涉及基因GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2和/或LDB2的筛选和治疗方法
阅读：993发布：2020-07-20
专利汇可以提供涉及基因GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2和/或LDB2的筛选和治疗方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 鉴别 化合物作为候选药物的方法，所述方法包括步骤：a.使所述化合物与表达基因CYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2的细胞 接触 ；并且b.分析所述化合物是否调节所述基因中至少一种的表达。本发明还涉及鉴别化合物作为候选药物的方法，所述方法包括步骤：a.使所述化合物与表达基因LDB2的细胞接触；并且b.分析所述化合物是否调节LDB2的表达。本发明进一步涉及用于此类方法的遗传修饰细胞和动物，并且涉及用于 治疗 动脉粥样硬化、动脉粥样硬化相关 疾病 或 炎症 疾病的方法，所述方法包括使用此类鉴别的化合物。，下面是涉及基因GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2和/或LDB2的筛选和治疗方法专利的具体信息内容。
1.一种鉴别化合物作为候选药物的方法，其包括如下步骤：
a.使所述化合物与表达基因GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、 HSDL2的细胞接触；并且
b.分析所述化合物是否调节所述基因中至少一种的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤b包括对所述基因中至少两种 的表达调节的分析。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤b进一步包括对选自由 CD36和PPARα组成的组的基因的表达调节的分析。
4.一种鉴别化合物作为候选药物的方法，其包括：
a.使所述化合物与选自由GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、 HSDL2组成的组的基因的基因产物接触；并且
b.分析所述化合物是否调节所述基因产物的生物活性。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述分析针对所述基因产物的生物 活性的增加。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述分析针对所述基因产物的生物 活性的降低。
7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述生物活性是调节参 与动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病的发展或进展的基因的表达。
8.如权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述生物活性是调节选 自由GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2、CD36和PPARα 组成的组的基因。
9.一种鉴别化合物作为候选药物的方法，其包括如下步骤：
a.使所述化合物与表达基因LDB2的细胞接触；并且
b.分析所述化合物是否调节LDB2的表达。
10.一种鉴别化合物作为候选药物的方法，其包括如下步骤：
a.使所述化合物与基因LDB2的基因产物接触；并且
b.分析所述化合物是否调节LDB2的生物活性。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述生物活性是调节参与动脉粥 样硬化或动脉粥样硬化相关疾病的发展或进展的基因的表达。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述生物活性是白细胞的跨内皮 迁移。
13.如前述权利要求的任一项所述的方法，其包括：
a.获得DNA分子，所述DNA分子包括选自由LDB2、GYPC、AGPAT3、 AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2组成的组的基因的编码序列，以及任选 地，调节所述基因的表达的序列元件；
b.将所述DNA分子引入宿主细胞，诸如非人胚胎的细胞系或细胞， 以获得所述DNA分子的细胞表达；
c.使所述宿主细胞接触所述化合物，并且
d.分析所述化合物是否调节所述DNA分子的表达或所述基因产物的 生物活性。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述分析步骤包括分析白细胞的 跨内皮迁移。
15.如前述权利要求的任一项所述的方法，其用于鉴别化合物作为用 于治疗选自由动脉粥样硬化、动脉粥样硬化相关疾病和炎症疾病组成的组 的疾病的候选药物。
16.如前述权利要求的任一项所述的方法，其中所述化合物选自由有 机小分子、肽、多肽、蛋白质、抗体和其片段、诸如DNA或RNA的核酸， 包括siRNA和miRNA、诸如PNA的修饰的核酸，或为加强治疗目的修饰 的这类化合物组成的组。
17.一种鉴别用于评估动脉粥样硬化、动脉粥样硬化相关疾病或炎症 疾病的诱因、发展和/或结果的遗传标志物的方法，其包括：
a.检测群体中的个体之间的选自由基因LDB2、GYPC、AGPAT3、 AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2组成的组的基因的遗传性变异，并且
b.将所述遗传性变异与所述个体之间的动脉粥样硬化和动脉粥样硬 化相关疾病的诱因、发展和/或结果的差异相互关联。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述遗传性变异是调节基因产物 的表达的变异。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述遗传性变异是调节基因产物 的生物活性的变异。
20.一种动物物种的遗传修饰细胞，
a.包含异源DNA分子，所述异源DNA分子包含选自由基因LDB2、 GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2组成的组的基因的编码 序列，和/或
b.具有选自由灭活的基因LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、 HMGB3、HSDL2组成的组的基因。
21.如权利要求20所述的遗传修饰细胞，其中所述DNA分子编码LIM 结构域结合蛋白2和/或选自所述组的基因是LDB2。
22.如权利要求20或21所述的遗传修饰细胞，其中所述动物物种是 哺乳动物。
23.如权利要求20-22中任一项所述的遗传修饰细胞，其中所述动物 物种选自由人、非人灵长类和啮齿类组成的组。
24.一种遗传修饰的非人动物，其包含根据权利要求20-23中任一项 所述的细胞。
25.一种治疗患有动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病或有发展所 述疾病的风险的患者的方法，其包括向所述患者施用选自由基因LDB2、 GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2组成的组的基因的原型 或修饰变体或用根据权利要求1-12中任一项所述的方法鉴别的化合物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所施用的基因是编码LIM结构 域结合2的基因。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述化合物是siRNA。
28.一种治疗患有动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病或有发展所 述疾病的风险的患者的方法，其包括向所述患者施用选自由siRNA分子组 成的组的化合物，所述siRNA分子靶向选自由LDB2、GYPC、AGPAT3、 AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2组成的组的基因。
29.一种鉴别受治疗者具有低于平均的发展动脉粥样硬化或动脉粥样 硬化相关疾病的风险的方法，其包括分析所述受治疗者的LDB2基因，并 且其中所述LDB2基因中单核苷酸多态rs 10939673的T次要等位基因的存 在表明低于平均的风险。
发明领域
本发明涉及药物开发领域，并且特别涉及筛选对动脉粥样硬化和动脉 粥样硬化相关的疾病以及对参与炎症和白细胞从血流向病态组织迁移的 其他疾病具有疗效的化合物。
发明背景
尽管改善的生活方式和有效的降脂剂，例如他汀类药物(statins)，冠心 病(CAD)仍然是主要的健康威胁。CAD是变性疾病，该病是由循环血细胞 和其他血浆成分的应激经过数十年发展而来，所述应激逐渐改变动脉壁的 成分(细胞的和细胞外的)，最终导致动脉粥样硬化斑块的形成。动脉粥样 硬化的发展速率依赖于环境压力和个体的基因组成。与CAD有关的环境 压力主要通过空气中的污染物(包括香烟的烟)、传染和食物摄取(卡路里和 胆固醇)并通过行为因素，特别是应激和锻炼的程度来介导。通过个体基因 组成过滤的环境压力的净效应通过血流量和成分的变化来反映。数年后， 环境和生活方式的因素改变器官中的基因表达。与肝、脂肪或骨骼肌中的 能量代谢和炎症相关的基因的表达变化被认为与CAD十分相关。进而， 基因表达的改变反映在循环中，在所述循环中可检测到在这些器官中合成 的代谢和炎症标志物。因此，血浆成分(例如胆固醇和甘油三酯)、血糖和 胰岛素水平以及炎症标志物(例如C-反应蛋白)的测量是检测高三酸甘油 脂血症、高胆固醇血症、胰岛素耐受性、糖尿病、炎症和免疫活化的状态 以及其他CAD表型的标准方法。血液和血浆的这些成分以及很可能还未 鉴别的成分决定了动脉粥样硬化的进展速率。
CAD风险主要从脂质、葡萄糖和炎症标志物的血浆浓度以及从血压、 身体质量指数(body mass index)和腰臀比例(waist-to-hip ratio)来判断。改善 生活方式风险因子(例如吸烟、高脂肪和卡路里摄取以及缺少锻炼)可以降 低高血压和体重并具有对血液中风险因子的有益影响。
虽然CAD风险因子是密切相互关联的并且在大多数人中被终身监测， 但严重的动脉粥样硬化通常在晚期才被检测到，经常是作为心肌梗塞(MI)、 中风或其他临床表现的结果。
动脉粥样硬化是终身的进行性疾病，它在50％的群体中变得临床显著， 导致心肌梗塞和中风以及最后的死亡。动脉粥样硬化的第一个表现是在动 脉壁的内膜中形成泡沫细胞，产生脂纹的组织学外观。简而言之，循环脂 蛋白，主要是LDL，粘着于内皮下基质并经受最终改变了内皮细胞的基因 和蛋白质表达的氧化修饰。这些变化导致单核细胞的募集，所述单核细胞 迁移到动脉壁的内膜，分化成巨噬细胞并吞噬修饰的LDL。这些早期步骤 的后面是额外的炎症和免疫响应，平滑肌细胞迁移和纤维化，最终形成动 脉粥样硬化斑块并凋亡。这些生物过程以及还未鉴别的其他可能过程的相 互作用构成了动脉粥样硬化发展的基础。最近，降低血浆胆固醇的他汀类 药物疗法已经表现出防止或在一些情况下甚至退化动脉粥样硬化的发展 (1)。然而，关于构成动脉粥样硬化损伤发展基础的转录变化的全部内容 (repertoire)却知之甚少(2)，并且几乎不了解关于血浆胆固醇降低对动脉 壁基因表达的有益影响的任何事情。
发明概述
人类基因组的作图(mapping)已经产生大量的新技术来从基因组角 度研究复杂疾病，像CAD。通过揭示构成复杂生物系统基础的分子活性的 全部内容，这些技术可用于疾病的早期鉴别和靶向中心疾病途径(central disease pathway)的新疗法(3-5)。实际上，这说明从现在开始的使用这些 技术的研究工作可以从引起疾病的所有活性的角度而不是从某些途径或 基因的狭窄角度去鉴别疾病的机制。由于可监测所有分子的活性，表现最 中心的分子将成为用于治疗的最高等级的靶，这与迄今鉴别的根据候选驱 动假说(candidate-driven hypothesis)预选的所有的靶的历史相反。这一历 史偏见可能是我们观察到当今如此多的靶在临床试验的后期(II和III期) 失败的原因，这并不少见。本文提供的新鉴别的靶基因代表新一代的靶， 其是根据它们在涉及动脉粥样硬化和动脉粥样硬化相关疾病的所有可能 的靶的高等级来选择的。
本文提供的靶基因主要通过在小鼠中的研究发现，所述基因使用独特 的小鼠模型鉴别，在所述小鼠模型中可使用肝中的遗传开关(genetic switch) 降低血浆胆固醇，所述遗传开关可在小鼠成年期的任何给定时间点被活化 (9)。血浆胆固醇降低是当今阻止动脉粥样硬化发展的最有效的方法。不 幸地是，只有小部分群体(＜10％)适合血浆胆固醇降低治疗。使用这一小 鼠模型，发明人已经鉴别出在响应血浆胆固醇降低而预防动脉粥样硬化中 介导有益影响的基因靶。因此，这些靶可用于干预患有动脉粥样硬化的大 多数患者，他们也缺乏高水平的血浆胆固醇。开发直接靶向所鉴别的分子 的化合物应该有助于防止或甚至退化这些个体的动脉粥样硬化发展。
通过对人的研究发现的靶基因表明白细胞的跨内皮迁移是内脏脂肪 和动脉壁中导致动脉粥样硬化发展的生物过程。这一过程对所有的炎症反 应是常见的，因此所鉴别的靶(即负责这一过程的基因)可用于预防除动脉 粥样硬化以外的其他炎症疾病，例如类风湿关节炎、炎性肠病、阿尔茨海 默病等几个实例。在人类中进行的导致本发明的研究的另一个方面是，不 仅在病态的动脉壁(即动脉粥样硬化动脉壁)中，还在肝、骨骼肌和内脏脂 肪中寻找靶。这种多器官筛选增加假定的靶的覆盖范围，其超过疾病自身 的分子活性的全部内容，到达可影响动脉粥样硬化发展的所有器官。本发 明包括参与白细胞跨内皮迁移的129个基因(表8)。这一应用的重点是 LDB2，已发现它是这129个基因中的122个的高级调节子，并且因此是 干预的合适靶。
本发明是基于对表4和表8中公开的基因，特别是LDB2、GYPC、 AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2与动脉粥样硬化和动脉粥样硬 化相关疾病之间的关系的发现。
在第一个方面中，本发明涉及鉴别化合物作为候选药物的方法，所述 方法包括使所述化合物接触表达选自由表4和表8中公开的基因(特别是 LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2)组成的组的 基因的细胞，并且分析所述化合物是否调节所述基因中至少一种的表达。
表达的调节可相对未治疗对照的参考水平，通过技术人员可用的任何 合适的直接或间接方法来测量，所述方法诸如测量转录的mRNA的量、产 生的基因产物的量、基因产物的活性或测量引入的报道实体(reporter entity)。
在根据这一方面的本发明的一个实施方案中，所述分析包括对所述基 因中至少两种的表达调节的分析。在进一步的实施方案中，所述分析进一 步包括对选自由CD 36和PPARα组成的组的基因的表达调节的分析。
在第二个方面中，本发明涉及鉴别化合物作为候选药物的方法，所述 方法包括使所述化合物接触选自由表4和表8中公开的基因(特别是 LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL26)组成的组的 基因的基因产物，并且分析所述化合物是否调节所述基因产物的生物活 性。
在这一方面，所述调节可以是活性的增加或降低。所述活性可以是一 般与以下相关的活性：所述基因产物、或参与动脉粥样硬化或动脉粥样硬 化相关疾病的发展或进展的基因表达的调节(所述基因诸如选自由LDB2、 GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2、CD 36和PPARα组 成的组的基因)或白细胞的跨内皮迁移。
在进一步方面中，本发明涉及根据前述方面的任一方面的方法，所述 方法包括：
-获得DNA分子，所述DNA分子包括选自由LDB2、GYPC、AGPAT3、 AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2组成的组的基因的编码序列，以及任选地， 调节所述基因表达的序列元件；
-将所述DNA分子引入宿主细胞，诸如非人胚胎的细胞系或细胞，以 获得所述DNA分子的细胞表达；
-使所述宿主细胞接触所述化合物，并且
-分析所述化合物是否调节所述DNA分子的表达或所述基因产物的生 物活性。
根据这一方面的方法的分析步骤可包括对白细胞的跨内皮迁移的分 析。
在根据以上(ebove)方面的方法的优选实施方案中，该方法涉及鉴别 化合物作为用于治疗选自由动脉粥样硬化和动脉粥样硬化相关疾病组成 的组的疾病的候选药物。
在以上提到的方面中，有待鉴别为候选药物的化合物可以是有机小分 子、肽、多肽或蛋白质、诸如DNA或RNA的核酸，包括siRNA和miRNA、 诸如PNA的修饰的核酸或可掺入药物组合物的任何其他化合物。
在进一步的方面中，本发明涉及鉴别用于评估动脉粥样硬化和动脉粥 样硬化相关的疾病(诸如冠心病、中风和心肌梗塞)或炎症疾病的诱因、发 展和/或结果的遗传标志物的方法，所述方法包括检测群体中的个体之间的 选自由表4和表8中公开的基因(特别是LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、 PVRL2、HMGB3、HSDL2)组成的组的基因的遗传性变异，并将所述遗传 性变异与所述个体之间的动脉粥样硬化和动脉粥样硬化相关疾病的诱因、 发展和/或结果的差异相互关联。
在本发明的这一方面中，所述遗传性变异可以是调节(例如增加或降 低)基因的表达或基因产物的活性的遗传性变异。
在进一步的方面中，本发明涉及包含异源DNA分子的遗传修饰细胞 和动物，所述异源DNA分子包含选自由表4和表8中公开的基因(特别 是LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2)组成的组 的基因的编码序列，和/或使这些基因之一灭活。此类“敲除”动物是本领 域公知的，并且根据需求进行商业基础的生产。所述基因的灭活不需要 100％；将该基因灭活达到敲除动物的表型在相关实验中可用的程度就足够 了。可进一步引入异源DNA分子，所述异源DNA分子包含动物的敲除基 因的编码序列，优选地具有允许所调节的基因产物表达的调节序列。
在这一方面中，所述动物可以是任何非人动物，优选哺乳动物，诸如 灵长类或啮齿类，如小鼠或大鼠。遗传修饰细胞可以是任何来源的，并且 本领域技术人员可决定合适的表达系统。根据这一方面的遗传修饰细胞和 动物可用于以上鉴别化合物作为候选药物的方法。
在这一方面的一个实施方案中，所述异源DNA分子进一步包含选自 由表4和表8中公开的基因(特别是LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、 HMGB3、HSDL2)组成的组的基因的调节序列。
在进一步的方面中，本发明涉及治疗患有动脉粥样硬化或动脉粥样硬 化相关疾病(诸如冠心病、中风和心肌梗塞)或炎症疾病或有发展所述疾病 的风险的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用选自由表4和表8中 公开的基因(特别是LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、 HSDL2)组成的组的基因的原型或修饰变体或用根据以上提到方面的方法 鉴别的化合物。
在进一步的方面中，本发明涉及治疗患有动脉粥样硬化或动脉粥样硬 化相关的疾病或有发展所述疾病的风险的患者的方法，所述方法包括向所 述患者施用选自由siRNA分子组成的组的化合物，所述siRNA分子靶向 选自由LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2组成的 组的基因。
这一方面还涵盖了包含靶向选自由LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、 PVRL2、HMGB3、HSDL2组成的组的基因的siRNA分子以及任选地，药 学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂以及类似物质的药物组合物。此类 siRNA分子还可被修饰以增强性质，诸如增加的摄取、体内延长的半衰期 等。
在进一步的方面中，本发明涉及鉴别受治疗者具有低于平均的发展动 脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病的风险的方法，所述方法包括分析所 述受治疗者的LDB2基因，并且其中LDB2基因中单核苷酸多态rs 10939673 的T次要等位基因(minor allele)的存在表明低于平均的风险。
附图简述
图1.通过苏丹IV染色固定住(pinned-out)的主动脉来评估 Ldlr-/-Apob100/100Mttpflox/flox小鼠中动脉粥样硬化的进展。第20(n＝12)、30 (n＝25)、40(n＝15)、50(n＝15)和60(n＝10)周的动脉粥样硬化进展的箱形图。 P＜0.05，20周对比30周；P＜0.0001，30周对比40周；P＜0.02，40周对比 50周。值为表面损伤面积占整个主动脉的百分比。箱形包括在百分之75 和百分之25之间的值，柱形表示百分之90和百分之10之间的值，并且 黑点表示这些边界之外的个别观察结果。
图2.动脉粥样硬化细胞类型的细胞特异性标志物的相对表达水平。 显示了每个细胞类型的标志物数量。唯一的统计显著增加是泡沫细胞的数 量，它在第20周和30周之间增加20％(P＜0.001)并在60周时仍然升高。
图3：血浆胆固醇降低对损伤进展的影响。损伤表面面积通过损伤面 积占从分叉到主动脉根的固定住的主动脉总面积的百分比来确定。在28 周龄时，小鼠接受腹膜内pI-pC注射以诱导肝中Mttp的重组，并且12周 后或实现胆固醇降低1周后处死小鼠。高胆固醇对照小鼠注射PBS。(A)在 40周龄时，具有低血浆胆固醇的小鼠(即pI-pC处理的，n＝7)的损伤表 面面积没有进展并且与40周的高胆固醇对照(即PBS处理的，n＝6)显著 不同(*P＜0.005)。(B，C)一周的胆固醇低水平(30周龄的小鼠)没有影响 (B)损伤大小(P＝0.96)。显示损伤面积的相对变化的百分比。(C)泡沫细胞 (P＝0.52)、内皮细胞(P＝0.49)、平滑肌细胞(P＝0.18)(SMC)和T细胞(P＝0.34) 的数量。
图4.泡沫细胞形成的调节基因网络。使用siRNA靶向THP-1巨噬细 胞中的12个胆固醇响应动脉粥样硬化基因。转染后2天，siRNA靶向的 巨噬细胞和用非特异性siRNA处理的对照用AcLDL(50μg/mL)孵育48小 时；分离总RNA，并且确定CE和脂质的积累。(A)将来自12个siRNA 实验和四个混合对照的16个表达谱(HG-U133_Plus_2阵列，Affymetrix) 用于产生参与泡沫细胞形成的8个胆固醇响应基因的调节基因网络，包括 PPARa和CD36。(B)CE积累被8个基因中的5个的siRNA抑制降低，并 被2个其它基因的抑制增加；1个基因的抑制没有影响(另参见表2)。
图5.与冠状动脉和颈动脉狭窄有关以及与白细胞跨内皮迁移途径有 关的聚类(clusters)的Venn图。A.表7中的聚类代表的基因的Venn图。 7个基因发现于动脉粥样硬化的主动脉根/IMA聚类和纵隔脂肪聚类(Pc＜7 ×10-10)，17个在动脉粥样硬化的主动脉根/IMA聚类和颈动脉聚类(Pc＜1 ×10-30)并且16个在纵隔聚类和颈动脉聚类(Pc＜9×10-27)。发现6个基 因存在于所有这三种聚类(Pc＜7.15×10-23)中。所有三个聚类的并集为129 个基因。
发明详述
本发明是基于使用最新水平的聚类算法(cluster algorithms)对来自小 鼠和人的转录数据的系统生物处理，所述转录数据包含基因组中所有基因 的基因活性信息以及在发展动脉粥样硬化期间它们的活性谱。与其中以研 究的关注基因的初始选择为标准的本领域的标准技术形成对比，这一方法 允许本发明人对参与动脉粥样硬化的所有基因进行无偏见的研究。另外， 这一方法允许发明人将所有的人类基因以对动脉粥样硬化的重要性的顺 序分级。这一方法在以下给出的两个实施例中进一步解释。
在实施例1中，发明人已经表明，在动脉粥样硬化损伤的快速扩展前 降低血浆胆固醇防止动脉粥样硬化损伤的进一步扩大，并且已经鉴别介导 这一效应的基因(即靶)。发明人所用的生物信息方法学(即反向工程) 构建了胆固醇响应的动脉粥样硬化靶基因的基因网络。治疗性降低血浆胆 固醇(诸如通过施用他汀类药物)的有益影响至少部分是通过这一基因网 络的作用来介导的。因此，本发明涉及筛选影响这一血浆胆固醇调节的基 因网络的候选药物的方法，并涉及它如何防止或甚至退化动脉粥样硬化或 动脉粥样硬化相关疾病的发展和/或进展。作为该方法工作的确认，使用靶 向所述网络中的单个基因的siRNA分子调节所述基因的表达。已发现基因 表达的调节影响巨噬细胞中胆固醇酯的积累，这是一个对动脉粥样硬化进 展重要的过程。
在实施例2中，发明人使用多器官全基因组表达谱分析来鉴别与动脉 粥样硬化和其相关疾病有关的所有分子活性。使用鉴别在所有患者的四种 不同器官中具有相似表达模式的基因的聚类算法，发明人鉴别了总共60 个聚类。发现其中有3个与动脉粥样硬化的程度相关。这三个聚类一起代 表129种基因，其中大多数对白细胞向病态组织的跨内皮迁移起作用。当 在动脉壁和纵隔脂肪而不是在肝或骨骼肌中有活性时，这一过程与动脉粥 样硬化的程度有关。这些发现在患有颈动脉(至头部的动脉)动脉粥样硬 化的患者的确认组(validation cohort)中重复。发现129个基因中的122个具 有共同的调节子；LIM-结构域结合2(LDB2)。因此这一高级调节子参与调 节动脉粥样硬化和动脉粥样硬化相关疾病的严重性。LDB2中单核苷酸多 态rs 10939673的T次要等位基因被鉴别为在心肌梗塞的幸存者中未被充 分代表，并且相反与LDB2mRNA和冠状动脉粥样硬化相关。因此，这一 SNP可用作降低的冠状动脉粥样硬化风险的遗传标志物。
由于白细胞迁移是任何炎症反应的主要途径，因此作为这一过程的调 节子的LDB2的发现将具有作为除动脉粥样硬化以外还有其它炎症相关疾 病的标志物和/或治疗靶的含义。
本申请中公开的新型基因网络和高级调节子LDB2还提供鉴别动脉粥 样硬化或动脉粥样硬化相关疾病的诱因的或预测这些疾病的发展或结果 的遗传标志物的新的可能性。因此，本发明部分涉及通过对比具有动脉粥 样硬化或动脉粥样硬化相关疾病的患者与没有患所述疾病的受治疗者的 基因型来鉴别所述遗传标志物的方法。并且就LDB2而言，还为了除动脉 粥样硬化以外的其它炎症相关疾病。
本发明通过对表达谱的两个研究，一个在小鼠中并且一个在人中，来 进一步描述，其显示所鉴别的基因与动脉粥样硬化和动脉粥样硬化相关的 疾病之间的联系。这些研究用于阐释和证实本发明，而不应该被认为是限 制本发明的范围，本发明的范围是由所附的权利要求定义。当实践本发明 时，本领域技术人员可进一步使用以下领域的常规技术：药物化学、免疫 学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、转基因动物和重组DNA技术， 参见Sambrook等人.“Molecular cloning：A laboratory manual”(分子克隆： 实验室手册)，第3版2001；Ausubel等人.“Short protocols in molecular biology”(精编分子生物学实验指南)，第5版1995；“Methods in enzymology”(酶学方法)，Academic Press，Inc.；MacPherson、Hames和 Taylor(编)“PCR 2：Apractical approach”(PCR 2：实践方法)1995；Harlow 和Lane(编)“Antibodies，a laboratory manual”(抗体，实验室手册)1988； Freshney(编)“Culture of animal cells”(动物细胞培养)第4版2000；Hogan 等人.“Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual”(小鼠胚胎操 作：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，1994；或这些书的后续 版本所公开的内容。
实施例1
转录谱分析和遗传降低血浆胆固醇以鉴定胆固醇响应的动脉粥样硬 化靶基因
动脉粥样硬化进展的转录表型在很大程度上是未知的。我们以10周 的间隔在有动脉粥样硬化倾向(atherosclerosis-prone)的小鼠中执行损伤 发展的转录谱分析，所述小鼠具有人样高胆固醇血症和关闭肝脂蛋白产生 的遗传开关。我们显示开始动脉粥样硬化进展缓慢，在脂纹转化为斑块后 迅速扩大，并在晚期损伤形成后达到平稳状态。形成四个不同表达聚类的 1259个基因(其中329个先前与动脉粥样硬化相关)的活性表达这一发展。 遗传性降低具有早期损伤的小鼠的血浆胆固醇导致不同的转录响应，防止 迅速扩大和转化为斑块。鉴别了37个胆固醇响应基因(表4)，其中＞90％ 先前没有与动脉粥样硬化相关。在6个沉默干扰RNA介导的全部10个胆 固醇响应基因的抑制中，由THP-1巨噬细胞产生泡沫细胞也受到影响。因 此，通过仔细研究损伤进展的转录表型和当血浆胆固醇降低时的其预防， 可鉴别胆固醇响应的动脉粥样硬化靶基因。
动脉粥样硬化是终身的进行性疾病，它在50％的群体中变得临床显著， 导致心肌梗塞和中风以及最后的死亡。最近，降低血浆胆固醇的他汀类药 物疗法已经表现出防止或在一些情况下甚至退化动脉粥样硬化的发展。然 而，关于构成动脉粥样硬化损伤发展的基础的转录变化的全部内容却知之 甚少，并且几乎不了解关于血浆胆固醇降低对动脉壁基因表达的有益影响 的任何事情。现在，在人(6，7)和小鼠(8)基因组计划之后发展的全 基因组测定技术为阐释与复杂疾病(像动脉粥样硬化)相关的表达变化的 全部内容提供了可能性。我们研究了Ldlr-/-Apob100/100Mttpflox/floxMx1-Cre小 鼠模型(9)以调查损伤进展、基本的转录表型和血浆胆固醇降低的影响。 这些小鼠具有与家族性高胆固醇血症相似的血浆脂蛋白谱 (Ldlr-/-Apob100/100)并且含有关闭脂蛋白的肝合成的遗传开关 (Mttpflox/floxMx1-Cre)。
动脉粥样硬化进展
在第10、20、30、40、50和60周龄时检查小鼠。血浆胆固醇随时间 略有增加，但是甘油三酯和葡萄糖水平没有显著变化(表1)。在87只 Ldlr-/-Apob100/100Mttpflox/flox小鼠中评估损伤面积和形态学变化(图1)。在第 10周时，仅检测到少数的苏丹IV染色的斑点(n＝10，未显示)，但是在第 20周时，所有的小鼠中均检测到损伤。在第20周和30周之间，损伤大小 增加了～1.6％(P＝0.05)，并且在第30周和40周之间增加了～7.2％ (P＜0.0001)。在第20周时，主要的形态学特征是脂纹(具有扩散边界的 红色透明区域)；未检测到斑块。然而，在第30周时，所有的小鼠的主动 脉弓具有小斑块(具有明确边界的红色不透明区域)，其在第40周大幅扩 大。在第50周和60周，斑块生长受到限制。损伤随时间的发展通过油红 O染色和CD68抗原的荧光的变化来反映(未显示)。
动脉粥样硬化进展的转录表型
随后，我们鉴别了在动脉粥样硬化进展期间构成组织学变化基础的转 录变化。在小鼠基因组信息数据库(参见www.jax.org)的19,879个基因 中，6.3％在至少一次时间对比中被差异表达(FDR＜0.05，未修正P＜0.00008， n＝1259)，并且329个(27％)先前已经与动脉粥样硬化相关。在剩余的 73％中，根据GO分析，95％具有已知的生物学功能。在动脉粥样硬化中 具有明确作用的基因中，78％在至少一次时间对比中被差异表达(P＜0.05， n＝88/111)。
为了反映动脉粥样硬化进展期间的基因表达模式，我们对所述1259 个被差异表达的基因执行mRNA水平的聚类分析(cluster analysis)。产生 了4个不同的聚类(表3)。聚类1的基因(n＝293)在损伤的快速扩大期 间被活化(图1)，在全部60周内保持活化，并且具有先前与动脉粥样硬 化和动脉粥样硬化细胞类型相关的最高百分比的基因(表3)。在聚类1的 基因中，89％与炎症细胞相关，包括巨噬细胞标志物CD68，其增加了五倍； 在免疫组织化学方面，也鉴别到增加的CD68表达(未显示)。这些发现和 8个巨噬细胞标志物的相对数量的增加一起(图2)有力地表明聚类1的 表达模式反映损伤巨噬细胞的募集和活化。聚类2在第30周(n＝331)， 聚类4在第40周(n＝300)，基因活性达到峰值，并且在动脉粥样硬化进 展的后期被抑制。在这些聚类的基因中，73％先前没有与动脉粥样硬化或 动脉粥样硬化细胞类型相关。在20个转录因子TF中，17个失活并且只有 三个被活化。聚类2和4的功能注解表明其可能参与平滑肌细胞的增殖和 向损伤的迁移。聚类3(n＝339)是特别显示的。这些基因的mRNA水平 在第30周达到峰值，并且在第40周被抑制，这与动脉粥样硬化损伤的快 速扩大一致。此外，该聚类含有比聚类1少但比聚类2或4多的动脉粥样 硬化相关基因，并且主要由与羧基和脂质代谢相关的基因组成。该聚类的 19个TF中的13个在脂质和能量代谢中是已经确认的，例如过氧化物酶体 增殖物激活受体(peroxisome proliferator activator receptors，PPAR)、PPARa、 PPARd和PPARγ以及固醇调节元件结合因子2。凋亡和细胞死亡在聚类2 至4中是活性过程，但在聚类1中不是。这一发现与以下观点一致：在动 脉粥样硬化发展的所有阶段，细胞死亡和凋亡是连续的过程(10)。
泡沫细胞的转录表型
除了泡沫细胞(其在第20周和30周之间的数量是增加的(P＜0.001； 图2))之外，其他主要损伤细胞类型(即内皮细胞、平滑肌细胞和T细胞) 的相对量是随时间相对稳定的，如细胞类型特异性基因标志物的mRNA水 平所示。
免疫组织化学上证实了在第30周的缺乏脂质的巨噬细胞的募集，其 在第40周扩张并成为脂质富集的。
总之，基因表达数据表明缺乏脂质的巨噬细胞在损伤发展的早期逐渐 积累，在第30周达到临界质量(图2)，诱导炎症反应(表3，聚类1)， 增加泡沫细胞中脂质的积累(表3，聚类3)并引起迅速的损伤扩大(图1)。 泡沫细胞中的脂质积累维持到第40周(表3，聚类3)。炎症持续到后期 (表3，聚类1)。聚类2和4是与动脉粥样硬化的新相关(表3)。
LDL胆固醇降低对动脉粥样硬化进展的影响
随后，我们通过用聚肌胞苷酸(polyinosinic polycytodylic acid)(pI-pC) 处理以诱导主要在肝中的Cre转基因的Mx1-启动子，导致Mttp的重组 (Ldlr-/-Apob100/100MttpΔ/Δ)来遗传性降低30周龄的小鼠的血浆LDL胆固 醇；对照小鼠用盐水处理。我们选择第30周的时间点是因为它在动脉粥 样硬化损伤迅速扩大之前，并且因为所鉴别的动脉粥样硬化基因在损伤和 泡沫细胞中随时间的表达模式。Mttp重组后，血浆胆固醇水平被降低了超 过80％(从427到54±31mg/L，n＝4)，并且在这一水平保持10周直到处 死。处死时，这些小鼠的损伤大小没有增加并且显著少于具有高胆固醇的 40周龄的小鼠(图3A，P＜0.005)。因此，在第30周降低血浆胆固醇防止 在具有高血浆胆固醇水平的小鼠中所观察到的动脉粥样硬化损伤的迅速 扩大(～7.2％，P＜0.0001；表1和图1)。
胆固醇降低对动脉粥样硬化的转录表型的影响
为了鉴别由血浆胆固醇降低诱导的转录变化，我们再次在28周龄的 小鼠中重组了肝Mttp，但这次在实现胆固醇降低后仅1周(第30周)就 处死动物。在检查损伤中基因表达变化前，我们检查了影响损伤表达的其 他可能来源。首先，我们检查了损伤大小和四种主要细胞类型的相对数量 在pI-pC处理的具有降低的胆固醇的小鼠(Mttp重组的)和用盐水处理的 具有高胆固醇的对照(Mttp完整的)中是否不同。如细胞类型特异性基因 标志物的表达水平所示，损伤大小(图3B)或细胞类型的数量(图3C) 没有差异。这些观察通过油红O染色的损伤的组织学外观和损伤的CD68 表达的免疫组织化学分析来确认(未显示)。在动脉粥样硬化的动脉壁中 变化最显著的血浆胆固醇响应基因中的37个显示于表4。为了排除任何基 因表达变化是因为Mx-1Cre转基因的肝活化而不是胆固醇降低这一可能 性，我们繁殖了缺少位于Mttp启动子和外显子1的侧翼的lox P位点的小 鼠(Ldlr-/-Apob100/100Mttpwt/wt)，并且对从pI-pC处理的和PBS处理的小鼠 (每个n＝5)分离的损伤RNA执行转录谱分析。这一对比所鉴别的几个显 著变化的动脉壁基因中没有表4中的基因(数据未显示)。
基因沉默对从培养的THP-1巨噬细胞形成泡沫细胞的影响
因为几种原因，泡沫细胞形成显示出在第30周和40周之间的损伤的 快速扩大中起重要作用。首先，第30周的动脉壁中巨噬细胞的积累处在 损伤的快速扩大之前(图2)。第二，损伤聚类3含有对细胞内脂质代谢重 要的基因，它在第30周被短暂地活化。第三，在第30周，炎症和免疫响 应在损伤聚类1中活化。第四并且可能是最重要的，在炎症和泡沫细胞的 脂质体内稳态中具有已知作用的TF在第40周失活(PPAR和SREBP-2)。
从第30周至40周的损伤的迅速扩大主要由第30周出现的泡沫细胞 的脂质载入引起(表2中聚类1和3)。我们怀疑在第30周所鉴别的胆固 醇响应基因(表4)中的一些基因是这一过程的关键。为处理这一点，我 们选择了37个基因中的12个，它们先前已经与泡沫细胞形成相关或为已 知的巨噬细胞基因(参见“方法”)。在用AcLDL孵育的THP-1巨噬细胞 中用siRNA靶向这12个基因。来自所靶向的细胞的mRNA经受转录谱分 析(n＝15)，并且如所描述的来推知泡沫细胞形成的调节基因网络(11)(参 见“方法”)。
所靶向的基因中的8个属于共有调节基因网络(图4A)并且被siRNA 有效抑制(表2)。这些基因包括促进泡沫细胞形成的CD36和防止它的 PPARa。羟类固醇脱氢酶样2(HDSL2)上调PPARa并下调CD36。此外， 脊髓灰质炎病毒受体相关2(PVRL2)也调节CD36，增加其表达并且负调 节HSDL2，并且因此间接抑制PPARa活性。我们从这一调节网络中CD36 和PPARa的调节(图4A)预测抑制PVRL2将防止泡沫细胞形成，而抑制 HDSL2将促进它。为了测试这些预测和评估在网络中抑制单个基因的影 响，我们测量胆固醇酯(CE)和脂质积累(图4B和表2)。总的来说，CE 的测量结果确认了我们的预测并且显示几种其他网络基因也影响THP-1巨 噬细胞中CE的积累(图4B，表2)。
在这一研究中，我们鉴别了临界点，在它之前动脉粥样硬化缓慢发展 并且仅出现低水平的炎症。此后，损伤迅速扩大并且炎症显著增加。炎症 持续到后期，导致晚期斑块(advanced plaque)的形成，但是在10周的时间 内损伤大小短暂增加。迅速的损伤扩大主要由巨噬细胞中同样迅速的CE 积累引起。具有低含量脂质的巨噬细胞在动脉粥样硬化发展的早期积累， 达到启动脂质的迅速积累和炎症的临界密度。在这一临界点上降低血浆胆 固醇防止损伤的迅速扩大和晚期斑块的形成。胆固醇降低效应至少部分地 由37个胆固醇响应的动脉粥样硬化基因介导。通过siRNA靶向的用 AcLDL孵育的THP1巨噬细胞的转录谱分析确认了这些基因中的一些，显 露了泡沫细胞形成的调节基因网络。这一网络构架突出PVRL2和HSDL2 作为新的候选基因，它们可能是防止晚期斑块形成的未来疗法的良好的 靶。
理解动脉粥样硬化损伤的转录谱富有挑战性(2)。此类损伤含有几种 细胞类型，并且给定细胞类型的平均mRNA贡献随疾病的发展变化。因此， mRNA水平的变化代表细胞mRNA浓度实际变化和细胞类型混合物变化 的混合。此外，在给定的细胞类型内，处于增殖和分化(例如巨噬细胞分 化为泡沫细胞)的不同阶段的细胞也增加了这一问题。然而，损伤mRNA 浓度提供损伤中活化的生物过程和途径的概况。
损伤mRNA聚类(表3)的分析表明，首先巨噬细胞相对缓慢地浸润 动脉壁，导致脂纹的形成。然后，在显示为非常具体的时间点，这些细胞 被活化，导致大量的炎症活性，所述活性和巨噬细胞中CE迅速积累组合 产生晚期斑块。我们认为这种转化可与动脉壁中巨噬细胞的密度有关。在 给定的密度下，巨噬细胞不但刺激它们自身(自分泌)，还相互刺激(旁 分泌)，导致大量的炎症活性并增加脂质摄取(12)。如果该机制也存在于 人中，那么防止或延缓动脉粥样硬化发展的治疗时机可能非常重要。事实 上在小鼠中，晚期斑块的形成被在迅速损伤扩大前的遗传性降低阻止(图 3A)。
与损伤发展形成对比，不同细胞类型在损伤中的程度(extent)和相对 组成在亚急性降低血浆胆固醇前后是相似的(图3B，C)。因此，通过基 因芯片(GeneChip)监测的mRNA浓度的变化可能反映细胞mRNA水平的 实际变化。由于巨噬细胞中脂质的积累是迅速损伤扩大的中心过程，因此 通过siRNA在用AcLDL孵育的THP-1巨噬细胞中证实了37个胆固醇响 应基因中的12个。已发现八个基因属于共有调节基因网络，其中PVRL2 和HSDL2具有核心作用。关于PVRL2和HSDL2知之甚少(在PubMed 中分别产生6和3个匹配(hits))。PVRL2中的一个序列变体与多发性硬化 的严重性有关(13)。HSDL编码固醇载体蛋白2，一种体外增强膜之间的 脂质转移的小的细胞内碱性蛋白结构域(14)。如调节基因网络所示(图 4A)，所述调节网络中没有节点(即基因)单独促进或抑制泡沫细胞的形 成，这突出了推断基因网络以了解并评估候选基因在复杂疾病中真实复杂 性的重要性(11，15)。
我们的发现暗示用血浆胆固醇降低剂干预的时机是关键。具有发展动 脉粥样硬化的并发症(例如，中风和心肌梗塞)的风险的患者可从在生命 的极早期治疗受益。检测早期动脉粥样硬化的无创技术(noninvasive technology)在这方面是重要的。对于具有其他动脉粥样硬化风险因子的血 胆固醇正常(normocholesterolemic)的个体，介导血浆胆固醇降低的有益效 果的靶向动脉粥样硬化基因的新方案可能是有效的。
因此，本发明的一个方面是鉴别化合物作为用于防止后期动脉粥样硬 化损伤的发展的未来疗法的候选药物，所述化合物靶向这些胆固醇响应基 因。这一方面在所附的权利要求中进一步定义。
方法
小鼠模型
Ldlr-/-Apob100/100Mttpflox/floxMx1-Cre小鼠模型具有与家族性高胆固醇血 症相似的血浆脂蛋白谱，所述家族性高胆固醇血症引起动脉粥样硬化的迅 速发展(9)。为了Mttp删除，小鼠在6天的时间内每隔一天注射500μl 的pI-pC(1μg/μl；Sigma，St.Louis，MO)以诱导Cre表达，由此在 Ldlr-/-Apob100/100Mttpwt/wtMx1-Cre小鼠中重组或不重组Mttp(MttpΔ/Δ)。同 窝出生仔畜对照接受PBS(Mttpflox/flox)。研究小鼠与C57BL/6回交5次 (＜5％129/SvJae和＞95％C57BL/6)，圈养于无病原体屏障设备(12-小时 光/12-小时黑暗周期)，并用含有4％脂肪的啮齿动物饲料(rodent chow)喂 养。基因型通过用来自尾部活体标本(biopsy)的基因组DNA的聚合酶链 式反应(PCR)来确定。血浆胆固醇和甘油三酯浓度用比色测定(无限 (Infinity)胆固醇/甘油三酯试剂盒；Thermo Trace)确定，并且血浆葡萄糖 水平用Precision Xtra(MediScience，Cherry Hill，NJ)测定。
平面(En Face)分析和组织学
如所述地将主动脉平面固定于黑蜡表面(16)，用苏丹IV染色，用 Nikon SMZ1000显微镜拍照，并用Easy Image Analysis 2000软件(Tekno Optik，Skarholmen，Sweden)分析。损伤面积计算为主动脉根到髂动脉分 叉(iliac bifurcation)之间的全部主动脉表面的百分比。将主动脉根分离并 立即于在OCT化合物(Histolab，Sweden)中的液氮中 冷冻。如所述地切割冻干切片(20μm)并用苏木精和油红O染色(17)； 其他切片(6-8μm)首先用大鼠抗小鼠CD68抗体或对照抗体(Serotec) 在4℃下孵育过夜，然后用荧光抗大鼠IgG(Vector Laboratories，Burlingame， CA)孵育，并且用含有DAPI的封固剂(Vector Laboratories)复染。
转录谱分析
主动脉用RNAlater(Qiagen，Valencia，CA)灌注，并且移除从第三 个肋状突起(rib)向上到主动脉根的主动脉弓，并且用FastPrep(Qbiogene， Irvine，CA)匀浆。总RNA用使用DNAse I处理步骤的RNeasy小型试剂 盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen)来分离。RNA质量用生物分析仪2100 (Bioanalyzer 2100，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)评估。将高 质量的RNA样品(32个来自Mttpflox/flox，5个来自MttpΔ/Δ，并且9个来自 Mttpwt/wt小鼠)在第10(n＝7)、20(n＝5)、30(n＝6+5)(pI-pC)和9Mttpwt/wt (n＝5(PBS)+4(pI-pC))、40(n＝5)、50(n＝5)和60(n＝4)周用于总 基因表达测定，所述测定用cDNA阵列(小鼠基因组4302.0基因芯片， Affymetrix，Santa Clara，CA)进行。所有样品用生产商推荐的双循环规 程制备。阵列用GeneChip Scanner 3000扫描并用基因芯片操作软件 (GeneChip Operating Software，Affymetrix)分析。
文本挖掘(text mining)和现有动脉粥样硬化知识
使用PubMed的自动文本挖掘建立与动脉粥样硬化、泡沫细胞、平滑 肌细胞、内皮细胞和T细胞相关的基因的列表。简单地说，一个基因被认 为是相关的，如果它与PubMed中的文章的摘要中的任何以下术语同时出 现：动脉粥样硬化、动脉硬化(“动脉粥样硬化相关的”)、泡沫细胞、巨 噬细胞、单核细胞(“泡沫细胞相关的”)、平滑肌细胞、内皮细胞和T细 胞。这些匹配构成相当广泛但不具体的基因列表，并具有相当的重复，所 述基因在动脉粥样硬化或参与动脉粥样硬化的细胞类型(即可能含有假阳 性，但假阴性数量低)中可能起作用。我们还通过从已知对动脉粥样硬化 重要的最近的综述的基因中人工提取，制作了“确定的”动脉粥样硬化基 因的列表。
用乙酰化LDL孵育的THP-1巨噬细胞的siRNA
将人类单核细胞细胞系THP-1的单核细胞以6×105个细胞/孔(于含 有L谷氨酰胺(2mM)和HEPES缓冲液(25mM)(Gibco-Invitrogen， Carlsbad，CA)且补充了青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)(PEST) 的10％胎牛血清(FCS)-RPMI-1640培养基中)置于6孔培养盘(Falcon， Becton Dickinson Labware)中，并用佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)(50ng/mL)(Sigma)诱导72小时以分化为 巨噬细胞。对于每种基因，细胞用至多三种siRNA(Ambion，Austin，TX)， 根据生产商的说明书(Invitrogen)使用Lipofectamine 2000在不含FCS、 PEST和PMA的培养基中转染。转染2天后，siRNA靶向的巨噬细胞和模 拟物处理的对照(非特异性siRNA)用乙酰化LDL(AcLDL，50μg/mL) 在含有PEST的1％FCS培养基中孵育48小时。如所述地制备AcLDL(18)。 在4℃下，针对PBS透析样品。AcLDL蛋白浓度通过Bradford方法确定。 LDL通过顺序超速离心从健康的捐赠者的血浆分离(19)。
脂质、蛋白质和基因表达测定
为了脂质成像，源自THP-1的泡沫细胞用在PBS中的10％甲醛固定 10分钟，并用PBS洗涤2次。所述细胞用油红O(0.3％于60％异丙醇中) 染色20分钟，用60％异丙醇洗涤2次并用PBS洗涤2次，并用Nikon Eclipse E800显微镜在40×放大倍率下检测。脂质通过在室温下己烷/异丙醇(3∶2) 提取1小时，随后0.5ml氯仿提取15分钟来分离(20)。将脂质提取物干 燥并重新悬浮于80μl含有1％Triton-X-100(Sigma)的异丙醇。泡沫细胞 的脂质含量通过酶促分析，使用针对总胆固醇的无限试剂盒(Thermo Trace)和针对游离胆固醇的试剂盒(Wako Chemicals，Richmond，VA)来确 定。脂质提取后，蛋白质通过用0.5M的氢氧化钠在37℃下孵育5小时来 从相同的孔中提取。蛋白质浓度通过Bradford方法确定。
为了HG-U133_Plus_2阵列分析(Affymetrix)并且为了确定siRNA 的击倒(knockdown)程度，总RNA用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)从AcLDL 孵育的THP-1细胞中分离。RNA浓度用分光光度计(ND-100，NanoDrop Technologies，Wilmington，DE)确定。为了cDNA合成，0.5μg的总RNA 根据生产商的规程用Superscript II(Invitrogen)逆转录。5倍稀释后，根 据生产商的规程，通过实时PCR用1×TaqMan通用PCR核心试剂盒 (universal PCR master mix)(Applied Biosystems，Foster City，CA)在ABI Prism 7000(PE Biosystems)和软件上扩增cDNA(3μL)。使用含有相应 引物和探针的来自Applied Biosystems的Assay-On-Demand试剂盒，并且 将表达值针对酸性核糖体磷蛋白P0进行归一化。每个样品以两个重复进 行分析。
统计和计算
使用未配对t检验分析所选基因的mRNA水平的差异、小鼠血浆测量 值的差异和时间点之间的损伤表面面积的差异。基因表达的信号水平数据 用MAS 5.0(Affymetrix)使用默认设置来计算，进行对数转换 (log-transformed)并归一化为总强度(全局缩放(global scaling))。归一 化后，通过平均相应Affymetrix探针组合的信号，计算小鼠基因组信息数 据库(MGD基因，Jackson Laboratory，www.jax.org)中的每个基因的信 号强度。在数据库中没有配对的11,979个基因芯片探针组合(小鼠基因组 4302.0基因芯片，Affymetrix)中，1.5％被差异表达(错误发现率(FDR) ＜0.05，n＝177)，表示基因/探针组合的部分不会被考虑用于进一步的分析。 剩余的33,122个探针组合在19,879个MGD基因(总共32,095个)中有 至少一个配对。差异表达测试前，以逐对(pair-wise)方式应用Lowess归一 化(21)。为了在计算差异表达的概率和FDR时进行多重检验的校正，我 们使用经验Bayes统计(22)。使用Mathematica 5.1(Wolfram Research， Champaign，IL)中的FindCluster算法进行聚类。GO和途径分析用EASE 软件执行(23)。如所述地推断用AcLDL孵育的THP-1巨噬细胞的调节 基因网络(11)(见下文)。
胆固醇响应的动脉粥样硬化基因鉴别
胆固醇响应的动脉粥样硬化基因被认为是在小鼠的动脉粥样硬化主 动脉弓中被差异表达(FDR＜0.05)的那些基因，与注射PBS的对照相比， 所述小鼠肝中的Mttp重组(参见上文)已经通过腹膜内注射500μl pIpC (1μg/μl)诱导(参见表4，n＝37)。注射在具有两天间隔的四个顺序时 间点执行，它开始于第29周(week 29 weeks)的第一天，持续到第29周 的最后。如第30周处死时在血浆中所测，pIpC治疗在所有小鼠中实现80％ 或更多的血浆胆固醇降低。用盐水处理的对照小鼠的血浆胆固醇水平没有 影响。在第30周期间，单独留下小鼠以洗除注射的任何残留效应。在缺 少floxed Mttp(Ldlr-/-Apob100/100Mttpwt/wtMx1-Cre)的pIpC处理的对照小鼠 中，这37个基因中没有一个被鉴别出，因此，Mttp的重组的确没有发生， 血浆胆固醇也没有降低。用基因芯片阵列研究这些对照小鼠以排除所述血 浆胆固醇响应基因代替地是动脉粥样硬化损伤中pIpC诱导的基因的可能 性。
选择用于siRNA靶向的胆固醇响应基因
在37个鉴别的胆固醇响应基因中，27个具有预先确定的taqman和 siRNA测定(Invitrogen)。在表4中，这37个基因中的12个被标记为粗 体，表示先前已经报道它们是由THP-1巨噬细胞表达。这些基因由沉默干 扰RNA靶向。CD36作为阳性对照1并且PPAR-a作为阴性对照2包含在 这些基因之中。
调节网络鉴别
表达数据(Affymetrix Hu 130，2.0+)从12个siRNA实验(对所有实 验＞58％抑制，另参见表4，标记粗体的基因)和用非特异性siRNA(模拟 物)处理的4组对照中产生。在已经由PMA活化，用siRNA或模拟物处 理然后用乙酰化LDL孵育48小时的细胞培养物中，从所靶向的和对照的 THP-1巨噬细胞中分离总RNA(也参见上文)。三个转录物GPR120、GPR81 和SOX6低于基因芯片的检测极限，表明这些基因在这一泡沫细胞形成的 实验模型中没有充分活化以被检测或是失活的。将剩余的基因组织成9×9 的数据矩阵。每个基因的表达数据通过除以对照的平均表达水平，随后进 行对数转换来归一化。如前所述，将线性基因调节模型
与数据拟合(11)。其中x指表达数据向量，W是网络邻接矩阵，并且p 是干扰向量。在每个击倒实验中，对于干扰基因p的元素(element)是-1， 对于所有其他基因是0。应注意，由于进行了对数转换，这相当于实际表 达水平的乘法模型(multiplicative model)。该算法通过单一参数d控制精确 度和召回率(recall)之间的权衡。在我们的实验中，我们选择d＝0.2。在模拟 中，我们发现这一值对应约60％的精确度和80％的召回率。应注意，基因 之间的相互作用(即指向刺激或抑制效应的边缘)不暗示直接的生物相互 作用，而在大多数情况下暗示间接的生物相互作用(例如由蛋白质、代谢 物或甚至中间体基因(intermediate gene)(具有低表达水平，诸如转录因子) 介导)。
实施例2
多器官基因表达谱分析显示冠心病中新的候选基因
在这一实施例中，我们在Stockholm动脉粥样硬化基因表达(STAGE) 研究中的具有冠心病(CAD)的患者中执行多器官基因表达谱分析。
方法
在STAGE研究中，在冠状动脉旁路移植术期间，使用Affymetrix HG-U133基因芯片从动脉粥样硬化的和未被影响的动脉壁(n＝40×2)中 以及从肝、骨骼肌和纵隔脂肪(n＝66×3)中获得278个转录谱。还分析 了确认组(25例颈动脉狭窄患者)。mRNA水平的聚类通过偶联双向聚类 来鉴别。
患者和活体标本收集
为了探究新的CAD和动脉粥样硬化的表达表型，STAGE研究包含了 124例因为CABG(＝2次移植)而入住Karolinska大学医院，Solna的患 者。征募42例在Stockholm医院进行颈动脉手术的患者作为确认组。 淘汰标准是其他严重的疾病(例如癌症、肾病和慢性全身性炎症疾病)。 该研究由Karolinska大学医院的道德委员会，Solna批准。所有的患者提供 了知情同意。遗传确认在具有＜60岁的匹配对照的387例MI幸存者中执 行(39)以及在具有Stockholm心脏流行病学计划(SHEEP)的匹配对照 的1091例MI幸存者中执行(24)。
四名外科医生执行CABG，两名执行颈动脉手术。麻醉为标准化的； 收缩压保持在＜150mmHg。在CABG患者中，活体标本从乳房内动脉 (IMA)、主动脉根、肝、骨骼肌和纵隔脂肪获得，保存于RNAlater(Qiagen) 中并在-80℃下冷冻。主动脉根样品中存在动脉粥样硬化损伤(25，26)和 IMA中不存在损伤(27)通过肉眼检查和显微镜检查确认(未显示)。颈 动脉斑块从动脉壁分离，粉碎，用不含核糖核酸酶的水洗涤，嵌入OCT 培养基(Tissue-Tek，Histolab Products)，在液态异戊烷和干冰下冷冻，并 在-80℃下储存。
随访和实验室测量
完成了对124例CABG患者中的114例以及42例颈动脉狭窄患者中 的39例的3个月的随访。使用标准问卷，研究护士获得了病史和生活方 式因素的信息(例如吸烟、饮酒和体力活动)。进行身体检查，并将静脉 血样品抽入预先冷却的含有NaEDTA的无菌管(Vacutainer，Becton Dickinson)中并置于冰上。如所述的，在30分钟内通过离心回收血浆(2.750 g，20分钟，4℃)以分析胆固醇、甘油三酯和脂蛋白(28)。血糖通过葡 萄糖氧化酶方法(Kodak Ektachem)测量，并且胰岛素和胰岛素原通过酶 联免疫吸附测定(Dako Diagnostics)测量。
RNA分离和表达谱分析
总RNA用Trizol(BRL-Life Technologies)和FastPrep(MP Biomedicals)分离，用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)纯化，并且用RNase-Free DNase Set(Qiagen)处理。样品质量用安捷伦生物分析仪2100(Agilent Bioanalyzer 2100)评估。与HG-U133Plus_2阵列(Affymetrix)杂交前， 用分光光度计(ND-1000，NanoDrop Technologies)评估cRNA收率。阵 列用Fluidics Station 450处理，用GeneArray Scanner 3000扫描，并用基因 芯片操作软件2.0分析。对40例患者的所有五种活体标本、来自STAGE 研究的另外26例患者的三种代谢活体标本以及来自25例随机选择的颈动 脉狭窄患者的颈动脉损伤执行表达谱分析。
冠状和颈动脉粥样硬化测量
所有CABG患者经受手术前双平面冠状血管造影术(Judkins技术)。 血管造影片用定量冠状血管造影术(QCA)技术(Medis)评估。将左右冠状动 脉和它们的分支分为几个部分(29)。每个部分在舒张末期期间测量，并 且将斑块面积确定为占该部分的总面积的百分比。一些患者具有右冠状动 脉阻塞，这阻止了QCA评估。冠状动脉狭窄分数从冠状动脉中所有动脉 粥样硬化损伤来计算(腔的20％-50％和＞50％的阻塞分别为1分和2分)。
外科手术前，颈动脉用B型超声检测。使用颈总动脉的远壁(far wall) 从动脉内膜切除术(endoarterectomy)侧测量内膜中层厚度(IMT)(30)。
基因分型
用Qiagen血液和细胞培养DNA试剂盒从血液中提取DNA。基因分型 用TaqMan SNP基因分型测定(Applied Biosystems)执行。在LIM结构域 结合2(LDB2)基因(dbSNP：rs872478、rs1501127、rs10939673、rs2658509 和rs7671482)中选择了五种单核苷酸多态(SNP)，根据SNPbrowser Software 3.5(Applied Biosystems)，所述单核苷酸多态平均分布于不同的 连锁不平衡(LD)区。
0.5μg的总RNA根据生产商的规程用Superscript II(Invitrogen)逆转 录。5倍稀释后，根据生产商的规程，通过实时PCR用1×TaqMan通用 PCR核心试剂盒(Applied Biosystems)在ABI Prism 7000(PE Biosystems) 和软件上扩增cDNA(3μL)。使用含有相应引物和探针的来自Applied Biosystem的Assay On-Demand试剂盒。将mRNA水平对36B4进行归一 化。每个样品以两个重复进行分析。
计算和统计分析
临床和代谢特征提供为平均值±SD的连续变量以及受治疗者数量和百 分比的分类变量。P值用非配对t检验计算；将偏态值(skewed value)进 行对数转换。对于SNP分析，使用ANOVA、卡方和逻辑回归(Stat View 5.0.1)。基因表达值用分位数归一化和稳健多芯片平均(Robust Multichip Average)预处理(31)(另参见“补充方法”)。604,258个完全配对的 Affymetrix探针信号中，423,636个可绘制成参考序列(refseq)转录物(32)， 产生15,042个参考序列转录物。基因表达数据通过偶联双向方法聚类(33， 34)。首先，基因聚类用超级顺磁聚类算法来鉴别(33)。第二，对于每个 基因聚类，患者通过分级聚类来分组(35)(参见“补充方法”)。聚类用 树形图(TreeView)来显示(35)。如所述地计算差异表达的概率和错误发现 率(22)。基因本体论(Gene Ontology，GO)和途径分析用DAVID软件 (56)执行，并且所有的计算用Mathematica 5.1执行。使用文本挖掘定义 先前与CAD和动脉粥样硬化相关的转录物(参见“补充方法”)。对于启 动子分析，使用TRANSFAC(36)。
补充方法
活体标本采集
STAGE研究所包含的114例患者经受分离的选择性冠状动脉旁路移植 术(CABG)。手术期间获得5个组织样品。0.5g骨骼肌取自接近切口的顶 腹直肌(apical rectus abdominis muscle)的内侧缘，并且约1g的纵隔脂肪 取自位于心包和大血管前的组织。乳房内动脉从左胸壁的内部分离，并且 切下1em的远端部分。全厚度主动脉壁样品从穿孔获得，所述穿孔用于在 手术期间在主动脉根处产生近侧静脉移植物吻合。约0.05g肝组织(直径 3mm)在手术末期取自左肝叶的极下缘。当在剑突下仅几厘米处打开腹膜 后，肝的这一部分是容易接近的。在移走活体标本后缝合该极小切口，并 且将腹膜再次闭合。所有组织样品获取没有使用烧灼术且没有并发症。将 它们在10秒钟内立即放入RNAlater(Qiagen)溶液，并且在-80℃冷冻直 到进一步处理。
聚类分析
来自每个组织的基因表达数据以Getz等人启发的偶联双向方式聚类 (34)。该程序的第一步包括使用由Tetko等人实施的超级顺磁聚类(SPC) 算法聚类基因(33)。该算法允许基因表现为多个聚类。基因表达谱之间 的相似性用Spearman等级相关来测量。我们鉴别在0.015温度间隔内稳定 的聚类，并移除重叠的聚类，如果它们超过60％同一性，并且排除具有超 过1000个成员的聚类。基于单个基因聚类，我们使用分级(聚合)聚类 用Mathematica中的平均连锁将患者分为2个聚类。使用Manhattan距离 测量2例患者表达谱之间的相似性。小的患者聚类(3例患者或更少)被 认为是异常值并因此移除，将剩余的患者重新聚类。为了具体化，患者用 Eisen等人的聚类中的分级聚类来重新聚类(35)。这产生了与我们的聚合 算法聚类完全相同的用树形图具体化(35)的聚类树。
定义先前与CAD相关的转录物
使用PubMed的自动化文本挖掘建立先前与CAD和动脉粥样硬化相 关的基因的广泛列表。简单地说，一个基因被认为是相关的，如果它与 PubMed上的发表文章的摘要中的任何以下术语同时出现：冠心病、动脉 粥样硬化和动脉硬化。其他2个列表使用胆固醇或糖尿病作为搜索术语 人工生成。由于一些明确的动脉粥样硬化基因未被捕捉，所以从最近CAD 和动脉粥样硬化的综述中人工提取了一些基因。CAD相关的基因的列表包 含2832个基因。
启动子分析
启动子序列来自Ensembl v.43，从Biomart(http://www.biomart.org/) 下载。鉴别了具有LIM结构域(37)或已知与LDB2相互作用(38)的转 录因子(TF)。我们在TRANSFAC v 10.4(36)上从这组Tf中搜索已知的 转录因子结合位点(TFBS)。这些Tf中的7个具有总计171个已知的TFBS。 我们使用程序PATCH(36)并在启动子序列中搜索这171个基序以至少 6bp配对且没有错配的位置。
遗传确认组
SCARF
Stockholm冠状动脉粥样硬化风险因子(SCARF)研究是病例-对照研 究，其被设计以形成遗传和生物化学因子早发MI研究的基础。包括总计 387例年龄小于60岁的首次MI的幸存者，他们已经入住Stockholm北部 三家医院(Danderyd医院、Karolinska大学医院Solna和医院) 的冠心病监护病房。简单地说，登记了满足选择标准的随意挑选的患者， 并且淘汰标准为：1型糖尿病、肾功能不全(定义为血浆肌酐＞200μmol/L)、 任何慢性炎症疾病、药物成瘾、精神病或无力遵从规程。对于每位心肌梗 塞后的患者，从一般人群中征募性别和年龄匹配的对照者(响应率79％)。 在所述索引心血管事件(index cardiac event)后三个月，患者和对照经受 体检，并且过夜禁食后取得血液样品。背景资料(例如社会环境、生活方 式、病史和药物治疗)通过结构性访谈的形式收集。种族划分根据自我报 道的回溯远至3代的起源来记录，并且超过99％的本研究参加者被认为是 白种人。另参见表9。
Stockholm心脏流行病学计划(SHEEP)研究是大型的基于人群的病 例-对照研究，其目标为研究诱发MI的遗传、生物化学和环境因子。潜在 的研究参与者(年龄范围45-70岁)是生活在Stockholm郡的先前没有临 床诊断为MI的所有瑞典居民。男性病例征募于1992-1994年之间，并且 女性病例于1992-1994年之间。Mi诊断的标准是根据由瑞典心脏病学会于 1991年提出的指导原则，并且包括：(1)典型症状；(2)血清肌酸激酶(S-CK) 和乳酸脱氢酶(LDH)的显著升高以及(3)特有的心电图变化。如果满 足2个或3个标准，则患者被诊断为MI。每名病例的5名对照候选者在病 例事件的2天内取样，以便能够代替潜在的无响应者。对于每位心肌梗塞 后患者，在符合年龄、性别和集水区域(catchment area)后，在病例事件 2天内征募随机选择的健康个体。由于来自一些初始对照的延迟响应，偶 尔地会同时包括初始和可选对照。在患者的所述索引心血管事件后近三个 月，收集血液样品，并且所有的参与者经受体检。另参见表10。
结果
患者特征
所述114例STAGE患者为典型CAD组(表5)。重要地，他们的特征 没有显著不同于从中获取代谢基因表达谱的66例STAGE患者的特征，所 述114例STAGE患者转而也没有不同于从中获取全部5个表达谱的40例 STAGE患者。从中获取基因表达谱的颈动脉狭窄患者(n＝25)的基本特征 也显示于表5中。
与冠状动脉粥样硬化的程度相关的基因表达
为了定义与动脉粥样硬化相关的基因聚类，我们使用偶联双向聚类分 析(补充方法)，分析来自动脉粥样硬化主动脉根与未受影响的IMA的 15,042参考序列转录物(方法)的mRNA比例。在14个基因聚类(表7) 中，一个基因聚类(n＝49个基因)将患者聚类成冠状动脉狭窄程度不同 (P＝0.008)的2组。从肝和骨骼肌鉴别的基因聚类(分别为15和11聚类； 表7)与冠状动脉狭窄不相关。相反，纵隔脂肪基因表达谱的双向聚类产 生了20个基因聚类(表7)；一个基因聚类(n＝59)将患者聚类成冠状动 脉狭窄程度不同(P＝0.00015)的2组。7个基因出现在两个动脉粥样硬化 相关的聚类中(偶然出现的可能性(Pc)＜7×10-10)，表明了在纵隔脂肪和 动脉粥样硬化主动脉根中的共同的动脉粥样硬化相关基因活性。
与颈动脉粥样硬化的程度相关的基因表达
为了确认在STAGE组中鉴别的动脉粥样硬化相关的基因，我们分析 一组经受颈动脉外科手术的颈动脉狭窄患者(表5)。偶联双向聚类来自 25个颈动脉斑块的表达谱产生11个基因聚类(表7)，其中一个(n＝55) 将患者聚类成IMT分数不同(P＝0.038)的2组。明显地，所述55个基因 中的16个与纵隔脂肪聚类基因重叠(Pc＜9×10-27)，并且17个与主动脉根 /IMA聚类基因重叠(Pc＜1×10-30)。6个转录物(C型凝集素结构域家族 14、钙黏着蛋白5、染色体20开放阅读框160、内皮分化鞘脂G蛋白偶联 受体-1、G蛋白偶联受体-116和LDB2)在所有三个聚类中(Pc＜7.15×10-23)， 并且总计有129个基因(表8)。
基因本体论和KEGG途径分析
3种鉴别的聚类(与来自两个患者组的3个单独的组织中动脉粥样硬 化的程度相关，图5)之间的高度显著的重叠表明这3个聚类包含了对动 脉粥样硬化发展重要的生物活性。为了了解更多关于这些聚类中的基因 (n＝129，表8)，我们执行了GO和KEGG途径分析。89个在GO分类生 物过程中具有匹配，100个在分子功能中具有匹配，并且93个在细胞区 室中具有匹配。最高分在生物过程中是细胞通讯(n＝40，P＜1.410-5)、 信号转导(n＝37，P＝3.7×10-5)和细胞黏着(n＝13，P＜6.5×10-4)；在分子 功能中是鸟苷酸交换因子活性(n＝7，P＜8.7×10-5)、GTP酶调节活性(n＝9， P＜2.5×10-4)和信号转导活性(n＝34，P＝3.1×10-4)；并且在细胞区室中 是膜(n＝64，P＜1.310-7)和质膜(n＝31，P＜4.8×10-7)。在129个基因中 (表8)；31个基因先前已经与动脉粥样硬化相关，40个没有生物过程注 释并且7个参与调节活性(转录因子(TF)和它们的辅因子)。在38个有 KEGG途径的注释的基因中，16个与跨内皮迁移途径有关，其中8个具有 精确的匹配(n＝8，P＜7.7×10-7)。
启动子分析和遗传确认
在重复代表的具有与冠状和颈动脉粥样硬化程度相关的较高mRNA 水平的6个基因中(所有三个聚类的交叉；图5)，LDB2作为唯一的转录 调节子脱颖而出。为了探究LDB2可能参与调节其他128个基因(除LDB2 以外的所有三个聚类的联合，图5)中的一些基因的可能性，我们在 TRANSFAC中对在这些基因中的122个基因中发现的161个启动子执行计 算机芯片(in silico)序列匹配。首先，我们鉴别了7个TF，这些TF具有在 TRANSFAC(v10.4)中已知的结合位点基序和LIM结合结构域或已知与 LDB2相互作用的其他结构域(ISL-1α、Lmo2、Lhx3a、Lhx3b、LHX2、 LHX4和BRCA1)。我们发现在这129个基因中的122个(94％)中发现 的161个启动子(靶启动子)的81％具有至少一个这种结合位点。涉及相 对于转录起始位点的10255个人启动子覆盖[-600，-1]区的背景，结合靶启 动子显著增加1.2至5倍。
聚类和计算机芯片上的启动子分析表明LDB2可能与涉及动脉粥样硬 化严重性的129个基因中的一些基因的体内调节有关。如果是这样，影响 LDB2表达的功能多态应该也影响动脉粥样硬化的发展。为了检验这一假 设，我们在遗传学上确认了387名MI幸存者和匹配对照中(39)，以及1091 名MI幸存者和来自SHEEP的对照中的LDB2基因(24)。首先，我们鉴 别了根据LD区在LDB2中均匀分布的5个SNP，然后寻找与STAGE组 中的基因表达的关联。SNP rs 10939673的次要T等位基因的载体倾向于在 主动脉根/IMA(P00.004)和纵隔脂肪(P＝0.001)中具有较低的LDB2mRNA 水平(通过实时PCR评估)。此外，如通过冠状动脉狭窄分数(P＝0.012， n＝375)和斑块面积百分比(P＝0.029)判断的，T等位基因载体在MI幸 存者中明显未被充分代表(P＝0.014(n＝375)，0.03(n＝917)和0.005(n＝1304， 组合)，表6A-C)，并且具有较少的动脉粥样硬化(表6D)。
结果总结
在所有组织类型中鉴别的60个聚类中，2个与冠状动脉狭窄的程度有 关：一个在主动脉损伤(n＝49个基因)中并且一个在纵隔脂肪中(n＝59)。 明显地，在颈动脉狭窄的患者的确认组中，也在与动脉粥样硬化程度相关 的聚类(n＝55)中鉴别了这些基因中的27个。功能分析将白细胞的跨内 皮迁移鉴别为动脉粥样硬化严重性和LIM-结构域结合2(LDB2)的共同 特征，因为7个基因中的一个涉及转录调节。计算机芯片上的启动子分析 表明LDB2可间接调节大部分鉴别的基因。在387位具有匹配对照的心肌 梗塞幸存者中，LDB2中的SNP rs10939673的稀少T等位基因在幸存者中 未被充分代表，并且相反地与冠状动脉粥样硬化相关。
讨论
不同于候选基因或途径方法，全基因组方法，诸如全基因表达分析相 对于所研究的生物或病理学系统的现有知识更加公正。因此，全基因组分 析可迅速增加我们对复杂生物问题的分子机制和共有调节子的理解。在 STAGE研究中，在每位患者中分析了5个CAD相关的器官中的15,042个 参考序列信号值，以反映对冠状动脉粥样硬化的发展重要的基因活性。动 脉粥样硬化主动脉壁和纵隔内脏脂肪中的101个转录物与冠状动脉粥样硬 化的程度有关，而在肝和骨骼肌中的基因活性聚类是无关的。明显地，在 25例颈动脉狭窄患者的确认组中，还发现101个转录物中的27个属于与 动脉粥样硬化程度相关的唯一的基因活性聚类。
生物信息评估表明所鉴别的基因中的仅31个先前与动脉粥样硬化相 关，40个没有生物过程注释并且16个与跨内皮白细胞迁移途径相关。根 据计算机芯片序列启动子分析，与转录调节相关的7个转录物中，一个 (LDB2)可潜在调节多达81％的所鉴别的转录物。在两组具有基于人群 的对照的MI幸存者中的LDB2遗传确认表明SNP rs 10939673的次要T等 位基因较少地与冠状动脉狭窄相关，并且在MI幸存者中具有明显较少的 普遍性。
这些结果表明(1)纵隔中的内脏脂肪充当影响冠状动脉粥样硬化的 炎症的局部来源；(2)增加的白细胞跨内皮迁移与增加的动脉粥样硬化严 重性相关；(3)LDB2是参与CAD发展的高级调节子；(4)LDB2的拮抗 物值得作为动脉粥样硬化的疗法来测试；并且(5)LDB2中的SNP rs 10939673可用于鉴别CAD/MI风险。
白细胞的跨内皮迁移是动脉粥样硬化发展的明确途径。单核细胞的跨 内皮迁移对泡沫细胞形成和启动动脉粥样硬化斑块发展是重要的(40，41) 并且T细胞的跨内皮迁移被认为是动脉粥样硬化后期的中心过程(42)。 事实上，跨内皮白细胞迁移已经被认为是动脉粥样硬化治疗的可能靶。我 们的KEGG途径分析表明增加的白细胞的跨内皮迁移可能是具有更加严 重的动脉粥样硬化患者的共同特征。此外，所鉴别的基因中的一些没有注 释的基因可能在这一途径或其调节中起作用。另外，我们的数据表明这一 途径直接参与斑块的形成并且也通过增加纵隔脂肪的炎症状态间接地参 与斑块的形成。
在肝或骨骼肌中没有鉴别到与冠状动脉狭窄的程度相关的基因聚类。 当考虑这些器官对明确的CAD风险因子，诸如血浆胆固醇和葡萄糖水平 (即糖尿病)的重要性，这是令人惊讶的。这些发现可反映基因表达通过 对这些风险因子的治疗而正常化。纵隔脂肪(或任何内脏脂肪)与血液中 明确的CAD风险因子的关系并不清楚。然而，增加的腰臀比例-腹部内 脏脂肪质量增加的指示-是CAD最有力的预告者之一。纵隔脂肪令人关 注的方面是其解剖位置并且最近的数据表明内脏脂肪作为炎症介质的来 源的作用(43)。尽管我们的研究没有表明纵隔脂肪可如何引起动脉粥样 硬化，但炎症介质的局部来源可增加动脉粥样硬化进展的速率(44)。
编码LIM结构域结合因子(诸如LDB2)的基因最初是在筛选与核蛋 白的LIM结构域物理上相互作用的蛋白质中分离的。这些蛋白质结合多种 TF并且可能起增强子的作用，将不同的转录因子结合到一起以形成高阶活 化复合体(higher-order activation complex)(45，46)。在我们筛选LDB2 相关的TF中，鉴别了ISL-1α、Lmo2、Lhx3a、Lhx3b、Lhx2、Lhx4和BRCA1。 ISL-1α增强HNF4活性，因此增强胰岛素信令(signalling)(47，48)。Lmo2 参与血管发生(49，50)。Lhx3和Lhx4调节垂体特异性细胞谱系的增殖和 分化(51)并且在淋巴细胞的亚型(52)和胸腺细胞肿瘤细胞系(53)中 表达。BRCA1与自发和LPS诱导的TNF-α的产生的选择性缺陷有关，并 与自发和LPS诱导的TNF-α诱导的外周血单核细胞上(54)细胞间黏着分 子1的表达的产生的选择性缺陷及控制T淋巴细胞生命周期(55)中的选 择性缺陷相关。直到本研究为止，LDB2都未与CAD或动脉粥样硬化相关。 其高等级的调节作用和参与不同生物过程使之成为复杂疾病的进一步评 估所关注的靶。
总之，几种CAD相关器官的分子谱分析反映由纵隔脂肪分享并在颈 动脉损伤中复制的独特分子动脉粥样硬化表型。该表型包括白细胞的跨内 皮迁移和作为包含动脉粥样硬化保护性(atheroprotective)稀少SNP等位 基因的高级调节子的TF辅因子LDB2。
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表1.代表性Ldlr-/-Apob100/100Mttpflox/floxMx1-Cre小鼠的血浆胆固醇、甘 油三酯和葡萄糖的浓度
值为平均值±SD。时间点之间没有统计显著的差异(P＞0.05)。
表2siRNA靶向的胆固醇响应基因
aP值表示与lipofectamine转染的平行对照(n＝6)相比，所靶向基因 (n＝6)的泡沫细胞中的CE含量。CE表示胆固醇酯；ORO，油红O；nd， 无差异；ns，不显著
表3
动脉粥样硬化 相关 巨噬细胞相关 内皮细胞 相关 平滑肌细胞 相关 T-细胞相 关 新型 聚类1 36％ 44％ 36％ 25％ 40％ 39％ 聚类2 22％ 14％ 15％ 11％ 18％ 66％ 聚类3 27％ 22％ 23％ 17％ 26％ 60％ 聚类4 20％ 15％ 14％ 12％ 16％ 69％ 总计 27％ 24％ 22％％ 16％ 25％ 59％
表430周龄的小鼠的动脉粥样硬化壁中的胆固醇响应基因
表5STAGE研究中患者的基础特征
P值使用非配对t检验比较STAGE中的亚组和整个STAGE组(N＝114)来计算.
*P值＜0.05；**P值＜0.01
￥斑块面积是对左冠状动脉的7个部分的总结。
圆括号中的数字表示整个亚组的％.
表6MI病例和匹配对照两个组中rs10939673的关联分析
MAF表示次要等位基因频率；MI，心肌梗塞
斑块面积是对所有部分的总结
表7
与所有组织中狭窄分数或IMT相关的偶联双向基因聚类
表8
主动脉-IMA、纵隔脂肪和颈动脉损伤中三个所鉴别的聚类的联合中的 129个基因
参考序列 基因符号 基因名称 NM_000054 AVPR2 精氨酸加压素受体2(肾原性尿崩症) NM_000148 FUT1 岩藻糖基转移酶1(半乳糖苷2-α-L-岩藻糖基转移酶，H血型) NM_000334 SCN4A 钠通道，电压门控，类型IV，α NM_000355 TCN2 钴胺传递蛋白II；巨红细胞性贫血 NM_000442 PECAM1 血小板/内皮细胞黏着分子(CD31抗原) NM_000459 TEK TEK酪氨酸激酶，内皮(静脉畸形，多皮的和黏膜的) NM_000552 VWF von Willebrand因子 NM_000609 CXCL12 趋化因子(C-X-C基序)配体12(基质细胞衍生因子1) NM_000681 ADRA2A 肾上腺素能，α-2A-，受体 NM_000717 CA4 碳酸酐酶IV NM_001010846 SHE 含Src同源性2结构域E NM_001046 SLC12A2 溶质载体蛋白家族12(钠/钾/氯转运蛋白)，成员2 NM_001084 PLOD3 原胶原-赖氨酸，2-酮戊二酸5-双加氧酶3 NM_001289 CLIC2 氯细胞内通道2 NM_001290 LDB2 LIM结构域结合2 NM_001312 CRIP2 半胱氨酸富集蛋白2 NM_001400 EDG1 内皮分化，鞘脂G蛋白偶联受体，1 NM_001552 IGFBP4 胰岛素样生长因子结合蛋白4 NM_001718 BMP6 骨形态发生蛋白6 NM_001795 CDH5 钙黏着蛋白5，类型2，VE-钙黏着蛋白(血管上皮) NM_001882 CRHBP 促肾上腺皮质素释放激素结合蛋白
NM_001889 CRYZ 晶体蛋白，ζ(醌还原酶) NM_002017 FLI1 Friend白血病病毒整合子1 NM_002060 GJA4 间隙连接蛋白，α4，37KDa(连接蛋白37) NM_002073 GNAZ 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，αz多肽 NM_002253 KDR 激酶插入结构域受体(类型I I I受体酪氨酸激酶) NM_002290 LAMA4 层粘连蛋白，α4 NM_002343 LTF 乳运铁蛋白 NM_002599 PDE2A 磷酸二酯酶2A，cGMP-刺激 NM_002661 PLCG2 磷脂酶C，γ2(磷脂酰肌醇特异性) NM_002837 PTPRB 蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型，B NM_002856 PVRL2 脊髓灰质炎病毒受体相关2(疱疹病毒侵入介质B) NM_003265 TLR3 Toll样受体3 NM_003277 CLDN5 密蛋白5(心瓣面综合征中删除的跨膜蛋白) NM_003810 TNFSF10 肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员10 NM_004444 EPHB4 EPH受体B4 NM_004510 SP110 sp110核体蛋白 NM_004557 NOTCH4 Notch同系物4(果蝇) NM_004955 SLC29A1 溶质载体蛋白家族29(核苷转运蛋白)，成员1 NM_005161 AGTRL1 血管紧张素II受体样1 NM_005424 TIE1 具有免疫球蛋白样和ECF样结构域的酪氨酸激酶1 NM_005512 LRRC32 含富含亮氨酸重复序列32 NM_005693 NR1H3 核受体亚家族1，组H，成员3 NM_005723 TSPAN5 四旋蛋白(tetraspanin)5 NM_005795 CALCRL 降钙素受体样 NM_005797 EVA1 上皮V样抗原1 NM_005856 RAMP3 受体(降钙素)活性修饰蛋白3 NM_006105 RAPGEF3 Rap鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)3 NM_006255 PRKCH 蛋白激酶C，η
NM_006334 OLFM1 嗅介蛋白1 NM_006435 IFITM2 干扰素诱导跨膜蛋白2(1-8D) NM_007023 RAPGEF4 Rap鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)4 NM_007177 FAM107A 具有序列相似性的家族107，成员A NM_012072 CIQR1 补体成分1，q亚成分，受体1 NM_012307 EPB41L3 红细胞膜蛋白带4.1样3 NM_013355 PKN3 蛋白激酶N3 NM_014220 TM4SF1 跨膜4L六家族成员1 NM_014421 DKK2 dickkopf同系物2(爪蟾) NM_014550 CARD10 胱天蛋白酶募集域家族，成员10 NM_014725 STARD8 含START结构域8 NM_014839 LPPR4 可塑性相关基因1 NM_015234 GPR116 G蛋白偶联受体116 NM_015460 MYRIP 肌球蛋白VIIA和R ab相互作用蛋白 NM_015568 PPP1R16B 蛋白磷酸酶1，调节(抑制子)亚基16B NM_015660 GIMAP2 GTP酶，IMAP家族成员2 NM_015937 PIG T 磷脂酰肌醇聚糖，T类 NM_016242 EMCN endomucin NM_016511 CLEC1A C型凝集素结构域家族1，成员A NM_016580 PCDH12 原钙黏着蛋白12 NM_016929 CLIC5 氯细胞内通道5 NM_017577 GRAMDIC 含GRAM结构域1C NM_017719 SNRK SNF相关激酶 NM_017805 RASIPI Ras相互作用蛋白1 NM_018058 CRTAC1 软骨酸性蛋白1 NM_018326 GIMAP4 GTP酶，IMAP家族成员4 NM_018664 SNFT jun二聚化蛋白p21 snft NM_018728 MYO5C 肌球蛋白VC NM_019055 ROBO4 迂回同源物4，神奇迂回(果蝇) NM_019555 ARHGEF3 Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)3 NM_020130 C8orf4 染色体8可读框4 NM_020142 NDUFA4L2 nadh：辅酶Q氧化还原酶mlrq亚基同系物
NM_020766 PCDH19 原钙黏着蛋白19 NM_020812 DOCK6 胞质分裂的贡献者(dedicator)6 NM_021034 IFITM3 干扰素诱导的跨膜蛋白3(1-8U) NM_022003 FXYD6 含FXYD结构域的离子转运调节子6 NM_022164 TINAGL1 肾小管间质性肾炎抗原样1 NM_022454 SOX17 SRY(性别决定区Y)-盒17 NM_022481 CENTD3 半人马蛋白，δ3 NM_022770 NM_022770 假设蛋白flj13912 NM_022821 ELOVL1 极长链脂肪酸的延长(FEN1/Elo2，SUR4/Elo3，酵母)-样1 NM_024689 CXorf36 染色体X可读框36 NM_024756 MMRN2 多聚蛋白2 NM_024781 C18orf14 染色体18可读框14 NM_024869 GRRP1 甘氨酸/精氨酸富集蛋白1 NM_025179 PLXNA2 丛蛋白A2 NM_031310 PLVAP 胞膜小泡相关蛋白 NM_031439 SOX7 SRY(性别决定区Y)-盒7 NM_052946 NOSTRIN 氧化氮合酶运输者(trafficker) NM_052954 CYYR1 半胱氨酸/酪氨酸富集1 NM_052960 RBP7 视黄醇结合蛋白7，细胞 NM_052970 HSPA12B 热休克70kD蛋白12B NM_080388 S100A16 S100钙结合蛋白A16 NM_080625 C20orf160 染色体20可读框160 NM_133625 SYN2 突触蛋白ii NM_138786 TM4SF18 跨膜4L六家族成员18 NM_138961 ESAM 内皮细胞黏着分子 NM_139247 ADCY4 腺苷酸环化酶4 NM_144649 TMEM 71 跨膜蛋白71 NM_144765 EVA1 上皮v样抗原1 NM_145057 CDC42EP5 CDC42效应子蛋白(Rho GTP酶结合)5 NM_145273 CD300LG CD300抗原样家族成员G NM_152354 ZNF285 锌指蛋白285
NM_152400 NM_152400 假设蛋白f1j39370 NM_152406 NM_152406 假设蛋白f1j36748 NM_152536 FGD5 含FYVE、RhoGEF和PH结构域5 NM_152727 CPNE2 copineII NM_170600 SH2D3C 含sh2结构域3c NM_173505 ANKRD29 锚蛋白重复结构域29 NM_173728 ARHGEF15 Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)15 NM_174934 SCN4B 钠通道，电压门控，类型IV，β NM_174938 FRMD3 含FERM结构域3 NM_175060 CLEC14A C型凝集素结构域家族14，成员A NM_175571 GIMAP8 GTP酶，IMAP家族成员8 NM_175744 RHOC ras同系物基因家族，成员C NM_178172 LOC338328 高密度脂蛋白-结合蛋白 NM_181844 BCL6B B细胞CLL/淋巴瘤6，成员B(锌指蛋白) NM_182487 OLFML2A 嗅介蛋白样2A NM_198471 ANKRD47 锚蛋白重复结构域47 NM_199054 MKNK2 map激酶相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶2
表9387个MI患者和对照受治疗者的基本特征
表10根据性别和病例-对照状态的一般特征和基因型频率分配
CAD风险主要从脂质、葡萄糖和炎症标志物的血浆浓度以及从血压、 身体质量指数(body mass index)和腰臀比例(waist-to-hip ratio)来判断。改善 生活方式风险因子(例如吸烟、高脂肪和卡路里摄取以及缺少锻炼)可以降 低高血压和体重并具有对血液中风险因子的有益影响。
虽然CAD风险因子是密切相互关联的并且在大多数人中被终身监测， 但严重的动脉粥样硬化通常在晚期才被检测到，经常是作为心肌梗塞(MI)、 中风或其他临床表现的结果。
动脉粥样硬化是终身的进行性疾病，它在50％的群体中变得临床显著， 导致心肌梗塞和中风以及最后的死亡。动脉粥样硬化的第一个表现是在动 脉壁的内膜中形成泡沫细胞，产生脂纹的组织学外观。简而言之，循环脂 蛋白，主要是LDL，粘着于内皮下基质并经受最终改变了内皮细胞的基因 和蛋白质表达的氧化修饰。这些变化导致单核细胞的募集，所述单核细胞 迁移到动脉壁的内膜，分化成巨噬细胞并吞噬修饰的LDL。这些早期步骤 的后面是额外的炎症和免疫响应，平滑肌细胞迁移和纤维化，最终形成动 脉粥样硬化斑块并凋亡。这些生物过程以及还未鉴别的其他可能过程的相 互作用构成了动脉粥样硬化发展的基础。最近，降低血浆胆固醇的他汀类 药物疗法已经表现出防止或在一些情况下甚至退化动脉粥样硬化的发展 (1)。然而，关于构成动脉粥样硬化损伤发展基础的转录变化的全部内容 (repertoire)却知之甚少(2)，并且几乎不了解关于血浆胆固醇降低对动脉 壁基因表达的有益影响的任何事情。
发明概述
人类基因组的作图(mapping)已经产生大量的新技术来从基因组角 度研究复杂疾病，像CAD。通过揭示构成复杂生物系统基础的分子活性的 全部内容，这些技术可用于疾病的早期鉴别和靶向中心疾病途径(central disease pathway)的新疗法(3-5)。实际上，这说明从现在开始的使用这些 技术的研究工作可以从引起疾病的所有活性的角度而不是从某些途径或 基因的狭窄角度去鉴别疾病的机制。由于可监测所有分子的活性，表现最 中心的分子将成为用于治疗的最高等级的靶，这与迄今鉴别的根据候选驱 动假说(candidate-driven hypothesis)预选的所有的靶的历史相反。这一历 史偏见可能是我们观察到当今如此多的靶在临床试验的后期(II和III期) 失败的原因，这并不少见。本文提供的新鉴别的靶基因代表新一代的靶， 其是根据它们在涉及动脉粥样硬化和动脉粥样硬化相关疾病的所有可能 的靶的高等级来选择的。
本文提供的靶基因主要通过在小鼠中的研究发现，所述基因使用独特 的小鼠模型鉴别，在所述小鼠模型中可使用肝中的遗传开关(genetic switch) 降低血浆胆固醇，所述遗传开关可在小鼠成年期的任何给定时间点被活化 (9)。血浆胆固醇降低是当今阻止动脉粥样硬化发展的最有效的方法。不 幸地是，只有小部分群体(＜10％)适合血浆胆固醇降低治疗。使用这一小 鼠模型，发明人已经鉴别出在响应血浆胆固醇降低而预防动脉粥样硬化中 介导有益影响的基因靶。因此，这些靶可用于干预患有动脉粥样硬化的大 多数患者，他们也缺乏高水平的血浆胆固醇。开发直接靶向所鉴别的分子 的化合物应该有助于防止或甚至退化这些个体的动脉粥样硬化发展。
通过对人的研究发现的靶基因表明白细胞的跨内皮迁移是内脏脂肪 和动脉壁中导致动脉粥样硬化发展的生物过程。这一过程对所有的炎症反 应是常见的，因此所鉴别的靶(即负责这一过程的基因)可用于预防除动脉 粥样硬化以外的其他炎症疾病，例如类风湿关节炎、炎性肠病、阿尔茨海 默病等几个实例。在人类中进行的导致本发明的研究的另一个方面是，不 仅在病态的动脉壁(即动脉粥样硬化动脉壁)中，还在肝、骨骼肌和内脏脂 肪中寻找靶。这种多器官筛选增加假定的靶的覆盖范围，其超过疾病自身 的分子活性的全部内容，到达可影响动脉粥样硬化发展的所有器官。本发 明包括参与白细胞跨内皮迁移的129个基因(表8)。这一应用的重点是 LDB2，已发现它是这129个基因中的122个的高级调节子，并且因此是 干预的合适靶。
本发明是基于对表4和表8中公开的基因，特别是LDB2、GYPC、 AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2与动脉粥样硬化和动脉粥样硬 化相关疾病之间的关系的发现。
在第一个方面中，本发明涉及鉴别化合物作为候选药物的方法，所述 方法包括使所述化合物接触表达选自由表4和表8中公开的基因(特别是 LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2)组成的组的 基因的细胞，并且分析所述化合物是否调节所述基因中至少一种的表达。
表达的调节可相对未治疗对照的参考水平，通过技术人员可用的任何 合适的直接或间接方法来测量，所述方法诸如测量转录的mRNA的量、产 生的基因产物的量、基因产物的活性或测量引入的报道实体(reporter entity)。
在根据这一方面的本发明的一个实施方案中，所述分析包括对所述基 因中至少两种的表达调节的分析。在进一步的实施方案中，所述分析进一 步包括对选自由CD 36和PPARα组成的组的基因的表达调节的分析。
在第二个方面中，本发明涉及鉴别化合物作为候选药物的方法，所述 方法包括使所述化合物接触选自由表4和表8中公开的基因(特别是 LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL26)组成的组的 基因的基因产物，并且分析所述化合物是否调节所述基因产物的生物活 性。
在这一方面，所述调节可以是活性的增加或降低。所述活性可以是一 般与以下相关的活性：所述基因产物、或参与动脉粥样硬化或动脉粥样硬 化相关疾病的发展或进展的基因表达的调节(所述基因诸如选自由LDB2、 GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2、CD 36和PPARα组 成的组的基因)或白细胞的跨内皮迁移。
在进一步方面中，本发明涉及根据前述方面的任一方面的方法，所述 方法包括：
-获得DNA分子，所述DNA分子包括选自由LDB2、GYPC、AGPAT3、 AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2组成的组的基因的编码序列，以及任选地， 调节所述基因表达的序列元件；
-将所述DNA分子引入宿主细胞，诸如非人胚胎的细胞系或细胞，以 获得所述DNA分子的细胞表达；
-使所述宿主细胞接触所述化合物，并且
-分析所述化合物是否调节所述DNA分子的表达或所述基因产物的生 物活性。
根据这一方面的方法的分析步骤可包括对白细胞的跨内皮迁移的分 析。
在根据以上(ebove)方面的方法的优选实施方案中，该方法涉及鉴别 化合物作为用于治疗选自由动脉粥样硬化和动脉粥样硬化相关疾病组成 的组的疾病的候选药物。
在以上提到的方面中，有待鉴别为候选药物的化合物可以是有机小分 子、肽、多肽或蛋白质、诸如DNA或RNA的核酸，包括siRNA和miRNA、 诸如PNA的修饰的核酸或可掺入药物组合物的任何其他化合物。
在进一步的方面中，本发明涉及鉴别用于评估动脉粥样硬化和动脉粥 样硬化相关的疾病(诸如冠心病、中风和心肌梗塞)或炎症疾病的诱因、发 展和/或结果的遗传标志物的方法，所述方法包括检测群体中的个体之间的 选自由表4和表8中公开的基因(特别是LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、 PVRL2、HMGB3、HSDL2)组成的组的基因的遗传性变异，并将所述遗传 性变异与所述个体之间的动脉粥样硬化和动脉粥样硬化相关疾病的诱因、 发展和/或结果的差异相互关联。
在本发明的这一方面中，所述遗传性变异可以是调节(例如增加或降 低)基因的表达或基因产物的活性的遗传性变异。
在进一步的方面中，本发明涉及包含异源DNA分子的遗传修饰细胞 和动物，所述异源DNA分子包含选自由表4和表8中公开的基因(特别 是LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2)组成的组 的基因的编码序列，和/或使这些基因之一灭活。此类“敲除”动物是本领 域公知的，并且根据需求进行商业基础的生产。所述基因的灭活不需要 100％；将该基因灭活达到敲除动物的表型在相关实验中可用的程度就足够 了。可进一步引入异源DNA分子，所述异源DNA分子包含动物的敲除基 因的编码序列，优选地具有允许所调节的基因产物表达的调节序列。
在这一方面中，所述动物可以是任何非人动物，优选哺乳动物，诸如 灵长类或啮齿类，如小鼠或大鼠。遗传修饰细胞可以是任何来源的，并且 本领域技术人员可决定合适的表达系统。根据这一方面的遗传修饰细胞和 动物可用于以上鉴别化合物作为候选药物的方法。
在这一方面的一个实施方案中，所述异源DNA分子进一步包含选自 由表4和表8中公开的基因(特别是LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、 HMGB3、HSDL2)组成的组的基因的调节序列。
在进一步的方面中，本发明涉及治疗患有动脉粥样硬化或动脉粥样硬 化相关疾病(诸如冠心病、中风和心肌梗塞)或炎症疾病或有发展所述疾病 的风险的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用选自由表4和表8中 公开的基因(特别是LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、 HSDL2)组成的组的基因的原型或修饰变体或用根据以上提到方面的方法 鉴别的化合物。
在进一步的方面中，本发明涉及治疗患有动脉粥样硬化或动脉粥样硬 化相关的疾病或有发展所述疾病的风险的患者的方法，所述方法包括向所 述患者施用选自由siRNA分子组成的组的化合物，所述siRNA分子靶向 选自由LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、PVRL2、HMGB3、HSDL2组成的 组的基因。
这一方面还涵盖了包含靶向选自由LDB2、GYPC、AGPAT3、AGL、 PVRL2、HMGB3、HSDL2组成的组的基因的siRNA分子以及任选地，药 学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂以及类似物质的药物组合物。此类 siRNA分子还可被修饰以增强性质，诸如增加的摄取、体内延长的半衰期 等。
在进一步的方面中，本发明涉及鉴别受治疗者具有低于平均的发展动 脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病的风险的方法，所述方法包括分析所 述受治疗者的LDB2基因，并且其中LDB2基因中单核苷酸多态rs 10939673 的T次要等位基因(minor allele)的存在表明低于平均的风险。
附图简述
图1.通过苏丹IV染色固定住(pinned-out)的主动脉来评估 Ldlr-/-Apob100/100Mttpflox/flox小鼠中动脉粥样硬化的进展。第20(n＝12)、30 (n＝25)、40(n＝15)、50(n＝15)和60(n＝10)周的动脉粥样硬化进展的箱形图。 P＜0.05，20周对比30周；P＜0.0001，30周对比40周；P＜0.02，40周对比 50周。值为表面损伤面积占整个主动脉的百分比。箱形包括在百分之75 和百分之25之间的值，柱形表示百分之90和百分之10之间的值，并且 黑点表示这些边界之外的个别观察结果。
图2.动脉粥样硬化细胞类型的细胞特异性标志物的相对表达水平。 显示了每个细胞类型的标志物数量。唯一的统计显著增加是泡沫细胞的数 量，它在第20周和30周之间增加20％(P＜0.001)并在60周时仍然升高。
图3：血浆胆固醇降低对损伤进展的影响。损伤表面面积通过损伤面 积占从分叉到主动脉根的固定住的主动脉总面积的百分比来确定。在28 周龄时，小鼠接受腹膜内pI-pC注射以诱导肝中Mttp的重组，并且12周 后或实现胆固醇降低1周后处死小鼠。高胆固醇对照小鼠注射PBS。(A)在 40周龄时，具有低血浆胆固醇的小鼠(即pI-pC处理的，n＝7)的损伤表 面面积没有进展并且与40周的高胆固醇对照(即PBS处理的，n＝6)显著 不同(*P＜0.005)。(B，C)一周的胆固醇低水平(30周龄的小鼠)没有影响 (B)损伤大小(P＝0.96)。显示损伤面积的相对变化的百分比。(C)泡沫细胞 (P＝0.52)、内皮细胞(P＝0.49)、平滑肌细胞(P＝0.18)(SMC)和T细胞(P＝0.34) 的数量。
图4.泡沫细胞形成的调节基因网络。使用siRNA靶向THP-1巨噬细 胞中的12个胆固醇响应动脉粥样硬化基因。转染后2天，siRNA靶向的 巨噬细胞和用非特异性siRNA处理的对照用AcLDL(50μg/mL)孵育48小 时；分离总RNA，并且确定CE和脂质的积累。(A)将来自12个siRNA 实验和四个混合对照的16个表达谱(HG-U133_Plus_2阵列，Affymetrix) 用于产生参与泡沫细胞形成的8个胆固醇响应基因的调节基因网络，包括 PPARa和CD36。(B)CE积累被8个基因中的5个的siRNA抑制降低，并 被2个其它基因的抑制增加；1个基因的抑制没有影响(另参见表2)。
图5.与冠状动脉和颈动脉狭窄有关以及与白细胞跨内皮迁移途径有 关的聚类(clusters)的Venn图。A.表7中的聚类代表的基因的Venn图。 7个基因发现于动脉粥样硬化的主动脉根/IMA聚类和纵隔脂肪聚类(Pc＜7 ×10-10)，17个在动脉粥样硬化的主动脉根/IMA聚类和颈动脉聚类(Pc＜1 ×10-30)并且16个在纵隔聚类和颈动脉聚类(Pc＜9×10-27)。发现6个基 因存在于所有这三种聚类(Pc＜7.15×10-23)中。所有三个聚类的并集为129 个基因。
发明详述
本发明是基于使用最新水平的聚类算法(cluster algorithms)对来自小 鼠和人的转录数据的系统生物处理，所述转录数据包含基因组中所有基因 的基因活性信息以及在发展动脉粥样硬化期间它们的活性谱。与其中以研 究的关注基因的初始选择为标准的本领域的标准技术形成对比，这一方法 允许本发明人对参与动脉粥样硬化的所有基因进行无偏见的研究。另外， 这一方法允许发明人将所有的人类基因以对动脉粥样硬化的重要性的顺 序分级。这一方法在以下给出的两个实施例中进一步解释。
在实施例1中，发明人已经表明，在动脉粥样硬化损伤的快速扩展前 降低血浆胆固醇防止动脉粥样硬化损伤的进一步扩大，并且已经鉴别介导 这一效应的基因(即靶)。发明人所用的生物信息方法学(即反向工程) 构建了胆固醇响应的动脉粥样硬化靶基因的基因网络。治疗性降低血浆胆 固醇(诸如通过施用他汀类药物)的有益影响至少部分是通过这一基因网 络的作用来介导的。因此，本发明涉及筛选影响这一血浆胆固醇调节的基 因网络的候选药物的方法，并涉及它如何防止或甚至退化动脉粥样硬化或 动脉粥样硬化相关疾病的发展和/或进展。作为该方法工作的确认，使用靶 向所述网络中的单个基因的siRNA分子调节所述基因的表达。已发现基因 表达的调节影响巨噬细胞中胆固醇酯的积累，这是一个对动脉粥样硬化进 展重要的过程。
在实施例2中，发明人使用多器官全基因组表达谱分析来鉴别与动脉 粥样硬化和其相关疾病有关的所有分子活性。使用鉴别在所有患者的四种 不同器官中具有相似表达模式的基因的聚类算法，发明人鉴别了总共60 个聚类。发现其中有3个与动脉粥样硬化的程度相关。这三个聚类一起代 表129种基因，其中大多数对白细胞向病态组织的跨内皮迁移起作用。当 在动脉壁和纵隔脂肪而不是在肝或骨骼肌中有活性时，这一过程与动脉粥 样硬化的程度有关。这些发现在患有颈动脉(至头部的动脉)动脉粥样硬 化的患者的确认组(validation cohort)中重复。发现129个基因中的122个具 有共同的调节子；LIM-结构域结合2(LDB2)。因此这一高级调节子参与调 节动脉粥样硬化和动脉粥样硬化相关疾病的严重性。LDB2中单核苷酸多 态rs 10939673的T次要等位基因被鉴别为在心肌梗塞的幸存者中未被充 分代表，并且相反与LDB2mRNA和冠状动脉粥样硬化相关。因此，这一 SNP可用作降低的冠状动脉粥样硬化风险的遗传标志物。
由于白细胞迁移是任何炎症反应的主要途径，因此作为这一过程的调 节子的LDB2的发现将具有作为除动脉粥样硬化以外还有其它炎症相关疾 病的标志物和/或治疗靶的含义。
本申请中公开的新型基因网络和高级调节子LDB2还提供鉴别动脉粥 样硬化或动脉粥样硬化相关疾病的诱因的或预测这些疾病的发展或结果 的遗传标志物的新的可能性。因此，本发明部分涉及通过对比具有动脉粥 样硬化或动脉粥样硬化相关疾病的患者与没有患所述疾病的受治疗者的 基因型来鉴别所述遗传标志物的方法。并且就LDB2而言，还为了除动脉 粥样硬化以外的其它炎症相关疾病。
本发明通过对表达谱的两个研究，一个在小鼠中并且一个在人中，来 进一步描述，其显示所鉴别的基因与动脉粥样硬化和动脉粥样硬化相关的 疾病之间的联系。这些研究用于阐释和证实本发明，而不应该被认为是限 制本发明的范围，本发明的范围是由所附的权利要求定义。当实践本发明 时，本领域技术人员可进一步使用以下领域的常规技术：药物化学、免疫 学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、转基因动物和重组DNA技术， 参见Sambrook等人.“Molecular cloning：A laboratory manual”(分子克隆： 实验室手册)，第3版2001；Ausubel等人.“Short protocols in molecular biology”(精编分子生物学实验指南)，第5版1995；“Methods in enzymology”(酶学方法)，Academic Press，Inc.；MacPherson、Hames和 Taylor(编)“PCR 2：Apractical approach”(PCR 2：实践方法)1995；Harlow 和Lane(编)“Antibodies，a laboratory manual”(抗体，实验室手册)1988； Freshney(编)“Culture of animal cells”(动物细胞培养)第4版2000；Hogan 等人.“Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual”(小鼠胚胎操 作：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，1994；或这些书的后续 版本所公开的内容。
实施例1
转录谱分析和遗传降低血浆胆固醇以鉴定胆固醇响应的动脉粥样硬 化靶基因
动脉粥样硬化进展的转录表型在很大程度上是未知的。我们以10周 的间隔在有动脉粥样硬化倾向(atherosclerosis-prone)的小鼠中执行损伤 发展的转录谱分析，所述小鼠具有人样高胆固醇血症和关闭肝脂蛋白产生 的遗传开关。我们显示开始动脉粥样硬化进展缓慢，在脂纹转化为斑块后 迅速扩大，并在晚期损伤形成后达到平稳状态。形成四个不同表达聚类的 1259个基因(其中329个先前与动脉粥样硬化相关)的活性表达这一发展。 遗传性降低具有早期损伤的小鼠的血浆胆固醇导致不同的转录响应，防止 迅速扩大和转化为斑块。鉴别了37个胆固醇响应基因(表4)，其中＞90％ 先前没有与动脉粥样硬化相关。在6个沉默干扰RNA介导的全部10个胆 固醇响应基因的抑制中，由THP-1巨噬细胞产生泡沫细胞也受到影响。因 此，通过仔细研究损伤进展的转录表型和当血浆胆固醇降低时的其预防， 可鉴别胆固醇响应的动脉粥样硬化靶基因。
动脉粥样硬化是终身的进行性疾病，它在50％的群体中变得临床显著， 导致心肌梗塞和中风以及最后的死亡。最近，降低血浆胆固醇的他汀类药 物疗法已经表现出防止或在一些情况下甚至退化动脉粥样硬化的发展。然 而，关于构成动脉粥样硬化损伤发展的基础的转录变化的全部内容却知之 甚少，并且几乎不了解关于血浆胆固醇降低对动脉壁基因表达的有益影响 的任何事情。现在，在人(6，7)和小鼠(8)基因组计划之后发展的全 基因组测定技术为阐释与复杂疾病(像动脉粥样硬化)相关的表达变化的 全部内容提供了可能性。我们研究了Ldlr-/-Apob100/100Mttpflox/floxMx1-Cre小 鼠模型(9)以调查损伤进展、基本的转录表型和血浆胆固醇降低的影响。 这些小鼠具有与家族性高胆固醇血症相似的血浆脂蛋白谱 (Ldlr-/-Apob100/100)并且含有关闭脂蛋白的肝合成的遗传开关 (Mttpflox/floxMx1-Cre)。
动脉粥样硬化进展
在第10、20、30、40、50和60周龄时检查小鼠。血浆胆固醇随时间 略有增加，但是甘油三酯和葡萄糖水平没有显著变化(表1)。在87只 Ldlr-/-Apob100/100Mttpflox/flox小鼠中评估损伤面积和形态学变化(图1)。在第 10周时，仅检测到少数的苏丹IV染色的斑点(n＝10，未显示)，但是在第 20周时，所有的小鼠中均检测到损伤。在第20周和30周之间，损伤大小 增加了～1.6％(P＝0.05)，并且在第30周和40周之间增加了～7.2％ (P＜0.0001)。在第20周时，主要的形态学特征是脂纹(具有扩散边界的 红色透明区域)；未检测到斑块。然而，在第30周时，所有的小鼠的主动 脉弓具有小斑块(具有明确边界的红色不透明区域)，其在第40周大幅扩 大。在第50周和60周，斑块生长受到限制。损伤随时间的发展通过油红 O染色和CD68抗原的荧光的变化来反映(未显示)。
动脉粥样硬化进展的转录表型
随后，我们鉴别了在动脉粥样硬化进展期间构成组织学变化基础的转 录变化。在小鼠基因组信息数据库(参见www.jax.org)的19,879个基因 中，6.3％在至少一次时间对比中被差异表达(FDR＜0.05，未修正P＜0.00008， n＝1259)，并且329个(27％)先前已经与动脉粥样硬化相关。在剩余的 73％中，根据GO分析，95％具有已知的生物学功能。在动脉粥样硬化中 具有明确作用的基因中，78％在至少一次时间对比中被差异表达(P＜0.05， n＝88/111)。
为了反映动脉粥样硬化进展期间的基因表达模式，我们对所述1259 个被差异表达的基因执行mRNA水平的聚类分析(cluster analysis)。产生 了4个不同的聚类(表3)。聚类1的基因(n＝293)在损伤的快速扩大期 间被活化(图1)，在全部60周内保持活化，并且具有先前与动脉粥样硬 化和动脉粥样硬化细胞类型相关的最高百分比的基因(表3)。在聚类1的 基因中，89％与炎症细胞相关，包括巨噬细胞标志物CD68，其增加了五倍； 在免疫组织化学方面，也鉴别到增加的CD68表达(未显示)。这些发现和 8个巨噬细胞标志物的相对数量的增加一起(图2)有力地表明聚类1的 表达模式反映损伤巨噬细胞的募集和活化。聚类2在第30周(n＝331)， 聚类4在第40周(n＝300)，基因活性达到峰值，并且在动脉粥样硬化进 展的后期被抑制。在这些聚类的基因中，73％先前没有与动脉粥样硬化或 动脉粥样硬化细胞类型相关。在20个转录因子TF中，17个失活并且只有 三个被活化。聚类2和4的功能注解表明其可能参与平滑肌细胞的增殖和 向损伤的迁移。聚类3(n＝339)是特别显示的。这些基因的mRNA水平 在第30周达到峰值，并且在第40周被抑制，这与动脉粥样硬化损伤的快 速扩大一致。此外，该聚类含有比聚类1少但比聚类2或4多的动脉粥样 硬化相关基因，并且主要由与羧基和脂质代谢相关的基因组成。该聚类的 19个TF中的13个在脂质和能量代谢中是已经确认的，例如过氧化物酶体 增殖物激活受体(peroxisome proliferator activator receptors，PPAR)、PPARa、 PPARd和PPARγ以及固醇调节元件结合因子2。凋亡和细胞死亡在聚类2 至4中是活性过程，但在聚类1中不是。这一发现与以下观点一致：在动 脉粥样硬化发展的所有阶段，细胞死亡和凋亡是连续的过程(10)。
泡沫细胞的转录表型
除了泡沫细胞(其在第20周和30周之间的数量是增加的(P＜0.001； 图2))之外，其他主要损伤细胞类型(即内皮细胞、平滑肌细胞和T细胞) 的相对量是随时间相对稳定的，如细胞类型特异性基因标志物的mRNA水 平所示。
免疫组织化学上证实了在第30周的缺乏脂质的巨噬细胞的募集，其 在第40周扩张并成为脂质富集的。
总之，基因表达数据表明缺乏脂质的巨噬细胞在损伤发展的早期逐渐 积累，在第30周达到临界质量(图2)，诱导炎症反应(表3，聚类1)， 增加泡沫细胞中脂质的积累(表3，聚类3)并引起迅速的损伤扩大(图1)。 泡沫细胞中的脂质积累维持到第40周(表3，聚类3)。炎症持续到后期 (表3，聚类1)。聚类2和4是与动脉粥样硬化的新相关(表3)。
LDL胆固醇降低对动脉粥样硬化进展的影响
随后，我们通过用聚肌胞苷酸(polyinosinic polycytodylic acid)(pI-pC) 处理以诱导主要在肝中的Cre转基因的Mx1-启动子，导致Mttp的重组 (Ldlr-/-Apob100/100MttpΔ/Δ)来遗传性降低30周龄的小鼠的血浆LDL胆固 醇；对照小鼠用盐水处理。我们选择第30周的时间点是因为它在动脉粥 样硬化损伤迅速扩大之前，并且因为所鉴别的动脉粥样硬化基因在损伤和 泡沫细胞中随时间的表达模式。Mttp重组后，血浆胆固醇水平被降低了超 过80％(从427到54±31mg/L，n＝4)，并且在这一水平保持10周直到处 死。处死时，这些小鼠的损伤大小没有增加并且显著少于具有高胆固醇的 40周龄的小鼠(图3A，P＜0.005)。因此，在第30周降低血浆胆固醇防止 在具有高血浆胆固醇水平的小鼠中所观察到的动脉粥样硬化损伤的迅速 扩大(～7.2％，P＜0.0001；表1和图1)。
胆固醇降低对动脉粥样硬化的转录表型的影响
为了鉴别由血浆胆固醇降低诱导的转录变化，我们再次在28周龄的 小鼠中重组了肝Mttp，但这次在实现胆固醇降低后仅1周(第30周)就 处死动物。在检查损伤中基因表达变化前，我们检查了影响损伤表达的其 他可能来源。首先，我们检查了损伤大小和四种主要细胞类型的相对数量 在pI-pC处理的具有降低的胆固醇的小鼠(Mttp重组的)和用盐水处理的 具有高胆固醇的对照(Mttp完整的)中是否不同。如细胞类型特异性基因 标志物的表达水平所示，损伤大小(图3B)或细胞类型的数量(图3C) 没有差异。这些观察通过油红O染色的损伤的组织学外观和损伤的CD68 表达的免疫组织化学分析来确认(未显示)。在动脉粥样硬化的动脉壁中 变化最显著的血浆胆固醇响应基因中的37个显示于表4。为了排除任何基 因表达变化是因为Mx-1Cre转基因的肝活化而不是胆固醇降低这一可能 性，我们繁殖了缺少位于Mttp启动子和外显子1的侧翼的lox P位点的小 鼠(Ldlr-/-Apob100/100Mttpwt/wt)，并且对从pI-pC处理的和PBS处理的小鼠 (每个n＝5)分离的损伤RNA执行转录谱分析。这一对比所鉴别的几个显 著变化的动脉壁基因中没有表4中的基因(数据未显示)。
基因沉默对从培养的THP-1巨噬细胞形成泡沫细胞的影响
因为几种原因，泡沫细胞形成显示出在第30周和40周之间的损伤的 快速扩大中起重要作用。首先，第30周的动脉壁中巨噬细胞的积累处在 损伤的快速扩大之前(图2)。第二，损伤聚类3含有对细胞内脂质代谢重 要的基因，它在第30周被短暂地活化。第三，在第30周，炎症和免疫响 应在损伤聚类1中活化。第四并且可能是最重要的，在炎症和泡沫细胞的 脂质体内稳态中具有已知作用的TF在第40周失活(PPAR和SREBP-2)。
从第30周至40周的损伤的迅速扩大主要由第30周出现的泡沫细胞 的脂质载入引起(表2中聚类1和3)。我们怀疑在第30周所鉴别的胆固 醇响应基因(表4)中的一些基因是这一过程的关键。为处理这一点，我 们选择了37个基因中的12个，它们先前已经与泡沫细胞形成相关或为已 知的巨噬细胞基因(参见“方法”)。在用AcLDL孵育的THP-1巨噬细胞 中用siRNA靶向这12个基因。来自所靶向的细胞的mRNA经受转录谱分 析(n＝15)，并且如所描述的来推知泡沫细胞形成的调节基因网络(11)(参 见“方法”)。
所靶向的基因中的8个属于共有调节基因网络(图4A)并且被siRNA 有效抑制(表2)。这些基因包括促进泡沫细胞形成的CD36和防止它的 PPARa。羟类固醇脱氢酶样2(HDSL2)上调PPARa并下调CD36。此外， 脊髓灰质炎病毒受体相关2(PVRL2)也调节CD36，增加其表达并且负调 节HSDL2，并且因此间接抑制PPARa活性。我们从这一调节网络中CD36 和PPARa的调节(图4A)预测抑制PVRL2将防止泡沫细胞形成，而抑制 HDSL2将促进它。为了测试这些预测和评估在网络中抑制单个基因的影 响，我们测量胆固醇酯(CE)和脂质积累(图4B和表2)。总的来说，CE 的测量结果确认了我们的预测并且显示几种其他网络基因也影响THP-1巨 噬细胞中CE的积累(图4B，表2)。
在这一研究中，我们鉴别了临界点，在它之前动脉粥样硬化缓慢发展 并且仅出现低水平的炎症。此后，损伤迅速扩大并且炎症显著增加。炎症 持续到后期，导致晚期斑块(advanced plaque)的形成，但是在10周的时间 内损伤大小短暂增加。迅速的损伤扩大主要由巨噬细胞中同样迅速的CE 积累引起。具有低含量脂质的巨噬细胞在动脉粥样硬化发展的早期积累， 达到启动脂质的迅速积累和炎症的临界密度。在这一临界点上降低血浆胆 固醇防止损伤的迅速扩大和晚期斑块的形成。胆固醇降低效应至少部分地 由37个胆固醇响应的动脉粥样硬化基因介导。通过siRNA靶向的用 AcLDL孵育的THP1巨噬细胞的转录谱分析确认了这些基因中的一些，显 露了泡沫细胞形成的调节基因网络。这一网络构架突出PVRL2和HSDL2 作为新的候选基因，它们可能是防止晚期斑块形成的未来疗法的良好的 靶。
理解动脉粥样硬化损伤的转录谱富有挑战性(2)。此类损伤含有几种 细胞类型，并且给定细胞类型的平均mRNA贡献随疾病的发展变化。因此， mRNA水平的变化代表细胞mRNA浓度实际变化和细胞类型混合物变化 的混合。此外，在给定的细胞类型内，处于增殖和分化(例如巨噬细胞分 化为泡沫细胞)的不同阶段的细胞也增加了这一问题。然而，损伤mRNA 浓度提供损伤中活化的生物过程和途径的概况。
损伤mRNA聚类(表3)的分析表明，首先巨噬细胞相对缓慢地浸润 动脉壁，导致脂纹的形成。然后，在显示为非常具体的时间点，这些细胞 被活化，导致大量的炎症活性，所述活性和巨噬细胞中CE迅速积累组合 产生晚期斑块。我们认为这种转化可与动脉壁中巨噬细胞的密度有关。在 给定的密度下，巨噬细胞不但刺激它们自身(自分泌)，还相互刺激(旁 分泌)，导致大量的炎症活性并增加脂质摄取(12)。如果该机制也存在于 人中，那么防止或延缓动脉粥样硬化发展的治疗时机可能非常重要。事实 上在小鼠中，晚期斑块的形成被在迅速损伤扩大前的遗传性降低阻止(图 3A)。
与损伤发展形成对比，不同细胞类型在损伤中的程度(extent)和相对 组成在亚急性降低血浆胆固醇前后是相似的(图3B，C)。因此，通过基 因芯片(GeneChip)监测的mRNA浓度的变化可能反映细胞mRNA水平的 实际变化。由于巨噬细胞中脂质的积累是迅速损伤扩大的中心过程，因此 通过siRNA在用AcLDL孵育的THP-1巨噬细胞中证实了37个胆固醇响 应基因中的12个。已发现八个基因属于共有调节基因网络，其中PVRL2 和HSDL2具有核心作用。关于PVRL2和HSDL2知之甚少(在PubMed 中分别产生6和3个匹配(hits))。PVRL2中的一个序列变体与多发性硬化 的严重性有关(13)。HSDL编码固醇载体蛋白2，一种体外增强膜之间的 脂质转移的小的细胞内碱性蛋白结构域(14)。如调节基因网络所示(图 4A)，所述调节网络中没有节点(即基因)单独促进或抑制泡沫细胞的形 成，这突出了推断基因网络以了解并评估候选基因在复杂疾病中真实复杂 性的重要性(11，15)。
我们的发现暗示用血浆胆固醇降低剂干预的时机是关键。具有发展动 脉粥样硬化的并发症(例如，中风和心肌梗塞)的风险的患者可从在生命 的极早期治疗受益。检测早期动脉粥样硬化的无创技术(noninvasive technology)在这方面是重要的。对于具有其他动脉粥样硬化风险因子的血 胆固醇正常(normocholesterolemic)的个体，介导血浆胆固醇降低的有益效 果的靶向动脉粥样硬化基因的新方案可能是有效的。
因此，本发明的一个方面是鉴别化合物作为用于防止后期动脉粥样硬 化损伤的发展的未来疗法的候选药物，所述化合物靶向这些胆固醇响应基 因。这一方面在所附的权利要求中进一步定义。
方法
小鼠模型
Ldlr-/-Apob100/100Mttpflox/floxMx1-Cre小鼠模型具有与家族性高胆固醇血 症相似的血浆脂蛋白谱，所述家族性高胆固醇血症引起动脉粥样硬化的迅 速发展(9)。为了Mttp删除，小鼠在6天的时间内每隔一天注射500μl 的pI-pC(1μg/μl；Sigma，St.Louis，MO)以诱导Cre表达，由此在 Ldlr-/-Apob100/100Mttpwt/wtMx1-Cre小鼠中重组或不重组Mttp(MttpΔ/Δ)。同 窝出生仔畜对照接受PBS(Mttpflox/flox)。研究小鼠与C57BL/6回交5次 (＜5％129/SvJae和＞95％C57BL/6)，圈养于无病原体屏障设备(12-小时 光/12-小时黑暗周期)，并用含有4％脂肪的啮齿动物饲料(rodent chow)喂 养。基因型通过用来自尾部活体标本(biopsy)的基因组DNA的聚合酶链 式反应(PCR)来确定。血浆胆固醇和甘油三酯浓度用比色测定(无限 (Infinity)胆固醇/甘油三酯试剂盒；Thermo Trace)确定，并且血浆葡萄糖 水平用Precision Xtra(MediScience，Cherry Hill，NJ)测定。
平面(En Face)分析和组织学
如所述地将主动脉平面固定于黑蜡表面(16)，用苏丹IV染色，用 Nikon SMZ1000显微镜拍照，并用Easy Image Analysis 2000软件(Tekno Optik，Skarholmen，Sweden)分析。损伤面积计算为主动脉根到髂动脉分 叉(iliac bifurcation)之间的全部主动脉表面的百分比。将主动脉根分离并 立即于在OCT化合物(Histolab，Sweden)中的液氮中 冷冻。如所述地切割冻干切片(20μm)并用苏木精和油红O染色(17)； 其他切片(6-8μm)首先用大鼠抗小鼠CD68抗体或对照抗体(Serotec) 在4℃下孵育过夜，然后用荧光抗大鼠IgG(Vector Laboratories，Burlingame， CA)孵育，并且用含有DAPI的封固剂(Vector Laboratories)复染。
转录谱分析
主动脉用RNAlater(Qiagen，Valencia，CA)灌注，并且移除从第三 个肋状突起(rib)向上到主动脉根的主动脉弓，并且用FastPrep(Qbiogene， Irvine，CA)匀浆。总RNA用使用DNAse I处理步骤的RNeasy小型试剂 盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen)来分离。RNA质量用生物分析仪2100 (Bioanalyzer 2100，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)评估。将高 质量的RNA样品(32个来自Mttpflox/flox，5个来自MttpΔ/Δ，并且9个来自 Mttpwt/wt小鼠)在第10(n＝7)、20(n＝5)、30(n＝6+5)(pI-pC)和9Mttpwt/wt (n＝5(PBS)+4(pI-pC))、40(n＝5)、50(n＝5)和60(n＝4)周用于总 基因表达测定，所述测定用cDNA阵列(小鼠基因组4302.0基因芯片， Affymetrix，Santa Clara，CA)进行。所有样品用生产商推荐的双循环规 程制备。阵列用GeneChip Scanner 3000扫描并用基因芯片操作软件 (GeneChip Operating Software，Affymetrix)分析。
文本挖掘(text mining)和现有动脉粥样硬化知识
使用PubMed的自动文本挖掘建立与动脉粥样硬化、泡沫细胞、平滑 肌细胞、内皮细胞和T细胞相关的基因的列表。简单地说，一个基因被认 为是相关的，如果它与PubMed中的文章的摘要中的任何以下术语同时出 现：动脉粥样硬化、动脉硬化(“动脉粥样硬化相关的”)、泡沫细胞、巨 噬细胞、单核细胞(“泡沫细胞相关的”)、平滑肌细胞、内皮细胞和T细 胞。这些匹配构成相当广泛但不具体的基因列表，并具有相当的重复，所 述基因在动脉粥样硬化或参与动脉粥样硬化的细胞类型(即可能含有假阳 性，但假阴性数量低)中可能起作用。我们还通过从已知对动脉粥样硬化 重要的最近的综述的基因中人工提取，制作了“确定的”动脉粥样硬化基 因的列表。
用乙酰化LDL孵育的THP-1巨噬细胞的siRNA
将人类单核细胞细胞系THP-1的单核细胞以6×105个细胞/孔(于含 有L谷氨酰胺(2mM)和HEPES缓冲液(25mM)(Gibco-Invitrogen， Carlsbad，CA)且补充了青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)(PEST) 的10％胎牛血清(FCS)-RPMI-1640培养基中)置于6孔培养盘(Falcon， Becton Dickinson Labware)中，并用佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)(50ng/mL)(Sigma)诱导72小时以分化为 巨噬细胞。对于每种基因，细胞用至多三种siRNA(Ambion，Austin，TX)， 根据生产商的说明书(Invitrogen)使用Lipofectamine 2000在不含FCS、 PEST和PMA的培养基中转染。转染2天后，siRNA靶向的巨噬细胞和模 拟物处理的对照(非特异性siRNA)用乙酰化LDL(AcLDL，50μg/mL) 在含有PEST的1％FCS培养基中孵育48小时。如所述地制备AcLDL(18)。 在4℃下，针对PBS透析样品。AcLDL蛋白浓度通过Bradford方法确定。 LDL通过顺序超速离心从健康的捐赠者的血浆分离(19)。
脂质、蛋白质和基因表达测定
为了脂质成像，源自THP-1的泡沫细胞用在PBS中的10％甲醛固定 10分钟，并用PBS洗涤2次。所述细胞用油红O(0.3％于60％异丙醇中) 染色20分钟，用60％异丙醇洗涤2次并用PBS洗涤2次，并用Nikon Eclipse E800显微镜在40×放大倍率下检测。脂质通过在室温下己烷/异丙醇(3∶2) 提取1小时，随后0.5ml氯仿提取15分钟来分离(20)。将脂质提取物干 燥并重新悬浮于80μl含有1％Triton-X-100(Sigma)的异丙醇。泡沫细胞 的脂质含量通过酶促分析，使用针对总胆固醇的无限试剂盒(Thermo Trace)和针对游离胆固醇的试剂盒(Wako Chemicals，Richmond，VA)来确 定。脂质提取后，蛋白质通过用0.5M的氢氧化钠在37℃下孵育5小时来 从相同的孔中提取。蛋白质浓度通过Bradford方法确定。
为了HG-U133_Plus_2阵列分析(Affymetrix)并且为了确定siRNA 的击倒(knockdown)程度，总RNA用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)从AcLDL 孵育的THP-1细胞中分离。RNA浓度用分光光度计(ND-100，NanoDrop Technologies，Wilmington，DE)确定。为了cDNA合成，0.5μg的总RNA 根据生产商的规程用Superscript II(Invitrogen)逆转录。5倍稀释后，根 据生产商的规程，通过实时PCR用1×TaqMan通用PCR核心试剂盒 (universal PCR master mix)(Applied Biosystems，Foster City，CA)在ABI Prism 7000(PE Biosystems)和软件上扩增cDNA(3μL)。使用含有相应 引物和探针的来自Applied Biosystems的Assay-On-Demand试剂盒，并且 将表达值针对酸性核糖体磷蛋白P0进行归一化。每个样品以两个重复进 行分析。
统计和计算
使用未配对t检验分析所选基因的mRNA水平的差异、小鼠血浆测量 值的差异和时间点之间的损伤表面面积的差异。基因表达的信号水平数据 用MAS 5.0(Affymetrix)使用默认设置来计算，进行对数转换 (log-transformed)并归一化为总强度(全局缩放(global scaling))。归一 化后，通过平均相应Affymetrix探针组合的信号，计算小鼠基因组信息数 据库(MGD基因，Jackson Laboratory，www.jax.org)中的每个基因的信 号强度。在数据库中没有配对的11,979个基因芯片探针组合(小鼠基因组 4302.0基因芯片，Affymetrix)中，1.5％被差异表达(错误发现率(FDR) ＜0.05，n＝177)，表示基因/探针组合的部分不会被考虑用于进一步的分析。 剩余的33,122个探针组合在19,879个MGD基因(总共32,095个)中有 至少一个配对。差异表达测试前，以逐对(pair-wise)方式应用Lowess归一 化(21)。为了在计算差异表达的概率和FDR时进行多重检验的校正，我 们使用经验Bayes统计(22)。使用Mathematica 5.1(Wolfram Research， Champaign，IL)中的FindCluster算法进行聚类。GO和途径分析用EASE 软件执行(23)。如所述地推断用AcLDL孵育的THP-1巨噬细胞的调节 基因网络(11)(见下文)。
胆固醇响应的动脉粥样硬化基因鉴别
胆固醇响应的动脉粥样硬化基因被认为是在小鼠的动脉粥样硬化主 动脉弓中被差异表达(FDR＜0.05)的那些基因，与注射PBS的对照相比， 所述小鼠肝中的Mttp重组(参见上文)已经通过腹膜内注射500μl pIpC (1μg/μl)诱导(参见表4，n＝37)。注射在具有两天间隔的四个顺序时 间点执行，它开始于第29周(week 29 weeks)的第一天，持续到第29周 的最后。如第30周处死时在血浆中所测，pIpC治疗在所有小鼠中实现80％ 或更多的血浆胆固醇降低。用盐水处理的对照小鼠的血浆胆固醇水平没有 影响。在第30周期间，单独留下小鼠以洗除注射的任何残留效应。在缺 少floxed Mttp(Ldlr-/-Apob100/100Mttpwt/wtMx1-Cre)的pIpC处理的对照小鼠 中，这37个基因中没有一个被鉴别出，因此，Mttp的重组的确没有发生， 血浆胆固醇也没有降低。用基因芯片阵列研究这些对照小鼠以排除所述血 浆胆固醇响应基因代替地是动脉粥样硬化损伤中pIpC诱导的基因的可能 性。
选择用于siRNA靶向的胆固醇响应基因
在37个鉴别的胆固醇响应基因中，27个具有预先确定的taqman和 siRNA测定(Invitrogen)。在表4中，这37个基因中的12个被标记为粗 体，表示先前已经报道它们是由THP-1巨噬细胞表达。这些基因由沉默干 扰RNA靶向。CD36作为阳性对照1并且PPAR-a作为阴性对照2包含在 这些基因之中。
调节网络鉴别
表达数据(Affymetrix Hu 130，2.0+)从12个siRNA实验(对所有实 验＞58％抑制，另参见表4，标记粗体的基因)和用非特异性siRNA(模拟 物)处理的4组对照中产生。在已经由PMA活化，用siRNA或模拟物处 理然后用乙酰化LDL孵育48小时的细胞培养物中，从所靶向的和对照的 THP-1巨噬细胞中分离总RNA(也参见上文)。三个转录物GPR120、GPR81 和SOX6低于基因芯片的检测极限，表明这些基因在这一泡沫细胞形成的 实验模型中没有充分活化以被检测或是失活的。将剩余的基因组织成9×9 的数据矩阵。每个基因的表达数据通过除以对照的平均表达水平，随后进 行对数转换来归一化。如前所述，将线性基因调节模型
与数据拟合(11)。其中x指表达数据向量，W是网络邻接矩阵，并且p 是干扰向量。在每个击倒实验中，对于干扰基因p的元素(element)是-1， 对于所有其他基因是0。应注意，由于进行了对数转换，这相当于实际表 达水平的乘法模型(multiplicative model)。该算法通过单一参数d控制精确 度和召回率(recall)之间的权衡。在我们的实验中，我们选择d＝0.2。在模拟 中，我们发现这一值对应约60％的精确度和80％的召回率。应注意，基因 之间的相互作用(即指向刺激或抑制效应的边缘)不暗示直接的生物相互 作用，而在大多数情况下暗示间接的生物相互作用(例如由蛋白质、代谢 物或甚至中间体基因(intermediate gene)(具有低表达水平，诸如转录因子) 介导)。
实施例2
多器官基因表达谱分析显示冠心病中新的候选基因
在这一实施例中，我们在Stockholm动脉粥样硬化基因表达(STAGE) 研究中的具有冠心病(CAD)的患者中执行多器官基因表达谱分析。
方法
在STAGE研究中，在冠状动脉旁路移植术期间，使用Affymetrix HG-U133基因芯片从动脉粥样硬化的和未被影响的动脉壁(n＝40×2)中 以及从肝、骨骼肌和纵隔脂肪(n＝66×3)中获得278个转录谱。还分析 了确认组(25例颈动脉狭窄患者)。mRNA水平的聚类通过偶联双向聚类 来鉴别。
患者和活体标本收集
为了探究新的CAD和动脉粥样硬化的表达表型，STAGE研究包含了 124例因为CABG(＝2次移植)而入住Karolinska大学医院，Solna的患 者。征募42例在Stockholm医院进行颈动脉手术的患者作为确认组。 淘汰标准是其他严重的疾病(例如癌症、肾病和慢性全身性炎症疾病)。 该研究由Karolinska大学医院的道德委员会，Solna批准。所有的患者提供 了知情同意。遗传确认在具有＜60岁的匹配对照的387例MI幸存者中执 行(39)以及在具有Stockholm心脏流行病学计划(SHEEP)的匹配对照 的1091例MI幸存者中执行(24)。
四名外科医生执行CABG，两名执行颈动脉手术。麻醉为标准化的； 收缩压保持在＜150mmHg。在CABG患者中，活体标本从乳房内动脉 (IMA)、主动脉根、肝、骨骼肌和纵隔脂肪获得，保存于RNAlater(Qiagen) 中并在-80℃下冷冻。主动脉根样品中存在动脉粥样硬化损伤(25，26)和 IMA中不存在损伤(27)通过肉眼检查和显微镜检查确认(未显示)。颈 动脉斑块从动脉壁分离，粉碎，用不含核糖核酸酶的水洗涤，嵌入OCT 培养基(Tissue-Tek，Histolab Products)，在液态异戊烷和干冰下冷冻，并 在-80℃下储存。
随访和实验室测量
完成了对124例CABG患者中的114例以及42例颈动脉狭窄患者中 的39例的3个月的随访。使用标准问卷，研究护士获得了病史和生活方 式因素的信息(例如吸烟、饮酒和体力活动)。进行身体检查，并将静脉 血样品抽入预先冷却的含有NaEDTA的无菌管(Vacutainer，Becton Dickinson)中并置于冰上。如所述的，在30分钟内通过离心回收血浆(2.750 g，20分钟，4℃)以分析胆固醇、甘油三酯和脂蛋白(28)。血糖通过葡 萄糖氧化酶方法(Kodak Ektachem)测量，并且胰岛素和胰岛素原通过酶 联免疫吸附测定(Dako Diagnostics)测量。
RNA分离和表达谱分析
总RNA用Trizol(BRL-Life Technologies)和FastPrep(MP Biomedicals)分离，用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)纯化，并且用RNase-Free DNase Set(Qiagen)处理。样品质量用安捷伦生物分析仪2100(Agilent Bioanalyzer 2100)评估。与HG-U133Plus_2阵列(Affymetrix)杂交前， 用分光光度计(ND-1000，NanoDrop Technologies)评估cRNA收率。阵 列用Fluidics Station 450处理，用GeneArray Scanner 3000扫描，并用基因 芯片操作软件2.0分析。对40例患者的所有五种活体标本、来自STAGE 研究的另外26例患者的三种代谢活体标本以及来自25例随机选择的颈动 脉狭窄患者的颈动脉损伤执行表达谱分析。
冠状和颈动脉粥样硬化测量
所有CABG患者经受手术前双平面冠状血管造影术(Judkins技术)。 血管造影片用定量冠状血管造影术(QCA)技术(Medis)评估。将左右冠状动 脉和它们的分支分为几个部分(29)。每个部分在舒张末期期间测量，并 且将斑块面积确定为占该部分的总面积的百分比。一些患者具有右冠状动 脉阻塞，这阻止了QCA评估。冠状动脉狭窄分数从冠状动脉中所有动脉 粥样硬化损伤来计算(腔的20％-50％和＞50％的阻塞分别为1分和2分)。
外科手术前，颈动脉用B型超声检测。使用颈总动脉的远壁(far wall) 从动脉内膜切除术(endoarterectomy)侧测量内膜中层厚度(IMT)(30)。
基因分型
用Qiagen血液和细胞培养DNA试剂盒从血液中提取DNA。基因分型 用TaqMan SNP基因分型测定(Applied Biosystems)执行。在LIM结构域 结合2(LDB2)基因(dbSNP：rs872478、rs1501127、rs10939673、rs2658509 和rs7671482)中选择了五种单核苷酸多态(SNP)，根据SNPbrowser Software 3.5(Applied Biosystems)，所述单核苷酸多态平均分布于不同的 连锁不平衡(LD)区。
0.5μg的总RNA根据生产商的规程用Superscript II(Invitrogen)逆转 录。5倍稀释后，根据生产商的规程，通过实时PCR用1×TaqMan通用 PCR核心试剂盒(Applied Biosystems)在ABI Prism 7000(PE Biosystems) 和软件上扩增cDNA(3μL)。使用含有相应引物和探针的来自Applied Biosystem的Assay On-Demand试剂盒。将mRNA水平对36B4进行归一 化。每个样品以两个重复进行分析。
计算和统计分析
临床和代谢特征提供为平均值±SD的连续变量以及受治疗者数量和百 分比的分类变量。P值用非配对t检验计算；将偏态值(skewed value)进 行对数转换。对于SNP分析，使用ANOVA、卡方和逻辑回归(Stat View 5.0.1)。基因表达值用分位数归一化和稳健多芯片平均(Robust Multichip Average)预处理(31)(另参见“补充方法”)。604,258个完全配对的 Affymetrix探针信号中，423,636个可绘制成参考序列(refseq)转录物(32)， 产生15,042个参考序列转录物。基因表达数据通过偶联双向方法聚类(33， 34)。首先，基因聚类用超级顺磁聚类算法来鉴别(33)。第二，对于每个 基因聚类，患者通过分级聚类来分组(35)(参见“补充方法”)。聚类用 树形图(TreeView)来显示(35)。如所述地计算差异表达的概率和错误发现 率(22)。基因本体论(Gene Ontology，GO)和途径分析用DAVID软件 (56)执行，并且所有的计算用Mathematica 5.1执行。使用文本挖掘定义 先前与CAD和动脉粥样硬化相关的转录物(参见“补充方法”)。对于启 动子分析，使用TRANSFAC(36)。
补充方法
活体标本采集
STAGE研究所包含的114例患者经受分离的选择性冠状动脉旁路移植 术(CABG)。手术期间获得5个组织样品。0.5g骨骼肌取自接近切口的顶 腹直肌(apical rectus abdominis muscle)的内侧缘，并且约1g的纵隔脂肪 取自位于心包和大血管前的组织。乳房内动脉从左胸壁的内部分离，并且 切下1em的远端部分。全厚度主动脉壁样品从穿孔获得，所述穿孔用于在 手术期间在主动脉根处产生近侧静脉移植物吻合。约0.05g肝组织(直径 3mm)在手术末期取自左肝叶的极下缘。当在剑突下仅几厘米处打开腹膜 后，肝的这一部分是容易接近的。在移走活体标本后缝合该极小切口，并 且将腹膜再次闭合。所有组织样品获取没有使用烧灼术且没有并发症。将 它们在10秒钟内立即放入RNAlater(Qiagen)溶液，并且在-80℃冷冻直 到进一步处理。
聚类分析
来自每个组织的基因表达数据以Getz等人启发的偶联双向方式聚类 (34)。该程序的第一步包括使用由Tetko等人实施的超级顺磁聚类(SPC) 算法聚类基因(33)。该算法允许基因表现为多个聚类。基因表达谱之间 的相似性用Spearman等级相关来测量。我们鉴别在0.015温度间隔内稳定 的聚类，并移除重叠的聚类，如果它们超过60％同一性，并且排除具有超 过1000个成员的聚类。基于单个基因聚类，我们使用分级(聚合)聚类 用Mathematica中的平均连锁将患者分为2个聚类。使用Manhattan距离 测量2例患者表达谱之间的相似性。小的患者聚类(3例患者或更少)被 认为是异常值并因此移除，将剩余的患者重新聚类。为了具体化，患者用 Eisen等人的聚类中的分级聚类来重新聚类(35)。这产生了与我们的聚合 算法聚类完全相同的用树形图具体化(35)的聚类树。
定义先前与CAD相关的转录物
使用PubMed的自动化文本挖掘建立先前与CAD和动脉粥样硬化相 关的基因的广泛列表。简单地说，一个基因被认为是相关的，如果它与 PubMed上的发表文章的摘要中的任何以下术语同时出现：冠心病、动脉 粥样硬化和动脉硬化。其他2个列表使用胆固醇或糖尿病作为搜索术语 人工生成。由于一些明确的动脉粥样硬化基因未被捕捉，所以从最近CAD 和动脉粥样硬化的综述中人工提取了一些基因。CAD相关的基因的列表包 含2832个基因。
启动子分析
启动子序列来自Ensembl v.43，从Biomart(http://www.biomart.org/) 下载。鉴别了具有LIM结构域(37)或已知与LDB2相互作用(38)的转 录因子(TF)。我们在TRANSFAC v 10.4(36)上从这组Tf中搜索已知的 转录因子结合位点(TFBS)。这些Tf中的7个具有总计171个已知的TFBS。 我们使用程序PATCH(36)并在启动子序列中搜索这171个基序以至少 6bp配对且没有错配的位置。
遗传确认组
SCARF
Stockholm冠状动脉粥样硬化风险因子(SCARF)研究是病例-对照研 究，其被设计以形成遗传和生物化学因子早发MI研究的基础。包括总计 387例年龄小于60岁的首次MI的幸存者，他们已经入住Stockholm北部 三家医院(Danderyd医院、Karolinska大学医院Solna和医院) 的冠心病监护病房。简单地说，登记了满足选择标准的随意挑选的患者， 并且淘汰标准为：1型糖尿病、肾功能不全(定义为血浆肌酐＞200μmol/L)、 任何慢性炎症疾病、药物成瘾、精神病或无力遵从规程。对于每位心肌梗 塞后的患者，从一般人群中征募性别和年龄匹配的对照者(响应率79％)。 在所述索引心血管事件(index cardiac event)后三个月，患者和对照经受 体检，并且过夜禁食后取得血液样品。背景资料(例如社会环境、生活方 式、病史和药物治疗)通过结构性访谈的形式收集。种族划分根据自我报 道的回溯远至3代的起源来记录，并且超过99％的本研究参加者被认为是 白种人。另参见表9。
Stockholm心脏流行病学计划(SHEEP)研究是大型的基于人群的病 例-对照研究，其目标为研究诱发MI的遗传、生物化学和环境因子。潜在 的研究参与者(年龄范围45-70岁)是生活在Stockholm郡的先前没有临 床诊断为MI的所有瑞典居民。男性病例征募于1992-1994年之间，并且 女性病例于1992-1994年之间。Mi诊断的标准是根据由瑞典心脏病学会于 1991年提出的指导原则，并且包括：(1)典型症状；(2)血清肌酸激酶(S-CK) 和乳酸脱氢酶(LDH)的显著升高以及(3)特有的心电图变化。如果满 足2个或3个标准，则患者被诊断为MI。每名病例的5名对照候选者在病 例事件的2天内取样，以便能够代替潜在的无响应者。对于每位心肌梗塞 后患者，在符合年龄、性别和集水区域(catchment area)后，在病例事件 2天内征募随机选择的健康个体。由于来自一些初始对照的延迟响应，偶 尔地会同时包括初始和可选对照。在患者的所述索引心血管事件后近三个 月，收集血液样品，并且所有的参与者经受体检。另参见表10。
结果
患者特征
所述114例STAGE患者为典型CAD组(表5)。重要地，他们的特征 没有显著不同于从中获取代谢基因表达谱的66例STAGE患者的特征，所 述114例STAGE患者转而也没有不同于从中获取全部5个表达谱的40例 STAGE患者。从中获取基因表达谱的颈动脉狭窄患者(n＝25)的基本特征 也显示于表5中。
与冠状动脉粥样硬化的程度相关的基因表达
为了定义与动脉粥样硬化相关的基因聚类，我们使用偶联双向聚类分 析(补充方法)，分析来自动脉粥样硬化主动脉根与未受影响的IMA的 15,042参考序列转录物(方法)的mRNA比例。在14个基因聚类(表7) 中，一个基因聚类(n＝49个基因)将患者聚类成冠状动脉狭窄程度不同 (P＝0.008)的2组。从肝和骨骼肌鉴别的基因聚类(分别为15和11聚类； 表7)与冠状动脉狭窄不相关。相反，纵隔脂肪基因表达谱的双向聚类产 生了20个基因聚类(表7)；一个基因聚类(n＝59)将患者聚类成冠状动 脉狭窄程度不同(P＝0.00015)的2组。7个基因出现在两个动脉粥样硬化 相关的聚类中(偶然出现的可能性(Pc)＜7×10-10)，表明了在纵隔脂肪和 动脉粥样硬化主动脉根中的共同的动脉粥样硬化相关基因活性。
与颈动脉粥样硬化的程度相关的基因表达
为了确认在STAGE组中鉴别的动脉粥样硬化相关的基因，我们分析 一组经受颈动脉外科手术的颈动脉狭窄患者(表5)。偶联双向聚类来自 25个颈动脉斑块的表达谱产生11个基因聚类(表7)，其中一个(n＝55) 将患者聚类成IMT分数不同(P＝0.038)的2组。明显地，所述55个基因 中的16个与纵隔脂肪聚类基因重叠(Pc＜9×10-27)，并且17个与主动脉根 /IMA聚类基因重叠(Pc＜1×10-30)。6个转录物(C型凝集素结构域家族 14、钙黏着蛋白5、染色体20开放阅读框160、内皮分化鞘脂G蛋白偶联 受体-1、G蛋白偶联受体-116和LDB2)在所有三个聚类中(Pc＜7.15×10-23)， 并且总计有129个基因(表8)。
基因本体论和KEGG途径分析
3种鉴别的聚类(与来自两个患者组的3个单独的组织中动脉粥样硬 化的程度相关，图5)之间的高度显著的重叠表明这3个聚类包含了对动 脉粥样硬化发展重要的生物活性。为了了解更多关于这些聚类中的基因 (n＝129，表8)，我们执行了GO和KEGG途径分析。89个在GO分类生 物过程中具有匹配，100个在分子功能中具有匹配，并且93个在细胞区 室中具有匹配。最高分在生物过程中是细胞通讯(n＝40，P＜1.410-5)、 信号转导(n＝37，P＝3.7×10-5)和细胞黏着(n＝13，P＜6.5×10-4)；在分子 功能中是鸟苷酸交换因子活性(n＝7，P＜8.7×10-5)、GTP酶调节活性(n＝9， P＜2.5×10-4)和信号转导活性(n＝34，P＝3.1×10-4)；并且在细胞区室中 是膜(n＝64，P＜1.310-7)和质膜(n＝31，P＜4.8×10-7)。在129个基因中 (表8)；31个基因先前已经与动脉粥样硬化相关，40个没有生物过程注 释并且7个参与调节活性(转录因子(TF)和它们的辅因子)。在38个有 KEGG途径的注释的基因中，16个与跨内皮迁移途径有关，其中8个具有 精确的匹配(n＝8，P＜7.7×10-7)。
启动子分析和遗传确认
在重复代表的具有与冠状和颈动脉粥样硬化程度相关的较高mRNA 水平的6个基因中(所有三个聚类的交叉；图5)，LDB2作为唯一的转录 调节子脱颖而出。为了探究LDB2可能参与调节其他128个基因(除LDB2 以外的所有三个聚类的联合，图5)中的一些基因的可能性，我们在 TRANSFAC中对在这些基因中的122个基因中发现的161个启动子执行计 算机芯片(in silico)序列匹配。首先，我们鉴别了7个TF，这些TF具有在 TRANSFAC(v10.4)中已知的结合位点基序和LIM结合结构域或已知与 LDB2相互作用的其他结构域(ISL-1α、Lmo2、Lhx3a、Lhx3b、LHX2、 LHX4和BRCA1)。我们发现在这129个基因中的122个(94％)中发现 的161个启动子(靶启动子)的81％具有至少一个这种结合位点。涉及相 对于转录起始位点的10255个人启动子覆盖[-600，-1]区的背景，结合靶启 动子显著增加1.2至5倍。
聚类和计算机芯片上的启动子分析表明LDB2可能与涉及动脉粥样硬 化严重性的129个基因中的一些基因的体内调节有关。如果是这样，影响 LDB2表达的功能多态应该也影响动脉粥样硬化的发展。为了检验这一假 设，我们在遗传学上确认了387名MI幸存者和匹配对照中(39)，以及1091 名MI幸存者和来自SHEEP的对照中的LDB2基因(24)。首先，我们鉴 别了根据LD区在LDB2中均匀分布的5个SNP，然后寻找与STAGE组 中的基因表达的关联。SNP rs 10939673的次要T等位基因的载体倾向于在 主动脉根/IMA(P00.004)和纵隔脂肪(P＝0.001)中具有较低的LDB2mRNA 水平(通过实时PCR评估)。此外，如通过冠状动脉狭窄分数(P＝0.012， n＝375)和斑块面积百分比(P＝0.029)判断的，T等位基因载体在MI幸 存者中明显未被充分代表(P＝0.014(n＝375)，0.03(n＝917)和0.005(n＝1304， 组合)，表6A-C)，并且具有较少的动脉粥样硬化(表6D)。
结果总结
在所有组织类型中鉴别的60个聚类中，2个与冠状动脉狭窄的程度有 关：一个在主动脉损伤(n＝49个基因)中并且一个在纵隔脂肪中(n＝59)。 明显地，在颈动脉狭窄的患者的确认组中，也在与动脉粥样硬化程度相关 的聚类(n＝55)中鉴别了这些基因中的27个。功能分析将白细胞的跨内 皮迁移鉴别为动脉粥样硬化严重性和LIM-结构域结合2(LDB2)的共同 特征，因为7个基因中的一个涉及转录调节。计算机芯片上的启动子分析 表明LDB2可间接调节大部分鉴别的基因。在387位具有匹配对照的心肌 梗塞幸存者中，LDB2中的SNP rs10939673的稀少T等位基因在幸存者中 未被充分代表，并且相反地与冠状动脉粥样硬化相关。
讨论
不同于候选基因或途径方法，全基因组方法，诸如全基因表达分析相 对于所研究的生物或病理学系统的现有知识更加公正。因此，全基因组分 析可迅速增加我们对复杂生物问题的分子机制和共有调节子的理解。在 STAGE研究中，在每位患者中分析了5个CAD相关的器官中的15,042个 参考序列信号值，以反映对冠状动脉粥样硬化的发展重要的基因活性。动 脉粥样硬化主动脉壁和纵隔内脏脂肪中的101个转录物与冠状动脉粥样硬 化的程度有关，而在肝和骨骼肌中的基因活性聚类是无关的。明显地，在 25例颈动脉狭窄患者的确认组中，还发现101个转录物中的27个属于与 动脉粥样硬化程度相关的唯一的基因活性聚类。
生物信息评估表明所鉴别的基因中的仅31个先前与动脉粥样硬化相 关，40个没有生物过程注释并且16个与跨内皮白细胞迁移途径相关。根 据计算机芯片序列启动子分析，与转录调节相关的7个转录物中，一个 (LDB2)可潜在调节多达81％的所鉴别的转录物。在两组具有基于人群 的对照的MI幸存者中的LDB2遗传确认表明SNP rs 10939673的次要T等 位基因较少地与冠状动脉狭窄相关，并且在MI幸存者中具有明显较少的 普遍性。
这些结果表明(1)纵隔中的内脏脂肪充当影响冠状动脉粥样硬化的 炎症的局部来源；(2)增加的白细胞跨内皮迁移与增加的动脉粥样硬化严 重性相关；(3)LDB2是参与CAD发展的高级调节子；(4)LDB2的拮抗 物值得作为动脉粥样硬化的疗法来测试；并且(5)LDB2中的SNP rs 10939673可用于鉴别CAD/MI风险。
白细胞的跨内皮迁移是动脉粥样硬化发展的明确途径。单核细胞的跨 内皮迁移对泡沫细胞形成和启动动脉粥样硬化斑块发展是重要的(40，41) 并且T细胞的跨内皮迁移被认为是动脉粥样硬化后期的中心过程(42)。 事实上，跨内皮白细胞迁移已经被认为是动脉粥样硬化治疗的可能靶。我 们的KEGG途径分析表明增加的白细胞的跨内皮迁移可能是具有更加严 重的动脉粥样硬化患者的共同特征。此外，所鉴别的基因中的一些没有注 释的基因可能在这一途径或其调节中起作用。另外，我们的数据表明这一 途径直接参与斑块的形成并且也通过增加纵隔脂肪的炎症状态间接地参 与斑块的形成。
在肝或骨骼肌中没有鉴别到与冠状动脉狭窄的程度相关的基因聚类。 当考虑这些器官对明确的CAD风险因子，诸如血浆胆固醇和葡萄糖水平 (即糖尿病)的重要性，这是令人惊讶的。这些发现可反映基因表达通过 对这些风险因子的治疗而正常化。纵隔脂肪(或任何内脏脂肪)与血液中 明确的CAD风险因子的关系并不清楚。然而，增加的腰臀比例-腹部内 脏脂肪质量增加的指示-是CAD最有力的预告者之一。纵隔脂肪令人关 注的方面是其解剖位置并且最近的数据表明内脏脂肪作为炎症介质的来 源的作用(43)。尽管我们的研究没有表明纵隔脂肪可如何引起动脉粥样 硬化，但炎症介质的局部来源可增加动脉粥样硬化进展的速率(44)。
编码LIM结构域结合因子(诸如LDB2)的基因最初是在筛选与核蛋 白的LIM结构域物理上相互作用的蛋白质中分离的。这些蛋白质结合多种 TF并且可能起增强子的作用，将不同的转录因子结合到一起以形成高阶活 化复合体(higher-order activation complex)(45，46)。在我们筛选LDB2 相关的TF中，鉴别了ISL-1α、Lmo2、Lhx3a、Lhx3b、Lhx2、Lhx4和BRCA1。 ISL-1α增强HNF4活性，因此增强胰岛素信令(signalling)(47，48)。Lmo2 参与血管发生(49，50)。Lhx3和Lhx4调节垂体特异性细胞谱系的增殖和 分化(51)并且在淋巴细胞的亚型(52)和胸腺细胞肿瘤细胞系(53)中 表达。BRCA1与自发和LPS诱导的TNF-α的产生的选择性缺陷有关，并 与自发和LPS诱导的TNF-α诱导的外周血单核细胞上(54)细胞间黏着分 子1的表达的产生的选择性缺陷及控制T淋巴细胞生命周期(55)中的选 择性缺陷相关。直到本研究为止，LDB2都未与CAD或动脉粥样硬化相关。 其高等级的调节作用和参与不同生物过程使之成为复杂疾病的进一步评 估所关注的靶。
总之，几种CAD相关器官的分子谱分析反映由纵隔脂肪分享并在颈 动脉损伤中复制的独特分子动脉粥样硬化表型。该表型包括白细胞的跨内 皮迁移和作为包含动脉粥样硬化保护性(atheroprotective)稀少SNP等位 基因的高级调节子的TF辅因子LDB2。
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表1.代表性Ldlr-/-Apob100/100Mttpflox/floxMx1-Cre小鼠的血浆胆固醇、甘 油三酯和葡萄糖的浓度
值为平均值±SD。时间点之间没有统计显著的差异(P＞0.05)。
表2siRNA靶向的胆固醇响应基因
aP值表示与lipofectamine转染的平行对照(n＝6)相比，所靶向基因 (n＝6)的泡沫细胞中的CE含量。CE表示胆固醇酯；ORO，油红O；nd， 无差异；ns，不显著
表3
动脉粥样硬化 相关 巨噬细胞相关 内皮细胞 相关 平滑肌细胞 相关 T-细胞相 关 新型 聚类1 36％ 44％ 36％ 25％ 40％ 39％ 聚类2 22％ 14％ 15％ 11％ 18％ 66％ 聚类3 27％ 22％ 23％ 17％ 26％ 60％ 聚类4 20％ 15％ 14％ 12％ 16％ 69％ 总计 27％ 24％ 22％％ 16％ 25％ 59％
表430周龄的小鼠的动脉粥样硬化壁中的胆固醇响应基因
表5STAGE研究中患者的基础特征
P值使用非配对t检验比较STAGE中的亚组和整个STAGE组(N＝114)来计算.
*P值＜0.05；**P值＜0.01
￥斑块面积是对左冠状动脉的7个部分的总结。
圆括号中的数字表示整个亚组的％.
表6MI病例和匹配对照两个组中rs10939673的关联分析
MAF表示次要等位基因频率；MI，心肌梗塞
斑块面积是对所有部分的总结
表7
与所有组织中狭窄分数或IMT相关的偶联双向基因聚类
表8
主动脉-IMA、纵隔脂肪和颈动脉损伤中三个所鉴别的聚类的联合中的 129个基因
参考序列 基因符号 基因名称 NM_000054 AVPR2 精氨酸加压素受体2(肾原性尿崩症) NM_000148 FUT1 岩藻糖基转移酶1(半乳糖苷2-α-L-岩藻糖基转移酶，H血型) NM_000334 SCN4A 钠通道，电压门控，类型IV，α NM_000355 TCN2 钴胺传递蛋白II；巨红细胞性贫血 NM_000442 PECAM1 血小板/内皮细胞黏着分子(CD31抗原) NM_000459 TEK TEK酪氨酸激酶，内皮(静脉畸形，多皮的和黏膜的) NM_000552 VWF von Willebrand因子 NM_000609 CXCL12 趋化因子(C-X-C基序)配体12(基质细胞衍生因子1) NM_000681 ADRA2A 肾上腺素能，α-2A-，受体 NM_000717 CA4 碳酸酐酶IV NM_001010846 SHE 含Src同源性2结构域E NM_001046 SLC12A2 溶质载体蛋白家族12(钠/钾/氯转运蛋白)，成员2 NM_001084 PLOD3 原胶原-赖氨酸，2-酮戊二酸5-双加氧酶3 NM_001289 CLIC2 氯细胞内通道2 NM_001290 LDB2 LIM结构域结合2 NM_001312 CRIP2 半胱氨酸富集蛋白2 NM_001400 EDG1 内皮分化，鞘脂G蛋白偶联受体，1 NM_001552 IGFBP4 胰岛素样生长因子结合蛋白4 NM_001718 BMP6 骨形态发生蛋白6 NM_001795 CDH5 钙黏着蛋白5，类型2，VE-钙黏着蛋白(血管上皮) NM_001882 CRHBP 促肾上腺皮质素释放激素结合蛋白
NM_001889 CRYZ 晶体蛋白，ζ(醌还原酶) NM_002017 FLI1 Friend白血病病毒整合子1 NM_002060 GJA4 间隙连接蛋白，α4，37KDa(连接蛋白37) NM_002073 GNAZ 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，αz多肽 NM_002253 KDR 激酶插入结构域受体(类型I I I受体酪氨酸激酶) NM_002290 LAMA4 层粘连蛋白，α4 NM_002343 LTF 乳运铁蛋白 NM_002599 PDE2A 磷酸二酯酶2A，cGMP-刺激 NM_002661 PLCG2 磷脂酶C，γ2(磷脂酰肌醇特异性) NM_002837 PTPRB 蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型，B NM_002856 PVRL2 脊髓灰质炎病毒受体相关2(疱疹病毒侵入介质B) NM_003265 TLR3 Toll样受体3 NM_003277 CLDN5 密蛋白5(心瓣面综合征中删除的跨膜蛋白) NM_003810 TNFSF10 肿瘤坏死因子(配体)超家族，成员10 NM_004444 EPHB4 EPH受体B4 NM_004510 SP110 sp110核体蛋白 NM_004557 NOTCH4 Notch同系物4(果蝇) NM_004955 SLC29A1 溶质载体蛋白家族29(核苷转运蛋白)，成员1 NM_005161 AGTRL1 血管紧张素II受体样1 NM_005424 TIE1 具有免疫球蛋白样和ECF样结构域的酪氨酸激酶1 NM_005512 LRRC32 含富含亮氨酸重复序列32 NM_005693 NR1H3 核受体亚家族1，组H，成员3 NM_005723 TSPAN5 四旋蛋白(tetraspanin)5 NM_005795 CALCRL 降钙素受体样 NM_005797 EVA1 上皮V样抗原1 NM_005856 RAMP3 受体(降钙素)活性修饰蛋白3 NM_006105 RAPGEF3 Rap鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)3 NM_006255 PRKCH 蛋白激酶C，η
NM_006334 OLFM1 嗅介蛋白1 NM_006435 IFITM2 干扰素诱导跨膜蛋白2(1-8D) NM_007023 RAPGEF4 Rap鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)4 NM_007177 FAM107A 具有序列相似性的家族107，成员A NM_012072 CIQR1 补体成分1，q亚成分，受体1 NM_012307 EPB41L3 红细胞膜蛋白带4.1样3 NM_013355 PKN3 蛋白激酶N3 NM_014220 TM4SF1 跨膜4L六家族成员1 NM_014421 DKK2 dickkopf同系物2(爪蟾) NM_014550 CARD10 胱天蛋白酶募集域家族，成员10 NM_014725 STARD8 含START结构域8 NM_014839 LPPR4 可塑性相关基因1 NM_015234 GPR116 G蛋白偶联受体116 NM_015460 MYRIP 肌球蛋白VIIA和R ab相互作用蛋白 NM_015568 PPP1R16B 蛋白磷酸酶1，调节(抑制子)亚基16B NM_015660 GIMAP2 GTP酶，IMAP家族成员2 NM_015937 PIG T 磷脂酰肌醇聚糖，T类 NM_016242 EMCN endomucin NM_016511 CLEC1A C型凝集素结构域家族1，成员A NM_016580 PCDH12 原钙黏着蛋白12 NM_016929 CLIC5 氯细胞内通道5 NM_017577 GRAMDIC 含GRAM结构域1C NM_017719 SNRK SNF相关激酶 NM_017805 RASIPI Ras相互作用蛋白1 NM_018058 CRTAC1 软骨酸性蛋白1 NM_018326 GIMAP4 GTP酶，IMAP家族成员4 NM_018664 SNFT jun二聚化蛋白p21 snft NM_018728 MYO5C 肌球蛋白VC NM_019055 ROBO4 迂回同源物4，神奇迂回(果蝇) NM_019555 ARHGEF3 Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)3 NM_020130 C8orf4 染色体8可读框4 NM_020142 NDUFA4L2 nadh：辅酶Q氧化还原酶mlrq亚基同系物
NM_020766 PCDH19 原钙黏着蛋白19 NM_020812 DOCK6 胞质分裂的贡献者(dedicator)6 NM_021034 IFITM3 干扰素诱导的跨膜蛋白3(1-8U) NM_022003 FXYD6 含FXYD结构域的离子转运调节子6 NM_022164 TINAGL1 肾小管间质性肾炎抗原样1 NM_022454 SOX17 SRY(性别决定区Y)-盒17 NM_022481 CENTD3 半人马蛋白，δ3 NM_022770 NM_022770 假设蛋白flj13912 NM_022821 ELOVL1 极长链脂肪酸的延长(FEN1/Elo2，SUR4/Elo3，酵母)-样1 NM_024689 CXorf36 染色体X可读框36 NM_024756 MMRN2 多聚蛋白2 NM_024781 C18orf14 染色体18可读框14 NM_024869 GRRP1 甘氨酸/精氨酸富集蛋白1 NM_025179 PLXNA2 丛蛋白A2 NM_031310 PLVAP 胞膜小泡相关蛋白 NM_031439 SOX7 SRY(性别决定区Y)-盒7 NM_052946 NOSTRIN 氧化氮合酶运输者(trafficker) NM_052954 CYYR1 半胱氨酸/酪氨酸富集1 NM_052960 RBP7 视黄醇结合蛋白7，细胞 NM_052970 HSPA12B 热休克70kD蛋白12B NM_080388 S100A16 S100钙结合蛋白A16 NM_080625 C20orf160 染色体20可读框160 NM_133625 SYN2 突触蛋白ii NM_138786 TM4SF18 跨膜4L六家族成员18 NM_138961 ESAM 内皮细胞黏着分子 NM_139247 ADCY4 腺苷酸环化酶4 NM_144649 TMEM 71 跨膜蛋白71 NM_144765 EVA1 上皮v样抗原1 NM_145057 CDC42EP5 CDC42效应子蛋白(Rho GTP酶结合)5 NM_145273 CD300LG CD300抗原样家族成员G NM_152354 ZNF285 锌指蛋白285
NM_152400 NM_152400 假设蛋白f1j39370 NM_152406 NM_152406 假设蛋白f1j36748 NM_152536 FGD5 含FYVE、RhoGEF和PH结构域5 NM_152727 CPNE2 copineII NM_170600 SH2D3C 含sh2结构域3c NM_173505 ANKRD29 锚蛋白重复结构域29 NM_173728 ARHGEF15 Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)15 NM_174934 SCN4B 钠通道，电压门控，类型IV，β NM_174938 FRMD3 含FERM结构域3 NM_175060 CLEC14A C型凝集素结构域家族14，成员A NM_175571 GIMAP8 GTP酶，IMAP家族成员8 NM_175744 RHOC ras同系物基因家族，成员C NM_178172 LOC338328 高密度脂蛋白-结合蛋白 NM_181844 BCL6B B细胞CLL/淋巴瘤6，成员B(锌指蛋白) NM_182487 OLFML2A 嗅介蛋白样2A NM_198471 ANKRD47 锚蛋白重复结构域47 NM_199054 MKNK2 map激酶相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶2
表9387个MI患者和对照受治疗者的基本特征
表10根据性别和病例-对照状态的一般特征和基因型频率分配
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 用于研究啮齿类动物注意力的行为装置 | 2020-05-21 | 415 |
| 结直肠癌的模型 | 2020-05-27 | 367 |
| 利用多瘤病毒和EB病毒序列的啮齿动物表达系统 | 2020-05-13 | 858 |
| 重建胚胎中核转移后融合和活化的方法和系统 | 2020-05-19 | 659 |
| 一种应用无毒型高膨胀固化致死的鼠类饵剂及制备方法 | 2020-05-23 | 624 |
| 一种啮齿动物温度感觉识别系统及其温度感觉缺陷动物筛选方法 | 2020-05-13 | 888 |
| 架空线缆防鼠器 | 2020-05-26 | 424 |
| 新型啮齿动物驱逐器 | 2020-05-16 | 812 |
| 防鼠非金属光缆 | 2020-05-25 | 56 |
| 一种层绞式非铠装光缆 | 2020-05-26 | 225 |
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