遗传测定
阅读：103发布：2020-08-21
专利汇可以提供遗传测定专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了用于重组测定的方法、组合物、系统和 试剂 盒 ，其的许多包括扩增反应诸如PCR或小滴数字PCR。所述方法、组合物、试剂盒和系统对极小化在测定过程期间起因于病毒基因组或其他基因组(例如，任何 微 生物 基因组)之间的重组的人为偏差特别有用。在一些方面，本文提供了进行重组测定的方法。，下面是遗传测定专利的具体信息内容。
1.一种进行重组测定的方法，所述方法包括：
a.获得包含基因组核酸的样品，其中所述基因组核酸包含多个重组的核酸，其中所述多个重组的核酸的每个在相同的链上包含：来源于第一基因组的第一序列和来源于不同于所述第一基因组的第二基因组的第二序列；
b.将所述样品分区至多个隔室内；
c.在所述多个隔室内进行反应；以及
d.计数包含所述第一序列和所述第二序列两者的所述多个隔室，以获得可被用来计算所述样品中是重组的核酸的基因组核酸的比例的数值。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一基因组和所述第二基因组是病毒基因组。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包括病毒。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包括细菌。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述第一基因组和所述第二基因组是细菌基因组。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包括RNA。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述第一病毒基因组和所述第二病毒基因组来自不同的科。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述不同的科选自由以下组成的组：腺病毒科(Adenoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、肝脱氧核糖核酸病毒科
(Hepadnaviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、肝炎病毒科(Hepeviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、以及呼肠孤病毒科(Reoviridae)。
9.如权利要求2所述的方法，其中所述第一病毒基因组或所述第二病毒基因组选自由以下组成的组：腺病毒、柯萨基病毒、EB病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、人类疱疹病毒8型、HIV、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、水痘-带状疱疹病毒及其变体毒株。
10.如权利要求2所述的方法，其中所述第一病毒基因组和所述第二病毒基因组来自不同的病毒毒株。
11.如权利要求2所述的方法，其中所述第一病毒基因组和所述第二病毒基因组来自不同的病毒物种。
12.如权利要求2所述的方法，其中所述第一病毒基因组和所述第二病毒基因组来自流感病毒毒株。
13.如权利要求2所述的方法，其中所述第一病毒基因组和所述第二病毒基因组是HIV病毒基因组。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述流感病毒毒株是H1N1、H5N1、H3N2、H7N9或H1N2，或其重组毒株。
15.如权利要求2所述的方法，其中所述第一病毒基因组和所述第二病毒基因组来自能够感染不同的宿主细胞类型的病毒，其中所述不同的宿主细胞类型选自由以下组成的组：
鸟类、狗、猪、人及马宿主细胞。
16.如权利要求2所述的方法，其中所述第一病毒基因组和所述第二病毒基因组来自能够感染不同的宿主细胞类型的病毒，其中所述不同的宿主细胞类型选自由以下组成的组：
奶牛、山羊、啮齿动物、兔、小鼠、狗、豚鼠及大鼠。
17.如权利要求2所述的方法，其中所述第一病毒序列和所述第二病毒序列的至少一个包含遗传变异。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述遗传变异选自由以下组成的组：单核苷酸多态性、插入、倒置、重排、颠换、缺失、插入缺失、微卫星重复序列、小卫星重复序列、短串联重复序列、转座元件、大规模结构变体及其组合。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述遗传变异是两个或更多个亲本毒株之间的多态性。
20.如权利要求2所述的方法，其中所述第一病毒序列和所述第二病毒序列在步骤(c)的反应之前与标记组合。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第一病毒序列和所述第二病毒序列各自用不同的颜色来标记。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述样品还包含是所述第一病毒序列的等位基因的第三病毒序列。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述第一病毒序列和所述第二病毒序列用不同的颜色来标记，且所述第三病毒序列用与所述第一病毒序列的标记颜色相同但具有与所述第一病毒序列的标记不同强度的标记来标记。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述方法具有大于75％的准确度。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述方法具有大于75％的灵敏度。
26.如权利要求1所述的方法，其中所述方法能够检测所述样品中的所述重组的核酸，其中所述样品中的少于5％的总基因组核酸是所述重组的核酸。
27.如权利要求1所述的方法，其中所述方法能够检测所述样品中的所述重组的核酸，其中少于5％的包含来源于所述第一基因组的所述第一序列的所述基因组核酸是所述重组的核酸。
28.如权利要求1所述的方法，其中少于5％的所述核酸在步骤(c)的反应期间经历重组。
29.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括检测由针对所述多个隔室内的所述病毒序列的一个或更多个探针发射的信号。
30.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括使用由计算机可读介质指示的处理器以计数所述多个隔室。
31.如权利要求1所述的方法，其中所述多个隔室是在油包水乳液内的含水小滴。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述样品被分区，使得每个隔室包含平均每含水小滴少于0.1个基因组拷贝的浓度。
33.如权利要求3所述的方法，其中包含病毒的所述样品被分区，使得每个隔室包含平均不多于一个的病毒。
34.如权利要求4所述的方法，其中包含细菌的所述样品被分区，使得每个隔室包含平均不多于一个的细菌。
35.如权利要求2所述的方法，其中所述第一病毒序列和所述第二病毒序列在同一隔室内偶然共定位的概率小于约0.001％。
36.如权利要求2所述的方法，其中片段化频率低于约10％。
37.如权利要求2所述的方法，其中两个病毒序列之间的距离小于约20千碱基。
38.如权利要求1所述的方法，其中所述样品被分区至多于约10,000,000个隔室内。
39.如权利要求1所述的方法，其中所述反应是扩增反应。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述扩增反应是聚合酶链式反应。
41.如权利要求1所述的方法，其中所述反应包括所述第一序列结合至探针，且所述第二序列结合至不同的探针。
42.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括基于步骤(d)中获得的所述数值确定所述第一序列和所述第二序列的重组率或重组频率。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述重组率或重组频率是病毒重组率或病毒重组频率。
44.如权利要求2所述的方法，其中所述方法还包括基于步骤(d)中获得的所述数值确定所述重组的核酸的病毒载量。
45.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括多重测定，其中所述样品还包含来源于第三基因组的第三序列，且所述方法还包括计算包含所述第一序列、所述第二序列和所述第三序列的基因组核酸的比例。
46.如权利要求1所述的方法，其中所述数值还基于(i)包含所述第一序列但不包含所述第二序列的隔室的数目；(ii)包含所述第二序列但不包含所述第一序列的隔室的数目；
或(iii)(i)和(ii)两者。
47.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括计数(i)包含来源于所述第一基因组的所述第一序列和来源于所述第一基因组的第三序列的隔室，其中所述第三序列是所述第二序列的等位基因；(ii)包含来源于所述第二基因组的所述第二序列和来源于所述第二基因组的第四序列的隔室，其中所述第四序列是所述第一序列的等位基因；或(iii)(i)和(ii)两者。
48.如权利要求46所述的方法，所述方法还包括：(e)基于(i)包含所述第一序列但不包含所述第二序列；(ii)包含所述第二序列但不包含所述第一序列；或(i)和(ii)两者的隔室的数目计算所述样品的片段化频率。
49.如权利要求48所述的方法，所述方法还包括：(f)使用步骤(e)的所述片段化频率确定包含在同一隔室中偶然共定位并存在于单独的链上的所述第一序列和所述第二序列的所述样品的部分的数值；以及(g)使用步骤(f)中的所述数值调整步骤(d)中获得的所述多个重组核酸的数值，以确定所述多个重组的核酸的最终数值。
50.如权利要求1所述的方法，其中所述第一基因组是人基因组且所述第二基因组是病毒基因组。
51.如权利要求2所述的方法，其中所述样品由至少80％亲本核酸构成，其中亲本核酸是在相同链上包含：来源于所述第一基因组的所述第一序列和来源于所述第一基因组的第三序列的核酸，其中来源于所述第一基因组的所述第三序列是来源于所述第二基因组的所述第二序列的等位基因。
52.一种检测重组的核酸的方法，所述方法包括：
a.获得包含以下的样品：(i)第一亲本核酸，其包含位于相同第一链的第一基因座和第二基因座；(ii)第二亲本核酸，其包含所述第一基因座的遗传变体和所述第二基因座的遗传变体，其中所述遗传变体位于相同的第二链；(iii)重组的核酸，其包含所述第二基因座和所述第一基因座的遗传变体；(iii)第一探针组，其通过当检测所述第一基因座时发射具有第一强度的第一颜色的信号，且当检测所述第一基因座的所述遗传变体时发射具有不同于所述第一强度的强度的第一颜色的信号，能够特异性检测所述第一基因座和所述第一基因座的所述遗传变体；以及(iv)第二探针组，其通过发射具有不同于所述第一颜色的第二颜色且取决于是检测所述第二基因座还是所述第二基因座的遗传变体而具有不同强度的信号，能够特异性检测所述第二基因座和所述第二基因座的所述遗传变体；
b.将所述样品分区至多个隔室内，其中隔室的总数目大于十；
c.在所述隔室内执行反应以能够实现步骤(a)中的所述信号的发射；
d.通过计数包含来自所述第二基因座和所述第一基因座的所述遗传变体两者的信号的隔室的数目计数包含所述重组的核酸的隔室的数目；以及e.基于步骤(d)的计数确定所述样品中是重组的核酸的核酸的比例以获得重组率。
53.一种检测重组的核酸的方法，所述方法包括：
a.获得包含以下的样品：(i)第一亲本核酸，其包含位于相同第一链的第一基因座和第二基因座；(ii)第二亲本核酸，其包含所述第一基因座的遗传变体和所述第二基因座的遗传变体，其中所述遗传变体位于相同的第二链；(iii)重组的核酸，其包含所述第二基因座和所述第一基因座的遗传变体；(iii)第一探针组，其通过当检测所述第一基因座时发射具有第一强度的第一颜色的信号，且当检测所述第二基因座时发射具有不同于所述第一强度的强度的第一颜色的信号，能够特异性检测所述第一基因座和所述第二基因座；以及(iv)第二探针组，其通过发射具有不同于所述第一颜色的第二颜色且取决于是检测所述第一基因座的所述遗传变体还是所述第二基因座的遗传变体而具有不同强度的信号，能够特异性检测所述第一基因座的所述遗传变体和所述第二基因座的所述遗传变体；
b.将所述样品分区至多个隔室内，其中隔室的总数目大于十；
c.在所述隔室内执行反应以能够实现步骤(a)中的所述信号的发射；
d.通过计数包含来自所述第二基因座和所述第一基因座的所述遗传变体两者的信号的隔室的数目计数包含所述重组的核酸的隔室的数目；以及e.基于步骤(d)的计数确定所述样品中是重组的核酸的核酸的比例以获得重组率。
54.如权利要求52或53所述的方法，其中所述比例反映以下比的至少一个：重组的核酸:亲本核酸；重组的核酸:第一亲本核酸；重组的核酸:第二核酸；或重组的核酸:亲本核酸和重组的核酸的总和。
55.如权利要求52或53所述的方法，其中所述样品还包含：包含所述第一基因座和所述第二基因座的遗传变体的重组的核酸。
56.如权利要求52或53所述的方法，其中所述方法还包括计数包含了包含所述第一基因座和所述第二基因座的遗传变体的重组的核酸的隔室的数目。
57.如权利要求52或53所述的方法，其中所述计数包括检测由所述第一探针组和所述第二探针组发射的所述信号的颜色和强度。
58.如权利要求52或53所述的方法，其中片段化频率低于约10％。
59.如权利要求52或53所述的方法，所述方法还包括：(f)基于以下的隔室的数目计算所述样品的片段化频率：(i)包含来自所述第二基因座的所述信号但不包含来自所述第一基因座的所述遗传变体的所述信号；(ii)包含来自所述第一基因座的所述遗传变体的所述信号但不包含来自所述第二基因座的所述信号；或(i)和(ii)两者。
60.如权利要求59所述的方法，所述方法还包括：(g)使用步骤(f)的片段化频率确定包含在同一隔室中偶然共定位并存在于单独的链上的所述第一基因座的所述遗传变异和所述第二基因座的所述样品的部分的数值；以及(h)使用步骤(g)中的所述数值调整步骤(d)中获得的所述多个重组核酸的所述数值以确定所述多个重组的核酸的最终数值。
61.如权利要求52所述的方法，其中所述第一探针组包括附连至荧光团的多核苷酸。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述多核苷酸能够以第一亲和力与所述第一基因座杂交，且以不同于所述第一亲和力的第二亲和力与所述第一基因座的遗传变体杂交。
63.如权利要求52或53所述的方法，其中所述第一基因座包含野生型序列，且所述第一基因座的所述遗传变体包含所述野生型序列的单核苷酸多态性。
64.如权利要求52或53所述的方法，其中所述核酸来源于病毒基因组。
65.如权利要求52或53所述的方法，其中所述样品是细胞样品。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述细胞样品包括用病毒感染的细胞。
67.如权利要求52或53所述的方法，其中所述样品是病毒的样品。
68.如权利要求52或53所述的方法，其中所述隔室是在乳液内的小滴。
69.如权利要求52或53所述的方法，其中所述样品包含基因组核酸，且所述基因组核酸被分区使得至多0.01个基因组拷贝存在于每个隔室中。
70.如权利要求52或53所述的方法，其中所述重组的核酸包含以下的至少一个：(i)V、D或J结构域；(ii)来自B细胞受体的结构域；(iii)来自T细胞受体的结构域；或(iii)来自HLA区域的结构域。
71.一种进行病毒颗粒测定的方法，所述方法包括：
a.使包含病毒颗粒的样品与结合所述病毒颗粒上的第一表位的第一抗体接触，其中所述第一抗体被连接至第一多核苷酸；
b.使包含所述病毒颗粒的所述样品与结合所述病毒颗粒上的第二表位的第二抗体接触，其中所述第二表位来源于不同的病毒颗粒且其中所述第二抗体被连接至能够直接或间接结合所述第一多核苷酸的第二多核苷酸；
c.将所述样品分区至离散的隔室内；
d.在所述离散的隔室内进行扩增反应；以及
e.如果扩增反应产物存在于所述离散的隔室的一个或更多个中则鉴定重组多肽。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述第一多核苷酸被直接连接至所述第一抗体。
73.如权利要求71所述的方法，其中所述第一多核苷酸通过接头被连接至所述第一抗体。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述接头是抗体或聚乙二醇(PEG)基团。
75.如权利要求71所述的方法，其中所述第一表位存在于病毒衣壳或包膜蛋白上。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述第一表位存在于病毒血凝素(HA)蛋白或神经氨酸酶(NA)蛋白上。
77.如权利要求75所述的方法，其中所述第一表位来源于HIV病毒。
78.如权利要求71所述的方法，其中所述第一多核苷酸能够与所述第二多核苷酸特异性杂交。
79.如权利要求71所述的方法，其中所述第一多核苷酸能够与第三多核苷酸特异性杂交，其中所述第三多核苷酸能够与所述第二多核苷酸特异性杂交。
80.一种分析病毒颗粒的核酸和多肽的方法，所述方法包括：
a.获得病毒颗粒的样品，其中所述病毒颗粒包含来源于第一病毒基因组的第一病毒序列和来源于不同于所述第一病毒基因组的第二病毒基因组的第二病毒序列，其中所述第一病毒序列和所述第二病毒序列存在于相同链上；
b.将所述病毒颗粒分区至隔室内，使得平均不多于一个的病毒颗粒存在于每个隔室中；
c.通过在所述隔室内进行第一扩增反应检测所述第一病毒序列和所述第二病毒序列；
d.通过使所述多肽与连接至寡核苷酸引物的抗体接触和在所述隔室内进行扩增反应来检测所述多肽；以及
e.如果所述第一病毒序列和所述第二病毒序列存在于同一隔室则检测到重组事件。
81.一种选择性繁殖感兴趣的病毒的方法，所述方法包括：
a.使测试宿主细胞与感兴趣的病毒接触以允许所述宿主细胞被所述病毒感染；
b.使所述感兴趣的病毒在所感染的宿主细胞中繁殖；
c.从所感染的宿主细胞分离病毒基因组进入离散隔室内；
d.在所述离散的隔室内扩增所述病毒基因组；
e.检测所述病毒基因组内遗传变异的存在或不存在；以及
f.如果所述遗传变异是存在的，从所述测试宿主细胞繁殖另外的感兴趣的病毒。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述另外的感兴趣的病毒包含病毒疗法载体。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述病毒疗法载体用于生物体中的基因疗法或细胞疗法。
84.如权利要求81所述的方法，其中所述另外的感兴趣的病毒被用于疫苗中。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述疫苗被用来治疗生物体。
遗传测定
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请要求2013年7月25日提交的美国临时申请号61/858,311和2013年11月1日提交的美国临时申请号61/899,027的权益，这些申请的每个通过引用以其整体并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] 重组，特别是病毒重组，可极大地影响进化和流行病学两者。在病毒中，重组率取决于共感染发生的频率以及在感染的宿主细胞内不同的病毒基因组之间的遗传交换的频率。测量重组率的能力对理解病毒生长、毒力以及对创建用于开发新的疫苗的减毒毒株是重要的。
[0005] 用于测量重组率的当前方法，例如包括凝胶电泳和测序的方法是不精确和/或耗时的，且通常导致重组水平的过高估算。本文公开的用于重组测定的方法、组合物、系统和试剂盒克服了这些挑战中的许多。本文提供的方法、组合物、系统和试剂盒还可用于其他类型的重组分析，诸如细菌重组、免疫细胞中的V(D)J结构域或VJ结构域的重组，以及其他类型的分析诸如单体型分析。
[0006] 发明概述
[0007] 本公开内容提供了用于分析重组，特别是病毒重组的方法、组合物、试剂盒和系统。该方法、组合物、试剂盒和系统对极小化在测定过程期间起因于病毒基因组或其他基因组(例如，任何微生物基因组)之间的重组的人为偏差特别有用。
[0008] 在一些方面，本文提供了用于进行重组测定的方法，所述方法包括：a.获得包含基因组核酸的样品，其中所述基因组核酸包含多个重组的核酸，其中所述多个重组的核酸的每个在相同的链上包含：来源于第一基因组的第一序列和来源于不同于所述第一基因组的第二基因组的第二序列；b.将所述样品分区至多个隔室内；c.在所述多个隔室内进行反应；以及d.计数包含所述第一序列和所述第二序列两者的所述多个隔室，以获得可用于计算样品中是重组的核酸的所述基因组核酸的比例的数值。
[0009] 在一些情况下，样品包含病毒。在一些情况下，样品包含细菌或细菌颗粒。在一些情况下，第一基因组和第二基因组是细菌基因组。在一些情况下，样品包含RNA。样品可包含DNA。
[0010] 在一些情况下，第一基因组和第二基因组是病毒基因组。在一些情况下，第一病毒基因组和第二病毒基因组来自不同的科。在一些情况下，不同的科选自由以下组成的组：腺病毒科(Adenoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、冠状病毒科
(Coronaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、肝炎病毒科(Hepeviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、以及呼肠孤病毒科(Reoviridae)。
(Coronaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、肝炎病毒科(Hepeviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、以及呼肠孤病毒科(Reoviridae)。
[0011] 在一些情况下，第一病毒基因组或第二病毒基因组选自由以下组成的组：腺病毒、柯萨基病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、人类疱疹病毒8型、HIV、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、水痘-带状疱疹病毒及其变体毒株。
[0012] 在一些情况下，第一病毒基因组和第二病毒基因组来自不同的病毒毒株。在一些情况下，第一病毒基因组和第二病毒基因组来自不同的病毒物种。在一些情况下，第一病毒基因组和第二病毒基因组来自流感病毒毒株。在一些情况下，第一病毒基因组和第二病毒基因组是HIV病毒基因组。在一些情况下，流感病毒毒株是H1N1、H5N1、H3N2、H7N9或H1N2，或其重组毒株。在一些情况下，第一病毒基因组和第二病毒基因组来自能够感染不同的宿主细胞类型的病毒，其中不同的宿主细胞类型选自由以下组成的组：鸟类、狗、猪、人及马宿主细胞。在一些情况下，第一病毒基因组和第二病毒基因组来自能够感染不同的宿主细胞类型的病毒，其中不同的宿主细胞类型选自由以下组成的组：奶牛(cows)、山羊(goats)、啮齿动物、兔、小鼠、狗、豚鼠及大鼠。
[0013] 在一些情况下，第一病毒序列和第二病毒序列的至少一个包含遗传变异。在一些情况下，遗传变异选自由以下组成的组：单核苷酸多态性(SNP)、插入、倒置、重排、颠换、缺失、插入缺失(indels)、微卫星重复序列、小卫星重复序列、短串联重复序列、转座元件、大规模结构变体及其组合。在一些情况下，遗传变异是两个或更多个亲本毒株之间的多态性。
[0014] 在一些情况下，第一病毒序列和第二病毒序列在步骤(c)的反应之前与标记组合。在一些情况下，第一病毒序列和第二病毒序列各自用不同的颜色来标记。在一些情况下，样品还包含是第一病毒序列的等位基因的第三病毒序列。在一些情况下，第一病毒序列和第二病毒序列用不同的颜色来标记，且第三病毒序列用与第一病毒序列的标记颜色相同但具有与第一病毒序列的标记不同强度的标记来标记。
[0015] 在一些情况下，该方法具有大于75％的准确度。在一些情况下，该方法具有至少80％、90％、95％、97％或99％的准确度。在一些情况下，该方法具有大于75％的灵敏度。在一些情况下，该方法具有至少80％、90％、95％、97％或99％的灵敏度。在一些情况下，该方法能够检测样品中的重组的核酸，其中样品中少于5％的总基因组核酸是重组的核酸。在一些情况下，该方法能够检测样品中的重组的核酸，其中样品中少于4％、3％、2％、1％或
0.1％的总基因组核酸是重组的核酸。在一些情况下，该方法能够检测样品中的重组的核酸，其中少于5％的包含来源于第一基因组的第一序列的基因组核酸是重组的核酸。在一些情况下，该方法能够检测样品中的重组的核酸，其中少于4％、3％、2％、1％或0.1％的包含来源于第一基因组的第一序列的基因组核酸是重组的核酸。在一些情况下，少于5％的核酸在步骤(c)的反应期间经历重组。在一些情况下，少于4％、3％、2％、1％或0.1％的核酸在步骤(c)的反应期间经历重组。
0.1％的总基因组核酸是重组的核酸。在一些情况下，该方法能够检测样品中的重组的核酸，其中少于5％的包含来源于第一基因组的第一序列的基因组核酸是重组的核酸。在一些情况下，该方法能够检测样品中的重组的核酸，其中少于4％、3％、2％、1％或0.1％的包含来源于第一基因组的第一序列的基因组核酸是重组的核酸。在一些情况下，少于5％的核酸在步骤(c)的反应期间经历重组。在一些情况下，少于4％、3％、2％、1％或0.1％的核酸在步骤(c)的反应期间经历重组。
[0016] 在一些情况下，该方法还包括检测由针对多个隔室内的病毒序列的一个或更多个探针发射的信号。在一些情况下，该方法还包括使用由计算机可读介质指示的处理器以计数多个隔室。在一些情况下，多个隔室是在油包水乳液内的含水小滴。在一些情况下，样品被分区，使得每个隔室包含平均每含水小滴少于0.1个基因组拷贝的浓度。在一些情况下，包含病毒的样品被分区，使得每个隔室包含平均不多于一个的病毒。在一些情况下，包含细菌颗粒的样品被分区，使得每个隔室包含平均不多于一个的细菌颗粒。
[0017] 在一些情况下，第一病毒序列和第二病毒序列在同一隔室内偶然共定位的概率小于约0.001％。在一些情况下，片段化频率小于约10％。在一些情况下，两个病毒序列之间的距离小于约20千碱基对。在一些情况下，样品被分区至多于约10,000,000个隔室内。在一些情况下，反应是扩增反应。在一些情况下，扩增反应是聚合酶链式反应。在一些情况下，反应包括第一序列结合至探针，且第二序列结合至不同的探针。
[0018] 在一些情况下，该方法还包括基于步骤(d)中获得的数值确定第一序列和第二序列的重组率或重组频率。在一些情况下，重组率或重组频率是病毒重组率或病毒重组频率。在一些情况下，该方法还包括基于步骤(d)中获得的数值确定重组的核酸的病毒载量。
[0019] 在一些情况下，该方法还包括进行多重测定，其中样品还包含来源于第三基因组的第三序列，且该方法还包括计算包含第一序列、第二序列和第三序列的基因组核酸的比例。在一些情况下，数值还基于(i)包含第一序列但不包含第二序列的隔室的数目；(ii)包含第二序列但不包含第一序列的隔室的数目；或(iii)(i)和(ii)两者。在一些情况下，多重测定能够鉴定至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个不同的重组基因组。
[0020] 在一些情况下，方法还包括计数(i)包含来源于第一基因组的第一序列和来源于第一基因组的第三序列的隔室，其中第三序列是第二序列的等位基因；(ii)包含来源于第二基因组的第二序列和来源于第二基因组的第四序列的隔室，其中第四序列是第一序列的等位基因；或(iii)(i)和(ii)两者。
[0021] 在一些情况下，该方法还包括：(e)基于(i)包含第一序列但不包含第二序列；(ii)包含第二序列但不包含第一序列；或(i)和(ii)两者的隔室的数目计算样品的片段化频率。在一些情况下，该方法还包括：(f)使用步骤(e)的所述片段化频率确定包含在同一隔室中偶然共定位并存在于单独的链上的所述第一序列和所述第二序列的所述样品的部分的数值；以及(g)使用步骤(f)中的所述数值调整步骤(d)中获得的所述多个重组核酸的数值，以确定所述多个重组的核酸的最终数值。
[0022] 在一些情况下，第一基因组是人基因组且第二基因组是病毒基因组。在一些情况下，样品由至少80％亲本核酸构成，其中亲本核酸是在相同链上包含：来源于第一基因组的第一序列和来源于第一基因组的第三序列的核酸，其中来源于第一基因组的第三序列是来源于第二基因组的第二序列的等位基因。
[0023] 在一些方面，本文提供了检测重组的核酸的方法，所述方法包括：a.获得包含以下的样品：(i)第一亲本核酸，包含位于相同第一链的第一基因座和第二基因座；(ii)第二亲本核酸，包含所述第一基因座的遗传变体和所述第二基因座的遗传变体，其中所述遗传变体位于相同的第二链；(iii)重组的核酸，其包含所述第二基因座和所述第一基因座的遗传变体；(iii)第一探针组，其通过当检测所述第一基因座时发射具有第一强度的第一颜色的信号，且当检测所述第一基因座的所述遗传变体时发射具有不同于所述第一强度的强度的第一颜色的信号，能够特异性检测所述第一基因座和所述第一基因座的所述遗传变体；以及(iv)第二探针组，其通过发射具有不同于所述第一颜色的第二颜色且取决于是检测所述第二基因座还是所述第二基因座的所述遗传变体而具有不同强度的信号，能够特异性检测所述第二基因座和所述第二基因座的遗传变体；b.将所述样品分区至多个隔室内，其中隔室的总数目大于十；c.在所述隔室内执行反应以能够实现步骤(a)中的所述信号的发射；d.通过计数包含来自所述第二基因座和所述第一基因座的所述遗传变体两者的信号的隔室的数目计数包含所述重组的核酸的隔室的数目；以及e.基于步骤(d)的计数确定样品中是重组的核酸的核酸的比例以获得重组率。
[0024] 在一些方面，本文提供了检测重组的核酸的方法，所述方法包括：a.获得所述样品包含以下的样品：(i)第一亲本核酸，其包含位于相同第一链的第一基因座和第二基因座；(ii)第二亲本核酸，其包含所述第一基因座的遗传变体和所述第二基因座的遗传变体，其中所述遗传变体位于相同的第二链；(iii)重组的核酸，其包含所述第二基因座和所述第一基因座的遗传变体；(iii)第一探针组，其通过当检测所述第一基因座时发射具有第一强度的第一颜色的信号，且当检测所述第二基因座时发射具有不同于所述第一强度的强度的第一颜色的信号，能够特异性检测所述第一基因座和所述第二基因座；以及(iv)第二探针组，其通过发射具有不同于所述第一颜色的第二颜色且取决于是检测所述第一基因座的所述遗传变体还是所述第二基因座的所述遗传变体而具有不同强度的信号，能够特异性检测所述第一基因座的遗传变体和所述第二基因座的遗传变体；b.将所述样品分区至多个隔室内，其中隔室的总数目大于十；c.在所述隔室内执行反应以能够实现步骤(a)中的所述信号的发射；d.通过计数包含来自所述第二基因座和所述第一基因座的所述遗传变体两者的信号的隔室的数目计数包含所述重组的核酸的隔室的数目；以及e.基于步骤(d)的计数确定样品中是重组的核酸的核酸的比例以获得重组率。在一些情况下，比例反映以下比的至少一个：重组的核酸:亲本核酸；重组的核酸:第一亲本核酸；重组的核酸:第二核酸；或重组的核酸:亲本核酸和重组的核酸的总和。在一些情况下，样品还包含：包含第一基因座和第二基因座的遗传变体的重组的核酸。
[0025] 在一些情况下，方法还包括计数包含了包含第一基因座和第二基因座的遗传变体的重组的核酸的隔室的数目。在一些情况下，计数包括检测由第一探针组和第二探针组发射的信号的颜色和强度。
[0026] 在一些情况下，片段化频率低于约10％。在一些情况下，该方法还包括：(f)基于以下的隔室的数目计算样品的片段化频率：(i)包含来自第二基因座的信号但不包含来自第一基因座的遗传变体的信号；(ii)包含来自第一基因座的遗传变体的信号但不包含来自第二基因座的信号；或(i)和(ii)两者。在一些情况下，该方法还包括：(g)使用步骤(f)的片段化频率确定包含在同一隔室中偶然共定位并存在于单独的链上的所述第一基因座的所述遗传变异和所述第二基因座的所述样品的部分的数值；以及(h)使用步骤(g)中的所述数值调整步骤(d)中获得的所述多个重组核酸的所述数值以确定所述多个重组的核酸的最终数值。
[0027] 在一些情况下，第一探针组包含附连至荧光团的多核苷酸。在一些情况下，多核苷酸能够以第一亲和力与第一基因座杂交，且以不同于第一亲和力的第二亲和力与第一基因座的遗传变体杂交。在一些情况下，第一基因座包含野生型序列，且第一基因座的遗传变体包含野生型序列的单核苷酸多态性。
[0028] 在一些情况下，核酸来源于病毒基因组。在一些情况下，样品是细胞样品。在一些情况下，细胞样品包括用病毒感染的细胞。在一些情况下，样品是病毒的样品。在一些情况下，隔室是乳液内的小滴。在一些情况下，样品包含基因组核酸，且基因组核酸被分区使得至多0.01个基因组拷贝存在于每个隔室中。在一些情况下，重组的核酸包含以下的至少一个：(i)V、D或J结构域；(ii)来自B细胞受体的结构域；(iii)来自T细胞受体的结构域；或(iii)来自HLA区域的结构域。
[0029] 在一些方面，本文提供了进行病毒颗粒测定的方法，所述方法包括：a.使包含病毒颗粒的样品与结合所述病毒颗粒上的第一表位的第一抗体接触，其中所述第一抗体被连接至第一多核苷酸；b.使包含所述病毒颗粒的所述样品与结合所述病毒颗粒上的第二表位的第二抗体接触，其中所述第二表位来源于不同的病毒颗粒且其中所述第二抗体被连接至能够直接或间接结合所述第一多核苷酸的第二多核苷酸；c.将所述样品分区至离散的隔室内；d.在离散的隔室内进行扩增反应；以及e.如果扩增反应产物存在于所述离散的隔室的一个或更多个中则鉴定重组多肽。
[0030] 在一些情况下，第一多核苷酸被直接连接至第一抗体。在一些情况下，第一多核苷酸通过接头被连接至第一抗体。在一些情况下，接头是抗体或聚乙二醇(PEG)基团。
[0031] 在一些情况下，第一表位存在于病毒衣壳或包膜蛋白上。在一些情况下，第一表位存在于病毒血凝素(HA)蛋白或神经氨酸酶(NA)蛋白上。在一些情况下，第一表位来源于HIV病毒。在一些情况下，第一多核苷酸能够与第二多核苷酸特异性杂交。在一些情况下，第一多核苷酸能够与第三多核苷酸特异性杂交，其中第三多核苷酸能够与第二多核苷酸特异性杂交。
[0032] 在一些方面，本文提供了分析病毒颗粒的核酸和多肽的方法，所述方法包括：a.获得病毒颗粒的样品，其中病毒颗粒包含来源于第一病毒基因组的第一病毒序列和来源于不同于所述第一病毒基因组的第二病毒基因组的第二病毒序列，其中所述第一病毒序列和所述第二病毒序列存在于相同链上；b.将所述病毒颗粒分区至隔室内，使得平均不多于一个的病毒颗粒存在于每个隔室中；c.通过在所述隔室内进行第一扩增反应检测所述第一病毒序列和所述第二病毒序列；d.通过使所述多肽与连接至寡核苷酸引物的抗体接触和在所述隔室内进行扩增反应来检测所述多肽；以及e.如果所述第一病毒序列和所述第二病毒序列存在于同一隔室则检测重组事件。
[0033] 在一些方面，本文提供了选择性繁殖感兴趣的病毒的方法，所述方法包括：a.使测试宿主细胞与感兴趣的病毒接触以允许所述宿主细胞被所述病毒感染；b.使所述感兴趣的病毒在感染的宿主细胞中繁殖；c.从所感染的宿主细胞分离病毒基因组进入离散隔室内；d.在所述离散的隔室内扩增所述病毒基因组；e.检测所述病毒基因组内遗传变异的存在或不存在；以及f.如果所述遗传变异是存在的，从所述测试宿主细胞繁殖另外的感兴趣的病毒。在一些情况下，另外的感兴趣的病毒包含病毒疗法载体。在一些情况下，病毒疗法载体用于生物体中的基因疗法或细胞疗法。在一些情况下，另外的感兴趣的病毒用于疫苗中。在一些情况下，疫苗用于治疗生物体。
[0034] 通过引用并入
[0038] 图1提供了用于定量重组率的方法的概述。
[0039] 图2示出了概括宿主细胞中病毒感染和生长(例如复制)所牵涉的步骤的通用模型。
[0040] 图3提供了用于预测核酸中片段化的实施方案的概述(还适用于重组)。
[0042] 图5提供了本文提供的系统、装置和方法的选定方面的概述。
[0043] 图6示出了在分区之前从总脑RNA逆转录的cDNA的基因表达测定，其中使用标志物鉴定的振幅的多重方法在相同ddPCR反应中单独地或一起检测SDHA(琥珀酸脱氢酶)和B2M(β2-微球蛋白)。
[0044] 图7A和7B示出了使用标志物鉴定的振幅和颜色两者确定病毒重组率的多重方法，其中三重测定包括GAPDH在VIC中被检测，且B2M和SDHA两者在FAM中以不同的FAM振幅来检测。
[0045] 图8是描绘两个亲本基因组之间的重组的图，使用相同荧光标志物的高和低振幅探针，区分相同毒株的替代基因座，示出了毒株A，其中A1用低振幅荧光FAM来标记，且A2用高振幅荧光FAM来标记；且在毒株B中，其中B1用低振幅荧光HEX(或VIC)来标记，且B2用高振幅荧光HEX(或VIC)来标记。
[0046] 图9A、9B和9C示出了使用两种标志物鉴定方案确定病毒重组率的多重方法，其中振幅区分基因座，且颜色区分亲本基因组(或等位基因)。9A代表了非常高的稀释方案(0.01个基因组拷贝/小滴)与非常大数目的小滴(例如>1M)而没有片段化，9B代表了高稀释方案与若干片段化，且9C代表了低稀释方案。未示出可存在于指定簇中的所有可能的物质。
[0047] 图10A、10B和10C示出了在重组事件之后的标志物(A1、A2以及B1、B2)。10A示出了在重组之前位于单个全长分子中的一个亲本基因组的两个标志物。10B示出了从重组事件生成的亲本全长分子和重组全长分子两者的混合物。10C示出了其中片段是存在的情况。
[0048] 图11是描绘两个亲本基因组之间的重组的图，使用相同颜色的高和低强度标志物探针区分相同基因座的替代等位基因，示出了毒株A，其中A1用FAM来标记，且A2用HEX(或VIC)来标记；且在毒株B中，其中B1用FAM来标记，且B2用HEX(或VIC)来标记。
[0049] 图12示出了使用两种标志物鉴定方案确定病毒重组率的选择性多重方法，其中颜色区分等位基因，且振幅区分亲本基因座。
[0050] 图13是描绘可本文提供的方法、系统和多种实施方案所使用的邻位连接测定(PLA)的图。
[0051] 图14示出了随顺式(连锁的)和反式(不连锁的或重组)病毒等位基因出现的小滴簇的复杂群体。
[0052] 图15A、15B、15C和15D示出了计算病毒重组的方法。15A示出了在测定中检测的分子物质。15B示出了鉴定每个单独的簇的编号方案。15C示出了可参与任何小滴的所有可能的分子物质。15D示出了，对于使用两种颜色与分层强度的测定的所有可能的簇，在给定的小滴内的可能的物质。
[0053] 图16示出了多种长度(1kb、10kb、100kb)的FAM标记的里程碑标志物，其可被连接至VIC标记的锚(RPP30锚)以提供DNA大小测量的标尺。
[0054] 图17A、17B、17C和17D示出了2D荧光强度图，显示了与图17A的用于不连锁的基因座核糖核酸酶P和染色体6标志物的双链体测定相比，对于每个双链化核糖核酸酶P:染色体10里程碑标志物(在图17B中的1kb、在图17C中的10kb、在图17D中的100kb)测定的双阳性FAM+/VIC+小滴的数目。总双阳性计数由在每个双链体测定的可比较DNA输入的每个2D图的右上方象限中的箭头指示。
[0055] 图18A和18B显示了2D荧光强度图，显示了FAM/VIC+/+双阳性(“连锁的”)分子在另一个未消化的DNA样品中的数目，反映锚和图18A的190bp足迹及图18B的1kp足迹的里程碑标志物之间的紧密物理连锁。
[0056] 发明详述
[0057] I.一般概述
[0058] 本公开内容提供了用于进行重组测定，特别是通过核酸或多肽分析区分微生物颗粒(例如，病毒、细菌)彼此的方法、组合物、系统和试剂盒。在另一个方面，重组测定通过分析核酸和多肽两者和/或大分子来进行。在一些情况下，多个重组测定被并行进行。在一些情况下，多个重组测定被进行以检测由于一个或更多个病毒重组事件出现在核酸的相同链上的两个或更多个标志物；在一些情况下，多个重组测定被进行以检测多个样品中的相同标志物或多个样品中的不同标志物。
[0059] 通常，重组测定可包括至少以下步骤。一个步骤可包括获得待使用本文提供的重组测定测定的生物样品。例如，样品可以是病毒颗粒，或其部分，例如，病毒核酸。在一些情况下，样品是临床样品，例如，从感染了病毒或其他病原体的受试者获得的样品。样品可以是细胞样品或体液。样品可包含核酸，其中核酸包含存在于相同链上的第一病毒序列和第二病毒序列，其中第二病毒序列来源于与第一病毒序列不同的基因组。重组测定还可包括将样品分区至多个离散隔室内的步骤，其允许共定位和分离来自给定的样品的离散信号。重组测定还可包括检测步骤，其中第一病毒序列和第二病毒序列通过以下来检测：在离散的隔室内进行扩增反应，并如果第一序列和第二序列共定位至同一隔室则鉴定重组事件。
在一些情况下，病毒测定包括通过分析可检测的标记的信号的振幅和/或扩增子大小测定与多个可检测的标记接触的多个病毒序列。在一些情况下，扩增子大小可被改变，以控制可检测的标记(例如，荧光标志物)的信号的振幅。在一个实例中，其中样品包含来自两个亲本基因组(A和B)的重组的核酸，其中A基因组包含A1基因座和A2基因座，且B基因组包含分别是A1和A2的等位基因的B1基因座和B2基因座，重组的核酸可以几种方法之一来检测。在一个实例中，基因座可用不同颜色的探针来标记，且等位基因可用不同的振幅的探针来标记。
例如，A1和A2可用不同颜色的探针来标记，B1可用与A1颜色相同但以不同振幅发射信号的探针来标记，且B2可用与A2颜色相同但以不同振幅发射信号的探针来标记。在另一个实例中，基因座(例如，A1和A2)可用相同颜色但以不同振幅发射信号的探针来标记，且等位基因(例如，A1和B1)可用具有不同颜色的探针来标记。在一些情况下，病毒测定通过调整引物浓度、探针浓度、引物和探针浓度或通过混合探针的多种比(例如，荧光团的不同比)来进行。
在一些情况下，测定还包括确定样品的片段化率。在一些情况下，测定还包括鉴于样品的片段化率调整重组频率。
在一些情况下，病毒测定包括通过分析可检测的标记的信号的振幅和/或扩增子大小测定与多个可检测的标记接触的多个病毒序列。在一些情况下，扩增子大小可被改变，以控制可检测的标记(例如，荧光标志物)的信号的振幅。在一个实例中，其中样品包含来自两个亲本基因组(A和B)的重组的核酸，其中A基因组包含A1基因座和A2基因座，且B基因组包含分别是A1和A2的等位基因的B1基因座和B2基因座，重组的核酸可以几种方法之一来检测。在一个实例中，基因座可用不同颜色的探针来标记，且等位基因可用不同的振幅的探针来标记。
例如，A1和A2可用不同颜色的探针来标记，B1可用与A1颜色相同但以不同振幅发射信号的探针来标记，且B2可用与A2颜色相同但以不同振幅发射信号的探针来标记。在另一个实例中，基因座(例如，A1和A2)可用相同颜色但以不同振幅发射信号的探针来标记，且等位基因(例如，A1和B1)可用具有不同颜色的探针来标记。在一些情况下，病毒测定通过调整引物浓度、探针浓度、引物和探针浓度或通过混合探针的多种比(例如，荧光团的不同比)来进行。
在一些情况下，测定还包括确定样品的片段化率。在一些情况下，测定还包括鉴于样品的片段化率调整重组频率。
[0060] 另外，重组测定可包括获得病毒样品(或包含大分子复合物的其他样品)，并在离散的隔室内使用抗体检测和扩增两者，以鉴定样品中的核酸或多肽。在一些情况下，第一序列和第二序列(例如，第一病毒序列和第二病毒序列)的检测通过添加连接至寡核苷酸的抗体来进行。抗体可识别在离散的隔室内的第一序列和第二序列(例如，病毒序列、多肽序列)，且第一序列和第二序列可通过以下来检测：将寡核苷酸连接在一起或在它结合至另一个之后延伸一个寡核苷酸，且进行扩增反应或杂交反应以检测连接的寡核苷酸。
[0061] 由本公开内容提供的多种系统通常包含用于指示系统的多种设备的计算机处理器和软件接口，包含允许将样品分区至离散隔室内的微流体组件的小滴生成装置，允许感兴趣的一个或更多个大分子在离散隔室内进行扩增反应的热循环装置，以及能够检测离散隔室内一个或更多个扩增的数字分析装置。在相关的方面，系统可以是可包括自动化机器诸如，移液、铺板或液体操作机器人的较大系统的一部分，或被束缚至允许进一步或相似样品分析，例如，测序、成像、染色或杂交装置的工具。
[0062] 另外，在多个方面，本发明提供的重组测定可产生各种类型的信息，诸如绝对定量病毒重组率或重组分子频率，病毒载量、标志物辅助的病毒颗粒的基因分型，病毒颗粒的分子签名，毒力，和生长率。在其他方面，重组测定可用于在体外或体内生成和繁殖医学利益诸如基因疗法或细胞疗法的或用于科学研究工具诸如基因表达系统的新的病毒毒株。同样地，重组测定可用于非病毒病原体(例如，细菌、寄生虫等)或检测在其他背景中的重组，诸如检测免疫组库。
[0063] II.用于重组测定的方法
[0064] 图1示出了确定和定量重组事件(101)的方法的实施方案的概述；该图和本公开内容中提供的其余图仅用于说明性目的并不旨在限制本发明。图1中的步骤可以以任何合适的顺序和组合来进行，并且可与本公开内容的任何其他步骤联合。获得多核苷酸的样品(120)；样品可以是，例如，来自生物样品的核酸，诸如来自病毒、细菌或其他微生物，或来自被感染的受试者诸如人受试者的核酸或多肽。在一些情况下，样品是完整的病毒。在一些情况下，单个病毒颗粒(例如，病毒，完整的病毒，病毒片段等等)可被分区至单独的分区(例如，小滴)内用于扩增鉴定(例如，PCR)标志物。在一些情况下，单独的分区还可包括核酸序列的一个或更多个片段。在一些情况下，样品中的靶核酸序列任选地物理分离或片段化(例如，通过限制性内切酶)(140)。样品可被分区至多个隔室内，例如在油包水乳液内的多个含水小滴(160)。具有靶序列(例如分子标志物)的隔室的数目可被计数并定量(180)。然后靶序列的重组事件可被进一步评估，以确定重组率或重组频率；该事件还可依据应用通过本领域已知的多种方法来描述(190)。
[0065] A.样品
[0066] 与本文公开的方法的多种应用一起使用的样品可包括细胞、颗粒、微生物或大分子的同源或异源群体。
[0067] 细胞可以是微生物细胞、原核细胞、真核细胞或用病毒颗粒感染的细胞。细胞可来源于哺乳动物细胞。可被使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括：人、非人灵长类动物、灵长类动物、啮齿类动物、奶牛、绵羊、羔羊、猴、猩猩、兔、狗、猪、小鼠、大鼠、豚鼠或猫。在一个优选的应用中，细胞是人细胞。在一些应用中，细胞是非人的哺乳动物细胞，或甚至是非哺乳动物细胞。可被使用的非哺乳动物细胞的非限制性实例包括：昆虫、鸟类、鱼类、两栖类、爬行类、微生物类、原生动物类、无脊椎动物、细菌、植物、真菌、寄生虫和病毒颗粒。
[0068] 图2示出了概括牵涉宿主细胞中病毒感染和生长(例如复制)的步骤的通用模型。在一些应用中，样品来自被病毒感染的宿主细胞。
[0069] 在其他应用中，样品可以是游离的或分离的病毒体。包含病毒颗粒(来自宿主细胞，游离的或分离的)的样品可包含核酸分子。核酸分子可以是，例如、DNA、RNA、线粒体DNA、线粒体RNA、基因组DNA、核糖体DNA、叶绿体DNA或RNA、mRNA、siRNA、miRNA、cRNA、单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA、tRNA、rRNA、或cDNA。
[0070] 在其中样品是RNA样品的情况下，RNA样品可通过逆转录被转化为DNA样品，通常通过使用逆转录的酶诸如逆转录酶(reverse transcriptase)进行。在一些情况下，RNA可在分区之前被转化为cDNA。在一些情况下，RNA可在隔室(例如，小滴)内被转化为cDNA。在一些情况下，RNA可在分区之后被转化为cDNA。在一些情况下，所得的cDNA分子的长度可被制成包含在每个基因组上被评分的两个标志物。在一个优选的实施方案中，RNA可在将RNA分区至一个或更多个小滴内之后被转化为cDNA，以防止最初物理连接的标志物脱连接。在其中RNA可在分区之后被转化为cDNA的一些情况下，可导致来自人工脱连接的片段化分子的增加。
[0071] 可与本公开内容一起使用或分析的病毒包括，但不限于：dsDNA病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、ssDNA病毒(+链或"有义")、DNA(例如，细小病毒)、dsRNA病毒(例如呼肠孤病毒)、(+)ssRNA病毒(+链或有义)、RNA(例如，小核糖核酸病毒、披膜病毒)、(-)ssRNA病毒、(-链或反义)RNA(例如，正粘病毒(包括流感病毒)、弹状病毒)、ssRNA-RT病毒(+链或有义)RNA与DNA在生命周期中的中间体(例如，逆转录酶病毒)或dsDNA-RT病毒(例如，嗜肝DNA病毒)。在一些优选的实施方案中，HIV病毒以所描述的方法进行分析。在一些优选的实施方案中，流感病毒以所描述的方法进行分析。
[0072] 在一些情况下，样品是重组病毒颗粒，特别是从宿主分离的重组病毒颗粒。在一些情况下，重组病毒颗粒从被具有不同基因组的两个或更多个病毒颗粒感染的宿主中分离。在此类情况下，两种或更多种病毒颗粒可在宿主内经历重组事件。例如，两种或更多种病毒颗粒可感染相同的细胞，并例如，在由逆转录酶催化的反应期间经历遗传信息的重排或重组。在一些情况下，宿主用已经经历了重组或重排的病毒颗粒来感染。重组病毒颗粒因此可以是在它感染宿主之后被分离的重组病毒颗粒。在一些情况下，重组病毒颗粒(例如，流感病毒)，其感染多个宿主，包括不同物种的宿主。在一些情况下，重组病毒颗粒是感染宿主并然后在宿主内经历进一步重组或重排的重组病毒颗粒。
[0073] 重组病毒颗粒可从感染的宿主组织或细胞来分离图2；在其他情况下，重组病毒颗粒可存在于宿主中作为无细胞病毒并可被分离，具有来自体液诸如血液、血浆、尿液、粘液等等的循环颗粒。
[0074] 图8和11是描绘了两个亲本基因组之间的重组的图。病毒重组可当共感染亲本的病毒颗粒交换遗传信息(例如，基因组区段)时发生，创建新颖重组病毒“后代”。该机制可引起病毒中的多种变化，包括病毒毒株的表型变异。此类基因组改变可产生具有新抗原决定簇的病毒。抗原性新颖病毒通过基因组改变的出现被称为抗原漂移。抗原性改变的病毒可能够在先前耐受性的宿主或免疫的宿主中引起疾病。这些机制还可导致病毒致病性的改变、改变的宿主范围，或改变的靶细胞特异性，但有完整的抗原性。本文提供了方法、试剂盒和系统，提供测定抗原漂移的病毒中的基因组改变、病毒致病性的改变、改变的宿主范围、改变的靶细胞特异性，及其组合。尽管图8和11提及“毒株”，该方法同样适用于经历重组的任何核酸(例如，免疫细胞中的V(D)J重组)。
[0075] 病毒重组可通过多种方法诸如自由组合(independent assortment)来进行。自由组合可在具有区段化基因组的病毒中出现。驻留于核酸的不同部分的基因随机组合。这可导致具有新的抗原决定簇和新的宿主范围的病毒的产生。可选地，重组可在不完全连锁的基因之间发生。驻留于核酸的相同部分的基因也可经历重组。本文提供了方法、试剂盒和系统，提供测定通过自由组合的基因组改变。
[0076] 本文提供了可与本公开内容一起使用的多种类型重组的非限制性实例。重组可在两种不同的病毒毒株和两种相同的宿主细胞类型之间发生。例如，人流感病毒H1N1毒株可与人流感病毒H2N2毒株经历重组。重组可在相同的病毒毒株和两种不同的宿主细胞类型之间发生。例如，人H1N1毒株可与猪H1N1毒株经历重组。重组可在两种不同的病毒毒株和两种不同的宿主细胞类型之间发生。例如，人H1N1毒株可与猪H2N2毒株经历重组。在一些情况下，病毒颗粒可包含来源于至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或20种不同宿主细胞类型的遗传信息。在一些情况下，病毒颗粒可包含来源于至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、40种或50种不同的病毒毒株的遗传信息。在另一实例中，逆转录病毒(例如，HIV、SIV，等等)可在多种背景中重组。例如，SIV病毒可与人HIV重组。
[0077] 可与本文提供的方法、组合物、系统和试剂盒一起使用的病毒的实例可包括以下，以及其任何组合：腺病毒属(Adenovirus)(该属中物种的实例包括但不限于，在七种腺病毒物种A至G中的HAdV-1至HAdV-57)、苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)(该属中物种的实例包括但不限于，苜蓿病毒1、苜蓿病毒2、苜蓿花叶病毒、苜蓿花叶病毒病毒(Marmor medicaginis virus)以及马铃薯印花病毒)、青葱病毒属(Allexivirus)(该属中物种的实例包括但不限于，青葱X病毒以及大蒜病毒)、异轻小噬菌体属(Allolevivirus)(该属中物种的实例包括但不限于，肠杆菌噬菌体Qβ以及肠杆菌噬菌体F1)、α潜隐病毒属(Alphacryptovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，白三叶草潜隐病毒1(White clover cryptic virus 1))、甲型脂毛噬菌体属(Alphalipothrixvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，附着嗜热变形杆菌病毒1型)、Alphanodoavirus、α乳头瘤病毒属(Alphapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人乳头瘤病毒32(HPV-32)、HPV-6、HPV-7、HPV-10、HPV-16、HPV-18、HPV-26、HPV-32、HPV-61和HPV-71)、α逆转录病毒属(Alpharetrovirus)(该属中物种的实例包括但不限于，禽白血病病毒、劳氏肉瘤病毒、禽成骨髓细胞性白血病病毒以及弗吉纳米肿瘤病毒)、甲病毒属(Alphavirus)(该属中物种的实例包括但不限于，辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒、基孔肯雅病毒以及欧尼恩病毒(O’nyong-nyong virus))、阿留申貂病毒属(Amdovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，阿留申貂病)、葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，葡萄卷叶伴随病毒3、葡萄卷叶伴随病毒1、葡萄卷叶伴随病毒5、菠萝粉蚧萎病毒伴随病毒1(Pinapple mealybug wilt-associated virus 1)、菠萝粉蚧萎病毒伴随病毒2以及小樱桃病毒2)、口蹄疫病毒属
(Aphthovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，O型口蹄疫病毒、A型马鼻炎病毒以及B型牛鼻炎病毒)、水生双RNA病毒属(Aquabirnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，感染性胰腺坏死病毒)、水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，水生呼肠孤病毒A型：大麻哈鱼呼肠孤病毒CS，水生呼肠孤病毒B型：大鳞大麻哈鱼呼肠孤病毒B，水生呼肠孤病毒C型：美鳊呼肠孤病毒(Golden shiner reovirus)、草鱼呼肠孤病毒、水生呼肠孤病毒D型：斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(Channel catfish reovirus)、水生呼肠孤病毒E型：多宝鱼呼肠孤病毒、水生呼肠孤病毒F型：银大麻哈鱼呼肠孤病毒SSR(Coho salmon reovirus SSR)以及水生呼肠孤病毒G型：美国草鱼呼肠孤病毒)、沙粒病毒属
(Arenavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、拉沙病毒、Tacaribe病毒(Tacaribe virus)以及皮秦德病毒(Pichinde virus))、动脉炎病毒属(Arterivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马动脉炎病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、乳酸脱氢酶升高病毒(Lactate dehydrogenase-elevating virus)以及猴出血热病毒)、囊泡病毒属(Ascovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，草地贪夜蛾囊泡病毒1a(Spodoptera frugiperda ascovirus 1a)、粉纹夜蛾囊泡病毒2a(Trichoplusiani
ascovirus 2a)、烟芽夜蛾囊泡病毒3c(Heliothisvirescens ascovirus 3c)、美双缘姬蜂囊泡病毒(Diadromuspulchellus ascovirus 4))、Asfivirus(该属中物种的实例包括，但不限于，非洲猪瘟病病毒)、富AT腺病毒属(Atadenovirus)(绵羊腺病毒D(Ovine
adenovirus D)、鸭腺病毒A、牛腺病毒D(Bovine adenovirus D)以及负鼠腺病毒1(Possum adenovirus 1))、黄金葛病毒属(Aureusvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，黄金葛潜伏病毒(Pothos latent virus))、禽星状病毒属(Avastrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，火鸡星状病毒(Turkey astrovirus))、燕麦病毒属(Avenavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，燕麦褪绿矮化病毒(Oat chlorotic stunt virus))、禽腺病毒属(Aviadenovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，禽腺病毒(A至E)以及鹅腺病毒)、禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，传染性法氏囊病病毒)、禽嗜肝DNA病毒属(Avihepadnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鸭乙型肝炎病毒)、禽痘病毒属(Avipoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、鸽痘病毒、鹌鹑痘病毒以及火鸡痘病毒)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，新城鸡瘟病毒、禽副粘病毒2型、禽副粘病毒3型以及禽副粘病毒4型)、香蕉顶束病毒属(Babuvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，香蕉束顶病毒以及麻蕉束顶病毒(Abaca bunchy top virus))、杆状DNA病毒属(Badnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鸭跖草黄斑驳病毒)、杆状RNA病毒属(Barnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蘑菇杆状病毒(Mushroom bacilliform virus))、蛭弧菌微小噬菌体属(Bdellomicrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蛭弧菌噬菌体MAC1
(Bdellovibrio phage MAC 1))、菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蚕豆金黄色花叶病毒、蚕豆矮花叶病毒(Bean dwarf mosaic virus)、苘麻花叶病毒、非洲木薯花叶病毒、辣椒卷叶病毒(Chilli leaf curl virus)、南瓜卷叶病毒(Squash leaf curl virus)、马铃薯黄花叶病毒以及番茄黄卷叶病毒)、乙型潜隐病毒属(Betacryptovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，白三叶潜隐病毒2(White clover cryptic virus 2))、乙型脂毛噬菌体属(Betalipothrixvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，冰岛硫化叶菌丝状病毒(Sulfolobus islandicus filamentous virus)以及酸菌丝状病毒3型(Acidianus filamentous virus 3))、β乳头瘤病毒(Betapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人乳头瘤病毒5(HPV-5)、HPV-9以及HPV-49)、
Betanodovirus、β逆转录病毒属(Betaretrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，小鼠乳腺瘤病毒、绵羊肺腺瘤病病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus)以及松鼠猴逆转录病毒)、β四体病毒属(Betatetravirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，松天蚕蛾β病毒(Nudaurelia capensis beta virus)、按树柞蚕病毒、刺蛾病毒、茸毒蛾β四体病毒
(Dasychirapudibunda virus)、尺夜蛾病毒(Pseudoplusia includes virus)以及纹夜蛾病毒(Trichoplusiani virus))、博卡病毒属(Bocavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛细小病毒(Bovine parvovirus)、人博卡病毒(Human bocavirus)以及犬细小病毒(Canine minute virus))、博尔纳病毒属(Bornavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，博尔纳病病毒以及禽博尔纳病毒(Avian Bornavirus))、茧蜂病毒属(Bracovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，柳毒蛾盘绒茧蜂病毒(Cotesia melanoscela
bracovirus))、短浓核病毒属(Brevidensovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，埃及伊蚊浓核病毒以及白纹伊蚊浓核病毒(AalDNV)、雀麦花叶病毒属(Bromovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus))、大麦黄化花叶病毒属(Bymovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，大麦黄花叶病毒、大麦轻度花叶病毒、燕麦花叶病毒以及水稻坏死花叶病毒)。发状病毒属(Capillovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，苹果凹茎病毒、樱桃病毒A(Cherry virus A)以及丁香花褪绿叶斑病毒(Lilac chlorotic leafspot virus))、山羊痘病毒属(Capripoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，绵羊痘病毒、山羊痘病毒以及皱皮病病毒)、心病毒属(Cardiovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，脑心肌炎病毒以及泰勒病毒(Theilovirus))、香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，香石竹潜隐病毒、大蒜普通潜隐病毒(Garlic common latent virus)、百合无症病毒(Lily symptomless virusm)、马铃薯M病毒以及葱潜隐病毒(Shallot latent virus))、香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，香石竹斑驳病毒)、花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，花椰菜花叶病毒)、木薯脉花叶病毒属(Cavemovirus)(该属中物种的实例包括 ，但不限于 ，木薯花叶病毒 )、衣原体微小噬菌体属
(Chlamydiamicrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，衣原体噬菌体1)，绿藻病毒属(Chlorovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，绿草履虫(Paramecium bursaria)病毒以及小球藻病毒)、绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，无脊椎动物虹彩病毒3型(Invertebrate iridescent virus 3))、青霉病毒属
(Chrysovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，产黄青霉病毒)、环病毒属
(Circovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、鸽圆环病毒以及天鹅圆环病毒)、长线形病毒属(Closterovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，甜菜黄化病毒(Beet yellows virus)、柑桔衰退病毒以及葡萄卷叶伴随病毒2型
(Grapevine leafroll-associated virus 2))、海洋球石藻病毒(Coccolithovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，赫氏圆石藻病毒86(Emiliania huxleyi virus 86))、科罗拉多蜱传染症病毒属(Coltivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，科洛拉多蜱热病毒以及欧洲Eyach病毒(European eyach virus))、豇豆花叶病毒属(Comovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，豇豆花叶病毒、菜豆荚斑点病毒、豇豆重花叶病毒、红三叶草斑驳病毒以及南瓜花叶病毒)、冠状病毒属(Coronavirus)、被盖病毒属(Corticovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，假交替单胞菌噬菌体PM2)、蟋蟀麻痹病毒属(Cripavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蟋蟀麻痹病毒)、南瓜花叶病毒属(Cucumovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，黄瓜花叶病毒、花生矮化病毒以及番茄不孕病毒)、曲顶病毒属(Curtovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，甜菜曲顶病毒(Beet curly top
virus)、甜菜轻度曲顶病毒(Beet mild curly top virus)、甜菜严重曲顶病毒(Beet severe curly top virus)以及辣根曲顶病毒(Horseradish curly top virus))、质型多角体病毒属(Cypovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，质型多角体病毒1型
(Cypovirus 1))、囊状病毒属(Cystovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，假单胞菌噬菌体phi6以及假单胞菌噬菌体Phi7至Phi14)、巨细胞病毒属(Cytomegalovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人巨细胞病毒、恒河猴疱疹病毒5型、恒河猴疱疹病毒8型以及猿疱疹病毒4型(Pongine herpesvirus 4))、胞内水稻黄矮炮弹病毒属(Cytorhabdovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，莴苣坏死黄化病毒以及北方谷物花叶病毒)、
Dainthovirus、丁型乳头瘤病毒属(Deltapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，欧洲麋鹿乳头瘤病毒、牛乳头瘤病毒1型、牛乳头瘤病毒2型以及鹿乳头瘤病毒)、δ逆转录病毒属(Deltaretrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛白血病病毒、人类T淋巴细胞病毒、人类T淋巴细胞白病毒2型、人类T淋巴细胞病毒3型以及猴T淋巴细胞病毒1型(Simian T-lymphotropic virus 1))、δ病毒属(Deltavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，丁型肝炎病毒)、浓核病毒属(Densovirus)、依赖病毒属(Dependovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，腺病毒相关病毒2型(Adeno-associated virus-2)、腺病毒相关病毒1型(Adeno-associated virus-1)以及鸭细小病毒)、埃博拉病毒属(Ebolavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，扎伊尔埃博拉病毒(Zaire ebolavirus)、雷斯顿埃博拉病毒(Reston ebolavirus)以及苏丹埃博拉病毒(Sudan ebolavirus))、豌豆耳突花叶病毒属(Enamovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，豌豆耳突花叶病毒1型(Peaenation mosaic virus-1))、肠道病毒属(Enterovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，脊髓灰质炎病毒(人类肠道病毒C血清型PV-1、PV-2、PV-3)、人柯萨奇病毒、人肠道病毒70型以及人鼻病毒A型(Human rhinovirus A))、昆虫双RNA病毒属(Entomobirnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，果蝇X病毒)、昆虫痘病毒A(Entomopoxvirus A)、昆虫痘病毒B
(Entomopoxvirus B)、昆虫痘病毒C(Entomopoxvirus C)、短暂热病毒属(Ephemerovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛流行热病毒以及贝里马病毒(Berrimah virus))、戊型乳头瘤病毒属(Epsilonpapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛乳头瘤病毒5型(Bovine papillomavirus 5))、ε反转录病毒属(Epsilonretrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒)、马鼻病毒属(Erbovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，乙型马鼻炎病毒1(Equine rhinitis B virus 1)以及乙型马鼻炎病毒2(Equine rhinitis B virus 2))、漂移病毒属(Errantivirus)、红病毒属
(Erythrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人细小病毒B19以及猴细小病毒
(Simian parvovirus))、庚型乳头瘤病毒属(Etapapillomavirus)、蚕豆萎蔫病毒属
(Fabavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蚕豆萎蔫病毒1(Broad bean wilt virus
1)、蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2)以及芝麻轻型花叶病毒(Lamium mild mosaic virus))、斐济病毒属(Fijivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，斐济病病毒、玉米粗缩病毒(Maize rough dwarf virus)、里奧夸尔托病毒(Mal de Rio Cuarto virus)、水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus)、燕麦不育矮缩病毒(Oat sterile dwarf virus)、褐飞虱呼肠孤病毒(Nilaparvata lugens reovirus)以及马唐矮化病毒(Pangola stunt virus))、黄病毒属(Flavivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，黄热病病毒、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、蜱媒脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、圣路易斯脑炎病毒
(St.louis encephalitis virus)以及墨累山谷脑炎病毒(Murray valley encephalitis virus))，凹陷病毒属(Foveavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus)、杏潜隐病毒(Apricot latent virus)以及沙地葡萄茎痘相关病毒(Rupestris steem pitting-associated virus))、微小纺锤形噬菌体属
(Fusellovirus)、丙型脂毛噬菌体属(Gammalipothrixvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，酸菌丝状病毒1型(Acidianus filamentous virus 1))、γ乳头瘤病毒属
(Gammapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人乳头瘤病毒4(HPV-4)、HPV-
48、HPV-50、HPV-60以及HPV-88)、γ逆转录病毒属(Gammaretrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，小鼠白血病病毒、猫白血病病毒、长臂猿白血病病毒(Gibbon ape
leukemia virus)以及异嗜性小鼠白血病病毒相关病毒(Xenotropic murine leukemia virus-related virus))、贾第鞭毛虫病毒属(Giardiavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，兰氏贾第鞭毛虫病毒)、颗粒体病毒属(Granulovirus)、小滴形病毒属
(Guttavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，新西兰硫化叶菌小滴形病毒
(Sulfolobus newzealandicus droplet-shaped virus))、环转病毒属(Gyrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鸡贫血病毒)、汉坦病毒属(Hantavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，汉坦病毒(Hantaan virus)、纽约病毒(New York virus)、普马拉病毒、辛诺柏病毒以及图拉病毒(Tula virus))、半病毒属(Hemivirus)、亨尼帕病毒属
(Henipavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，亨德拉病毒(Hendra virus)以及尼帕病(Nipah virus))、丙型肝炎病毒属(Hepacivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，丙型肝炎病毒)、肝DNA病毒属(Hepadnavirus)、肝病毒属(Hepatovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，甲型肝炎病毒、人甲型肝炎病毒以及猴甲型肝炎病毒)、低毒病毒属(Hypovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，栗疫菌低毒病毒1(Cryphonectria
hypovirus 1)、栗疫菌低毒病毒2(Cryphonectria hypovirus 2)、栗疫菌低毒病毒3
(Cryphonectria hypovirus 3)以及栗疫菌低毒病毒4(Cryphonectria hypovirus 4))、姬蜂病毒属(Ichnovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，发声齿唇姬蜂病毒
(Campoletis sonorensis ichnovirus))，鱼疱疹病毒属(Ictalurivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鮰类疱疹病毒1型(Ictalurid herpesvirus 1))、昆虫非包涵体病毒属(Idnoreovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，昆虫非包涵体病毒1型
(Idnoreovirus 1)：美丽姬蜂非包涵体病毒1型(Diadromus pulchellus idnoreovirus
1)、昆虫非包涵体病毒2型(Idnoreovirus 2)：镶颚姬蜂非包涵体病毒2型(Hyposoter exiguae idnoreovirus 2)、昆虫非包涵体病毒3型(Idnoreovirus 3)：家蝇非包涵体病毒3型(Musca domestica idnoreovirus 3)、昆虫非包涵体病毒4型(Idnoreovirus 4)：橄榄实蝇非包涵体病毒4型(Dacus oleae idnoreovirus 4)、昆虫非包涵体病毒5型
(Idnoreovirus 5)：地中海实蝇非包涵体病毒5型(Ceratitis capitata idnoreovirus 5)以及黑腹果蝇非包涵体病毒5型(Drosophila melanogaster idnoreovirus-5))、等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，烟草条纹病毒(Tobacco streak virus))、传喉炎病毒属(Iltovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，格利德原鸡属疱疹病毒1型(Gallid herpesvirus 1)以及鹦鹉疱疹病毒1型(Psittacid
herpesvirus 1))、甲型流感病毒属(Influenza A virus)(该属中物种的实例包括，但不限于，H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7以及H7N9。甲型流感病毒属/波多黎各/8/34H1N1(FLUAV)(Influenza A/Puerto Rico/8/34H1N1(FLUAV))、乙型流感病毒属(Influenza B virus)(该属中物种的实例包括，但不限于，乙型流感病毒/Lee/1940(FLUBV)(Influenza B/Lee/1940(FLUBV))、丙型流感病毒属(Influenza C virus)(该属中物种的实例包括，但不限于，丙型流感病毒/加利福尼亚/78(FLUCV)(Influenza C/
California/78(FLUCV))、丝状病毒属(Inovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，肠杆菌噬菌体M13以及假单胞菌噬菌体Pf1)、壬型乳头瘤病毒属(Iotapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，多乳鼠乳头瘤病毒(Mastomys natalensis
papillomavirus))、甘薯病毒属(Ipomovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，甘薯轻型斑驳病毒以及黄瓜脉黄化病毒)、虹彩病毒属(Iridovirus)，鲑传贫病毒属(Isavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，传染性鲑鱼贫血病毒(Infectious salmon anemia virus))、艾特拉病毒属(Iteravirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，家蚕浓核病毒5型(Bombyx mori densovirus 5)、家蚕浓核病毒1型(Bombyx mori densovirus 1)以及新刺峨浓核病毒(Casphalia extranea densovirus))、κ乳头瘤病毒属(Kappa
papillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，白尾棕色兔乳头状瘤病毒
(Cottontail rabbit papillomavirus)、以及兔口腔乳头瘤病毒(Rabbit oral
papillomavirus))、嵴病毒(Kobuvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，爱知病毒(Aichi virus)以及牛嵴病毒属(Bovine kobuvirus))、兔病毒属(Lagovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，兔出血病病毒)、λ乳头瘤病毒属(Lambdapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，犬口腔乳头状瘤病毒)、利什曼原虫病毒属(Leishmaniavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，利什曼原虫RNA病毒1-1型(LRV-1-1)至(LRV-1-12)以及利什曼原虫RNA病毒2-1型)、慢病毒属(Lentivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、HIV-2、猴免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒以及猫免疫缺陷病毒)、粘液瘤亚群病毒属(Leporipoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，粘液瘤病毒(Myxoma virus)、野兔纤维瘤病毒(Hare fibroma virus)、兔纤维瘤病毒以及松鼠纤维瘤病毒)、轻小噬菌体属(Levivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，肠杆菌噬菌体MS2、肠杆菌噬菌体BZ13、肠杆菌噬菌体以及肠杆菌噬菌体MS2)、黄症病毒属(Luteovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，大麦黄矮病毒-PAV、大麦黄矮病毒-MAV、大麦黄矮病毒-PAS、豆卷叶病毒(Bean leafroll virus)以及大豆矮缩病毒)、淋巴隐伏病毒属
(Lymphocryptovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人疱疹病毒4型(EB病毒)、恒河猴疱疹病毒12型(Cercopithecine herpesvirus 12)、恒河猴疱疹病毒14型、恒河猴疱疹病毒15型、猿疱疹病毒1型、猿疱疹病毒2型以及猿疱疹病毒3型)、淋巴囊肿病毒属
(Lymphocystivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，淋巴囊肿病病毒1型)、狂犬病病毒属(Lyssavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，狂犬病病毒、莫科拉病毒以及杜文黑基病毒)、玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，玉米褪绿斑驳病毒)、橙桑花叶病毒属(Macluravirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，橙桑花叶病毒)、斑点病毒属(Maculavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，葡萄斑点病毒)、星状病毒属(Mamastrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人星状病毒、牛星状病毒、猫星状病毒、水貂星状病毒、绵羊星状病毒以及猪星状病毒)、柑橘病毒属
(Mandarivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，印度柑橘环斑病毒)、玉米雷亚朵非纳病毒属(Marafivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，玉米雷亚多非纳病毒、燕麦蓝矮病毒以及百慕大草蚀线病毒)、马尔堡病毒属(Marburgvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，维多利亚湖马尔堡病毒)、马立克病毒属(Mardivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，禽疱疹病毒2型(Gallid herpesvirus 2)、禽疱疹病毒3型以及吐绶鸡疱疹病毒1型(Meleagrid herpesvirus 1))、海洋RNA病毒属(Marnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，赤潮异弯藻RNA病毒(Heterosigma akashiwo RNA virus)、裂殖壶菌单链RNA病毒(Schizochytrium single-stranded RNA virus)、海洋RNA病毒JP-A以及海洋RNA病毒JP-B)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人腺病毒C型、人腺病毒A型、人腺病毒B型、人腺病毒D型、人腺病毒E型以及人腺病毒F)、玉米线条病毒属(Mastrevirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，玉米条纹病毒、菜豆黄矮病毒、虎尾草条点花叶病毒(Chloris striate mosaic virus)、马唐线条病毒(Digitaria streak virus)、芒属线条病毒(Miscanthus streak virus)、烟草黄矮病毒以及小麦矮缩病毒)、肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney Necrosis virus))、偏肺病毒属(Metapneumovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus)以及人偏肺病毒)、转座病毒属(Metavirus)、微小噬菌体属(Microvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，肠杆菌噬菌体PhiX174)、线粒体病毒属(Mitovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，栗疫病菌线粒体病毒1型(Cryphonectria mitovirus 1)以及长喙壳线粒体病毒3A型(Ophiostoma mitovirus 3A))、软疣痘病毒属(Molluscipoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，接触传染性软疣病毒(Molluscum contagiosum virus))、麻疹病毒属
(Morbillivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫病毒)，μ乳头瘤病毒属(Mupapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人乳头瘤病毒1型)、鼠巨细胞病毒属(Muromegalovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，小鼠疱疹病毒1型以及小鼠疱疹病毒2型)、真菌呼肠孤病毒属(Mycoreovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，真菌呼肠孤病毒1型(mycoreovirus 1)：栗疫病菌呼肠孤病毒1型(Cryphonectria parasitica mycoreovirus-1)以及真菌呼肠孤病毒3型：褐座坚壳呼肠孤病毒3型(Rosellinia necatrix mycoreovirus-3))、内罗病毒属(sNairovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，达格毕病毒(Dugbe virus)以及克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus))、矮化病毒属(Nanovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，地三叶草矮化病毒(Subterranean clover stunt virus)、蚕豆坏死黄化病毒(Faba bean necrotic yellows virus)以及紫云英矮缩病毒(Milk vetch dwarf virus))、裸露RNA病毒属(Narnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，酿酒酵母20S RNA裸露RNA病毒(Saccharomyces cerevisiae narnavirus 20S)以及酿酒酵母23S RNA裸露RNA病毒(Saccharomyces 23S RNA narnavirus))、坏死病毒属(Necrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，烟草坏死病毒)、线虫传多角体病毒属(Nepovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，烟草环斑病毒、葡萄扇叶病毒、甜菜环斑病毒以及黑加仑逆转病毒(Blackcurrant reversion virus))、诺如病毒属(Norovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，诺瓦克病毒(Norwalk virus)、洛兹达雷病毒(Lordsdale virus)以及南安普敦病毒(Southampton virus))、粒外弹状病毒属(Novirhabdovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，传染性造血组织坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus)以及黑鱼病毒(Snakehead virus))、核型多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus)、核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马铃薯黄矮病毒以及玉米花叶病毒(Maize mosaic virus))、寅型乳头瘤病毒属(Nupapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人乳头瘤病毒41型)，头甲病毒属(Okavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鳃相关病毒(Gill-associated virus)以及黄头病毒)、油橄榄病毒属
(Oleavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，油橄榄潜隐病毒2型)、ω四体病毒属(Omegatetravirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，松天蚕蛾ω病毒(Nudaurelia capensis omega virus)、棉铃虫矮化病毒(Helicoverpa armigera stunt virus)以及马尾松毛虫病毒(Dendrolimus punctatus virus))、辰型乳头瘤病毒属
(Omikronpapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，棘鳍海豚乳头瘤病毒
(Phocoena spinipinnispapillomavirus))、环状病毒(Orbivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蓝舌病毒(Bluetongue virus)以及非洲马疫病毒、及动物流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus))、正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，布尼安维拉病毒(Bunyamwera virus)、拉克罗斯病毒(La Crosse virus)以及施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus))、正嗜肝DNA病毒属
(Orthohepadnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，乙型肝炎病毒)、正痘病毒属(Orthopoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛痘病毒(Vaccinia virus)、牛痘病毒(Cowpox virus)、马痘病毒、猴痘病毒以及天花病毒)、正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，哺乳动物正呼肠孤病毒、禽正呼肠孤病毒(Avian orthoreovirus)、尼尔森湾正呼肠孤病毒(Nelson Bay orthoreovirus)、狒狒正呼肠孤病毒(Baboon orthoreovirus)以及爬虫正呼肠病毒(Reptilian orthoreovirus))、水稻病毒属(Oryzavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，水稻齿叶矮化病毒以及裨草齿叶矮缩病毒(Echinochloa ragged stunt virus))、黍花叶病毒属(Panicovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，稷子花叶病毒)、副痘病毒属(Parapoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，传染性脓疱病毒(Orf virus)、牛丘疹性口炎病毒、假牛痘病毒以及松鼠副痘病毒(Squirrel parapoxvirus))、双埃克病毒属(Parechovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人双埃克病毒1型(Human parechovirus 1)(以前为埃克病毒22型)、人双埃克病毒2型(HPeV-2)(以前为埃克病毒23型)、人双埃克病毒3型(HPeV-3)以及永贝里病毒
(Ljungan virus))、分病毒属(Partitivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，艾特金菌病毒(Atkinsonella Hypoxylon virus))、细小病毒属(Parvovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鼠细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、小鼠细小病毒1型以及LuIII病毒(LuIII virus))、环星黑烟浓稠病毒属(Pefudensovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa densovirus)以及家蟋蟀浓核病毒
(Acheta domesticus densovirus))、瘟疫病毒属(Pestivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛腹泻病毒1型(Bovine diarrhea virus 1)、牛腹泻病毒2型、边境疾病病毒以及经典猪瘟病毒(Classical swine fever virus))、碧冬茄病毒属(Petuvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，碧冬茄脉明病毒(Petunia vein clearing virus))、褐藻病毒属(Phaeovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，长囊水云病毒1型(Ectocarpus
siliculosus virus 1))、白蛉病毒属(Phlebovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，裂谷热病毒(Rift valley fever virus)、尤尤库尼米病毒(Uukuniemi virus)以及庞塔托鲁白蛉病毒(Punta toro phlebovirus))、植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，伤瘤病毒(Wound tumor virus)、水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus)、水稻瘿矮病毒(Ricegall dwarf virus)以及烟草叶耳突植物呼肠孤病毒(Tobacco leaf enation phytoreovirus))、巳型乳头瘤病毒属(Pipapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，仓鼠口腔乳头瘤病毒(Hamster oral papillomavirus)以及褐家鼠乳头瘤病毒1型(Rattus norvegicus papillomavirus 1))、芽生病毒属(Plasmavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，无胆甾原体L2噬菌体(Acholeplasma phage L2))、短杆状噬菌体属(Plectrovi)(该属中物种的实例包括，但不限于，无胆甾原体噬菌体L51
(Acholeplasma phage L51))、肺炎病毒属(Pneumovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人呼吸道合胞病毒以及牛呼吸道合胞病毒)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马铃薯卷叶病毒、西部甜菜黄化病毒以及谷物黄矮病毒)、多瘤病毒属(Polyomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猿猴病毒40、BK多瘤病毒(BK polyomavirus)、默克尔细胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus)、鹦鹉幼雏病病毒(Budgerigar fledgling disease polyomavirus)、牛多瘤病毒(Bovine polyomavirus)、JC多瘤病毒(JC polyomavirus)以及鼠多瘤病毒)、马铃薯X病毒属(Potexvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马铃薯X病毒、三叶草黄花叶病毒以及兰花花叶病毒)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马铃薯Y病毒、甜菜花叶病毒、三叶草黄叶脉病毒、洋李痘疱病毒(Plum pox virus)、马铃薯A病毒以及烟草脉斑驳病毒
(Tobaccovein mottling virus))、青绿藻病毒属(Prasinovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，细小微单胞藻病毒SP1(Micromonas pusilla virus SP1))、金藻病毒属(Prymnesiovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，短丝金藻病毒PW1
(Chrysochromulina brevifilum virus PW1))、假病毒属(Pseudovirus)、蛙病毒属
(Ranavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蛙病毒3型)、针胞藻病毒属
(Raphidovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，赤潮异弯藻病毒01型(Heterosigma akashiwo virus 01))、呼吸道病毒属(Respirovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，仙台病毒(Sendai virus)以及猴病毒10型(Simian virus 10))、疱疹病毒属
(Rhadinovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猿猴疱疹病毒2型(Saimiriine
herpesvirus 2)、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated
herpesvirus)、牛疱疹病毒4型、马疱疹病毒2型以及鼠疱疹病毒4型(Murid herpesvirus
4))、鼻病毒属(Rhinovirus)、玫瑰疹病毒属(Roseolovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人疱疹病毒6A型、人疱疹病毒7型以及人疱疹病毒6B型)、轮状病毒属(Rotavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，轮状病毒A型至轮状病毒G型)、风疹病毒属(Rubivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，风疹病毒)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，腮腺炎病毒以及马普埃拉病毒(Mapuera virus))、古噬菌体属(Rudivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，冰岛硫化叶菌杆状病毒1型(Sulfolobus islandicus rod-shaped virus 1)以及冰岛硫化叶菌杆状病毒2型)、黑麦草花叶病毒属(Rymovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，黑麦草花叶病毒)、札幌病毒(Sapovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，札幌病毒(Sapporo virus))、东南亚十二节段RNA病毒属(Seadornavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，版纳病毒(Banna virus)、卡迪皮羅病毒(Kadipiro virus)以及辽宁病毒(Liao ning virus))、伴生病毒属(Sequivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，欧洲防风黄点病毒(Parsnip yellow fleck virus)、蒲公英黄花叶病毒(Dandelion yellow mosaic sequivirus)以及莴苣斑驳病毒(Lettuce mottle virus))、唾液酸酶腺病毒属(Siadenovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蛙腺病毒以及火鸡腺病毒A型)、单纯疱疹病毒属(Simplexvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人疱疹病毒1型、人疱疹病毒2型以及牛疱疹病毒2型)、大豆褪绿斑驳病毒属(Soymovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，大豆褪绿斑驳病毒、蓝莓红环斑病毒以及花生褪绿条纹病毒)、螺旋体微小噬菌体属(Spiromicrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，螺旋体噬菌体4型)、泡沫病毒属(Spumavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猴泡沫病毒、牛泡沫病毒以及猫泡沫病毒)、猪痘病毒属(Suipoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猪痘病毒)、复层噬菌体属(Tectivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，肠杆菌噬菌体PRD1、芽孢杆菌噬菌体AP50、芽孢杆菌噬菌体Bam35以及栖热菌噬菌体P17-14)、捷申病毒属(Teschovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猪捷申病毒1型(PTV-1)至PTV-11)、辛型乳头瘤病毒属(Thetapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，非洲灰鹦鹉乳头瘤病毒(Psittacus erithacus timneh papillomavirus))、索戈托病毒属(Thogotovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，索戈托病毒(Thogoto virus)以及多理病毒(Dhori virus))、番茄丛矮病毒属(Tombusvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，番茄丛矮病毒以及香石竹意大利环斑病毒(Carnation Italian ringspot virus))、番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，番茄伪曲项病毒(Tomato pseudo-curly top virus))、环曲病毒属(Torovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马环曲病毒(Equine Torovirus)、人环曲病毒(Human torovirus)以及布雷达病毒(Breda virus))、番茄斑萎病毒属(Tospovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，番茄斑萎病毒)、全病毒属(Totivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，酿酒酵母病毒L-A、酿酒酵母病毒L-BC以及玉蜀黍黑菌病毒H1)、发状病毒属(Trichovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，苹果褪绿叶斑病毒、樱桃叶斑点病毒、葡萄浆果内坏死病毒(Grapevine berry inner necrosis virus)以及桃花叶病毒(Peach mosaic virus))、花叶病毒属(Tritimovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，小麦线条花叶病毒)、东格鲁病毒属(Tungrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，水稻东格鲁杆状病毒(Rice tungro bacilliform virus))、芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，芜菁黄花叶病毒、安第斯马铃薯潜伏病毒(Andean potato latent virus)、颠茄斑驳病毒(Belladonna mottle virus)以及可可树黄花叶病毒)、水痘病毒属
(Varicellovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人疱疹病毒3型(水痘-带状疮疹病毒)、牛疱疹病毒1型、牛疱疹病毒5型以及猪疱疹病毒1型(Suid herpesvirus 1))，水疱性病毒属(Vesiculovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，疱疹性口炎、印第安那病毒(Indiana virus)、科卡尔病毒(Cocal virus)、马拉巴病毒(Maraba virus)以及皮理病毒(Piry virus))、水疱疹病毒属(Vesivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猪水疱疹病毒(Vesicular exanthema of swine virus))、葡萄病毒属(Vitivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，葡萄病毒A型(Grapevine virus A)、葡萄病毒B型、葡萄病毒D型以及独活潜隐病毒(Heracleum latent virus))、矮化病毒属(Waikavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，水稻东格鲁球形病毒以及玉米褪绿矮缩病毒)、白点病毒属(Whispovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，白斑综合症病毒1型)、卯型乳头瘤病毒属
(Xipapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛乳头瘤病毒3型、牛乳头瘤病毒
4型以及牛乳头瘤病毒6型)、亚塔痘病毒属(Yatapoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，亚巴猴肿瘤病毒(Yaba monkey tumor virus)以及塔纳痘病毒(Tanapox virus))或己型乳头瘤病毒属(Zetapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马人乳头瘤病毒1型(Equine papillomavirus 1))。
(Aphthovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，O型口蹄疫病毒、A型马鼻炎病毒以及B型牛鼻炎病毒)、水生双RNA病毒属(Aquabirnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，感染性胰腺坏死病毒)、水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，水生呼肠孤病毒A型：大麻哈鱼呼肠孤病毒CS，水生呼肠孤病毒B型：大鳞大麻哈鱼呼肠孤病毒B，水生呼肠孤病毒C型：美鳊呼肠孤病毒(Golden shiner reovirus)、草鱼呼肠孤病毒、水生呼肠孤病毒D型：斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(Channel catfish reovirus)、水生呼肠孤病毒E型：多宝鱼呼肠孤病毒、水生呼肠孤病毒F型：银大麻哈鱼呼肠孤病毒SSR(Coho salmon reovirus SSR)以及水生呼肠孤病毒G型：美国草鱼呼肠孤病毒)、沙粒病毒属
(Arenavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、拉沙病毒、Tacaribe病毒(Tacaribe virus)以及皮秦德病毒(Pichinde virus))、动脉炎病毒属(Arterivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马动脉炎病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、乳酸脱氢酶升高病毒(Lactate dehydrogenase-elevating virus)以及猴出血热病毒)、囊泡病毒属(Ascovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，草地贪夜蛾囊泡病毒1a(Spodoptera frugiperda ascovirus 1a)、粉纹夜蛾囊泡病毒2a(Trichoplusiani
ascovirus 2a)、烟芽夜蛾囊泡病毒3c(Heliothisvirescens ascovirus 3c)、美双缘姬蜂囊泡病毒(Diadromuspulchellus ascovirus 4))、Asfivirus(该属中物种的实例包括，但不限于，非洲猪瘟病病毒)、富AT腺病毒属(Atadenovirus)(绵羊腺病毒D(Ovine
adenovirus D)、鸭腺病毒A、牛腺病毒D(Bovine adenovirus D)以及负鼠腺病毒1(Possum adenovirus 1))、黄金葛病毒属(Aureusvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，黄金葛潜伏病毒(Pothos latent virus))、禽星状病毒属(Avastrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，火鸡星状病毒(Turkey astrovirus))、燕麦病毒属(Avenavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，燕麦褪绿矮化病毒(Oat chlorotic stunt virus))、禽腺病毒属(Aviadenovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，禽腺病毒(A至E)以及鹅腺病毒)、禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，传染性法氏囊病病毒)、禽嗜肝DNA病毒属(Avihepadnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鸭乙型肝炎病毒)、禽痘病毒属(Avipoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、鸽痘病毒、鹌鹑痘病毒以及火鸡痘病毒)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，新城鸡瘟病毒、禽副粘病毒2型、禽副粘病毒3型以及禽副粘病毒4型)、香蕉顶束病毒属(Babuvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，香蕉束顶病毒以及麻蕉束顶病毒(Abaca bunchy top virus))、杆状DNA病毒属(Badnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鸭跖草黄斑驳病毒)、杆状RNA病毒属(Barnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蘑菇杆状病毒(Mushroom bacilliform virus))、蛭弧菌微小噬菌体属(Bdellomicrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蛭弧菌噬菌体MAC1
(Bdellovibrio phage MAC 1))、菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蚕豆金黄色花叶病毒、蚕豆矮花叶病毒(Bean dwarf mosaic virus)、苘麻花叶病毒、非洲木薯花叶病毒、辣椒卷叶病毒(Chilli leaf curl virus)、南瓜卷叶病毒(Squash leaf curl virus)、马铃薯黄花叶病毒以及番茄黄卷叶病毒)、乙型潜隐病毒属(Betacryptovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，白三叶潜隐病毒2(White clover cryptic virus 2))、乙型脂毛噬菌体属(Betalipothrixvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，冰岛硫化叶菌丝状病毒(Sulfolobus islandicus filamentous virus)以及酸菌丝状病毒3型(Acidianus filamentous virus 3))、β乳头瘤病毒(Betapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人乳头瘤病毒5(HPV-5)、HPV-9以及HPV-49)、
Betanodovirus、β逆转录病毒属(Betaretrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，小鼠乳腺瘤病毒、绵羊肺腺瘤病病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus)以及松鼠猴逆转录病毒)、β四体病毒属(Betatetravirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，松天蚕蛾β病毒(Nudaurelia capensis beta virus)、按树柞蚕病毒、刺蛾病毒、茸毒蛾β四体病毒
(Dasychirapudibunda virus)、尺夜蛾病毒(Pseudoplusia includes virus)以及纹夜蛾病毒(Trichoplusiani virus))、博卡病毒属(Bocavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛细小病毒(Bovine parvovirus)、人博卡病毒(Human bocavirus)以及犬细小病毒(Canine minute virus))、博尔纳病毒属(Bornavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，博尔纳病病毒以及禽博尔纳病毒(Avian Bornavirus))、茧蜂病毒属(Bracovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，柳毒蛾盘绒茧蜂病毒(Cotesia melanoscela
bracovirus))、短浓核病毒属(Brevidensovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，埃及伊蚊浓核病毒以及白纹伊蚊浓核病毒(AalDNV)、雀麦花叶病毒属(Bromovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus))、大麦黄化花叶病毒属(Bymovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，大麦黄花叶病毒、大麦轻度花叶病毒、燕麦花叶病毒以及水稻坏死花叶病毒)。发状病毒属(Capillovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，苹果凹茎病毒、樱桃病毒A(Cherry virus A)以及丁香花褪绿叶斑病毒(Lilac chlorotic leafspot virus))、山羊痘病毒属(Capripoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，绵羊痘病毒、山羊痘病毒以及皱皮病病毒)、心病毒属(Cardiovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，脑心肌炎病毒以及泰勒病毒(Theilovirus))、香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，香石竹潜隐病毒、大蒜普通潜隐病毒(Garlic common latent virus)、百合无症病毒(Lily symptomless virusm)、马铃薯M病毒以及葱潜隐病毒(Shallot latent virus))、香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，香石竹斑驳病毒)、花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，花椰菜花叶病毒)、木薯脉花叶病毒属(Cavemovirus)(该属中物种的实例包括 ，但不限于 ，木薯花叶病毒 )、衣原体微小噬菌体属
(Chlamydiamicrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，衣原体噬菌体1)，绿藻病毒属(Chlorovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，绿草履虫(Paramecium bursaria)病毒以及小球藻病毒)、绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，无脊椎动物虹彩病毒3型(Invertebrate iridescent virus 3))、青霉病毒属
(Chrysovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，产黄青霉病毒)、环病毒属
(Circovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、鸽圆环病毒以及天鹅圆环病毒)、长线形病毒属(Closterovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，甜菜黄化病毒(Beet yellows virus)、柑桔衰退病毒以及葡萄卷叶伴随病毒2型
(Grapevine leafroll-associated virus 2))、海洋球石藻病毒(Coccolithovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，赫氏圆石藻病毒86(Emiliania huxleyi virus 86))、科罗拉多蜱传染症病毒属(Coltivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，科洛拉多蜱热病毒以及欧洲Eyach病毒(European eyach virus))、豇豆花叶病毒属(Comovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，豇豆花叶病毒、菜豆荚斑点病毒、豇豆重花叶病毒、红三叶草斑驳病毒以及南瓜花叶病毒)、冠状病毒属(Coronavirus)、被盖病毒属(Corticovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，假交替单胞菌噬菌体PM2)、蟋蟀麻痹病毒属(Cripavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蟋蟀麻痹病毒)、南瓜花叶病毒属(Cucumovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，黄瓜花叶病毒、花生矮化病毒以及番茄不孕病毒)、曲顶病毒属(Curtovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，甜菜曲顶病毒(Beet curly top
virus)、甜菜轻度曲顶病毒(Beet mild curly top virus)、甜菜严重曲顶病毒(Beet severe curly top virus)以及辣根曲顶病毒(Horseradish curly top virus))、质型多角体病毒属(Cypovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，质型多角体病毒1型
(Cypovirus 1))、囊状病毒属(Cystovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，假单胞菌噬菌体phi6以及假单胞菌噬菌体Phi7至Phi14)、巨细胞病毒属(Cytomegalovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人巨细胞病毒、恒河猴疱疹病毒5型、恒河猴疱疹病毒8型以及猿疱疹病毒4型(Pongine herpesvirus 4))、胞内水稻黄矮炮弹病毒属(Cytorhabdovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，莴苣坏死黄化病毒以及北方谷物花叶病毒)、
Dainthovirus、丁型乳头瘤病毒属(Deltapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，欧洲麋鹿乳头瘤病毒、牛乳头瘤病毒1型、牛乳头瘤病毒2型以及鹿乳头瘤病毒)、δ逆转录病毒属(Deltaretrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛白血病病毒、人类T淋巴细胞病毒、人类T淋巴细胞白病毒2型、人类T淋巴细胞病毒3型以及猴T淋巴细胞病毒1型(Simian T-lymphotropic virus 1))、δ病毒属(Deltavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，丁型肝炎病毒)、浓核病毒属(Densovirus)、依赖病毒属(Dependovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，腺病毒相关病毒2型(Adeno-associated virus-2)、腺病毒相关病毒1型(Adeno-associated virus-1)以及鸭细小病毒)、埃博拉病毒属(Ebolavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，扎伊尔埃博拉病毒(Zaire ebolavirus)、雷斯顿埃博拉病毒(Reston ebolavirus)以及苏丹埃博拉病毒(Sudan ebolavirus))、豌豆耳突花叶病毒属(Enamovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，豌豆耳突花叶病毒1型(Peaenation mosaic virus-1))、肠道病毒属(Enterovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，脊髓灰质炎病毒(人类肠道病毒C血清型PV-1、PV-2、PV-3)、人柯萨奇病毒、人肠道病毒70型以及人鼻病毒A型(Human rhinovirus A))、昆虫双RNA病毒属(Entomobirnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，果蝇X病毒)、昆虫痘病毒A(Entomopoxvirus A)、昆虫痘病毒B
(Entomopoxvirus B)、昆虫痘病毒C(Entomopoxvirus C)、短暂热病毒属(Ephemerovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛流行热病毒以及贝里马病毒(Berrimah virus))、戊型乳头瘤病毒属(Epsilonpapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛乳头瘤病毒5型(Bovine papillomavirus 5))、ε反转录病毒属(Epsilonretrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒)、马鼻病毒属(Erbovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，乙型马鼻炎病毒1(Equine rhinitis B virus 1)以及乙型马鼻炎病毒2(Equine rhinitis B virus 2))、漂移病毒属(Errantivirus)、红病毒属
(Erythrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人细小病毒B19以及猴细小病毒
(Simian parvovirus))、庚型乳头瘤病毒属(Etapapillomavirus)、蚕豆萎蔫病毒属
(Fabavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蚕豆萎蔫病毒1(Broad bean wilt virus
1)、蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2)以及芝麻轻型花叶病毒(Lamium mild mosaic virus))、斐济病毒属(Fijivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，斐济病病毒、玉米粗缩病毒(Maize rough dwarf virus)、里奧夸尔托病毒(Mal de Rio Cuarto virus)、水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus)、燕麦不育矮缩病毒(Oat sterile dwarf virus)、褐飞虱呼肠孤病毒(Nilaparvata lugens reovirus)以及马唐矮化病毒(Pangola stunt virus))、黄病毒属(Flavivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，黄热病病毒、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、蜱媒脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、圣路易斯脑炎病毒
(St.louis encephalitis virus)以及墨累山谷脑炎病毒(Murray valley encephalitis virus))，凹陷病毒属(Foveavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus)、杏潜隐病毒(Apricot latent virus)以及沙地葡萄茎痘相关病毒(Rupestris steem pitting-associated virus))、微小纺锤形噬菌体属
(Fusellovirus)、丙型脂毛噬菌体属(Gammalipothrixvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，酸菌丝状病毒1型(Acidianus filamentous virus 1))、γ乳头瘤病毒属
(Gammapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人乳头瘤病毒4(HPV-4)、HPV-
48、HPV-50、HPV-60以及HPV-88)、γ逆转录病毒属(Gammaretrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，小鼠白血病病毒、猫白血病病毒、长臂猿白血病病毒(Gibbon ape
leukemia virus)以及异嗜性小鼠白血病病毒相关病毒(Xenotropic murine leukemia virus-related virus))、贾第鞭毛虫病毒属(Giardiavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，兰氏贾第鞭毛虫病毒)、颗粒体病毒属(Granulovirus)、小滴形病毒属
(Guttavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，新西兰硫化叶菌小滴形病毒
(Sulfolobus newzealandicus droplet-shaped virus))、环转病毒属(Gyrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鸡贫血病毒)、汉坦病毒属(Hantavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，汉坦病毒(Hantaan virus)、纽约病毒(New York virus)、普马拉病毒、辛诺柏病毒以及图拉病毒(Tula virus))、半病毒属(Hemivirus)、亨尼帕病毒属
(Henipavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，亨德拉病毒(Hendra virus)以及尼帕病(Nipah virus))、丙型肝炎病毒属(Hepacivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，丙型肝炎病毒)、肝DNA病毒属(Hepadnavirus)、肝病毒属(Hepatovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，甲型肝炎病毒、人甲型肝炎病毒以及猴甲型肝炎病毒)、低毒病毒属(Hypovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，栗疫菌低毒病毒1(Cryphonectria
hypovirus 1)、栗疫菌低毒病毒2(Cryphonectria hypovirus 2)、栗疫菌低毒病毒3
(Cryphonectria hypovirus 3)以及栗疫菌低毒病毒4(Cryphonectria hypovirus 4))、姬蜂病毒属(Ichnovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，发声齿唇姬蜂病毒
(Campoletis sonorensis ichnovirus))，鱼疱疹病毒属(Ictalurivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鮰类疱疹病毒1型(Ictalurid herpesvirus 1))、昆虫非包涵体病毒属(Idnoreovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，昆虫非包涵体病毒1型
(Idnoreovirus 1)：美丽姬蜂非包涵体病毒1型(Diadromus pulchellus idnoreovirus
1)、昆虫非包涵体病毒2型(Idnoreovirus 2)：镶颚姬蜂非包涵体病毒2型(Hyposoter exiguae idnoreovirus 2)、昆虫非包涵体病毒3型(Idnoreovirus 3)：家蝇非包涵体病毒3型(Musca domestica idnoreovirus 3)、昆虫非包涵体病毒4型(Idnoreovirus 4)：橄榄实蝇非包涵体病毒4型(Dacus oleae idnoreovirus 4)、昆虫非包涵体病毒5型
(Idnoreovirus 5)：地中海实蝇非包涵体病毒5型(Ceratitis capitata idnoreovirus 5)以及黑腹果蝇非包涵体病毒5型(Drosophila melanogaster idnoreovirus-5))、等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，烟草条纹病毒(Tobacco streak virus))、传喉炎病毒属(Iltovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，格利德原鸡属疱疹病毒1型(Gallid herpesvirus 1)以及鹦鹉疱疹病毒1型(Psittacid
herpesvirus 1))、甲型流感病毒属(Influenza A virus)(该属中物种的实例包括，但不限于，H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7以及H7N9。甲型流感病毒属/波多黎各/8/34H1N1(FLUAV)(Influenza A/Puerto Rico/8/34H1N1(FLUAV))、乙型流感病毒属(Influenza B virus)(该属中物种的实例包括，但不限于，乙型流感病毒/Lee/1940(FLUBV)(Influenza B/Lee/1940(FLUBV))、丙型流感病毒属(Influenza C virus)(该属中物种的实例包括，但不限于，丙型流感病毒/加利福尼亚/78(FLUCV)(Influenza C/
California/78(FLUCV))、丝状病毒属(Inovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，肠杆菌噬菌体M13以及假单胞菌噬菌体Pf1)、壬型乳头瘤病毒属(Iotapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，多乳鼠乳头瘤病毒(Mastomys natalensis
papillomavirus))、甘薯病毒属(Ipomovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，甘薯轻型斑驳病毒以及黄瓜脉黄化病毒)、虹彩病毒属(Iridovirus)，鲑传贫病毒属(Isavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，传染性鲑鱼贫血病毒(Infectious salmon anemia virus))、艾特拉病毒属(Iteravirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，家蚕浓核病毒5型(Bombyx mori densovirus 5)、家蚕浓核病毒1型(Bombyx mori densovirus 1)以及新刺峨浓核病毒(Casphalia extranea densovirus))、κ乳头瘤病毒属(Kappa
papillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，白尾棕色兔乳头状瘤病毒
(Cottontail rabbit papillomavirus)、以及兔口腔乳头瘤病毒(Rabbit oral
papillomavirus))、嵴病毒(Kobuvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，爱知病毒(Aichi virus)以及牛嵴病毒属(Bovine kobuvirus))、兔病毒属(Lagovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，兔出血病病毒)、λ乳头瘤病毒属(Lambdapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，犬口腔乳头状瘤病毒)、利什曼原虫病毒属(Leishmaniavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，利什曼原虫RNA病毒1-1型(LRV-1-1)至(LRV-1-12)以及利什曼原虫RNA病毒2-1型)、慢病毒属(Lentivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、HIV-2、猴免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒以及猫免疫缺陷病毒)、粘液瘤亚群病毒属(Leporipoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，粘液瘤病毒(Myxoma virus)、野兔纤维瘤病毒(Hare fibroma virus)、兔纤维瘤病毒以及松鼠纤维瘤病毒)、轻小噬菌体属(Levivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，肠杆菌噬菌体MS2、肠杆菌噬菌体BZ13、肠杆菌噬菌体以及肠杆菌噬菌体MS2)、黄症病毒属(Luteovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，大麦黄矮病毒-PAV、大麦黄矮病毒-MAV、大麦黄矮病毒-PAS、豆卷叶病毒(Bean leafroll virus)以及大豆矮缩病毒)、淋巴隐伏病毒属
(Lymphocryptovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人疱疹病毒4型(EB病毒)、恒河猴疱疹病毒12型(Cercopithecine herpesvirus 12)、恒河猴疱疹病毒14型、恒河猴疱疹病毒15型、猿疱疹病毒1型、猿疱疹病毒2型以及猿疱疹病毒3型)、淋巴囊肿病毒属
(Lymphocystivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，淋巴囊肿病病毒1型)、狂犬病病毒属(Lyssavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，狂犬病病毒、莫科拉病毒以及杜文黑基病毒)、玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，玉米褪绿斑驳病毒)、橙桑花叶病毒属(Macluravirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，橙桑花叶病毒)、斑点病毒属(Maculavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，葡萄斑点病毒)、星状病毒属(Mamastrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人星状病毒、牛星状病毒、猫星状病毒、水貂星状病毒、绵羊星状病毒以及猪星状病毒)、柑橘病毒属
(Mandarivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，印度柑橘环斑病毒)、玉米雷亚朵非纳病毒属(Marafivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，玉米雷亚多非纳病毒、燕麦蓝矮病毒以及百慕大草蚀线病毒)、马尔堡病毒属(Marburgvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，维多利亚湖马尔堡病毒)、马立克病毒属(Mardivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，禽疱疹病毒2型(Gallid herpesvirus 2)、禽疱疹病毒3型以及吐绶鸡疱疹病毒1型(Meleagrid herpesvirus 1))、海洋RNA病毒属(Marnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，赤潮异弯藻RNA病毒(Heterosigma akashiwo RNA virus)、裂殖壶菌单链RNA病毒(Schizochytrium single-stranded RNA virus)、海洋RNA病毒JP-A以及海洋RNA病毒JP-B)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人腺病毒C型、人腺病毒A型、人腺病毒B型、人腺病毒D型、人腺病毒E型以及人腺病毒F)、玉米线条病毒属(Mastrevirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，玉米条纹病毒、菜豆黄矮病毒、虎尾草条点花叶病毒(Chloris striate mosaic virus)、马唐线条病毒(Digitaria streak virus)、芒属线条病毒(Miscanthus streak virus)、烟草黄矮病毒以及小麦矮缩病毒)、肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney Necrosis virus))、偏肺病毒属(Metapneumovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus)以及人偏肺病毒)、转座病毒属(Metavirus)、微小噬菌体属(Microvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，肠杆菌噬菌体PhiX174)、线粒体病毒属(Mitovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，栗疫病菌线粒体病毒1型(Cryphonectria mitovirus 1)以及长喙壳线粒体病毒3A型(Ophiostoma mitovirus 3A))、软疣痘病毒属(Molluscipoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，接触传染性软疣病毒(Molluscum contagiosum virus))、麻疹病毒属
(Morbillivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫病毒)，μ乳头瘤病毒属(Mupapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人乳头瘤病毒1型)、鼠巨细胞病毒属(Muromegalovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，小鼠疱疹病毒1型以及小鼠疱疹病毒2型)、真菌呼肠孤病毒属(Mycoreovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，真菌呼肠孤病毒1型(mycoreovirus 1)：栗疫病菌呼肠孤病毒1型(Cryphonectria parasitica mycoreovirus-1)以及真菌呼肠孤病毒3型：褐座坚壳呼肠孤病毒3型(Rosellinia necatrix mycoreovirus-3))、内罗病毒属(sNairovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，达格毕病毒(Dugbe virus)以及克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus))、矮化病毒属(Nanovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，地三叶草矮化病毒(Subterranean clover stunt virus)、蚕豆坏死黄化病毒(Faba bean necrotic yellows virus)以及紫云英矮缩病毒(Milk vetch dwarf virus))、裸露RNA病毒属(Narnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，酿酒酵母20S RNA裸露RNA病毒(Saccharomyces cerevisiae narnavirus 20S)以及酿酒酵母23S RNA裸露RNA病毒(Saccharomyces 23S RNA narnavirus))、坏死病毒属(Necrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，烟草坏死病毒)、线虫传多角体病毒属(Nepovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，烟草环斑病毒、葡萄扇叶病毒、甜菜环斑病毒以及黑加仑逆转病毒(Blackcurrant reversion virus))、诺如病毒属(Norovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，诺瓦克病毒(Norwalk virus)、洛兹达雷病毒(Lordsdale virus)以及南安普敦病毒(Southampton virus))、粒外弹状病毒属(Novirhabdovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，传染性造血组织坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus)以及黑鱼病毒(Snakehead virus))、核型多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus)、核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马铃薯黄矮病毒以及玉米花叶病毒(Maize mosaic virus))、寅型乳头瘤病毒属(Nupapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人乳头瘤病毒41型)，头甲病毒属(Okavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鳃相关病毒(Gill-associated virus)以及黄头病毒)、油橄榄病毒属
(Oleavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，油橄榄潜隐病毒2型)、ω四体病毒属(Omegatetravirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，松天蚕蛾ω病毒(Nudaurelia capensis omega virus)、棉铃虫矮化病毒(Helicoverpa armigera stunt virus)以及马尾松毛虫病毒(Dendrolimus punctatus virus))、辰型乳头瘤病毒属
(Omikronpapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，棘鳍海豚乳头瘤病毒
(Phocoena spinipinnispapillomavirus))、环状病毒(Orbivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蓝舌病毒(Bluetongue virus)以及非洲马疫病毒、及动物流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus))、正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，布尼安维拉病毒(Bunyamwera virus)、拉克罗斯病毒(La Crosse virus)以及施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus))、正嗜肝DNA病毒属
(Orthohepadnavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，乙型肝炎病毒)、正痘病毒属(Orthopoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛痘病毒(Vaccinia virus)、牛痘病毒(Cowpox virus)、马痘病毒、猴痘病毒以及天花病毒)、正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，哺乳动物正呼肠孤病毒、禽正呼肠孤病毒(Avian orthoreovirus)、尼尔森湾正呼肠孤病毒(Nelson Bay orthoreovirus)、狒狒正呼肠孤病毒(Baboon orthoreovirus)以及爬虫正呼肠病毒(Reptilian orthoreovirus))、水稻病毒属(Oryzavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，水稻齿叶矮化病毒以及裨草齿叶矮缩病毒(Echinochloa ragged stunt virus))、黍花叶病毒属(Panicovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，稷子花叶病毒)、副痘病毒属(Parapoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，传染性脓疱病毒(Orf virus)、牛丘疹性口炎病毒、假牛痘病毒以及松鼠副痘病毒(Squirrel parapoxvirus))、双埃克病毒属(Parechovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人双埃克病毒1型(Human parechovirus 1)(以前为埃克病毒22型)、人双埃克病毒2型(HPeV-2)(以前为埃克病毒23型)、人双埃克病毒3型(HPeV-3)以及永贝里病毒
(Ljungan virus))、分病毒属(Partitivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，艾特金菌病毒(Atkinsonella Hypoxylon virus))、细小病毒属(Parvovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，鼠细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、小鼠细小病毒1型以及LuIII病毒(LuIII virus))、环星黑烟浓稠病毒属(Pefudensovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa densovirus)以及家蟋蟀浓核病毒
(Acheta domesticus densovirus))、瘟疫病毒属(Pestivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛腹泻病毒1型(Bovine diarrhea virus 1)、牛腹泻病毒2型、边境疾病病毒以及经典猪瘟病毒(Classical swine fever virus))、碧冬茄病毒属(Petuvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，碧冬茄脉明病毒(Petunia vein clearing virus))、褐藻病毒属(Phaeovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，长囊水云病毒1型(Ectocarpus
siliculosus virus 1))、白蛉病毒属(Phlebovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，裂谷热病毒(Rift valley fever virus)、尤尤库尼米病毒(Uukuniemi virus)以及庞塔托鲁白蛉病毒(Punta toro phlebovirus))、植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，伤瘤病毒(Wound tumor virus)、水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus)、水稻瘿矮病毒(Ricegall dwarf virus)以及烟草叶耳突植物呼肠孤病毒(Tobacco leaf enation phytoreovirus))、巳型乳头瘤病毒属(Pipapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，仓鼠口腔乳头瘤病毒(Hamster oral papillomavirus)以及褐家鼠乳头瘤病毒1型(Rattus norvegicus papillomavirus 1))、芽生病毒属(Plasmavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，无胆甾原体L2噬菌体(Acholeplasma phage L2))、短杆状噬菌体属(Plectrovi)(该属中物种的实例包括，但不限于，无胆甾原体噬菌体L51
(Acholeplasma phage L51))、肺炎病毒属(Pneumovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人呼吸道合胞病毒以及牛呼吸道合胞病毒)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马铃薯卷叶病毒、西部甜菜黄化病毒以及谷物黄矮病毒)、多瘤病毒属(Polyomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猿猴病毒40、BK多瘤病毒(BK polyomavirus)、默克尔细胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus)、鹦鹉幼雏病病毒(Budgerigar fledgling disease polyomavirus)、牛多瘤病毒(Bovine polyomavirus)、JC多瘤病毒(JC polyomavirus)以及鼠多瘤病毒)、马铃薯X病毒属(Potexvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马铃薯X病毒、三叶草黄花叶病毒以及兰花花叶病毒)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马铃薯Y病毒、甜菜花叶病毒、三叶草黄叶脉病毒、洋李痘疱病毒(Plum pox virus)、马铃薯A病毒以及烟草脉斑驳病毒
(Tobaccovein mottling virus))、青绿藻病毒属(Prasinovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，细小微单胞藻病毒SP1(Micromonas pusilla virus SP1))、金藻病毒属(Prymnesiovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，短丝金藻病毒PW1
(Chrysochromulina brevifilum virus PW1))、假病毒属(Pseudovirus)、蛙病毒属
(Ranavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蛙病毒3型)、针胞藻病毒属
(Raphidovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，赤潮异弯藻病毒01型(Heterosigma akashiwo virus 01))、呼吸道病毒属(Respirovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，仙台病毒(Sendai virus)以及猴病毒10型(Simian virus 10))、疱疹病毒属
(Rhadinovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猿猴疱疹病毒2型(Saimiriine
herpesvirus 2)、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated
herpesvirus)、牛疱疹病毒4型、马疱疹病毒2型以及鼠疱疹病毒4型(Murid herpesvirus
4))、鼻病毒属(Rhinovirus)、玫瑰疹病毒属(Roseolovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人疱疹病毒6A型、人疱疹病毒7型以及人疱疹病毒6B型)、轮状病毒属(Rotavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，轮状病毒A型至轮状病毒G型)、风疹病毒属(Rubivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，风疹病毒)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，腮腺炎病毒以及马普埃拉病毒(Mapuera virus))、古噬菌体属(Rudivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，冰岛硫化叶菌杆状病毒1型(Sulfolobus islandicus rod-shaped virus 1)以及冰岛硫化叶菌杆状病毒2型)、黑麦草花叶病毒属(Rymovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，黑麦草花叶病毒)、札幌病毒(Sapovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，札幌病毒(Sapporo virus))、东南亚十二节段RNA病毒属(Seadornavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，版纳病毒(Banna virus)、卡迪皮羅病毒(Kadipiro virus)以及辽宁病毒(Liao ning virus))、伴生病毒属(Sequivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，欧洲防风黄点病毒(Parsnip yellow fleck virus)、蒲公英黄花叶病毒(Dandelion yellow mosaic sequivirus)以及莴苣斑驳病毒(Lettuce mottle virus))、唾液酸酶腺病毒属(Siadenovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，蛙腺病毒以及火鸡腺病毒A型)、单纯疱疹病毒属(Simplexvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人疱疹病毒1型、人疱疹病毒2型以及牛疱疹病毒2型)、大豆褪绿斑驳病毒属(Soymovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，大豆褪绿斑驳病毒、蓝莓红环斑病毒以及花生褪绿条纹病毒)、螺旋体微小噬菌体属(Spiromicrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，螺旋体噬菌体4型)、泡沫病毒属(Spumavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猴泡沫病毒、牛泡沫病毒以及猫泡沫病毒)、猪痘病毒属(Suipoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猪痘病毒)、复层噬菌体属(Tectivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，肠杆菌噬菌体PRD1、芽孢杆菌噬菌体AP50、芽孢杆菌噬菌体Bam35以及栖热菌噬菌体P17-14)、捷申病毒属(Teschovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猪捷申病毒1型(PTV-1)至PTV-11)、辛型乳头瘤病毒属(Thetapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，非洲灰鹦鹉乳头瘤病毒(Psittacus erithacus timneh papillomavirus))、索戈托病毒属(Thogotovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，索戈托病毒(Thogoto virus)以及多理病毒(Dhori virus))、番茄丛矮病毒属(Tombusvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，番茄丛矮病毒以及香石竹意大利环斑病毒(Carnation Italian ringspot virus))、番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，番茄伪曲项病毒(Tomato pseudo-curly top virus))、环曲病毒属(Torovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马环曲病毒(Equine Torovirus)、人环曲病毒(Human torovirus)以及布雷达病毒(Breda virus))、番茄斑萎病毒属(Tospovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，番茄斑萎病毒)、全病毒属(Totivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，酿酒酵母病毒L-A、酿酒酵母病毒L-BC以及玉蜀黍黑菌病毒H1)、发状病毒属(Trichovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，苹果褪绿叶斑病毒、樱桃叶斑点病毒、葡萄浆果内坏死病毒(Grapevine berry inner necrosis virus)以及桃花叶病毒(Peach mosaic virus))、花叶病毒属(Tritimovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，小麦线条花叶病毒)、东格鲁病毒属(Tungrovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，水稻东格鲁杆状病毒(Rice tungro bacilliform virus))、芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，芜菁黄花叶病毒、安第斯马铃薯潜伏病毒(Andean potato latent virus)、颠茄斑驳病毒(Belladonna mottle virus)以及可可树黄花叶病毒)、水痘病毒属
(Varicellovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，人疱疹病毒3型(水痘-带状疮疹病毒)、牛疱疹病毒1型、牛疱疹病毒5型以及猪疱疹病毒1型(Suid herpesvirus 1))，水疱性病毒属(Vesiculovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，疱疹性口炎、印第安那病毒(Indiana virus)、科卡尔病毒(Cocal virus)、马拉巴病毒(Maraba virus)以及皮理病毒(Piry virus))、水疱疹病毒属(Vesivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，猪水疱疹病毒(Vesicular exanthema of swine virus))、葡萄病毒属(Vitivirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，葡萄病毒A型(Grapevine virus A)、葡萄病毒B型、葡萄病毒D型以及独活潜隐病毒(Heracleum latent virus))、矮化病毒属(Waikavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，水稻东格鲁球形病毒以及玉米褪绿矮缩病毒)、白点病毒属(Whispovirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，白斑综合症病毒1型)、卯型乳头瘤病毒属
(Xipapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，牛乳头瘤病毒3型、牛乳头瘤病毒
4型以及牛乳头瘤病毒6型)、亚塔痘病毒属(Yatapoxvirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，亚巴猴肿瘤病毒(Yaba monkey tumor virus)以及塔纳痘病毒(Tanapox virus))或己型乳头瘤病毒属(Zetapapillomavirus)(该属中物种的实例包括，但不限于，马人乳头瘤病毒1型(Equine papillomavirus 1))。
[0078] 可与本文提供的方法一起使用的两种不同病毒的重组的非限制性实例包括，但不限于在毒株内，在物种内至少两种不同毒株之间，在亚种内至少两种不同物种之间，在科内至少两种不同亚种之间，在属内至少两种不同科之间或在至少两种不同属之间的重组。在至少两个属之间的重组的非限制性实例包括，例如在以下之间的重组：流感病毒属和苜蓿花叶病毒属、流感病毒属和青葱病毒属、流感病毒属和异轻小噬菌体属、流感病毒属和α潜隐病毒属、流感病毒属和甲型脂毛噬菌体属、流感病毒属和Alphanodoavirus、流感病毒属和α乳头瘤病毒属、流感病毒属和α逆转录病毒属、流感病毒属和甲病毒属、流感病毒属和阿留申貂病毒属、流感病毒属和葡萄卷叶病毒属、流感病毒属和口蹄疫病毒属、流感病毒属和水生双RNA病毒属、流感病毒属和水生呼肠孤病毒属、流感病毒属和沙粒病毒属、流感病毒属和动脉炎病毒属、流感病毒属和囊泡病毒属、流感病毒属和Asfivirus、流感病毒属和富AT腺病毒属、流感病毒属和黄金葛病毒属、流感病毒属和禽星状病毒属、流感病毒属和燕麦病毒属、流感病毒属和禽腺病毒属、流感病毒属和禽双RNA病毒属、流感病毒属和禽嗜肝DNA病毒属、流感病毒属和禽痘病毒属、流感病毒属和禽腮腺炎病毒属、流感病毒属和香蕉顶束病毒属、流感病毒属和杆状DNA病毒属、流感病毒属和杆状RNA病毒属、流感病毒属和蛭弧菌微小噬菌体属、流感病毒属和菜豆金黄花叶病毒属、流感病毒属和乙型潜隐病毒属、流感病毒属和乙型脂毛噬菌体属、流感病毒属和Betanodovirus、流感病毒属和β乳头瘤病毒、流感病毒属和β逆转录病毒属、流感病毒属和β四体病毒属、流感病毒属和博卡病毒属、流感病毒属和博尔纳病毒属、流感病毒属和茧蜂病毒属、流感病毒属和短浓核病毒属、流感病毒属和雀麦花叶病毒属、流感病毒属和大麦黄化花叶病毒属、流感病毒属和发状病毒属、流感病毒属和山羊痘病毒属、流感病毒属和心病毒属、流感病毒属和香石竹潜隐病毒属、流感病毒属和香石竹斑驳病毒属、流感病毒属和花椰菜花叶病毒属、流感病毒属和木薯脉花叶病毒属、流感病毒属和衣原体微小噬菌体属、流感病毒属和绿藻病毒属、流感病毒属和绿虹彩病毒属、流感病毒属和青霉病毒属、流感病毒属和环病毒属、流感病毒属和长线形病毒属、流感病毒属和海洋球石藻病毒属、流感病毒属和科罗拉多蜱传染症病毒属、流感病毒属和豇豆花叶病毒属、流感病毒属和冠状病毒属、流感病毒属和被盖病毒属、流感病毒属和蟋蟀麻痹病毒属、流感病毒属和南瓜花叶病毒属、流感病毒属和曲顶病毒属、流感病毒属和质型多角体病毒属、流感病毒属和囊状病毒属、流感病毒属和巨细胞病毒属、流感病毒属和胞内水稻黄矮炮弹病毒属、流感病毒属和Dainthovirus、流感病毒属和丁型乳头瘤病毒属、流感病毒属和δ逆转录病毒属、流感病毒属和δ病毒属、流感病毒属和浓核病毒属、流感病毒属和依赖病毒属、流感病毒属和埃博拉病毒属、流感病毒属和豌豆耳突花叶病毒属、流感病毒属和肠道病毒属、流感病毒属和昆虫双RNA病毒属、流感病毒属和昆虫痘病毒A、流感病毒属和昆虫痘病毒B、流感病毒属和昆虫痘病毒C、流感病毒属和短暂热病毒属、流感病毒属和戊型乳头瘤病毒属、流感病毒属和ε反转录病毒属、流感病毒属和马鼻病毒属、流感病毒属和漂移病毒属、流感病毒属和红病毒属、流感病毒属和庚型乳头瘤病毒属、流感病毒属和蚕豆萎蔫病毒属、流感病毒属和斐济病毒属、流感病毒属和黄病毒属、流感病毒属和凹陷病毒属、流感病毒属和微小纺锤形噬菌体属、流感病毒属和丙型脂毛噬菌体属、流感病毒属和γ乳头瘤病毒属、流感病毒属和γ逆转录病毒属、流感病毒属和贾第鞭毛虫病毒属、流感病毒属和颗粒体病毒属、流感病毒属和小滴形病毒属、流感病毒属和环转病毒属、流感病毒属和汉坦病毒属、流感病毒属和半病毒属、流感病毒属和亨尼帕病毒属、流感病毒属和丙型肝炎病毒属、流感病毒属和肝DNA病毒属、流感病毒属和肝病毒属、流感病毒属和低毒病毒属、流感病毒属和姬蜂病毒属、流感病毒属和鱼疱疹病毒属、流感病毒属和昆虫非包涵体病毒属、流感病毒属和等轴不稳环斑病毒属、流感病毒属和传喉炎病毒属、流感病毒属和甲型流感病毒属、流感病毒属和乙型流感病毒属、流感病毒属和丙型流感病毒属、流感病毒属和丝状病毒属、流感病毒属和壬型乳头瘤病毒属、流感病毒属和甘薯病毒属、流感病毒属和虹彩病毒属、流感病毒属和鲑传贫病毒属、流感病毒属和艾特拉病毒属、流感病毒属和κ乳头瘤病毒属、流感病毒属和嵴病毒属、流感病毒属和兔病毒属、流感病毒属和λ乳头瘤病毒属、流感病毒属和利什曼原虫病毒属、流感病毒属和慢病毒属、流感病毒属和粘液瘤亚群病毒属、流感病毒属和轻小噬菌体属、流感病毒属和黄症病毒属、流感病毒属和淋巴隐伏病毒属、流感病毒属和淋巴囊肿病毒属、流感病毒属和狂犬病病毒属、流感病毒属和玉米褪绿斑驳病毒属、流感病毒属和橙桑花叶病毒属、流感病毒属和斑点病毒属、流感病毒属和星状病毒属、流感病毒属和柑橘病毒属、流感病毒属和玉米雷亚朵非纳病毒属、流感病毒属和马尔堡病毒属、流感病毒属和马立克病毒属、流感病毒属和海洋RNA病毒属、流感病毒属和哺乳动物腺病毒属、流感病毒属和玉米线条病毒属、流感病毒属和肿大细胞病毒属、流感病毒属和偏肺病毒属、流感病毒属和转座病毒属、流感病毒属和微小噬菌体属、流感病毒属和线粒体病毒属、流感病毒属和软疣痘病毒属、流感病毒属和麻疹病毒属、流感病毒属和μ乳头瘤病毒属、流感病毒属和鼠巨细胞病毒属、流感病毒属和真菌呼肠孤病毒属、流感病毒属和内罗病毒属、流感病毒属和矮化病毒属、流感病毒属和裸露RNA病毒属、流感病毒属和坏死病毒属、流感病毒属和线虫传多角体病毒属、流感病毒属和诺如病毒属、流感病毒属和粒外弹状病毒属、流感病毒属和核型多角体病毒属、流感病毒属和核型弹状病毒属、流感病毒属和寅型乳头瘤病毒属、流感病毒属和头甲病毒属、流感病毒属和油橄榄病毒属、流感病毒属和ω四体病毒属、流感病毒属和辰型乳头瘤病毒属、流感病毒属和环状病毒、流感病毒属和正布尼亚病毒属、流感病毒属和正嗜肝DNA病毒属、流感病毒属和正痘病毒属、流感病毒属和正呼肠孤病毒属、流感病毒属和水稻病毒属、流感病毒属和黍花叶病毒属、流感病毒属和副痘病毒属、流感病毒属和双埃克病毒属、流感病毒属和分病毒属、流感病毒属和细小病毒属、流感病毒属和环星黑烟浓稠病毒属、流感病毒属和瘟疫病毒属、流感病毒属和碧冬茄病毒属、流感病毒属和褐藻病毒属、流感病毒属和白蛉病毒属、流感病毒属和植物呼肠孤病毒属、流感病毒属和巳型乳头瘤病毒属、流感病毒属和芽生病毒属、流感病毒属和短杆状噬菌体属、流感病毒属和肺炎病毒属、流感病毒属和马铃薯卷叶病毒属、流感病毒属和多瘤病毒属、流感病毒属和马铃薯X病毒属、流感病毒属和马铃薯Y病毒属、流感病毒属和青绿藻病毒属、流感病毒属和金藻病毒属、流感病毒属和假病毒属、流感病毒属和蛙病毒属、流感病毒属和针胞藻病毒属、流感病毒属和呼吸道病毒属、流感病毒属和疱疹病毒属、流感病毒属和鼻病毒属、流感病毒属和玫瑰疹病毒属、流感病毒属和轮状病毒属、流感病毒属和风疹病毒属、流感病毒属和腮腺炎病毒属、流感病毒属和古噬菌体属、流感病毒属和黑麦草花叶病毒属、流感病毒属和札幌病毒、流感病毒属和东南亚十二节段RNA病毒属、流感病毒属和伴生病毒属、流感病毒属和唾液酸酶腺病毒属、流感病毒属和单纯疱疹病毒属、流感病毒属和大豆褪绿斑驳病毒属、流感病毒属和螺旋体微小噬菌体属、流感病毒属和泡沫病毒属、流感病毒属和猪痘病毒属、流感病毒属和复层噬菌体属、流感病毒属和捷申病毒属、流感病毒属和辛型乳头瘤病毒属、流感病毒属和索戈托病毒属、流感病毒属和番茄丛矮病毒属、流感病毒属和番茄伪曲顶病毒属、流感病毒属和环曲病毒属、流感病毒属和番茄斑萎病毒属、流感病毒属和全病毒属、流感病毒属和发状病毒属、流感病毒属和花叶病毒属、流感病毒属和东格鲁病毒属、流感病毒属和芜菁黄花叶病毒属、流感病毒属和水痘病毒属、流感病毒属和水疱性病毒属、流感病毒属和水疱疹病毒属、流感病毒属和葡萄病毒属、流感病毒属和矮化病毒属、流感病毒属和白点病毒属、流感病毒属和卯型乳头瘤病毒属、流感病毒属和亚塔痘病毒属或流感病毒属和己型乳头瘤病毒属。
[0079] 感染的细胞可来自原核细胞。可与本公开内容一起使用的原核细胞的实例包括但不限于：炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus aureus)(MRSA)、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(Methicillin-Sensitive Staphylococcus
Aureus)(MSSA)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(MTB)。其他细菌细胞包括，但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属
(Shigella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、鸟胞内分枝杆菌(Mycobacterium aviumintracellulare)、耶尔森菌(Yersinia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、巴氏杆菌(Pasteurella)、布鲁氏菌(Brucella)、梭状芽胞杆菌
(Clostridia)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、类杆菌属(Bacteroides)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、B溶血链球菌(B-Hemolytic strep.)、棒状杆菌(Corynebacteria)、军团菌属(Legionella)、支原体属(Mycoplasma)、脲原体属(Ureaplasma)、衣原体(Chlamydia)、淋病奈瑟氏菌
(Neisseriagonorrhea)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)、流感嗜血杆菌
(Hemophilus influenza)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、梅毒螺旋体(Treponema palladium)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、回归热包柔氏螺旋体(Borrelia recurrentis)、立克次体病原体(Rickettsial pathogens)、诺卡氏菌属(Nocardia)和放线菌(Acitnomycetes)。
Aureus)(MSSA)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(MTB)。其他细菌细胞包括，但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属
(Shigella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、鸟胞内分枝杆菌(Mycobacterium aviumintracellulare)、耶尔森菌(Yersinia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、巴氏杆菌(Pasteurella)、布鲁氏菌(Brucella)、梭状芽胞杆菌
(Clostridia)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、类杆菌属(Bacteroides)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、B溶血链球菌(B-Hemolytic strep.)、棒状杆菌(Corynebacteria)、军团菌属(Legionella)、支原体属(Mycoplasma)、脲原体属(Ureaplasma)、衣原体(Chlamydia)、淋病奈瑟氏菌
(Neisseriagonorrhea)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)、流感嗜血杆菌
(Hemophilus influenza)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、梅毒螺旋体(Treponema palladium)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、回归热包柔氏螺旋体(Borrelia recurrentis)、立克次体病原体(Rickettsial pathogens)、诺卡氏菌属(Nocardia)和放线菌(Acitnomycetes)。
[0080] 可与本公开内容一起使用的寄生虫包括，但不限于：疟原虫，恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、疟疾疟原虫(Plasmodium malaria)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、诺氏疟原虫(P.knowlesi)、旋盘尾丝虫
(Onchoverva volvulus)、利什曼原虫(Leishmania)、锥虫属物种(Trypanosoma spp.)、血吸虫属物种(Schistosoma spp.)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、隐孢子虫属(Cryptosporidum)、贾第虫属物种(Giardia spp.)、滴虫属物种(Trichimonas spp.)、结肠小袋绦虫(Balatidium coli)、班氏丝虫(Wuchereria bancrofti)、弓形虫属物种
(Toxoplasma spp.)、蛲虫(Enterobius vermicularis)、蛔虫(Ascaris lumbricoides)、鞭虫(Trichuris trichiura)、麦地那龙线虫(Dracunculus medinesis)、吸虫(trematodes)、阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)、带绦虫属物种(Taenia spp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)以及美洲板口线虫(Necator americanis)。
(Onchoverva volvulus)、利什曼原虫(Leishmania)、锥虫属物种(Trypanosoma spp.)、血吸虫属物种(Schistosoma spp.)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、隐孢子虫属(Cryptosporidum)、贾第虫属物种(Giardia spp.)、滴虫属物种(Trichimonas spp.)、结肠小袋绦虫(Balatidium coli)、班氏丝虫(Wuchereria bancrofti)、弓形虫属物种
(Toxoplasma spp.)、蛲虫(Enterobius vermicularis)、蛔虫(Ascaris lumbricoides)、鞭虫(Trichuris trichiura)、麦地那龙线虫(Dracunculus medinesis)、吸虫(trematodes)、阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)、带绦虫属物种(Taenia spp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)以及美洲板口线虫(Necator americanis)。
[0081] 在一些应用中，样品包含约1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种、41种、42种、43种、44种、45种、46种、47种、48种、49种、50种、51种、52种、53种、54种、55种、56种、57种、58种、59种、60种、61种、62种、63种、64种、65种、66种、67种、68种、69种、70种、71种、72种、73种、74种、75种、76种、77种、78种、79种、80种、81种、82种、83种、84种、85种、86种、87种、88种、89种、90种、91种、92种、93种、94种、95种、96种、97种、98种、99种、100种、200种、
300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、
6000种、7000种、8000种、9000种、10,000种、20,000种、30,000种、40,000种、50,000种、60,
000种、70,000种、80,000种、90,000种或100,000不同的病毒物种。在一些实施方案中，样品包含约1种至约10种、约10种至约100种、约10种至约1000种、约100种至约1000种、约100种至约10,000种、约1000种至10,000种、约10,000种至约50,000种或约10,000种至约100,000种不同的病毒物种。
300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、
6000种、7000种、8000种、9000种、10,000种、20,000种、30,000种、40,000种、50,000种、60,
000种、70,000种、80,000种、90,000种或100,000不同的病毒物种。在一些实施方案中，样品包含约1种至约10种、约10种至约100种、约10种至约1000种、约100种至约1000种、约100种至约10,000种、约1000种至10,000种、约10,000种至约50,000种或约10,000种至约100,000种不同的病毒物种。
[0082] 在一些应用中，样品包含约1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种、41种、42种、43种、44种、45种、46种、47种、48种、49种、50种、51种、52种、53种、54种、55种、56种、57种、58种、59种、60种、61种、62种、63种、64种、65种、66种、67种、68种、69种、70种、71种、72种、73种、74种、75种、76种、77种、78种、79种、80种、81种、82种、83种、84种、85种、86种、87种、88种、89种、90种、91种、92种、93种、94种、95种、96种、97种、98种、99种、100种、200种、
300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、
6000种、7000种、8000种、9000种、10,000种、20,000种、30,000种、40,000种、50,000种、60,
000种、70,000种、80,000种、90,000种或100,000种不同的病毒亚种。在一些实施方案中，样品包含约10种至约100种、约10种至约1000种、约100种至约1000种、约100种至约10,000种、约1000种至10,000种、约10,000种至约50,000种或约10,000种至约100,000种不同的病毒亚种。
300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、
6000种、7000种、8000种、9000种、10,000种、20,000种、30,000种、40,000种、50,000种、60,
000种、70,000种、80,000种、90,000种或100,000种不同的病毒亚种。在一些实施方案中，样品包含约10种至约100种、约10种至约1000种、约100种至约1000种、约100种至约10,000种、约1000种至10,000种、约10,000种至约50,000种或约10,000种至约100,000种不同的病毒亚种。
[0083] 在一些应用中，样品包含约1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种、41种、42种、43种、44种、45种、46种、47种、48种、49种、50种、51种、52种、53种、54种、55种、56种、57种、58种、59种、60种、61种、62种、63种、64种、65种、66种、67种、68种、69种、70种、71种、72种、73种、74种、75种、76种、77种、78种、79种、80种、81种、82种、83种、84种、85种、86种、87种、88种、89种、90种、91种、92种、93种、94种、95种、96种、97种、98种、99种、100种、200种、
300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、
6000种、7000种、8000种、9000种、10,000种、20,000种、30,000种、40,000种、50,000种、60,
000种、70,000种、80,000种、90,000种或100,000种不同的病毒毒株。在一些实施方案中，样品包含约10种至约100种、约10种至约1000种、约100种至约1000种、约100种至约10,000种、约1000种至10,000种、约10,000种至约50,000种或约10,000种至约100,000种不同的病毒毒株。
300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、
6000种、7000种、8000种、9000种、10,000种、20,000种、30,000种、40,000种、50,000种、60,
000种、70,000种、80,000种、90,000种或100,000种不同的病毒毒株。在一些实施方案中，样品包含约10种至约100种、约10种至约1000种、约100种至约1000种、约100种至约10,000种、约1000种至10,000种、约10,000种至约50,000种或约10,000种至约100,000种不同的病毒毒株。
[0084] 在一些实施方案中，将被本文公开的方法、系统和试剂盒分析的基因组中的靶病毒可包含在小滴隔室内的约，多于约，少于约，或至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、500个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10,000个、20,000个、30,000个、40,000个、50,000个、60,000个、70,000个、80,000个、
90,000个或100,000个分子标志物或遗传变异。在一些实施方案中，将被分析的靶的数目是小滴隔室内的约2个至约5个、约2个至约10个、约2个至约20个、约2个至约30个、约2个至约
40个、约2个至约50个、约2个至约100个、约5个至约10个、约5个至约25个、约5个至约50个、约5个至约100个、约10个至约20个、约10个至约50个、约10个至约100个、约25个至约50个、约25个至约75个、约25个至约100个、约100个至约200个、约100个至约500个、约100个至约
1000个、约500个至约1000个、约1000个至约5000个、约1000个至约10,000个、约10,000个至约20,000个、约10,000个至约50,000个、约10,000个至约100,000个或约50,000个至约100,
000个分子标志物或遗传变异。
90,000个或100,000个分子标志物或遗传变异。在一些实施方案中，将被分析的靶的数目是小滴隔室内的约2个至约5个、约2个至约10个、约2个至约20个、约2个至约30个、约2个至约
40个、约2个至约50个、约2个至约100个、约5个至约10个、约5个至约25个、约5个至约50个、约5个至约100个、约10个至约20个、约10个至约50个、约10个至约100个、约25个至约50个、约25个至约75个、约25个至约100个、约100个至约200个、约100个至约500个、约100个至约
1000个、约500个至约1000个、约1000个至约5000个、约1000个至约10,000个、约10,000个至约20,000个、约10,000个至约50,000个、约10,000个至约100,000个或约50,000个至约100,
000个分子标志物或遗传变异。
[0085] B.样品制备
[0086] 在分析样品之前，通常可期望对样品进行一种或更多种样品制备操作。通常，这些样品制备操作可包括诸如从细胞、组织或生物体提取细胞内物质这样的操作，诸如从样品提取核酸、蛋白或其他大分子。
[0087] 通常，本文提供的方法和组合物被使用，以检测、诊断、监测或预测临床受试者，特别是人受试者中疾病或感染(例如，病毒感染、寄生虫感染、细菌感染)的过程。人可以是新生儿、婴儿、儿童、青少年、少年、成年或老年人。人可以是男性或女性。人可以在约1个月大和12个月大之间；例如，约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月大。人可以在约1岁和约110岁之间；例如约1-110岁、1-65岁、1-35岁、1-18岁、1-11岁、1-6岁、1-2岁、2-110岁、2-65岁、2-35岁、2-18岁、2-11岁、2-6岁、6-110岁、6-65岁、6-35岁、6-18岁、6-11岁、11-110岁、11-65岁、11-35岁、11-18岁、18-110岁、18-
65岁、18-35岁、35-110岁、35-65岁、65-110岁、1岁、2岁、3岁、4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9岁、10岁、11岁、12岁、13岁、14岁、15岁、16岁、17岁、18岁、19岁、20岁、21岁、22岁、23岁、24岁、25岁、26岁、27岁、28岁、29岁、30岁、31岁、32岁、33岁、34岁、35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、90岁、100岁、110岁。方法还可用于非人的动物受试者。
65岁、18-35岁、35-110岁、35-65岁、65-110岁、1岁、2岁、3岁、4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9岁、10岁、11岁、12岁、13岁、14岁、15岁、16岁、17岁、18岁、19岁、20岁、21岁、22岁、23岁、24岁、25岁、26岁、27岁、28岁、29岁、30岁、31岁、32岁、33岁、34岁、35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、90岁、100岁、110岁。方法还可用于非人的动物受试者。
[0088] 本公开内容的方法提供了从受试者获得生物样品。如本文所用，术语受试者指任何动物，特别是人，但还包括非人的受试者，如非人的哺乳动物，猿、大猩猩、黑猩猩、奶牛、马、狗、猫、长颈鹿、斑马、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠)、绵羊、山羊、驼鹿、鹿、猪、鸡、公鸡、家禽(fowl)、鸽子、鸟类、爬行动物、鳄鱼(crocodiles)、短吻鳄(alligators)、蜥蜴。方法和组合物可特别有益于畜牧业，以监测、检测、诊断和/或预测圈养动物或家养动物中的疾病或感染。方法和组合物还可用于在野外，或在特定的物种内，或跨越物种或在检查跨越种群的感染的流行病学研究中，包括在流行病或大流行病期间，追踪微生物进化。
[0089] 生物样品可通过本领域已知的方法，包括擦拭、刮、刺骼、活检(例如，切除、细针抽吸、切口、芯针等等)，或任何其他适合的方法来获得。在优选的实施方案中，特别是对于患有或怀疑患有流感感染的受试者，鼻咽抽出物(NPA)、鼻拭子(NS)、咽拭子(TS)或口腔拭子可被用于获得样品。
[0090] 生物样品可从本文提供的任何组织来获得；包括，但不限于肺、呼吸道、鼻腔、胃肠道、口、皮肤、心脏、肺、肾、乳腺、胰腺、肝脏、血液、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、肠、脑、前列腺、食道或甲状腺。可选地，样品可从任何其他来源来获得；包括，但不限于，血液、汗、毛囊、颊组织、眼泪、月经、粪便、痰、鼻腔或唾液。生物样品可由医学专业人员(例如，传染病专家、热带医学专家)来获得。医学专业人员可委托受试者向测试中心或实验室提交生物样品。在一些情况下，受试者可直接提供生物样品。
[0091] 特定感染或其他状况的诊断可包括受试者通过医师、护士或其他医学专业人员的检查。检查可以是常规检查的一部分，或检查可由于特定的诉苦，包括但不限于，以下之一：疼痛，疾患，疾患的预感，可疑肿块或块，疾病或状况的存在。受试者可以知道或可以不知道疾病或状况。医学专业人员可获得生物样品用于测试。在一些情况下，医学专业人员可委托受试者向测试中心或实验室提交生物样品。
[0092] 1.大分子提取
[0093] 当方法被应用于其中整个细胞、病毒或其他组织样品将被分析的应用时，可通常需要从这些样品提取核酸。因此，在获得样品之后，核酸可从收集的样本，例如，细胞、病毒外壳(衣壳或包膜)等中释放为粗制提取物。
[0094] 接近来自样品细胞或病毒的细胞间隙的核酸和大分子，以及DNA结合蛋白的变性通常可通过物理、化学方法，或两者的组合来进行。在该方法的一些应用中，在分离粗制提取物之后，将通常期望从粗制提取物的其他要素，例如，蛋白，细胞膜颗粒等分离核酸。在该方法的一些应用中，将期望保持核酸与其蛋白和细胞膜颗粒。
[0095] 在本文提供的方法的一些应用中，DNA或RNA可在使用本公开内容的方法分析之前从生物样品来提取。提取可通过方法包括，但不限于，使用去垢剂裂解物、超声处理或玻璃珠涡旋。在特定实施方案中，DNA可根据标准方法，例如，使用Qiagen UltraSens DNA提取试剂盒从血液来提取。在一些实施方案中，分离的核酸分子可取决于应用来片段化或完整保留。可被应用于此类分离和片段化的反应条件和酶是相关领域普通技术人员已知的(例如，从由制造商提供的方案)，并可被优化从而用于此类使用。在另一个实施方案中，核酸分子可使用本领域中适合的任何技术来分离，包括，但不限于，使用梯度离心(例如，氯化铯梯度，蔗糖梯度，葡萄糖梯度等等)的技术、离心方案、煮沸、纯化试剂盒(例如，Qiagen纯化系统；Promega纯化系统；Amersham纯化系统；Invitrogen Life Technologies纯化；Mo-Bio Laboratories纯化系统，等等)。提取核酸的方法还可包括使用湿法提取与试剂提取方法诸如使用Trizol或DNAzol的方法。
[0096] 在本文提供的方法的一些应用中，涉及用于分离细胞以外的核酸，例如病毒的核酸或细菌的核酸的方法。此类方法通常包括以下步骤：(a)获得包含核酸的样品；(b)将细胞裂解抑制剂、细胞膜稳定剂或交联剂添加至样品；以及(c)分离核酸。
[0097] 本文提供的方法的一些应用可涉及用于分离细胞内的核酸，例如病毒的核酸或细菌的核酸的方法。此类方法通常包括以下步骤：(a)获得一个或更多个被感染的细胞的样品；(b)将细胞裂解试剂添加至细胞群；(c)裂解被感染的细胞，以及(d)分离核酸。在一些情况下，细胞裂解可在分区之前发生。在一些情况下，细胞裂解可在分区之内发生。
[0098] 2.稀释
[0099] 在该方法的一些应用中，期望以有限的稀释制备样品，使得在特定体积诸如特定小滴体积中存在有限的数目和已知量的核酸、多肽和/或大分子。在本文提供的方法的一些应用中，靶核酸、多肽和/或大分子以以下的平均浓度存在：每小滴(例如，隔室)少于约五个拷贝、每小滴少于约四个拷贝、每小滴少于约三个拷贝、每小滴少于约两个拷贝、或每小滴少于约一个拷贝、或每小滴少于约0.5个拷贝、或每小滴少于约0.4个拷贝、或每小滴少于约0.3个拷贝、或每小滴少于约0.2个拷贝、或每小滴少于约0.1个拷贝。在一些情况下，核酸、多肽和/或大分子可以以以下的平均浓度存在：每小滴约5个、4个、3个、2个、1个、0.5个、0.4个、0.3个、0.2个、0.1个、0.095个、0.09个、0.085个、0.08个、0.075个、0.07个、0.065个、
0.06个、0.055个、0.05个、0.045个、0.04个、0.035个、0.03个、0.025个、0.02个、0.015个、
0.01个、0.0095个、0.009个、0.0085个、0.008个、0.0075个、0.007个、0.0065个、0.006个、
0.0055个、0.005个、0.0045个、0.004个、0.0035个、0.003个、0.0025个、0.002个、0.0015个、或约0.001个拷贝。在一些情况下，核酸、多肽和/或大分子可以以以下的平均浓度存在：每小滴多于约5个、4个、3个、2个、1个、0.5个、0.4个、0.3个、0.2个、0.1个、0.095个、0.09个、
0.085个、0.08个、0.075个、0.07个、0.065个、0.06个、0.055个、0.05个、0.045个、0.04个、
0.035个、0.03个、0.025个、0.02个、0.015个、0.01个、0.0095个、0.009个、0.0085个、0.008个、0.0075个、0.007个、0.0065个、0.006个、0.0055个、0.005个、0.0045个、0.004个、0.0035个、0.003个、0.0025个、0.002个、0.0015个、或0.001个拷贝或更多个。在一些情况下，核酸、多肽和/或大分子可以以以下的平均浓度存在：每小滴少于约5个、4个、3个、2个、1个、0.5个、0.4个、0.3个、0.2个、0.1个、0.095个、0.09个、0.085个、0.08个、0.075个、0.07个、0.065个、0.06个、0.055个、0.05个、0.045个、0.04个、0.035个、0.03个、0.025个、0.02个、0.015个、0.01个、0.0095个、0.009个、0.0085个、0.008个、0.0075个、0.007个、0.0065个、0.006个、0.0055个、0.005个、0.0045个、0.004个、0.0035个、0.003个、0.0025个、0.002个、0.0015个、或约0.001个拷贝或更少。
0.06个、0.055个、0.05个、0.045个、0.04个、0.035个、0.03个、0.025个、0.02个、0.015个、
0.01个、0.0095个、0.009个、0.0085个、0.008个、0.0075个、0.007个、0.0065个、0.006个、
0.0055个、0.005个、0.0045个、0.004个、0.0035个、0.003个、0.0025个、0.002个、0.0015个、或约0.001个拷贝。在一些情况下，核酸、多肽和/或大分子可以以以下的平均浓度存在：每小滴多于约5个、4个、3个、2个、1个、0.5个、0.4个、0.3个、0.2个、0.1个、0.095个、0.09个、
0.085个、0.08个、0.075个、0.07个、0.065个、0.06个、0.055个、0.05个、0.045个、0.04个、
0.035个、0.03个、0.025个、0.02个、0.015个、0.01个、0.0095个、0.009个、0.0085个、0.008个、0.0075个、0.007个、0.0065个、0.006个、0.0055个、0.005个、0.0045个、0.004个、0.0035个、0.003个、0.0025个、0.002个、0.0015个、或0.001个拷贝或更多个。在一些情况下，核酸、多肽和/或大分子可以以以下的平均浓度存在：每小滴少于约5个、4个、3个、2个、1个、0.5个、0.4个、0.3个、0.2个、0.1个、0.095个、0.09个、0.085个、0.08个、0.075个、0.07个、0.065个、0.06个、0.055个、0.05个、0.045个、0.04个、0.035个、0.03个、0.025个、0.02个、0.015个、0.01个、0.0095个、0.009个、0.0085个、0.008个、0.0075个、0.007个、0.0065个、0.006个、0.0055个、0.005个、0.0045个、0.004个、0.0035个、0.003个、0.0025个、0.002个、0.0015个、或约0.001个拷贝或更少。
[0100] 在该方法的一些应用中，包含基因组核酸的样品可被分区至隔室(例如，小滴)内。在一些情况下，样品包括微生物基因组(例如，病毒基因组、细菌基因组、寄生虫基因组)。在一些情况下，微生物基因组(例如，病毒基因组、细菌基因组、寄生虫基因组)以以下的平均浓度被分区至隔室(例如，小滴)内：每隔室(例如，小滴)少于约5个、4个、3个、2个、1个、0.5个、0.4个、0.3个、0.2个、0.1个、0.095个、0.09个、0.085个、0.08个、0.075个、0.07个、0.065个、0.06个、0.055个、0.05个、0.045个、0.04个、0.035个、0.03个、0.025个、0.02个、0.015个、0.01个、0.0095个、0.009个、0.0085个、0.008个、0.0075个、0.007个、0.0065个、0.006个、0.0055个、0.005个、0.0045个、0.004个、0.0035个、0.003个、0.0025个、0.002个、0.0015个、或约0.001个微生物基因组拷贝或更少。在一些情况下，样品来源于被感染的人或其他哺乳动物或非哺乳动物受试者。在一些情况下，微生物核酸(例如，HIV逆转录的DNA)可被整合进人基因组或样品可包含游离的人核酸和游离的微生物核酸的混合物。在此类情况下，微生物基因组(例如，病毒基因组、细菌基因组、寄生虫基因组)被分区至隔室(例如，小滴)内，以以下的平均浓度存在：每隔室(例如，小滴)少于约5个、4个、3个、2个、1个、0.5个、0.4个、0.3个、0.2个、0.1个、0.095个、0.09个、0.085个、0.08个、0.075个、0.07个、0.065个、
0.06个、0.055个、0.05个、0.045个、0.04个、0.035个、0.03个、0.025个、0.02个、0.015个、
0.01个、0.0095个、0.009个、0.0085个、0.008个、0.0075个、0.007个、0.0065个、0.006个、
0.0055个、0.005个、0.0045个、0.004个、0.0035个、0.003个、0.0025个、0.002个、0.0015个、或约0.001个微生物基因组拷贝或更少。然而，在一些情况下，当样品包含微生物核酸(例如，病毒、细菌、寄生虫)和哺乳动物核酸(例如，人、啮齿动物等等)的混合物时，样品被分区使得哺乳动物核酸(例如，人、啮齿动物等等)以以下的平均浓度存在：每隔室(例如，小滴)少于约5个、4个、3个、2个、1个、0.5个、0.4个、0.3个、0.2个、0.1个、0.095个、0.09个、0.085个、0.08个、0.075个、0.07个、0.065个、0.06个、0.055个、0.05个、0.045个、0.04个、0.035个、0.03个、0.025个、0.02个、0.015个、0.01个、0.0095个、0.009个、0.0085个、0.008个、
0.0075个、0.007个、0.0065个、0.006个、0.0055个、0.005个、0.0045个、0.004个、0.0035个、
0.003个、0.0025个、0.002个、0.0015个、或约0.001个哺乳动物基因组拷贝或更少。在该方法的一些应用中，期望以有限的稀释制备样品，使得存在有限的数目和已知量的完整细胞、完整病毒颗粒和/或来自另一个生物体(例如，细菌)的颗粒。在本文提供的方法的一些应用中，细胞或颗粒以每小滴约5个、4个、3个、2个或1个颗粒或细胞的平均浓度存在。在一些情况下，细胞或颗粒以每小滴多于约5个、4个、3个、2个或1个或更多个颗粒或细胞的平均浓度存在。在一些情况下，细胞或颗粒以每小滴少于约5个、4个、3个、2个或1个或更少的颗粒或细胞的平均浓度存在。在一些情况下，当两个片段偶然在分区内共定位时可出现假阳性的测量结果。在一些情况下，分区完整的病毒颗粒可防止由于片段化的重组的假阳性的测量结果。
0.06个、0.055个、0.05个、0.045个、0.04个、0.035个、0.03个、0.025个、0.02个、0.015个、
0.01个、0.0095个、0.009个、0.0085个、0.008个、0.0075个、0.007个、0.0065个、0.006个、
0.0055个、0.005个、0.0045个、0.004个、0.0035个、0.003个、0.0025个、0.002个、0.0015个、或约0.001个微生物基因组拷贝或更少。然而，在一些情况下，当样品包含微生物核酸(例如，病毒、细菌、寄生虫)和哺乳动物核酸(例如，人、啮齿动物等等)的混合物时，样品被分区使得哺乳动物核酸(例如，人、啮齿动物等等)以以下的平均浓度存在：每隔室(例如，小滴)少于约5个、4个、3个、2个、1个、0.5个、0.4个、0.3个、0.2个、0.1个、0.095个、0.09个、0.085个、0.08个、0.075个、0.07个、0.065个、0.06个、0.055个、0.05个、0.045个、0.04个、0.035个、0.03个、0.025个、0.02个、0.015个、0.01个、0.0095个、0.009个、0.0085个、0.008个、
0.0075个、0.007个、0.0065个、0.006个、0.0055个、0.005个、0.0045个、0.004个、0.0035个、
0.003个、0.0025个、0.002个、0.0015个、或约0.001个哺乳动物基因组拷贝或更少。在该方法的一些应用中，期望以有限的稀释制备样品，使得存在有限的数目和已知量的完整细胞、完整病毒颗粒和/或来自另一个生物体(例如，细菌)的颗粒。在本文提供的方法的一些应用中，细胞或颗粒以每小滴约5个、4个、3个、2个或1个颗粒或细胞的平均浓度存在。在一些情况下，细胞或颗粒以每小滴多于约5个、4个、3个、2个或1个或更多个颗粒或细胞的平均浓度存在。在一些情况下，细胞或颗粒以每小滴少于约5个、4个、3个、2个或1个或更少的颗粒或细胞的平均浓度存在。在一些情况下，当两个片段偶然在分区内共定位时可出现假阳性的测量结果。在一些情况下，分区完整的病毒颗粒可防止由于片段化的重组的假阳性的测量结果。
[0101] 在该方法的一些应用中，可期望制备具有大数目隔室或分区的样品。在一些情况下，隔室可以是小滴。在一些情况下，小滴的数目可以是约10,000,000个、15,000,000个、20,000,000个、25,000,000个、30,000,000个、35,000,000个、40,000,000个、45,000,000个、50,000,000个、55,000,000个、60,000,000个、65,000,000个、70,000,000个、75,000,
000个、80,000,000个、85,000,000个、90,000,000个、95,000,000个、100,000,000个、125,
000,000个、150,000,000个、175,000,000个、200,000,000个、225,000,000个、250,000,000个、275,000,000个、300,000,000个、325,000,000个、350,000,000个、375,000,000个、400,
000,000个、425,000,000个、450,000,000个、475,000,000个或约500,000,000个小滴。在一些情况下，小滴的数目可以是多于约10,000,000个、15,000,000个、20,000,000个、25,000,
000个、30,000,000个、35,000,000个、40,000,000个、45,000,000个、50,000,000个、55,
000,000个、60,000,000个、65,000,000个、70,000,000个、75,000,000个、80,000,000个、
85,000,000个、90,000,000个、95,000,000个、100,000,000个、125,000,000个、150,000,
000个、175,000,000个、200,000,000个、225,000,000个、250,000,000个、275,000,000个、
300,000,000个、325,000,000个、350,000,000个、375,000,000个、400,000,000个、425,
000,000个、450,000,000个、475,000,000个或约500,000,000个小滴。在一些情况下，小滴的数目可以是少于约10,000,000个、15,000,000个、20,000,000个、25,000,000个、30,000,
000个、35,000,000个、40,000,000个、45,000,000个、50,000,000个、55,000,000个、60,
000,000个、65,000,000个、70,000,000个、75,000,000个、80,000,000个、85,000,000个、
90,000,000个、95,000,000个、100,000,000个、125,000,000个、150,000,000个、175,000,
000个、200,000,000个、225,000,000个、250,000,000个、275,000,000个、300,000,000个、
325,000,000个、350,000,000个、375,000,000个、400,000,000个、425,000,000个、450,
000,000个、475,000,000个或约500,000,000个小滴或更少。
000个、80,000,000个、85,000,000个、90,000,000个、95,000,000个、100,000,000个、125,
000,000个、150,000,000个、175,000,000个、200,000,000个、225,000,000个、250,000,000个、275,000,000个、300,000,000个、325,000,000个、350,000,000个、375,000,000个、400,
000,000个、425,000,000个、450,000,000个、475,000,000个或约500,000,000个小滴。在一些情况下，小滴的数目可以是多于约10,000,000个、15,000,000个、20,000,000个、25,000,
000个、30,000,000个、35,000,000个、40,000,000个、45,000,000个、50,000,000个、55,
000,000个、60,000,000个、65,000,000个、70,000,000个、75,000,000个、80,000,000个、
85,000,000个、90,000,000个、95,000,000个、100,000,000个、125,000,000个、150,000,
000个、175,000,000个、200,000,000个、225,000,000个、250,000,000个、275,000,000个、
300,000,000个、325,000,000个、350,000,000个、375,000,000个、400,000,000个、425,
000,000个、450,000,000个、475,000,000个或约500,000,000个小滴。在一些情况下，小滴的数目可以是少于约10,000,000个、15,000,000个、20,000,000个、25,000,000个、30,000,
000个、35,000,000个、40,000,000个、45,000,000个、50,000,000个、55,000,000个、60,
000,000个、65,000,000个、70,000,000个、75,000,000个、80,000,000个、85,000,000个、
90,000,000个、95,000,000个、100,000,000个、125,000,000个、150,000,000个、175,000,
000个、200,000,000个、225,000,000个、250,000,000个、275,000,000个、300,000,000个、
325,000,000个、350,000,000个、375,000,000个、400,000,000个、425,000,000个、450,
000,000个、475,000,000个或约500,000,000个小滴或更少。
[0102] 当亲本分子和片段偶然在分区内共定位时可发生重组分子的假阳性测量结果。在一些情况下，重组分子的假阳性测量结果可以是非常低的。在一些情况下，假阳性事件可以少于约10-6个。在一些情况下，重组分子的假阳性测量结果可表示为每分区拷贝的平方，例如，0.001x 0.001。在一些情况下，样品的片段化的量可以是小的。在一些情况下，样品的片段化可以少于约10％。在这些情况下，假阳性测量结果的数目可以是低的。
[0103] 在该方法的一些应用中，重组分子可具有每分区存在的多于一个的标志物。在一些情况下，重组分子可具有每分区存在的两个标志物。在一些情况下，重组分子可具有每分区存在的多于两个的标志物。在一些情况下，相对的亲本形式的共定位的分子可具有比重组分子多一个的标志物。在一些情况下，相对的亲本形式的共定位的分子可具有比重组分子多两个的标志物。在一些情况下，标志物的数目可在重组分子和共定位的分子之间是不同的。在这些情况下，标志物数目中的差异可用于从重组分子鉴定假阳性测量结果。例如，与可具有每小滴存在的3个或4个标志物的相对的亲本形式的共定位的亲本分子相比，重组分子可具有每小滴存在的两个标志物。
[0104] 3.片段化
[0105] 在该方法的一些应用中，期望保持分子(例如，病毒基因组核酸)完整或基本上无片段化，诸如当确定病毒重组率，或基因组中一个或更多个标志物的连接时。
[0106] 在一些情况下，样品的部分的片段化可发生。在一些情况下，片段化的样品的重量百分比可以是约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、
0.5％、0.4％、0.3％0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、
0.03％、0.02％或约0.01％。在一些情况下，片段化的样品的重量百分比可以是少于约
95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、
20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％
0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或约0.01％或更少。在一些情况下，是片段的样品的重量百分比可以是多于约95％、90％、85％、80％、
75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、
4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％0.2％、0.1％、0.09％、
0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或约0.01％或更多。在一些应用中，可期望计算片段化的程度。片段化的程度可基于与样本内亲本双阳性相比的单阳性的分数来确定。在一些情况下，诸如较高的样品输入浓度，片段化的程度可用于校正给定分区内两个片段的随机共定位，使得分区给出相同Ch1荧光强度和相同Ch2荧光强度作为包含单个重组分子的分区，从而错误地指示重组事件。在一些情况下，片段化的程度可用于评分存在于样品中的基因组的总数目。
0.5％、0.4％、0.3％0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、
0.03％、0.02％或约0.01％。在一些情况下，片段化的样品的重量百分比可以是少于约
95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、
20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％
0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或约0.01％或更少。在一些情况下，是片段的样品的重量百分比可以是多于约95％、90％、85％、80％、
75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、
4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％0.2％、0.1％、0.09％、
0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或约0.01％或更多。在一些应用中，可期望计算片段化的程度。片段化的程度可基于与样本内亲本双阳性相比的单阳性的分数来确定。在一些情况下，诸如较高的样品输入浓度，片段化的程度可用于校正给定分区内两个片段的随机共定位，使得分区给出相同Ch1荧光强度和相同Ch2荧光强度作为包含单个重组分子的分区，从而错误地指示重组事件。在一些情况下，片段化的程度可用于评分存在于样品中的基因组的总数目。
[0107] 在一些情况下，当感兴趣的两个标志物之间的距离大于约10千碱基对(kb)、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb、17kb、18kb、19kb、20kb或更多时，基因组分子可在样品内被片段化(例如，DNA或RNA)，使得感兴趣的两个标志物在物理上分开。在一些情况下，当感兴趣的两个标志物被分隔相对短的距离，例如，约少于10kb、9kb、8kb、7kb、6kb、5kb、4kb、3kb、
2kb)时，感兴趣的基因组分子可在样品中不被片段化，使得感兴趣的两个标志物保持物理连接。在一些情况下，样品片段化的百分比可通过在基因组分子的释放被评分之前直接将完整病毒或细菌分区至分区内来降低。
2kb)时，感兴趣的基因组分子可在样品中不被片段化，使得感兴趣的两个标志物保持物理连接。在一些情况下，样品片段化的百分比可通过在基因组分子的释放被评分之前直接将完整病毒或细菌分区至分区内来降低。
[0108] 增加感兴趣的两个标志物之间的基因组距离可增加将被物理分离的那些标志物的百分比。减少感兴趣的两个标志物之间的基因组距离可增加保持物理连接的那些标志物的百分比。例如，多种长度(1kb、10kb、100kb)的FAM标记的里程碑标志物可被连接至荧光锚(例如VIC标记的RPP30)，参见图16。在这些情况下，代表物理连接的分子的双阳性测量结果(FAM+/VIC+)的数目可对于每个里程碑标志物(1kb、10kb、100kb)来计数并与消化的样品进行比较。在其他情况下，双链体测定可与未消化的DNA一起被用来确定不同染色体上的标志物，例如，如在图17A-D中的核糖核酸酶P及染色体6。2D荧光强度图中作为标志物大小的函数的连锁的分子计数，可代表血浆DNA样品中DNA片段大小分布，参见图17A-D。在一些情况下，与1kb(图17B)和10kb(图17C)里程碑双链体中双阳性数目相比，核糖核酸酶P:Chr6对照双链体中随机共定位的双阳性的数目图17A之间的显著差异，可揭示相同DNA分子上标志物之间连接的程度。在一些情况下，随着标志物之间的距离增加，样品制备中完整DNA分子的数目可减少且连锁可在很远的距离不是可检测的(例如，该样品中的100kb里程碑，参见图17D)。FAM/VIC+/+双阳性(“连锁的”)分子在里程碑标志物(190bp足迹，图18A和1kp足迹，图
18B)的另一个未消化的DNA样品中的数目可指示锚和里程碑标志物之间的紧密物理连锁。
18B)的另一个未消化的DNA样品中的数目可指示锚和里程碑标志物之间的紧密物理连锁。
[0109] 在一些情况下，感兴趣的两个基因座之间的距离可以是1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、20kb、30kb、33kb、40kb、50kb、60kb、70kb、80kb、90kb、100kb、
110kb、120kb、130kb、140kb、150kb、160kb、170kb、180kb、190kb、200kb、210kb、300kb、
400kb、500kb、600kb、700kb、800kb、900kb、1000kb或10,000kb。在一些情况下，两个基因座之间的距离可以是多于1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、20kb、30kb、33kb、
40kb、50kb、60kb、70kb、80kb、90kb、100kb、110kb、120kb、130kb、140kb、150kb、160kb、
170kb、180kb、190kb、200kb、210kb、300kb、400kb、500kb、600kb、700kb、800kb、900kb、
1000kb或10,000kb或更多。在一些情况下，两个基因座之间的距离可以是少于2kb、3kb、
4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、20kb、30kb、33kb、40kb、50kb、60kb、70kb、80kb、90kb、
100kb、110kb、120kb、130kb、140kb、150kb、160kb、170kb、180kb、190kb、200kb、210kb、
300kb、400kb、500kb、600kb、700kb、800kb、900kb、1000kb或10,000kb或更少。
110kb、120kb、130kb、140kb、150kb、160kb、170kb、180kb、190kb、200kb、210kb、300kb、
400kb、500kb、600kb、700kb、800kb、900kb、1000kb或10,000kb。在一些情况下，两个基因座之间的距离可以是多于1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、20kb、30kb、33kb、
40kb、50kb、60kb、70kb、80kb、90kb、100kb、110kb、120kb、130kb、140kb、150kb、160kb、
170kb、180kb、190kb、200kb、210kb、300kb、400kb、500kb、600kb、700kb、800kb、900kb、
1000kb或10,000kb或更多。在一些情况下，两个基因座之间的距离可以是少于2kb、3kb、
4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、20kb、30kb、33kb、40kb、50kb、60kb、70kb、80kb、90kb、
100kb、110kb、120kb、130kb、140kb、150kb、160kb、170kb、180kb、190kb、200kb、210kb、
300kb、400kb、500kb、600kb、700kb、800kb、900kb、1000kb或10,000kb或更少。
[0110] 在一些情况下，样品可包含片段化的核酸，并且可被分区至多个隔室(例如，小滴)内，用于随后的分析。在这些情况下，隔室可包含多个片段。如果两个或更多个片段包含感兴趣的不同的标志物，则多个标志物可共定位至单个隔室，并且因此可在相同室内被检测。为了确定共定位的标志物是否存在于隔室中，由于(a)它们存在于在隔室内的单独的片段上或(b)它们存在于隔室内的单个核酸分子上，在一些情况下，运行对照样品可以是有用的。此类对照样品可包含原始样品的子集，但可用试剂来处理以破坏或切割多个感兴趣的标志物之间的核酸。通常，试剂是能够切割感兴趣的两个标志物之间的区域内的核酸的限制性内切酶。例如，具有存在于不同核酸链上的G和T标志物的核酸样品可被点在显示显著单阳性小滴的集群图上，反映两个标志物被分区至单独的隔室内。具有相同核酸链上感兴趣的A和T标志物的核酸样品可被点在描绘许多双阳性小滴(例如HEX/FAM)的存在的集群图上，其通常反映标志物存在于相同链上。用限制性内切酶消化的对照样品可被描绘在集群图上，与具有A和T标志物的核酸样品的图相比显示双阳性小滴的百分比的减少。双阳性小滴的百分比的减少可反映感兴趣的标志物事实上在未消化的样品中是连锁的，且该连接被限制性内切酶破坏。相反地，剩余双阳性小滴可反映包含核酸的单独的片段上的两个标志物的小滴。剩余小滴还可反映包含在单链上是连锁的，但出于不管什么原因在限制性内切酶消化期间未消化的两个标志物的小滴。一些原因可包括，反应不是完全反应或这两个标志物之间的限制性位点具有使它对酶耐受性的特定的多态性。
[0111] 在一些应用中，可期望在进行测定之前将样品片段化。在一些情况下，可期望在分区之前将样品片段化。在一些情况下，限制性内切酶可用于片段化样品。在一些情况下，片段化对照可被使用(例如阳性或阴性对照)。例如，已知被广泛片段化的样品可用作片段化对照。在其他情况下，限制性内切酶可用于拆开单独的全长拷贝。在这些情况下，限制性消化后保持的双阳性可以是片段。
[0112] 在一些应用中，可期望在分区之前片段化样品，特别是DNA样品或RNA样品以减少流体粘度。在一些情况下，具有高粘度的流体可不形成分区。在一些情况下，核酸(特别是DNA)在样品中的量可增加水相粘度-特别是当该核酸以相对高的浓度存在时。在一些情况下，病毒颗粒在样品中的量可增加水相粘度。在一些情况下，粘度可在分区之前通过片段化样品来减少。
[0113] 在一些情况下，已知被大距离，例如，大于1kb、大于10kb、大于20kb、大于50kb、大于75kb、大于100kb等等间隔的两个标志物可被用作阳性片段化对照。这是因为片段化率通常与两个标志物之间的距离直接相关。在一些情况下，已知被相对短的距离，例如，少于10kb、少于5kb、少于1kb、少于100bp、少于50bp、少于25bp或少于10bp间隔的两个标志物可被用作片段化阴性对照。相对短的间隔可表明两个标志物不太可能通过片段化彼此物理上分离。
[0114] 核酸、多肽或大分子或核酸或大分子的片段的长度可以是约100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10,000个、20,000个、30,000个、40,000个、50,000个、60,000个、70,000个、80,000个、90,000个、100,000个、200,000个、300,000个、400,000个、500,000个、600,000个、700,000个、800,000个、900,000个、1,000,000个、2,000,000个、3,000,000个、4,000,000个、5,000,000个、6,000,000个、7,000,000个、8,000,000个、9,000,000个、
10,000,000个、20,000,000个、30,000,000个、40,000,000个、50,000,000个、60,000,000个、70,000,000个、80,000,000个、90,000,000个、100,000,000个、110,000,000个、120,
000,000个、130,000,000个、140,000,000个、150,000,000个、160,000,000个、170,000,000个、180,000,000个、190,000,000个、200,000,000个、210,000,000个、220,000,000个、230,
000,000个、240,000,000个或250,000,000个或更多个核苷酸或碱基对或氨基酸等等的长度。
10,000,000个、20,000,000个、30,000,000个、40,000,000个、50,000,000个、60,000,000个、70,000,000个、80,000,000个、90,000,000个、100,000,000个、110,000,000个、120,
000,000个、130,000,000个、140,000,000个、150,000,000个、160,000,000个、170,000,000个、180,000,000个、190,000,000个、200,000,000个、210,000,000个、220,000,000个、230,
000,000个、240,000,000个或250,000,000个或更多个核苷酸或碱基对或氨基酸等等的长度。
[0115] 数字分析可被进行，以确定样品中两个标志物之间的片段化的程度。在一些情况下，片段化的程度可在测量重组频率使用的样品中被测量。图3示出了确定片段化的程度的工作流程的一个实施方案(300)。在一些情况下，片段化的程度可被使用，以调整获得的任何值用于确定重组率或重组频率。尽管图指定片段化(380)，算法还可被用于预测重组，以及有或没有预测片段化。图3中的步骤可以以任何合适的顺序和组合来进行，并且可与本公开内容的任何其他步骤联合。多核苷酸的样品可被获得(320)。样品可被划分成多个隔室(例如，小滴、孔)(340)，使得每个隔室包含平均少于约0个、0.1个、0.2个、0.3个、0.4个、0.5个、0.6个、0.7个、0.8个、0.9个、1个、2个、个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、125个、150个、175个、200个、300个、400个、500个、750个、1000个、5000个或10000个靶多核苷酸。在一个优选的实施方案中，每个隔室可包含平均少于10个的靶多核苷酸。在一些情况下，每个隔室包含每隔室(例如，小滴)平均少于
10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个拷贝的靶核酸。在一些情况下，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、
100个、125个、150个、175个、200个、500个、1000个、5000个、10000个、50000个或更多个隔室(例如，小滴)具有零拷贝个靶核酸。隔室可被测定，以计数具有第一靶序列和第二靶序列的隔室(360)，且算法可被用于预测第一靶序列和第二靶序列之间的片段化(380)以及此类序列和外来基因组的序列之间的重组率。算法还可用于预测第一靶序列和第二靶序列之间的重组事件。
10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个拷贝的靶核酸。在一些情况下，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、
100个、125个、150个、175个、200个、500个、1000个、5000个、10000个、50000个或更多个隔室(例如，小滴)具有零拷贝个靶核酸。隔室可被测定，以计数具有第一靶序列和第二靶序列的隔室(360)，且算法可被用于预测第一靶序列和第二靶序列之间的片段化(380)以及此类序列和外来基因组的序列之间的重组率。算法还可用于预测第一靶序列和第二靶序列之间的重组事件。
[0116] 在一些情况下，两个基因越靠近在一起，重组在它们之间越不太可能发生。在这些情况下，A1和B2之间的距离越长，A1和B2之间的片段化或重组的概率越高。在一些情况下，重组热点的发生可使对于两个基因座之间的给定距离的测量的重组频率失真。例如，在一些情况下，相距200kb的两个基因座可具有低的重组频率。在其他情况下，两个基因座也被200kb间隔，但它们是重组热点，可以以比先前情况高得多的频率重组。
[0117] 样品可被分区(图3：340)。数字分析可被进行，诸如数字PCR或基于小滴的数字PCR，且具有A1、B2，以及A1和B2信号的隔室可被计数(360)。算法可被开发并用于确定A1和B2之间的片段化或重组的概率(380)。算法可利用A1和B2之间的碱基或碱基对的数目(如果已知的)。该方法可用于确定给定样品中的DNA或RNA，或本文描述的任何类型核酸分子的片段化的程度。在一些情况下，方法可包括通过分析包含单个标志物，例如，A1、B1、A2或B2的分区的数目确定片段化值。在一些情况下，包含仅单个标志物(例如，A1)的隔室可包含最初包含此类标志物(例如A1和第二标志物例如，A2、B2)但现在被片段化的核酸链。如果包含来自A1和B2两者的信号的分区的数目大于人们将预料如果A1和B2是在不同的片段上的分区的数目，该观察结果可指示A1和B2是连锁的。
[0118] 本文提供的方法可被用于确定一个或更多个分子或遗传标志物是否连锁。本文提供的方法可被用于确定一个或更多个分子或遗传标志物是否不连锁。本文提供的方法可被用于确定基因组中一个或更多个分子或遗传标志物之间的距离。以上方法还可用在样品的核酸(例如，DNA或RNA)上以确保或确定DNA或RNA为足够高的分子量，使得连锁信息被保存在样品中。
[0119] 在任何本文描述的利用DNA或RNA的方法中，测定可被进行以估算样品中的DNA或RNA的片段化，并且该方法可并入有关DNA或RNA的片段化的信息。在另一个实施方案中，测定的结果可基于样品中DNA或RNA的片段化的程度被归一化。
[0120] 可选地，在本文提供的方法的一些应用中，核酸片段化或重组可通过，例如，凝胶、生物分析仪或尺寸排阻层析来测量。在一些情况下，本文描述的方法可被组合以确定核酸片段化或重组。在一些情况下，组合的方法可被使用，例如，使用ddPCR和凝胶测量重组。在一些情况下，ddPCR和生物分析仪可被使用。在一些情况下，ddPCR和尺寸排阻层析可被包括。
[0121] C.分子和遗传标志物
[0122] 在分子和遗传标志物中发现的变异可提供用于区分基因组、序列靶诸如包含处于连锁不平衡中的特定基因或单倍型的基因组区段，或病毒分离株的工具(means)。此类遗传变异标志物的实例包括，但不限于，多态性诸如：限制性片段长度多态性、单核苷酸DNA多态性、单核苷酸cDNA多态性、单核苷酸RNA多态性、插入、缺失、倒位、重排、大型结构变异、插入缺失、微卫星重复序列(简单序列重复)、小卫星重复序列(可变数目的串联重复)、短串联重复序列、转座元件、随机扩增多态性DNA以及扩增片段长度多态性。
[0123] 在该方法的一些应用中，本文提供的一种类型的分子标志物或遗传变异标志物被分析。在该方法的其他应用中，本文提供的一种或更多种类型的分子标志物或遗传变异标志物被分析。在该方法的一些应用中，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个标志物被分析。在该方法的一些应用中，在连锁不平衡中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、
23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个标志物被分析。在该方法的一些应用中，在不在连锁不平衡中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、
19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个标志物被分析。在该方法的一些应用中，不在连锁不平衡中和在连锁不平衡中两者的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个标志物被分析。
23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个标志物被分析。在该方法的一些应用中，在不在连锁不平衡中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、
19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个标志物被分析。在该方法的一些应用中，不在连锁不平衡中和在连锁不平衡中两者的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个标志物被分析。
[0124] 在该方法的一些应用中，由该方法分析的标志物可区分两个或更多个亲本毒株。在该方法的一些应用中，由该方法分析的标志物可区分两个或更多个病毒毒株。在该方法的一些应用中，由该方法分析的标志物可区分两个或更多个病毒物种。在该方法的一些应用中，由该方法分析的标志物可区分两个或更多个病毒亚种。在该方法的一些应用中，由该方法分析的标志物可区分两个或更多个病毒属。在该方法的一些应用中，由该方法分析的标志物可区分一个或更多个基因组中的两个或更多个重组位点。在该方法的一些应用中，由该方法分析的标志物可用于发现一个或更多个基因组中的新的重组位点。在该方法的一些应用中，由该方法分析的标志物可用于发现一个或更多个基因组中的新的热点(例如高的重组率)的重组位点。在该方法的一些应用中，由该方法分析的标志物可用于发现一个或更多个基因组中的新的冷点(例如低的重组率)的重组位点。
[0125] 在该方法的一些应用中，标志物可在重组位点之外，但已知与该重组位点连锁。例如，被分析的标志物可相距，例如，少于约10、9、8、7、6、5、4、5、2、1、0.7、0.5、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01百万碱基；或其在多核苷酸上彼此非常接近，例如，相距少于约10、9、8、7、6、5、
4、3、2或1千碱基。在一些情况下，该方法对分析在多核苷酸上彼此非常靠近，例如，相距在约1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或950碱基对(bp的)之内的标志物有用。在一些情况下，该方法对分析间隔零(0)碱基对的标志物有用。
在一些情况下，该方法可被应用于相同的、几乎相同的以及完全不同的分子或遗传变异标志物。
4、3、2或1千碱基。在一些情况下，该方法对分析在多核苷酸上彼此非常靠近，例如，相距在约1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或950碱基对(bp的)之内的标志物有用。在一些情况下，该方法对分析间隔零(0)碱基对的标志物有用。
在一些情况下，该方法可被应用于相同的、几乎相同的以及完全不同的分子或遗传变异标志物。
[0126] D.装置
[0127] 1.小滴隔室生成
[0128] 本公开内容包括用于检测和分析遗传材料诸如核酸以及使用小滴数字PCR的组合物和方法。小滴数字PCR使用微流体生成包含感兴趣的大分子以及进行测定所必需的分子组分、酶和环境的小滴隔室。
[0129] 本文描述的小滴包括美国专利号7,622,280中描述的乳液组合物(或两种或更多种不混溶流体的组合物)，以及由第一发明人：Colston的国际申请公布号WO/2010/036352中描述的装置生成的小滴，其的每个在此通过引用以其整体并入。如本文所用的术语乳液通常指不混溶液体(诸如油和水)的混合物。油相和/或油包水乳液允许含水小滴内的反应混合物的隔室化。在一些应用中，乳液包括在连续的油相内的含水小滴。在其他实施方案中，本文提供的乳液是水包油乳液，其中小滴是在连续水相内的油滴。本文提供的小滴隔室被设计成防止隔室之间的混合，每个隔室防止其内容物蒸发以及与其他隔室的内容物聚结。
[0130] 在该方法的一些应用中，水相还可包含添加剂，包括，但不限于，非特异性背景/阻断核酸(例如，鲑鱼精子DNA)、生物防腐剂(例如，叠氮化钠)、PCR增强剂(例如，甜菜碱、海藻糖等等)以及抑制剂(例如，RNA酶抑制剂)。在该方法的一些应用中，包含，例如甜菜碱的富含GC的添加剂和DMSO被添加至本文提供的方法中测定的样品。
[0131] 本文描述的混合物或乳液可以是稳定的或不稳定的。在一些应用中，乳液是相对稳定的，并具有最小的聚结。当小的小滴结合形成逐渐较大的小滴时聚结发生。在一些实施方案中，由小滴发生器生成的小滴的少于约0.00001％、0.00005％、0.00010％、0.00050％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、
5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他小滴聚结。乳液还可以具有有限的絮凝，絮凝是分散相以薄片的形式从悬浮液中出现的过程。
5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他小滴聚结。乳液还可以具有有限的絮凝，絮凝是分散相以薄片的形式从悬浮液中出现的过程。
[0132] 如本文所述将样品拆分成小的反应体积，可使能够使用减少的量的试剂，从而降低了分析的材料成本。通过分区减少样品复杂性还改进了检测的动态范围，由于不同隔室中的较高丰度分子与低丰度分子分离，从而允许较低丰度分子较大比例接近反应试剂，其反过来提高较低丰度分子的检测。
[0133] 在该方法的一些应用中，可生成具有约0.001微米、0.01微米、0.05微米、0.1微米、1微米、5微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、100微米、
120微米、130微米、140微米、150微米、160微米、180微米、200微米、300微米、400微米或500微米的平均直径的小滴隔室。已知使用微通道横流聚焦或物理搅动产生乳液小滴的微流体方法产生单分散乳液或多分散乳液。在该方法的一些应用中，小滴隔室是单分散的小滴。在该方法的一些应用中，小滴隔室被这样生成，使得小滴隔室的大小不变化多于小滴的平均大小的正或负5％。在该方法的一些应用中，小滴隔室被这样生成，使得小滴的大小不变化多于小滴的平均大小的正或负2％。在一些应用中，小滴发生器可从单样品生成小滴群，其中没有小滴的大小变化多于小滴总群的平均大小的正或负0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、
2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或
10％。
120微米、130微米、140微米、150微米、160微米、180微米、200微米、300微米、400微米或500微米的平均直径的小滴隔室。已知使用微通道横流聚焦或物理搅动产生乳液小滴的微流体方法产生单分散乳液或多分散乳液。在该方法的一些应用中，小滴隔室是单分散的小滴。在该方法的一些应用中，小滴隔室被这样生成，使得小滴隔室的大小不变化多于小滴的平均大小的正或负5％。在该方法的一些应用中，小滴隔室被这样生成，使得小滴的大小不变化多于小滴的平均大小的正或负2％。在一些应用中，小滴发生器可从单样品生成小滴群，其中没有小滴的大小变化多于小滴总群的平均大小的正或负0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、
2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或
10％。
[0134] 在该方法的一些应用中，油相、水相或两者的流速可被利用，以控制每时间或每样品体积生成的小滴的数目。在一些情况下，流速可通过主动泵送、通过一个或更多个压力梯度、通过真空或其组合来控制。在一些情况下，流速可通过流体粘度、通道阻力、流体温度、通道温度或其组合来控制。在一些应用中，在小滴发生器中的一个或更多个通道的大小和几何形状可控制每时间或每样品体积生成的小滴的数目。在一些应用中，在一个或更多个水流体通道和油通道之间的相交的角度可控制每时间或每样品体积生成的小滴的数目。
[0135] 在一些情况下，每秒可形成约1,000个小滴。在一些情况下，每秒可形成多于约1,000个小滴。在一些情况下，每秒可形成少于约1,000个小滴。在一些情况下，每秒可形成约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个、155个、160个、165个、170个、175,180个、185个、190个、195个、200个、205个、210个、215个、220个、225个、230个、235个、240个、245个、
250个、255个、260个、265个、270个、275个、280个、285个、290个、295个、300个、305个、310个、315个、320个、325个、330个、335个、340个、345个、350个、355个、360个、365个、370个、
375个、380个、385个、390个、395个、400个、405个、410个、415个、420个、425个、430个、435个、440个、445个、450个、455个、460个、465个、470个、475个、480个、485个、490个、495个、
500个、505个、510个、515个、520个、525个、530个、535个、540个、545个、550个、555个、560个、565个、570个、575个、580个、585个、590个、595个、600个、605个、610个、615个、620个、
625个、630个、635个、640个、645个、650个、655个、660个、665个、670个、675个、680个、685个、690个、695个、700个、705个、710个、715个、720个、725个、730个、735个、740个、745个、
750个、755个、760个、765个、770个、775个、780个、785个、790个、795个、800个、805个、810个、815个、820个、825个、830个、835个、840个、845个、850个、855个、860个、865个、870个、
875个、880个、885个、890个、895个、900个、905个、910个、915个、920个、925个、930个、935个、940个、945个、950个、955个、960个、965个、970个、975个、980个、985个、990个、995个、1,
000个、1,500个、2,000个、2,500个、3,000个、3,500个、4,000个、4,500个、5,000个、5,500个、6,000个、6,500个、7,000个、7,500个、8,000个、8,500个、9,000个、9,500个、10,000个小滴。在一些情况下，每秒可形成多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个、155个、160个、165个、170个、175个、180个、185个、190个、195个、200个、205个、210个、215个、
220个、225个、230个、235个、240个、245个、250个、255个、260个、265个、270个、275个、280个、285个、290个、295个、300个、305个、310个、315个、320个、325个、330个、335个、340个、
345个、350个、355个、360个、365个、370个、375个、380个、385个、390个、395个、400个、405个、410个、415个、420个、425个、430个、435个、440个、445个、450个、455个、460个、465个、
470个、475个、480个、485个、490个、495个、500个、505个、510个、515个、520个、525个、530个、535个、540个、545个、550个、555个、560个、565个、570个、575个、580个、585个、590个、
595个、600个、605个、610个、615个、620个、625个、630个、635个、640个、645个、650个、655个、660个、665个、670个、675个、680个、685个、690个、695个、700个、705个、710个、715个、
720个、725个、730个、735个、740个、745个、750个、755个、760个、765个、770个、775个、780个、785个、790个、795个、800个、805个、810个、815个、820个、825个、830个、835个、840个、
845个、850个、855个、860个、865个、870个、875个、880个、885个、890个、895个、900个、905个、910个、915个、920个、925个、930个、935个、940个、945个、950个、955个、960个、965个、
970个、975个、980个、985个、990个、995个、1,000个、1,500个、2,000个、2,500个、3,000个、
3,500个、4,000个、4,500个、5,000个、5,500个、6,000个、6,500个、7,000个、7,500个、8,000个、8,500个、9,000个、9,500个、10,000个或更多个小滴。在一些情况下，每秒可形成少于约
1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、
50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个、155个、160个、165个、170个、175个、180个、
185个、190个、195个、200个、205个、210个、215个、220个、225个、230个、235个、240个、245个、250个、255个、260个、265个、270个、275个、280个、285个、290个、295个、300个、305个、
310个、315个、320个、325个、330个、335个、340个、345个、350个、355个、360个、365个、370个、375个、380个、385个、390个、395个、400个、405个、410个、415个、420个、425个、430个、
435个、440个、445个、450个、455个、460个、465个、470个、475个、480个、485个、490个、495个、500个、505个、510个、515个、520个、525个、530个、535个、540个、545个、550个、555个、
560个、565个、570个、575个、580个、585个、590个、595个、600个、605个、610个、615个、620个、625个、630个、635个、640个、645个、650个、655个、660个、665个、670个、675个、680个、
685个、690个、695个、700个、705个、710个、715个、720个、725个、730个、735个、740个、745个、750个、755个、760个、765个、770个、775个、780个、785个、790个、795个、800个、805个、
810个、815个、820个、825个、830个、835个、840个、845个、850个、855个、860个、865个、870个、875个、880个、885个、890个、895个、900个、905个、910个、915个、920个、925个、930个、
935个、940个、945个、950个、955个、960个、965个、970个、975个、980个、985个、990个、995个、1,000个、1,500个、2,000个、2,500个、3,000个、3,500个、4,000个、4,500个、5,000个、5,
500个、6,000个、6,500个、7,000个、7,500个、8,000个、8,500个、9,000个、9,500个、10,000个或更少的小滴。
250个、255个、260个、265个、270个、275个、280个、285个、290个、295个、300个、305个、310个、315个、320个、325个、330个、335个、340个、345个、350个、355个、360个、365个、370个、
375个、380个、385个、390个、395个、400个、405个、410个、415个、420个、425个、430个、435个、440个、445个、450个、455个、460个、465个、470个、475个、480个、485个、490个、495个、
500个、505个、510个、515个、520个、525个、530个、535个、540个、545个、550个、555个、560个、565个、570个、575个、580个、585个、590个、595个、600个、605个、610个、615个、620个、
625个、630个、635个、640个、645个、650个、655个、660个、665个、670个、675个、680个、685个、690个、695个、700个、705个、710个、715个、720个、725个、730个、735个、740个、745个、
750个、755个、760个、765个、770个、775个、780个、785个、790个、795个、800个、805个、810个、815个、820个、825个、830个、835个、840个、845个、850个、855个、860个、865个、870个、
875个、880个、885个、890个、895个、900个、905个、910个、915个、920个、925个、930个、935个、940个、945个、950个、955个、960个、965个、970个、975个、980个、985个、990个、995个、1,
000个、1,500个、2,000个、2,500个、3,000个、3,500个、4,000个、4,500个、5,000个、5,500个、6,000个、6,500个、7,000个、7,500个、8,000个、8,500个、9,000个、9,500个、10,000个小滴。在一些情况下，每秒可形成多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个、155个、160个、165个、170个、175个、180个、185个、190个、195个、200个、205个、210个、215个、
220个、225个、230个、235个、240个、245个、250个、255个、260个、265个、270个、275个、280个、285个、290个、295个、300个、305个、310个、315个、320个、325个、330个、335个、340个、
345个、350个、355个、360个、365个、370个、375个、380个、385个、390个、395个、400个、405个、410个、415个、420个、425个、430个、435个、440个、445个、450个、455个、460个、465个、
470个、475个、480个、485个、490个、495个、500个、505个、510个、515个、520个、525个、530个、535个、540个、545个、550个、555个、560个、565个、570个、575个、580个、585个、590个、
595个、600个、605个、610个、615个、620个、625个、630个、635个、640个、645个、650个、655个、660个、665个、670个、675个、680个、685个、690个、695个、700个、705个、710个、715个、
720个、725个、730个、735个、740个、745个、750个、755个、760个、765个、770个、775个、780个、785个、790个、795个、800个、805个、810个、815个、820个、825个、830个、835个、840个、
845个、850个、855个、860个、865个、870个、875个、880个、885个、890个、895个、900个、905个、910个、915个、920个、925个、930个、935个、940个、945个、950个、955个、960个、965个、
970个、975个、980个、985个、990个、995个、1,000个、1,500个、2,000个、2,500个、3,000个、
3,500个、4,000个、4,500个、5,000个、5,500个、6,000个、6,500个、7,000个、7,500个、8,000个、8,500个、9,000个、9,500个、10,000个或更多个小滴。在一些情况下，每秒可形成少于约
1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、
50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个、155个、160个、165个、170个、175个、180个、
185个、190个、195个、200个、205个、210个、215个、220个、225个、230个、235个、240个、245个、250个、255个、260个、265个、270个、275个、280个、285个、290个、295个、300个、305个、
310个、315个、320个、325个、330个、335个、340个、345个、350个、355个、360个、365个、370个、375个、380个、385个、390个、395个、400个、405个、410个、415个、420个、425个、430个、
435个、440个、445个、450个、455个、460个、465个、470个、475个、480个、485个、490个、495个、500个、505个、510个、515个、520个、525个、530个、535个、540个、545个、550个、555个、
560个、565个、570个、575个、580个、585个、590个、595个、600个、605个、610个、615个、620个、625个、630个、635个、640个、645个、650个、655个、660个、665个、670个、675个、680个、
685个、690个、695个、700个、705个、710个、715个、720个、725个、730个、735个、740个、745个、750个、755个、760个、765个、770个、775个、780个、785个、790个、795个、800个、805个、
810个、815个、820个、825个、830个、835个、840个、845个、850个、855个、860个、865个、870个、875个、880个、885个、890个、895个、900个、905个、910个、915个、920个、925个、930个、
935个、940个、945个、950个、955个、960个、965个、970个、975个、980个、985个、990个、995个、1,000个、1,500个、2,000个、2,500个、3,000个、3,500个、4,000个、4,500个、5,000个、5,
500个、6,000个、6,500个、7,000个、7,500个、8,000个、8,500个、9,000个、9,500个、10,000个或更少的小滴。
[0136] 在一些情况下，小滴发生器中的流速可以是约0.00001mL/min、0.00005mL/min、0.0001mL/min、0.0005mL/min、0.001mL/min、0.005mL/min、0.01mL/min、0.05mL/min、
0.1mL/min、0.5mL/min、1mL/min、5mL/min、10mL/min、50mL/min、100mL/min。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以多于约0.00001mL/min、0.00005mL/min、0.0001mL/min、
0.0005mL/min、0.001mL/min、0.005mL/min、0.01mL/min、0.05mL/min、0.1mL/min、0.5mL/min、1mL/min、5mL/min、10mL/min、50mL/min、100mL/min或更多。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以少于约0.00001mL/min、0.00005mL/min、0.0001mL/min、0.0005mL/min、
0.001mL/min、0.005mL/min、0.01mL/min、0.05mL/min、0.1mL/min、0.5mL/min、1mL/min、
5mL/min、10mL/min、50mL/min、100mL/min或更少。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以是约0.01mL/min至约0.1mL/min。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以是约0.0001mL/min至约10mL/min。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以多于约0.01mL/min。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以少于约0.1mL/min。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以是连续的。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以不是连续的。
0.1mL/min、0.5mL/min、1mL/min、5mL/min、10mL/min、50mL/min、100mL/min。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以多于约0.00001mL/min、0.00005mL/min、0.0001mL/min、
0.0005mL/min、0.001mL/min、0.005mL/min、0.01mL/min、0.05mL/min、0.1mL/min、0.5mL/min、1mL/min、5mL/min、10mL/min、50mL/min、100mL/min或更多。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以少于约0.00001mL/min、0.00005mL/min、0.0001mL/min、0.0005mL/min、
0.001mL/min、0.005mL/min、0.01mL/min、0.05mL/min、0.1mL/min、0.5mL/min、1mL/min、
5mL/min、10mL/min、50mL/min、100mL/min或更少。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以是约0.01mL/min至约0.1mL/min。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以是约0.0001mL/min至约10mL/min。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以多于约0.01mL/min。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以少于约0.1mL/min。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以是连续的。在一些情况下，小滴发生器中的流速可以不是连续的。
[0137] 在该方法的一些应用中，小滴隔室可通过油相流动通过含水样品来形成。在该方法的一些应用中，水相包含缓冲的溶液和用于进行PCR反应的试剂，包括核苷酸、引物、用于荧光检测的探针、模板核酸、DNA聚合酶酶，以及任选地，逆转录酶。
[0138] 在该方法的一些应用中，水相包含缓冲的溶液和用于进行无固态珠，诸如磁珠的PCR反应的试剂。在一些实施方案中，缓冲的溶液可包含约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、50mM、100mM或200mM Tris。在一些应用中，氯化钾的浓度可以是约10mM、20mM、30mM、40mM、
50mM、60mM、80mM、100mM、200mM。在一个应用中，缓冲的溶液包含15mM Tris和50mM KCl。在一些实施方案中，核苷酸包含脱氧核糖核苷酸三磷酸分子，包括在各自约50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM或700μM的浓度的dATP、dCTP、dGTP、dTTP。在一些实施方案中，在水相内添加dUTP至约50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM或700μM、800μM、900μM或1000μM的浓度。在一些应用中，将氯化镁(MgCl2)以约1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM或
5.0mM的浓度添加至水相。在一个实施方案中，MgCl2的浓度是3.2mM。
50mM、60mM、80mM、100mM、200mM。在一个应用中，缓冲的溶液包含15mM Tris和50mM KCl。在一些实施方案中，核苷酸包含脱氧核糖核苷酸三磷酸分子，包括在各自约50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM或700μM的浓度的dATP、dCTP、dGTP、dTTP。在一些实施方案中，在水相内添加dUTP至约50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM或700μM、800μM、900μM或1000μM的浓度。在一些应用中，将氯化镁(MgCl2)以约1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM或
5.0mM的浓度添加至水相。在一个实施方案中，MgCl2的浓度是3.2mM。
[0139] 非特异性阻断剂诸如BSA或来自牛皮肤的明胶可被使用，其中明胶或BSA以约0.1-0.9％w/v的浓度范围存在。其他可能的阻断剂可包括β-乳球蛋白、酪蛋白、奶粉或其他常见的阻断剂。在一些应用中，BSA和明胶的优选的浓度是0.1％w/v。
[0140] 用于在水相内扩增的引物可具有约0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM或1.0μM的浓度。在一个实施方案中，引物的浓度是0.5μM。在一些应用中，水相包括在约0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM或0.5μM的浓度的用于荧光检测的一种或更多种探针。在一个应用中，用于荧光检测的探针的浓度是0.25μM。PCR中靶核酸浓度的适合的范围在约1pg至约500ng之间。
[0141] 在一些应用中，将非离子环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物以约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1.0％的浓度添加至水相中。常见生物表面活性剂包括非离子表面活性剂诸如普兰尼克F-68(Pluronic F-68)、Tetronics、Zonyl FSN。在一个应用中，普兰尼克F-68以0.5％w/v的浓度存在。
[0142] 在一些实施方案中，硫酸镁可以以相似的浓度代替氯化镁。宽范围的来自不同供应商的常见的、商品化PCR缓冲液可代替缓冲的溶液。
[0143] 油相可包括氟化基础油，其可另外通过与氟化表面活性剂诸如全氟化聚醚组合被稳定。在一些实施方案中，基础油可以是HFE 7500、FC-40、FC-43、FC-70中的一种或更多种，或另一种常见的氟化油。在一些实施方案中，阴离子表面活性剂是Ammonium Krytox(Krytox-AM)、Krytox FSH的铵盐或Krytox FSH的吗啉代衍生物。Krytox-AS可以以约
0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或
4.0％w/w的浓度存在。在一些实施方案中，Krytox-AS的浓度是1.8％。在其他应用中，Krytox-AS的浓度是1.62％。Krytox-FSH的吗啉代衍生物可以以约0.1％、0.2％、0.3％、
0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％w/w的浓度存在。在一些应用中，Krytox-FSH的吗啉代衍生物的浓度是1.8％。在一些应用中，Krytox-FSH的吗啉代衍生物的浓度是1.62％。
0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或
4.0％w/w的浓度存在。在一些实施方案中，Krytox-AS的浓度是1.8％。在其他应用中，Krytox-AS的浓度是1.62％。Krytox-FSH的吗啉代衍生物可以以约0.1％、0.2％、0.3％、
0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％w/w的浓度存在。在一些应用中，Krytox-FSH的吗啉代衍生物的浓度是1.8％。在一些应用中，Krytox-FSH的吗啉代衍生物的浓度是1.62％。
[0144] 油相还可包括用于调节油性质诸如蒸汽压或粘度或表面张力的添加剂。非限制性实例包括全氟正辛醇(perfluoro-octanol)和1H,1H,2H,2H-全氟正癸醇(Perfluorodecanol)。在一些应用中，将1H,1H,2H,2H-全氟正癸醇添加至约0.05％、
0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、1.00％、1.25％、1.50％、1.75％、2.00％、2.25％、2.50％、
2.75％或3.00％w/w的浓度。在一些应用中，将1H,1H,2H,2H-全氟正癸醇添加至0.18％w/w的浓度。
0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、1.00％、1.25％、1.50％、1.75％、2.00％、2.25％、2.50％、
2.75％或3.00％w/w的浓度。在一些应用中，将1H,1H,2H,2H-全氟正癸醇添加至0.18％w/w的浓度。
[0145] 在该方法的一些应用中，乳液被配制为产生高度单分散的小滴，该小滴具有液体样界面膜，可通过加热被转化为具有固体样界面膜的微胶囊；此类微胶囊可表现为能够在通过反应过程诸如PCR扩增保持其内容物的生物反应器。向微胶囊形式的转化可以在加热时发生。例如，此类转化可在大于约50、60、70、80、90或95摄氏度的温度发生。在一些应用中，该加热使用热循环仪发生。在加热过程期间，流体或矿物油覆盖层可用于阻止蒸发。在加热之前，过量的连续油相可被去除或可不被去除。生物相容性胶囊可跨越宽范围的热加工和机械加工耐受聚结和/或絮凝。
[0146] 在转化之后，胶囊可被储存在约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40度，一个实施方案包括胶囊在少于约25度的储存。在一些应用中，这些胶囊可用于生物医学应用，生物医学应用诸如大分子，特别是包含核酸或蛋白，或两者一起的混合物的含水生物流体的稳定的、数字化的包封；药物和疫苗递送；生物分子库；临床成像应用以及其他。
[0147] 微胶囊可包含一个或更多个核酸探针(例如，分子倒置探针、连接探针等等)，并可耐受聚结，特别是在高温下。因此，PCR扩增反应可以以非常高的密度(例如，每单位体积的反应数目)发生。在一些应用中，每ml可发生大于100,000个、500,000个、1,000,000个、1,500,000个、2,000,000个、2,500,000个、5,000,000个或10,000,000个单独的反应。在一些应用中，反应在单个孔，例如，微量滴定板的孔中发生，而无反应体积之间的相互混合。微胶囊还可包含使PCR反应发生所需的其他组分，例如，引物、探针、dNTP、DNA或RNA聚合酶等等。
这些胶囊展现出对跨越广泛范围的热和机械加工的聚结和絮凝的耐受性。
这些胶囊展现出对跨越广泛范围的热和机械加工的聚结和絮凝的耐受性。
[0148] 本文描述的组合物包括包含两种或更多种不混溶流体诸如油和包含一种核酸探针(例如，TaqMan探针、分子倒置探针、连接探针等等)的水的混合物的组合物。在一些情况下，组合物包含本文描述的限制性内切酶，例如，包含限制性内切酶(例如，甲基化敏感性酶)的小滴。在其他应用中，本文描述的组合物包含了包含一种核酸(例如，TaqMan探针、分子倒置探针、连接探针等等)的微胶囊。此类微胶囊可耐受聚结，特别是在高温下，并因此，使扩增反应能够以非常高的密度(例如，每单位体积的反应数目)发生。
[0149] 在一些应用中，本文描述的小滴以大于约1个、2个、3个、4个、5个、10个、50个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个小滴/秒的速度被生成。小滴速度可以是约1-1000个、1-500个、1-250个、1-100个或1-50个小滴/秒。
[0150] 2.热循环仪：用于重组分析的数字PCR
[0151] 热循环仪(thermocycler)(还被称为热循环仪(therma cycler)，PCR仪或DNA扩增仪)是使用聚合酶链式反应(PCR)扩增核酸区段最常用的装置。通常，该装置具有带孔的热块，在其中样品管保持样品，且PCR反应混合物可被插入。热循环仪装置以离散的、预定程序的步骤提高和降低块的温度，以帮助促进扩增在PCR反应混合物中进行。
[0152] 与本文描述的方法、组合物和试剂盒一起使用的数字PCR装置(例如，小滴数字PCR装置)可检测多个信号(参见例如本文通过引用以其整体并入的2011年3月18日提交的美国临时专利申请号61/454,373)。
[0153] 小滴数字PCR可牵涉每秒数千次离散的、稳固的小滴反应器的生成。ddPCR可牵涉标准的热循环与安装的基础仪器，其可使研究人员立即访问数字数据。每个小滴的快速询问可产生存在于初始样品中的靶分子的计数。
[0154] 集成的、快速的、流通热循环装置可用于本文描述的方法中。参见，例如，2009年9月23日提交的国际申请号PCT/US2009/005317。在此类集成装置中，毛细管缠绕保持2个、3个或4个温度区的圆筒。随着小滴流通过毛细管，它们经历不同的温度区，以实现热循环。随着小滴进入每个温度区，每个小滴的小体积导致极其快速的温度转变。
[0155] 通常，热循环仪被用来例如，通过使用PCR、数字PCR、小滴数字PCR(ddPCR)等进行最终有助于检测本文提供的分子标志物或遗传变异标志物(例如SNP、插入缺失、短串联重复序列等等)的扩增反应。具体在ddPCR扩增的情况下，生成的小滴隔室(例如，小滴)然后经历热循环反应以促进在小滴隔室内的PCR反应，其最经常包含靶核苷酸、或能够与靶多核苷酸杂交的靶核苷酸的探针、适当的聚合酶、用于酶的产生扩增产物(例如，来自样品的扩增的核酸诸如ssDNA、dsDD、ssRNA、dsRNA、mRNA、cDNA或其他核酸)的适当的环境(例如，缓冲液、盐等等)。
[0156] 热循环反应可对包含在小滴内的样品来进行。小滴可在热循环期间保持完整。小滴可在热循环期间以以下的密度保持完整：大于约10,000个小滴/mL、100,000个小滴/mL、200,000个小滴/mL、300,000个小滴/mL、400,000个小滴/mL、500,000个小滴/mL、600,000个小滴/mL、700,000个小滴/mL、800,000个小滴/mL、900,000个小滴/mL或1,000,000个小滴/mL。在其他情况下，两个或更多个小滴可在热循环期间聚结。在其他情况下，大于100个小滴或大于1,000个小滴可在热循环期间聚结。
[0157] 催化PCR反应的任何DNA聚合酶可被使用，包括但不限于，大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶1的克列诺片段(Klenow fragment)、T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、Taq聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、噬菌体29、REDTaqTM基因组DNA聚合酶(REDTaqTM.Genomic DNA polymerase)或测序酶。优选地，耐热性DNA聚合酶被使用。热启动PCR(使用热启动DNA聚合酶，诸如抗体连接的DNA聚合酶)还可被进行，其中反应在添加聚合酶之前被加热至95℃持续两分钟，或聚合酶可被保持无活性直到循环1中的第一加热步骤。
热启动PCR可用于最小化非特异性扩增。任何数目的PCR循环可用于扩增DNA，包括但不限于
2个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个或45个循环。
热启动PCR可用于最小化非特异性扩增。任何数目的PCR循环可用于扩增DNA，包括但不限于
2个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个或45个循环。
[0158] 可与本公开内容的方法、组合物和系统一起使用的聚合酶链式反应(PCR)技术的实例包括，但不限于：定量PCR、定量荧光PCR(QF-PCR)、多重荧光PCR(MF-PCR)、实时PCR(RT-PCR)、实时逆转录酶聚合酶链式反应(RRT-PCR)、单细胞PCR、限制性片段长度多态性PCR(PCR-RFLP)、PCR-RFLP/RT-PCR-RFLP、热启动PCR、巢式PCR、原位polonoy PCR(in situ polonony PCR)、原位滚环扩增(in situ rolling circle amplification)(RCA)、桥式PCR(bridge PCR)、picotiter PCR和乳液PCR。其他适合的扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)、转录扩增、自主序列复制、靶多核苷酸序列的选择性扩增、共有序列引发的聚合酶链式反应(CP-PCR)、任意引发的聚合酶链式反应(AP-PCR)、简并寡核苷酸引发的PCR(DOP-PCR)和基于核酸的序列扩增(NASBA)。可被本文使用的其他扩增方法包括在美国专利号US
5,242,794、US 5,494,810、US 4,988,617和US 6,582,938中描述的那些。在该方法的一些应用中，靶核酸的扩增可在珠子上发生。在该方法的其他应用中，扩增不在珠子上发生。
5,242,794、US 5,494,810、US 4,988,617和US 6,582,938中描述的那些。在该方法的一些应用中，靶核酸的扩增可在珠子上发生。在该方法的其他应用中，扩增不在珠子上发生。
[0159] 引物的退火温度可在扩增的任何循环之后被重新计算和增加，扩增的任何循环包括但不限于约循环1、2、3、4、5，约循环6至约循环10、约循环10至约循环15、约循环15至约循环20、约循环20至约循环25、约循环25至约循环30、约循环30至约循环35或约循环35至约循环40。在扩增的初始循环之后，引物的5'一半可被掺入进来自每个感兴趣标志物的产物；因此TM可基于每个引物的5'一半和3'一半的序列两者来重新计算。
[0160] 引物的退火温度可在扩增的任何循环之后被重新计算和增加，扩增的任何循环包括但不限于约循环1、2、3、4、5，约循环6至约循环10、约循环10至约循环15、约循环15至约循环20、约循环20至约循环25、约循环25至约循环30、约循环30至约35或约循环35至约循环40。在扩增的初始循环之后，引物的5'一半可被掺入进来自每个感兴趣基因座的产物，因此TM可基于每个引物的5'一半和3'一半的序列两者来重新计算。
[0161] 取决于扩增反应的靶大小，PCR循环的数目将变化。因此，任何数目的PCR循环可被用来扩增靶核酸。扩增循环的数目可以是约1至约45、约10至约45、约20至约45、约30至约45、约35至约45、约10至约40、约10至约30、约10至约25、约10至约20、约10至约15、约20至约
35、约25至约35、约30至约35或约35至约40。
35、约25至约35、约30至约35或约35至约40。
[0162] 用于进行PCR反应的溶液和试剂可包括缓冲液。缓冲的溶液可包含约、多于约或少于约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、50mM、100mM或200mM Tris。在一些情况下，氯化钾的浓度可以是约、多于约或少于约10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、80mM、100mM、200mM。缓冲的溶液可包含约15mM Tris和50mM KCl。核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸三磷酸分子，包括在各自约、多于约或少于约50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM或700μM的浓度的dATP、dCTP、dGTP、dTTP。在一些情况下，非典型核苷酸，例如，dUTP被添加至扩增反应至约、多于约或少于约50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM或700μM、800μM、900μM或1000μM的浓度。在一些情况下，将氯化镁(MgCl2)以约、多于约或少于约1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM或5.0mM的浓度添加至扩增反应。MgCl2的浓度可以是约3.2mM。
[0163] 非特异性阻断剂诸如BSA或来自牛皮肤的明胶可被使用，其中明胶或BSA以约0.1％至约0.9％w/v的浓度范围存在。其他可能的阻断剂可包括β-乳球蛋白、酪蛋白、奶粉或其他常见的阻断剂。在一些情况下，BSA和明胶的优选的浓度是约0.1％w/v。
[0164] 在一些应用中，扩增反应还可包括一种或更多种添加剂，包括但不限于，非特异性背景/阻断核酸(例如，鲑鱼精子DNA)、生物防腐剂(例如叠氮化钠)、PCR增强剂(例如甜菜碱、海藻糖等等)和抑制剂(例如RNA酶抑制剂)。一种或更多种添加剂可包括，例如，2-吡咯烷酮、乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、B-羟乙基吡咯烷酮(HEP)、丙酰胺、NN-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基甲酰胺(MMP)、NN-二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、N-甲基乙酰胺(MMA)、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇、甜菜碱、四甲基氯化铵(TMAC)、7-脱氮-2'-脱氧鸟苷、牛血清白蛋白(BSA)、T4基因32蛋白、甘油、或非离子去垢剂(Triton X-100、吐温20、诺乃洗涤剂P-40(NP-40)、吐温40、SDS(例如，约0.1％SDS))、鲑精DNA、叠氮化钠、甜菜碱(N,N,N-三甲基甘氨酸；
[羧甲基]三甲基铵)、甲酰胺、海藻糖、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇(BME)、植物多糖、或RNA酶抑制剂。
[羧甲基]三甲基铵)、甲酰胺、海藻糖、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇(BME)、植物多糖、或RNA酶抑制剂。
[0165] 在一些应用中，扩增反应包括一种或更多种缓冲液。一种或更多种缓冲液可包括，例如，TAPS、N-二羟乙基甘氨酸(bicine)、Tris、三甲基甘氨酸(Tricine)、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、甲次砷酸盐、SSC、ADA、ACES、乙醇胺氯化物、乙酰胺甘氨酸、甘氨酰胺、马来酸盐、磷酸盐、CABS、哌啶、甘氨酸、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、苹果酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、丙酸盐、吡啶、哌嗪、组氨酸、bis-tris、乙醇胺、碳酸盐、MOPSO、咪唑、BIS-TRIS丙烷、BES、MOBS、三乙醇胺(TEA)、HEPPSO、POPSO、肼、Trizma(tris)、EPPS、HEPPS、N-二羟乙基甘氨酸、HEPBS、AMPSO、牛磺酸(AES)、硼酸盐、CHES、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、氢氧化铵、甲胺或MES。
[0166] 在一些情况下，将非离子环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物以约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1.0％的浓度添加至扩增反应。常见生物表面活性剂包括非离子表面活性剂诸如普兰尼克F-68、Tetronics、Zonyl FSN。普兰尼克F-
68可以以约0.5％w/v的浓度存在。
68可以以约0.5％w/v的浓度存在。
[0167] 在一些应用中，硫酸镁可以以相似的浓度代替氯化镁。宽范围的来自不同供应商的常见的、商品化PCR缓冲液可代替缓冲的溶液。
[0168] 3.数字检测器
[0169] 通常，与本公开内容的方法、组合物和系统一起使用的扩增反应将生成将被检测器装置(例如，光学阅读器等)检测的一个或更多个信号。
[0170] 在该方法的一些应用中，生成的信号将是荧光信号。来自扩增反应的荧光信号的检测可使用多种检测器装置来实现。通常，此类检测器装置将被配备有生成可被荧光剂吸收的激发光的模块，以及检测由荧光剂发射的光的模块。
[0171] 在该方法的一些应用中，包含在隔室内的一个或更多个样本可通过检测器装置来检测。例如，样品可被分配在放置在检测器中的塑料管中，所述检测器测量来自一个或更多个样品的来自塑料管的大量荧光。在该方法的应用中，一个或更多个样品(诸如小滴隔室)可被分区到板诸如96孔板或384孔板的一个或更多个孔中，并且单独孔的荧光可使用荧光板阅读器来检测。
[0172] 在该方法的一些应用中，检测器还包括样品处理能力，与用于实现单独的液滴进入检测器、经历检测，以及然后离开探测器的工具(means)。例如，流式细胞术装置可适宜在检测来自小滴样品的荧光中使用。在一些情况下，配备有泵以控制小滴移动的微流体装置被用于检测来自成行的小滴的荧光。在一些情况下，将小滴排列在二维表面上，并且检测器相对于该表面移动，检测包含单个小滴的每个位置处的荧光。
[0173] 在该方法的一些应用中，在获得信号检测数据之后，由计算机可执行的逻辑学驱动的计算机处理器可用于存储和处理数据。包括计算机可执行的逻辑学的处理器可用于进行诸如减去背景荧光、分配靶和/或参考序列以及定量数据的功能。例如，包含相应于样品中疑似病毒重组体的存在的荧光的小滴的数目可被计数，并与包含相应于不疑似是病毒重组体的染色体的存在的荧光的小滴的数目进行比较。
[0174] 由计算机可执行的逻辑学指导的处理器可用于显示、存储、检索或计算来自病毒重组体的分子签名谱的数据。由计算机可执行的逻辑学指导的处理器可用于显示、存储、检索或计算来自描述病毒颗粒的核酸和/或蛋白表达的原始数据。由计算机可执行的逻辑学指导的处理器可用于显示、存储、检索或计算原始数据以确定病毒载量、增长率、重组率等。
[0175] D.测定读出
[0176] 1.检测引物、探针、标签和染料
[0177] 与本公开内容的方法、组合物和系统一起使用的扩增反应可生成一个或更多个信号。在该方法的一些方面，使用标签在扩增反应中或在扩增反应之后生成信号。在该方法的一些方面，使用染料在扩增反应中或在扩增反应之后生成信号。
[0178] 引物
[0179] 在该方法的一些应用中，引物被设计来检测特定标志物。例如，引物可被设计成结合至两个或更多个多态性并区分两个或更多个多态性。此类靶向引物的实例是以下引物：被设计成识别限制性片段长度多态性、单核苷酸DNA多态性、单核苷酸cDNA多态性、单核苷酸RNA多态性、单核苷酸RNA多态性、插入、缺失、插入缺失、微卫星重复序列(简单序列重复)、小卫星重复序列(可变数目的串联重复)、短串联重复序列、转座元件、随机扩增多态性DNA以及扩增片段长度多态性。在一些情况下，引物可被设计，以产生特定大小的具体扩增子。当用探针(例如，荧光标签)检测时，扩增子可依据扩增子的长度以不同的振幅发荧光。
此类过程可对本文提供的测定有用，特别是其中两个因素(例如，基因座、等位基因等等)基于信号的振幅而不是单独地基于信号的颜色被区分时。例如，引物可被设计，以当扩增基因座1时产生相对短的扩增子以及当扩增相同链上的第二基因座时产生较长的扩增子。在另一种情况下，引物可被设计，以当扩增第一基因座时产生相对短的扩增子以及当扩增第一基因座的等位基因或遗传变体时产生较长的扩增子。
此类过程可对本文提供的测定有用，特别是其中两个因素(例如，基因座、等位基因等等)基于信号的振幅而不是单独地基于信号的颜色被区分时。例如，引物可被设计，以当扩增基因座1时产生相对短的扩增子以及当扩增相同链上的第二基因座时产生较长的扩增子。在另一种情况下，引物可被设计，以当扩增第一基因座时产生相对短的扩增子以及当扩增第一基因座的等位基因或遗传变体时产生较长的扩增子。
[0180] 引物可根据用于避免二级结构和自杂交的已知参数进行设计。不同的引物对可在另一引物对的约相同的温度退火和解链，例如，在约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃之内。在一些情况下，大于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个、500个、1000个、5000个、10,000个或更多个的引物被最初使用。此类引物可能够与本文描述的遗传靶和标志物杂交。在一些应用中，约2个至约10,000个、约2个至约5,000个、约2个至约2,500个、约2个至约1,000个、约2个至约500个、约2个至约100个、约2个至约50个、约2个至约20、约2个至约10个或约2个至约6个引物被使用。
[0181] 引物可通过多种方法来制备，多种方法包括，但不限于，使用本领域熟知的方法克隆适当的序列和直接化学合成(Narang等，Methods Enzymol.68:90(1979)；Brown等，Methods Enzymol.68:109(1979))。引物还可从商品化来源诸如Integrated DNA Technologies、Operon Technologies、Amersham Pharmacia Biotech、Sigma以及Life Technologies来获得。引物可具有相同的解链温度。引物的解链温度可以是约30℃、31℃、
32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃。在一些应用中，引物的解链温度是约30℃至约85℃、约30℃至约80℃、约30℃至约75℃、约30℃至约70℃、约30℃至约65℃、约30℃至约
60℃、约30℃至约55℃、约30℃至约50℃、约40℃至约85℃、约40℃至约80℃、约40℃至约75℃、约40℃至约70℃、约40℃至约65℃、约40℃至约60℃、约40℃至约55℃、约40℃至约50℃、约50℃至约85℃、约50℃至约80℃、约50℃至约75℃、约50℃至约70℃、约50℃至约65℃、约50℃至约60℃、约50℃至约55℃、约52℃至约60℃、约52℃至约58℃、约52℃至约56℃或约52℃至约54℃。
32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃。在一些应用中，引物的解链温度是约30℃至约85℃、约30℃至约80℃、约30℃至约75℃、约30℃至约70℃、约30℃至约65℃、约30℃至约
60℃、约30℃至约55℃、约30℃至约50℃、约40℃至约85℃、约40℃至约80℃、约40℃至约75℃、约40℃至约70℃、约40℃至约65℃、约40℃至约60℃、约40℃至约55℃、约40℃至约50℃、约50℃至约85℃、约50℃至约80℃、约50℃至约75℃、约50℃至约70℃、约50℃至约65℃、约50℃至约60℃、约50℃至约55℃、约52℃至约60℃、约52℃至约58℃、约52℃至约56℃或约52℃至约54℃。
[0182] 引物的长度可在5'末端或3'末端延长或缩短，以产生具有期望的解链温度的引物。引物对的一个引物可长于另一个引物。引物的3'退火长度可在引物对内不同。此外，每个引物对的退火位置可被这样设计，使得该引物对的序列和长度产生期望的解链温度。用于确定小于25个碱基对的引物的解链温度的等式是Wallace规则(Td＝2(A+T)+4(G+C))。计算机程序还可用来设计引物，计算机程序包括但不限于阵列设计者软件(Array Designer Software)(Arrayit Inc.)、用于遗传分析的寡核苷酸探针序列设计软件(Oligonucleotide Probe Sequence Design Software for Genetic Analysis)(Olympus Optical Co.)、NetPrimer以及来自Hitachi Software Engineering的DNAsis。每个引物的TM(解链温度或退火温度)可使用软件程序诸如Net Primer(在http://
www.premierbiosoft.com/netprimer/index.html的基于网络的免费程序)来计算。
www.premierbiosoft.com/netprimer/index.html的基于网络的免费程序)来计算。
[0183] 在一些情况下，具有基本上相似序列的两个等位基因可存在于样品内。在一些情况下，两个等位基因大小可相差1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb、17kb、18kb、19kb、20kb。在一些情况下，两个等位基因大小可相差少于2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb、
17kb、18kb、19kb、20kb或更少。在一些情况下，荧光报道物可被设计成仅靶向基本上相似的两个序列中的一个。在一些情况下，荧光报道物可与非靶等位基因不交叉反应。在一些情况下，荧光报道物可与非靶等位基因交叉反应。在一些情况下，交叉反应性的高速率可产生具有高于背景值的不同水平的荧光强度或振幅的小滴。
17kb、18kb、19kb、20kb或更少。在一些情况下，荧光报道物可被设计成仅靶向基本上相似的两个序列中的一个。在一些情况下，荧光报道物可与非靶等位基因不交叉反应。在一些情况下，荧光报道物可与非靶等位基因交叉反应。在一些情况下，交叉反应性的高速率可产生具有高于背景值的不同水平的荧光强度或振幅的小滴。
[0184] 探针
[0185] 在该方法的一些方面，使用探针在扩增反应中或在扩增反应之后生成一个或更多个信号。依据该方法的应用，某种类型的探针可以是期望的。在该方法的一些应用中，探针是随机序列或通用探针。通用探针可被设计成确保它不结合测定中的靶多核苷酸或不结合可能在样品中的其他非靶多核苷酸(例如，在被靶多核苷酸占据的区域之外的基因组DNA)。
[0186] 在该方法的一些应用中，探针是靶向的序列。例如，探针可被设计成结合至两个或更多个多态性并区分两个或更多个多态性。靶多态性探针的实例是以下探针：被设计成识别限制性片段长度多态性、单核苷酸DNA多态性、单核苷酸cDNA多态性、单核苷酸RNA多态性、单核苷酸RNA多态性、插入、缺失、插入缺失、微卫星重复序列(简单序列重复)、小卫星重复序列(可变数目的串联重复)、短串联重复序列、转座元件、随机扩增多态性DNA以及扩增片段长度多态性。在一些情况下，具有两种不同颜色的两种探针被用来区分两个或更多个多态性。在一些情况下，单一颜色的探针被用来区分两个多态性，由于其被设计成取决于它结合的哪种多态性发射具有不同振幅的信号。在一些情况下，它将更弱地结合至多态性中的一个，从而产生具有减少的幅度的信号。
[0187] 标签和染料
[0188] 在该方法的一些应用中，使用标签在扩增反应中或在扩增反应之后生成一个或更多个信号。标签可在探针的5’末端、探针的3’末端、在探针的5’末端和3’末端两者上或在探针的内部。独特的标签可被用来检测实验中的每个不同的基因座。可用于本文提供的方法、组合物和系统的标签的非限制性实例包括但不限于：用在探针(例如，Taqman探针)上检测本文描述的方法中的靶核酸序列或参考核酸序列的标签(荧光团、染料)，可以是，例如，6-羧基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、4,7,2′-三氯-7′-苯基-6-羧基荧光素(VIC)、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、四甲基罗丹明、ROX以及JOE。标签可以是Alexa Fluor染料，例如Alexa Fluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、633、647、660、680、700以及750。标签可以是级联蓝(Cascade Blue)、滨海蓝(Marina Blue)、俄勒冈绿500(Oregon Green
500)、俄勒冈绿514(Oregon Green 514)、俄勒冈绿488(Oregon Green 488)、俄勒冈绿488-X(Oregon Green 488-X)、太平洋蓝(Pacific Blue)、罗丹明绿、对甲氨基酚绿、罗丹明绿-X、罗丹明红-X、和德克萨斯红-X。
500)、俄勒冈绿514(Oregon Green 514)、俄勒冈绿488(Oregon Green 488)、俄勒冈绿488-X(Oregon Green 488-X)、太平洋蓝(Pacific Blue)、罗丹明绿、对甲氨基酚绿、罗丹明绿-X、罗丹明红-X、和德克萨斯红-X。
[0189] 在该方法的一些方面，使用Taqman探针在扩增反应中或在扩增反应之后生成一个或更多个信号。探针，(例如，Taqman探针)，可包含猝灭剂，例如，3'猝灭剂。3'猝灭剂可以是，例如，TAMARA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3。在一些情况下，在本文提供的方法中使用的猝灭剂是黑洞猝灭剂(BHQ)。在一些情况下，猝灭剂是小沟结合剂(MGB)。在一些情况下，猝灭剂是荧光猝灭剂。可检测的探针可包含荧光剂和猝灭剂分子。在其他情况下，猝灭剂是非荧光猝灭剂(NFQ)。
[0190] 探针可以是约或至少约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个碱基长。探针可以是约8个至约40个、约10个至约40个、约10个至约35个、约10个至约30个、约10个至约25个、约10个至约20个、约15个至约40个、约15个至约35个、约15个至约30个、约15个至约25个、约15个至约20个、约18个至约40个、约18个至约35个、约18个至约30个、约18个至约25个或约18个至22个碱基长。
[0191] 当检测来自与本公开内容一起使用的给定的探针、引物、标签或染料的信号时，该信号可通过其振幅强度(例如，图6)、通过其颜色或振幅强度和颜色两者(例如，图7、9和12)来区分。
[0192] 2.多重化
[0193] 一套(例如，一个或更多个)不同的检测探针可在该方法中被使用；例如，使用两个或更多个检测探针的多重可用来增加检测方法的灵敏度和/或增加检测的靶核酸的数目。在一些应用中，振幅调制的多种工具可被应用于本文公开的测定的多重化中。例如，振幅调制可包括但不限于扩增子大小、引物、探针、引物/探针、荧光团的混合物诸如例如FAM&HEX(或VIC)探针的～50:50的混合物等等，或其任何组合。例如，引物的浓度将影响扩增的效率和程度，转化为荧光振幅的差异。后者是对于待检测的特定物种的特征振幅。
[0194] 振幅调制可被应用于多重测定，其中两种不同的信号强度可区分两个不同的等位基因或两个不同的基因座。扩增子的长度可影响信号(例如，荧光标志物)的振幅或强度。在一些情况下，一组寡核苷酸序列可被设计成扩增不同长度的区域，例如，两个不同的基因座。在这些情况下，单一荧光标志物FAM可用来探测病毒样品。在这些情况下，FAM的不同振幅或强度可导致，并因此鉴定两个不同的基因座。
[0195] 探针组可以是包括以下的一个或更多个探针：约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个不同的检测标签。探针组可以是包括以下的一个或更多个探针：约1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种或30种不同的探针类型以及约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、
13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30种不同的检测标签。
13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30种不同的检测标签。
[0196] 本文提供的方法还提供了待多重化的重组测定。给定的探针可具有约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个附连的不同的检测标签。例如，两种或更多种颜色可在本文提供的方法中被使用，可以是以下的组合：FAM:BHQ以及NFQ-MGB测定；VIC:NFQ-MGB、TAMRA、HEX:BHQ。5'和3'标记可被使用，且内部标记的染料可被使用。在一些情况下，本文提供的方法中使用的颜色的数目大于两种，例如，大于3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种或20种颜色。
[0197] 图6示出了使用ddPCR和一种或更多种荧光团的振幅强度的cDNA基因表达测定的多重实验的一个应用。脑总RNA(Ambion)被获得并经历逆转录反应以生成cDNA。cDNA然后被分区(例如，使用小滴发生器)至单个隔室(例如，小滴)内。图示出了对于给定样品中以下每个荧光团是阳性和阴性的小滴的数目的测量结果：琥珀酸脱氢酶(SDHA)、β-2-微球蛋白(B2M)以及SDHA和B2M的组合。将样品中每个小滴绘制在y轴上振幅强度(例如，FAM振幅)对x轴上小滴数目(例如，事件数目)的图上。高于给定的阈值强度的所有阳性小滴(由黑体线所示)被评分为阳性并分配FAM振幅的值。所有阴性小滴(低于阈值的那些)被评分为阴性，且每个被分配零值。不同的荧光团SDHA、B2M以及SDHA和B2M的组合的读出通过其振幅的强度的水平来区分。阳性小滴的分数然后被拟合至泊松分布，以确定靶DNA分子以拷贝/μl(例如，cp/μl)的单位在输入反应混合物中的绝对数目。B2M和SDHA标志物的总拷贝数目/μl可从此类分析来计算。
[0198] 图9A-C示出了使用ddPCR在两个亲本毒株诸如图8中示出的那些之间的重组测定的多重实验的一个应用。图8示出了毒株A，其中A1用低振幅FAM来标记且A2用高振幅FAM来标记；以及毒株B，其中B1用低振幅HEX(或VIC)来标记且B2用高振幅HEX(或VIC)来标记。使用该标志物方案，亲本毒株使用荧光颜色(例如，FAM或HEX)来鉴定，且在相同亲本毒株上的单独的标志物(例如基因座)使用振幅强度(例如，高或地)来鉴定。
[0199] 在2-D图(图9A、9B、9C)中观察到了扩增的标志物，其中对于每个小滴，Ch1荧光水平相对于Ch2荧光水平来绘制。具有相同Ch1荧光水平和Ch2荧光水平的一个或更多个小滴可形成簇。簇可代表具有相同Ch1荧光水平和Ch2荧光水平的一个或更多个小滴。簇可代表具有相同分子的一个或更多个小滴。簇可代表具有不同分子的一个或更多个小滴。两种荧光颜色和两种振幅强度的不同组合可生成另外的簇。多于两种荧光颜色、多于两种振幅强度、多于两个亲本毒株或其组合可增加出现在簇图上的簇的数目。簇图可以是3D图。
[0200] 在非常高的稀释(例如，高数目小滴以及每小滴低数目拷贝)，参见图9A，小滴被聚集成5个不同的组：1组被测定为阴性(-/-)或不具有被检测的标志物、亲本的2个不同的组(A1-A2和B1-B2，还参见图10A)以及重组体的2个不同的组(A1-B2和B1-A2，还参见图10B)。在高稀释和低水平的片段化下，参见图9B，仅包含片段A1、仅包含片段A2、仅包含片段B1以及仅包含片段B2的另外的簇出现，还参见图10C。簇A1、A2、B1以及B2的浓度可用来计算片段化的程度。片段化的程度可用来通过消除偶然共定位的数目校正基因组在样品中的总数目。在低稀释下(例如，对于每个小滴的高拷贝数目)，另外的簇可出现，参见图9C。在这些稀释情况下，可能包含亲本或重组分子的小滴还可包含片段。例如，A1-A2小滴可包含A1和A2片段。对于B1-B2、A1-B2以及B1-A2分区同样如此。四组被检测为具有三个不同的标志物：
A1-A2、B1(片段(frag))或A1-A2、B2(片段)或B1-B2、A1(片段)或B1-B2、A2(片段)。注意，以下也是可能的：A1-A2，B1事实上是B1-A2，A1(片段)或甚至A1(片段)，A2(片段)，B1(片段)；
A1-A2，B2(片段)事实上是A1-B2，A2(片段)或A1(片段)，B2(片段)；A2(片段)。检测到一个组，该一个组具有四个不同的标志物A1+B1、A2+B2，其可反映四个不同的片段，或核酸的两条链诸如A1-A2和B1-B2或其他组合。在高稀释的九组或在低稀释的十六组可通过它们的由它们的不同的Ch1和Ch2荧光强度生成的颜色和/或通过比较它们的振幅强度来区分。
A1-A2、B1(片段(frag))或A1-A2、B2(片段)或B1-B2、A1(片段)或B1-B2、A2(片段)。注意，以下也是可能的：A1-A2，B1事实上是B1-A2，A1(片段)或甚至A1(片段)，A2(片段)，B1(片段)；
A1-A2，B2(片段)事实上是A1-B2，A2(片段)或A1(片段)，B2(片段)；A2(片段)。检测到一个组，该一个组具有四个不同的标志物A1+B1、A2+B2，其可反映四个不同的片段，或核酸的两条链诸如A1-A2和B1-B2或其他组合。在高稀释的九组或在低稀释的十六组可通过它们的由它们的不同的Ch1和Ch2荧光强度生成的颜色和/或通过比较它们的振幅强度来区分。
[0201] 在一些情况下，取决于测定中使用的上游制备方法，给定的2D簇可包含与通常主要物种相比的靶分子的其他组合。例如，在制备期间，其牵涉高片段化分子(例如A1-B2还可以是不连锁构型中的A1、B2)。这可使用本文提供的以及在相关申请美国申请号13/385,277中的片段化算法来确定。
[0202] 图11示出了在两个亲本毒株之间使用ddPCR的重组频率测定的多重实验的一个应用，其中在单一亲本毒株上的2个标志物(例如，基因座)通过颜色来区分，且亲本毒株本身通过振幅来区分。图11示出了分子标志物的分配(在毒株A中，A1用低强度荧光FAM标记，以及A2用低强度荧光HEX(或VIC)标记；以及毒株B，在毒株B中，B1用高振幅荧光FAM标记以及B2用高振幅荧光HEX(或VIC)标记。2-D簇图的相应示意，参见图12，显示亲本和重组体的测量结果。在2-D图中观察到了扩增的标志物，其中对于每个小滴，Ch1振幅荧光相对于Ch2振幅荧光来绘制。小滴被聚集成感兴趣的九个主要的组：阴性，无标志物存在；A1-A2(亲本A)；B1-B2(亲本B)；A1-B2(重组体)；B1-A2(重组体)；A1(片段)；B1(片段)；A2(片段)；B2(片段)。
[0203] 图7示出了用于重组测定的多重实验的一个应用，使用ddPCR与两个荧光团和振幅强度调制，以评分单孔内的三(3)个标志物。图示出了对于以下每个荧光团是阳性和阴性的小滴的数目的测量结果：具有两个FAM和一个VIC的三联体：SDHA-FAM、B2M-FAM、GAPDH-VIC。将样品中每个小滴绘制在y轴上振幅强度(例如，FAM或VIC振幅)对x轴上小滴数目(例如，事件数目)的图上。高于给定的阈值强度的所有FAM阳性小滴(由黑体线所示)被评分为阳性并分配FAM振幅的值(图7A)。高于给定的阈值强度的所有VIC(或HEX)阳性小滴(由黑体线所示)被评分为阳性并分配VIC振幅的值(图7B)。所有阴性小滴(低于阈值的那些)。组可通过它们的颜色和基于它们的荧光团重组的振幅强度来区分。在一些情况下，确定阈值强度可以是迭代过程。在一些情况下，阈值强度可被选择且高于所述阈值的小滴的总数目可被定量。该步骤随后可以是在亚群内增加阈值强度和重复小滴定量。该过程可被重复直到被定量的小滴的数目在一个强度阈值和下一个增加之间基本上不改变。
[0204] 在该应用的一些方法中，重组的程度可被计算。在一些情况下，重组的程度可使用随机分区组合数学来计算。在一些情况下，重组的程度可在两个亲本毒株之间来计算。在一些情况下，重组的程度可在三个亲本毒株之间来计算。在一些情况下，重组的程度可在多于两个的亲本毒株之间来计算。
[0205] 在一些情况下，使用在给定簇内的分区(例如小滴)的数目估算重组的程度可以是可能的。在一些情况下，使用九个簇估算重组的程度可以是可能的。在一些情况下，使用少于九个的簇估算重组的程度可以是可能的。在一些情况下，使用多于九个的簇估算重组的程度可以是可能的。在一些情况下，使用16个簇估算重组的程度可以是可能的。在一些情况下，使用少于16个的簇估算重组的程度可以是可能的。在一些情况下，使用多于16个的簇估算重组的程度可以是可能的。在一些情况下，使用2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个的簇估算重组的程度可以是可能的。在一些情况下，使用少于2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更少的簇估算重组的程度可以是可能的。在一些情况下，使用多于2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、
20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多的簇估算重组的程度可以是可能的。在一些情况下，与使用较少的簇的估算相比，更多的簇估算重组的程度可提供较小的方差。
20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多的簇估算重组的程度可以是可能的。在一些情况下，与使用较少的簇的估算相比，更多的簇估算重组的程度可提供较小的方差。
[0206] 3.共定位
[0207] 样品分区以及分析隔室内多个靶的能力允许人们当靶在样品中空间地聚集在一起时进行检测。这可通过如下来完成：评估具有标志物的特定组合的隔室的数目与如果靶随机分布在隔室内将预期的数目相比是否在统计上过量。此类隔室的过于丰富的程度可被用来估算标志物的组合的浓度。
[0208] 例如，人们可使用PCR方法(例如，ddPCR)测量两个标志物：A和B。例如，将存在四种类型的小滴隔室：对于两个靶阴性的小滴、对于A阳性的小滴、对于B阳性的小滴以及对于两者阳性的小滴。在随机分布下，双阳性小滴的数目应该接近(小滴的总数目)*(具有至少B的小滴的分数)*(具有至少A的小滴的分数)。如果双阳性小滴的的数目显著超过预期，可做出两个靶在样品中彼此接近的推论。该结果可意味着，靶A和B是物理上连锁的(由于，例如，在相同多核苷酸上，在相同病毒颗粒上)，它们是相同蛋白/核酸复合体的一部分，它们是相同外来体的一部分，或它们是相同细胞的一部分。
[0209] 特定靶在分区中的存在可通过使用对该靶特异性的荧光团作为基于探针的TaqMan测定方案的一部分来评估。例如，当测量两个靶A和B时，人们对于A可使用FAM且对于B可使用VIC。在一些应用中，不同的靶可使用端点荧光用相同的荧光团或嵌入染料来评估，以从包含B的那些、从包含A和B的那些区分包含A的分区。例如，参见图7，其示出了具有多种探针类型的多重测定。
[0210] 在该方法的一些应用中，一组探针、标签和/或染料或其组合在扩增反应中或在扩增反应之后被用来在隔室内生成从重组体基因组区分亲本基因组的一个或更多个信号。在该方法的一些应用中，探针、标签和/或染料或其组合在扩增反应中或在扩增反应之后被用来在隔室内生成确定重组率的一个或更多个信号。在该方法的一些应用中，探针、标签和/或染料或其组合在扩增反应中或在扩增反应之后被用来在隔室内生成确定生长率的一个或更多个信号。本领域已知的任何探针可在本文提供的方法中被使用，本领域已知的任何探针包括但不限于TaqMan探针、嵌入DNA的染料、分子信标、荧光标志物，p-点(p-Dots)等。本文描述的方法经常牵涉扩增步骤。然而，在一些情况下，方法不包括扩增步骤。例如，当探针是分子信标探针时，扩增步骤可以不是必需的。
[0211] 4.ddPCR的数字分析
[0212] 用于本文描述的方法、组合物和试剂盒的数字PCR装置(例如，小滴数字PCR装置)可检测多个信号(参见例如本文通过引用以其整体并入的2011年3月18日提交的美国临时专利申请号61/454,373)。
[0213] 小滴数字PCR可牵涉每秒数千次离散的、稳固的小滴反应器的生成。ddPCR可牵涉标准的热循环与安装的基础仪器，其可使研究人员立即访问数字数据。每个小滴的快速询问可产生存在于初始样品中的靶分子的计数。
[0214] 数字读出测定，例如，数字PCR，可被用来通过分区样品中的靶并鉴定包含靶的隔室计数标志物(例如，靶核酸序列或标志物)。数字读出是所有或全无分析，由于它指定给定的隔室是否包含感兴趣的靶，但并不一定指出隔室内有靶的多少拷贝。例如，包含两个靶的单个多核苷酸可在一个隔室内，但在正常分析条件下，该隔室将仅被认为包含一个靶。如果相同多核苷酸上的靶被大数目碱基对间隔，靶核酸序列中的一些可在样品的纯化期间由片段化来分离，一些连锁的靶核酸序列可在样品分离之后不保持物理连锁。数字PCR通常被描述，例如，在Vogelstein和Kinzler(1999)PNAS96:9236-9241。该技术的应用包括，但不限于，例如，病毒重组分析、病毒重组率确定、病毒载量分析、病毒签名在生物样品中的检测、高分辨率基因组分子标志物测量、全基因组关联研究、细胞遗传学分析、被病毒感染的癌组织中的改变、及连锁分析，以及如本文描述的其他应用。
[0215] 通常，dPCR可牵涉从样品空间分离(或在隔室中分区)单独的多核苷酸或多肽，以及对每个隔室进行聚合酶链式反应。隔室可以是，例如，孔(例如，微孔板的孔)、毛细管、乳液的分散相、室(例如、在小型化室阵列中的室)、小滴或核酸结合表面。样品可以被分配，使得每个隔室具有约0个、1个或2个靶多核苷酸或多肽。每个隔室可具有每隔室(例如，小滴)平均少于5个、4个、3个、2个或1个拷贝的靶核酸或多肽。在一些情况下，至少0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、125个、150个、175个或200个隔室(例如，小滴)具有零拷贝个靶核酸或多肽。在PCR扩增之后，有或没有PCR产物的隔室的数目可被计数。隔室的总数目可以是约或多于约500个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10,000个、11,
000个、12,000个、13,000个、14,000个、15,000个、16,000个、17,000个、18,000个、19,000个、20,000个、30,000个、40,000个、50,000个、60,000个、70,000个、80,000个、90,000个、
100,000个、150,000个、200,000个、500,000个、750,000个或1,000,000个。隔室的总数目可以是约500个至约1,000,000个、约500个至约500,000个、约500个至约250,000个、约500个至约100,000个、约1000个至约1,000,000个、约1000个至约500,000个、约1000个至约250,
000个、约1000个至约100,000个、约10,000个至约1,000,000个、约10,000个至约100,000个或约10,000个至约50,000个。
000个、12,000个、13,000个、14,000个、15,000个、16,000个、17,000个、18,000个、19,000个、20,000个、30,000个、40,000个、50,000个、60,000个、70,000个、80,000个、90,000个、
100,000个、150,000个、200,000个、500,000个、750,000个或1,000,000个。隔室的总数目可以是约500个至约1,000,000个、约500个至约500,000个、约500个至约250,000个、约500个至约100,000个、约1000个至约1,000,000个、约1000个至约500,000个、约1000个至约250,
000个、约1000个至约100,000个、约10,000个至约1,000,000个、约10,000个至约100,000个或约10,000个至约50,000个。
[0216] 在一些应用中，数字PCR是小滴数字PCR。在小滴数字PCR实验的一些应用中，靶多核苷酸或多肽的少于约0.00001个、0.00005个、0.00010个、0.00050个、0.001个、0.005个、0.01个、0.05个、0.1个、0.5个、1个、2个、2.5个、3个、3.5个、4个、4.5个、5个、6个、7个、8个、9个或10个标志物可检测。在一些情况下，靶多核苷酸或多肽的少于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个、250个、
300个、350个、400个、450个或500个标志物被检测。在一些情况下，本文描述的小滴以大于1个、2个、3个、4个、5个、10个、50个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、
900个或1000个小滴/秒的速度被生成。
300个、350个、400个、450个或500个标志物被检测。在一些情况下，本文描述的小滴以大于1个、2个、3个、4个、5个、10个、50个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、
900个或1000个小滴/秒的速度被生成。
[0217] 使用ddPCRTM的方法可允许(empower)人们在单工作班次(work shift)中筛选许多样品，例如，数以百计的样品，用于病毒重组和重组率分析。在一个实施方案中，提供了ddPCRTM工作流程，牵涉在组装双链体 测定之前使用一种或更多种限制性内切酶分离串联拷贝的靶核酸序列，双链体 测定包括检测靶核酸序列(例如，第一基
因)和单拷贝参考核酸序列(例如，第二基因)两者的试剂。
因)和单拷贝参考核酸序列(例如，第二基因)两者的试剂。
[0218] 本公开内容允许使用ddPCR来进行本文提供的重组测定以及确定关于病毒状态的信息的方法，病毒状态的信息诸如，绝对定量病毒重组率、病毒载量、病毒颗粒的标志物辅助的基因分型、病毒颗粒的分子签名、毒力和生长率。在其他方面，使用ddPCR重组测定的方法可用于在体外或体内生成和繁殖医学利益诸如基因疗法或细胞疗法的或用于科学研究工具诸如基因表达系统的新的病毒毒株。
[0219] 当ddPCRTM与该方法一起使用时，反应混合物可然后被分区至约、少于约或多于约500纳升、1000纳升、2000纳升、3000纳升、4000纳升、5000纳升、6000纳升、7000纳升、8000纳升、9000纳升、10,000纳升、11,000纳升、12,000纳升、13,000纳升、14,000纳升、15,000纳升、16,000纳升、17,000纳升、18,000纳升、19,000纳升、20,000纳升、30,000纳升、40,000纳升、50,000纳升、60,000纳升、70,000纳升、80,000纳升、90,000纳升、100,000纳升、150,000纳升、200,000纳升、500,000纳升、750,000纳升、1,000,000纳升、2,000,000纳升、3,000,
000纳升、4,000,000纳升、5,000,000纳升、6,000,000纳升、7,000,000纳升、8,000,000纳升、9,000,000或10,000,000纳升的小滴内，其可在被分析之前被热循环至终点。在一些情况下，小滴大于一纳升；在其他情况下，小滴少于一纳升(例如，微微升)。每反应小滴的数目可以是约1000个至约1,000,000个、约1000个至约750,000个、约1000个至约500,000个、约
1000个至约250,000个、约1000个至约100,000个、约1000个至约50,000个、约1000个至约
30,000个、约1000个至约10,000个、约10,000个至约1,000,000个、约10,000个至约750,000个、约10,000个至约500,000个、约10,000个至约250,000个、约10,000个至约100,000个、约
10,000个至约50,000个或约10,000个至约30,000个。每反应小滴的数目可以是约20,000个至约1,000,000个、约20,000个至约750,000个、约20,000个至约500,000个、约20,000个至约250,000个、约20,000个至约200,000个、约20,000个至约50,000个、约50,000个至约100,
000个、约50,000个至约200,000个；或约50,000个至约300,000个。
000纳升、4,000,000纳升、5,000,000纳升、6,000,000纳升、7,000,000纳升、8,000,000纳升、9,000,000或10,000,000纳升的小滴内，其可在被分析之前被热循环至终点。在一些情况下，小滴大于一纳升；在其他情况下，小滴少于一纳升(例如，微微升)。每反应小滴的数目可以是约1000个至约1,000,000个、约1000个至约750,000个、约1000个至约500,000个、约
1000个至约250,000个、约1000个至约100,000个、约1000个至约50,000个、约1000个至约
30,000个、约1000个至约10,000个、约10,000个至约1,000,000个、约10,000个至约750,000个、约10,000个至约500,000个、约10,000个至约250,000个、约10,000个至约100,000个、约
10,000个至约50,000个或约10,000个至约30,000个。每反应小滴的数目可以是约20,000个至约1,000,000个、约20,000个至约750,000个、约20,000个至约500,000个、约20,000个至约250,000个、约20,000个至约200,000个、约20,000个至约50,000个、约50,000个至约100,
000个、约50,000个至约200,000个；或约50,000个至约300,000个。
[0220] 分析可发生在数字检测器诸如，例如色彩阅读器中。阳性计数的小滴的分数可使靶或参考核酸序列(例如，基因、基因中的遗传变异或核酸区段或靶序列或多肽)的绝对浓度能够被测量。该信息可被用来确定遗传变体的相对数目。例如，每孔至少20,000个PCR复制可提供解决量中的高量级差异的统计功效。该低成本方法可以可靠地生成跨越整数没有相邻状态重叠的具有95％置信区间的测量结果。该技术能够确定遗传变体的连锁，且它可被用来确定该遗传变体是否在相同的或不同的链或染色体上或确定它们在基因组中相距多远。
[0221] 体积可具有任何适合的大小。在一些应用中，体积可具有约1至10微米、1至100微米或1至1000微米的直径或特征横截面维度。在一些应用中，体积可具有约10至100微米、10至1000或10至10,000微米的直径或特征横截面维度。
[0222] 被分区的核酸可具有任何适合的特征。核酸可包括本文提供的受试者的遗传材料(例如，受试者的基因组DNA和/或RNA)、受试者的信使RNA、和/或来源于受试者的RNA的cDNA，以及其他。核酸可具有任何适合的平均长度。通常，平均长度基本上大于待分析的多态性基因座(例如，遗传变异)之间在染色体上的距离。以该平均长度，被研究的多核苷酸中的分子标志物在分离的核酸中频发的连锁，并因此当水相被分区时趋向于一起分布至相同的体积。在一些应用中，每个引物组可能够从基因组区段、靶序列、单倍型或基因座扩增至少一对独特的分子标志物。在一些应用中，每个引物组可能够从多肽或肽靶序列或携带多肽的遗传变异的已知区域扩增至少一对独特的分子标志物。
[0223] 每个体积可被分区成包含任何适合的平均浓度的核酸。通常，分区的过程与水相中核酸的适合的起始浓度组合，产生具有平均每体积小于约几个基因组当量的核酸的体积。尽管该方法可用平均每体积多于一个的基因组当量(例如，每体积约两个基因组当量)来进行，通过将浓度限制至平均每体积少于约一个的基因组当量，分析通常以较少的背景变得更有效和可靠。因此，每个体积可包含靶区域(其包含每个多态性基因座)的平均少于约一个拷贝或分子，和/或每个多态性基因座(例如，遗传变异)的平均少于约一个拷贝的任何等位基因序列。
[0224] 5.邻位连接测定
[0225] 本发明的方法、组合物和试剂盒可结合蛋白和大分子检测测定诸如，例如，邻位连接测定(PLA)一起使用，参见图13。邻位连接测定可检测蛋白、蛋白相互作用或蛋白修饰的存在。在一些情况下，PLA测定使用能够识别两种不同的靶抗原的两个或更多个PLA抗体来进行。在一些情况下，PLA抗体被缀合至寡核苷酸。当它们的靶非常邻近时，一个PLA抗体的寡核苷酸可被连接至另一个PLA抗体的寡核苷酸。扩增反应然后可被进行，以检测连接产物。在一些情况下，能够“桥接”两个分子的第三寡核苷酸被用来检测连接的产物。在一些情况下，寡核苷酸可被设计成以其他方式相互作用；例如，它们可杂交，使得寡核苷酸中的一个可使用另一个寡核苷酸作为模板引发扩增反应(参见，例如，本文有关PEA测定的讨论)。在仍其他实例中，能够识别两种寡核苷酸的第三“桥接”寡核苷酸被引入。在一些情况下，PLA测定可不包括第三桥接寡核苷酸。
[0226] PLA测定可在重组病毒颗粒测定中特别有用。例如，重组病毒颗粒可具有蛋白，所述蛋白具有来源于两种或更多种不同病毒属、毒株或物种的结构域。在一些情况下，重组颗粒可具有两种不同的蛋白，其中每个蛋白来源于不同的病毒属、物种或毒株。PLA测定可确定两种不同的结构域是否存在于相同的病毒颗粒内。
[0227] 在一些情况下，PEA(邻近延伸测定)可被进行。在这些情况下，至少两个探针(例如，缀合至寡核苷酸的抗体)结合至单独的靶(例如，基因座)，其中单独的靶距离足够接近，或其中探针足够长或两者，使得两个抗体连接的寡核苷酸的重叠可发生。在此类情况下，寡核苷酸中的一个可以能够充当引物，与另一个寡核苷酸杂交，并使用它作为模板用于引物延伸反应或其他扩增反应。在一些情况下，PEA测定可不包括两个抗体连接的寡核苷酸的充分重叠。在这些情况下，可提供第三寡核苷酸，其具有与每个邻近探针同源的区域，且其可充当两个探测的靶之间的分子桥。在一些情况下，PEA测定可包括第三桥接寡核苷酸。在一些情况下，PEA测定可包括多个桥接寡核苷酸。在一些情况下，PEA测定可不包括第三桥接寡核苷酸。
[0228] 在一些情况下，PLA抗体可各自被附连至具有不同序列的PLA寡核苷酸。连接反应可被进行，以当它们非常邻近时，将两个或更多个不同的PLA寡核苷酸连接在一起(参见图13)。连接的PLA寡核苷酸可然后使用识别两种PLA寡核苷酸序列的探针来检测。在一些情况下，探针是能够在连接之后环化(circularizing)的分子倒置探针。环化的分子倒置探针可通过本领域已知的任何方法来检测。在一些情况下，分子倒置探针通过，例如，PCR、实时PCR或滚环PCR来扩增。在一些情况下，探针是各自识别不同的PLA寡核苷酸的两个或更多个线性连接探针。在杂交之后，线性探针可通过本领域已知的任何方法来扩增。
[0229] 在一些情况下，两组或更多组抗体可被使用。在一些情况下，病毒颗粒与第一抗体的组接触，其中抗体的子集来源于一种物种(例如，小鼠、兔)并识别一种靶多肽序列，且抗体的子集来源于不同的物种且识别第二靶多肽序列。物种特异性第二抗体可然后结合至第一抗体，其中物种特异性第二抗体的每个被附连至独特的寡核苷酸序列。具有不同序列且非常邻近的寡核苷酸可然后使用本文描述的方法或本领域已知的其他方式来检测。
[0230] 本公开内容提供了使用本文提供的步骤、方法、试剂盒、系统和组合物结合邻位连接测定检测病毒、蛋白的存在、蛋白相互作用或蛋白修饰。本公开内容还提供了使用本文提供的步骤、方法、试剂盒、系统和组合物结合邻位连接测定检测病毒核苷酸和蛋白。
[0231] 准确度和灵敏度
[0232] 本文提供的方法和组合物可以以高的准确度定量样品中的多核苷酸(例如，病毒RNA或DNA多核苷酸)。牵涉凝胶电泳和测序的当前方法是不准确的或耗时的。这些方法易于在未分区的逆转录(RNA病毒的)期间发生体外重组人为现象(artifacts)，且PCR扩增导致人为的高数目重组体被测量到(Negroni等，1995；Diaz&DeStefano,1996；Frohman&Martin。本文提供的方法和系统通常用于ddPCR应用。然而，在一些情况下，为了在测定期间最小化重组，样品(例如，病毒样品或细菌样品或其他微生物)可被分区至在油包水乳液内的含水小滴内，使得不超过一个的微生物、不超过两个的微生物、不超过三个的微生物、不超过四个的微生物或不超过五个的微生物在单个小滴内。小滴(或其他类型的分区，例如，孔)可经历具有减少的水平的人为重组的扩增反应。小滴或分区可然后被汇集并通过任何其他方法诸如通过测序(例如，NextGen测序)来分析。
[0233] 在一些情况下，本文提供的方法和组合物可以以大于以下的准确度定量样品中多核苷酸(例如，病毒RNA或DNA多核苷酸、重组的多核苷酸等等)的量：1％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、
99.2％、99.5％、99.7％或99.9％。在一些情况下，本文提供的方法和组合物可以以大于以下的灵敏度定量多核苷酸(例如，样品中病毒RNA或DNA多核苷酸、样品中重组的核酸等等)的量：1％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.7％或99.9％。本文提供的方法和组合物可以以大于以下的准确度定量样品中多肽(例如，病毒多肽)的量：1％、10％、20％、30％、
40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、
99.2％、99.5％、99.7％或99.9％。本文提供的方法和组合物可以以大于以下的灵敏度定量样品中多肽(例如，病毒多肽)的量：1％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、
70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.7％或
99.9％。本文提供的方法和组合物可以以优异的置信区间定量样品中大分子(例如，病毒大分子)的量。本文提供的方法和组合物可以以大于以下的置信区间定量样品中的多核苷酸和多肽(例如，病毒颗粒)的量：1、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.7％或99.9％。
99.2％、99.5％、99.7％或99.9％。在一些情况下，本文提供的方法和组合物可以以大于以下的灵敏度定量多核苷酸(例如，样品中病毒RNA或DNA多核苷酸、样品中重组的核酸等等)的量：1％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.7％或99.9％。本文提供的方法和组合物可以以大于以下的准确度定量样品中多肽(例如，病毒多肽)的量：1％、10％、20％、30％、
40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、
99.2％、99.5％、99.7％或99.9％。本文提供的方法和组合物可以以大于以下的灵敏度定量样品中多肽(例如，病毒多肽)的量：1％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、
70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.7％或
99.9％。本文提供的方法和组合物可以以优异的置信区间定量样品中大分子(例如，病毒大分子)的量。本文提供的方法和组合物可以以大于以下的置信区间定量样品中的多核苷酸和多肽(例如，病毒颗粒)的量：1、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.7％或99.9％。
[0234] 在一些应用中，本文提供的方法和组合物可以以是用于确定样品诸如血液或组织中病毒多核苷酸重组率的相同测定的灵敏度的至少1％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、
99.5％、99.7％或99.9％的灵敏度定量起源于在生物样品(例如，感染病毒的细胞)内的病毒的多核苷酸，其中病毒多核苷酸的起源来自一种或更多种不同的病毒毒株、属、物种或亚型。
99.5％、99.7％或99.9％的灵敏度定量起源于在生物样品(例如，感染病毒的细胞)内的病毒的多核苷酸，其中病毒多核苷酸的起源来自一种或更多种不同的病毒毒株、属、物种或亚型。
[0235] 本公开内容提供了用于快速、有效和灵敏地检测细胞过程诸如重组率或生长率的工具。在一些应用中，少于约0.00001个、0.00005个、0.00010个、0.00050个、0.001个、0.005个、0.01个、0.05个、0.1个、0.5个、1个、2个、2.5个、3个、3.5个、4个、4.5个、5个、6个、7个、8个、9个或10个拷贝的靶多核苷酸或遗传变异被检测，以确定重组率或生长率。在一些应用中，少于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个或500个拷贝的靶多核苷酸遗传变异被检测，以确定毒力。在一些应用中，少于约0.00001个、0.00005个、0.00010个、0.00050个、0.001个、0.005个、0.01个、0.05个、0.1个、0.5个、1个、2个、2.5个、3个、3.5个、4个、4.5个、5个、6个、7个、8个、9个或10个拷贝的靶多核苷酸/隔室、拷贝的靶多肽/隔室、拷贝的遗传变异/隔室或基因组拷贝/隔室被检测，以确定重组率、生长率或一些其他参数。在一些应用中，少于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、
15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个或500个拷贝的靶多核苷酸/隔室、靶多肽/隔室、拷贝的遗传变异/隔室或基因组拷贝/隔室被检测，以确定毒力。
15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个或500个拷贝的靶多核苷酸/隔室、靶多肽/隔室、拷贝的遗传变异/隔室或基因组拷贝/隔室被检测，以确定毒力。
[0236] 在一些应用中，少于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个或500个拷贝的靶多核苷酸遗传变异或多肽被检测，以确定病毒签名。在一些应用中，每隔室少于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、
35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、
200个、250个、300个、350个、400个、450个或500个拷贝的靶多核苷酸遗传变异或多肽被检测，以确定病毒签名。
35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、
200个、250个、300个、350个、400个、450个或500个拷贝的靶多核苷酸遗传变异或多肽被检测，以确定病毒签名。
[0237] 在一些应用中，少于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个或500个拷贝的靶多核苷酸遗传变异或多肽被检测，以确定样品中的病毒载量。在一些应用中，少于1个、
2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、
35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、
200个、250个、300个、350个、400个、450个或500个拷贝的靶多核苷酸遗传变异或多肽被检测，以确定病毒的分类学或基因型。在一些应用中，少于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、
60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、
400个、450个或500个拷贝的靶多核苷酸遗传变异或多肽被检测，以确定病毒的遗传漂移程度。
2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、
35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、
200个、250个、300个、350个、400个、450个或500个拷贝的靶多核苷酸遗传变异或多肽被检测，以确定病毒的分类学或基因型。在一些应用中，少于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、
60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、
400个、450个或500个拷贝的靶多核苷酸遗传变异或多肽被检测，以确定病毒的遗传漂移程度。
[0238] 在一些情况下，本文提供的方法和组合物包括检测样品中重组的核酸，其中样品中总核酸的少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、0.00001％是重组的核酸。在一些情况下，本文提供的方法和组合物包括检测样品中重组的多肽，其中样品中总多肽的少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％、
0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、0.00001％是重组的多肽。在一些情况下，本文提供的方法和组合物包括检测样品中重组的核酸，其中样品中包含一个或更多个特定基因座的总核酸的少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、
1％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、0.00001％是重组的核酸。在一些情况下，本文提供的方法和组合物包括检测样品中重组的多肽，其中样品中包含一种或更多种特定的氨基酸序列的总多肽的少于20％、15％、10％、9％、8％、
7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、
0.0001％、0.00005％、0.00001％是重组的多肽。
0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、0.00001％是重组的多肽。在一些情况下，本文提供的方法和组合物包括检测样品中重组的核酸，其中样品中包含一个或更多个特定基因座的总核酸的少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、
1％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、0.00001％是重组的核酸。在一些情况下，本文提供的方法和组合物包括检测样品中重组的多肽，其中样品中包含一种或更多种特定的氨基酸序列的总多肽的少于20％、15％、10％、9％、8％、
7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、
0.0001％、0.00005％、0.00001％是重组的多肽。
[0239] 在一些情况下，重组的核酸包含第一基因座和第二基因座的遗传变异。本文提供的方法和组合物能够检测样品中此类重组的核酸，其中包含第一基因座的核酸的少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、
0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％或0.00001％是重组的核酸。在一些情况下，重组的多肽包含第一基因座和第二基因座的遗传变异。本文提供的方法和组合物能够检测样品中此类重组的多肽，其中包含第一基因座的多肽的少于20％、15％、10％、9％、
8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、
0.0001％、0.00005％或0.00001％是重组的核酸。
0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％或0.00001％是重组的核酸。在一些情况下，重组的多肽包含第一基因座和第二基因座的遗传变异。本文提供的方法和组合物能够检测样品中此类重组的多肽，其中包含第一基因座的多肽的少于20％、15％、10％、9％、
8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、
0.0001％、0.00005％或0.00001％是重组的核酸。
[0240] III.用于重组测定的系统
[0241] 本公开内容提供了用于重组分析的系统，包括：(a)小滴发生器，其被配置成形成包含核酸或蛋白或病毒颗粒等等的水相的小滴；(b)检测器，其被配置成收集用于来自单独小滴的标志物的每个的遗传变异特异性扩增数据；以及(c)处理器，其被配置成将第一基因座的遗传变异特异性扩增数据与来自相同体积的第二基因座的遗传变异特异性扩增数据相关以及基于所述遗传变异特异性扩增数据的关联描述或选择所述第一和第二基因座的核酸的特定签名(例如，鉴定亲本基因组、重组基因组或两者)。
[0242] 图4示出了本文提供的系统400用于进行方法的选择的方面的示意图。系统可包括小滴发生器(DG)410、热循环仪(TC)420、检测器(DET)430以及处理器(PROC)440。箭头450-470在系统组件之间延伸，以分别指示小滴(450和460)的移动和数据(470)。
[0243] 小滴发生器410可形成小滴诸如在油包水乳液中的含水小滴，使得小滴包含核酸或蛋白或病毒颗粒等等。小滴可被连续或并行形成。在一些情况下，小滴也包含另外的组分诸如试剂、引物和/或探针，扩增反应(例如，PCR、RT-PCR、逆转录PCR等等)所必需的试剂。
[0244] 热循环仪420可将小滴暴露于加热和冷却的多个循环以驱动扩增，诸如等位基因序列的PCR扩增。热循环仪可以是并行扩增所有小滴的分批热循环仪，或可以是连续扩增小滴的基于流的热循环仪等等。
[0245] 检测器430收集扩增数据，诸如来自小滴的等位基因特异性或遗传变异特异性扩增数据。检测器，例如，可以是荧光检测器，并可连续或并行检测小滴。
[0246] 还可被称为控制器的处理器440可与检测器430通讯，并可被编程以处理来自检测器的扩增数据。可以是数字处理器的处理器可被编程以处理来自检测器的原始数据，诸如，以减去背景和/或基于小滴大小标准化小滴数据。处理器还或可选地可被编程以应用阈值将数据转换成二进制形式，以进行扩增数据的相关，以计算和/或比较共扩增的一个或更多个量度，以基于相关性和/或量度、重组率或其任何组合选择重组体。
[0247] 图5示出了进行示例性方法的装置和系统的选择方面的示意图，使用ddPCR用于检测病毒重组体并确定病毒重组率或如本文提供的其他病毒测量结果以及状态。如所示，该过程可通过使用小滴发生器将样品分区至在多个分区(例如，小滴)内开始，随后是在热循环仪中热循环样品。小滴的荧光可然后使用阅读器(例如，光学阅读器)来检测。
[0248] 小滴发生器、热循环仪、检测器以及控制器的另外方面在通过引用并入本文的2010年7月8日公布的美国专利申请公布号2010/0173394 A1中被描述。在一些情况下，雨滴数字PCR系统可与本申请的方法一起使用。
[0249] 通常，从如本文描述的装置获得的数据使用由装置诸如计算机应用的算法来分析。在一些应用中，系统可包括小滴发生器、热循环仪、小滴阅读器以及计算机，每个是单独的装置。在其他应用中，系统可包括构成本文描述的此类装置的两个或更多个的一个装置，以任何组合彼此通讯。例如系统可包括，但不限于，与热循环仪通讯的小滴发生器。在另一个实例中，系统可包括彼此通讯的小滴发生器、热循环仪以及小滴阅读器。
[0250] 计算机和软件
[0251] 本文提供了计算机处理器和计算机可读介质，其包含当由计算机执行时其使计算机进行本文描述的方法的指令。
[0252] 在获得荧光检测数据之后，处理器可在一些应用中被用来存储或处理数据。用于或处理数据的计算机可执行逻辑学的非限制实例可被用来进行此类功能，如减去背景荧光、分配靶序列和/或参考序列、确定病毒重组率、鉴定病毒重组体以及定量核酸或蛋白数据。例如，包含相应于样品中标志物的存在的荧光的小滴的数目可被计数，并与包含相应于亲本病毒颗粒共同的遗传元件的存在的荧光的小滴的数目进行比较。
[0253] 计算机可用于显示、存储、检索或计算来自分子谱(例如包括标志物的病毒签名)的诊断结果；显示、存储、检索或计算来自基因组、核酸表达分析、蛋白分析的原始数据；或显示、存储、检索或计算在本公开内容的方法中有用的任何样品或患者信息。
[0254] 本文还提供了用于进行本文提供的方法的系统，包括处理器和用于指导用于用本文描述的一个或更多个装置进行方法的处理器的计算机可读介质。
[0255] IV.方法的应用
[0256] 本公开内容的方法、组合物和系统可在多种临床和研究相关的应用两者中使用。
[0257] 本公开内容的另外的应用提供了用于确定病毒颗粒的分类学，诸如它的基因组和蛋白衣壳的分子描述的方法。在该实施方案中，本文提供的方法与测定诸如邻位连接测定(PLA测定)或邻位延伸测定(PEA测定)结合使用以确定病毒颗粒的衣壳和/或包膜组成，或其他病毒多肽的组成。
[0258] 本公开内容的另外的应用提供了定量病毒颗粒的毒力的程度的方法。病毒毒力因子确定感染是否发生且所得病毒疾病症状是如何严重。病毒通常需要宿主细胞上它们特异性结合的受体蛋白。通常，这些宿主细胞蛋白被内吞，并且结合的病毒然后进入宿主细胞。
[0259] 本公开内容的另外的应用提供了定量病毒复制率的方法。病毒通过感染宿主细胞做出新的病毒。新病毒在宿主细胞中从组分部分组装为成熟或接近成熟的病毒体颗粒。在典型的病毒复制和成熟期间，单个感染的细胞可做出数百或甚至数千个新的病毒体。
[0260] 本公开内容的另外的应用提供了用于确定和定量病毒颗粒在多种类型宿主细胞中感染的能力的方法。病毒可感染的宿主细胞的范围被称为它的“宿主范围”。这可以是窄的，或如当病毒能够感染许多物种时是宽的，能够感染许多不同类型的宿主细胞(例如动物、植物、微生物或原生动物等等)。例如，甲型流感病毒中抗原漂移的产生可起因于猪被来自几个不同宿主(诸如人和鸟)的病毒感染。该共感染提供了现有毒株之间的病毒基因的混合，从而产生新的病毒毒株的机会。
[0261] 本公开内容的另外的应用可提供用于评估在合成生物学应用中区段改组的程度的方法。改组基因组区段是合成生物学中通过重复诱变和扩增周期选择期望的性状用以创造新的部分以及改进的功能的过程。类似于测量病毒样品中重组体分子的数目，合成生物学样品的改组的区段也可以被定量。在一些情况下，本文描述的方法可被用作合成过程的质量控制量度，以确认在样品中已被改组的区段的量。同样地，本文描述的方法可被用来评估或测量质粒、F’因子以及其他合成的模板中的重组。
[0262] 本公开内容的另外的应用包括测量体细胞重组，诸如免疫组库(immune repertoire)。该方法可包括测量T细胞受体结构域或B细胞受体或抗体中可变区(V)、多态区(Diverse regions)(D)和连接区(J)的重组率。V(D)J重排以及VJ重排可被评价。在免疫细胞内的重组率可特别有益于诊断、治疗、预测或检测自身免疫疾病或紊乱或感染性疾病。
本文提供的方法还可适用于测量HLA序列中的变异或重组。
本文提供的方法还可适用于测量HLA序列中的变异或重组。
[0263] 本文提供的方法，特别是当它们涉及PEA和PLA测定时，可以能够评估不同因素如何调制多组分复合体或大分子复合体(例如，核糖体、剪接体、过氧化物酶体、光合反应中心、线粒体等等)的组成。因素可以是突变(例如，改变该等位基因的蛋白产物的稳定性并因此导致该编码的亚基对多聚复合体小贡献的突变)、药物或其他因素。使用所述方法中的PLA或PEA的优点是，它们可被用来询问具有功能影响诸如扰乱蛋白-蛋白相互作用的突变或药物。
[0264] 使用本文描述的PLA和PEA测定询问可在药物筛选测定中是有用的。在此类情况下，测试试剂可被应用于已知的大分子复合体。复合体可然后通过本文提供的PLA或PEA方法来询问，以确定测试试剂是否导致该大分子复合体的结构的破坏或改变。同样地，测试试剂可被应用于能够组装成大分子复合体的游离组件(例如，游离衣壳蛋白)。本文提供的PLA和PEA方法可被用来确定测试试剂是否导致组件的组装(例如，在衣壳的情况下，组装为病毒颗粒)。
[0265] 使用本文描述的PLA和PEA测定的询问还可在临床环境中使用，例如，以确定药物对患者内大分子复合体的结构的影响。例如，有Duchenne型肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophe)的受试者可用特定药物诸如能够改变肌肉组织中“改进”(不完全的wt)肌营养不良蛋白:突变体肌营养不良蛋白的分数的反义外显子跳跃的药物来治疗。为了确定该药物是否正常工作，肌肉样品可从患者来采取且改进的突变体肌营养不良蛋白的相对量可被确定。可选地，该测定可被用来确定被设计成沉默毒害大分子复合体的功能结构的显性等位基因产物的药物的效力。该方法还可被用来评价受精产物的遗传组成。例如，该方法可被用来确定存在于两个基因组中的每个变体等位基因(编码不同的大分子复合体的产物)是否均等或不均等贡献于大分子复合体的组成。
[0266] 本公开内容对检测流感病毒内的重组特别有用。甲型流感病毒衣壳包含抗原糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA在病毒附连中起作用且NA参与病毒释放。衣壳由每种多肽的数百分子构成。通常，宿主的免疫系统识别HA和NA，从而引发免疫应答。甲型流感病毒HA和NA蛋白存在许多不同的亚型；且人的免疫系统经常被新的抗原攻击。例如，HA和NA基因中的点突变可导致抗原性的改变，其允许病毒感染被先前循环的病毒感染或接种疫苗的人。流感病毒基因组还编码形成衣壳、核蛋白(NP)所必需的另外的结构蛋白以及蛋白NS1(非结构蛋白1)和NS2/核输出蛋白(NEP)。仍由病毒基因组编码的其他蛋白包括膜蛋白M1和M2(其被核输出以及几个其他功能所需要)。
[0267] 本发明提供了用于评价和定量疫苗产生的潜在病毒毒株的方法、组合物和试剂盒。例如，病毒疫苗毒株可被用来创造携带编码特定免疫原的额外基因的重组病毒。在病毒接种疫苗期间，复制病毒将表达特定免疫原。特异性抗体产生将被刺激，且宿主将被保护免受免疫原以及疫苗病毒。可选地，两种病毒毒株可有意共感染以创造多种新颖的重组体。例如，多种重组病毒颗粒的组用多种测试试剂来筛选，以鉴定停止或减少靶病毒颗粒在宿主细胞中的生长率的感兴趣的疫苗。在此类病毒研究中(病毒多核苷酸(例如，DNA、RNA、线粒体DNA等等)随时间被监测，以确定病毒的生长率、毒力、或感染率。在一些情况下，如本文所述，本文提供的方法和组合物可被用来确定重组频率。在一些情况下，重组频率可受样品中病毒(或其他微生物，例如，细菌、寄生虫)的生长率影响。例如，重组的病毒的生长率的增加可导致观察到的重组频率的增加。此类增加可具有极大数量的临床应用，特别是在重组的病毒具有亲本毒株的毒力的增加的毒力(例如，多于1倍、2倍、3倍、5倍或10倍)的情况下。此类强毒重组体的增加可提供关于强毒病毒的传播的流行病学信息，并且还可以是临床用途和患者的知情治疗(例如，药物筛选、个性化护理)。在微生物(例如，病毒)的几个共感染毒株感染宿主或受试者的情况下，重组频率可由存在的一种或更多种病毒物种的差异生长率(differential growth rate)来配混(compounded)。例如，如果共感染物种的一种特别经受较高生长率或重组，重组频率可反映该点。
[0268] 本公开内容对测量物种之间，诸如病毒和其宿主，例如人宿主之间的重组频率特别有用。在此类情况下，病毒和宿主(例如，人)标志物的重组可被计算。
[0269] 在又另一个实例中，一组疫苗可针对特定细胞类型(例如，特定的宿主细胞类型，植物、动物或微生物等等)，或具体细胞类型，诸如癌性哺乳动物细胞来筛选，并且然后癌细胞生长的速率可通过使用本发明方法和组合物随时间检测细胞的多核苷酸来监测。在又另一个实例中，一组疫苗可针对特定类型细胞来筛选，并且然后细胞存活力可通过使用本公开内容的本发明方法和组合物随时间检测细胞的多核苷酸来监测。以此类方式，引起细胞毒性的疫苗可被鉴定。在又其他应用中，当改变疫苗剂量、化学品浓度和环境条件(例如，宿主细胞类型，温度和气氛)时，随时间测量对细胞生长的影响。
[0270] 本公开内容的另外的应用提供了生成病毒颗粒的分子签名的方法。病毒签名是分子指纹，由于它可被用来检测和鉴定细胞、组织或生物流体中的特定病毒。病毒颗粒的分子签名可从组成该病毒颗粒基因组的核酸来生成。病毒颗粒的分子签名可从组成该病毒颗粒衣壳的多肽或大分子来生成。病毒颗粒的分子签名可从组成该病毒颗粒衣壳的多核苷酸或大分子以及组成该病毒基因组的核酸来生成。
[0271] 本公开内容的另外的应用提供了用于生成新的病毒重组毒株的方法。天然存在的重组在被多于一种的病毒毒株感染的细胞中的病毒基因组之间发生。这通过核酸链的同源交叉或通过基因组区段的重排发生。新的病毒重组毒株可在新颖的病毒疫苗或基因疗法载体的生成中是有用的。
[0272] 本公开内容的另外的应用提供了用于检测、鉴定、以及定量细胞、组织或生物流体中的病毒载量的方法。还被称为病毒负荷或病毒滴度的病毒载量是病毒感染的严重程度的量度，并且可通过估算牵涉的体液中病毒的量来计算。例如，它可以以每毫升血液的RNA或DNA拷贝给出。追踪病毒载量可用来监测在慢性病毒感染期间，以及在免疫功能低下的患者诸如从骨髓或实体器官移植中恢复的那些中的疗法。
[0273] 本公开内容的另外的应用提供了用于描述哺乳动物细胞、组织或生物流体中的基因组重排或病毒基因组的方法。病毒可在其基因组中经历重排，使得它们展示基因组单位的移码。已知该现象在整个真核RNA病毒中广泛发生。如在由HIV基因组提供的实例中，逆转录病毒基因组展现出重叠基因排列。小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)基因组已被证明展现出重叠的gag、pro和pol基因排列。
[0274] 本公开内容的另外的应用可提供用于确定HIV的重组形式在给定种群中的发生率的方法。在一些情况下，HIV可在其基因组中经历重排，在人群体内创建病毒多样性。抗逆转录病毒药物的广泛使用可导致HIV的特定耐药毒株。因此，理解给定种群内循环遗传变体的范围是重要的。本文描述的方法可提供定量重组形式的发生率的方法。
[0275] 方法和组合物还可被用在或用于评价用于基因疗法或细胞疗法的病毒疗法载体的效力。用于治疗疾病的基因疗法或细胞疗法的病毒疗法载体的实例，包括这样的疾病，如黄斑变性(macular degeneration)、肌营养不良或其他组织消耗疾病。
[0276] 本发明提供了用于检测和定量基于病毒的细胞表达系统的方法、组合物和试剂盒。诸如，例如在外科手术中用于检测特定细胞类型或患病的细胞(例如肿瘤细胞或感染的细胞)、或健康的细胞(例如，非感染的细胞)的基于病毒的细胞表达系统，在实验生物体或动物模型中使用的用于实验室和研究的基于病毒的细胞表达系统。
[0277] 本发明提供了用于评价包括：在感染病毒的细胞、组织或生物流体中抗病毒治疗的效力的方法、组合物和试剂盒。在一些应用中，临床样品可从患者在不同时间点，例如在该患者用抗病毒治疗或其他药物治疗之前以及之后来获得，且然后病毒多核苷酸的浓度可在这些样品中被比较，以确定该患者是否响应抗病毒治疗。在一些应用中，一个样品在治疗之前来采取且一个样品在该患者用抗病毒治疗或其他药物的治疗之后来采取。在其他应用中，一个样品在治疗之前来采取且然后多个样品在患者用抗病毒治疗或其他药物的治疗之后来采取。临床样品可从正常患者、处于具有疾病或紊乱(例如，感染性疾病)的风险中的患者、具有特定疾病的患者、具有感染性疾病的患者、具有感染性疾病并经历药物治疗的患者来获得。本公开内容的方法和组合物可被用来监测未用特定抗病毒治疗来治疗的受试者中感染的过程，或监测药物，例如，抗病毒治疗针对此类感染的效力。
[0278] 本公开内容的方法和组合物还可被用来鉴定给定宿主细胞的病毒敏感性和/或对特定药物(例如，抗病毒治疗)的耐受性。病毒颗粒(例如，临床分离株)可与宿主细胞一起培养，并然后用特定药物(例如，抗病毒治疗)来处理。在处理之后，病毒的生长率可被监测，以确定病毒是否对该特定药物敏感或耐受。在一些应用中，一个样品在治疗之前来采取且一个样品在该样品用抗病毒治疗或其他药物治疗之后来采取。在其他应用中，一个样品在治疗之前来采取且然后多个样品在该样品用抗病毒治疗或其他药物治疗之后来采取。
[0279] 本公开内容的另外的应用提供了评价病毒颗粒的经历适应的能力的方法。即，方法提供了将被评价的病毒颗粒，用于定量病毒将能够成功出现在新物种中的可能性，以预测疾病出现在新宿主种群中的风险。
[0280] 本公开内容的另外的应用提供了用于评价体内或体外系统以定量病毒颗粒的病毒适应度(virus fitness)、传播适应度和/或流行病学适应度的方法。
[0281] 本发明主题的方法和组合物还可用来鉴定病毒去污工作(efforts)或消毒工作的效力。例如，样品或来自表面的拭子在去污或消毒之前以及之后来获得。此类样品或拭子然后可使用本发明主题的方法和组合物来分析以评价病毒污染的存在以及此类污染被消除的程度。本发明主题的方法和组合物还可用来检测病毒污染是否已发生，例如来自工业或学术实验室的事故性释放，或起因于生物恐怖主义或生物战的行为的释放。
[0282] 为了进行本文提供的方法的多种应用，多种常规技术可组合被使用以对特定应用定制方法。此类常规技术可被发现于标准实验室手册诸如以下中：Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(卷I-IV)，Using Antibodies:A Laboratory Manual，Cells:A Laboratory Manual，PCR Primer:A Laboratory Manual以及Molecular Cloning:A Laboratory Manual(全部来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Stryer,L.
(1995)Biochemistry(第4版)Freeman,New York；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”1984,IRL Press,London,Nelson and Cox(2000),Lehninger,
(2004)Principles of Biochemistry第4版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.和Berg等(2006)Biochemistry,第6版，W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.，其的全部出于所有目的通过引用以其整体并入。
(1995)Biochemistry(第4版)Freeman,New York；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”1984,IRL Press,London,Nelson and Cox(2000),Lehninger,
(2004)Principles of Biochemistry第4版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.和Berg等(2006)Biochemistry,第6版，W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.，其的全部出于所有目的通过引用以其整体并入。
[0283] IV.试剂盒
[0284] 本文提供了用于进行由本公开内容描述的方法和应用的试剂盒。本文描述的试剂盒可被提供、销售和/或推销至卫生保健提供者，包括医师、临床实验室科学家、护士、药剂师、处方官员等。试剂盒还可被直接销售至消费者。
[0285] 试剂盒可通常包括插页材料、组合物、试剂、装置组件和关于如何对特定类型生物样品进行方法或测试的说明书。试剂盒可以以任何适合的方式被包装，通常具有在单个容器内的所有要素连同用于进行该方法或测试的一张印刷的说明书。取决于期望的方法，试剂盒可包括以下组件中的一个或更多个：试剂、缓冲液、酶(例如内切核酸酶、外切核酸酶、连接酶、聚合酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶、逆转录酶、拓扑异构酶、激酶、磷酸酶)、抗体、引物、探针、染料、实验标准(例如描述的病毒颗粒、细胞、核酸等)、装置以及驱动和指导装置的计算机软件(例如，指导处理器的计算机可执行的逻辑学)，以及用于用户或技术人员诸如，研究人员或临床医师用于实施本文提供的方法的说明书。
[0286] 试剂盒还可包括能够通过下游方法检测细胞标志物的试剂，下游方法诸如RT-PCR、小滴数字PCR、基于小滴的数字PCR、DNA和RNA测序、质谱、免疫组织化学(IHC)、激光细胞显微切割(LCM)、高含量细胞筛选、流式细胞术，其适合于增强来自方法和装置的信息用于进一步临床检测、预后、药物响应确定以及诊断患有疾病的患者。
[0287] 在其他应用中，试剂盒还可包括分析病毒颗粒谱数据的软件包，其可包括用于比较的参考病毒谱。在一些应用中，试剂盒软件包，包括至中央服务器的连接，以进行数据分析并且其中关于疾病状态的建议、治疗建议或患者中治疗或病毒管理的程序的建议的报告可被临床医师检索。
[0289] 在一些应用中，试剂盒和由该试剂盒生成的报告还可包括信息，诸如科学参考文献、包装插页材料、临床试验结果，或这些的摘要信息等，其表明或建立组合物的活性和/或优点，和/或其描述剂量、施用、副作用、药物相互作用，或对医疗服务人员(health care provider)有用的其他信息。此类信息可基于多种研究的结果，例如，使用的牵涉体内模型的实验动物的研究以及基于人临床试验的研究。
[0290] 如在本文和整个本公开内容中使用的术语“约”通常指可在特定使用的上下文内大于所列举数值的15％，或小于所列举数值的15％的范围。例如，“约10”将包括从8.5至11.5的范围。
[0291] 尽管本文已显示和描述了本发明的优选的应用，但对于本领域技术人员将明显的是，此类应用仅通过示例的方式提供。本领域技术人员现在将想到许多变型、变化和替换而不偏离本发明。应当理解，在实践本发明时可采用本文描述的本发明的应用的各种替代选择。以下权利要求意在限定本发明的范围，并且从而涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。实施例
[0292] 实施例1-小滴簇鉴定和分类
[0293] 样品可通过对被怀疑感染流感病毒的特别强毒重组毒株的受试者进行的咽拭或鼻拭来获得。来自该样品的核酸被提取，与特定探针和/或扩增试剂结合，并被分区至在在油包水乳液内的含水小滴内。毒性毒株可以在A/a基因座的A等位基因和在B/b基因座的B等位基因为特征。包含附连至荧光团的探针的引物被设计成通过发射具有特定颜色的信号检测A基因座，以及通过发射具有不同颜色的信号检测B基因座。尽管荧光探针被设计成一种病毒等位基因，当它们与其他等位基因交叉反应时，它们也发荧光(以减少的强度)。例如，FAM-标记的探针被设计成检测A等位基因，且小滴展现出四个水平的荧光：最高的水平是对于包含仅A等位基因的小滴；较低的水平是对于包含A和a的混合物的小滴；基本上较低的水平是对于包含仅a的小滴；且最低的水平是对于既不包含A也不包含a的小滴。起因于单个分子物质(例如连锁的A-B物质)的小滴比起因于偶然碰巧出现在同一小滴(例如包含A和B的不连锁的分子)中的分子的组合的小滴更常见。小滴群大小的数学分析被用来估算每个物质的连锁的分子的数目，并确定相以及重组频率。该方法还包括确定样品中是重组的病毒(指示更强毒毒株)的病毒的比例。基于这些结果，药物疗法方案依据哪种病毒是占优势的病毒来设计。
[0294] 实施例2-确定RNA样品中的重组率
[0295] RNA从来自感染HIV的患者的细胞血液样品来采取。该样品被分区至在油包水乳液中的含水小滴内。等位基因特异性荧光探针(FAM；和HEX)被用来检测在HIV病毒上的两个不同的基因座上的病毒等位基因。在RT-ddPCR之后，取决于它们在反应开始时包含的病毒等位基因，小滴对一个荧光团是阳性的，对两个荧光团是阳性的或对两个荧光团都不是阳性的。反式配置的病毒等位基因独立地分区至小滴内。顺式配置的病毒等位基因趋向于共分离至相同的小滴内，由于它们是物理上连锁的，参见图14。在顺式配置的病毒等位基因之间的位点上的限制性内切酶酶切消化废除两个病毒等位基因的共分区(未示出)。反式配置和顺式配置的病毒等位基因之间的该定量差或比决定HIV样品的重组率。
[0296] 实施例3-确定DNA样品中的重组率
[0297] DNA从来自感染HIV的患者的细胞血液样品来采取。该样品被分区至在油水乳液中的含水小滴内。等位基因特异性荧光探针(FAM；和HEX)被用来检测在HIV病毒上的两个不同的基因座上的病毒等位基因。在ddPCR之后，取决于它们在反应开始时包含的病毒等位基因，小滴对一个荧光团是阳性的，对两个荧光团是阳性的或对两个荧光团都不是阳性的。反式配置的病毒等位基因独立地分区至小滴内。顺式配置的病毒等位基因趋向于共分离至相同的小滴内，由于它们是物理上连锁的，参见图14。在顺式配置的病毒等位基因之间的位点上的限制性内切酶酶切消化废除两个病毒等位基因的共分区。反式配置和顺式配置的病毒等位基因之间的该定量差或比决定HIV样品的重组率。
[0298] 实施例4-确定纯化的病毒样品中的重组率
[0299] 纯化的病毒样品从感染HIV的患者来采取。该样品被分区至在油包水乳液中的含水小滴内，使得至多一个病毒颗粒被包含在小滴内。病毒颗粒在小滴内经历裂解反应，且任选地，在小滴内经历逆转录反应。等位基因特异性荧光探针(FAM；和HEX)被用来检测在HIV病毒上的两个不同的基因座上的病毒等位基因。在RT-ddPCR之后，取决于它们在反应开始时包含的病毒等位基因，小滴对一个荧光团是阳性的，对两个荧光团是阳性的或对两个荧光团都不是阳性的。反式配置的病毒等位基因独立地分区在小滴内。顺式配置的病毒等位基因趋向于共分离成相同的小滴，由于它们是物理上连锁的，参见图14。在顺式配置的病毒等位基因之间的位点上的限制性内切酶酶切消化废除两个病毒等位基因的共分区(未示出)。反式配置和顺式配置的病毒等位基因之间的该定量差或比决定HIV样品的重组率。
[0300] 实施例5-当两个序列物理上不连锁时的数学关系
[0301] 两个标志物A和B在相同染色体上物理上不。在该情况下，分区具有偶然共定位存在的A和B两者以及分子分区的独立性被表示为：
[0302] Eq.1NANB＝NENAB
[0303] 其中N指示小滴的数目，其中NA和NB是单阳性小滴的计数，NE是阴性(空的)小滴的计数，且NAB是双阳性小滴的计数。一些小滴包含相同靶的多个拷贝。在这些情况下，观察到的小滴的数目作为双阳性由于偶然，Nch被表示为：
[0304] Eq.2Nch＝NANB/NE
[0305] 实施例6-当两个序列是连锁的时的数学关系
[0306] 两个DNA序列是物理上连锁的。当A-B分子是存在的时，额外的双阳性小滴是存在的。双阳性小滴包括：A-B、A+A-B、B+A-B、A-B以及A+B+A-B。不包含连锁的分子的小滴的总数目被表示为：
[0307] Eq.3N非_AB＝NE+NA+NB+NANB/NE
[0308] 贡献于连锁的小滴A-B的分子的浓度(平均拷贝/小滴)被表示为：
[0309] Eq.4λAB＝ln(Ntot)-ln(NE+NA+NB+NANB/NE)
[0310] 其中Ntot是观察到的小滴的总数目。
[0311] 连锁的分子的百分比被表示为：
[0312] Eq.5％AB＝2λAB/(λA+λB)
[0313] 实施例7-病毒重组计算
[0314] 应用随机分区的组合数学来计算全长亲本分子、全长重组分子或两者的浓度。在该实施例中，存在通过测定检测的总计八个分子物质，包括2个亲本全长病毒等位基因、2个重组全长病毒等位基因以及4个单独的标志物片段(假设一些片段化发生)，参见图15A。基于振幅的多重导致16个可能的小滴簇，参见图15B。每个簇包含许多小滴。每簇的计数被表示为Nxy。通过组合这些数字，所有八个物质的浓度被计算。图15C展示了被分区在任何小滴或16个簇的任一个的部分中的所有可能的分子物质。在每个框中，小滴包含示出的物质的任何组合，但为了小滴着陆在给定的框，例如N_11中，小滴包含至少A1和B1。如果A1、B1或两者缺失，小滴不着陆在N_11中。所得的小滴与在发生在每个框中的单小滴(用括号指示的)内的所有可能的分子物质组合在图15D中示出。
[0315] 使用所有16个簇计算病毒重组是可能的。在该实施例中，表的左下部中的仅9个簇被用来(图15D，灰色组)计算病毒重组。在簇N_21中，可能的小滴类型是(B1A2)、(B1A2、B1)、(B1A2、A2)以及(B1、A2)。为了计算重组物质B1A2的浓度，不包含该物质的小滴需要被排除。首先，应用泊松公式：
[0316] Eq.6λ＝ln(Ntot)-ln(N阴性)
[0317] 种类(B1、A2)的小滴的期望的数目被计算为：
[0318]
[0319] 因此具有B1A2的小滴的实际数目被计算为：
[0320]
[0321] 然后，B1A2物质的每小滴期望的拷贝λB1A2由以下给出：
[0322]
[0323] Eq.10 Ntot＝N00+N20+N01+N21
[0324] 类似地，对于其他重组体：
[0325]
[0326] Eq.12 Ntot＝N00+N02+N10+N12
[0327] 对于亲本物质A1A2和B1B2，每小滴期望的拷贝由以下给出
[0328]
[0329] Eq.14 Ntot＝N0o+N1o+N20+N30
[0330]
[0331] Eq.16 Ntot＝N00+N01+N02+N03
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种防止啮齿目动物创面皮肤收缩的固定及缝合方法及其用途 | 2020-05-12 | 324 |
| 用于二色视动物的驱避剂和引诱剂组合物 | 2020-05-18 | 811 |
| 一种高血压急症动物模型的建立方法 | 2020-05-19 | 623 |
| 用于研究啮齿类动物注意力的行为装置 | 2020-05-21 | 804 |
| 一种啮齿动物温度感觉识别系统及其温度感觉缺陷动物筛选方法 | 2020-05-13 | 14 |
| 一种采用机械化防治草原鼠害的方法 | 2020-05-15 | 621 |
| 地喹氯铵作为鼠类的生育控制药物的应用 | 2020-05-14 | 564 |
| CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用 | 2020-05-14 | 740 |
| 一种可拆卸啮齿类动物雾化吸入装置 | 2020-05-18 | 270 |
| 苗期保护装置 | 2020-05-25 | 499 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈