用于在细胞中表达蛋白质的方法和产品
阅读：1004发布：2020-08-17
专利汇可以提供用于在细胞中表达蛋白质的方法和产品专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 部分地涉及编码 蛋白质 的核酸，包含编码蛋白质的核酸的 治疗 剂，用于诱导细胞以使用核酸来表达蛋白质的方法，用于 转染 、基因编辑和重编程细胞的方法、 试剂 盒 和器件，和使用这些方法、试剂盒和器件所产生的细胞、 生物 体和治疗剂。描述了用于改变细胞的DNA序列的方法和产品，以及用于诱导细胞以使用合成RNA分子来表达蛋白质的方法和产品。也描述了包含编码基因编辑蛋白的核酸的治疗剂。，下面是用于在细胞中表达蛋白质的方法和产品专利的具体信息内容。
1.一种合成RNA分子，其包含以下中的至少两种：5-甲基尿苷、5-甲基胞苷和7-脱氮鸟苷。
2.根据权利要求1所述的合成RNA分子，其进一步包含5-甲基尿苷、5-甲基胞苷和
7-脱氮鸟苷中的每一种的至少一个残基。
3.根据权利要求1所述的合成RNA分子，其中所述合成RNA分子包含尿苷部分并且约
20％至约80％的所述尿苷部分是5-甲基尿苷。
4.根据权利要求1所述的合成RNA分子，其中所述合成RNA分子包含胞苷部分并且约
50％至约100％的所述胞苷部分是5-甲基胞苷。
5.根据权利要求1所述的合成RNA分子，其中所述合成RNA分子包含鸟苷部分并且约
20％至约80％的所述鸟苷部分是7-脱氮鸟苷。
6.根据权利要求2所述的合成RNA分子，其中所述合成RNA分子包含尿苷、胞苷和鸟苷部分并且约20％至约80％的所述尿苷是5-甲基尿苷，约50％至约100％的所述胞苷是
5-甲基胞苷，并且约20％至约80％的所述鸟苷是7-脱氮鸟苷。
7.根据权利要求1所述的合成RNA分子，其进一步包含5'-帽结构。
8.根据权利要求7所述的合成RNA分子，其中所述5'-帽结构是Cap 1结构。
9.根据权利要求1所述的合成RNA分子，其进一步包含3'-聚(A)尾。
10.根据权利要求1所述的合成RNA分子，其进一步包含UTR。
11.根据权利要求1所述的合成RNA分子，其进一步包含强Kozak序列。
12.根据权利要求1所述的合成RNA分子，其中所述合成RNA分子编码重编程蛋白。
13.根据权利要求12所述的合成RNA分子，其中所述重编程蛋白选自Oct4蛋白、Sox2蛋白、Klf4蛋白、c-Myc蛋白或Lin28蛋白。
14.根据权利要求1所述的合成RNA分子，其中所述合成RNA分子编码基因编辑蛋白。
15.根据权利要求14所述的合成RNA分子，其中所述基因编辑蛋白包含DNA结合结构域和DNA核酸内切酶或其生物活性片段的催化结构域。
16.根据权利要求14所述的合成RNA分子，其中所述基因编辑蛋白包含以下中的至少一种：锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、核酸酶、大范围核酸酶、切口酶和规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白或其生物活性片段或变体。
17.一种编码基因编辑蛋白的核酸，其中所述基因编辑蛋白靶向以下的成员：TERT、TERC、HBB、BRCA1、BRCA2、CCR5、CFTR、CXCR4、DDB2、DMD、EGFR、ERCC4、ERCC5、ERCC6、F9、F8、F11、SLC40A1、HAMP、HEXA、HFE、HJV、JAK家族、MYC家族、NF1、NF2、TP53、POLH、RAD2、PKN3、RAS家族、BIRC5、TFR2、XPA、XPB、XPC、XPD、Rosa26、AAVS1、FBN1、HTT、APP、PSEN1、PSEN2、APOE、SNCA、PRKN、LRRK2、CR1、CLU、PICALM、BIN1、MS4A4、MS4A6E、CD2AP、CD33、EPHA1、PINK1、PARK7、ATP13A2、HNPCC1、HNPCC2、HNPCC5、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM、FANCN、FANCP、RAD51C、VEGF家族、GCK、HNF1A、HNF4A、HNF1B、SOD1、PTEN、RET、KIT、MET、APC、RB1和TNF或其变体。
18.根据权利要求14所述的合成RNA分子，其中所述基因编辑蛋白降低一种或多种蛋白质的表达。
19.一种编码基因编辑蛋白的核酸，其中所述基因编辑蛋白产生编码非功能蛋白的基因。
20.一种编码基因编辑蛋白的核酸，其中所述基因编辑蛋白产生编码显性负性蛋白的基因。
21.一种编码基因编辑蛋白的核酸，其中所述基因编辑蛋白靶向非癌性人类基因组中不存在的序列。
22.一种编码基因编辑蛋白的核酸，其中所述基因编辑蛋白靶向以下的成员：病毒序列、细菌序列、真菌序列、寄生虫序列和癌症基因组序列。
23.根据权利要求17所述的核酸，其中所述基因编辑蛋白靶向以下中的至少一种：
TTGCCCCCTGCCTGGCAGCC和TTCTTGAATGTAGAGATGCG。
24.一种编码基因编辑蛋白的合成RNA分子，所述基因编辑蛋白包含以下中的至少一种：假尿苷、5-甲基假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、N4-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷和7-脱氮鸟苷或其衍生物。
25.一种编码基因编辑蛋白的核酸，其中所述基因编辑蛋白降低存活素蛋白的表达。
26.一种编码基因编辑蛋白的核酸，其中所述基因编辑蛋白产生编码存活素蛋白的非功能变体的基因。
27.一种编码基因编辑蛋白的核酸，其中所述基因编辑蛋白产生编码存活素蛋白的显性负性变体的基因。
28.一种治疗组合物，其包含根据权利要求1所述的合成RNA分子或根据权利要求17所述的核酸。
29.根据权利要求28所述的治疗组合物，其进一步包含递送试剂。
30.根据权利要求29所述的治疗组合物，其中所述递送试剂包含脂质。
31.根据权利要求29所述的治疗组合物，其中所述递送试剂包含聚乙二醇或其衍生物。
32.根据权利要求28所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物是以粒子的无菌水性混悬液形式制备。
33.根据权利要求32所述的治疗组合物，其中所述粒子是脂质体。
34.根据权利要求28所述的治疗组合物，其进一步包含第二合成RNA分子或核酸。
35.根据权利要求28所述的治疗组合物，其进一步包含修复模板。
36.一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的根据权利要求28所述的治疗组合物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述癌症包括以下中的至少一种：前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、皮肤癌、脑癌、白血病、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、骨癌、睾丸癌、肉瘤、癌瘤、咽喉癌、肾癌、淋巴瘤、心脏癌、子宫颈癌、卵巢癌、眼癌、子宫癌、乳腺导管癌、胆囊癌、口腔癌、颈癌、间皮瘤、鼻癌、窦癌、阴茎癌、肛门癌、唾液腺癌、小肠癌、甲状腺癌、尿道癌、阴道癌和外阴癌。
38.一种用于诱导细胞以表达相关蛋白质的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求
1所述的合成RNA分子或根据权利要求17所述的核酸接触。
39.一种细胞，其通过根据权利要求38所述的方法产生。
40.一种生物体，其通过将根据权利要求39所述的细胞植入胚泡或子宫中而产生。
41.根据权利要求40所述的生物体，其中所述生物体选自大鼠、小鼠、兔、豚鼠、灵长类动物、猪、牛、鸡、山羊、驴、猫、狗和斑马鱼。
42.根据权利要求40所述的生物体，其中使所述细胞与编码人类基因或其片段的核酸进一步接触。
43.根据权利要求42所述的生物体，其中将所述人类基因插入所述生物体的基因组中。
44.根据权利要求40所述的生物体，其中所述基因编辑蛋白靶向所述人类基因的一种或多种内源性直系同源物。
45.根据权利要求44所述的生物体，其中所述一种或多种内源性直系同源物是灭活的。
46.根据权利要求39所述的细胞，其中所述细胞进一步分化成以下的成员：皮肤细胞、葡萄糖反应性胰岛素产生细胞、造血细胞、心脏细胞、视网膜细胞、肾细胞、神经细胞、间质细胞、脂肪细胞、骨细胞、肌肉细胞、卵母细胞和精子细胞。
47.根据权利要求39所述的细胞，其中所述细胞是以高通量筛选相容性格式培养的。
48.根据权利要求47所述的细胞，其中所述格式是多孔板。
49.一种治疗组合物，其包含根据权利要求39所述的细胞。
50.一种用于改变活细胞的DNA序列的组合物，其包含编码基因编辑蛋白的核酸，其中所述基因编辑蛋白包含：
a.DNA结合结构域，和
b.核酸酶结构域，
其中所述DNA结合结构域包含多个重复序列，所述重复序列中的至少两个彼此具有至少50％同源性，并且所述重复序列中的至少一个含有一个或多个能够结合至目标DNA分子中的结合位点的区域，所述结合位点含有长度为1至5个碱基的限定序列，并且所述核酸酶结构域包含选自StsI、StsI-HA、StsI-HA2、StsI-UHA、StsI-UHA2、StsI-HF、StsI-UHF的蛋白质或其生物活性片段的催化结构域。
51.一种用于改变活细胞的DNA序列的组合物，其包含核酸混合物，所述核酸混合物包含：
a.编码第一基因编辑蛋白的第一核酸，和
b.编码第二基因编辑蛋白的第二核酸，
其中所述第一基因编辑蛋白或所述第二基因编辑蛋白或者所述第一基因编辑蛋白与所述第二基因编辑蛋白包含：
i.DNA结合结构域，和
ii.核酸酶结构域，
其中所述DNA结合结构域包含多个重复序列，所述重复序列中的至少两个彼此具有至少50％同源性，并且所述重复序列中的至少一个含有一个或多个能够结合至目标DNA分子中的结合位点的区域，所述结合位点含有长度为1至5个碱基的限定序列，并且所述核酸酶结构域包含选自FokI、StsI、StsI-HA、StsI-HA2、StsI-UHA、StsI-UHA2、StsI-HF、StsI-UHF的蛋白质或其生物活性片段的催化结构域。
52.一种用于修饰细胞的基因组的方法，其包括向所述细胞中引入编码非天然存在的融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含包括一个或多个长度为36个氨基酸的重复单元的人工转录激活因子样(TAL)效应物重复结构域和核酸内切酶结构域，其中所述重复结构域经过工程改造以识别预定核苷酸序列，并且其中所述融合蛋白识别所述预定核苷酸序列。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述细胞是动物细胞。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述细胞是人类细胞。
57.根据权利要求52所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。
58.根据权利要求52所述的方法，其中所述细胞是原核细胞。
59.根据权利要求52所述的方法，其中所述融合蛋白在所述细胞的核酸中引入核酸内切，由此修饰所述细胞的基因组。
60.一种编码非天然存在的融合蛋白的核酸分子，其包含包括一个或多个长度为36个氨基酸的重复单元的人工转录激活因子样(TAL)效应物重复结构域和限制性核酸内切酶活性，其中所述重复结构域经过工程改造以识别预定核苷酸序列并且其中所述融合蛋白识别所述预定核苷酸序列。
61.根据权利要求60所述的核酸分子，其中所述重复单元各自相差不超过七个氨基酸。
62.根据权利要求60所述的核酸分子，其中所述重复单元各自含有氨基酸序列：
LTPXQVVAIAS，其中X可以是E或Q，并且其中所述氨基酸序列LTPXQVVAIAS在羧基末端上接着是一个或两个氨基酸，其确定腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶中的一个的识别。
63.根据权利要求60所述的核酸，其编码约1.5至约28.5个重复单元。
64.根据权利要求60所述的核酸分子，其编码约11.5、约14.5、约17.5或约18.5个重复单元。
65.根据权利要求60所述的核酸分子，其中所述预定核苷酸序列是启动子区域。
66.一种载体，其含有根据权利要求60所述的核酸分子。
67.根据权利要求66所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
68.根据权利要求67所述的病毒载体，其中所述载体包含以下中的一种或多种：腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺相关病毒，和工程改造的病毒。
69.一种编码非天然存在的融合蛋白的核酸分子，其包含识别预定核苷酸序列的第一区域和具有核酸内切酶活性的第二区域，其中所述第一区域含有人工TAL效应物重复结构域，其包含一个或多个长度为约36个氨基酸的重复单元，彼此相差不超过七个氨基酸，其中所述重复结构域经过工程改造以识别所述预定核苷酸序列。
70.根据权利要求69所述的核酸分子，其中所述第一区域含有氨基酸序列：
LTPXQVVAIAS，其中X可以是E或Q。
71.根据权利要求70所述的核酸分子，其中所述编码的非天然存在的融合蛋白的所述氨基酸序列LTPXQVVAIAS后紧接着选自由HD、NG、NS、NI、NN和N组成的群组的氨基酸序列。
72.根据权利要求69所述的核酸分子，其中所述融合蛋白包含限制性核酸内切酶活性。
73.一种载体，其含有根据权利要求69所述的核酸分子。
74.根据权利要求73所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
75.根据权利要求74所述的病毒载体，其中所述载体包含以下中的一种或多种：腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺相关病毒，和工程改造的病毒。
76.一种核酸分子，其编码包含一种或多种选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的序列的蛋白质。
77.根据权利要求50所述的组合物，其中所述核酸进一步包含核定位序列。
78.根据权利要求77所述的组合物，其中所述核定位序列包括氨基酸序列PKKKRKV。
79.根据权利要求50所述的组合物，其中所述核酸进一步包含线粒体定位序列。
80.根据权利要求30所述的组合物，其中所述线粒体定位序列包括氨基酸序列
LGRVIPRKIASRASLM。
81.根据权利要求50所述的组合物，其中所述DNA结合结构域和所述核酸酶结构域由连接子隔开。
82.根据权利要求81所述的组合物，其中所述连接子的长度为约1至约10个氨基酸。
83.一种包含多个重复序列的基因编辑蛋白，其中所述多个重复序列包含至少一个包含氨基酸序列LTPvQVVAIAwxyzGHGG的重复序列，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“x”是N、H或I，“y”是任何氨基酸或无氨基酸，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD或GKQALETVQRLLPVLCQA。
84.根据权利要求83所述的基因编辑蛋白，其中所述多个重复序列包括至少一个包含氨基酸序列LTPvQVVAIAwxyzGHGG的重复序列，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“x”是N、H或I，“y”选自：D、A、I、N、H、K、S和G，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD或GKQALETVQRLLPVLCQA。
85.根据权利要求83所述的基因编辑蛋白，其中所述多个重复序列包括至少一个
包含氨基酸序列LTPvQVVAIAwxyzGHGG的重复序列，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“x”是除N、H和I之外的任何氨基酸，“y”是任何氨基酸或无氨基酸，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD或GKQALETVQRLLPVLCQA。
86.根据权利要求83所述的基因编辑蛋白，其中所述多个重复序列包括至少一个
包含氨基酸序列LTPvQVVAIAwIyzGHGG的重复序列，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“y”是除G之外的任何氨基酸，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD或GKQALETVQRLLPVLCQA。
87.根据权利要求83所述的基因编辑蛋白，其中所述多个重复序列包括至少一个包含氨基酸序列LTPvQVVAIAwIAzGHGG的重复序列，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD或GKQALETVQRLLPVLCQA。
88.根据权利要求83所述的基因编辑蛋白，其中所述多个重复序列包括至少一个包含氨基酸序列LTPvQVVAIAwxyzGHGG的重复序列，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“x”是S、T或Q，“y”是任何氨基酸或无氨基酸，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD或GKQALETVQRLLPVLCQA。
89.根据权利要求83所述的基因编辑蛋白，其中所述多个重复序列包括至少一个包含氨基酸序列LTPvQVVAIAwxyzGHGG的重复序列，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“x”是S、T或Q，“y”选自：D、A、I、N、H、K、S和G，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD或GKQALETVQRLLPVLCQA。
90.根据权利要求83所述的基因编辑蛋白，其中所述多个重复序列包括至少一个包含氨基酸序列LTPvQVVAIAwx的重复序列，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，并且“x”是S、T或Q。
91.根据权利要求83所述的基因编辑蛋白，其中所述多个重复序列包括至少一个包含氨基酸序列LTPvQVVAIAwxy的重复序列，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“x”是S、T或Q，并且“y”选自：D、A、I、N、H、K、S和G。
92.根据权利要求51所述的组合物，其中所述第一基因编辑蛋白的结合位点和所述第二基因编辑蛋白的结合位点存在于相同的目标DNA分子中。
93.根据权利要求92所述的组合物，其中所述第一基因编辑蛋白的结合位点和所述第二基因编辑蛋白的结合位点间隔不超过约50个碱基。
94.根据权利要求50所述的组合物，其中所述基因编辑蛋白能够在所述目标DNA分子中产生切口或双链断裂。
95.根据权利要求51所述的组合物，其中所述第一基因编辑蛋白的核酸酶结构域和所述第二基因编辑蛋白的核酸酶结构域能够形成二聚体，并且所述二聚体能够在所述目标DNA分子中产生切口或双链断裂。
96.根据权利要求50所述的组合物，其中所述多个重复序列包括至少一个与转录激活因子样效应物单体具有至少约50％同源性的重复序列。
97.根据权利要求50所述的组合物，其中所述多个重复序列包括至少一个锌指单体。
98.根据权利要求50所述的组合物，其中所述核酸是合成RNA分子。
99.根据权利要求98所述的组合物，其中所述合成RNA分子包含以下中的至少一种：
假尿苷、5-甲基假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、N4-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷和7-脱氮鸟苷。
100.一种用于合成基因编辑蛋白或编码包含核酸的基因编辑蛋白的核酸的制品，其中所述核酸包含：
a.编码DNA结合结构域的核苷酸序列，和
b.编码核酸酶结构域的核苷酸序列，
其中所述DNA结合结构域包含多个重复序列，所述重复序列中的至少两个彼此具有至少约50％同源性，并且所述重复序列中的至少一个含有一个或多个能够结合至目标DNA分子中的结合位点的区域，所述结合位点含有长度为约1至约5个碱基的限定序列，并且所述核酸酶结构域包含选自FokI、StsI、StsI-HA、StsI-HA2、StsI-UHA、StsI-UHA2、StsI-HF、StsI-UHF的蛋白质或其生物活性片段的催化结构域。
101.根据权利要求100所述的物品，其中所述核酸进一步包含RNA-聚合酶启动子。
102.根据权利要求101所述的物品，其中所述RNA聚合酶启动子选自T7启动子和SP6启动子。
103.根据权利要求100所述的物品，其中所述核酸进一步包含病毒启动子。
104.根据权利要求100所述的物品，其中所述核酸进一步包含非翻译区。
105.根据权利要求100所述的物品，其中所述核酸是体外转录模板。
106.一种用于诱导活细胞以表达基因编辑蛋白的方法，其包括用根据权利要求50所述的组合物转染所述细胞。
107.一种用于改变活细胞的DNA序列的方法，其包括用根据权利要求50所述的组合物转染细胞。
108.一种用于降低活细胞中相关蛋白质的表达的方法，其包括用根据权利要求50所述的组合物转染所述细胞，其中所述目标DNA分子编码相关蛋白质。
109.一种用于改变活细胞的DNA序列以产生灭活、减活或显性负性形式的相关蛋白质的方法，其包括用根据权利要求50所述的组合物转染所述细胞，其中所述目标DNA分子编码所述相关蛋白质，并且导致所述细胞产生灭活、减活或显性负性形式的所述蛋白质。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述相关蛋白质是存活素。
111.一种用于治疗患者的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求
50所述的组合物，并且导致所述患者的一种或多种症状减轻。
112.一种用于治疗癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据权利要求50所述的组合物，并且导致所述患者中的癌细胞的生长降低和/或停止。
113.根据权利要求50所述的组合物，其中所述目标DNA分子包含BIRC5基因。
114.一种用于改变包含基因编辑蛋白的活细胞的DNA序列的组合物，其中所述基因编辑蛋白能够结合至与选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的序列具有至少50％同源性的序列。
115.一种用于改变包含基因编辑蛋白的活细胞的DNA序列的组合物，其中所述基因编辑蛋白能够结合至一个或多个结合位点，并且其中多个所述结合位点与以下中的两个或更多个具有至少50％同源性：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。
116.根据权利要求50所述的组合物，其进一步包含修复模板。
117.一种用于治疗患者的方法，其包括：
a.从所述患者中移出细胞，
b.通过用根据权利要求50所述的组合物转染所述细胞来诱导所述细胞以表达基因编辑蛋白，
c.通过用编码一种或多种重编程蛋白的一种或多种核酸转染所述细胞来重编程所述细胞，
d.将所述细胞分化成以下中的一种：皮肤细胞、葡萄糖反应性胰岛素产生细胞、造血细胞、心脏细胞、视网膜细胞、肾细胞、神经细胞、间质细胞、脂肪细胞、骨细胞、肌肉细胞、卵母细胞和精子细胞，和
e.将所述细胞引入所述患者中。
118.一种用于治疗患者的方法，其包括：
a.从所述患者中移出造血细胞或干细胞，
b.通过用根据权利要求50所述的组合物转染所述细胞来诱导所述细胞以表达基因编辑蛋白，和
c.将所述细胞引入所述患者中。
119.一种用于治疗癌症的方法，其包括：
a.从患者中移出含有一个或多个癌细胞的活检组织，
b.测定所述一个或多个癌细胞中的癌症相关基因标志物的序列，和
c.向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求50所述的组合物，其中所述目标DNA分子的序列与所述癌症相关基因标志物的序列具有至少约50％同源性。
120.根据权利要求119所述的方法，其进一步包括比较所述一个或多个癌细胞中的一种或多种癌症相关基因标志物的序列与一个或多个非癌性细胞中的相同癌症相关基因标志物的序列，选择所述一个或多个癌细胞和所述一个或多个非癌性细胞中具有不同序列的癌症相关基因标志物，并且其中所述目标DNA分子的序列与所选癌症相关基因标志物的序列具有至少约50％同源性。
121.一种用于治疗神经退化性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸，其中所述基因编辑蛋白能够结合至编码形成疾病相关斑块的蛋白质的核苷酸序列，并且导致所述患者中的疾病进程延迟或停止和/或疾病相关斑块减少。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述核苷酸序列包含SNCA基因。
123.根据权利要求121所述的方法，其中所述核苷酸序列编码α-突触核蛋白。
124.根据权利要求121所述的方法，其中所述神经退化性疾病选自帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和痴呆症。
125.一种用于改变活细胞的DNA序列的试剂盒，其包含根据权利要求50所述的组合物。
126.一种用于改变人类活细胞的DNA序列的试剂盒，其包含根据权利要求50所述的组合物，其中所述目标DNA分子包含编码AAVS1基因座的核苷酸序列。
127.一种用于改变啮齿动物活细胞的DNA序列的试剂盒，其包含根据权利要求50所述的组合物，其中所述目标DNA分子包含编码Rosa26基因座的核苷酸序列。
128.一种用于鉴定致病毒物的方法，其包括用基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸转染活细胞以改变所述细胞的DNA序列，其中所改变的DNA序列赋予疾病易感性，使所述细胞与疑似致病毒物接触，和评估所述细胞展现与所述疾病相关的表型的程度。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述疾病是神经退化性疾病、自身免疫疾病、呼吸道疾病、生殖障碍或癌症。
130.一种用于评估治疗物质的安全性的方法，其包括用基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸转染活细胞以改变所述细胞的DNA序列，其中所改变的DNA序列赋予对所述治疗物质的一种或多种毒性作用的易感性，使所述细胞与所述治疗物质接触，和测量所述治疗物质对所述细胞的一种或多种毒性作用。
131.一种用于评估治疗物质的有效性的方法，其包括用基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸转染活细胞以改变所述细胞的DNA序列，其中所改变的DNA序列造成所述细胞展现一种或多种疾病相关表型，使所述细胞与所述治疗物质接触，和测量所述一种或多种疾病相关表型降低的程度。
132.一种用于治疗传染性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸，其中所述基因编辑蛋白能够结合至传染因子中存在的一个或多个核苷酸序列。
133.根据权利要求112所述的方法，其中所述癌症是神经胶质瘤。
134.根据权利要求112所述的方法，其中所述患者先前已进行手术或放射疗法来去除癌症。
135.根据权利要求112所述的方法，其中所述施用是通过以下中的一种或多种：鞘内注射、颅内注射、静脉内注射、灌注、皮下注射、腹膜内注射、门静脉内注射和局部递送。
136.根据权利要求111所述的方法，其中所述患者被诊断患有蛋白病。
137.根据权利要求125所述的试剂盒，其进一步包含修复模板。
138.根据权利要求137所述的试剂盒，其中所述修复模板含有多个克隆位点。
139.一种用于在细胞中表达相关蛋白质的方法，其通过使所述细胞与合成RNA分子接触，所述合成RNA分子包含5-甲基尿苷、7-脱氮鸟苷，和以下中的至少一种：5-甲基胞苷、
5-羟基甲基胞苷、N4-甲基胞苷和N4-乙酰基胞苷。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述合成RNA分子包含尿苷残基，并且约
40％的所述尿苷残基是5-甲基尿苷残基。
141.根据权利要求139所述的方法，其中所述合成RNA分子包含胞苷残基，并且约
40％至约100％的所述胞苷残基选自：5-甲基胞苷残基、5-羟基甲基胞苷残基、N4-甲基胞苷残基和N4-乙酰基胞苷残基。
142.根据权利要求139所述的方法，其中所述合成RNA分子包含鸟苷残基，并且约
50％的所述鸟苷残基是7-脱氮鸟苷残基。
143.一种编码相关蛋白质的核酸，包含5-甲基尿苷、7-脱氮鸟苷，和以下中的至少一种：5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、N4-甲基胞苷和N4-乙酰基胞苷。
144.一种用于增加细胞中的同源重组的方法，其包括：
a.使所述细胞与NHEJ抑制剂接触，
b.用编码一种或多种基因编辑蛋白的一种或多种核酸转染所述细胞，其中所述一种或多种基因编辑蛋白中的至少一种结合至目标区域，和
c.用一种或多种与所述目标区域具有至少50％同源性的核酸转染所述细胞。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述NHEJ抑制剂是DNA-PK抑制剂。
146.根据权利要求144所述的方法，其中所述DNA-PK抑制剂是以下的成员：化合物
401(2-(4-吗啉基)-4H-嘧啶并[2,1-a]异喹啉-4-酮)、DMNB、IC87361、LY294002、NU7026、NU7441、OK-1035、PI 103盐酸盐、香草醛和渥曼青霉素或其衍生物。
147.一种用于治疗杜兴氏肌营养不良症的方法，其包括向患者施用一种或多种基因编辑蛋白或编码一种或多种基因编辑蛋白的核酸，其中所述一种或多种基因编辑蛋白靶向DMD基因内的序列。
148.根据权利要求147所述的方法，其中所述治疗导致产生截短形式的DMD蛋白。
149.根据权利要求147所述的方法，其中所述目标序列在约1kb的剪接受体位点内。
用于在细胞中表达蛋白质的方法和产品
[0001] 【优先权】
[0002] 本申请要求2012年11月1日提交的美国临时申请No.61/721,302、2013年3月14日提交的美国临时申请No.61/785,404和2013年7月3日提交的美国临时申请No.61/842,874的优先权，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。本申请与2012年5月7日提交的美国申请No.13/465,490、2012年12月5日提交的国际申请No.PCT/US2012/067966和2013年6月28日提交的美国申请No.13/931,251有关，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
【技术领域】
【技术领域】
[0003] 本发明部分地涉及编码蛋白质的核酸，包含编码蛋白质的核酸的治疗剂，用于诱导细胞以使用核酸来表达蛋白质的方法，用于转染、基因编辑和重编程细胞的方法、试剂盒和器件，和使用这些方法、试剂盒和器件而产生的细胞、生物体和治疗剂。
[0004] 【以电子方式提交的文本文件的描述】
[0005] 以电子方式与其一起提交的文本文件的内容是以全文引用的方式并入本文中：序列表的计算机可读格式副本(文件名：FABI_005_02WO_SeqList_ST25.txt；记录日期：2013年10月30日；文件大小：255KB)。
[0006] 【发明背景】
[0007] 【合成RNA和RNA治疗剂】
[0008] 核糖核酸(RNA)普遍存在于原核和真核细胞中，其中它以信使RNA形式编码遗传信息，以转运RNA形式结合并转运氨基酸，以核糖体RNA形式将氨基酸组装到蛋白质中，并且以微RNA和长的非编码RNA形式执行众多其它功能，包括基因表达调控。RNA可通过包括直接化学合成和体外转录的方法合成产生，并且可施用至患者以用于治疗用途。
[0009] 【细胞重编程和基于细胞的疗法】
[0010] 可以通过使细胞暴露于特定的细胞外信号和/或通过特定蛋白质、微RNA等的异位表达来将细胞重编程。虽然先前已描述了若干种重编程方法，但依赖于异位表达的大部分重编程方法需要引入外源DNA，其可能携带突变风险。已报道了基于重编程蛋白的直接递送的无DNA的重编程方法。然而，这些方法对于商业用途来说太低效并且不可靠。另外，已经描述了基于RNA的重编程方法(参见例如Angel.MIT Thesis.2008.1-56；Angel等,PLoS ONE.2010.5,107；Warren等,Cell Stem Cell.2010.7,618-630；Angel.MIT Thesis.2011.1-89；和Lee等,Cell.2012.151,547-558；其全部的内容特此以引用的方式并入)。然而，当在成人细胞上进行时，现有的基于RNA的重编程方法是缓慢、不可靠和低效的，需要许多次转染(产生显著的费用和错误机会)，可以重编程仅有限数目的细胞类型，可以将细胞重编程至仅有限数目的细胞类型，需要使用免疫抑制剂，并且需要使用多种人类来源的组分，包括血源性HSA和人类成纤维细胞饲养细胞。先前公开的基于RNA的重编程方法的许多缺点使其对于研究和治疗用途来说是不理想的。
[0011] 【基因编辑】
[0012] 若干种天然存在的蛋白质含有可以识别特定DNA序列的DNA结合结构域，例如，锌指(ZF)和转录激活因子样效应物(TALE)。含有一个或多个这些DNA结合结构域和FokI核酸内切酶的切割域的融合蛋白可用于在细胞中的所希望DNA区域中产生双链断裂(参见例如美国专利申请公开No.US 2012/0064620、美国专利申请公开No.US 2011/0239315、美国专利No.8,470,973、美国专利申请公开No.US 2013/0217119、美国专利No.8,420,782、美国专利申请公开No.US 2011/0301073、美国专利申请公开No.US 2011/0145940、美国专利No.8,450,471、美国专利No.8,440,431、美国专利No.8,440,432和美国专利申请公开No.2013/0122581，其全部的内容特此以引用的方式并入)。然而，目前用于基因编辑细胞的方法是低效的并且带有不受控制诱变的风险，使其对于研究和治疗用途来说是不理想的。先前尚未探讨体细胞的无DNA基因编辑方法，也未探讨用于对体细胞进行同时或依序基因编辑和重编程的方法。另外，先前尚未探讨用于对患者中的细胞(即，体内)进行直接基因编辑的方法，并且这些方法的发展已受到以下的限制：缺乏可接受靶标、低效递送、一种或多种基因编辑蛋白的低效表达、所表达的一种或多种基因编辑蛋白的低效基因编辑、部分地由于DNA结合结构域的不良结合、过量的脱靶效应、部分地由于FokI切割域的非定向二聚和DNA结合结构域的不良特异性，和其它因素。最后，先前尚未探讨基因编辑在抗细菌、抗病毒和抗癌治疗中的使用。
[0013] 因此，仍需要用于在细胞中表达蛋白质的改进的组合物和方法。【发明内容】
[0014] 本发明部分地提供用于诱导细胞以表达蛋白质的组合物、方法、物品和器件，用于产生这些组合物、方法、物品和器件的方法、物品和器件，和使用这些组合物、方法、物品和器件而产生的组合物和物品，包括细胞、生物体和治疗剂。不同于先前报道的方法，本发明的某些实施方案不包括使细胞暴露于外源DNA或者同种异体或动物源材料，这使得根据本发明的方法制造的产品可用于治疗应用。
[0015] 在一些方面，提供具有低毒性和高翻译效率的合成RNA分子。在一个方面，提供用于细胞的高效率转染、重编程和基因编辑的细胞培养基。其它方面涉及用于产生编码重编程蛋白的合成RNA分子的方法。其它方面涉及用于产生编码基因编辑蛋白的合成RNA分子的方法。
[0016] 在一个方面，本发明提供包含工程改造的核酸酶切割域的高效率基因编辑蛋白。在另一个方面，本发明提供包含工程改造的核酸酶切割域的高保真基因编辑蛋白。其它方面涉及包含工程改造的DNA结合结构域的高效率基因编辑蛋白。其它方面涉及包含工程改造的DNA结合结构域的高保真基因编辑蛋白。其它方面涉及包含工程改造的重复序列的基因编辑蛋白。一些方面涉及通过转染细胞或诱导细胞以表达基因编辑蛋白来改变细胞的DNA序列的方法。其它方面涉及用于改变体外培养物中存在的细胞的DNA序列的方法。其它方面涉及用于改变体内存在的细胞的DNA序列的方法。
[0017] 在一些方面，本发明提供用于治疗癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸。在一个方面，所述基因编辑蛋白能够改变癌症相关基因的DNA序列。在另一个方面，所述癌症相关基因是BIRC5基因。其它方面涉及包含核酸和/或细胞的治疗剂和使用包含核酸和/或细胞的治疗剂来治疗例如以下疾病的方法：1型糖尿病、心脏病包括缺血性和扩张性心肌病、黄斑变性、帕金森氏病(Parkinson's disease)、囊性纤维化、镰状细胞贫血、地中海贫血、范可尼贫血(Fanconi anemia)、重症联合免疫缺陷、遗传性感觉神经病、着色性干皮病、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、肌营养不良症、肌萎缩性侧索硬化、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、癌症和传染性疾病包括肝炎和HIV/AIDS。在一些方面，所述核酸包含合成RNA。在其它方面，使用病毒将所述核酸递送至细胞。在一些方面，所述病毒是有能力复制型病毒。在其它方面，所述病毒是无能力复制型病毒。
[0018] 本发明的细节阐述于下面所附描述中。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述类似或等效的方法和材料，但现在描述说明性方法和材料。根据本说明书和权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将是显而易见的。在本说明书和所附的权利要求书中，除非上下文另外明确说明，否则单数形式也包括复数。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。【附图说明】
[0020] 图1B描绘在变性甲醛-琼脂糖凝胶上离析的编码所示蛋白质并含有腺苷、50％鸟苷、50％7-脱氮鸟苷、50％尿苷、50％5-甲基尿苷和5-甲基胞苷的RNA。
[0021] 图2描绘通过用编码重编程蛋白的RNA进行五次转染而重编程的原代人类新生儿成纤维细胞。将细胞固定并对Oct4蛋白染色。用Hoechst 33342将核反染色。
[0022] 图3A描绘原代人类成人成纤维细胞。
[0023] 图3B描绘图3A中所示的原代人类成人成纤维细胞，其通过用编码重编程蛋白的RNA进行七次转染来重编程。箭头指示重编程细胞的集落。
[0024] 图3C描绘重编程原代人类成人成纤维细胞的大的集落。
[0025] 图4A描绘靶向人类CCR5基因的TALEN对的位置。单线指示TALEN结合位点。双线指示Δ32突变的位置。
[0026] 图4B描绘在变性甲醛-琼脂糖凝胶上离析的编码图4A的TALEN对的合成RNA。
[0027] 图4C描绘测试图4B的RNA在人类皮肤成纤维细胞(GM00609)上的功能性的SURVEYOR测定法的结果。在从用RNA转染的细胞产生的样品中出现760bp和200bp条带指示成功的基因编辑。每个泳道下面的百分比指示基因编辑效率(所编辑的等位基因的百分比)。
[0028] 图4D描绘图4C的“阴性”和“TALEN”泳道的线-轮廓图。数字指示三个条带相对于总积分强度的积分强度。
[0029] 图4E描绘如图4C中一样进行并且还包括从用RNA转染两次的细胞产生的样品的SURVEYOR测定法的结果(条带标记为“2x”)。
[0030] 图4F描绘使用合成RNA对原代人类细胞(GM00609)进行同时的基因编辑和重编程。图像示出重编程细胞的代表性集落。
[0031] 图4G描绘对如图4F中所产生的基因编辑的重编程细胞中的CCR5基因进行直接测序的结果。所测试的9条线中的4条在TALEN结合位点之间含有缺失，从而指示有效的基因编辑。
[0032] 图5描绘如图4C中一样进行的SURVEYOR测定法的结果，其中例外为使用靶向人类MYC基因并含有标准核苷酸(“A、G、U、C”)或非标准核苷酸(“A、7dG、5mU、5mC”)的RNA。在470bp和500bp下的深色条带指示高效率基因编辑。
[0033] 图6描绘如图4C中一样进行的SURVEYOR测定法的结果，其中例外为使用靶向人类BIRC5基因并含有标准核苷酸(“A、G、U、C”)或非标准核苷酸(“A、7dG、5mU、5mC”)的RNA。在710bp下的深色条带指示高效率基因编辑。
[0034] 图7A描绘用靶向人类BIRC5基因的RNA(RiboSlice)转染的HeLa细胞(子宫颈癌)。用单个RNA(“2×存活素L”)或相等量的每个成员的RNA对(“存活素L+R”)转染细胞，其中在每种情况下递送相同总量的RNA。如右图中所示，用RNA对转染的细胞变得增大，并且呈现出破碎核和显著降低的增殖，这表明RiboSlice的有效抗癌活性。
[0035] 图7B描绘如图7A中一样用靶向人类BIRC5基因的RNA转染的HeLa细胞。随后将细胞固定并对存活素蛋白染色。用Hoechst 33342将核反染色。用箭头指示用RiboSlice转染的细胞的大的破碎核。
[0036] 图8描绘使用合成RNA重编程的原代人类成人成纤维细胞。箭头指示展现指示重编程的形态的细胞的密实集落。
[0037] 图9描绘在变性甲醛-琼脂糖凝胶上离析的编码所示基因编辑蛋白的合成RNA。
[0038] 图10A描绘测试图9的RNA对于人类皮肤成纤维细胞的有效性的SURVEYOR测定法的结果。细胞在转染后大约48小时裂解。用星号指示对应于由成功的基因编辑产生的消化产物的条带。泳道标记具有形式“X.Y”，其中X是指扩增DNA的外显子，并且Y是指基因编辑蛋白对。例如，“1.1”是指靶向最接近于起始密码子的外显子1的区域的基因编辑蛋白对。“X.N”是指未转染的细胞。
[0039] 图10B描绘测试图9的RNA对于人类皮肤成纤维细胞的毒性的SURVEYOR测定法的结果。细胞在转染后11天裂解。泳道和条带如图10A中一样标记。用星号指示的条带的出现证实转染的细胞保持高活力。
[0040] 图11描绘被设计用于测试编码体内的基因编辑蛋白的RNA的安全性的研究的结果。该图示出四组小鼠(每组10只动物)的平均体重，所述组包括一个未处理组、一个仅媒介物组、一个经由肿瘤内注射用RiboSlice处理的组，和一个经由静脉内注射用RiboSlice处理的组。对于所有的处理组，从第1天至第9天，每隔一天，向动物给予5次给药。对动物随访至第17天。四个组的平均体重之间缺乏统计学显著差异，证实RiboSlice的体内安全性。
[0041] 图12A描绘测试包含多种长度为36个氨基酸的重复序列的基因编辑蛋白的有效性的SURVEYOR测定法的结果。人类皮肤成纤维细胞在用编码含有所示重复序列的基因编辑蛋白的RNA转染后约48小时裂解。用星号指示对应于由成功的基因编辑产生的消化产物的条带。泳道标记是指在重复序列的C末端的氨基酸。“阴性”是指未转染的细胞。
[0042] 图12B描绘测试其中每个其它重复序列的长度为36个氨基酸的基因编辑蛋白的有效性的SURVEYOR测定法的结果。人类皮肤成纤维细胞在用编码含有所示重复序列的基因编辑蛋白的RNA转染后约48小时裂解。用星号指示对应于由成功的基因编辑产生的消化产物的条带。泳道标记是指在重复序列的C末端的氨基酸。“阴性”是指未转染的细胞。
[0043] 图13A描绘被设计用于测试带有编码基因编辑蛋白的核酸的RiboSlice AAV无能力复制型病毒在体内的安全性和功效的研究的结果。该图示出带有包含人类神经胶质瘤细胞的皮下肿瘤的小鼠的三个组的平均体重，所述组包括一个未处理组(无处理对照组，“NTC”，n＝6)、一个经由肿瘤内注射用编码GFP的AAV处理的组(“GFP”，n＝2)，和一个经由肿瘤内注射用编码靶向BIRC5基因的基因编辑蛋白的RiboSlice AAV处理的组(“RiboSlice”，n＝2)。对于GFP组，在第1天向动物给药，并且对于RiboSlice组，在第1天和第15天给药。对动物随访至第25天。三个组的平均体重之间缺乏统计学显著差异，从而证实RiboSlice AAV的体内安全性。
[0044] 图13B描绘在图13A中所示研究中的动物的标准化肿瘤体积。相比于NTC和GFP组，在用RiboSlice AAV处理的组中的标准化肿瘤体积的较缓慢增加证实RiboSlice AAV的体内功效。
[0045] 图14描绘如图12B中一样测试基因编辑蛋白的有效性的SURVEYOR测定法的结果。“RiboSlice”是指其中每个其它重复序列的长度为36个氨基酸的基因编辑蛋白。“野生型”是指未转染的细胞。
[0046] 图15描绘在变性甲醛-琼脂糖凝胶上离析的编码所示蛋白质并含有腺苷、50％鸟苷、50％7-脱氮鸟苷、60％尿苷、40％5-甲基尿苷和5-甲基胞苷的RNA。
[0047] 图16描绘测试修复模板整合至APP基因中的测定法的结果。在由用RNA和修复模板转染的细胞产生的样品中出现562bp和385bp条带指示PstI限制位点的成功整合。“-”是指未消化的样品，“+”是指用PstI限制性核酸酶处理的样品。【具体实施方式】
[0048] 【定义】
[0049] “分子”意指分子实体(分子、离子、络合物等)。
[0050] “RNA分子”意指包含RNA的分子。
[0051] “合成RNA分子”意指在细胞外部产生或使用生物工程改造在细胞内部产生的RNA分子，作为非限制性实例为在体外转录反应中产生的RNA分子、通过直接化学合成产生的RNA分子或在遗传工程改造的大肠杆菌细胞中产生的RNA分子。
[0052] “转染”意指使细胞与分子接触，其中所述分子被所述细胞内化。
[0053] “在转染后”意指在转染期间或之后。
[0054] “转染试剂”意指与分子缔合并促进所述分子递送至细胞和/或所述分子被细胞内化的物质或物质混合物，作为非限制性实例为阳离子脂质、带电荷的聚合物或细胞渗透肽。
[0055] “基于试剂的转染”意指使用转染试剂进行的转染。
[0056] “细胞培养基”意指可用于细胞培养的培养基，作为非限制性实例为杜尔伯科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)或DMEM+10％胎牛血清(FBS)。
[0057] “络合培养基”意指向其中加入转染试剂和待转染的分子并且其中所述转染试剂与所述待转染的分子相缔合的培养基。
[0058] “转染培养基”意指可用于转染的培养基，作为非限制性实例为杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)或DMEM/F12。
[0060] “脂质载体”意指可以增加脂质或脂溶性分子在水溶液中的溶解性的物质，作为非限制性实例为人类血清白蛋白或甲基-β-环糊精。
[0061] “Oct4蛋白”意指由POU5F1基因编码的蛋白质，或其天然或工程改造的变体、家族成员、直系同源物、片段或融合构建体，作为非限制性实例为人类Oct4蛋白(SEQ ID NO:8)、小鼠Oct4蛋白、Oct1蛋白、由POU5F1假基因2编码的蛋白、Oct4蛋白的DNA结合结构域或Oct4-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，Oct4蛋白包含与SEQ ID NO:8具有至少70％同一性的氨基酸序列，或者在其它实施方案中，与SEQ ID NO:8具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Oct4蛋白包含相对于SEQ ID NO:8具有1至20个氨基酸插入、缺失或取代(总计)的氨基酸序列。或者在其它实施方案中，Oct4蛋白包含相对于SEQ ID NO:8具有1至15个或1至10个氨基酸插入、缺失或取代(总计)的氨基酸序列。
[0062] “Sox2蛋白”意指由SOX2基因编码的蛋白质，或其天然或工程改造的变体、家族成员、直系同源物、片段或融合构建体，作为非限制性实例为人类Sox2蛋白(SEQ ID NO:9)、小鼠Sox2蛋白、Sox2蛋白的DNA结合结构域或Sox2-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，Sox2蛋白包含与SEQ ID NO:9具有至少70％同一性的氨基酸序列，或者在其它实施方案中，与SEQ ID NO:9具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Sox2蛋白包含相对于SEQ ID NO:9具有1至20个氨基酸插入、缺失或取代(总计)的氨基酸序列。或者在其它实施方案中，Sox2蛋白包含相对于SEQ ID NO:9具有1至15个或1至10个氨基酸插入、缺失或取代(总计)的氨基酸序列。
[0063] “Klf4蛋白”意指由KLF4基因编码的蛋白质，或其天然或工程改造的变体、家族成员、直系同源物、片段或融合构建体，作为非限制性实例为人类Klf4蛋白(SEQ ID NO:10)、小鼠Klf4蛋白、Klf4蛋白的DNA结合结构域或Klf4-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，Klf4蛋白包含与SEQ ID NO:10具有至少70％同一性的氨基酸序列，或者在其它实施方案中，与SEQ ID NO:10具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Klf4蛋白包含相对于SEQ ID NO:10具有1至20个氨基酸插入、缺失或取代(总计)的氨基酸序列。或者在其它实施方案中，Klf4蛋白包含相对于SEQ ID NO:10具有1至15个或1至10个氨基酸插入、缺失或取代(总计)的氨基酸序列。
[0064] “c-Myc蛋白”意指由MYC基因编码的蛋白质，或其天然或工程改造的变体、家族成员、直系同源物、片段或融合构建体，作为非限制性实例为人类c-Myc蛋白(SEQ ID NO:11)、小鼠c-Myc蛋白、l-Myc蛋白、c-Myc(T58A)蛋白、c-Myc蛋白的DNA结合结构域或c-Myc-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，c-Myc蛋白包含与SEQ ID NO:11具有至少70％同一性的氨基酸序列，或者在其它实施方案中，与SEQ ID NO:11具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，c-Myc蛋白包含相对于SEQ ID NO:11具有
1至20个氨基酸插入、缺失或取代(总计)的氨基酸序列。或者在其它实施方案中，c-Myc蛋白包含相对于SEQ ID NO:11具有1至15个或1至10个氨基酸插入、缺失或取代(总计)的氨基酸序列。
1至20个氨基酸插入、缺失或取代(总计)的氨基酸序列。或者在其它实施方案中，c-Myc蛋白包含相对于SEQ ID NO:11具有1至15个或1至10个氨基酸插入、缺失或取代(总计)的氨基酸序列。
[0065] “重编程”意指造成细胞表型的变化，作为非限制性实例为造成β祖细胞分化为成熟β细胞、造成成纤维细胞去分化为多能干细胞、造成角化细胞转分化为心脏干细胞或造成神经元轴突生长。
[0066] “重编程因子”意指当细胞与分子接触和/或细胞表达分子时，可以单独地或与其它分子组合造成重编程的分子，作为非限制性实例为Oct4蛋白。
[0067] “饲养细胞”意指可用于调节培养基或以其它方式支持培养物中的其它细胞的生长的细胞。
[0068] “调节”意指使一种或多种饲养细胞与培养基接触。
[0069] “脂肪酸”意指包含至少两个碳原子的脂族链的分子，作为非限制性实例为亚油酸、α-亚麻酸、辛酸、白三烯、前列腺素、胆固醇、糖皮质激素、消退素、保护素、血栓素、脂氧素、maresin、鞘脂、色氨酸、N-乙酰基色氨酸或其盐、甲酯或衍生物。
[0070] “短链脂肪酸”意指包含具有2至30个碳原子的脂族链的脂肪酸。
[0071] “白蛋白”意指在水中高度可溶的蛋白质，作为非限制性实例为人类血清白蛋白。
[0072] “缔合分子”意指与另一个分子非共价结合的分子。
[0073] “白蛋白的缔合分子组分”意指结合于白蛋白多肽的一种或多种分子，作为非限制性实例为结合于白蛋白多肽的脂质、激素、胆固醇、钙离子等。
[0074] “经过处理的白蛋白”意指经过处理以降低、去除、置换或以其它方式灭活白蛋白的缔合分子组分的白蛋白，作为非限制性实例为在高温下温育的人类血清白蛋白、与辛酸钠接触的人类血清白蛋白或与多孔材料接触的人类血清白蛋白。
[0075] “离子交换树脂”意指当与含有离子的溶液接触时可以用一个或多个不同离子置换一个或多个离子的材料，作为非限制性实例为可以用一个或多个钠离子置换一个或多个钙离子的材料。
[0076] “生殖细胞”意指精子细胞或卵子细胞。
[0077] “多能干细胞”意指可以在体内分化成具有所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞的细胞。
[0078] “体细胞”意指并非多能干细胞或生殖细胞的细胞，作为非限制性实例为皮肤细胞。
[0079] “葡萄糖反应性胰岛素产生细胞”意指当暴露于特定浓度的葡萄糖时可以产生和/或分泌一定量的胰岛素并且所述量不同于(小于或大于)当细胞暴露于不同浓度的葡萄糖时细胞产生和/或分泌的胰岛素量的细胞，作为非限制性实例为β细胞。
[0080] “造血细胞”意指血细胞或可以分化成血细胞的细胞，作为非限制性实例为造血干细胞或白血细胞。
[0081] “心脏细胞”意指心脏细胞或可以分化成心脏细胞的细胞，作为非限制性实例为心脏干细胞或心肌细胞。
[0082] “视网膜细胞”意指视网膜细胞或可以分化成视网膜细胞的细胞，作为非限制性实例为视网膜色素上皮细胞。
[0083] “皮肤细胞”意指通常存在于皮肤中的细胞，作为非限制性实例为成纤维细胞、角化细胞、黑素细胞、脂肪细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或血细胞。
[0084] “Wnt信号传导激动剂”意指可以执行Wnt蛋白质家族的一个或多个成员的一种或多种生物功能的分子，作为非限制性实例为Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a或2-氨基-4-[3,4-(亚甲二氧基)苄基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶。
[0085] “IL-6信号传导激动剂”意指可以执行IL-6蛋白的一种或多种生物功能的分子，作为非限制性实例为IL-6蛋白或IL-6受体(也称为可溶性IL-6受体、IL-6R、IL-6Rα等)。
[0086] “TGF-β信号传导激动剂”意指可以执行TGF-β蛋白超家族的一个或多个成员的一种或多种生物功能的分子，作为非限制性实例为TGF-β1、TGF-β3、激活素A、BMP-4或Nodal。
[0088] “单链断裂”意指其中一条或两条链中的一条链中的一个或多个连接核苷酸的共价键已经断裂的单链或双链DNA的区域。
[0089] “双链断裂”意指其中两条链中的每一条链中的一个或多个连接核苷酸的共价键已经断裂的双链DNA的区域。
[0091] “核苷”意指核苷酸或其片段或衍生物，作为非限制性实例为核碱基、核苷、三磷酸核苷酸等。
[0092] “基因编辑”意指改变细胞的DNA序列，作为非限制性实例为通过用造成细胞的DNA突变的蛋白质转染所述细胞。
[0093] “基因编辑蛋白”意指可以单独地或与一种或多种其它分子组合来改变细胞的DNA序列的蛋白质，作为非限制性实例为核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶、大范围核酸酶、切口酶、规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白质或者其天然或工程改造的变体、家族成员、直系同源物、片段或融合构建体。
[0094] “修复模板”意指含有与基因编辑蛋白的10kb目标位点内的序列具有至少约70％同源性的区域的核酸。
[0095] “重复序列”意指以一个以上拷贝存在于蛋白质中、在至少约10％同源性内的氨基酸序列，作为非限制性实例为转录激活因子样效应物的单体重复序列。
[0096] “DNA结合结构域”意指能够结合于DNA分子的分子区域，作为非限制性实例为包含一个或多个锌指的蛋白质结构域、包含一个或多个转录激活因子样(TAL)效应物重复序列的蛋白质结构域或能够结合于DNA分子的小分子的结合袋。
[0097] “结合位点”意指能够被基因编辑蛋白、DNA结合蛋白、DNA结合结构域或其生物活性片段或变体识别的核酸序列或者基因编辑蛋白、DNA结合蛋白、DNA结合结构域或其生物活性片段或变体对其具有高亲和力的核酸序列，作为非限制性实例为人类BIRC5基因的外显子1中的DNA的约20个碱基对序列。
[0098] “靶标”意指含有结合位点的核酸。
[0099] 其它定义阐述于美国申请No.13/465,490、美国临时申请No.61/664,494、美国临时申请No.61/721,302、国际申请No.PCT/US12/67966、美国临时申请No.61/785,404和美国临时申请No.61/842,874中，所述文献的内容特此以全文引用的方式并入。
[0100] 现在已发现，5-甲基胞苷去甲基化途径的非标准核苷酸成员，当并入合成RNA中时，可能增加所述合成RNA可翻译成蛋白质的效率，并且可能降低所述合成RNA的毒性。这些非标准核苷酸包括例如：5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-甲酰基胞苷和5-羧基胞苷(又称为“胞苷-5-甲酸”)。因此某些实施方案涉及核酸。在一个实施方案中，所述核酸是合成RNA分子。在另一个实施方案中，所述核酸包含一个或多个非标准核苷酸。在一个实施方案中，所述核酸包含5-甲基胞苷去甲基化途径的一个或多个非标准核苷酸成员。在另一个实施方案中，所述核酸包含以下中的至少一种：5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-甲酰基胞苷和5-羧基胞苷或其衍生物。在另一个实施方案中，所述核酸包含以下中的至少一种：假尿苷、5-甲基假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、N4-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷和7-脱氮鸟苷或其衍生物。
[0101] 【5-甲基胞苷去甲基化途径】
[0102]
[0103] 某些实施方案涉及蛋白质。其它实施方案涉及编码蛋白质的核酸。在一个实施方案中，所述蛋白质是相关蛋白质。在另一个实施方案中，所述蛋白质选自：重编程蛋白和基因编辑蛋白。在一个实施方案中，所述核酸是质粒。在另一个实施方案中，所述核酸存在于病毒或病毒载体中。在另一个实施方案中，所述病毒或病毒载体是无能力复制型。在另一个实施方案中，所述病毒或病毒载体是有能力复制型。在一个实施方案中，所述病毒或病毒载体包括以下中的至少一种：腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或其天然或工程改造变体，和工程改造的病毒。
[0104] 已发现，非标准核苷酸的某些组合可以特别有效地增加合成RNA可翻译成蛋白质的效率，并且降低合成RNA的毒性，例如组合为：5-甲基尿苷和5-甲基胞苷；5-甲基尿苷和7-脱氮鸟苷；5-甲基胞苷和7-脱氮鸟苷；5-甲基尿苷、5-甲基胞苷和7-脱氮鸟苷；和5-甲基尿苷、5-羟基甲基胞苷和7-脱氮鸟苷。因此某些实施方案涉及包含以下中的至少两种的核酸：5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷和7-脱氮鸟苷或其一种或多种衍生物。其它实施方案涉及包含以下中的至少三种的核酸：5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷和7-脱氮鸟苷或其一种或多种衍生物。其它实施方案涉及包含以下全部的核酸：5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷和7-脱氮鸟苷或其一种或多种衍生物。在一个实施方案中，所述核酸包含一个或多个5-甲基尿苷残基、一个或多个5-甲基胞苷残基和一个或多个7-脱氮鸟苷残基，或一个或多个5-甲基尿苷残基、一个或多个5-羟基甲基胞苷残基和一个或多个7-脱氮鸟苷残基。
[0105] 已进一步发现，含有某些非标准核苷酸的某些部分和其组合的合成RNA分子可以展现特别高的翻译效率和低毒性。因此某些实施方案涉及包含一个或多个尿苷残基、一个或多个胞苷残基和一个或多个鸟苷残基中的至少一种并包含一个或多个非标准核苷酸的核酸。在一个实施方案中，约20％至约80％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基。在另一个实施方案中，约30％至约50％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基。在另一个实施方案中，约40％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基。在一个实施方案中，约60％至约80％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基。在另一个实施方案中，约80％至约100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基。在另一个实施方案中，约100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基。在另一个实施方案中，约20％至约100％的胞苷残基是5-羟基甲基胞苷残基。在一个实施方案中，约20％至约80％的鸟苷残基是7-脱氮鸟苷残基。在另一个实施方案中，约40％至约60％的鸟苷残基是7-脱氮鸟苷残基。在另一个实施方案中，约50％的鸟苷残基是7-脱氮鸟苷残基。在一个实施方案中，约20％至约80％或约30％至约60％或约40％的胞苷残基是N4-甲基胞苷和/或N4-乙酰基胞苷残基。在另一个实施方案中，每个胞苷残基是5-甲基胞苷残基。在另一个实施方案中，约100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基和/或5-羟基甲基胞苷残基和/或N4-甲基胞苷残基和/或N4-乙酰基胞苷残基和/或一种或多种其衍生物。在另一个实施方案中，约40％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基，约20％至约100％的胞苷残基是N4-甲基胞苷和/或N4-乙酰基胞苷残基，并且约50％的鸟苷残基是7-脱氮鸟苷残基。在一个实施方案中，约40％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基并且约100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基。在另一个实施方案中，约40％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基并且约50％的鸟苷残基是7-脱氮鸟苷残基。在另一个实施方案中，约100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基并且约50％的鸟苷残基是7-脱氮鸟苷残基。在一个实施方案中，约40％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基，约100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基，并且约50％的鸟苷残基是7-脱氮鸟苷残基。在另一个实施方案中，约40％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基，约20％至约100％的胞苷残基是5-羟基甲基胞苷残基，并且约50％的鸟苷残基是7-脱氮鸟苷残基。在一些实施方案中，少于100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基。在其它实施方案中，少于100％的胞苷残基是5-羟基甲基胞苷残基。在一个实施方案中，合成RNA分子中的每个尿苷残基是假尿苷残基或5-甲基假尿苷残基。在另一个实施方案中，约100％的尿苷残基是假尿苷残基和/或5-甲基假尿苷残基。在另一个实施方案中，约100％的尿苷残基是假尿苷残基和/或5-甲基假尿苷残基，约100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基，并且约50％的鸟苷残基是7-脱氮鸟苷残基。
[0106] 可代替5-甲基尿苷或与5-甲基尿苷组合使用的其它非标准核苷酸包括(但不限于)：假尿苷和5-甲基假尿苷(又称为“1-甲基假尿苷”，又称为“N1-甲基假尿苷”)或一种或多种其衍生物。可代替5-甲基胞苷和/或5-羟基甲基胞苷或与5-甲基胞苷和/或5-羟基甲基胞苷组合使用的其它非标准核苷酸包括(但不限于)：假异胞苷、5-甲基假异胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羧基胞苷、N4-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷或一种或多种其衍生物。在某些实施方案中，例如，当仅进行单次转染时或当所转染的细胞对于转染相关毒性或先天免疫信号传导不是特别敏感时，可降低非标准核苷酸的分率。降低非标准核苷酸的分率可能是有利的，在某种程度上是因为降低非标准核苷酸的分率可降低核酸的成本。在某些情形下，例如，当希望核酸的免疫原性最小时，可以增加非标准核苷酸的分率。
[0107] 例如T7RNA聚合酶的酶可在含有标准和非标准核苷酸的体外转录反应中优先并入标准核苷酸。因此，含有某些分率的非标准核苷酸的体外转录反应可得到含有不同于反应中存在的非标准核苷酸的分率且通常较低分率的非标准核苷酸的RNA。在某些实施方案中，对于核苷酸并入分率(例如，“50％5-甲基尿苷”)的提及因此可能是指含有所述分率的核苷酸的核酸，和在含有所述分率的核苷酸(或核苷酸衍生物，例如三磷酸核苷酸)的反应中合成的核酸，即使这种反应可得到含有不同于反应中存在的非标准核苷酸分率的分率的核苷酸的核酸。另外，不同的核苷酸序列可通过利用可选的密码子来编码相同的蛋白质。在某些实施方案中，对于核苷酸并入分率的提及因此可能是指含有所述分率的核苷酸的核酸，和与不同核酸编码相同蛋白质的核酸，其中所述不同的核酸含有所述分率的核苷酸。
[0108] 细胞的DNA序列可通过使所述细胞与基因编辑蛋白接触或通过诱导所述细胞以表达基因编辑蛋白来改变。然而，先前公开的基因编辑蛋白具有低结合效率和过量的脱靶活性，其可以在细胞的DNA中引入不希望的突变，从而严重地限制其在治疗应用中的使用，其中在患者的细胞中引入不希望的突变可导致癌症的发展。现在已发现，包含StsI核酸内切酶切割域(SEQ ID NO:1)的基因编辑蛋白可以展现相比于先前公开的基因编辑蛋白大大降低的脱靶活性，同时保持高水平的中靶活性。也已经发现了其它新颖的工程改造的蛋白质，当其用作如下基因编辑蛋白的核酸酶结构域时，其可以展现高的中靶活性、低的脱靶活性、小尺寸、溶解性和其它所希望的特性：StsI-HA(SEQ ID NO:2)、StsI-HA2(SEQ ID NO:3)、StsI-UHA(SEQ ID NO:4)、StsI-UHA2(SEQ ID NO:5)、StsI-HF(SEQ ID NO:6)和StsI-UHF (SEQ ID NO:7)。StsI-HA、StsI-HA2(高活性)、StsI-UHA和StsI-UHA2(超高活性)可以展现比野生型StsI和野生型FokI更高的中靶活性，这在某种程度上是由于在N端区域内的34和61位置处的特定氨基酸取代，而StsI-HF(高保真)和StsI-UHF(超高保真)可以展现比野生型StsI和野生型FokI低的脱靶活性，这在某种程度上是由于在C端区域内的141和152位置处的特定氨基酸取代。因此某些实施方案涉及包含核酸酶结构域的蛋白质。
在一个实施方案中，所述核酸酶结构域包含以下中的一种或多种：FokI核酸内切酶的切割域(SEQ ID NO:53)、StsI核酸内切酶的切割域(SEQ ID NO:1)、StsI-HA(SEQ ID NO:2)、StsI-HA2(SEQ ID NO:3)、StsI-UHA(SEQ ID NO:4)、StsI-UHA2(SEQ ID NO:5)、StsI-HF(SEQ ID NO:6)和StsI-UHF(SEQ ID NO:7)或其生物活性片段或变体。
在一个实施方案中，所述核酸酶结构域包含以下中的一种或多种：FokI核酸内切酶的切割域(SEQ ID NO:53)、StsI核酸内切酶的切割域(SEQ ID NO:1)、StsI-HA(SEQ ID NO:2)、StsI-HA2(SEQ ID NO:3)、StsI-UHA(SEQ ID NO:4)、StsI-UHA2(SEQ ID NO:5)、StsI-HF(SEQ ID NO:6)和StsI-UHF(SEQ ID NO:7)或其生物活性片段或变体。
[0109] 还已经发现，包含包括某些新颖重复序列的DNA结合结构域的工程改造的基因编辑蛋白可以展现比先前公开的基因编辑蛋白低的脱靶活性，同时保持高水平的中靶活性。这些工程改造的基因编辑蛋白中的某些可提供若干优于先前公开的基因编辑蛋白的优点，包括例如连接重复序列的连接子区域的柔性增加，其可导致结合效率增加。因此某些实施方案涉及包含多个重复序列的蛋白质。在一个实施方案中，至少一个重复序列含有氨基酸序列：GabG，其中“a”和“b”各自表达任何氨基酸。在一个实施方案中，所述蛋白质是基因编辑蛋白。在另一个实施方案中，一个或多个重复序列存在于DNA结合结构域中。在另一个实施方案中，“a”和“b”各自独立地选自群组：H和G。在另一个实施方案中，“a”和“b”分别是H和G。在一个实施方案中，氨基酸序列存在于重复序列的C末端的约5个氨基酸内。在另一个实施方案中，氨基酸序列存在于重复序列的C末端。在一些实施方案中，氨基酸序列GabG中的一个或多个G被一个或多个除G之外的氨基酸例如A、H或GG置换。在一个实施方案中，重复序列具有约32至约40个氨基酸或约33至约39个氨基酸或约34至38个氨基酸或约35至约37个氨基酸或约36个氨基酸或大于约32个氨基酸或大于约33个氨基酸或大于约34个氨基酸或大于约35个氨基酸的长度。其它实施方案涉及包含一个或多个转录激活因子样效应物结构域的蛋白质。在一个实施方案中，至少一个转录激活因子样效应物结构域包含重复序列。其它实施方案涉及包含通过将一个或多个氨基酸插入转录激活因子样效应物结构域的至少两个重复序列之间而产生的多个重复序列的蛋白质。在一个实施方案中，插入一个或多个氨基酸，从至少一个重复序列的C末端起约1或约2或约3或约4或约5个氨基酸。其它实施方案涉及包含多个重复序列的蛋白质，其中大致每隔一个重复序列具有不同于紧邻重复序列之前或之后的重复序列的长度。在一个实施方案中，每隔一个重复序列的长度为约36个氨基酸。在另一个实施方案中，每隔一个重复序列的长度为36个氨基酸。其它实施方案涉及包含多个重复序列的蛋白质，其中所述多个重复序列包含至少两个长度各自为至少36个氨基酸的重复序列，并且其中至少两个长度为至少36个氨基酸的重复序列被至少一个长度小于36个氨基酸的重复序列隔开。一些实施方案涉及包含一个或多个选自例如SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的序列的蛋白质。
[0110] 其它实施方案涉及包含DNA结合结构域的蛋白质。在一些实施方案中，所述DNA结合结构域包含多个重复序列。在一个实施方案中，所述多个重复序列能够实现目标DNA分子中的结合位点的高特异性识别。在另一个实施方案中，至少两个重复序列彼此具有至少约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约98％、或约99％同源性。在另一个实施方案中，至少一个重复序列包含能够结合于目标DNA分子中的结合位点的一个或多个区域。在另一个实施方案中，所述结合位点包含长度为约1至约5个碱基的限定序列。在一个实施方案中，所述DNA结合结构域包含锌指。在另一个实施方案中，所述DNA结合结构域包含转录激活因子样效应物(TALE)。在另一个实施方案中，所述多个重复序列包括至少一个与TALE具有至少约50％或约60％或约70％或约80％或约90％或约95％或约98％、或约99％同源性的重复序列。在另一个实施方案中，所述基因编辑蛋白包含规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白包含核定位序列。在另一个实施方案中，所述核定位序列包含氨基酸序列：PKKKRKV。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白包含线粒体定位序列。在另一个实施方案中，所述线粒体定位序列包含氨基酸序列：LGRVIPRKIASRASLM。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白包含连接子。在另一个实施方案中，所述连接子将DNA结合结构域连接至核酸酶结构域。在另一个实施方案中，所述连接子的长度为约1至约10个氨基酸。在一些实施方案中，所述连接子的长度为约1、约2、或约3、或约4、或约5、或约6、或约7、或约8、或约9、或约10个氨基酸。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白能够在目标DNA分子中产生切口或双链断裂。
[0111] 某些实施方案涉及用于修饰细胞的基因组的方法，所述方法包括向所述细胞中引入编码非天然存在的融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含包括一个或多个长度为36个氨基酸的重复单元的人工转录激活因子样(TAL)效应物重复结构域和核酸内切酶结构域，其中所述重复结构域经过工程改造以识别预定核苷酸序列，并且其中所述融合蛋白识别所述预定核苷酸序列。在一个实施方案中，所述细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是动物细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是人类细胞。在一个实施方案中，所述细胞是植物细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述融合蛋白在细胞的核酸中引入核酸内切，由此修饰所述细胞的基因组。
[0112] 其它实施方案涉及编码非天然存在的融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含包括一个或多个长度为36个氨基酸的重复单元的人工转录激活因子样(TAL)效应物重复结构域和限制性核酸内切酶活性，其中所述重复结构域经过工程改造以识别预定核苷酸序列并且其中所述融合蛋白识别所述预定核苷酸序列。在一个实施方案中，所述重复单元相差不超过约七个氨基酸。在另一个实施方案中，每个重复单元含有氨基酸序列：LTPXQVVAIAS，其中X可以是E或Q，并且所述氨基酸序列LTPXQVVAIAS在羧基末端上接着是一个或两个氨基酸，其确定腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶中的一个的识别。在一个实施方案中，核酸编码约1.5至约28.5个重复单元。在另一个实施方案中，核酸编码约11.5、约14.5、约17.5或约18.5个重复单元。在另一个实施方案中，预定核苷酸序列是启动子区域。一些实施方案涉及包含核酸分子或序列的载体。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体。在另一个实施方案中，所述病毒载体包含以下中的一种或多种：腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或其天然或工程改造变体，和工程改造的病毒。
[0113] 某些实施方案涉及编码非天然存在的融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含识别预定核苷酸序列的第一区域和具有核酸内切酶活性的第二区域，其中所述第一区域含有包含一个或多个长度为约36个氨基酸的重复单元(其彼此相差不超过七个氨基酸)的人工TAL效应物重复结构域，并且其中所述重复结构域经过工程改造以识别预定核苷酸序列。在一个实施方案中，所述第一区域含有氨基酸序列：LTPXQVVAIAS，其中X可以是E或Q。在另一个实施方案中，编码的非天然存在的融合蛋白的氨基酸序列LTPXQVVAIAS后紧接着选自HD、NG、NS、NI、NN和N的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述融合蛋白包含限制性核酸内切酶活性。一些实施方案涉及编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质包含一个或多个选自以下的序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60。
[0114] 在一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwxyzHG，其中“v”是D或E，“w”是S或N，“x”是N、H或I，“y”是任何氨基酸或无氨基酸，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQDHG、GGKQALETVQRLLPVLCQAHG、GKQALETVQRLLPVLCQDHG 或GKQALETVQRLLPVLCQAHG。在另一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwxyzHG，其中“v”是D或E，“w”是S或N，“x”是N、H或I，“y”选自：D、A、I、N、H、K、S和G，并 且“z” 是 GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQDHG、GGKQALETVQRLLPVLCQAHG、GKQALETVQRLLPVLCQDHG或GKQALETVQRLLPVLCQAHG。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwxyzHG，其中“v”是D或E，“w”是S或N，“x”是除N、H和I之外的任何氨基酸，“y”是任何氨基酸或无氨基酸，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQDHG、GGKQALETVQRLLPVLCQAHG、GKQALETVQRLLPVLCQDHG或GKQALETVQRLLPVLCQAHG。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwIyzHG，其中“v”是D或E，“w”是S或N，“y”是除G之外的任何氨基酸，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQDHG、GGKQALETVQRLLPVLCQAHG、GKQALETVQRLLPVLCQDHG或 GKQALETVQRLLPVLCQAHG。 在 又 一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwIAzHG，其中“v”是D或E，“w”是S或N，并 且“z”是 GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQDHG、GGKQALETVQRLLPVLCQAHG、GKQALETVQRLLPVLCQDHG或GKQALETVQRLLPVLCQAHG。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwxyzHG，其中“v”是D或E，“w”是S或N，“x”是S、T或Q，“y”是任何氨基酸或无氨基酸，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQDHG、GGKQALETVQRLLPVLCQAHG、GKQALETVQRLLPVLCQDHG或GKQALETVQRLLPVLCQAHG。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwxyzHG，其中“v”是D或E，“w”是S或N，“x”是S、T或Q，“y”选自：D、A、I、N、H、K、S和G，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQDHG、GGKQALETVQRLLPVLCQAHG、GKQALETVQRLLPVLCQDHG或GKQALETVQRLLPVLCQAHG。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwx，其中“v”是D或E，“w”是S或N，并且“x”是S、T或Q。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwxy，其中“v”是D或E，“w”是S或N，“x”是S、T或Q，并且“y”选自：D、A、I、N、H、K、S和G。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwxyzGHGG，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“x”是N、H或I，“y”是任何氨基酸或无氨基酸，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD或GKQALETVQRLLPVLCQA。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwxyzGHGG，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“x”是N、H或I，“y”选自：D、A、I、N、H、K、S和G，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD或GKQALETVQRLLPVLCQA。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwxyzGHGG，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“x”是除N、H和I之外的任何氨基酸，“y”是任何氨基酸或无氨基酸，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD或GKQALETVQRLLPVLCQA。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwIyzGHGG，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“y”是除G之外的任何氨基酸，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD 或GKQALETVQRLLPVLCQA。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwIAzGHGG，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD或GKQALETVQRLLPVLCQA。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwxyzGHGG，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“x”是S、T或Q，“y”是任何氨基酸或无氨基酸，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD或GKQALETVQRLLPVLCQA。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwxyzGHGG，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“x”是S、T或Q，“y”选自：D、A、I、N、H、K、S和G，并且“z”是GGRPALE、GGKQALE、GGKQALETVQRLLPVLCQD、GGKQALETVQRLLPVLCQA、GKQALETVQRLLPVLCQD或GKQALETVQRLLPVLCQA。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwx，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，并且“x”是S、T或Q。在又一个实施方案中，所述重复序列包含：LTPvQVVAIAwxy，其中“v”是Q、D或E，“w”是S或N，“x”是S、T或Q，并且“y”选自：D、A、I、N、H、K、S和G。
[0115] 核酸内切酶切割域的某些片段，包括在N末端截短的片段、在C末端截短的片段、具有内部缺失的片段和组合了N末端、C末端和/或内部缺失的片段，可以维持完全核酸内切酶切割域的部分或全部的催化活性。可通过例如以下来测定片段是否可以维持完全结构域的部分或全部的催化活性：根据本发明的方法合成含有所述片段的基因编辑蛋白，根据本发明的方法诱导细胞以表达所述基因编辑蛋白，和测量基因编辑的效率。以这种方式，基因编辑效率的测量结果可用于确定任何特定片段是否可以维持完全核酸内切酶切割域的部分或全部的催化活性。因此，某些实施方案涉及核酸内切酶切割域的生物活性片段。在一个实施方案中，所述核酸内切酶切割域选自：FokI、StsI、StsI-HA、StsI-HA2、StsI-UHA、StsI-UHA2、StsI-HF和StsI-UHF或其天然或工程改造的变体或生物活性片段。
[0116] DNA结合结构域或重复序列的某些片段，包括在N末端截短的片段、在C末端截短的片段、具有内部缺失的片段和组合了N末端、C末端和/或内部缺失的片段，可以维持完全DNA结合结构域或重复序列的部分或全部的结合活性。可以维持完全重复序列的部分或全部的结合活性的DNA结合结构域或重复序列的片段的实例包括青枯雷氏尔菌(Ralstonia solanacearum)TALE样蛋白(RTL)。可通过例如以下来测定片段是否可以维持完全DNA结合结构域或重复序列的部分或全部的结合活性：根据本发明的方法合成含有所述片段的基因编辑蛋白，根据本发明的方法诱导细胞以表达所述基因编辑蛋白，和测量基因编辑的效率。以这种方式，基因编辑效率的测量结果可用于确定任何特定片段是否可以维持完全DNA结合结构域或重复序列的部分或全部的结合活性。因此，某些实施方案涉及DNA结合结构域或重复序列的生物活性片段。在一个实施方案中，所述片段能够高特异性识别目标DNA分子中的结合位点。在另一个实施方案中，所述片段包含编码青枯雷氏尔菌TALE样蛋白的序列或其生物活性片段。
[0117] 某些实施方案涉及用于改变包含核酸的细胞的DNA序列的组合物，其中所述核酸编码基因编辑蛋白。其它实施方案涉及用于改变包含核酸混合物的细胞的DNA序列的组合物，其中所述核酸混合物包含：编码第一基因编辑蛋白的第一核酸，和编码第二基因编辑蛋白的第二核酸。在一个实施方案中，所述第一基因编辑蛋白的结合位点和所述第二基因编辑蛋白的结合位点存在于相同的目标DNA分子中。在另一个实施方案中，所述第一基因编辑蛋白的结合位点和所述第二基因编辑蛋白的结合位点间隔小于约50个碱基、或小于约40个碱基、或小于约30个碱基或小于约20个碱基、或小于约10个碱基、或约10个碱基至约25个碱基或约15个碱基。在一个实施方案中，所述第一基因编辑蛋白的核酸酶结构域和所述第二基因编辑蛋白的核酸酶结构域能够形成二聚体。在另一个实施方案中，所述二聚体能够在目标DNA分子中产生切口或双链断裂。在一个实施方案中，所述组合物是治疗组合物。在另一个实施方案中，所述组合物包含修复模板。在另一个实施方案中，所述修复模板是单链DNA分子或双链DNA分子。
[0118] 其它实施方案涉及用于合成蛋白质或编码蛋白质的核酸的制品。在一个实施方案中，所述物品是核酸。在另一个实施方案中，所述蛋白质包含DNA结合结构域。在另一个实施方案中，所述核酸包含编码DNA结合结构域的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述蛋白质包含核酸酶结构域。在另一个实施方案中，所述核酸包含编码核酸酶结构域的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述蛋白质包含多个重复序列。在另一个实施方案中，所述核酸编码多个重复序列。在另一个实施方案中，所述核酸酶结构域选自：FokI、StsI、StsI-HA、StsI-HA2、StsI-UHA、StsI-UHA2、StsI-HF和StsI-UHF或其天然或工程改造的变体或生物活性片段。在一个实施方案中，所述核酸包含RNA-聚合酶启动子。在另一个实施方案中，所述RNA-聚合酶启动子是T7启动子或SP6启动子。在另一个实施方案中，所述核酸包含病毒启动子。在一个实施方案中，所述核酸包含非翻译区。在另一个实施方案中，所述核酸是体外转录模板。
[0119] 某些实施方案涉及用于诱导细胞以表达蛋白质的方法。其它实施方案涉及用于改变细胞的DNA序列的方法，其包括用基因编辑蛋白转染所述细胞或诱导所述细胞以表达基因编辑蛋白。其它实施方案涉及用于降低细胞中相关蛋白质的表达的方法。在一个实施方案中，诱导所述细胞以表达基因编辑蛋白，其中所述基因编辑蛋白能够在目标DNA分子中产生切口或双链断裂。在另一个实施方案中，所述切口或双链断裂导致基因的灭活。其它实施方案涉及用于产生灭活、减活或显性负性形式的蛋白质的方法。在一个实施方案中，所述蛋白质是存活素。其它实施方案涉及用于修复细胞中的一个或多个突变的方法。在一个实施方案中，使所述细胞与修复模板接触。在另一个实施方案中，所述修复模板是DNA分子。在另一个实施方案中，所述修复模板不含基因编辑蛋白的结合位点。在另一个实施方案中，所述修复模板编码由包含基因编辑蛋白的结合位点的DNA序列编码的氨基酸序列。
[0120] 其它实施方案涉及用于治疗患者的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的蛋白质或编码蛋白质的核酸。在一个实施方案中，所述患者导致患者的一种或多种症状减轻。某些实施方案涉及用于治疗患者的方法，其包括：a.从所述患者中移出细胞，b.通过用编码基因编辑蛋白的核酸转染所述细胞来诱导所述细胞以表达所述基因编辑蛋白，c.重编程所述细胞，和e.将所述细胞引入所述患者中。在一个实施方案中，将所述细胞重编程至较小分化状态。在另一个实施方案中，通过用编码一种或多种重编程蛋白的一种或多种合成RNA分子转染所述细胞来重编程所述细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是分化的。在另一个实施方案中，所述细胞分化成以下中的一种：皮肤细胞、葡萄糖反应性胰岛素产生细胞、造血细胞、心脏细胞、视网膜细胞、肾细胞、神经细胞、间质细胞、脂肪细胞、骨细胞、肌肉细胞、卵母细胞和精子细胞。其它实施方案涉及用于治疗患者的方法，其包括：a.从所述患者中移出造血细胞或干细胞，b.通过用编码基因编辑蛋白的核酸转染所述细胞来诱导所述细胞以表达所述基因编辑蛋白，和c.将所述细胞引入所述患者中。
[0121] 现在已发现，基本上由DMEM/F12、抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β组成或包含DMEM/F12、抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β的细胞培养基足以在体外维持多能干细胞，包括人类多能干细胞。因此，某些实施方案涉及基本上由以下组成或包含以下的细胞培养基：DMEM/F12、抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β。在一个实施方案中，抗坏血酸以约50μg/mL存在。在另一个实施方案中，胰岛素以约10μg/mL存在。在另一个实施方案中，转铁蛋白以约5.5μg/mL存在。在另一个实施方案中，亚硒酸钠以约6.7ng/mL存在。在另一个实施方案中，乙醇胺以约2μg/mL存在。在另一个实施方案中，碱性成纤维细胞生长因子以约20ng/mL存在。在另一个实施方案中，转化生长因子-β以约2ng/mL存在。在一个实施方案中，抗坏血酸是抗坏血酸-2-磷酸酯。在另一个实施方案中，转化生长因子-β是转化生长因子-β1或转化生长因子-β3。在一个实施方案中，使用细胞培养基来培养多能干细胞。在另一个实施方案中，所述多能干细胞是人类多能干细胞。在另一个实施方案中，在重编程期间或之后使用细胞培养基来培养细胞。在一个实施方案中，细胞培养基不含动物源组分。在另一个实施方案中，根据制造标准来制造细胞培养基。在另一个实施方案中，所述制造标准是GMP。在一个实施方案中，使所述细胞与细胞粘附分子接触。在另一个实施方案中，所述细胞粘附分子选自：纤维连接蛋白和玻连蛋白或其生物活性片段。在另一个实施方案中，使所述细胞与纤维连接蛋白和玻连蛋白接触。在另一个实施方案中，所述细胞粘附分子是重组的。
[0122] 在某些情形下，例如，当制造治疗剂时，用非动物源组分代替动物源组分可以是有利的，在某种程度上降低被病毒和/或其它动物源性病原体污染的风险。现在已发现，合成胆固醇，包括半合成植物源胆固醇，可以代替转染培养基中的动物源胆固醇，而不降低转染效率或增加转染相关毒性。因此，某些实施方案涉及含有合成或半合成胆固醇的转染培养基。在一个实施方案中，所述半合成胆固醇是植物源的。在另一个实施方案中，所述转染培养基不含动物源胆固醇。在另一个实施方案中，所述转染培养基是重编程培养基。其它实施方案涉及络合培养基。在一个实施方案中，所述络合培养基具有大于约7、或大于约7.2、或大于约7.4、或大于约7.6、或大于约7.8、或大于约8.0、或大于约8.2、或大于约8.4、或大于约8.6、或大于约8.8、或大于约9.0的pH。在另一个实施方案中，所述络合培养基包含转铁蛋白。在另一个实施方案中，所述络合培养基包含DMEM。在另一个实施方案中，所述络合培养基包含DMEM/F12。其它实施方案涉及用于形成核酸-转染试剂络合物的方法。在一个实施方案中，所述转染试剂与络合培养基一起温育。在另一个实施方案中，在混合步骤之前发生温育。在另一个实施方案中，温育步骤为约5秒至约5分钟或者约10秒至约2分钟或者约15秒至约1分钟或者约30秒至约45秒。在一个实施方案中，所述转染试剂选自表1。在另一个实施方案中，所述转染试剂是脂质或类脂质。在另一个实施方案中，所述转染试剂包含阳离子。在另一个实施方案中，所述阳离子是多价阳离子。在另一个实施方案中，所述转染试剂是N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油烯氧基]-苯甲酰胺(又称为MVL5)或其衍生物。
[0123] 某些实施方案涉及通过使细胞与核酸接触以诱导所述细胞以表达蛋白质的方法。在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是人类细胞或啮齿动物细胞。其它实施方案涉及使用一种或多种本发明的方法产生的细胞。在一个实施方案中，所述细胞存在于患者中。在另一个实施方案中，所述细胞是从患者中分离的。其它实施方案涉及包含使用一种或多种本发明的方法产生的细胞的筛选文库。在一个实施方案中，将所述筛选文库用于以下中的至少一种：毒性筛选，包括：心脏毒性筛选、神经毒性筛选和肝毒性筛选；功效筛选，高通量筛选；高内涵筛选和其它筛选。
[0124] 其它实施方案涉及含有核酸的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒含有递送试剂(又称为“转染试剂”)。在另一个实施方案中，所述试剂盒是重编程试剂盒。在另一个实施方案中，所述试剂盒是基因编辑试剂盒。其它实施方案涉及用于产生核酸的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒含有以下中的至少两种：假尿苷-三磷酸酯、5-甲基尿苷三磷酸酯、5-甲基胞苷三磷酸酯、5-羟基甲基胞苷三磷酸酯、N4-甲基胞苷三磷酸酯、N4-乙酰基胞苷三磷酸酯和7-脱氮鸟苷三磷酸酯或一种或多种其衍生物。其它实施方案涉及包含核酸的治疗剂。在一个实施方案中，所述治疗剂是药物组合物。在另一个实施方案中，所述药物组合物是配制的。在另一个实施方案中，所述制剂包含脂质体的水性混悬液。脂质体组分的实例阐述于表1中，并且是作为实例而非限制给出的。在一个实施方案中，所述脂质体包括一个或多个聚乙二醇(PEG)链。在另一个实施方案中，所述PEG是PEG2000。在另一个实施方案中，所述脂质体包括1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)或其衍生物。在一个实施方案中，所述治疗剂包含一种或多种配体。在另一个实施方案中，所述治疗剂包含以下中的至少一种：雄激素、CD30(TNFRSF8)、细胞穿透肽、CXCR、雌激素、表皮生长因子、EGFR、HER2、叶酸、胰岛素、胰岛素样生长因子-I、白介素-13、整合素、孕酮、基质衍生因子-1、凝血酶、维生素D和转铁蛋白或其生物活性片段或变体。其它实施方案涉及包含使用一种或多种本发明的方法产生的细胞的治疗剂。在一个实施方案中，将所述治疗剂施用至患者以治疗以下中的至少一种：1型糖尿病、心脏病包括缺血性和扩张性心肌病、黄斑变性、帕金森氏病、囊性纤维化、镰状细胞贫血、地中海贫血、范可尼贫血、重症联合免疫缺陷、遗传性感觉神经病、着色性干皮病、亨廷顿氏病、肌营养不良症、肌萎缩性侧索硬化、阿尔茨海默氏病、癌症和传染性疾病包括肝炎和HIV/AIDS。
[0125] 【表1.示例性生物相容性脂质】
[0126]
[0127] 某些实施方案涉及包含选自Cap 0、Cap 1、Cap 2和Cap 3的5'-帽结构的核酸或其衍生物。在一个实施方案中，所述核酸包含一个或多个UTR。在另一个实施方案中，所述一个或多个UTR增加核酸的稳定性。在另一个实施方案中，所述一个或多个UTR包含α-球蛋白或β-球蛋白5'-UTR。在另一个实施方案中，所述一个或多个UTR包含α-球蛋白或β-球蛋白3'-UTR。在另一个实施方案中，合成RNA分子包含α-球蛋白或β-球蛋白5'-UTR和α-球蛋白或β-球蛋白3'-UTR。在一个实施方案中，所述5'-UTR包含与Kozak一致序列基本上类似的Kozak序列。在另一个实施方案中，所述核酸包含3'-聚(A)尾。在另一个实施方案中，所述3'-聚(A)尾的长度为约20nt至约250nt或者约120nt至约150nt。在另一个实施方案中，所述3'-聚(A)尾的长度为约20nt、或约30nt、或约40nt、或约50nt、或约60nt、或约70nt、或约80nt、或约90nt、或约100nt、或约110nt、或约120nt、或约130nt、或约140nt、或约150nt、或约160nt、或约170nt、或约180nt、或约190nt、或约200nt、或约210nt、或约220nt、或约230nt、或约240nt、或约250nt。
[0128] 其它实施方案涉及用于重编程细胞的方法。在一个实施方案中，通过使细胞与一种或多种核酸接触来重编程细胞。在一个实施方案中，使细胞与编码以下中的至少一种的多个核酸接触：Oct4蛋白、Sox2蛋白、Klf4蛋白、c-Myc蛋白、Lin28蛋白或其生物活性片段、变体或衍生物。在另一个实施方案中，使细胞与编码包括以下的多个蛋白质的多个核酸接触：Oct4蛋白、Sox2蛋白、Klf4蛋白和c-Myc蛋白或其一种或多种生物活性片段、变体或衍生物。其它实施方案涉及用于基因编辑细胞的方法。在一个实施方案中，通过使细胞与一种或多种核酸接触来基因编辑所述细胞。
[0129] 通常使用动物模型来研究生物过程的作用。在某些情况下，例如，当研究人类疾病时，含有修饰基因组的动物模型可以是有利的，这在某种程度上是因为这种动物模型可更紧密地模仿人类疾病表型。某些实施方案因此涉及用于产生含有一种或多种基因修饰(又称为“突变”，又称为“基因编辑”)的生物体的方法。在一个实施方案中，所述一种或多种基因修饰是通过用一种或多种编码一种或多种基因编辑蛋白的核酸转染细胞而产生。在另一个实施方案中，所述一种或多种核酸包括合成RNA分子。在一个实施方案中，所述一种或多种基因编辑蛋白包括以下中的至少一种：锌指核酸酶、TALEN、规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白、核酸酶、大范围核酸酶和切口酶或其生物活性片段或变体。在一个实施方案中，所述细胞是多能细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是胚胎干细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是胚胎。在另一个实施方案中，所述细胞是以下的成员：动物细胞、植物细胞、酵母细胞和细菌细胞。在一个实施方案中，所述细胞是啮齿动物细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是人类细胞。在某些实施方案中，所述细胞是用编码一种或多种基因编辑蛋白的一种或多种核酸和编码一种或多种修复模板的一种或多种核酸转染的。在一个实施方案中，将所述细胞引入胚泡中。在另一个实施方案中，将所述细胞引入假孕雌性中。在另一个实施方案中，测定后代中基因修饰的存在或不存在。在另一个实施方案中，所述测定是通过直接测序。在一个实施方案中，所述生物体是家畜，例如，猪、牛等。在另一个实施方案中，所述生物体是宠物，例如，狗、猫、鱼等。
[0130] 在某些情况下，例如，当通过添加核酸序列来修饰目标细胞的基因组时，将所述核酸序列插入安全港位置可以是有利的，以部分地降低与随机插入相关的风险。因此，某些实施方案涉及用于将核酸序列插入安全港位置中的方法。在一个实施方案中，所述细胞是人类细胞并且所述安全港位置是AAVS1基因座。在另一个实施方案中，所述细胞是啮齿动物细胞并且所述安全港位置是Rosa26基因座。在一个实施方案中，使所述细胞与编码一种或多种修复模板的一种或多种核酸进一步接触。其它实施方案涉及用于改变细胞的DNA序列的试剂盒。在一个实施方案中，所述细胞是人类细胞，并且所述目标DNA分子包含编码AAVS1基因座的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述细胞是啮齿动物细胞，并且所述目标DNA分子包含编码Rosa26基因座的核苷酸序列。其它实施方案涉及用于通过使细胞与编码一种或多种基因编辑蛋白的一种或多种核酸和编码一种或多种修复模板的一种或多种核酸接触来产生报告细胞的方法。在一个实施方案中，所述一种或多种修复模板包含DNA。在另一个实施方案中，所述一种或多种修复模板编码一种或多种荧光蛋白。在另一个实施方案中，所述一种或多种修复模板编码基因的启动子区域的至少一部分。
[0131] 在某些情况下，例如，当产生基因编辑细胞文库时，增大基因编辑效率可以是有利的，以部分地降低细胞表征的成本。现在已发现，可通过反复地使细胞与编码一种或多种基因编辑蛋白的合成RNA接触来增大基因编辑效率。因此，某些实施方案涉及通过反复地使细胞与编码一种或多种基因编辑蛋白的一种或多种核酸接触来基因编辑细胞的方法。在一个实施方案中，在连续五天内使所述细胞接触至少两次。在另一个实施方案中，以约24小时至约48小时的时间间隔使细胞接触两次。
[0132] 在癌症中，恶性细胞的存活和增殖可能部分是由于患者中一般不存在的特定基因异常的存在。现在已发现，基因编辑蛋白可用于靶向存活和增殖相关途径，并且当以这种方式使用时，基因编辑蛋白和编码基因编辑蛋白的核酸可以构成有效的抗癌治疗剂。因此，某些实施方案涉及抗癌治疗剂。在一个实施方案中，所述治疗剂是抑制细胞的存活和/或预防、减缓或以其它方式限制细胞的增殖的治疗组合物。在另一个实施方案中，所述细胞是癌细胞。在另一个实施方案中，所述治疗剂包含一种或多种基因编辑蛋白或者编码一种或多种基因编辑蛋白的核酸。在另一个实施方案中，所述一个或多个基因编辑蛋白靶向一个或多个促进细胞的存活和/或增殖的序列。这些序列包括(但不限于)：细胞凋亡相关基因，包括细胞凋亡抑制剂(IAP)家族的基因(参见例如表2和美国临时申请No.61/721,302的表2，所述文献的内容特此以引用的方式并入)，例如BIRC5；与端粒维持相关的序列，例如基因端粒酶反转录酶(TERT)和端粒酶RNA组分(TERC)；影响血管生成的序列，例如基因VEGF，和其它癌症相关基因，包括：BRAF、BRCA1、BRCA2、CDKN2A、CTNNB1、EGFR、MYC家族、RAS家族、PIK3CA、PIK3R1、PKN3、TP53、PTEN、RET、SMAD4、KIT、MET、APC、RB1、VEGF家族、TNF，和核糖核苷酸还原酶家族的基因。BIRC5的基因编辑蛋白目标序列的实例阐述于表3中和美国临时申请No.61/721,302的表3中，所述文献的内容特此以引用的方式并入，并且是作为实例而非作为限制给出。在一个实施方案中，一种或多种序列中的至少一种存在于恶性和非恶性细胞中。在另一个实施方案中，一种或多种序列中的至少一种富集于恶性细胞中。在另一个实施方案中，一种或多种序列中的至少一种富集于非恶性细胞中。在一个实施方案中，所述治疗组合物进一步包含编码一个或多个修复模板的核酸。在另一个实施方案中，所述一种或多种基因编辑蛋白诱导所述细胞以表达非活性或显性负性形式的蛋白质。在另一个实施方案中，所述蛋白质是IAP家族成员。在另一个实施方案中，所述蛋白质是存活素。
[0133] 【表2.示例性细胞凋亡抑制剂(IAP)基因】
[0134]名称 长度/aa BIR结构域 CARD结构域 RING结构域
BIRC1(神经元细胞凋亡抑制蛋白) 1,403 3 N N
BIRC2(c-IAP1蛋白) 604 3 Y Y
BIRC3(c-IAP2蛋白) 618 3 Y Y
BIRC4(X连锁IAP) 497 3 N Y
BIRC5(存活素蛋白) 142 1 N N
BIRC6(BRUCE/apollon蛋白) 4845 1 N N
BIRC7(livin蛋白) 298 1 N Y
ILP2(BIRC4的组织特异性同源物) 236 1 N Y
BIRC1(神经元细胞凋亡抑制蛋白) 1,403 3 N N
BIRC2(c-IAP1蛋白) 604 3 Y Y
BIRC3(c-IAP2蛋白) 618 3 Y Y
BIRC4(X连锁IAP) 497 3 N Y
BIRC5(存活素蛋白) 142 1 N N
BIRC6(BRUCE/apollon蛋白) 4845 1 N N
BIRC7(livin蛋白) 298 1 N Y
ILP2(BIRC4的组织特异性同源物) 236 1 N Y
[0135] 【表3.BIRC5的示例性基因编辑蛋白目标序列】
[0136]
[0137] 其它实施方案涉及用于治疗癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的基因编辑蛋白或编码一种或多种基因编辑蛋白的核酸。在一个实施方案中，所述治疗导致所述患者中的癌细胞生长降低或停止。在另一个实施方案中，所述治疗导致癌症进程延迟或癌症缓解。在一个实施方案中，所述目标DNA分子包含BIRC5基因。在另一个实施方案中，所述目标DNA分子包含选自以下的序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。在另一个实施方案中，多个相邻的结合位点与表3、表4、美国临时申请No.61/721,302(其内容特此以引用的方式并入)的表3、美国临时申请No.61/785,404(其内容特此以引用的方式并入)的表1或美国临时申请No.61/842,874(其内容特此以引用的方式并入)的表1中所列的一种或多种序列具有至少约50％或至少约60％或至少约70％或至少约80％或至少约90％或至少约95％或至少约98％或至少约99％同源性。在某些情况下，具有截短N端结构域的基因编辑蛋白可用于消除结合位点序列上的第一碱基T限制。在一些实施方案中，所述癌症是神经胶质瘤。在一个实施方案中，所述患者先前已进行手术和/或放射疗法和/或同时进行手术和/或放射疗法。在另一个实施方案中，所述施用是通过以下中的一种或多种：鞘内注射、颅内注射、静脉内注射、灌注、皮下注射、腹膜内注射、门静脉内注射和局部递送。
[0138] 【表4.示例性BIRC5结合位点】
[0139]
[0140]
[0141]
[0142] 某些实施方案涉及用于治疗癌症的方法，其包括：a.从患者中移出含有一个或多个癌细胞的活检组织，b.测定所述一个或多个癌细胞中的癌症相关基因标志物的序列，和c.向所述患者施用治疗有效量的基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸，其中目标DNA分子的序列与所述癌症相关基因标志物的序列具有至少约50％或约60％或约70％或约80％或约90％或约95％或约98％或约99％同源性。在一个实施方案中，所述方法进一步包括比较所述一个或多个癌细胞中的一种或多种癌症相关基因标志物的序列与一个或多个非癌性细胞中的相同癌症相关基因标志物的序列，选择所述一个或多个癌细胞和所述一个或多个非癌性细胞中具有不同序列的癌症相关基因标志物，并且其中目标DNA分子或结合位点的序列与所选癌症相关基因标志物的序列具有至少约50％或约60％或约70％或约
80％或约90％或约95％或约98％或约99％同源性。
80％或约90％或约95％或约98％或约99％同源性。
[0143] 许多癌细胞表达存活素，它是细胞凋亡抑制剂(IAP)蛋白质家族的成员，在人类中被BIRC5基因编码。使用RNA干扰来降低某些mRNA分子(包括存活素mRNA)的表达，可以短暂抑制某些癌细胞的生长。然而，使用RNA干扰来降低存活素mRNA的表达的先前方法得到暂时效果，并且仅导致动物模型中平均死亡时间(TTD)的短暂增加。现在已发现，诱导细胞以表达靶向BIRC5基因的一种或多种基因编辑蛋白可以导致BIRC5基因的破坏，可以诱导细胞以表达和/或分泌存活素蛋白的非功能变体，可以诱导细胞以表达和/或分泌存活素蛋白的显性负性变体，可以触发细胞和附近细胞中的一种或多种细胞凋亡途径的活化，可以减缓或停止细胞和附近细胞的生长，可以导致细胞和附近细胞的死亡，可以抑制癌症的进展，并且可以导致癌症患者的缓解。因此，某些实施方案涉及靶向BIRC5基因的基因编辑蛋白。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白结合至BIRC5基因中的一个或多个区域。在另一个实施方案中，所述基因编辑蛋白结合至选自以下的序列的一个或多个区域：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。在另一个实施方案中，所述基因编辑蛋白结合至选自以下的一个或多个序列：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。在另一个实施方案中，所述基因编辑蛋白结合至编码SEQ ID NO:34的一个或多个核酸序列或其生物活性片段、变体或类似物。在另一个实施方案中，所述基因编辑蛋白结合至选自以下的一种或多种序列：表3、表4、美国临时申请No.61/721,302(其内容特此以引用的方式并入)的表3、美国临时申请No.61/785,404(其内容特此以引用的方式并入)的表1或美国临时申请No.61/842,874(其内容特此以引用的方式并入)的表1，或者结合至与选自表3、表4、美国临时申请No.61/721,302(其内容特此以引用的方式并入)的表3、美国临时申请No.61/785,404(其内容特此以引用的方式并入)的表1或美国临时申请No.61/842,874(其内容特此以引用的方式并入)的表1的一种或多种序列具有至少约50％或至少约60％或至少约70％或至少约80％或至少约90％或至少约95％或至少约98％或约99％同源性的一种或多种序列。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白在所述细胞的DNA中产生一个或多个切口或双链断裂。在另一个实施方案中，在BIRC5基因中产生一个或多个切口或双链断裂。在另一个实施方案中，在BIRC5基因的一个或多个外显子中产生一个或多个切口或双链断裂。在另一个实施方案中，在选自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的序列中产生一个或多个切口或双链断裂。在另一个实施方案中，在编码细胞凋亡抑制剂结构域(又称为“IAP”、“IAP结构域”、“IAP重复序列”、“细胞凋亡蛋白质重复序列的杆状病毒抑制剂”、“BIR”等)的序列内产生一个或多个切口或双链断裂。在另一个实施方案中，所述基因编辑蛋白结合至选自以下的一种或多种序列：表5、美国临时申请No.61/785,404(其内容特此以引用的方式并入)的表2或美国临时申请No.61/842,874(其内容特此以引用的方式并入)的表2，或者结合至与选自表5、美国临时申请No.61/785,404(其内容特此以引用的方式并入)的表2或美国临时申请No.61/842,874(其内容特此以引用的方式并入)的表2的一种或多种序列具有至少约50％或至少约60％或至少约70％或至少约80％或至少约90％或至少约95％或至少约98％同源性的一种或多种序列。在又一个实施方案中，所述基因编辑蛋白结合至编码选自以下的一种或多种基因的序列：表2、表5、表6、表7、美国临时申请No.61/721,302(其内容特此以引用的方式并入)的表4、美国临时申请No.61/785,404(其内容特此以引用的方式并入)的表2或美国临时申请No.61/842,874(其内容特此以引用的方式并入)的表2。
[0144] 【表5.示例性癌症相关基因结合位点】
[0145]
[0146]
[0147]
[0148]
[0149]
[0150] 在一些实施方案中，所述目标DNA分子包含在癌症中过度表达的基因。在癌症中过度表达的基因的实例包括(但不限于)：ABL1、BIRC5、BLK、BTK、CDK家族成员、EGFR、ERBB2、FAS、FGR、FLT4、FRK、FYN、HCK、HIF1A、HRAS、HSP90AA1、HSP90AA1、HSPA4、KDR、KIF11、KIF11、KIF20A、KIF21A、KIF25、KIT、KRAS、LCK、LYN、MAPK1、MET、MYC、MYH1、MYO1G、NRAS、NTRK1、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PKN3、PLK1、RAF1、RB1、RET、RRM1、RRM2、SRC、TNF、TPM2、TYRO3、VEGFA、VEGFB、VEGFC、YES1和ZAP70。在一些实施方案中，所述目标DNA分子包含选自以下的基因：ABL1、BIRC5、BLK、BTK、CDK家族成员、EGFR、ERBB2、FAS、FGR、FLT4、FRK、FYN、HCK、HIF1A、HRAS、HSP90AA1、HSP90AA1、HSPA4、KDR、KIF11、KIF11、KIF20A、KIF21A、KIF25、KIT、KRAS、LCK、LYN、MAPK1、MET、MYC、MYH1、MYO1G、NRAS、NTRK1、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PKN3、PLK1、RAF1、RB1、RET、RRM1、RRM2、SRC、TNF、TPM2、TYRO3、VEGFA、VEGFB、VEGFC、YES1和ZAP70或其片段或变体。在其它实施方案中，所述目标DNA分子包含在癌症中突变的基因。在癌症中突变的基因的实例包括(但不限于)：AIM1、APC、BRCA1、BRCA2、CDKN1B、CDKN2A、FAS、FZD家族成员、HNF1A、HOPX、KLF6、MEN1、MLH1、NTRK1、PTEN、RARRES1、RB1、SDHB、SDHD、SFRP1、ST家族成员、TNF、TP53、TP63、TP73、VBP1、VHL、WNT家族成员、BRAF、CTNNB1、PIK3CA、PIK3R1、SMAD4和YPEL3。在一些实施方案中，所述目标DNA分子包含选自以下的基因：AIM1、APC、BRCA1、BRCA2、CDKN1B、CDKN2A、FAS、FZD家族成员、HNF1A、HOPX、KLF6、MEN1、MLH1、NTRK1、PTEN、RARRES1、RB1、SDHB、SDHD、SFRP1、ST家族成员、TNF、TP53、TP63、TP73、VBP1、VHL、WNT家族成员、BRAF、CTNNB1、PIK3CA、PIK3R1、SMAD4和YPEL3或其片段或变体。在一个实施方案中，所述方法进一步包括向患者施用治疗有效量的修复模板。
[0151] 某些基因的突变可增加细胞变成癌性的可能性。然而，在某些情况下，将非癌性细胞中的癌症相关基因灭活可能是有害的，例如，如果癌症相关基因的非突变形式有利的话。现在已发现，基因编辑蛋白可用于特定地灭活部分或完全突变形式的基因。癌症相关突变的实例包括(但不限于)：ALK(F1174、R1275)、APC(R876、Q1378、R1450)、BRAF(V600)、CDKN2A(R58、R80、H83、D84、E88、D108G、W110、P114)、CTNNB1(D32、S33、G34、S37、T41,或S45)、EGFR(G719、T790、L858)、EZH2(Y646)、FGFR3(S249、Y373)、FLT3(D835)、GNAS(R201)、HRAS(G12、G13、Q61)、IDH1(R132)、JAK2(V617)、KIT(D816)、KRAS(G12、G13)、NRAS(G12、G13、Q61)、PDGFRA(D842)、PIK3CA(E542、E545、H1047)、PTEN(R130)和TP53(R175、H179、G245、R248、R249、R273、W282)。因此，某些实施方案涉及结合至疾病相关突变的基因编辑蛋白。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白结合至含有特定突变的DNA，其相比于不含突变的DNA具有更大亲和力。在另一个实施方案中，所述疾病是癌症。
[0152] 神经退化性疾病，包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和路易体痴呆症，特征在于中枢和/或外周神经系统的功能逐渐丧失和/或细胞死亡。疾病进展可伴随着可包含蛋白质α-突触核蛋白(在人类中被SNCA基因编码)的富蛋白质斑块的积聚。因而，研究人员已经试图开发可以分解这些斑块的治疗剂，其例如通过结合至斑块并将其标记以通过免疫系统破坏的抗体。然而，在许多情况下，分解斑块对于患者的疾病症状或进程具有很小影响或无影响。现在已发现，靶向神经退化性疾病相关斑块的现有疗法的失败在某种程度上是由于神经系统不能修复在斑块形成早期阶段发生的细胞损伤。已进一步发现，诱导细胞以表达靶向SNCA基因的一种或多种基因编辑蛋白可以导致SNCA基因的破坏，可以诱导细胞以表达α-突触核蛋白的斑块抗性变体，可以减缓或停止神经退化性疾病相关斑块的生长，可以保护细胞和附近细胞免于神经退化性疾病相关斑块的破坏作用，可以减缓和/或停止包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和路易体痴呆症的神经退化性疾病的进程，并且可以导致具有神经退化性疾病(包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和路易体痴呆症)的患者中的症状减少和/或功能获得。其它神经退化性疾病包括例如视力减退包括失明、听力减退包括耳聋、平衡失调、味觉和/或嗅觉丧失，和其它感官障碍。因此，某些实施方案涉及靶向SNCA基因的基因编辑蛋白。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白结合至SNCA基因中的一个或多个区域。在另一个实施方案中，所述基因编辑蛋白结合至编码SEQ ID NO:51的一种或多种核酸序列或其生物活性片段、变体或类似物。其它实施方案涉及用于治疗神经退化性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸，其中所述基因编辑蛋白能够结合至编码形成疾病相关斑块的蛋白质的核苷酸序列，并且导致患者中疾病相关斑块的减少和/或疾病进程的延迟或停止。在一个实施方案中，所述核苷酸序列包含SNCA基因。在另一个实施方案中，所述核苷酸序列编码α-突触核蛋白。在另一个实施方案中，所述神经退化性疾病选自：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和痴呆症。
[0153] 某些实施方案涉及用于鉴定致病毒物的方法，其包括用基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸转染细胞以改变所述细胞的DNA序列，其中改变的DNA序列赋予疾病易感性，使所述细胞与疑似致病毒物接触，和评估所述细胞展现与所述疾病相关的表型的程度。在一个实施方案中，所述疾病是神经退化性疾病、自身免疫疾病、呼吸道疾病、生殖障碍或癌症。其它实施方案涉及用于评估治疗物质的安全性的方法，其包括用基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸转染细胞以改变所述细胞的DNA序列，其中改变的DNA序列赋予对所述治疗物质的一种或多种毒性作用的易感性，使所述细胞与所述治疗物质接触，和测量所述治疗物质对所述细胞的一种或多种毒性作用。其它实施方案涉及用于评估治疗物质的有效性的方法，其包括用基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸转染活细胞以改变所述细胞的DNA序列，其中所述改变的DNA序列造成所述细胞展现一种或多种疾病相关表型，使所述细胞与所述治疗物质接触，和测量所述一种或多种疾病相关表型降低的程度。
[0154] 在一些实施方案中，所述患者被诊断患有蛋白病。蛋白病和蛋白病相关基因的实例给出于表6中，并且是作为实例而非作为限制包括。在一个实施方案中，所述蛋白病选自：AA(继发性)淀粉样变性、亚历山大病(Alexander disease)、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化、主动脉中膜淀粉样变性、ApoAI淀粉样变性、ApoAII淀粉样变性、ApoAIV淀粉样变性、纤维蛋白原淀粉样变性、心脏心房淀粉样变性、伴有皮质下梗死和白质脑病的脑常染色体显性动脉病、脑β淀粉样血管病、透析淀粉样变性、家族性淀粉样心肌病、家族性淀粉样多神经病、家族性淀粉样变性(芬兰型)、家族性英国痴呆症、家族性丹麦痴呆症、额颞叶变性、遗传性脑淀粉样血管病、遗传性网格状角膜营养不良、亨廷顿氏病、包涵体肌炎/肌病、溶菌酶淀粉样变性、甲状腺髓样癌、牙源性(Pindborg)淀粉样肿瘤、帕金森氏病、垂体泌乳素瘤、朊病毒病、肺泡蛋白沉积症、青光眼中的视网膜神经节细胞变性、伴有视紫红质突变的色素性视网膜炎、老年性系统性淀粉样变性、丝氨酸病变(serpinopathies)、突触核蛋白病、Tau蛋白病、II型糖尿病、拳击员痴呆症(慢性创伤性脑病)、额颞叶痴呆症、额颞叶变性、神经节细胞瘤、神经节神经胶质瘤、哈勒沃登-斯帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、铅性脑病、脂褐质沉积症、Lytico-Bodig病、脑膜血管瘤病、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、缠结主导型痴呆症和结节性硬化症。在另一个实施方案中，所述目标DNA分子包含选自以下的基因：APOA1、APOA2、APOA4、APP、B2M、CALCA、CST3、FGA、FGB、FGG、FUS、GFAP、GSN、HTT、IAPP、ITM2B、LYZ、MAPT、MFGE8、NOTCH3、NPPA、ODAM、PRL、PRNP、RHO、SAA家族成员、SERPIN家族成员、SFTPC、SNCA、SOD家族成员、TARDBP、TGFBI和TRR或其片段或变体。在另一个实施方案中，所述目标DNA分子编码选自表6的基因或其片段，并且所述患者被诊断患有表6中所列的相应疾病。
[0155] 【表6.示例性蛋白病和蛋白病相关基因】
[0156]
[0157] Tau蛋白病的实例包括(但不限于)阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病。Tau蛋白病的其它实例包括：拳击员痴呆症(慢性创伤性脑病)、额颞叶痴呆症、额颞叶变性、神经节细胞瘤、神经节神经胶质瘤、哈勒沃登-斯帕茨病、铅性脑病、脂褐质沉积症、Lytico-Bodig病、脑膜血管瘤病、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、缠结主导型痴呆症和结节性硬化症。在一些实施方案中，所述患者被诊断患有Tau蛋白病。在一个实施方案中，所述Tau蛋白病选自：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病。在另一个实施方案中，所述Tau蛋白病选自：拳击员痴呆症(慢性创伤性脑病)、额颞叶痴呆症、额颞叶变性、神经节细胞瘤、神经节神经胶质瘤、哈勒沃登-斯帕茨病、铅性脑病、脂褐质沉积症、Lytico-Bodig病、脑膜血管瘤病、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、缠结主导型痴呆症和结节性硬化症。
[0158] 自身免疫疾病，包括(但不限于)狼疮、多发性硬化症(MS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和移植排斥，特征在于部分地由攻击未感染和非癌性等基因细胞和/或组织的免疫系统中的一种或多种要素造成的症状。因此，某些实施方案涉及用于治疗自身免疫疾病的方法。在一个实施方案中，所述自身免疫疾病选自：狼疮、多发性硬化症(MS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和移植排斥。在另一个实施方案中，所述目标DNA分子编码可被宿主免疫系统识别的多肽序列。
[0159] 传染因子可含有宿主生物体中不存在的核酸序列。现在已发现，基因编辑蛋白可用于消除、降低或以其它方式完全或部分改变传染因子和/或感染作用，并且当以这种方式使用时，基因编辑蛋白和编码基因编辑蛋白的核酸可构成有效的抗感染治疗剂。可以这种方式治疗的传染因子包括(但不限于)：病毒、细菌、真菌、酵母和寄生虫。因此，某些实施方案涉及用于诱导细胞以表达靶向一种或多种传染因子相关序列的基因编辑蛋白的方法。在一个实施方案中，所述细胞是以下中的一种：细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞和寄生虫细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是人类细胞。其它实施方案涉及治疗组合物，其包含编码靶向一种或多种传染因子相关序列的一种或多种基因编辑蛋白的核酸。某些实施方案涉及用于诱导细胞以表达靶向一种或多种与感染易感性或抗性相关的序列的基因编辑蛋白的方法。其它实施方案涉及治疗组合物，其包含编码靶向一种或多种与感染易感性或抗性相关的序列的一种或多种基因编辑蛋白的核酸。在一个实施方案中，用编码一种或多种基因编辑蛋白的核酸和编码一种或多种修复模板的核酸转染细胞。在另一个实施方案中，所述修复模板含有抗性基因或其生物活性片段或变体。在另一个实施方案中，所述修复模板含有RNAi序列。在另一个实施方案中，所述RNAi序列是shRNA。其它实施方案涉及用于治疗传染性疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸，其中所述基因编辑蛋白能够结合至传染因子中存在的一种或多种核苷酸序列。
[0160] 现在已发现，可通过改变DNA修复途径的一种或多种组分的表达和/或功能来改变非同源末端接合事件与同源重组事件的比率。编码DNA修复途径的组分的基因的非限制性实例包括(但不限于)：Artemis、BLM、CtIP、DNA-PK、DNA-PKcs、EXOl、FEN1、Ku70、Ku86、LIGIII、LIGIV、MRE11、NBS1、PARP1、RAD50、RAD54B、XLF、XRCC1、XRCC3和XRCC4。因此，某些实施方案涉及用于改变DNA修复途径的一种或多种组分的表达和/或功能的方法。在某些实施方案中，所述表达和/或功能增加。在其它实施方案中，所述表达和/或功能降低。DNA依赖性蛋白质激酶(DNA-PK)是非同源末端接合DNA修复途径的组分。现在已发现，可通过改变DNA-PK的表达来增加经由同源重组的修复。在一个实施方案中，使细胞与DNA-PK抑制剂接触。DNA-PK抑制剂的实例包括(但不限于)：化合物401(2-(4-吗啉基)-4H-嘧啶并[2,1-a]异喹啉-4-酮)、DMNB、IC87361、LY294002、NU7026、NU7441、OK-1035、PI 103盐酸盐、香草醛和渥曼青霉素。
[0161] 基因突变可影响蛋白质产物的长度，例如，通过引入终止密码子和/或破坏开放阅读框。某些疾病，包括杜兴氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy)，可由截短和/或移码蛋白的产生造成。现在已发现，基因编辑蛋白可用于治疗与一种或多种截短和/或移码蛋白的产生相关的疾病。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白在约1kb或约0.5kb或约0.1kb的含有促进疾病的突变的外显子内产生双链断裂。在另一个实施方案中，所述基因编辑蛋白与包含一种或多种野生型序列的DNA序列共同表达。在某些实施方案中，所述DNA是单链的。在其它实施方案中，所述DNA是双链的。由截短蛋白质的表达造成的疾病可通过外显子跳跃来治疗。现在已发现，基因编辑蛋白可用于诱导外显子跳跃。在一个实施方案中，所述基因编辑蛋白在约1kb或约0.5kb或约0.1kb的待跳跃的外显子内产生双链断裂。在另一个实施方案中，所述基因编辑蛋白在待跳跃的外显子上游的约1kb或约0.5kb或约0.1kb的内含子内产生双链断裂。在另一个实施方案中，所述基因编辑蛋白在待跳跃的外显子上游的约1kb或约0.5kb或约0.1kb的内含子的剪接受体位点内产生双链断裂。
[0162] 核酸，包括含有核酸的脂质体制剂，当在体内递送时，可能积聚在肝脏和/或脾脏中。现在已发现，编辑基因编辑蛋白的核酸可以调节肝脏和脾脏中的基因表达，并且以这种方式使用的核酸可以构成用于治疗肝脏和脾脏疾病的有效治疗剂。因此，某些实施方案涉及用于治疗肝脏和/或脾脏疾病的方法，其通过向患者递送编码一种或多种基因编辑蛋白的核酸。其它实施方案涉及治疗组合物，其包含编码一种或多种基因编辑蛋白的核酸，以用于治疗肝脏和/或脾脏疾病。可治疗的肝脏和/或脾脏的疾病和病状包括(但不限于)：肝炎、酒精诱发性肝病、药物诱发性肝病、爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr virus)感染、腺病毒感染、巨细胞病毒感染、弓形体病、落基山斑疹热(Rocky Mountain spotted fever)、非酒精性脂肪肝病、血色素沉着症、威尔逊氏病(Wilson's Disease)、吉尔伯特氏病(Gilbert's Disease)和肝脏和/或脾脏癌症。可使用本发明的方法由基因编辑蛋白靶向的序列(包括基因、基因家族和基因座)的其它实例阐述于表7中，并且是作为实例而非作为限制给出。
[0163] 【表7.示例性基因编辑蛋白靶标】
[0164]
[0165] 某些实施方案涉及组合疗法，其包含一种或多种本发明的治疗组合物和一种或多种辅助疗法。辅助疗法的实例阐述于表8和美国临时申请No.61/721,302(其内容特此以引用的方式并入)的表5中，并且是作为举例而非作为限制给出。
[0166] 【表8.示例性辅助疗法】
[0167]
[0168] 药物制剂可另外包含递送试剂(又称为“转染试剂”)和/或赋形剂。药物学上可接受的递送试剂、赋形剂，和其制备和使用方法，包括用于制备药物制剂和向患者(又称为“受试者”)施用药物制剂的方法，是本领域中众所周知的，并且阐述于众多出版物中，包括例如美国专利申请公开No.US 2008/0213377中，所述文献的全部内容特此以引用的方式并入。
[0169] 例如，本发明的组合物可以呈药物学上可接受的盐形式。这些盐包括例如 J.Pharma.Sci.66,2-19(1977) 和 The Handbook of Pharmaceutical Salts；
Properties,Selection,and Use.P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编),Verlag,Zurich(Switzerland)2002中所列出的那些，所述文献特此以全文引用的方式并入。药物学上可接受的盐的非限制性实例包括：硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、双羟萘酸盐、苯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、氯苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻乙酰氧基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐、异丁酸盐、苯基丁酸盐、α-羟基丁酸盐、丁炔-1,4-二甲酸盐、己炔-1,4-二甲酸盐、癸酸盐、辛酸盐、肉桂酸盐、乙醇酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、苹果酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、癸二酸盐、辛二酸盐、对溴苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、乙基磺酸盐、2-羟基乙基磺酸盐、甲基磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、萘-1,5-磺酸盐、二甲苯磺酸盐、酒石酸盐、碱金属例如钠、钾和锂的氢氧化物；碱土金属例如钙和镁的氢氧化物；其它金属例如铝和锌的氢氧化物；氨，和有机胺，例如未被取代或被羟基取代的单烷基胺、二烷基胺或三烷基胺、二环己基胺；三丁基胺；吡啶；N-甲基,N-乙基胺；二乙胺；三乙胺；单-(2-OH-低级烷基胺)、双-(2-OH-低级烷基胺)或三-(2-OH-低级烷基胺)，例如单-(2-羟基乙基)胺、双-(2-羟基乙基)胺或三-(2-羟基乙基)胺、2-羟基-叔丁基胺、或三-(羟基甲基)甲基胺、N,N-二-低级烷基-N-(羟基-低级烷基)-胺，例如N,N-二甲基-N-(2-羟基乙基)胺或三-(2-羟基乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；和氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸等。
Properties,Selection,and Use.P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编),Verlag,Zurich(Switzerland)2002中所列出的那些，所述文献特此以全文引用的方式并入。药物学上可接受的盐的非限制性实例包括：硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、双羟萘酸盐、苯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、氯苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻乙酰氧基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐、异丁酸盐、苯基丁酸盐、α-羟基丁酸盐、丁炔-1,4-二甲酸盐、己炔-1,4-二甲酸盐、癸酸盐、辛酸盐、肉桂酸盐、乙醇酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、苹果酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、癸二酸盐、辛二酸盐、对溴苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、乙基磺酸盐、2-羟基乙基磺酸盐、甲基磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、萘-1,5-磺酸盐、二甲苯磺酸盐、酒石酸盐、碱金属例如钠、钾和锂的氢氧化物；碱土金属例如钙和镁的氢氧化物；其它金属例如铝和锌的氢氧化物；氨，和有机胺，例如未被取代或被羟基取代的单烷基胺、二烷基胺或三烷基胺、二环己基胺；三丁基胺；吡啶；N-甲基,N-乙基胺；二乙胺；三乙胺；单-(2-OH-低级烷基胺)、双-(2-OH-低级烷基胺)或三-(2-OH-低级烷基胺)，例如单-(2-羟基乙基)胺、双-(2-羟基乙基)胺或三-(2-羟基乙基)胺、2-羟基-叔丁基胺、或三-(羟基甲基)甲基胺、N,N-二-低级烷基-N-(羟基-低级烷基)-胺，例如N,N-二甲基-N-(2-羟基乙基)胺或三-(2-羟基乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；和氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸等。
[0170] 本发明的药物组合物可包含赋形剂，包括液体例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。所述药物赋形剂可以是例如盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。另外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，当施用至受试者时，药物学上可接受的赋形剂是无菌的。合适的药物赋形剂也包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要的话，本文所述的任何试剂还可包含微量的润湿或乳化剂，或pH缓冲剂。
[0171] 在多种实施方案中，本文所述的组合物可以例如约1mg/kg至约100mg/kg、约2.5mg/kg至约50mg/kg、或约5mg/kg至约25mg/kg的有效剂量施用。精确确定有效剂量时将要考虑的可能是基于每个患者个别的因素，包括其体型、年龄和疾病类型。本领域的普通技术人员根据本公开内容和本领域中的知识可以容易地确定剂量。例如，可用参考文献Physicians'Desk Reference,第66版,PDR Network；2012版(2011年12月27日)测定剂量，所述文献的内容以全文引用的方式并入。
[0172] 本发明的活性组合物可包括经典的药物制剂。根据本发明的这些组合物的施用可能是经由任何常见的途径，只要目标组织可经由所述途径获得即可。这包括经口、经鼻或经颊。可选地，施用可能是通过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射，或通过直接注射至癌症组织中。本文所公开的试剂也可通过导管系统施用。此类组合物通常将以如本文所述的药物学上可接受的组合物形式施用。
[0173] 在配制后，可以与剂量制剂相容的方式并以治疗上有效的量施用溶液。所述制剂可容易以多种剂型施用，例如注射溶液、药物释放胶囊等。对于以水溶液形式进行肠胃外施用，例如，溶液一般被适当缓冲并且首先用例如足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些水溶液可用于例如静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。优选地，按照本领域的技术人员所知，特别是鉴于本公开内容来使用无菌水性介质。
[0174] 示例性受试者或患者是指任何脊椎动物，包括(但不限于)人类和其它灵长类动物(例如，黑猩猩和其它猿类和猴物种)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如，狗和猫)、实验动物(例如，啮齿动物例如小鼠、大鼠和豚鼠)，和鸟类(例如，家养、野生和游戏鸟类例如鸡、火鸡和其它鹑鸡类、鸭、鹅等)。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是人类。
[0175] 通过以下非限制性实施例来进一步说明本发明。
[0176] 【实施例】
[0177] 【实施例1RNA合成】
[0178] 根据制造商的说明和本发明人先前公开的发明(美国申请No.13/465,490(现为美国专利No.8,497,124)、美国临时申请No.61/637,570、美国临时申请No.61/664,494、国际申请No.PCT/US12/67966、美国临时申请No.61/785,404、美国申请No.13/931,251和美国临时申请No.61/842,874，其全部的内容特此以全文引用的方式并入)，使用具有mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶的T7高产率RNA合成试剂盒和牛痘病毒加帽系统试剂盒(都来自New England Biolabs,Inc.)，从DNA模板合成编码人类蛋白Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc-2(T58A)和Lin28的RNA或靶向人类基因XPA、CCR5、TERT、MYC和BIRC5并包含标准和非标准核苷酸的各种组合的TALEN(表9、图1A、图1B和图15)。然后用不含核酸酶的水将RNA稀释到100ng/μL至200ng/μL。对于某些实验，以1μL/100μg RNA的浓度加入RNA酶抑制剂(Superase·In，Life Technologies Corporation)。将RNA溶液储存在4℃。对于重编程实验，以3:1:1:1:1的摩尔比混合编码Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc-2(T58A)和Lin28的RNA。
[0179] 【表9.RNA合成】
[0180]
[0181]
[0182]
[0183]
[0184] 【实施例2用合成RNA转染细胞】
[0185] 对于在6孔板中转染，首先将2μg RNA和6μL转染试剂(LipofectamineRNAiMAX，Life Technologies Corporation)在络合培养基(Opti-MEM，Life Technologies Corporation或DMEM/F12+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+2μg/mL乙醇胺)中单独稀释至各自60μL的总体积。然后根据转染试剂制造商的说明，混合稀释的RNA和转染试剂并在室温下温育15分钟。然后将络合物加入培养中的细胞中。向每个孔已含有2mL转染培养基的6孔板的每个孔中加入30μL至240μL的络合物。将板轻轻摇动以使络合物分配在整个孔中。将细胞与络合物一起温育4小时至过夜，随后用新鲜的转染培养基(2mL/孔)更换培养基。按比例扩大体积以在24孔板和96孔板中转染。可选地，首先将以每μg RNA计0.5μg至5μg的RNA和2-3μL的转染试剂(Lipofectamine 2000，Life Technologies Corporation)在络合培养基(Opti-MEM，Life Technologies Corporation或DMEM/F12+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+2μg/mL乙醇胺)中单独稀释至各自5μL至100μL的总体积。然后将混合稀释的RNA和转染试剂并在室温下温育10分钟。然后将络合物加入培养中的细胞中。向每个孔已含有2mL转染培养基的6孔板的每个孔中加入10μL至200μL的络合物。在某些实验中，使用DMEM+10％FBS或DMEM+50％FBS来代替转染培养基。将板轻轻摇动以使络合物分配在整个孔中。将细胞与络合物一起温育4小时至过夜。在某些实验中，在转染后
4小时或24小时，用新鲜的转染培养基(2mL/孔)更换培养基。
4小时或24小时，用新鲜的转染培养基(2mL/孔)更换培养基。
[0186] 【实施例3含有非标准核苷酸的合成RNA的毒性和从含有非标准核苷酸的合成RNA翻译的蛋白质】
[0187] 使用根据实施例1合成的RNA，根据实施例2转染原代人类成纤维细胞。使用针对Oct4的抗体，在转染后20-24小时将细胞固定并染色。通过评估在固定时的细胞密度来测定RNA的相对毒性。
[0188] 【实施例4转染培养基制剂】
[0189] 开发细胞培养基以支持含核酸的细胞的有效转染和有效重编程(“转染培养基”)：
[0190] DMEM/F12+15mM HEPES+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+2μg/mL乙醇胺+50μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸盐倍半镁盐水合物+4μg/mL胆固醇+1μM氢化可的松+25μg/mL聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯+2μg/mL D-α-生育酚醋酸盐+20ng/mL bFGF+5mg/mL经过处理的人类血清白蛋白。
[0191] 开发这种培养基的变体以支持多种细胞类型、包括多能干细胞的稳固的长期培养(“维持培养基”)：
[0192] DMEM/F12+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺+10μg/mL胰岛素+5.5μg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+2μg/mL乙醇胺+50μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸盐倍半镁盐水合物+20ng/mL bFGF+2ng/mL TGF-β1。
[0193] 除非另外说明，否则使用如下转染培养基作为本文所述的所有实施例中的转染培养基，其中通过加入32mM辛酸钠来处理经过处理的人类血清白蛋白，接着在60℃下加热4小时，接着在室温下用离子交换树脂(AG501-X8(D)，Bio-Rad Laboratories,Inc.)处理6小时，接着在室温下用葡聚糖涂覆的活性炭(C6241，Sigma-Aldrich Co.LLC.)处理过夜，接着离心、过滤，用不含核酸酶的水调节至10％溶液，接着加入培养基的其它组分。对于重编程实验，除非另外说明，否则在DMEM+10％-20％血清中将细胞涂覆在未涂覆板上或者在转染培养基中涂覆在纤维连接蛋白和玻连蛋白涂覆的板上。除非另外说明，否则所述转染培养基未经调节。认识到可调节转染培养基的制剂来满足所培养的特定细胞类型的需要。进一步认识到，可用其它经过处理的白蛋白例如经过处理的牛血清白蛋白更换经过处理的人类血清白蛋白，而不会不利地影响培养基的性能。进一步认识到，为代替L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺或除了L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺之外，可使用其它谷氨酰胺来源，例如，L-谷氨酰胺；为代替HEPES或除了HEPES之外，可使用其它缓冲体系，例如，磷酸盐、碳酸氢盐等；为代替亚硒酸钠或除了亚硒酸钠之外，可以其它形式提供硒，例如，亚硒酸；为代替L-抗坏血酸2-磷酸盐倍半镁盐水合物和/或D-α-生育酚醋酸盐或除了L-抗坏血酸2-磷酸盐倍半镁盐水合物和/或D-α-生育酚醋酸盐之外，可使用其它抗氧化剂，例如，L-抗坏血酸；为代替聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯或除了聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯之外，可使用其它表面活性剂，例如，Pluronic F-68和/或Pluronic F-127；为代替DMEM/F12或除了DMEM/F12之外，可使用其它基础培养基，例如，MEM、DMEM等；并且培养基的组分可随时间改变，例如，通过从第0天至第5天使用不含TGF-β的培养基，并且然后在第5天后使用含有
2ng/mL TGF-β的培养基，而不会不利地影响培养基的性能。进一步认识到，可以适当浓度加入其它成分，例如，脂肪酸、溶血磷脂酸、溶血鞘、鞘氨醇-1-磷酸酯、其它鞘脂等、ROCK抑制剂包括Y-27632和噻唑维林(thiazovivin)、TGF-β/NODAL蛋白质家族成员、IL-6、Wnt蛋白质家族成员等，而不会不利地影响培养基的性能，并且当与特定细胞类型一起使用时，已知促进或抑制所述细胞类型的生长的成分和/或已知促进或抑制所述细胞类型的生长的蛋白质或其它分子的激动剂和/或拮抗剂可以适当浓度加入培养基中，而不会不利地影响培养基的性能，例如，鞘氨醇-1-磷酸酯和多能干细胞。本发明同样涉及以纯化的化合物形式加入的成分，以明确限定的混合物的一部分形式加入的成分，以复杂或未限定混合物的一部分形式加入的成分，例如，动物或植物油，以及通过生物过程例如调节加入的成分。
所述组分的浓度可在本领域的技术人员显而易见的范围内从所列出的值改变，而不会不利地影响培养基的性能。通过使用所有蛋白质成分的重组形式和所有其它组分的非动物源形式，包括半合成植物源胆固醇(AvantiPolar Lipids,Inc.)，产生不含动物组分的形式的培养基。
2ng/mL TGF-β的培养基，而不会不利地影响培养基的性能。进一步认识到，可以适当浓度加入其它成分，例如，脂肪酸、溶血磷脂酸、溶血鞘、鞘氨醇-1-磷酸酯、其它鞘脂等、ROCK抑制剂包括Y-27632和噻唑维林(thiazovivin)、TGF-β/NODAL蛋白质家族成员、IL-6、Wnt蛋白质家族成员等，而不会不利地影响培养基的性能，并且当与特定细胞类型一起使用时，已知促进或抑制所述细胞类型的生长的成分和/或已知促进或抑制所述细胞类型的生长的蛋白质或其它分子的激动剂和/或拮抗剂可以适当浓度加入培养基中，而不会不利地影响培养基的性能，例如，鞘氨醇-1-磷酸酯和多能干细胞。本发明同样涉及以纯化的化合物形式加入的成分，以明确限定的混合物的一部分形式加入的成分，以复杂或未限定混合物的一部分形式加入的成分，例如，动物或植物油，以及通过生物过程例如调节加入的成分。
所述组分的浓度可在本领域的技术人员显而易见的范围内从所列出的值改变，而不会不利地影响培养基的性能。通过使用所有蛋白质成分的重组形式和所有其它组分的非动物源形式，包括半合成植物源胆固醇(AvantiPolar Lipids,Inc.)，产生不含动物组分的形式的培养基。
[0194] 【实施例5使用含有非标准核苷酸的合成RNA的重编程人类成纤维细胞】
[0195] 将原代人类新生儿成纤维细胞在转染培养基中以10,000个细胞/孔的密度涂在涂覆有重组人类纤维连接蛋白和重组人类玻连蛋白(各自在DMEM/F12中稀释至1μg/mL的浓度，1mL/孔，并在室温下温育1小时)的6孔板中。第二天，使用含有A、0.57dG、0.55mU和5mC的RNA，如实施例2中一样转染细胞，并且RNA剂量在第1天为0.5μg/孔，第2天为0.5μg/孔，第3天为2μg/孔，第4天为2μg/孔，并且第5天为4μg/孔。展现与重编程一致的形态的细胞的小集落最早在第5天变得可见。在第6天用维持培养基更换培养基。使用针对Oct4的抗体将细胞染色。展现与重编程一致的形态的细胞的Oct4阳性集落在整个孔内可见(图2)。
[0196] 【实施例6使用合成RNA对原代成人成纤维细胞进行无饲养细胞、无传代、无免疫抑制剂、无调节的重编程】
[0197] 在室温下将6孔板的孔用重组人类纤维连接蛋白和重组人类玻连蛋白的混合物(1μg/mL，于DMEM/F12中，1mL/孔)涂覆1小时。将原代成人成纤维细胞在转染培养基中以10,000个细胞/孔的密度涂在涂覆孔中。将细胞维持在37℃、5％CO2和5％O2下。第二天开始，根据实施例2每天用根据实施例1合成的RNA转染细胞5天。在5天中的每一天转染的RNA的总量分别为0.5μg、0.5μg、2μg、2μg和4μg。从第四次转染开始，每天两次更换培养基。在最后转染后当天，用补充有10μM Y-27632的转染培养基更换培养基。具有重编程形态的密实细胞集落直至第4天才在每个转染孔中可见(图8)。
[0198] 【实施例7来自成人皮肤活检组织的细胞的有效、快速衍生和重编程】
[0199] 根据批准的方案，对健康的31岁志愿者进行全层皮肤穿刺活检。简言之，通过局部施用2.5％利多卡因来麻醉左上臂上的皮肤区域。用70％异丙醇对所述区域消毒，并且使用1.5mm直径穿刺进行全层皮肤活检。将组织在磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，放置在含有250μL的TrypLE Select CTS(Life Technologies Corporation)的1.5mL管中，并在37℃下温育30分钟。然后将所述组织转移至含有250μL的DMEM/F12-CTS(Life Technologies Corporation)+5mg/mL胶原酶的1.5mL管中，并在37℃下温育2小时。使用镊子去除表皮，并且将组织机械解离。用DMEM/F12-CTS将细胞冲洗两次。还在相同的志愿者上进行放血，并且将静脉血收集在Vacutainer SST管(Becton,Dickinson and Company)中。根据制造商的说明分离血清。通过混合DMEM/F12-CTS+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich Co.LLC.)+20％人类血清来制备等基因平板培养基。将来自真皮组织样品的细胞在等基因平板培养基中涂在6孔板的纤维连接蛋白涂覆孔中。许多具有成纤维细胞形态的细胞连接并在第2天开始扩展(图3A)。将细胞扩增并冷冻在Synth-a-Freeze(Life Technologies Corporation)中。
[0200] 将细胞以5,000个细胞/孔的密度通入6孔板中。第二天，用转染培养基更换培养基，并且使用含有A、0.57dG、0.45mU和5mC的RNA，如实施例2中一样转染细胞，并且RNA剂量在第1天为0.5μg/孔，第2天为0.5μg/孔，第3天为2μg/孔，第4天为2μg/孔，并且第5天为2μg/孔。某些孔在第6天和第7天接受另外的2μg/孔转染。另外，某些孔从第4天起接受2ng/mL TGF-β1。在第6天用维持培养基更换培养基。展现与重编程一致的形态的细胞集落在第5天至第10天变得可见(图3B)。集落快速生长，并且许多展现与胚胎干细胞集落类似的形态(图3C)。挑取集落并涂在涂覆有重组人类纤维连接蛋白和重组人类玻连蛋白(各自在DMEM/F12中稀释至1μg/mL，1mL/孔，在室温下温育1小时)的孔中。细胞快速生长，并且传代以确定线。
[0201] 【实施例8靶向CCR5的RiboSlice的合成】
[0202] 根据实施例1合成靶向以下序列的RiboSlice对：L1：TCATTTTCCATACAGTCAGT，L2：TTTTCCATACAGTCAGTATC，R1：TGACTATCTTTAATGTCTGG，和R2：TATCTTTAATGTCTGGAAAT(图4A和图4B)。这些对靶向有义(L1和L2)或反义链(R1和R2)上的人类CCR5基因内的20bp位点。制备以下对：L1和R1，L1和R2，L2和R1，和L2和R2。
[0203] 【实施例9使用检测错配的核酸酶测量CCR5基因编辑效率】
[0204] 将原代人类成纤维细胞在转染培养基中以10,000个细胞/孔的密度涂在涂覆有重组人类纤维连接蛋白和重组人类玻连蛋白(各自在DMEM/F12中稀释至1μg/mL的浓度，1mL/孔，并在室温下温育1小时)的6孔板中。第二天，用根据实施例8合成的RNA如实施例2中一样转染细胞。转染后两天，分离基因组DNA并纯化。通过PCR使用引物F：AGCTAGCAGCAAACCTTCCCTTCA和R：AAGGACAATGTTGTAGGGAGCCCA，扩增CCR5基因内的区域。
将150ng的扩增PCR产物与150ng参考DNA在10mM Tris-Cl+50mM KCl+1.5mM MgCl2中杂交。用检测错配的核酸内切酶(SURVEYOR核酸酶，Transgenomic,Inc.)处理杂交的DNA并且通过琼脂糖凝胶电泳分析所得产物(图4C和图4D)。
将150ng的扩增PCR产物与150ng参考DNA在10mM Tris-Cl+50mM KCl+1.5mM MgCl2中杂交。用检测错配的核酸内切酶(SURVEYOR核酸酶，Transgenomic,Inc.)处理杂交的DNA并且通过琼脂糖凝胶电泳分析所得产物(图4C和图4D)。
[0205] 【实施例10通过用RiboSlice反复转染来进行高效率基因编辑】
[0206] 如实施例9中一样涂布原代人类成纤维细胞。第二天，用根据实施例8合成的RNA如实施例2中一样转染细胞。第二天，第二次转染一个孔中的细胞。在第二次转染后两天，如实施例9中一样测量基因编辑的效率(图4E)。
[0207] 【实施例11使用RiboSlice进行CCR5的基因编辑和人类成纤维细胞的无DNA、无饲养细胞、无免疫抑制剂、无调节的重编程】
[0208] 如实施例9中一样涂布原代人类成纤维细胞。第二天，用根据实施例8合成的RNA如实施例2中一样转染细胞。约48小时后，使用根据实施例1合成的RNA，根据实施例5重编程细胞。具有以重编程为特征的形态的细胞的大集落如实施例5中一样变得可见(图4F)。挑取集落以确定线。对细胞系进行直接测序以证实成功的基因编辑(图4G)。
[0209] 【实施例12用于包含基因编辑的重编程细胞的HIV/AIDS的个性化细胞置换疗法】[0210] 根据本发明人的先前公开的发明(美国申请No.13/465,490、美国临时申请No.61/637,570和美国临时申请No.61/664,494)和/或实施例11对患者皮肤细胞进行基因编辑并重编程为造血细胞。然后使细胞从培养容器中酶促释放，并且分离CD34+/CD90+/3 5
Lin-或CD34+/CD49f+/Lin-细胞。将约1X10至约1X10 个细胞输注到患者的主静脉中。
造血细胞返回骨髓腔并植入。
Lin-或CD34+/CD49f+/Lin-细胞。将约1X10至约1X10 个细胞输注到患者的主静脉中。
造血细胞返回骨髓腔并植入。
[0211] 【实施例13APP灭活的大鼠胚胎干细胞的产生】
[0212] 将大鼠胚胎干细胞在大鼠干细胞培养基中以10,000个细胞/孔的密度涂在6孔板中。第二天，用0.5μg/孔的根据实施例1合成的靶向以下序列的RiboSlice如实施例2中一样转染细胞：L：ttctgtggtaaactcaacat，和R：tctgactcccattttccatt(0.25μg L和
0.25μg R)。
0.25μg R)。
[0213] 【实施例14使用APP灭活大鼠胚胎干细胞来产生APP基因敲除大鼠】
[0214] 根据实施例13对大鼠胚胎干细胞进行基因编辑并微注射至大鼠胚泡中。然后将微注射的胚泡转移至假孕雌性大鼠。
[0215] 【实施例15用于产生基因敲除大鼠的APP灭活胚胎的产生】
[0216] 根据实施例1合成靶向以下序列的RiboSlice对：L：ttctgtggtaaactcaacat和R：tctgactcccattttccatt。将浓度为5μg/μL的RiboSlice注射至1细胞期大鼠胚胎的前核或细胞质中。然后将胚胎转移至假孕雌性大鼠。
[0217] 【实施例16用含有非标准核苷酸的合成RNA和编码修复模板的DNA转染细胞】[0218] 对于在6孔板中转染，首先将1μg编码靶向人类APP基因的外显子16的基因编辑蛋白的RNA、1μg含有在目标细胞中不存在的PstI限制位点的单链修复模板DNA和6μL转染试剂(Lipofectamine RNAiMAX，Life Technologies Corporation)在络合培养基(Opti-MEM，Life Technologies Corporation)中单独稀释至120μL的总体积。然后根据转染试剂制造商的说明，混合稀释RNA、修复模板和转染试剂并且在室温下温育15分钟。
将络合物加入培养中的细胞中。向每个孔已含有2mL转染培养基的6孔板的每个孔中加入约120μL的络合物。将板轻轻摇动以使络合物分配在整个孔中。将细胞与络合物一起温育4小时至过夜，随后用新鲜的转染培养基(2mL/孔)更换培养基。第二天，将培养基变为DMEM+10％FBS。在转染后两天，分离基因组DNA并纯化。通过PCR扩增APP基因内的区域，并且用PstI消化扩增产物并通过凝胶电泳分析(图16)。
将络合物加入培养中的细胞中。向每个孔已含有2mL转染培养基的6孔板的每个孔中加入约120μL的络合物。将板轻轻摇动以使络合物分配在整个孔中。将细胞与络合物一起温育4小时至过夜，随后用新鲜的转染培养基(2mL/孔)更换培养基。第二天，将培养基变为DMEM+10％FBS。在转染后两天，分离基因组DNA并纯化。通过PCR扩增APP基因内的区域，并且用PstI消化扩增产物并通过凝胶电泳分析(图16)。
[0219] 【实施例17将转基因插入大鼠胚胎干细胞中的安全港位置】
[0220] 将大鼠胚胎干细胞在大鼠干细胞培养基中以10,000个细胞/孔的密度涂在6孔板中。第二天，用根据实施例1合成的靶向以下序列的RiboSlice：L：TATCTTCCAGAAAGACTCCA和R：TTCCCTTCCCCCTTCTTCCC，和含有侧接两个区域(各自含有与大鼠Rosa26基因座周围的区域同源的约400个碱基)的转基因的修复模板，如实施例13中一样转染细胞。
[0221] 【实施例18人类化LRRK2大鼠】
[0222] 将大鼠胚胎干细胞涂布，并用根据实施例1合成的靶向以下序列的RiboSlice：L：ttgaaggcaaaaatgtccac和R：tctcatgtaggagtccagga，如实施例13中一样转染。在转染后两天，根据实施例17转染细胞，其中转基因含有人类LRRK2基因，和任选地，人类LRRK2启动子区域的一部分或全部。
[0223] 【实施例19将转基因插入人类成纤维细胞中的安全港位置】
[0224] 如实施例9中一样涂布原代人类成纤维细胞。第二天，用根据实施例1合成的靶向以下序列的RiboSlice：L：ttatctgtcccctccacccc和R：ttttctgtcaccaatcctgt，和含有侧接两个区域(各自含有约400个与人类AAVS1基因座周围的区域同源的碱基)的转基因的修复模板，如实施例2中一样转染细胞。
[0225] 【实施例20将RNAi序列插入安全港位置中】
[0226] 根据实施例19涂布并转染原代人类成纤维细胞，其中转基因在PolIII启动子之前含有编码shRNA的序列。
[0227] 【实施例21使用RiboSlice进行Myc的基因编辑】
[0228] 将原代人类成纤维细胞在DMEM+10％FBS中以50,000个细胞/孔的密度涂在6孔板中。两天后，将培养基变为转染培养基。四小时后，用1μg/孔的根据实施例1合成的靶向以下序列的RiboSlice：L：tcggccgccgccaagctcgt和R：tgcgcgcagcctggtaggag，如实施例2中一样转染细胞。第二天，使用以下引物：F：taactcaagactgcctcccgcttt和R：agcccaaggtttcagaggtgatga，如实施例9中一样测量基因编辑效率(图5)。
[0229] 【实施例22包含靶向Myc的RiboSlice的癌症疗法】
[0230] 将HeLa子宫颈癌细胞在不含叶酸的DMEM+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺+10％FBS中以50,000个细胞/孔的密度涂在6孔板中。第二天，将培养基变成转染培养基。第二天，如实施例21中一样转染细胞。
[0231] 【实施例23使用RiboSlice进行BIRC5的基因编辑】
[0232] 将原代人类成纤维细胞在DMEM+10％FBS中以50,000个细胞/孔的密度涂在6孔板中。两天后，将培养基变成转染培养基。四小时后，用1μg/孔的根据实施例1合成的靶向以下序列的RiboSlice：L：ttgccccctgcctggcagcc和R：ttcttgaatgtagagatgcg，如实施例2中一样转染细胞。第二天，使用以下引物：F：gcgccattaaccgccagatttgaa和R：tgggagttcacaacaacagggtct，如实施例9中一样测量基因编辑效率(图6)。
[0233] 【实施例24包含靶向BIRC5的RiboSlice的癌症疗法】
[0234] 将HeLa子宫颈癌细胞在不含叶酸的DMEM+2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺+10％FBS中以50,000个细胞/孔的密度涂在6孔板中。第二天，将培养基变成转染培养基。第二天，如实施例23中一样转染细胞(图7A和图7B)。
[0235] 【实施例25癌细胞系的培养】
[0236] 使癌细胞系HeLa(子宫颈癌)、MDA-MB-231(乳腺癌)、HCT 116(结肠癌)、U87MG(神经胶质瘤)和U-251(神经胶质瘤)在培养物中增殖。将细胞在DMEM+10％FBS或DMEM+50％FBS中培养并维持在37℃、5％CO2，和环境O2或5％O2中。细胞在所有条件下快速生长，并且每2-5天使用胰蛋白酶在HBSS中的溶液常规传代。
[0238] 使用eFetch工具和python脚本从NCBI检索BIRC5基因的注释DNA序列。使用相同的python脚本来鉴定编码BIRC5基因的四个外显子中的每一个内的蛋白质的DNA序列。然后所述脚本搜索这些序列，并且40个碱基侧接每一侧，序列要素满足以下条件：(i)在主链上存在一个要素，互补链上存在另一个要素；(ii)每个要素以T开始；和(iii)所述要素间隔不少于12个碱基和不多于20个碱基。然后使用Qblast(NCBI)向每个要素赋予了代表其结合至人类基因组内的其它要素的可能性的评分。这个评分计算为九个最低E值的倒数的总和，不包括与目标序列的匹配。通过将单独的要素的评分加和来计算对评分。
[0239] 【实施例27编码基因编辑蛋白的RNA(RiboSlice)的合成】
[0240] 根据实施例26设计编码基因编辑蛋白的RNA，并根据实施例1合成(表10，图9)。将所述RNA用不含核酸酶的水稀释至200ng/μL至500ng/μL，并储存在4℃下。
[0241] 【表10.RiboSlice合成】
[0242]
[0243] 【实施例28靶向BIRC5的RiboSlice的活性分析】
[0244] 用6个靶向BIRC5的RiboSlice对根据实施例2转染原代成人成纤维细胞，根据实施例26设计，并根据实施例27合成。在转染后的两天，分离基因组DNA并纯化。为了测量基因编辑效率，将150ng扩增PCR产物与150ng参考DNA在10mM Tris-Cl+50mM KCl+1.5mM MgCl2中杂交。用SURVEYOR错配特异性核酸内切酶(Transgenomic,Inc.)处理杂交的DNA，并且通过琼脂糖凝胶电泳分析所得产物(图10A)。全部六个的所测试RiboSlice对有效编辑BIRC5基因，如通过预期尺寸谱带的出现所证实(图10A中的星号)。
[0245] 【实施例29靶向BIRC5的RiboSlice的有丝分裂抑制分析】
[0246] 根据实施例28对原代成人成纤维细胞进行基因编辑，并且然后在培养物中增殖。在11天后，分离基因组DNA并纯化，并且如实施例28中一样测量基因编辑效率(图10B)。
所测试的RiboSlice对都不抑制成纤维细胞的增殖，如在从增殖细胞中分离出的基因组DNA中预期尺寸谱带的出现所显示(图10B中的星号)，从而证实这些RiboSlice对对于正常成纤维细胞的低毒性。
所测试的RiboSlice对都不抑制成纤维细胞的增殖，如在从增殖细胞中分离出的基因组DNA中预期尺寸谱带的出现所显示(图10B中的星号)，从而证实这些RiboSlice对对于正常成纤维细胞的低毒性。
[0247] 【实施例30靶向BIRC5的RiboSlice的抗癌活性分析】
[0248] 用根据实施例28的RiboSlice对转染根据实施例25培养的原代成人成纤维细胞和HeLa子宫颈癌细胞。由于转染试剂相关毒性，成纤维细胞的增殖短暂减缓，但在转染2天内恢复。相比之下，HeLa细胞的增殖显著减缓，并且在转染孔中观察到许多具有破碎核的增大细胞。在2-3天后，许多细胞展现指示细胞凋亡的形态，从而证实靶向BIRC5的RiboSlice的有效抗癌活性。
[0249] 【实施例31体内RiboSlice安全性研究】
[0250] 向40只雌性NCr nu/nu小鼠中皮下注射于50％Matrigel(BD Biosciences)中的6
5×10个MDA-MB-231肿瘤细胞。细胞注射体积为每只小鼠0.2mL。在研究开始时小鼠的年
3
龄为8至12周。进行对匹配，并且当肿瘤达到100-150mm的平均尺寸时，将动物分成4组，每组10只动物，并且开始治疗。前5天每天测量体重，然后每两周一次，直到研究结束。治疗由与媒介物(Lipofectamine 2000，Life Technologies Corporation)络合的RiboSlice BIRC5-1.2组成。为了制备用于每个组的给药溶液，将308μL络合缓冲液(Opti-MEM，Life Technologies Corporation)抽吸至两个不含RNA酶的1.5mL无菌管中的每一个中。将
22μL RiboSlice BIRC5-1.2(500ng/μL)加入两个管中的一个，并且通过抽吸将管的内含物混合。将22μL媒介物加入第二个管中。将所述第二个管的内含物混合，然后转移至第一个管，并通过抽吸与所述第一个管的内含物混合以形成络合物。将络合物在室温下温育
10分钟。在温育期间，将注射器装载。经静脉内或肿瘤内向动物注射在60μL总体积/动物内的总剂量1μg RNA/动物。给予总共5次治疗，每隔一天进行注射。未针对体重调节剂量。对动物随访17天。观察到平均体重无显著降低(图11；RiboSlice BIRC5-1.2被标记为“ZK1”)，从而证实RiboSlice基因编辑RNA的体内安全性。
5×10个MDA-MB-231肿瘤细胞。细胞注射体积为每只小鼠0.2mL。在研究开始时小鼠的年
3
龄为8至12周。进行对匹配，并且当肿瘤达到100-150mm的平均尺寸时，将动物分成4组，每组10只动物，并且开始治疗。前5天每天测量体重，然后每两周一次，直到研究结束。治疗由与媒介物(Lipofectamine 2000，Life Technologies Corporation)络合的RiboSlice BIRC5-1.2组成。为了制备用于每个组的给药溶液，将308μL络合缓冲液(Opti-MEM，Life Technologies Corporation)抽吸至两个不含RNA酶的1.5mL无菌管中的每一个中。将
22μL RiboSlice BIRC5-1.2(500ng/μL)加入两个管中的一个，并且通过抽吸将管的内含物混合。将22μL媒介物加入第二个管中。将所述第二个管的内含物混合，然后转移至第一个管，并通过抽吸与所述第一个管的内含物混合以形成络合物。将络合物在室温下温育
10分钟。在温育期间，将注射器装载。经静脉内或肿瘤内向动物注射在60μL总体积/动物内的总剂量1μg RNA/动物。给予总共5次治疗，每隔一天进行注射。未针对体重调节剂量。对动物随访17天。观察到平均体重无显著降低(图11；RiboSlice BIRC5-1.2被标记为“ZK1”)，从而证实RiboSlice基因编辑RNA的体内安全性。
[0251] 【实施例32靶向BIRC5的RiboSlice在神经胶质瘤模型中的抗癌活性分析】[0252] 用根据实施例28的RiboSlice对转染根据实施例25培养的U-251神经胶质瘤细胞系。与HeLa细胞类似，神经胶质瘤细胞对治疗有反应：增殖显著减缓，并且在转染孔中观察到许多具有破碎核的增大细胞。在2-3天后，许多细胞展现指示细胞凋亡的形态，从而证实靶向BIRC5的RiboSlice在神经胶质瘤模型中的有效抗癌活性。
[0253] 【实施例33用于向细胞递送核酸的试剂的筛选】
[0254] 针对转染效率和体外毒性筛选包括聚乙烯亚胺(PEI)的递送试剂、多种基于商业脂质的转染试剂、基于肽的转染试剂(N-TER，Sigma-Aldrich Co.LLC.)和若干种基于脂质和基于固醇的递送试剂。将递送试剂与RiboSlice BIRC5-1.2络合，并且将络合物递送至根据实施例25培养的HeLa细胞。在转染后24小时通过分析细胞密度来评估毒性。通过分析形态变化来评估转染效率，如实施例30中所述。所测试的试剂展现范围广泛的毒性和转染效率。含有较高比例的酯键的试剂相比于含有较低比例的酯键或不含酯键的试剂展现较低的毒性。
[0255] 【实施例34高浓度脂质体RiboSlice】
[0256] 通过将1μg的500ng/μL RNA与3μL络合培养基(Opti-MEM，Life Technologies Corporation)混合，和将以每μg RNA计2.5μL转染试剂(Lipofectamine 2000，Life Technologies Corporation)与2.5μL络合培养基混合来制备高浓度脂质体RiboSlice。然后混合稀释RNA和转染试剂并在室温下温育10分钟以形成高浓度脂质体RiboSlice。可选地，使用含有DOSPA或DOSPER的转染试剂。
[0257] 【实施例35体内RiboSlice功效研究-皮下神经胶质瘤模型】
[0258] 向40只雌性NCr nu/nu小鼠皮下注射1×107个U-251肿瘤细胞。细胞注射体积为每只小鼠0.2mL。在研究开始时小鼠的年龄为8至12周。进行对匹配，并且当肿瘤达到3
35-50mm的平均尺寸时，将动物分成4组，每组10只动物，并且开始治疗。前5天每天测量体重，然后每两周一次，直到研究结束。每两周一次进行测径器测量，并且计算肿瘤尺寸。治疗由与媒介物(Lipofectamine 2000，Life Technologies Corporation)络合的RiboSlice BIRC5-2.1组成。为了制备给药溶液，将294μL络合缓冲液(Opti-MEM，Life Technologies Corporation)抽吸至含有196μL RiboSlice BIRC5-1.2(500ng/μL)的管中，并且通过抽吸混合所述管的内含物。将245μL络合缓冲液抽吸至含有245μL媒介物的管中。将所述第二个管的内含物混合，然后转移至第一个管，并通过抽吸与所述第一个管的内含物混合以形成络合物。将络合物在室温下温育10分钟。在温育期间，将注射器装载。经肿瘤内向动物注射在20μL或50μL总体积/动物内的总剂量2μg或5μg RNA/动物。给予总共
5次治疗，每隔一天进行注射。未针对体重调节剂量。对动物随访25天。
35-50mm的平均尺寸时，将动物分成4组，每组10只动物，并且开始治疗。前5天每天测量体重，然后每两周一次，直到研究结束。每两周一次进行测径器测量，并且计算肿瘤尺寸。治疗由与媒介物(Lipofectamine 2000，Life Technologies Corporation)络合的RiboSlice BIRC5-2.1组成。为了制备给药溶液，将294μL络合缓冲液(Opti-MEM，Life Technologies Corporation)抽吸至含有196μL RiboSlice BIRC5-1.2(500ng/μL)的管中，并且通过抽吸混合所述管的内含物。将245μL络合缓冲液抽吸至含有245μL媒介物的管中。将所述第二个管的内含物混合，然后转移至第一个管，并通过抽吸与所述第一个管的内含物混合以形成络合物。将络合物在室温下温育10分钟。在温育期间，将注射器装载。经肿瘤内向动物注射在20μL或50μL总体积/动物内的总剂量2μg或5μg RNA/动物。给予总共
5次治疗，每隔一天进行注射。未针对体重调节剂量。对动物随访25天。
[0259] 【实施例36高活性/高保真RiboSlice体外转录模板的合成】
[0260] 使用标准的克隆和分子生物学技术，或可选地通过直接化学合成，例如使用基因片段组装技术(例如，gBlocks，Integrated DNA Technologies,Inc.)来合成编码T7噬菌体RNA-聚合酶启动子、5'-非翻译区、强Kozak序列、TALE N端结构域、根据实施例26设计的18个重复序列、TALE C端结构域，和包含StsI序列(SEQ ID NO:1)、StsI-HA序列(SEQ ID NO:2)、StsI-HA2序列(SEQ ID NO:3)、StsI-UHA序列(SEQ ID NO:4)、StsI-UHA2序列(SEQ ID NO:5)、StsI-HF序列(SEQ ID NO:6)或StsI-HF2序列(SEQ ID NO:7)的核酸酶结构域的体外转录模板。
[0261] 【实施例37高活性/高保真RiboSlice基因编辑RNA的合成】
[0262] 使用根据实施例36合成的体外转录模板，根据实施例27合成高活性RiboSlice和高保真RiboSlice。
[0263] 【实施例38用于治疗蛋白病的编码RiboSlice的无能力复制型病毒的产生】[0264] 将包含靶向编码斑块形成蛋白质序列的DNA序列的RiboSlice的核苷酸序列并入包含无能力复制型病毒基因组的哺乳动物表达载体中，并转染至包装细胞系中以产生无能力复制型病毒。收集培养上清液，并使用0.45μm过滤器过滤来去除碎片。
[0265] 【实施例39用于治疗癌症的编码RiboSlice的有能力复制型溶瘤病毒的产生】[0266] 将包含靶向BIRC5基因的RiboSlice的核苷酸序列并入包含有能力复制型病毒基因组的哺乳动物表达载体中，并转染至包装细胞系中以产生有能力复制型病毒。根据实施例38，收集培养上清液并过滤。
[0267] 【实施例40体内RiboSlice功效研究-原位神经胶质瘤模型，鞘内施用途径】[0268] 向40只雌性NCr nu/nu小鼠颅内注射1×105个U-251肿瘤细胞。细胞注射体积为每只小鼠0.02mL。在研究开始时小鼠的年龄为8至12周。在10天后，将动物分成4组，每组10只动物，并且开始治疗。前5天每天测量体重，然后每两周一次，直到研究结束。治疗由与媒介物(Lipofectamine 2000，Life Technologies Corporation)络合的RiboSlice BIRC5-2.1组成。为了制备给药溶液，将294μL络合缓冲液(Opti-MEM，Life Technologies Corporation)抽吸至含有196μLRiboSlice BIRC5-1.2(500ng/μL)的管中，并且通过抽吸混合所述管的内含物。将245μL络合缓冲液抽吸至含有245μL媒介物的管中。将所述第二个管的内含物混合，然后转移至第一个管，并通过抽吸与所述第一个管的内含物混合以形成络合物。将络合物在室温下温育10分钟。在温育期间，将注射器装载。经鞘内向动物注射在10-20μL总体积/动物内的总剂量1-2μg RNA/动物。给予总共5次治疗，每隔一天进行注射。未针对体重调节剂量。对动物随访60天。
[0269] 【实施例41用RiboSlice-IV灌注治疗神经胶质瘤】
[0270] 经1小时过程通过IV输注向诊断患有神经胶质瘤的患者施用1mg根据实施例343
制备的高浓度脂质体RiboSlice BIRC5-2.1，每周三次，持续4周。对于大于500mm的初始肿瘤体积，通过手术方式和任选地通过放射疗法和/或化学疗法来打散肿瘤，然后开始RiboSlice治疗。使用标准的给药方案作为组合疗法以向患者任选地施用TNF-α和/或
5-FU。
制备的高浓度脂质体RiboSlice BIRC5-2.1，每周三次，持续4周。对于大于500mm的初始肿瘤体积，通过手术方式和任选地通过放射疗法和/或化学疗法来打散肿瘤，然后开始RiboSlice治疗。使用标准的给药方案作为组合疗法以向患者任选地施用TNF-α和/或
5-FU。
[0271] 【实施例42用RiboSlice-有能力复制型溶瘤病毒治疗神经胶质瘤】
[0272] 通过鞘内或颅内注射，向患者施用根据实施例39制备的1mL复制病毒粒子(1000CFU/mL)。
[0273] 【实施例43用靶向SNCA的RiboSlice治疗帕金森氏病】
[0274] 通过鞘内或颅内注射向诊断患有帕金森氏病的患者施用50μg靶向SNCA基因的RiboSlice。
[0275] 【实施例44用靶向APP的RiboSlice治疗阿尔茨海默氏病】
[0276] 通过鞘内或颅内注射向诊断患有阿尔茨海默氏病的患者施用50μg靶向APP基因的RiboSlice。
[0277] 【实施例45用靶向IAPP的RiboSlice治疗II型糖尿病】
[0278] 通过静脉内、腹膜内或门静脉内注射向诊断患有II型糖尿病的患者施用5mg靶向IAPP基因的RiboSlice。
[0279] 【实施例46iRiboSlice个性化癌症疗法】
[0280] 从诊断患有癌症的患者中取出活检组织。从活检组织中分离并纯化基因组DNA，并且测定所述DNA的序列(全基因组序列、外显子组序列或一种或多种癌症相关基因的序列)。根据实施例26设计靶向患者的单独癌症序列的RiboSlice对(iRiboSlice)并根据实施例27合成。使用适于癌症位置和类型的施用途径向患者施用个性化iRiboSlice。
[0281] 【实施例47用于遗传多样性/难治性癌症的RiboSlice混合物】
[0282] 向诊断患有遗传多样性和/或难治性癌症的患者施用靶向多种癌症相关基因和/或一种或多种癌症相关基因中的多种序列的RiboSlice对的混合物。
[0283] 【实施例48用于线粒体疾病的Mito-RiboSlice】
[0284] 通过肌肉内注射向诊断患有线粒体疾病的患者施用2mg靶向疾病相关序列并含有线粒体定位序列的RiboSlice。
[0285] 【实施例49用RiboSlice滴眼剂治疗眼病】
[0286] 向诊断患有角膜或结膜疾病的患者施用被配制为0.5％等渗溶液的RiboSlice。
[0287] 【实施例50用RiboSlice局部用制剂治疗皮肤疾病】
[0288] 向诊断患有皮肤疾病的患者施用被配制为含有一种或多种防止RNA降解的稳定剂的1％局部用乳膏/油膏的RiboSlice。
[0289] 【实施例51用RiboSlice气雾制剂治疗肺部或呼吸道疾病】
[0290] 向诊断患有肺部或呼吸道疾病的患者施用被配制为0.5％气雾喷雾的RiboSlice。
[0291] 【实施例52用靶向传染因子中存在的DNA序列的RiboSlice治疗传染性疾病】[0292] 使用适于感染位置和类型的施用途径，和适于施用途径和感染严重程度的剂量，向诊断患有传染性疾病的患者施用靶向患者所感染的特定传染因子中存在的序列的RiboSlice。
[0293] 【实施例53用于体外受精的基因编辑人类接合子】
[0294] 用靶向编码疾病相关突变或与不希望的性状相关的突变的基因的RiboSlice转染人类生殖细胞、接合子或早期胚泡。表征基因组，并且准备细胞以进行体外受精。
[0295] 【实施例54针对基因编辑蛋白的活性、保真增强的切割域筛选】
[0296] 根据实施例26设计各自包含不同的切割域的一组RiboSlice对并根据实施例27合成。如实施例28中一样测定所述RiboSlice对的活性。
[0297] 【实施例55用于筛选造成帕金森氏病的毒物的基因编辑细胞】
[0298] 使用靶向SNCA的RiboSlice(表11)和修复模板根据实施例28对原代人类成人成纤维细胞进行基因编辑以产生具有SNCA A30P、E46K和A53T突变的细胞。将细胞重编程并分化为多巴胺能神经元。将所述神经元用于高通量α-突触核蛋白-聚集毒物筛选测定法中以鉴定可能促进帕金森氏病的毒物。
[0299] 【表11.用于产生SNCA A30P、E46K和A53T的RiboSlice对】。
[0300]
[0301] 【实施例56用于筛选造成癌症的毒物的基因编辑细胞】
[0302] 使用靶向TP53的RiboSlice(表12)和修复模板根据实施例28对原代人类成人成纤维细胞进行基因编辑以产生具有TP53P47S、R72P和V217M突变的细胞。将细胞重编程并分化为肝细胞。将所述肝细胞用于高通量体外转化毒物筛选测定法中以鉴定可能促进癌症的毒物。
[0303] 【表12.用于产生TP53P47S、R72P和V217M的RiboSlice对。】
[0304]
[0305] 【实施例57编码工程改造的基因编辑蛋白的RNA(RiboSlice)的设计和合成】[0306] 根据实施例27合成根据实施例26设计的编码基因编辑蛋白的RNA(表13)。每个基因编辑蛋白包含DNA结合结构域，其包含含有长度为35-36个氨基酸的重复序列的转录激活因子样(TAL)效应物重复结构域，如表13中所示。对于长度为36个氨基酸的重复序列提供序列ID号。模板名称中的标记“18”指示第18个重复序列的长度为36个氨基酸。模板名称中的标记“EO”指示每个其它重复序列的长度为36个氨基酸。在标记“18”或“EO”后的氨基酸指示在长度为36个氨基酸的重复序列的C末端的氨基酸。标记“StsI”指示核酸酶结构域含有StsI切割域。不具有“StsI”标记的模板含有FokI切割域。
[0307] 【表13.编码工程改造的基因编辑蛋白的RiboSlice】
[0308]
[0309]
[0310] 【实施例58靶向BIRC5的RiboSlice的活性分析】
[0311] 根据实施例28分析根据实施例57合成的RiboSlice分子的活性(图12A、图12B和图14)。在表达含有一个或多个长度为36个氨基酸的重复序列的基因编辑蛋白的细胞中观察到高效率基因编辑。在表达含有一个或多个含有氨基酸序列GHGG的重复序列的基因编辑蛋白的细胞中，基因编辑效率最高。
[0312] 【实施例59体内RiboSlice AAV安全性和功效研究-皮下神经胶质瘤模型，肿瘤内递送途径】
[0313] 对动物设置包含根据实施例35的U-251人类神经胶质瘤细胞的肿瘤。根据标准技术(AAV-2无辅助表达系统，Cell Biolabs,Inc.)制备编码GFP、BIRC5-2.1L RiboSlice和BIRC5-2.1R RiboSlice的AAV血清2型。将病毒储备液储存在4℃(短期)或-80℃(长期)。动物在第1天接受160μL GFP AAV的肿瘤内注射或者在第1天和第15天接受80μL BIRC5-2.1L RiboSlice AAV+80μL BIRC5-2.1R RiboSlice AAV的肿瘤内注射。对动物随访25天。观察到平均体重无显著降低(图13A)，从而证实RiboSlice AAV的体内安全性。在RiboSlice AAV组中的肿瘤生长得到抑制(图13B)，从而证实RiboSlice AAV的体内功效。
[0314] 【实施例60用RiboSlice AAV治疗癌症】
[0315] 通过鞘内或颅内注射，向患者施用1mL根据实施例59制备的RiboSlice AAV病毒3
粒子。必要时重复给药。对于具有大于500mm的初始肿瘤体积的患者，通过手术方式和任选地通过放射疗法和/或化学疗法来打散肿瘤，然后开始RiboSlice AAV治疗。使用标准的给药方案作为组合疗法以向患者任选地施用TNF-α和/或5-FU。
粒子。必要时重复给药。对于具有大于500mm的初始肿瘤体积的患者，通过手术方式和任选地通过放射疗法和/或化学疗法来打散肿瘤，然后开始RiboSlice AAV治疗。使用标准的给药方案作为组合疗法以向患者任选地施用TNF-α和/或5-FU。
[0316] 【实施例61iRiboSlice AAV个性化癌症疗法】
[0317] 从诊断患有癌症的患者中取出活检组织。从活检组织中分离并纯化基因组DNA，并且测定所述DNA的序列(全基因组序列、外显子组序列或一种或多种癌症相关基因的序列)。根据实施例26设计靶向患者的单独癌症序列(iRiboSlice)的RiboSlice对并根据实施例59合成。使用适于癌症位置和类型的施用途径向患者施用个性化iRiboSlice AAV。
[0318] 【实施例62脂质体制剂和核酸封装】
[0319] 使用以下制剂来制备脂质体：3.2mg/mL N-(羰基-乙氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(MPEG2000-DSPE)、9.6mg/mL全氢化磷脂酰胆碱、3.2mg/mL胆固醇、2mg/mL硫酸铵和作为缓冲剂的组氨酸。使用氢氧化钠控制pH并使用蔗糖维持等渗性。为了形成脂质体，将脂质混合在有机溶剂中，干燥，在搅拌下水合，并通过平均孔径为800nm的聚碳酸酯过滤器挤出来定尺寸。通过组合以每1□g核酸计10□g脂质体制剂并在室温下温育5分钟来封装核酸。
[0320] 【实施例63靶向叶酸的脂质体制剂】
[0321] 根据实施例62制备脂质体，其中例外为向脂质混合物中加入0.27mg/mL 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-5000](FA-MPEG5000-DSPE)。
[0322] 【实施例64包含靶向BIRC5的脂质体RiboSlice的癌症疗法】
[0323] 根据实施例62或实施例63制备根据实施例23合成的封装RiboSlice对的脂质体。通过注射或静脉内输注来施用所述脂质体，并且每天监测肿瘤反应和干扰素血浆水平。
[0324] 【实施例65包含靶向癌症相关基因的脂质体RiboSlice的癌症疗法】
[0325] 根据实施例62或实施例63制备根据实施例1合成的封装靶向癌症相关基因的RiboSlice的脂质体。通过注射或静脉内输注来施用所述脂质体，并且每天监测肿瘤反应和干扰素血浆水平。
[0326] 【实施例66包含编码脂质体蛋白的RNA的疗法】
[0327] 根据实施例62或实施例63制备根据实施例1合成的封装编码治疗蛋白的合成RNA的脂质体。通过注射或静脉内输注来施用所述脂质体。
[0328] 【实施例67包含靶向BIRC5的RiboSlice和TNF-α的组合癌症疗法】
[0329] 向患者施用肿瘤坏死因子α(TNF-α)和封装靶向BIRC5的RiboSlice的脂质体的隔离肢体灌注(ILP)(参见实施例64)。在将肢体升温后，经大约5分钟将脂质体注射至体外ILP回路的动脉管线中，并且再进行灌注85分钟。在1-2天后，经3-5分钟重复用注射至体外ILP回路的动脉管线中的TNF-α进行ILP并且再继续灌注60分钟。每天监测肿瘤反应和干扰素血浆水平。
[0330] 【实施例68包含靶向BIRC5的RiboSlice和氟尿嘧啶(5-FU)的组合癌症疗法】[0331] 第1天，患者接受封装靶向BIRC5的RiboSlice的脂质体的60分钟静脉内输注(参见实施例64)，接着在第2天和第3天接受5-FU的46小时静脉内输注。每天监测肿瘤反应和干扰素血浆水平。
[0332] 【等效方案】
[0333] 本领域的技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文特定描述的具体实施方案的众多等效方案。这些等效方案旨在涵盖于以下权利要求书的范畴内。
[0334] 【以引用的方式并入】
[0335] 本文提及的所有专利和出版物特此以全文引用的方式并入。
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