表示缀合至一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒剂)的抗体(例如抗体-药物缀合物(ADC))。
[0119] “减少/降低”或“抑制”表示引起例如20％或更多，50％或更多，或75％，85％，90％，95％，或更多的总体减少/降低的能力。在某些实施方案中，减少/降低或抑制可以指瘤发生性细胞或瘤的生长，这可以通过瘤发生性细胞数目，瘤尺寸，瘤载荷，瘤发生性细胞或瘤侵入性，和/或瘤转移的减少/降低或抑制来测量。
[0121] 术语“非人哺乳动物”指哺乳纲的所有成员，人除外。
[0122] 术语“啮齿动物”指啮齿目的所有成员，包括大鼠，小鼠，家兔，仓鼠，和豚鼠。
[0123] 详述
[0124] 结直肠癌(CRC)最初表现为大肠粘膜表面上的良性息肉。如果留着不切除的话，这些息肉会行进至侵入性腺癌，它们穿透结直肠壁的粘膜下层和外肌层，到达浆膜侧。最终到达肠淋巴结的区域性传播和到达肝的远程传播导致长出大体转移，它们是CRC死亡的主要原因。因此，译解CRC转移到这些部位的路径有潜力揭示可能影响死亡率的治疗机会。然而，关于转移路径的调查已经受到缺少CRC的有关体内转移模型可用阻碍。事实上，虽然CRC有多种异种移植物模型，化学诱导模型，和遗传工程模型(例如小鼠模型)可得(Heijstek et al.Dig.Surg.22:16-25,2005.Epub 2005 Apr14；Kobaek-Larsen et al.Comp.Med.50(1):16-26,2000；Rosenberg et al.Carcinogenesis.30(2):183-196,2009.Epub 2008 Nov 26；Taketo et al.Gastroenterology.136(3):780-798,2009)，但是这些模型中的瘤未能可再现地转移至区域性肠淋巴结和肝，即与人CRC有关的靶器官。
[0125] 结直肠癌的内腔植入模型
[0126] 本发明至少部分基于结直肠癌(CRC)的临床相关模型的开发。与CRC的已知模型不同，本发明的CRC模型是通过一种新颖内腔植入技术生成的，而且重要的是，它能够重演人CRC的病因。
[0127] 在生成CRC的内腔植入模型(LIM)中可以使用任何种，亚种，遗传性变型，组织变型，或其组合的非人动物(例如非人哺乳动物)。例如，非人哺乳动物可以是啮齿动物。啮齿动物种的例子包括但不限于大鼠，小鼠，仓鼠，家兔，豚鼠，和沙鼠。非人哺乳动物可以是雄性或雌性。非人哺乳动物可以是任何年龄，前提是能成功执行内腔植入技术。因而，例如，非人哺乳动物可以小于1周龄，约1周龄至约5年龄，约1周龄至约3年龄，约2周龄至约2年龄，约3周龄至约1年龄，约4周龄至约6月龄，约6周龄至约3月龄，约8周龄至约12周龄，大于3年龄，或大于5年龄。
[0128] 非人哺乳动物可以是野生型(例如免疫胜任型)或免疫缺陷型的。例如，当对接受者宿主非人哺乳动物的内腔植入异种(例如人)的捐献者细胞，瘤，或瘤发生性细胞时，宿主非人哺乳动物是免疫缺陷型的。然而，当对接受者宿主非人哺乳动物的内腔植入同基因的捐献者细胞，瘤，或瘤发生性细胞时，宿主非人哺乳动物可以是非免疫缺陷型(例如野生型)的。
[0129] 在某些情况中，非人哺乳动物为小鼠。小鼠可以是裸小鼠。小鼠可以是重度联合免疫缺陷型(SCID)小鼠，例如NOD/SCID白介素-2受体伽马链缺无(NSG)小鼠。NSG小鼠描述于Pearson et al.Curr.Top.Microbiol.Immunol.324:25-51,2008；
Shultz et al.Curr Top Microbiol Immunol.324:25-51,2005；Strom et al.Methods Mol.Biol.640:491-509,2010；McDermott et al.Blood.116(2):193-200,2010；
Lepus et al.Hum.Immunol.70(10):790-802,2009 ；Brehm et al.Clin
Immunol.135(l):84-98,2010。可使用任何合适的免疫缺陷型非人哺乳动物。合适的非人哺乳动物包括啮齿动物，它们可以自诸如Jackson Laboratory(Bar Harbor,Maine)，Charles River Laboratories International,Inc.(Wilmington,Massachusetts)，和Harlan Laboratories(Indianapolis,Indiana)等来源获得。
Shultz et al.Curr Top Microbiol Immunol.324:25-51,2005；Strom et al.Methods Mol.Biol.640:491-509,2010；McDermott et al.Blood.116(2):193-200,2010；
Lepus et al.Hum.Immunol.70(10):790-802,2009 ；Brehm et al.Clin
Immunol.135(l):84-98,2010。可使用任何合适的免疫缺陷型非人哺乳动物。合适的非人哺乳动物包括啮齿动物，它们可以自诸如Jackson Laboratory(Bar Harbor,Maine)，Charles River Laboratories International,Inc.(Wilmington,Massachusetts)，和Harlan Laboratories(Indianapolis,Indiana)等来源获得。
[0130] 内腔植入技术涉及植入一个或多个(例如1，2，3，4，5，10，20，30，40，50，102，103，4 5 6 7 8 9 10
10，10，10，10，10，10，或10 或更多个)能够在结肠粘膜表面(内腔侧)上植入且不破裂结肠壁的捐献者瘤发生性细胞。对于接受者非人哺乳动物宿主而言，捐献者瘤发生性细胞可以是同基因的(其中捐献者和接受者在遗传上是相同的)，同种异基因的(其中捐献者和接受者是不同遗传起源的但是相同物种的)，或异种的(其中捐献者和接受者来自不同物种，例如人)。捐献者瘤发生性细胞可以是侵入性的或非侵入性的，良性的或恶性的，转移性的或非转移性的。瘤发生性细胞可以是瘤细胞，或者，可以是例如胚胎细胞，改造成具有异常生长的细胞，癌细胞系，以及任何这些细胞类型的细胞团块。
10，10，10，10，10，10，或10 或更多个)能够在结肠粘膜表面(内腔侧)上植入且不破裂结肠壁的捐献者瘤发生性细胞。对于接受者非人哺乳动物宿主而言，捐献者瘤发生性细胞可以是同基因的(其中捐献者和接受者在遗传上是相同的)，同种异基因的(其中捐献者和接受者是不同遗传起源的但是相同物种的)，或异种的(其中捐献者和接受者来自不同物种，例如人)。捐献者瘤发生性细胞可以是侵入性的或非侵入性的，良性的或恶性的，转移性的或非转移性的。瘤发生性细胞可以是瘤细胞，或者，可以是例如胚胎细胞，改造成具有异常生长的细胞，癌细胞系，以及任何这些细胞类型的细胞团块。
[0131] 在植入超过一个捐献者瘤发生性细胞的情况中，植入的细胞可以是完整瘤，或其碎片。完整瘤或其碎片可以是完整恶性瘤，或其碎片，诸如在捐献者生物体中产生区域性转移(例如在肠淋巴结中)的III期CRC瘤或在捐献者生物体中产生远程转移(例如在肝或肺中)的IV期CRC瘤。或者，完整瘤或其碎片可以是完整良性或局部侵入性瘤，或其碎片，诸如局限于原发性起源的部位或组织的0期，I期，或II期CRC瘤，或其碎片。
[0132] 完整瘤，或其碎片不限于CRC瘤，或其碎片。例如，完整瘤，或其碎片可以是完整非CRC瘤，或其碎片，诸如但不限于乳腺癌瘤，肺癌瘤，肝癌瘤，脑癌瘤，淋巴结癌瘤，肾癌瘤，胃癌瘤，卵巢癌瘤，皮肤癌瘤，胰腺癌瘤，甲状腺癌瘤，或前列腺癌瘤，或其碎片。
[0133] 在接受者非人哺乳动物宿主的结肠粘膜表面上植入的完整瘤，或其碎片可以是实体瘤(例如结肠/CRC瘤，乳腺癌瘤，肺癌瘤，或肝癌瘤)，或其碎片。完整瘤，或其碎片可以衍生自任何合适的捐献者生物体，诸如人或小鼠。完整瘤，或其碎片可以来自特定细胞系，诸如CRC细胞系(例如HCT116，LS174T，或LoVo原发性人CRC衍生细胞系)或乳腺癌细胞系(例如MDA-231人乳腺癌细胞系)。
[0134] 植入的一个或多个捐献者瘤发生性细胞可以是任何集体尺寸的。在植入完整瘤，3 3
或其碎片的情况中，完整瘤，或其碎片为0.1-100mm左右的尺寸，例如1-100mm 左右的尺
3
寸，例如10mm左右的尺寸。
或其碎片的情况中，完整瘤，或其碎片为0.1-100mm左右的尺寸，例如1-100mm 左右的尺
3
寸，例如10mm左右的尺寸。
[0135] 植入部位可以是沿着非人哺乳动物的结肠粘膜表面的任何区域。在某些实施方案中，植入部位位于接受者非人哺乳动物的肛门附近，从而容许自植入部位取出植入的瘤的选项。在小鼠中，例如，优选瘤植入距离宿主小鼠的肛门约1-20mm(例如约5-15mm，例如约11-12.5mm)。
[0136] 一般而言，可以如下创建CRC的小鼠LIM，即麻醉小鼠(例如通过异氟烷吸入)，将小鼠仰卧位放置并四肢绑定，将钝端止血钳(Micro-Mosquito，No.13010-12，Fine Science Tools)或其它合适的工具插入肛门1cm左右，夹起一个粘膜折叠(例如通过将止血钳闭合至第一个缺刻)，收回和清洁外置的粘膜(例如用聚维酮/碘酒)，漂洗(例如用乳酸盐林3
格氏溶液)，并吸干。然后可以将一个或多个捐献者瘤发生性细胞(例如约10mm的捐献者瘤碎片或完整息肉)缝合到粘膜上(例如使用可吸收的4-0薇乔缝线(Ethicon))，确保缝线只穿透浅表粘膜层。将粘膜用PBS重水合后，可以将外置的结肠与缝合的瘤一起重插入，如此倒转直肠脱垂。为了最小化净化期间的瘤移动，可以自手术前3天左右至手术后7天左右在笼地板插件上饲养小鼠并供应100％啮齿动物液体饮食(AIN-76A，无纤维的酪蛋白水解产物；BioServe)。
格氏溶液)，并吸干。然后可以将一个或多个捐献者瘤发生性细胞(例如约10mm的捐献者瘤碎片或完整息肉)缝合到粘膜上(例如使用可吸收的4-0薇乔缝线(Ethicon))，确保缝线只穿透浅表粘膜层。将粘膜用PBS重水合后，可以将外置的结肠与缝合的瘤一起重插入，如此倒转直肠脱垂。为了最小化净化期间的瘤移动，可以自手术前3天左右至手术后7天左右在笼地板插件上饲养小鼠并供应100％啮齿动物液体饮食(AIN-76A，无纤维的酪蛋白水解产物；BioServe)。
[0137] 生成的CRC的非人哺乳动物LIM具有胜过已建立的CRC模型的众多优势，如下文实施例部分中证明的。LIM的这些优势包括但不限于与在现有的盲肠植入模型中在浆膜表面上植入瘤相比，在粘膜表面上植入瘤，导致：(i)在临床相关部位中产生远程转移的潜力，与现有的盲肠植入模型中瘤细胞脱落所致遍及腹膜腔的广泛传播瘤播散，而非实际的转移相比；(ii)将完整瘤碎片植入宿主小鼠的能力，代替现有的细胞悬浮液注射模型中不能维持瘤结构的细胞悬浮液；和(iii)维持结肠壁的完整性，与现有的细胞悬浮液注射模型中结肠壁穿孔的可能性相比。
[0138] 筛选抑制瘤发生的候选化合物
[0139] 例如，LIM可用于筛选拥有抗癌活性的候选化合物(例如抑制瘤发生性细胞生长的化合物)。抗癌活性可以包括在预防，延迟，减轻或抑制瘤生长和/或发展中直接或间接介导任何效果的活性，这可以为宿主提供有益效果。因此，候选化合物的抗癌活性可以表现为但不限于候选化合物直接或间接减少/降低或稳定下述各项的能力：瘤发生性细胞数目(例如将瘤发生性细胞数目减少至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多)，瘤尺寸(例如将瘤尺寸缩小至少20％，30％，40％，
50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多)，瘤载荷或负荷(例如将瘤载荷或负荷降低至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，
95％，96％，97％，98％，或99％或更多)，瘤发生性细胞侵入性(例如将组织附近的侵入性降低至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或
99％或更多)，和/或瘤转移(例如将转移和/或转移器官或组织数目减少至少20％，30％，
40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多)。因而，可以通过测定例如一项或多项涉及抑制LIM中瘤发生性细胞生长的上述效果的存在或缺失来评估候选化合物的抗癌活性，其中存在一项或多项对瘤发生性细胞生长的效果指示拥有抗癌活性的候选化合物。例如，关于测定对瘤尺寸和/或数目的效果，测定步骤可以包括在第一时间点和第二时间点测量瘤尺寸和/或数目，相对于在第一时间点测量到的瘤尺寸和/或数目比较在第二时间点测量到的瘤尺寸和/或数目。在一些情况中，关于瘤侵入性和转移，测定步骤可以包括通过大体视觉分析(例如在检测宏转移时)和/或通过组织学或细胞计数分析检测瘤侵入(例如穿过结肠壁到达结肠浆膜表面的侵入性瘤生长)或转移(例如肠淋巴结，肝，和/或肺中的转移)的存在或缺失。
50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多)，瘤载荷或负荷(例如将瘤载荷或负荷降低至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，
95％，96％，97％，98％，或99％或更多)，瘤发生性细胞侵入性(例如将组织附近的侵入性降低至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或
99％或更多)，和/或瘤转移(例如将转移和/或转移器官或组织数目减少至少20％，30％，
40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多)。因而，可以通过测定例如一项或多项涉及抑制LIM中瘤发生性细胞生长的上述效果的存在或缺失来评估候选化合物的抗癌活性，其中存在一项或多项对瘤发生性细胞生长的效果指示拥有抗癌活性的候选化合物。例如，关于测定对瘤尺寸和/或数目的效果，测定步骤可以包括在第一时间点和第二时间点测量瘤尺寸和/或数目，相对于在第一时间点测量到的瘤尺寸和/或数目比较在第二时间点测量到的瘤尺寸和/或数目。在一些情况中，关于瘤侵入性和转移，测定步骤可以包括通过大体视觉分析(例如在检测宏转移时)和/或通过组织学或细胞计数分析检测瘤侵入(例如穿过结肠壁到达结肠浆膜表面的侵入性瘤生长)或转移(例如肠淋巴结，肝，和/或肺中的转移)的存在或缺失。
[0140] 可以使用本发明的LIM来筛选抗癌活性的候选化合物包括但不限于合成的，天然发生的，或重组生成的分子，包括小分子，多核苷酸，肽，多肽，抗体，和免疫缀合物。可以自极其多种来源获得候选化合物，包括合成或天然化合物的文库。例如，有众多手段可用于极其多种有机化合物和生物分子的随机和定向合成，包括表达随机化的寡核苷酸和寡肽。或者，细菌，真菌，植物，和动物提取物形式的天然化合物文库是可得的或容易生成的。另外，天然的或合成生成的文库和化合物容易经由常规化学，物理，和生化手段来修饰，而且可用于生成组合文库。可以对已知的药理学药剂进行定向或随机化学修饰(诸如酰化，烷基化，酯化，和酰胺化)以生成结构类似物。
[0141] 可以以任何期望和/或适宜的方式以与优良医学实践一致的方式和为了检查抗癌活性来配制，定剂量，和施用候选化合物。可以使用本领域已知的标准方法通过混合具有期望纯度的活性组分与任选的生理学可接受载剂，赋形剂或稳定剂(Remington’s thPharmaceutical Sciences(20 edition),ed.A.Gennaro,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)在治疗性配制剂中制备候选化合物。可接受的载剂包括盐水，或缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约
10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；
TM TM
成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEEN ，PLURONICS ，或PEG。
10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；
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成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEEN ，PLURONICS ，或PEG。
[0142] 任选地，配制剂含有约生理学浓度的药学可接受盐(例如氯化钠)。任选地，本发明的配制剂可以含有药学可接受防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂的浓度范围为0.1至2.0％，典型的是v/v。合适的防腐剂包括药学领域已知的那些。苯甲醇，酚，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，和对羟基苯甲酸丙酯是优选的防腐剂。优选地，本发明的配制剂可以包括浓度
0.005至0.02％的药学可接受表面活性剂。
0.005至0.02％的药学可接受表面活性剂。
[0143] 候选化合物可以单一施用，或者可以与两种或更多种(例如3，4，或5或更多种)候选化合物组合，尤其是在施用化合物组合可导致协同效应的情况中。
[0144] 结直肠癌的辅助模型和筛选辅药
[0145] LIM还可用于生成CRC的辅助模型，随后要用于例如筛选拥有抗癌活性的辅药(例如抑制瘤发生性细胞生长的化合物)。为此，在植入后手术去除植入的原发性瘤，然后可以以与上文讨论的筛选抑制瘤发生生长的化合物类似的方式在非人哺乳动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)辅助模型上实施候选化合物的辅助筛选。
[0146] 在结直肠癌的这种辅助模型中，可以在植入后的对应于CRC疾病行进的不同阶段(例如0，I，II，III，或IV期)的各个时间点实施手术去除植入的原发性瘤。然后可以对相同或不同的候选化合物作为CRC不同阶段的治疗中的辅药测试功效。
[0147] 与对应未处理或对照处理的辅助模型相比在辅助设置中抑制瘤发生性细胞生长/重生长的候选化合物将候选化合物鉴定为辅药。
[0148] 可以在必要时以任何期望和/或适宜的方式以与优良医学实践一致的方式改变辅助疗法试验的持续时间，以及候选辅药或鉴定的辅药的配制剂，剂量，和施用路径，与上文所述用于主要疗法的候选化合物类似。实施例
[0149] 通过下面的实施例例示本发明，它们绝非意图限制本发明。
[0150] 实施例1。材料和方法
[0151] 本领域技术人员会认识到与本文中描述的材料和方法相似或等同的许多材料和方法，它们可用于实施本发明。事实上，本发明绝非限于下文描述的材料和方法。
[0152] 小鼠
[0153] 野生型NOD/SCID雌性小鼠(8-12周龄)购自Charles River Laboratories。Min/+
野生型NSG雌性小鼠(8-12周龄；物料编号005557)，Apc 小鼠(物料编号002020)，和12.4KbVilCre小鼠(物料编号004586；称作Villin-Cre)购自Jackson Laboratory。
LSLG12D/+
Kras 小鼠 得到Tyler Jacks(Massachusetts Institute of Technology)的 特
许。将来自集落编号4028的Apc/Kras化合物突变体小鼠与购自Jackson Laboratory的CAG-mRFP1小鼠(物料编号005884)交配。将来自集落编号4700的Apc/Kras化合物突变体小鼠与购自Jackson Laboratory的Rosa26-CAG-LSL-tdTomato小鼠(物料编号007909)交配。所有实验得到了Genentech动物科研伦理和方案审查委员会批准。
野生型NSG雌性小鼠(8-12周龄；物料编号005557)，Apc 小鼠(物料编号002020)，和12.4KbVilCre小鼠(物料编号004586；称作Villin-Cre)购自Jackson Laboratory。
LSLG12D/+
Kras 小鼠 得到Tyler Jacks(Massachusetts Institute of Technology)的 特
许。将来自集落编号4028的Apc/Kras化合物突变体小鼠与购自Jackson Laboratory的CAG-mRFP1小鼠(物料编号005884)交配。将来自集落编号4700的Apc/Kras化合物突变体小鼠与购自Jackson Laboratory的Rosa26-CAG-LSL-tdTomato小鼠(物料编号007909)交配。所有实验得到了Genentech动物科研伦理和方案审查委员会批准。
[0154] 细胞培养和基因转移
[0155] HCT116，LS174T，和LoVo原发性人结直肠癌衍生细胞系购自ATCC且在完全RPMI培养基(补充有10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素，和100mg/ml链霉素的RPMI1640)中于37℃和5％CO2维持。将细胞用TZV-CMV-Discosoma红色荧光蛋白(DsRed)慢病-1
毒载体(Open Biosystems)以感染复数(MOI)10在补充有8mg ml polybrene的完全RPMI培养基中于37℃和5％CO2转导6小时。在培养传4代后，在FACSAria(BO Biosciences)上通过荧光激活细胞分选分离DsRed阳性细胞。将分选的DsRed阳性细胞扩充2-3代，然后在液氮中保存。早代细胞用于所有体内实验。
毒载体(Open Biosystems)以感染复数(MOI)10在补充有8mg ml polybrene的完全RPMI培养基中于37℃和5％CO2转导6小时。在培养传4代后，在FACSAria(BO Biosciences)上通过荧光激活细胞分选分离DsRed阳性细胞。将分选的DsRed阳性细胞扩充2-3代，然后在液氮中保存。早代细胞用于所有体内实验。
[0156] 内腔植入技术
[0157] 通过异氟烷吸入来麻醉小鼠，以仰卧位放置，并用胶带将四肢绑定在纱布覆盖的平台上。将钝端止血钳(Micro-Mosquito，No.13010-12，Fine Science Tools)插入肛门约1cm，将止血钳拐向粘膜并略微打开，使得能通过将止血钳闭合至第一个缺刻而夹起一个粘膜折叠。自肛门收回止血钳，用聚维酮/碘酒清洁夹起的外置的粘膜，用乳酸盐林格氏溶3
液漂洗，并吸干。使用可吸收的4-0微乔缝线(Ethicon)将约10mm的捐献者瘤碎片或完整息肉缝合到粘膜上，确保缝线只穿透浅表粘膜层。将粘膜用PBS重水合后，释放止血钳并使用钝灌胃针将外置的结肠与缝合的瘤一起重插入，如此倒转直肠脱垂。平均瘤植入距离为距肛门11.8±0.5mm(n＝18)。手术后死亡率小于1％，伴有小于5％的小鼠中可归于可逆直肠脱垂的植入后2-4周的病态和可归于瘤负荷升高所致的重量减轻的植入后7周的病态。为了最小化净化期间的瘤移动，自手术前3天直至手术后7天在笼地板插件上饲养小鼠并供应100％啮齿动物液体饮食(AIN-76A，无纤维的酪蛋白水解产物；BioServe)。
液漂洗，并吸干。使用可吸收的4-0微乔缝线(Ethicon)将约10mm的捐献者瘤碎片或完整息肉缝合到粘膜上，确保缝线只穿透浅表粘膜层。将粘膜用PBS重水合后，释放止血钳并使用钝灌胃针将外置的结肠与缝合的瘤一起重插入，如此倒转直肠脱垂。平均瘤植入距离为距肛门11.8±0.5mm(n＝18)。手术后死亡率小于1％，伴有小于5％的小鼠中可归于可逆直肠脱垂的植入后2-4周的病态和可归于瘤负荷升高所致的重量减轻的植入后7周的病态。为了最小化净化期间的瘤移动，自手术前3天直至手术后7天在笼地板插件上饲养小鼠并供应100％啮齿动物液体饮食(AIN-76A，无纤维的酪蛋白水解产物；BioServe)。
[0158] 皮下瘤生成
[0159] 经胰蛋白酶消化收获细胞系，用锥虫蓝计数以评估存活力，并以100x106个细胞/ml的浓度在冷的完全RPMI培养基中重悬浮。以1:1比将冷的Matrigel(BD Biosciences)6
添加至细胞悬浮液以实现50x10个细胞/ml的最终细胞浓度。在100μl的体积中给NOD/
6
SCID小鼠在左体侧中皮下注射5x10个细胞。使用测径器测量瘤尺寸，并以0.523x长度x宽
3
度x宽度计算瘤体积。对于作为捐献者用于内腔植入技术的皮下瘤，收获1000-2000mm的
3
瘤，在显微镜下大体解剖掉坏死组织，将剩余的可存活组织分成10mm碎片，并在完全RPMI培养基中放置在冰上。
添加至细胞悬浮液以实现50x10个细胞/ml的最终细胞浓度。在100μl的体积中给NOD/
6
SCID小鼠在左体侧中皮下注射5x10个细胞。使用测径器测量瘤尺寸，并以0.523x长度x宽
3
度x宽度计算瘤体积。对于作为捐献者用于内腔植入技术的皮下瘤，收获1000-2000mm的
3
瘤，在显微镜下大体解剖掉坏死组织，将剩余的可存活组织分成10mm碎片，并在完全RPMI培养基中放置在冰上。
[0160] 内窥镜检查术
[0161] 在内窥镜成像之前，通过异氟烷吸入来麻醉小鼠，以仰卧位放置，并使用灌胃针将它们的结肠排空粪便。内窥镜成像设备组成如下：由检查和保护鞘包围的Hopkins II 0°直观1.9mm外径望远镜，附着于Mikata Point Setter望远镜夹持系统的Image-I高清晰度三芯片数字照相机，连接D Light System氙光源的光纤光导电缆，在成像期间维持结肠吹入的电子CO2吹入器，和连接高清晰度彩色监视器(Karl Storz)的AIDA Connect高清晰度文件记录系统。使用VLC媒体播放器(VideoLAN Team)观看内窥镜录像，并自这些录像捕捉静止图像。
[0162] 全器官成像和宏转移评估
[0163] 收获完整结肠，用PBS冲洗，纵向打开，钉在薄纸板片上，并对粘膜和浆膜二者成像。收获肝和肺，在PBS中清洗，并成像。使用附着于M80立体显微镜(Leica)的DFC295彩色数字照相机(Leica)对所有器官成像。使用S4立体显微镜(Leica)在视觉上评估宏观转移形成。对于肠淋巴结，对肛门至胃的整个肠道检查淋巴结累及的证据，并量化宏转移的数目。对于肝和肺，检查全器官的整个外表面，并量化宏转移的数目。在宏转移量化之后，将器官在含4％低聚甲醛的PBS中固定过夜。在4％低聚甲醛中的过夜固定之前，给肺灌注含4％低聚甲醛的PBS。使用参照测量刻度尺测定原发性结直肠瘤尺寸，并以0.523x长度x宽度x宽度计算瘤体积。
[0164] 组织消化和流式细胞术
[0165] 在GentieMACS解剖台(Miltenyi Biotec)上加工整个组织，在补充有1mg/ml胶原酶/分散酶的完全RPMI培养基中以210rpm摇动于37℃消化30分钟，并过滤穿过70μm滤器。在红血球裂解和离心之后，在补充有2％胎牛血清，20mM HEPES和5μg/ml碘化丙啶的PBS中重悬浮细胞，过滤入FACS管，并在FACSAria流式细胞仪(BO Biosystems)上分析。对于FACS对照，使用来自非荷瘤小鼠的正常组织，并建立DsRed阳性分析门使得在对照组
6
织标本中可检测到零DsRed阳性事件。每份标本分析平均5x10个可存活事件。数据表述
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成每1x10个可存活事件中DsRed阳性细胞的数目。
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织标本中可检测到零DsRed阳性事件。每份标本分析平均5x10个可存活事件。数据表述
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成每1x10个可存活事件中DsRed阳性细胞的数目。
[0166] 循环中的瘤细胞
[0167] 通过CO2吸入对小鼠施以安乐死。在呼吸平息后，立即张开胸腔以暴露心。将装有27号针的注射器插入心的右室，并取出约50μl血。立即将血转移至EOTA包被的Microtainer管(BD Biosciences)。在红血球裂解后，在补充有2％胎牛血清，20mM HEPES，和5μg/ml碘化丙啶的PBS中重悬浮血样品，并通过流式细胞术分析。对于FACS对照，使用来自非荷瘤小鼠的血，并建立DsRed阳性分析门使得在对照血标本中可检测到零DsRed6 6
阳性事件。每份标本分析平均5x10个可存活事件。数据表述成每1x10 个可存活事件中DsRed阳性细胞的数目。
阳性事件。每份标本分析平均5x10个可存活事件。数据表述成每1x10 个可存活事件中DsRed阳性细胞的数目。
[0168] 人结直肠癌临床标本
[0169] 自Bio-options Inc.获得依照联邦和州指导方针来自同意的患者的新鲜切除的人结直肠癌标本。标本在补充有10％胎牛血清，谷氨酰胺，万古霉素，甲硝唑，头孢噻肟，两性霉素B，青霉素，链霉素，和蛋白酶抑制剂混合物的DMEM高葡萄糖培养基中于4℃船运过3
夜。将标本切成约2mm瘤碎片，并在购自Harlan Sprague Dawley的无胸腺nu/nu雄性小鼠(6-8周龄)的肾囊下植入碎片个体。植入后6个月，使用在肾囊下生长的瘤作为捐献者
3
瘤，并将约2mm捐献者瘤碎片植入NOD/SCID小鼠的结肠内腔。
夜。将标本切成约2mm瘤碎片，并在购自Harlan Sprague Dawley的无胸腺nu/nu雄性小鼠(6-8周龄)的肾囊下植入碎片个体。植入后6个月，使用在肾囊下生长的瘤作为捐献者
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瘤，并将约2mm捐献者瘤碎片植入NOD/SCID小鼠的结肠内腔。
[0170] 抗VEGF-A和抗VEGF-C抗体
[0171] 抗VEGF-A单克隆抗体G6-31先前已有描述(美国专利No.7,758,859；Liang et al.J.Biol.Chem.281(2):951-961,2006.Epub 2005 Nov 7)。通过针对成熟形式的人VEGF-C(R&D Systems)的选择，自在单一框架上构建的合成噬菌体抗体文库(Lee et al.J.Mol.Biol.340:1073-1093,2004)分离抗VEGF-C单克隆抗体VC4.5。验证了一个阳性克隆VC4作为全长IgG阻断人VEGF-C和人VEGFR3之间的相互作用，抑制VEGF-C诱导的细胞活性且交叉结合鼠VEGF-C。如先前描述的(Lee et al.Blood.108:3103-3111,2006.Epub 2006 Jul 13)用噬菌体展示选择将VC4进一步亲和力改进至VC4.5，显示出改进阻断VEGF-C进行受体结合和细胞信号传导的效力。VC4.5展现相似的对人和鼠VEGF-C的亲和力(Kd＝0.3-1nM)，如通过在芯片上固定化VC4.5IgG或VEGF-C任一使用BIAcore仪器通过表面等离振子共振测量测定的。如果需要，可以利用其它抗VEGF-A或抗VEGF-C抗体。
[0172] 血管靶向
[0173] 在内腔植入前1天，通过腹膜内注射用功能阻断性单克隆抗体抗VEGF-A(G6-31；5mg/kg，在PBS中)和/或抗VEGF-C(VC4.5；40mg/kg，在PBS中)处理NOD/SCID小鼠。在第0天，将HCT116-DsRed瘤碎片植入到结肠粘膜上。每周一次施用抗体。
[0174] 组织病理学和免疫染色
[0175] 将组织在含4％低聚甲醛的PBS中固定过夜，在PBS中漂洗，在含30％蔗糖的PBS中于4℃防冻过夜，在OCT(Optimal Cutting Temperature，最佳切割温度)化合物中包埋，于-80℃冷冻，并以8μm切片。对于组织病理学分析，使用Jung Autostainer XL(Leica)将组织切片用苏木精和曙红(H&E)染色，并使用NanoZoomer(Hamamatsu)获取全组织切片扫描。对于免疫组织化学分析，将组织切片与一抗一起于4℃温育过夜，并与二抗一起于室温温育30分钟。使用的一抗为家兔抗胶原IV(多克隆ab6586；Abcam；1:100稀释)，山羊抗DsRed(多克隆sc-33354；Santa Cruz Biotechnology；1:100稀释)，和大鼠抗泛内皮细胞标志物(克隆MECA-32；Pharmingen；2μg/ml)。将使用的二抗缀合至Alexa Fluor 488或594(Invitrogen)。在配有ORCA-ER数字照相机(Hamamatsu)的Axioplan 2成像显微镜(Zeiss)上获取图像。血管密度表述成MECA-32阳性血管面积与总DAPI阳性可存活瘤面积之比乘以100。由具有CRC疾病专业知识的经过训练的病理学家检查组织学标本。
[0176] 统计学分析
[0177] 通过双尾Student氏t检验来评估组差异。通过Pearson相关系数来评估相关性。使用实际的小鼠数目作为输入数据，通过双侧卡方检验来评估偶然性分析。对于Min/+Kaplan-Meier存活分析，使用时序检验来计算P值，并使用Apc ；Villin-Cre小鼠作为比较物来计算危害比。认为小于0.05的P值是显著的。
[0178] 实施例2。开发结直肠癌的临床相关内腔植入模型
[0179] 肠癌的最广泛利用的遗传工程小鼠模型是ApcMin/+小鼠，它在一个Apc等位基Min/+因中怀有一处显性无义突变(Su et al.Science.256(5057):668-670,1992)。Apc
小鼠在肠道内形成众多腺瘤；然而，如果有过的话，这些腺瘤罕见行进至侵入性或转移腺癌(Moser et al.Science.247(4940):322-324,1990)。此外，这些腺瘤主要位于小肠，相对较少的腺瘤出现在结肠中(Moser et al.Science.247(4940):322-324,1990)。
对突变型Apc背景引入致瘤性Kras促进肠腺瘤多重性(Janssen et al.Gast
roenterology.131(4):1096-1109,2006.Epub 2006 Aug 16；Luo et al.Int.
J.Exp.Pathol.90(5):558-574,2009)且 加 速行 进 至 侵 入性 (Janssen et al.Gastroenterology.131(4):1096-1109,2006.Epub 2006 Aug 16；Haigis et al.Nat.
Genet.40(5):600-608,2008.Epub 2008 Mar 30；Sansom et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.103(38):14122-14127,2006.Epub 2006 Sep 7)，结肠的相关解剖学位置中的瘤形成得到显著增强(Luo et al.Int.J.Exp.Pathol.90(5):558-574,2009)。通过转基因RT-PCR(Janssen et al.Gastroenterology.131(4):1096-1109,2006.Epub 2006 Aug 16)或大体观察(Hung et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.107:1565-1570,2010)，在Apc/Kras化合物突变体小鼠中尚未观察到肠淋巴结转移的形成，只在20-27％的Apc/Kras化合物Min/+ LSLG12D/+
突变体小鼠中检测到远程肝转移。我们生成了Apc ；Kras ；Villin-Cre化合物
Min/+ LSLG12D
突变体小鼠(在Apc 背景上携带Cre依赖性活化的Kras等位基因(Kras )的小
鼠与携带遍及肠指导Cre重组酶表达的Villin-Cre转基因的小鼠交配)，并确认了与Min/+
Apc ；Villin-Cre对照小鼠相比结肠中瘤形成的增强(图1A-1C)。然而，作为肠瘤发Min/+ LSLG12D/+
生加速的一项后果，Apc ；Kras ；Villin-Cre小鼠展现显著缩短的寿命(图1D)，与先前的报告(Luo et al.Int.J.Exp.Pathol.90(5):558-574,2009；Haigis et al.Nat.Genet.40(5):600-608,2008.Epub 2008 Mar 30)一致。注意，在大约9周龄时病态发作时的疾病状态保持良性，如通过原发性结肠瘤未能侵入穿过到达结肠壁的浆膜侧和肝中没有转移形成(图1B)证明的。
小鼠在肠道内形成众多腺瘤；然而，如果有过的话，这些腺瘤罕见行进至侵入性或转移腺癌(Moser et al.Science.247(4940):322-324,1990)。此外，这些腺瘤主要位于小肠，相对较少的腺瘤出现在结肠中(Moser et al.Science.247(4940):322-324,1990)。
对突变型Apc背景引入致瘤性Kras促进肠腺瘤多重性(Janssen et al.Gast
roenterology.131(4):1096-1109,2006.Epub 2006 Aug 16；Luo et al.Int.
J.Exp.Pathol.90(5):558-574,2009)且 加 速行 进 至 侵 入性 (Janssen et al.Gastroenterology.131(4):1096-1109,2006.Epub 2006 Aug 16；Haigis et al.Nat.
Genet.40(5):600-608,2008.Epub 2008 Mar 30；Sansom et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.103(38):14122-14127,2006.Epub 2006 Sep 7)，结肠的相关解剖学位置中的瘤形成得到显著增强(Luo et al.Int.J.Exp.Pathol.90(5):558-574,2009)。通过转基因RT-PCR(Janssen et al.Gastroenterology.131(4):1096-1109,2006.Epub 2006 Aug 16)或大体观察(Hung et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.107:1565-1570,2010)，在Apc/Kras化合物突变体小鼠中尚未观察到肠淋巴结转移的形成，只在20-27％的Apc/Kras化合物Min/+ LSLG12D/+
突变体小鼠中检测到远程肝转移。我们生成了Apc ；Kras ；Villin-Cre化合物
Min/+ LSLG12D
突变体小鼠(在Apc 背景上携带Cre依赖性活化的Kras等位基因(Kras )的小
鼠与携带遍及肠指导Cre重组酶表达的Villin-Cre转基因的小鼠交配)，并确认了与Min/+
Apc ；Villin-Cre对照小鼠相比结肠中瘤形成的增强(图1A-1C)。然而，作为肠瘤发Min/+ LSLG12D/+
生加速的一项后果，Apc ；Kras ；Villin-Cre小鼠展现显著缩短的寿命(图1D)，与先前的报告(Luo et al.Int.J.Exp.Pathol.90(5):558-574,2009；Haigis et al.Nat.Genet.40(5):600-608,2008.Epub 2008 Mar 30)一致。注意，在大约9周龄时病态发作时的疾病状态保持良性，如通过原发性结肠瘤未能侵入穿过到达结肠壁的浆膜侧和肝中没有转移形成(图1B)证明的。
[0180] 鉴于Apc/Kras化合物突变体瘤展现早期恶性行进的特征(Janssen et al.Gastroenterology.131(4):1096-1109,2006.Epub 2006 Aug 16；Haigis et al.Nat.Genet.40(5):600-608,2008.Epub 2008 Mar 30；Sansom et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.103(38):14122-14127,2006.Epub 2006 Sep 7)，我们假定在体内维持化合物突变体瘤超出Apc/Kras突变体小鼠缩短的寿命可能能够实现转移潜力。因此，我们致力于在宿Min/+ LSLG12D/+主野生型C57BL/6小鼠结肠的粘膜层内移植一个完整Apc ；Kras ；Villin-Cre捐
献者瘤，因为这会如实地代表处于临床0期且有潜力行进至IV期疾病的同位原发性结直肠瘤。至今已经描述了数种结肠同位移植技术，包括直接将癌细胞悬浮液注射入直肠粘膜(Donigan et al.Surg.Endosc.24(3):642-647,2010.Epub 2009 Aug 18)或盲肠的浆膜壁(Cespedes et al.Am.J.Patho1.170(3):1077-1085,2007)，the粘膜电凝以促进瘤细胞摄取后将瘤细胞悬浮液灌输入结肠内腔(Bhullar et al.J.Am.Call.Surg.213(1):54-60；
discussion 60-61,2011.Epub 2011 Mar 31)，和将完整瘤碎片手术植入到盲肠壁的浆膜 侧 上(Fu et al.Natl.Acad.Sci.USA.88(20):9345-9349,1991；Jin et al.Tumour.Biol.32(2):391-397,2011.Epub 2010 Nov 19)。盲肠植入物规程的一项缺点是在盲肠壁的浆膜侧上植入瘤，如此绕开了原发性瘤侵入穿过粘膜到达浆膜以使转移发生的要求。重要的是，所有这些已建立的技术的一项主要警告是瘤细胞无意播种入腹膜空间的潜力，无论来自瘤细胞注射入粘膜期间结肠壁破裂，或者来自返回腹膜腔后瘤细胞自盲肠植入物脱落。事实上，虽然已经利用这些技术来生成据报告在肠淋巴结，肝和肺中形成转移的结直肠癌(CRC)的小鼠模型，但是这些技术还引起广泛传播的腹膜癌病(Bhullar et al.J.Am.Call.Surg.213(1):54-60；discussion 60-61,2011.Epub 2011 Mar 31；
Cespedes et al.Am.J.Patho1.170(3):1077-1085,2007；Fu et al.Natl.Acad.Sci.USA.88(20):9345-9349,1991；Jin et al.Tumour.Biol.32(2):391-397,2011.Epub 2010 Nov 19)。因此，看似可信的是，这些继发性部位中的瘤形成可能不是真实的转移，而是腹膜播种的结果。腹膜癌病不是人转移CRC的突出特征(Klaver et al.World.J.Gastroenterl.18(39):5489-5494,2012)，这进一步提示这些模型对于调查转移播散路径的有限效用。
献者瘤，因为这会如实地代表处于临床0期且有潜力行进至IV期疾病的同位原发性结直肠瘤。至今已经描述了数种结肠同位移植技术，包括直接将癌细胞悬浮液注射入直肠粘膜(Donigan et al.Surg.Endosc.24(3):642-647,2010.Epub 2009 Aug 18)或盲肠的浆膜壁(Cespedes et al.Am.J.Patho1.170(3):1077-1085,2007)，the粘膜电凝以促进瘤细胞摄取后将瘤细胞悬浮液灌输入结肠内腔(Bhullar et al.J.Am.Call.Surg.213(1):54-60；
discussion 60-61,2011.Epub 2011 Mar 31)，和将完整瘤碎片手术植入到盲肠壁的浆膜 侧 上(Fu et al.Natl.Acad.Sci.USA.88(20):9345-9349,1991；Jin et al.Tumour.Biol.32(2):391-397,2011.Epub 2010 Nov 19)。盲肠植入物规程的一项缺点是在盲肠壁的浆膜侧上植入瘤，如此绕开了原发性瘤侵入穿过粘膜到达浆膜以使转移发生的要求。重要的是，所有这些已建立的技术的一项主要警告是瘤细胞无意播种入腹膜空间的潜力，无论来自瘤细胞注射入粘膜期间结肠壁破裂，或者来自返回腹膜腔后瘤细胞自盲肠植入物脱落。事实上，虽然已经利用这些技术来生成据报告在肠淋巴结，肝和肺中形成转移的结直肠癌(CRC)的小鼠模型，但是这些技术还引起广泛传播的腹膜癌病(Bhullar et al.J.Am.Call.Surg.213(1):54-60；discussion 60-61,2011.Epub 2011 Mar 31；
Cespedes et al.Am.J.Patho1.170(3):1077-1085,2007；Fu et al.Natl.Acad.Sci.USA.88(20):9345-9349,1991；Jin et al.Tumour.Biol.32(2):391-397,2011.Epub 2010 Nov 19)。因此，看似可信的是，这些继发性部位中的瘤形成可能不是真实的转移，而是腹膜播种的结果。腹膜癌病不是人转移CRC的突出特征(Klaver et al.World.J.Gastroenterl.18(39):5489-5494,2012)，这进一步提示这些模型对于调查转移播散路径的有限效用。
[0181] 为了规避这些问题，我们已经开发了一种直肠脱垂诱导技术，它外置宿主结肠的Min/+ LSLG12D/+内腔，如此使得结肠粘膜表面服从手术操作(图2)。使用6-9周龄Apc ；Kras ；
Villin-Cre小鼠作为捐献者，我们将一个完整捐献者结肠瘤手术植入野生型C57Bl/6宿主结肠。注意，在植入前没有将捐献者瘤解离成单细胞，而是维持完整瘤组织，因为这会保留瘤细胞-基质细胞相互作用，以及细胞外基质相互作用。这些完整捐献者瘤在粘膜层内变成建立的并展现长期体内存留，如通过连续内窥镜检查术(图3A和3B)和植入后9周时的大体结肠活检(图1E)证明的。在由于年龄相关病态而处死宿主小鼠时，虽然绝大多数植入的捐献者瘤保持良性(图1F，3A，和3B)，但是一个小鼠子集展现恶性行进，捐献者瘤侵入穿过结肠壁，伴随肠淋巴结和肝转移形成(图1G)。鉴于在植入后51-92周(wpi)的植入时间只在17只中的3只(17.6％)宿主小鼠中观察到恶性行进(图1H)，我们的数据支持瘤行进和转移发生要求延长的时间段上别的遗传，外遗传，和/或微环境变化。
Villin-Cre小鼠作为捐献者，我们将一个完整捐献者结肠瘤手术植入野生型C57Bl/6宿主结肠。注意，在植入前没有将捐献者瘤解离成单细胞，而是维持完整瘤组织，因为这会保留瘤细胞-基质细胞相互作用，以及细胞外基质相互作用。这些完整捐献者瘤在粘膜层内变成建立的并展现长期体内存留，如通过连续内窥镜检查术(图3A和3B)和植入后9周时的大体结肠活检(图1E)证明的。在由于年龄相关病态而处死宿主小鼠时，虽然绝大多数植入的捐献者瘤保持良性(图1F，3A，和3B)，但是一个小鼠子集展现恶性行进，捐献者瘤侵入穿过结肠壁，伴随肠淋巴结和肝转移形成(图1G)。鉴于在植入后51-92周(wpi)的植入时间只在17只中的3只(17.6％)宿主小鼠中观察到恶性行进(图1H)，我们的数据支持瘤行进和转移发生要求延长的时间段上别的遗传，外遗传，和/或微环境变化。
[0182] 实施例3。使用CRC的内腔植入模型，转移性播散的路径
[0183] 在一项缩短我们的模型中恶性行进的时帧，使得能询问转移路径的努力中，我们将我们的内腔植入技术应用于分化较差的HCT116人CRC衍生细胞系。用编码红色荧光蛋3
白DsRed的基因转导HCT116细胞，并皮下植入小鼠以生成捐献者异种移植物瘤。将约10mm捐献者瘤碎片手术植入到宿主NOD/SCID小鼠结肠的粘膜表面上后，使用离体大体成像(图
4A)和体内内窥镜检查术(图4B)来监测瘤摄取率和随时间的生长(图4C)。植入的瘤首先在结肠的内腔空间内建立并生长(图4A和4B)，植入后1周作为粘膜内癌可检测到一个瘤灶(图4D和4E)。植入后立即进行的组织学评估确认了植入规程没有破裂结肠壁的厚度，因为原发瘤唯独定位在结肠的粘膜表面上(图5A，5B，5D，和5E)，较深壁层的完整性得到维持(图5C和5F)。植入后第1天也没有瘤细胞播散的证据，如通过流式细胞术评估的(图5G)。
白DsRed的基因转导HCT116细胞，并皮下植入小鼠以生成捐献者异种移植物瘤。将约10mm捐献者瘤碎片手术植入到宿主NOD/SCID小鼠结肠的粘膜表面上后，使用离体大体成像(图
4A)和体内内窥镜检查术(图4B)来监测瘤摄取率和随时间的生长(图4C)。植入的瘤首先在结肠的内腔空间内建立并生长(图4A和4B)，植入后1周作为粘膜内癌可检测到一个瘤灶(图4D和4E)。植入后立即进行的组织学评估确认了植入规程没有破裂结肠壁的厚度，因为原发瘤唯独定位在结肠的粘膜表面上(图5A，5B，5D，和5E)，较深壁层的完整性得到维持(图5C和5F)。植入后第1天也没有瘤细胞播散的证据，如通过流式细胞术评估的(图5G)。
[0184] 0期息肉不变地行进至I期瘤，它破裂粘膜下/外肌层，使得到植入后2-3周穿透穿过外肌层的富含胶原IV的基底膜(Vreemann et al.Biol.Chem.390:481-492,2009)到达结肠壁浆膜侧的侵入性II期腺癌是明显的(图4A和6)。注意，在植入后3周，在邻近(图4F-4H)和远离(图4F和4I)原发性腺癌的结肠壁内均可检测到侵入性瘤细胞的个别簇。原发性腺癌的继续扩充在结肠壁的浆膜侧上优势发生(图4A和6)，其程度为甚至在植入后7周的收获终点内腔阻塞并不明显。而是，植入后7周时的动物病态主要可归于原发瘤负荷所致的重量减轻，即在具有较晚期疾病的CRC患者中也观察到的一种常见症状(Jellema et al.BMJ.340:1269,2010)。
[0185] 作为用于生成行进至II期腺癌的0期结直肠瘤的一种可行技术开发了内腔植入后，我们接下来对荷瘤小鼠评估对应于III/IIV期疾病的区域性和/或远程转移行进的证据。在植入后6-7周时，作为位于与结肠壁平行的引流淋巴管网内的浆膜附近的宏观瘤节结，可检测到区域性肠淋巴结转移(图7A，8A，和8I)。结肠壁内瘤细胞的局部区域性传播也是突出的，原发瘤部位(图8A，8D，和8E)的近处(图8A和8F)和远处(图7A和8A-8C)均有。重要的是，小鼠还展现造血(图8G)，淋巴(图8J)和神经周(图8H)瘤细胞侵入，并与远程宏观DsRed阳性肝(图7B)和肺(图7C)转移一起呈现。为了更好地表征宏观转移显现的时机，我们经由大体检查实施了转移负荷的时间评估，并确定了宏转移主要在植入后约4周呈现(图7D)。然而，宏转移呈现不产生关于微观疾病播散的精确时机的信息。因此，我们将整个肝，肺，和肠边缘血管束(涵盖结肠旁，中间，和主要肠淋巴结)离解成单细胞并通过流式细胞术监测DsRed阳性瘤细胞。主要在植入后约3周时可检测到播散的瘤细胞，即在显现出大体宏转移前一周(图7E)。我们通过DsRed免疫荧光确认了植入后3周时肝和肺内存在播散的瘤细胞，尽管在大体或组织病理学水平均没有可检测到的疾病(图
7F和7G)。这些发现证明HCT116结直肠瘤的内腔植入是一种可存活体内模型，它以时间方式转移至与人疾病有关的区域性和远程部位。
7F和7G)。这些发现证明HCT116结直肠瘤的内腔植入是一种可存活体内模型，它以时间方式转移至与人疾病有关的区域性和远程部位。
[0186] 我们接下来测定如果使用不同起源的结直肠瘤作为捐献者的话，内腔植入规程是否会产生相似的行进和转移概况。为此，我们使用分化较好的原发性人CRC衍生LS174T细胞系。我们用编码DsRed的慢病毒转导LS174T细胞，在捐献者小鼠中生成LS174T-DsRed皮下瘤，并将捐献者瘤碎片移植到宿主小鼠结肠的粘膜表面上。与内腔植入的HCT116瘤相似，内腔植入的LS174T瘤首先在粘膜层内生长并最终侵入穿过结肠壁，使得在植入后8周收获终点时原发瘤负荷的大体位于壁的浆膜侧上(图9A和9B)。值得注意的是，肝，肺，和区域性淋巴结中的转移长出在这种模型中也是明显的，尽管具有比荷HCT116瘤小鼠中要长的潜伏期(图9A和9C-9E)。使用原发性人患者CRC瘤作为捐献者，通过显示内腔植入的来自II期患者的瘤保持非转移性的，而内腔植入的来自III期患者的瘤产生肠淋巴结转移，我们进一步证明了这种模型的效用(图10A-10C)。
[0187] 表1汇总使用CRC的内腔植入模型(LIM)将多种类型和来源的结直肠捐献者瘤内腔植入多种株的宿主小鼠后的瘤摄取率。摄取率定义为经历成功捐献者瘤移植的宿主小鼠的总数除以尝试手术移植的宿主小鼠的总数，表述为百分比。这些发现突显了LIM中疾病行进的临床适用性。
[0188] 表1。内腔植入结直肠后的瘤摄取率
[0189]
[0190] 实施例4。使用CRC的内腔植入模型，对临床相关部位的强力转移
[0191] 在临床中，某些瘤类型专门转移至某些器官(Fidler et al.Nat.Rev.Cancer.3(6):453-458,2003)。确实，CRC主要转移至区域性肠淋巴结，肝，和肺，而很大程度上不伤害其它器官(Chambers et al.Nat.Rev.Cancer.2(8):563-572,2002)。为了确定CRC的LIM是否会精确重演在人中观察到的优先靶器官特异性，我们在植入后6-7周通过宏观检查和DsRed阳性瘤细胞流式细胞术二者评估了多种内脏中的转移性瘤负荷。携带内腔植入的HCT116-DsRed瘤的NOD/SCID小鼠优先在肝，肺，和肠淋巴结中形成转移，在肾上腺，肾，脾，脑，和骨髓中可检测到最小限度的转移性负荷(图11A，11B，和12A)。这种优先靶器官归巢在将HCT116瘤植入更加高度免疫受损的NOD/SCID白介素-2受体伽马链缺无(NSG)小鼠株的结肠时得到维持(图11C-11G)，尽管NSG(图11A和11B)中的肝，肺，和肠淋巴结内的转移性性瘤负荷与NOD/SCID(图7B，7C，11A，和11B)小鼠相比有显著升高。原发性瘤转移潜力的这种增强可部分归于NSG小鼠中缺少天然杀伤细胞活性，与先前的报告(Ikoma et al.Oncol.Rep.14(3):633-637,2005；Quintana et al.Nature.456:593-598,2008)一致。重要的是，我们从未在任何我们的接受移植的NOD/SCID或NSG宿主小鼠中观察到腹膜癌病，那是迄今为止先前报告的CRC模型中普遍的一项特征(Bhullar et al.J.Am.Call.Surg.213(1):54-60；discussion 60-61,2011.Epub
2011 Mar 31；Cespedes et al.Am.J.Patho1.170(3):1077-1085,2007；Fu et al.Natl.Acad.Sci.USA.88(20):9345-9349,1991；Jin et al.Tumour.Biol.32(2):391-397,2011.Epub 2010 Nov 19)。鉴于腹膜癌病并非人CRC中的常见表现(Klaver et al.World.J.Gastroenterl.18(39):5489-5494,2012)，我们的发现进一步突显了我们的转移性CRC模型胜过文献中已经报告的那些的相关性和优势。
2011 Mar 31；Cespedes et al.Am.J.Patho1.170(3):1077-1085,2007；Fu et al.Natl.Acad.Sci.USA.88(20):9345-9349,1991；Jin et al.Tumour.Biol.32(2):391-397,2011.Epub 2010 Nov 19)。鉴于腹膜癌病并非人CRC中的常见表现(Klaver et al.World.J.Gastroenterl.18(39):5489-5494,2012)，我们的发现进一步突显了我们的转移性CRC模型胜过文献中已经报告的那些的相关性和优势。
[0192] 为了确定HCT116细胞是否能够不管植入部位而转移，我们在NOD/SCID和NSG小鼠二者中皮下植入HCT116-DsRed细胞，并评估转移性负荷。在NOD/SCID(图11A，11B，12B，和12C)和NSG(图11A，11B，11H，和11I)小鼠株二者中，皮下植入的瘤与它们的内腔植入的对应物相比并没有容易转移。用植入皮下和内腔部位的原代患者结直肠瘤标本观察到类似的发现。NOD/SCID小鼠中的尺寸匹配和时间匹配的植入后6周HCT116瘤的组织学评估揭示了，尽管皮下植入的瘤是高度坏死的，然而内腔植入的瘤几乎完全没有坏死(图13A和13B)。这种坏死缺失可归于内腔植入的瘤中增强的血管化，如通过MECA-32对内皮细胞的免疫染色证明(图13C-13E)，这继而可归于粘膜较之皮下植入部位增强的血管密度。鉴于相对于皮下植入的瘤而言，内腔植入的瘤展现升高的血管密度，伴随升高的转移，我们试图确定循环中的瘤细胞(CTC)数目是否能反映转移潜力，正如临床中已经报告的(Cohen et al.J.Clin.Oncol.26(19):3213-3221,2008)。一致的是，在NOD/SCID和NSG小鼠二者中，内腔植入的瘤产生比皮下植入的瘤要多约100倍的CTC，内腔植入的NSG小鼠展现比内腔植入的NOD/SCID小鼠要大大约2.5倍的CTC数目(图11J)。因此，内腔植入后有力的转移形成与升高的原发性瘤血管化有关，后者继而与增强的瘤细胞进入循环有关。综上所述，这些发现不支持HCT 116瘤中的内在转移表型，而是突显了相同瘤细胞能根据它们的原发性瘤微环境展现显著不同的转移能力的实情。
[0193] 实施例5。结直肠癌细胞转移至肝能不依赖淋巴结转移中介而发生
[0194] 迄今为止，没有CRC体内模型展现可预测性且可再现的来自同位建立的原发性结直肠瘤的在相关靶器官内的远程转移长出(Heijstek et al.Dig.Surg.22:16-25,2005.Epub 2005 Apr 14；Kobaek-Larsen et al.Comp.Med.50(1):16-26,2000；Rosenberg et al.Carcinogenesis.30(2):183-196,2009.Epub 2008 Nov 26；Taketo et al.Gastroenterology.136(3):780-798,2009)。缺少可用的模型排除了关于对远程器官的转移性传播的路径的调查。在临床中，不知道肝中的结直肠转移是否是区域性肠淋巴结的初始建群所继发的，或者这些肝转移是否是经来自原发性瘤的直接造血传播而发生的，不依赖淋巴结转移性生长(Bacac et al.Annu.Rev.Pathol.3:221-247,2008)。第一种假说得到下述观察结果支持：(i)分期标准基于癌传播的程度；单独的肠淋巴结转移的临床表现指示III期疾病，而存在肝转移是更加晚期的IV期诊断的原因(Schwartz et al.Am.J.Health.Syst.Pharm.65(11):S8-14,S22-24,2008)，(ii) 已经报告了远程肝转移和肠淋巴结转移的高共发生(Derwinger et al.World.J.Surg.Oncol.6:127,2008)，(iii)原发性瘤淋巴管密度与对淋巴结和肝二者的转移有关(Saad et al.Mod.Pathol.19(10):1317-1323.Epub 2006 Jun 23)，和(iv)瘤细胞进入淋巴系统推测早于进入造血脉管系统，原因在于不连续的基底膜和缺少周细胞覆盖(Saharinen et al.Trends.Immunol.25(7):387-395,2004)。数项观察结果支持第二种假说，包括：
(i)一些CRC患者在淋巴结累及缺失下呈现肝转移(Derwinger et al.World.J.Surg.Oncol.6:127,2008)，(ii)手术去除III期CRC患者中增多数目的引流肠淋巴结可能不改善总体存活(Prandi et al.Ann.Surg.235(4):458-463,2002；Tsikitis et al.J.Am.Coll.Surg.208(1):42-47,2009；Wong et al.JAMA.298(18):2149-2154,2007)，和(iii)原发性瘤的静脉侵入是CRC中远程肝转移形成的一项独立预后指标(Suzuki et al.Am.J.Surg.Pathol.33(11):1601-1607,2009)。作为重演人CRC转移向性的临床相关模型开发LIM之后，我们处于独特的位置来询问播散路径。在患者中，在淋巴结转移的存在/缺失和肝转移的存在/缺失之间存在关联(Derwinger et al.World.J.Surg.Oncol.6:127,2008)。在我们的NOD/SCID和NSG内腔植入模型二者中，淋巴结转移性负荷(牵涉的淋巴结的总数和淋巴结内的总DsRed阳性瘤细胞负荷二者)并非与肝转移负荷有关(图14A和14B)，提示淋巴结和肝的播散可能经截然不同的路径发生。
(i)一些CRC患者在淋巴结累及缺失下呈现肝转移(Derwinger et al.World.J.Surg.Oncol.6:127,2008)，(ii)手术去除III期CRC患者中增多数目的引流肠淋巴结可能不改善总体存活(Prandi et al.Ann.Surg.235(4):458-463,2002；Tsikitis et al.J.Am.Coll.Surg.208(1):42-47,2009；Wong et al.JAMA.298(18):2149-2154,2007)，和(iii)原发性瘤的静脉侵入是CRC中远程肝转移形成的一项独立预后指标(Suzuki et al.Am.J.Surg.Pathol.33(11):1601-1607,2009)。作为重演人CRC转移向性的临床相关模型开发LIM之后，我们处于独特的位置来询问播散路径。在患者中，在淋巴结转移的存在/缺失和肝转移的存在/缺失之间存在关联(Derwinger et al.World.J.Surg.Oncol.6:127,2008)。在我们的NOD/SCID和NSG内腔植入模型二者中，淋巴结转移性负荷(牵涉的淋巴结的总数和淋巴结内的总DsRed阳性瘤细胞负荷二者)并非与肝转移负荷有关(图14A和14B)，提示淋巴结和肝的播散可能经截然不同的路径发生。
[0195] 鉴于血管内皮生长因子(VEGF)在原发性瘤血管化中发挥至关重要作用(Carmeliet et al.Nature.473(7347):298-307,2011)， 其 中 VEGF-A 和 VEGF-C 分别主要发挥促进造血和淋巴脉管系统的功能(Adams et al.Nat.Rev.Mol.Cell.
Biol.8:464-478,2007；Ohet al.Dev.Biol.188:96-109,1997)，我们在我们的模型中评估了针对这些因子的功能阻断性抗体对转移性播散的影响。为此，我们利用了一种中和性抗VEGF-A抗体(Liang et al.J.Biol.Chem.281(2):951-961,2006.Epub 2005 Nov 7)，并生成了一种抗VEGF-C抗体。在HCT116-DsRed或LS174T-DsRed瘤植入前1天开始每周一次用抗体处理NOD/SCID宿主小鼠，并分别在植入后6-7或8周评估转移形成。抗VEGF-A抑制肝中的宏观转移形成(图14F和14G)，这通过DsRed阳性瘤细胞负荷(图14H)和呈现肝累及的小鼠百分比(图14I)二者的降低得到确认。抗VEGF-A也削弱(图14E和14K)但没有消除(图14C)大体淋巴结转移的生长，与它在通过促进血管发生来支持转移性淋巴结瘤生长中的作用一致(Niki et al.Clin.Cancer.Res.6:2431-2439,2000)。相反，尽管有淋巴结转移的接近完全消除(图14E和14K)，抗VEGF-C没有显著抑制肝转移形成(图
14F和14G)且相应没有降低肝内的DsRed阳性瘤细胞负荷(图14H)。在HCT116或LS174T LIM任一中，抗VEGF-C也对降低呈现肝宏转移的小鼠百分比没有影响(图14I和14L)。抗VEGF-A和抗VEGF-C抗体的组合处理抑制淋巴结和肝转移形成二者(图14E-14I和14L)。
为了说明抗体处理后原发性瘤体积的差异(图14C和14D)，我们将肝转移性负荷相对于所有处理分支中的原发性瘤体积标准化，并确认了抗VEGF-C介导的对淋巴结转移的阻断对肝转移形成没有影响(图15A和15B)。尽管我们的数据支持VEGF-A而非VEGF-C在CRC肝转移形成中的作用，抗VEGF-A是否抑制早就播种肝的瘤细胞长出或者抗VEGF-A是否直接抑制原发性瘤细胞播散至肝仍然不确定。为了回答这个问题，我们用抗VEGF-A处理荷瘤小鼠，并在植入后3周(这在表现出宏观肝转移之前)(图7D和7E)通过流式细胞术对肝评估微转移性DsRed阳性瘤细胞。抗VEGF-A显著减少肝内具有可检测到的播散的瘤细胞的小鼠的数目(图14J)。总之，这些发现证明了自原发性瘤至肝的CRC细胞转移能经直接造血传播而发生，不依赖淋巴结转移中介。
Biol.8:464-478,2007；Ohet al.Dev.Biol.188:96-109,1997)，我们在我们的模型中评估了针对这些因子的功能阻断性抗体对转移性播散的影响。为此，我们利用了一种中和性抗VEGF-A抗体(Liang et al.J.Biol.Chem.281(2):951-961,2006.Epub 2005 Nov 7)，并生成了一种抗VEGF-C抗体。在HCT116-DsRed或LS174T-DsRed瘤植入前1天开始每周一次用抗体处理NOD/SCID宿主小鼠，并分别在植入后6-7或8周评估转移形成。抗VEGF-A抑制肝中的宏观转移形成(图14F和14G)，这通过DsRed阳性瘤细胞负荷(图14H)和呈现肝累及的小鼠百分比(图14I)二者的降低得到确认。抗VEGF-A也削弱(图14E和14K)但没有消除(图14C)大体淋巴结转移的生长，与它在通过促进血管发生来支持转移性淋巴结瘤生长中的作用一致(Niki et al.Clin.Cancer.Res.6:2431-2439,2000)。相反，尽管有淋巴结转移的接近完全消除(图14E和14K)，抗VEGF-C没有显著抑制肝转移形成(图
14F和14G)且相应没有降低肝内的DsRed阳性瘤细胞负荷(图14H)。在HCT116或LS174T LIM任一中，抗VEGF-C也对降低呈现肝宏转移的小鼠百分比没有影响(图14I和14L)。抗VEGF-A和抗VEGF-C抗体的组合处理抑制淋巴结和肝转移形成二者(图14E-14I和14L)。
为了说明抗体处理后原发性瘤体积的差异(图14C和14D)，我们将肝转移性负荷相对于所有处理分支中的原发性瘤体积标准化，并确认了抗VEGF-C介导的对淋巴结转移的阻断对肝转移形成没有影响(图15A和15B)。尽管我们的数据支持VEGF-A而非VEGF-C在CRC肝转移形成中的作用，抗VEGF-A是否抑制早就播种肝的瘤细胞长出或者抗VEGF-A是否直接抑制原发性瘤细胞播散至肝仍然不确定。为了回答这个问题，我们用抗VEGF-A处理荷瘤小鼠，并在植入后3周(这在表现出宏观肝转移之前)(图7D和7E)通过流式细胞术对肝评估微转移性DsRed阳性瘤细胞。抗VEGF-A显著减少肝内具有可检测到的播散的瘤细胞的小鼠的数目(图14J)。总之，这些发现证明了自原发性瘤至肝的CRC细胞转移能经直接造血传播而发生，不依赖淋巴结转移中介。
[0196] 其它实施方案
[0197] 虽然已经结合其具体实施方案描述了本发明，但是会理解的是它能够进行进一步修改，而且本申请意图涵盖本发明的任何变化，用途，或适应，一般而言，它们遵循发明原理且包括在本发明所属领域的已知或常规实践内的与本公开文本的区别，而且可以应用于上文列出的本质特征。
[0198] 通过援引将本说明书中引用或提到的所有专利，专利申请，专利申请公开文本，和其它出版物收入本文，程度与就像通过援引具体和个别指出收录每篇独立专利，专利申请，专利申请公开文本或出版物相同。此类专利申请具体包括本申请主张权益的美国临时专利申请，2013年7月23日提交的No.61/857,638和2014年3月18日提交的No.61/954,788。
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