通过电穿孔将Cas9 mRNA导入到哺乳动物的受精卵的方法
阅读：1016发布：2020-07-15
专利汇可以提供通过电穿孔将Cas9 mRNA导入到哺乳动物的受精卵的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种向 哺乳动物 的受精卵导入编码Cas9蛋白的mRNA(Cas9 mRNA)的方法，包括如下的各阶段：(a)在电穿孔用 电极 之间放置包含Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物；(b)以实现最低mRNA导入效率(Rmin)以上的mRNA导入效率(R)的 电压 和通电时间 对电极 间施加电压，最低mRNA导入效率(Rmin)由Cas9 mRNA浓度c(ng/μl)算出。，下面是通过电穿孔将Cas9 mRNA导入到哺乳动物的受精卵的方法专利的具体信息内容。
1.一种向哺乳动物的受精卵导入编码Cas9蛋白的mRNA、即Cas9 mRNA的方法，包括以下各阶段：
(a)在电穿孔用电极之间放置包含Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物；
(b)以实现最低mRNA导入效率Rmin以上的mRNA导入效率R的电压和通电时间对电极间施加电压，所述最低mRNA导入效率Rmin通过下式(A)由Cas9 mRNA浓度c算出，所述浓度c的单位是ng/μl，
式(A)Rmin＝882/c
其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约30V时，mRNA导入效率R是通过式(I)R＝
0.0005×t3-0.0057×t2+0.2847×t由通电时间t算出的值，
每1mm电极间距离的电压为约30V～约40V时，mRNA导入效率R是通过式(II)R＝0.0015×t3-0.0191×t2+0.9489×t由通电时间t算出的值，
每1mm电极间距离的电压为约40V～约50V时，mRNA导入效率R是通过式(III)R＝0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×t由通电时间t算出的值，
每1mm电极间距离的电压为约50V以上时，mRNA导入效率R是通过式(IV)R＝0.0078×t3-
0.1414×t2+3.0103×t由通电时间t算出的值，
所述通电时间t的单位是msec，
其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，电压与通电时间的积为每1mm电极间距离约990Vmsec以下。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
每1mm电极间距离的电压为约25V～约35V。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
每1mm电极间距离的电压为约30V。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
Cas9 mRNA浓度为约50ng/μl以上，每1mm电极间距离的电压为约20V以上，通电时间为约36msec以上。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
Cas9 mRNA浓度为约50ng/μl以上，每1mm电极间距离的电压为约30V以上，通电时间为约21msec以上。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
Cas9 mRNA浓度为约200ng/μl以上，每1mm电极间距离的电压为约20V以上，通电时间为约15msec以上。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
Cas9 mRNA浓度为约200ng/μl以上，每1mm电极间距离的电压为约30V以上，通电时间为约5msec以上。
8.一种向哺乳动物的受精卵导入Cas9 mRNA的方法，包括以下各阶段：
(a)在电穿孔用电极之间放置包含Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物；
(c)以实现最低mRNA导入效率Rmin以上的mRNA导入效率R的电压和通电时间对电极间施加电压，所述最低mRNA导入效率Rmin通过下式(B)由Cas9 mRNA浓度c算出，所述浓度c的单位是ng/μl，
式(B) Rmin＝441/c
其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约30V时，mRNA导入效率R是通过式(I)R＝
0.0005×t3-0.0057×t2+0.2847×t由通电时间t算出的值，
每1mm电极间距离的电压为约30V～约40V时，mRNA导入效率R是通过式(II)R＝0.0015×t3-0.0191×t2+0.9489×t由通电时间t算出的值，
每1mm电极间距离的电压为约40V～约50V时，mRNA导入效率R是通过式(III)R＝0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×t由通电时间t算出的值，
3
每1mm电极间距离的电压为约50V以上时，mRNA导入效率R是通过式(IV)R＝0.0078×t-
0.1414×t2+3.0103×t由通电时间t算出的值，
所述通电时间t的单位是msec，
其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，电压与通电时间的积为每1mm电极间距离约630Vmsec以下，电压可以分成2次以上的脉冲来施加；
(d)以实现最低mRNA导入效率Rmin以上的mRNA导入效率R的电压和通电时间对电极间施加与阶段(c)相反方向的电压，最低mRNA导入效率Rmin由式(B)算出，其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，电压与通电时间的积为每1mm电极间距离约630Vmsec以下，电压可以分成2次以上的脉冲来施加，
在阶段(c)和(d)中将电压分成2次以上的脉冲来施加时，可以在连续地施加一个方向的脉冲后施加相反方向的脉冲，也可以交替施加各方向的脉冲，还可以随机施加各方向的脉冲。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其使用啮齿目的受精卵。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其使用小鼠的受精卵。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，
Cas9蛋白是包含与序列号1～序列号4中的任一氨基酸序列具有约90％以上的序列同源性的氨基酸序列且gRNA依赖性地与DNA结合的蛋白质。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，
Cas9蛋白具有RuvC核酸酶活性和HNH核酸酶活性中的任一者或两者。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，
Cas9蛋白包含序列号1～序列号4中的任一氨基酸序列。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，
Cas9蛋白包含序列号1的氨基酸序列。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其中，
溶液包含1种或1种以上的进一步的核酸分子，该核酸分子为gRNA、或crRNA与tracrRNA的组合，该核酸分子与Cas9 mRNA一起被导入受精卵。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，
进一步的核酸分子为gRNA。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，
溶液进一步包含单链寡脱氧核苷酸、即ssODN。
18.一种表达Cas9的哺乳动物的受精卵的制造方法，包括通过权利要求1～17中任一项所述的方法向哺乳动物的受精卵导入Cas9 mRNA。
19.一种以哺乳动物的受精卵进行基因组编辑的方法，包括通过权利要求15～17中任一项所述的方法向哺乳动物的受精卵导入Cas9 mRNA和进一步的核酸分子。
20.一种经基因组编辑的哺乳动物的受精卵的制作方法，包括通过权利要求15～17中任一项所述的方法向哺乳动物的受精卵导入Cas9 mRNA和进一步的核酸分子。
21.一种基因修饰动物的制作方法，包括向受体动物移植通过权利要求20所述的方法得到的受精卵。
通过电穿孔将Cas9 mRNA导入到哺乳动物的受精卵的方法
技术领域
[0002] 本发明涉及一种通过电穿孔将编码Cas9蛋白的mRNA(Cas9 mRNA)导入到哺乳动物的受精卵的方法。本发明还涉及利用上述方法制造表达Cas9的哺乳动物的受精卵；利用哺乳动物的受精卵进行基因组编辑；制作经基因组编辑的哺乳动物的受精卵；或制作基因修饰动物。
背景技术
[0003] 目前，在包括医学和生物学的各种研究领域中，为了阐明生物的基本机制或者作为人的疾病模型而使用基因修饰动物。作为迅速的基因修饰动物的制作方法，ZFN(锌指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases))、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases))和CRISPR/Cas系统(成簇的规律间隔的短回文重复序列系统(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-Associated System))等利用人工限制酶的系统近年来备受关注。这些新的技术被称为基因组编辑，能够在不利用胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)的情况下对广范围的生物的基因组进行修饰。
[0004] 基于基因组编辑的基因修饰动物的制作通常通过向原核期胚胎显微注射人工限制酶的基因来进行。目前该方法为主流，但为了防止细胞的损伤，需要熟练的手技。进而，显微注射必须使用专用设备向原核期胚胎一个一个地注入DNA和/或RNA，在同时处理多个细胞时不方便。
[0005] 电穿孔是用于将靶基因导入到细胞或组织的有用方法，在许多物种中广泛使用。对于小鼠，该技术被用于包含胎儿和出生后的个体的脑、睾丸和肌肉的各种组织。另一方面，向受精卵的基因导入主要通过显微注射来进行。例如，为了将直链状DNA插入到基因组，使用向原核的显微注射，为了使期望的基因不插入到基因组、而是瞬时表达，使用环状质粒或mRNA的显微注射。最近建立的小鼠基因组编辑也通过将Cas9 mRNA和gRNA(指导RNA)或表达这些RNA的质粒一个一个地显微注射到受精卵的细胞质或原核来实施。显微注射需要较长的时间和熟练的手技，在基于基因组编辑的基因修饰小鼠的制作中成为技术上的限速步骤(非专利文献1)。
[0006] 迄今为止，几乎未使用电穿孔用于向小鼠受精卵导入基因。作为例外，报道了为了敲除内源性基因，通过电穿孔将不编码蛋白质的dsRNA导入到小鼠受精卵(非专利文献2)。该方法在电穿孔前需要利用酸性台氏液将透明带除去或薄化的处理，但已知透明带对着床前的胚胎而言是重要的结构，利用该酸性台氏液的处理对小鼠胚胎具有毒性作用，因此，该方法并不实用。另外，该方法仅导入小于1kb的短RNA。也报道了不进行酸性台氏液处理的电穿孔，但仅将500bp左右的dsDNA导入到小鼠的囊胚期胚胎(非专利文献3)。
[0007] 最近报道了通过电穿孔向未对透明带进行处理的大鼠受精卵导入Cas9mRNA和gRNA(非专利文献4)。在该报道中，尽管使用1000～2000ng/μl的高浓度的mRNA，但基因组编辑的效率非常低，仅小于9％的新生小鼠进行了基因组编辑。
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1：美国专利第8697359号
[0011] 非专利文献
[0012] 非专利文献1：Wang,H.et al.,Cell 153,910-918(2013)
[0013] 非专利文献2：Grabarek,JB.et al.,Genesis 32:269-276(2002)
[0014] 非专利文献3：Soares,ML.et al.,BMC Developmental Biology 2005,5:28[0015] 非专利文献4：Kaneko,T.et al.,Scientific Reports 4,6382(2014)
[0016] 非专利文献5：Peng,H.et al.,(2012)PLos ONE 7(8):e43748
[0017] 非专利文献6：Ohnishi Y.et al.,Nucleic Acids Research,2010,Vol.38,No.155141-5151
[0018] 非专利文献7：Mazari,E.et al.,Development(2014)141,2349-2359
[0019] 非专利文献8：Yasue A.,et al.,Scientific Reports 4,5705(2014)
[0020] 非专利文献9：Yang,H.et al.,Cell 154,1370-1379(2013)
[0021] 非专利文献10：Mashiko,D.et al.,Scientific Reports 3,3355(2013)
发明内容
[0022] 发明要解决的问题
[0023] 本发明人等进行了深入研究，结果确定了用于将Cas9 mRNA导入到哺乳动物的受精卵的电穿孔的最佳条件，完成了本发明。
[0024] 用于解决问题的技术方案
[0025] 本发明提供一种向哺乳动物的受精卵导入编码Cas9蛋白的mRNA(Cas9 mRNA)的方法，包括如下的各阶段：
[0027] (b)以实现最低mRNA导入效率(Rmin)以上的mRNA导入效率(R)的电压和通电时间对电极间施加电压，所述最低mRNA导入效率(Rmin)通过下式(A)由Cas9 mRNA浓度c(ng/μl)算出，
[0028] 式(A) Rmin＝882/c
[0029] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约30V时，mRNA导入效率(R)是通过式(I)R＝0.0005×t3-0.0057×t2+0.2847×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0030] 每1mm电极间距离的电压为约30V～约40V时，mRNA导入效率(R)是通过式(II)R＝0.0015×t3-0.0191×t2+0.9489×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0031] 每1mm电极间距离的电压为约40V～约50V时，mRNA导入效率(R)是通过式(III)R＝0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0032] 每1mm电极间距离的电压为约50V以上时，mRNA导入效率(R)是通过式(IV)R＝0.0078×t3-0.1414×t2+3.0103×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0033] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约990Vmsec以下。
[0034] 另外，本发明提供一种表达Cas9的哺乳动物的受精卵的制造方法，包括如下的各阶段：
[0035] (a)在电穿孔用电极之间放置包含Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物；
[0036] (b)以实现最低mRNA导入效率(Rmin)以上的mRNA导入效率(R)的电压和通电时间对电极间施加电压，所述最低mRNA导入效率(Rmin)通过下式(A)由Cas9 mRNA浓度c(ng/μl)算出，
[0037] 式(A) Rmin＝882/c
[0038] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约30V时，mRNA导入效率(R)是通过式(I)R＝0.0005×t3-0.0057×t2+0.2847×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0039] 每1mm电极间距离的电压为约30V～约40V时，mRNA导入效率(R)是通过式(II)R＝3 2
0.0015×t-0.0191×t+0.9489×t由通电时间t(msec)算出的值，
0.0015×t-0.0191×t+0.9489×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0040] 每1mm电极间距离的电压为约40V～约50V时，mRNA导入效率(R)是通过式(III)R＝0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×t，由通电时间t(msec)算出的值，
[0041] 每1mm电极间距离的电压为约50V以上时，mRNA导入效率(R)是通过式(IV)R＝3 2
0.0078×t-0.1414×t+3.0103×t由通电时间t(msec)算出的值，
0.0078×t-0.1414×t+3.0103×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0042] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约990Vmsec以下。
[0043] 另外，本发明提供一种方法，是以哺乳动物的受精卵进行基因组编辑的方法，包括如下的各阶段：
[0044] (a)在电穿孔用电极之间放置包含Cas9 mRNA和进一步的核酸分子的溶液与受精卵的混合物，在此，进一步的核酸分子是crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)的组合或gRNA；
[0045] (b)以实现最低mRNA导入效率(Rmin)以上的mRNA导入效率(R)的电压和通电时间对电极间施加电压，所述最低mRNA导入效率(Rmin)通过下式(A)由Cas9 mRNA浓度c(ng/μl)算出，
[0046] 式(A) Rmin＝882/c
[0047] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约30V时，mRNA导入效率(R)是通过式(I)R＝0.0005×t3-0.0057×t2+0.2847×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0048] 每1mm电极间距离的电压为约30V～约40V时，mRNA导入效率(R)是通过式(II)R＝0.0015×t3-0.0191×t2+0.9489×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0049] 每1mm电极间距离的电压为约40V～约50V时，mRNA导入效率(R)是通过式(III)R＝3 2
0.0005×t+0.0508×t+0.9922×t由通电时间t(msec)算出的值，
0.0005×t+0.0508×t+0.9922×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0050] 每1mm电极间距离的电压为约50V以上时，mRNA导入效率(R)是通过式(IV)R＝0.0078×t3-0.1414×t2+3.0103×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0051] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约990Vmsec以下。
[0052] 另外，本发明提供一种经基因组编辑的哺乳动物的受精卵的制作方法，包括如下的各阶段：
[0053] (a)在电穿孔用电极之间放置包含Cas9 mRNA和进一步的核酸分子的溶液与受精卵的混合物，在此，进一步的核酸分子是crRNA和tracrRNA的组合或gRNA，
[0054] (b)以实现最低mRNA导入效率(Rmin)以上的mRNA导入效率(R)的电压和通电时间对电极间施加电压，所述最低mRNA导入效率(Rmin)通过下式(A)由Cas9 mRNA浓度c(ng/μl)算出，
[0055] 式(A) Rmin＝882/c
[0056] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约30V时，mRNA导入效率(R)是通过式(I)3 2
R＝0.0005×t-0.0057×t+0.2847×t由通电时间t(msec)算出的值，
R＝0.0005×t-0.0057×t+0.2847×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0057] 每1mm电极间距离的电压为约30V～约40V时，mRNA导入效率(R)是通过式(II)R＝0.0015×t3-0.0191×t2+0.9489×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0058] 每1mm电极间距离的电压为约40V～约50V时，mRNA导入效率(R)是通过式(III)R＝3 2
0.0005×t+0.0508×t+0.9922×t由通电时间t(msec)算出的值，
0.0005×t+0.0508×t+0.9922×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0059] 每1mm电极间距离的电压为约50V以上时，mRNA导入效率(R)是通过式(IV)R＝0.0078×t3-0.1414×t2+3.0103×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0060] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约990Vmsec以下。
[0061] 另外，本发明提供一种基因修饰动物的制作方法，包括向受体动物移植通过上述方法得到的受精卵。
[0062] 发明效果
[0064] 图1-1示出序列号1的氨基酸序列。
[0065] 图1-2示出序列号2的氨基酸序列。
[0066] 图1-3示出序列号3的氨基酸序列。
[0067] 图1-4示出序列号4的氨基酸序列。
[0068] 图2示出电穿孔装置。
[0069] 图3示出在各种条件下将mCherry mRNA进行电穿孔而得到的胚胎的mCherry荧光强度和到囊胚期为止的存活率。
[0070] 图4是基于图3在各电压预测各通电时间下的mRNA导入效率而得到的图表。
[0071] 图5示出使用两个方向的脉冲将mCherry mRNA进行电穿孔而得到的胚胎的mCherry荧光强度和到囊胚期为止的存活率。
[0072] 图6示出基于电穿孔的CRISPR/Cas系统中的Fgf10的基因组编辑。
[0073] 图7示出使用高浓度Cas9 mRNA的基于电穿孔的基因组编辑。
[0074] 图8示出基于电穿孔的在mCherry基因座的利用ssODN(单链寡脱氧核苷酸(single-stranded oligodeoxynucleotide))的HDR(同源重组修复(Homology Directed Repair))。
[0075] 图9示出基于电穿孔的在mCherry基因座的利用ssODN的HDR。
具体实施方式
[0076] 只要没有特别具体规定，则本说明书中使用的术语具有有机化学、医学、药学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学、微生物学等领域中的本领域技术人员一般所理解的含义。以下记载了一些关于本说明书中使用的术语的定义，这些定义在本说明书中优先于一般的理解。
[0077] 在本说明中，数值伴有术语“约”时，则是指包含该值±10％的范围。数值的范围包含两个端点之间的全部数值和两个端点的数值。有关范围的“约”适用于该范围的两个端点。因此，例如，“约20～30”包含“20±10％～30±10％”。
[0078] 电穿孔
[0079] 本发明中使用的电穿孔仪是指电脉冲的发生装置，只要能够实施本发明的阶段(a)和(b)，则可以为任何电穿孔仪。电穿孔仪能够从例如BioRad公司、BTX公司、BEX公司、Intracel公司、Eppendorf公司等购入。
[0080] 在本发明中，“电穿孔用电极”包含以往的电穿孔法中使用的所有电极。例如可以举出由铂、金、铝等金属构成的电极。通常，2根电极空出约0.25mm～约10mm、例如约0.5mm～约4mm或约1mm～约2mm的间隙而配置，可以在该间隙放置包含Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物。电极可以为与用于放入混合物的容器组合的比色皿电极。电穿孔用电极可以从例如BioRad公司、BTX公司、BEX公司、Intracel公司、Eppendorf公司等购入。
[0081] 在本发明的阶段(a)中，包含Cas9 mRNA的溶液以例如约30ng/μl～约2000ng/μl、约50ng/μl～约1000ng/μl、约50ng/μl～约500ng/μl、约50ng/μl～约300ng/μl、约50ng/μl～约200ng/μl、约200ng/μl～约1000ng/μl、约200ng/μl～约500ng/μl或约200ng/μl～约300ng/μl的浓度包含Cas9 mRNA。在本发明的某实施方案中，溶液包含约200ng/μl Cas9 mRNA。在一定的电气条件下，溶液中的Cas9 mRNA的浓度越高，mRNA导入量变得越多。
[0082] 在本发明的阶段(a)中，包含Cas9 mRNA的溶液是在可以用于电穿孔的任意溶液中溶解Cas9 mRNA而成的溶液。可以用于电穿孔的溶液只要是在实施电穿孔期间受精卵能够生存的培养基或缓冲液即可，例如包含Opti-MEM I、PBS、HBS、HBSS、Hanks、HCMF等培养基或缓冲液。优选溶液不含血清。
[0083] 在本发明的阶段(a)中，在电穿孔用电极之间放置包含Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物。可以将包含Cas9 mRNA的溶液和受精卵的预先混合而成的混合物添加到电极间，也可以将包含Cas9 mRNA的溶液和受精卵分别添加到电极间。混合物以充满上述电极的间隙的体积、例如约1μl～约50μl、优选约1.5μl～约15μl，更优选约2μl～约10μl的体积使用。在本发明的某实施方案中，混合物的体积为约5μl。
[0084] 在本发明的阶段(b)中，以实现由Cas9 mRNA浓度规定的最低mRNA导入效率(Rmin)以上的mRNA导入效率(R)的方式对电极间施加电压。最低mRNA导入效率(Rmin)通过下式(A)由Cas9 mRNA浓度c(ng/μl)算出。
[0085] 式(A) Rmin＝882/c
[0086] 在本发明的阶段(b)中，mRNA导入效率依赖于对电极间施加的电压和通电时间。通电时间为t(msec)、每1mm电极间距离的电压为约20V～约30V时，mRNA导入效率通过式(I)R＝0.0005×t3-0.0057×t2+0.2847×t算出，通电时间为t(msec)、每1mm电极间距离的电压为约30V～约40V时，mRNA导入效率通过式(II)R＝0.0015×t3-0.0191×t2+0.9489×t算出，通电时间为t(msec)、每1mm电极间距离的电压为约40V～约50V时，mRNA导入效率通过式(III)R＝0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×t算出，通电时间为t(msec)、每1mm电极间距离的电压为约50V以上时，mRNA导入效率通过式(IV)R＝0.0078×t3-0.1414×t2+3.0103×t算出。其中，每1mm电极间距离的电压为约30V时，使用式(II)算出mRNA导入效率，每1mm电极间距离的电压为约40V时，使用式(III)算出mRNA导入效率，每1mm电极间距离的电压为约50V时，使用式(IV)算出mRNA导入效率。
[0087] 在本发明的阶段(b)中，mRNA导入效率(R)只要是由阶段(a)的溶液的Cas9mRNA浓度算出的最低mRNA导入效率(Rmin)以上即可。例如，Cas9 mRNA浓度为50ng/μl时，Rmin为17.6，R只要为17.6以上即可，例如为25以上，优选为27.1以上。例如，Cas9 mRNA浓度为
200ng/μl时，Rmin为4.41，R只要为4.41以上即可，优选为7.9以上，更优选为14.7以上，最优选为27.1以上。
200ng/μl时，Rmin为4.41，R只要为4.41以上即可，优选为7.9以上，更优选为14.7以上，最优选为27.1以上。
[0088] 例如，Cas9 mRNA浓度为50ng/μl时，Rmin为17.6。为了实现该Rmin以上的mRNA导入效率(R)，例如，每1mm电极间距离施加约20V的电压约31msec以上，施加约30V的电压约17msec以上，施加约40V的电压约11msec以上，施加约50V的电压约7.5msec以上。优选每1mm电极间距离施加约20V的电压约36msec以上，施加约30V的电压约21msec以上，施加约40V的电压约14msec以上，施加约50V的电压约11msec以上。特别优选每1mm电极间距离施加约20V的电压约37msec以上，施加约30V的电压约22msec以上，施加约40V的电压约15msec以上或施加约
50V的电压约12msec以上。在某实施方案中，每1mm电极间距离施加约30V的电压约21msec。
50V的电压约12msec以上。在某实施方案中，每1mm电极间距离施加约30V的电压约21msec。
[0089] 例如，Cas9 mRNA浓度为200ng/μl时，Rmin为4.41。为了实现该Rmin以上的mRNA导入效率(R)，例如每1mm电极间距离施加约20V的电压约15msec以上，施加约30V的电压约5msec以上，施加约40V的电压约3.8msec以上，施加约50V的电压约1.6msec以上。优选每1mm电极间距离施加约20V的电压约21msec以上，施加约30V的电压约9msec以上，施加约40V的电压约6msec以上，施加约50V的电压约3msec以上。更优选每1mm电极间距离施加约20V的电压约29msec以上，施加约30V的电压约15msec以上，施加约40V的电压约10msec以上，施加约50V的电压约6msec以上。特别优选每1mm电极间距离施加约20V的电压约37msec以上，施加约
30V的电压约22msec以上，施加约40V的电压约15msec以上或施加约50V的电压约12msec以上。在某实施方案中，每1mm电极间距离施加约30V的电压约21msec。
30V的电压约22msec以上，施加约40V的电压约15msec以上或施加约50V的电压约12msec以上。在某实施方案中，每1mm电极间距离施加约30V的电压约21msec。
[0090] 在本发明的阶段(b)中，mRNA导入效率随着电压和通电时间而增加，但若电压过高或者若通电时间过长，则存在受精卵存活率降低的趋势。在本发明的阶段(b)中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，优选为约20V～约40V，进一步优选为约25V～约35V，最优选为约30V。关于通电时间，以电压和通电时间的积为每1mm电极间距离约990Vmsec以下、进一步优选约810msec以下、更优选约630Vmsec以下的方式进行设定。
[0091] 阶段(b)中的电压可以为恒定，也可以变动。在本发明的某实施方案中，阶段(b)中的电压为恒定。此时，作为电穿孔仪，可以使用以往的矩形脉冲式电穿孔仪。
[0092] 在本发明的某实施方案中，将电压分成多个脉冲来施加。例如，将电压分成2次～15次、3次～11次、5次～9次或6次～8次的脉冲来施加。在本发明的某实施方案中，将电压分成7次的脉冲来施加。各脉冲的时间例如为约0.01msec～约33msec、约0.5msec～约15msec、约1msec～约10msec、约2msec-约5msec，例如约3msec。各脉冲间的间隔例如为约0.5～约
500msec，优选为约5～约250msec，更优选为约10～约150msec，进一步优选为约80～
120msec。在本发明的某实施方案中，脉冲间的间隔为约97msec。
500msec，优选为约5～约250msec，更优选为约10～约150msec，进一步优选为约80～
120msec。在本发明的某实施方案中，脉冲间的间隔为约97msec。
[0093] 在本发明中，将电压分成多个脉冲来施加时，各脉冲的大小可以相同，也可以不同。
[0094] 在本发明中，将电压分成多个脉冲来施加时，各脉冲的方向可以相同，也可以至少1个脉冲的方向与其它脉冲相反。另外，使用两个方向的脉冲时，各方向的脉冲可以为任何顺序。例如，可以在连续地施加一个方向的脉冲后施加相反方向的脉冲，也可以交替施加各方向的脉冲，还可以随机施加各方向的脉冲。
[0095] 在本发明中，“相反方向的脉冲”是指相对于将2根电穿孔用电极中的1根作为阳极、另1根作为阴极的脉冲，将阳极和阴极调换时的脉冲。同样地，“相反方向的电压”是指相对于将2根电穿孔用电极中的1根作为阳极、另1根作为阴极的电压，将阳极和阴极调换时的电压。
[0096] 在本发明中，可以实施下述的阶段(c)和(d)代替阶段(b)。
[0097] 包含如下的各阶段：(c)以实现最低mRNA导入效率(Rmin)以上的mRNA导入效率(R)的电压和通电时间对电极间施加电压，所述最低mRNA导入效率(Rmin)通过下式(B)由Cas9 mRNA浓度c(ng/μl)算出，
[0098] 式(B) Rmin＝441/c
[0099] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约30V时，mRNA导入效率(R)是通过式(I)R＝0.0005×t3-0.0057×t2+0.2847×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0100] 每1mm电极间距离的电压为约30V～约40V时，mRNA导入效率(R)是通过式(II)R＝0.0015×t3-0.0191×t2+0.9489×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0101] 每1mm电极间距离的电压为约40V～约50V时，mRNA导入效率(R)是通过式(III)R＝0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0102] 每1mm电极间距离的电压为约50V以上时，mRNA导入效率(R)是通过式(IV)R＝0.0078×t3-0.1414×t2+3.0103×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0103] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下，优选为540Vmsec以下，电压可以分成2次以上的脉冲来施加；
[0104] (d)以实现最低mRNA导入效率(Rmin)以上的mRNA导入效率(R)的电压和通电时间对电极间施加与阶段(c)方向相反的电压，所述最低mRNA导入效率(Rmin)通过式(B)算出，其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下，优选为540Vmsec以下，电压可以分成2次以上的脉冲来施加，
[0105] 在阶段(c)和(d)中将电压分成2次以上脉冲来施加时，可以在连续地施加一个方向的脉冲后施加相反方向的脉冲，也可以交替施加各方向的脉冲，还可以随机施加各方向的脉冲。
[0106] 在阶段(c)和(d)中，可以依据阶段(b)来决定电压和通电时间等条件。
[0107] 基因组编辑
[0108] 在本发明中，“基因组编辑”是指使用人工限制酶对哺乳动物细胞中的1种或1种以上的基因进行修饰。通过基因组编辑对等位基因中的一者或两者进行修饰。在本发明中，使用源自细菌的CRISPR/Cas系统进行基因组编辑。CRISPR/Cas系统的详细情况记载于例如Wang,H.et al.,Cell,153,910-918(2013)和美国专利第8697359号中，通过引用将这些文献作为本说明书的一部分。
[0109] 一般而言，基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑需要核酸内切酶Cas9蛋白和gRNA。gRNA是将细菌的crRNA和tracrRNA组合而形成一个嵌合RNA而得到的。因此，gRNA兼具crRNA的靶序列特异性和成为Cas9蛋白的骨架的tracrRNA的特性。若gRNA和Cas9在细胞内表达，则能够永久地修饰基因组内的靶序列。
[0110] gRNA/Cas9蛋白复合物通过gRNA序列与基因组DNA内的靶序列的互补性碱基结合而募集到靶序列。为了使gRNA/Cas9蛋白复合物与靶序列结合，基因组内的靶序列必须在紧接在靶序列之后含有PAM(前间区序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif))序列。gRNA/Cas9蛋白复合物向靶序列的结合使Cas9蛋白局部化定位于基因组内的靶序列，Cas9蛋白切断DNA的两条链，引起DSB(双链断裂(Double Strand Break))。DSB可以通过NHEJ(非同源末端连接(Non-Homologous End Joining))DNA修复途径或HDR(同源重组修复)途径来修复。NHEJ修复途径总是对DSB的位点赋予碱基的插入/缺失，这可能会带来移码和/或终止密码子，破坏靶基因的开放阅读框。为了修复DSB，HDR途径需要存在修复模板。在HDR中，修复模板的序列被忠实地复制到经切断的靶序列。可以利用修复模板和HDR向靶基因导入期望的突变。
[0111] Cas9蛋白
[0112] 野生型Cas9蛋白具有RuvC和HNH这两个功能性核酸酶结构域，它们各自切断DNA的双链的不同的链。这两个结构域为活性时，Cas9蛋白在基因组DNA引起DSB(双链断裂)。也开发了仅具有RuvC或HNH中的任一催化活性的Cas9蛋白。此时，Cas9蛋白仅切断靶DNA中的任一链。例如，源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9蛋白的RuvC结构域通过D10A突变而失活，HNH结构域通过H840A突变而失活。
[0113] Cas9蛋白的DNA结合活性独立于其核酸酶活性。即使在承担核酸酶活性的RuvC和HNH为无活性且Cas9蛋白完全不具有核酸酶活性的情况下，Cas9蛋白仍保持gRNA依赖性地与DNA结合的能力。因此，可以将作为核酸酶无活性的Cas9蛋白(dCas9蛋白)作为分子生物学工具来利用。例如，可以通过利用gRNA使dCas9蛋白与已知的转录调节结构域结合，由此作为活化或抑制基因表达的转录调节因子。例如，与转录活化因子融合的dCas9蛋白能够活化靶序列的转录。相反，若仅dCas9蛋白与靶序列结合，则能够抑制转录。通过选择位于接近基因的启动子的区域的gRNA靶序列，能够调节各种基因的转录。或者，在染色质免疫沉淀等中，通过将与表位标签融合的dCas9蛋白与以任意的基因组DNA序列为靶gRNA一起使用，能够纯化基因组DNA。也可以将与GFP、mcherry等荧光蛋白标记融合的dCas9蛋白与以任意的基因组DNA序列为靶的gRNA组合，用作在活细胞中能够检测的DNA标记。
[0114] 在本发明中，“Cas9蛋白”是指具有gRNA依赖性地与DNA结合的能力的蛋白质，包含具有RuvC和HNH核酸酶活性这两者的物质，也包含不具有RuvC和HNH核酸酶活性中的任一者或两者的物质。Cas9蛋白的DNA结合活性和核酸酶活性可以通过例如Samuel H.Sternberg et al.,Nature 507,62-67(2014)中记载的方法来测定，所述Samuel H.Sternberg et al.,Nature 507,62-67(2014)通过引用而作为本说明书的一部分。
[0115] 在本发明中，“Cas9 mRNA”是指编码Cas9蛋白的mRNA，只要是能够翻译成Cas9蛋白的氨基酸序列，则可以具有任何核苷酸序列。
[0116] 在本发明的某实施方案中，Cas9蛋白源自具有CRISPR系统的细菌。已知具有CRISPR系统的细菌包含属于如下属的细菌：气热菌属(Aeropyrum)、火棒菌属(Pyrobaculum)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、古球菌属(Archaeoglobus)、盐盒菌属(Halocarcula)、甲烷杆菌属(Methanobacteriumn)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷嗜热菌属(Methanopyrus)、火球菌属(Pyrococcus)、嗜苦菌属(Picrophilus)、热原体属(Thermoplasma)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、产液菌属(Aquifex)、卟啉菌属
(Porphyromonas)、绿菌属(Chlorobium)、栖热菌属(Thermus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、李斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属(Clostridium)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、支原体属(Mycoplasma)、梭杆菌属(Fusobacterium)、固氮弧菌属(Azoarcus)、色杆菌属(Chromobacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)、亚硝酸菌属(Nitrosomonas)、脱硫化弧菌属(Desulfovibrio)、地杆菌属(Geobacter)、微球菌属(Micrococcus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、沃林氏菌属(Wolinella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、军团菌属(Legionella)、甲基球菌属(Methylococcus)、巴斯德菌属(Pasteurella)、发光杆菌属(Photobacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、黄单胞杆菌属(Xanthomonas)、耶尔辛氏菌属(Yersinia)、密螺旋体属(Treponema)和热袍菌属(Thermotoga)等。例如，Cas9蛋白源自酿脓链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)等细菌。
(Porphyromonas)、绿菌属(Chlorobium)、栖热菌属(Thermus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、李斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属(Clostridium)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、支原体属(Mycoplasma)、梭杆菌属(Fusobacterium)、固氮弧菌属(Azoarcus)、色杆菌属(Chromobacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)、亚硝酸菌属(Nitrosomonas)、脱硫化弧菌属(Desulfovibrio)、地杆菌属(Geobacter)、微球菌属(Micrococcus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、沃林氏菌属(Wolinella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、军团菌属(Legionella)、甲基球菌属(Methylococcus)、巴斯德菌属(Pasteurella)、发光杆菌属(Photobacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、黄单胞杆菌属(Xanthomonas)、耶尔辛氏菌属(Yersinia)、密螺旋体属(Treponema)和热袍菌属(Thermotoga)等。例如，Cas9蛋白源自酿脓链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)等细菌。
[0118] 在本发明的某实施方案中，Cas9蛋白可以为如下的蛋白质：包含与图1所示的序列号1～序列号4中的任一氨基酸序列具有约80％以上的序列同源性的氨基酸序列，且具有Cas9蛋白的gRNA依赖性DNA结合活性，根据情况具有RuvC核酸酶活性和HNH核酸酶活性中的任一者或两者。例如，Cas9蛋白包含序列号1～序列号4中的任一氨基酸序列，或者由序列号1～序列号4中的任一氨基酸序列构成。或者，Cas9蛋白可以为如下的蛋白质：包含与序列号
1的氨基酸序列具有约80％以上的序列同源性的氨基酸序列，且具有Cas9蛋白的gRNA依赖性DNA结合活性，根据情况具有RuvC和/或HNH核酸酶活性。例如，Cas9蛋白包含序列号1的氨基酸序列，或者由序列号1的氨基酸序列构成。序列号1～序列号4分别为源自酿脓链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜热链球菌、齿垢密螺旋体的Cas9蛋白的氨基酸序列。
1的氨基酸序列具有约80％以上的序列同源性的氨基酸序列，且具有Cas9蛋白的gRNA依赖性DNA结合活性，根据情况具有RuvC和/或HNH核酸酶活性。例如，Cas9蛋白包含序列号1的氨基酸序列，或者由序列号1的氨基酸序列构成。序列号1～序列号4分别为源自酿脓链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜热链球菌、齿垢密螺旋体的Cas9蛋白的氨基酸序列。
[0119] 在本发明的某实施方案中，Cas9蛋白包含与序列号1～序列号4中的任一氨基酸序列具有约80％以上、例如约85％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、更优选约97％以上、更优选约98％以上、更优选约99％以上、更优选约99.5％以上的序列同源性的氨基酸序列。氨基酸序列同源性是指将序列最佳比对时，在2个序列中相同的氨基酸残基的比例。因此，例如，90％氨基酸序列同源性是指在最佳比对的2个氨基酸序列中90％的氨基酸相同。氨基酸序列的比对和同源性的计算方法对于本领域技术人员是总所周知的，例如可以利用BLAST等程序。
[0120] 通过将编码期望的Cas9蛋白的氨基酸序列的DNA克隆到体外转录用载体并在体外转录，能够得到Cas9 mRNA。适合的体外转录用载体对于本领域技术人员是公知的。克隆有编码Cas9蛋白的DNA的体外转录用载体也是公知的，例如包括可以从Origene公司购入的pT7-Cas9。体外转录的方法对于本领域技术人员是公知的。
[0121] 在本发明的某实施方案中，包含Cas9 mRNA的溶液包含1种或2种以上的进一步的核酸分子，该核酸分子与Cas9 mRNA一起被导入受精卵。进一步的核酸分子可以为例如gRNA、crRNA、tracrRNA或ssODN，可以使用gRNA单独、crRNA和tracrRNA的组合、gRNA和ssODN的组合或crRNA、tracrRNA和ssODN的组合。
[0122] 相对于Cas9 mRNA的浓度，溶液中的gRNA的浓度以重量计可以为1：20～1：1，例如1：2。例如，溶液可以包含200ng/μl的Cas9 mRNA和100ng/μl的gRNA。相对于Cas9 mRNA的浓度，溶液中的crRNA和tracrRNA的浓度以重量计可以为1：1：20～1：1：1，例如1：1：2。例如，溶液可以包含200ng/μl的Cas9 mRNA、100ng/μl的crRNA和100ng/μl的tracrRNA。溶液中的ssODN的浓度可以为200～1000ng/μl，例如600ng/μl。
[0123] gRNA
[0124] 基因组编辑需要靶特异性的gRNA。在本发明中，“指导RNA”或“gRNA”是指crRNA和tracrRNA融合而成的人工单链RNA。在crRNA与tracrRNA之间可以存在接头序列。Cas9蛋白可以在gRNA的存在下与基因组DNA靶特异性地结合。
[0125] crRNA源自细菌的内源性RNA，承担gRNA的序列特异性。在本发明中，crRNA包含基因组DNA内的靶序列或与其互补的序列。作为靶序列，选择在基因组DNA内且紧接在其之后具有PAM序列的核苷酸序列。靶序列可以位于基因组DNA的任一链。可以利用能够用于靶序列的选择和/或gRNA的设计的多种工具以及通过生物信息学预测的关于各种种类的各种基因的靶序列的列表，例如可以举出通过引用而作为本说明书的一部分的Feng Zhang lab's Target Finder，Michael Boutros lab's Target Finder(E-CRISP)，RGEN Tools:Cas-OFFinder，CasFinder:Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes，CRISPR Optimal Target Finder等。
[0126] 为了使Cas9蛋白与DNA结合，基因组DNA内的靶序列需要在紧接靶序列之后具有PAM序列。PAM序列存在于基因组DNA内的紧接靶序列之后，但不存在于gRNA内的紧接靶序列之后。Cas9蛋白也可以与紧接靶序列之后具有PAM序列的任何DNA序列结合。PAM序列根据Cas9蛋白源自的细菌种类而不同。最广泛使用的Cas9蛋白源自酿脓链球菌，对应的PAM序列是位于紧接靶序列的3’末端之后的NGG序列。已知有各种细菌的菌种和PAM序列的组合，例如可以举出：脑膜炎奈瑟氏菌：NNNNGATT；嗜热链球菌：NNAGAA；齿垢密螺旋体：NAAAAC等。在这些序列中，N表示A、T、G和C中的任一碱基。
[0127] tracrRNA与crRNA的一部分互补地结合，形成发夹结构。该结构被Cas9识别，形成crRNA、tracrRNA和Cas9的复合物。因此，tracrRNA承担gRNA的Cas9蛋白结合能力。tracrRNA源自细菌的内源性RNA，根据细菌的菌种而具有不同的序列。本发明的tracrRNA可以为上述已知具有CRISPR系统的细菌的RNA，优选用于基因组编辑的tracrRNA和Cas9蛋白源自相同细菌的菌种。例如可以使用酿脓链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、嗜热链球菌、齿垢密螺旋体的tracrRNA。
[0128] 通过将具有期望的gRNA序列的DNA克隆到体外转录用载体并在体外转录，能够得到gRNA。适合的体外转录用载体对于本领域技术人员是公知的。另外，包含gRNA的靶序列以外的序列的体外转录用载体在该领域中是公知的。通过合成靶序列的寡核苷酸并插入到这样的载体进行体外转录，能够得到gRNA。这样的载体包含例如可以从addgene购入的pUC57-sgRNA expression vector、pCFD1-dU6:1gRNA、pCFD2-dU6:2gRNA pCFD3-dU6:3gRNA、pCFD4-U6:1_U6:3tandemgRNAs、pRB17、pMB60、DR274、SP6-sgRNA-scaffold、pT7-gRNA、DR274、pUC57-Simple-gRNA backbone以及可以从Origene公司购入的pT7-Guide-IVT。体外转录方法对于本领域技术人员是公知的。
[0129] 可以使用crRNA和tracrRNA的组合代替gRNA。使用crRNA和tracrRNA的组合时，crRNA和tracrRNA分别是经分离的RNA分子，它们的重量比可以为1：10～10：1，例如1：1。
[0130] HDR(同源重组修复)
[0131] 在CRISPR/Cas系统中，也可以利用HDR对靶序列的特定的核苷酸进行修饰。为了通过HDR对基因组DNA序列内的核苷酸进行修饰，在进行HDR时，必须存在包含期望的序列的DNA修复模板。在本发明的某实施方案中，可以使用ssODN(单链寡脱氧核苷酸)作为DNA修复模板。ssODN与DSB的上游和下游的序列具有高同源性。各同源性区域的长度和位置依赖于要导入的修饰尺寸。在适合的模板的存在下，HDR能够在基于Cas9蛋白的DSB的位点对特定的核苷酸进行修饰。在设计ssODN时，以被修复的基因不会被Cas9蛋白切断的方式并且以不包括紧接其后具有PAM序列的靶序列的方式设计ssODN。例如，通过使与PAM序列对应的序列在ssODN中为其它序列，能够使ssODN不被Cas9蛋白切断。ssODN的设计方法的详细情况记载于例如通过引用而作为本说明书的一部分的Yang,H.et al.,Cell,154(6),1370-9(2013)中。ssODN通常与gRNA和Cas9 mRNA一起被导入细胞中。
[0132] 在本发明中，“向受精卵导入编码Cas9蛋白的mRNA”或“向受精卵导入Cas9 mRNA”是指以在经电穿孔的受精卵或源自该受精卵的细胞的至少1个中能够表达Cas9蛋白的量向受精卵导入Cas9 mRNA。优选以在经电穿孔后的受精卵或源自该受精卵的至少1个细胞中能够在gRNA的存在下引起基因组中的至少1个靶基因的基因组编辑的量向受精卵导入Cas9 mRNA。
[0133] 在本发明的某实施方案中，本发明的方法进一步包括确认引起基因组编辑的阶段。可以通过本领域中已知的各种方法来确认引起基因组编辑这一点。例如，已知靶基因的表型时，可以通过检测其表型的变化或者在受精卵或由受精卵产生的胚胎的细胞中对包含靶序列的基因组DNA的序列进行测序来确认。在HDR的情况下，也可以通过向ssODN导入限制酶切断位点而以RFLP(限制性片段长度多态性)进行评价。这些方法在本领域中是众所周知的。
[0134] 在本发明中，“哺乳动物”包含归类为哺乳纲的所有生物。哺乳动物包含例如灵长目(例如，猴子、人等)、啮齿目(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等)、牛、猪、羊、山羊、马、狗、猫、兔子等。在某实施方案中，哺乳动物为啮齿目。在某实施方案中，哺乳动物为小鼠。
[0135] 在本发明中，“受精卵”是指受精后的卵或胚胎，包含受精卵(1细胞期)和从2细胞期到囊胚期为止的发育初期胚胎。受精卵可以为在体内或体外受精的受精卵，也可以以卵子或受精卵的形式冷冻保存。受精卵的制备、培养和保存方法在本领域中是公知的。优选在用于电穿孔之前，利用电穿孔用溶液对受精卵进行清洗，除去培养基。在本发明的某实施方案中，受精卵为1细胞期～桑椹胚期，优选为1细胞期～8细胞期，更优选为1细胞期～4细胞期，进一步优选为1细胞期～2细胞期，例如1细胞期的受精卵。在本发明的某实施方案中，在受精约6小时以后，优选约9小时以后，更优选约12小时以后实施电穿孔。在本发明的某实施方案中，在受精约6小时～约18小时后，优选约9小时～约15小时后，更优选约11小时～13小时后，例如约12小时后实施电穿孔。受精卵通常具有被称为透明带的保护膜。透明带可以通过酸性台氏液处理等来除去或薄化，但在本发明的方法中，透明带可以除去或薄化，也可以不除去或薄化。优选使用未将透明带除去或薄化的受精卵。
[0136] 本发明的某实施方案包括培养经电穿孔的受精卵来确认受精卵的存活的阶段。受精卵的培养方法对于本领域技术人员是众所周知的。可以通过在电穿孔后观察引起受精卵的至少一次细胞分裂的这一点来确认受精卵的存活。
[0137] 在本发明的某实施方案中，能够得到经基因组编辑的哺乳动物的受精卵。另外，本发明的某实施方案提供基因修饰动物的制作方法，包括向受体动物移植通过本发明的方法而得到的受精卵。受体动物通常为与受精卵相同的动物物种的假孕状态的雌性，将受精卵移植到其输卵管中。根据受精卵(胚胎)的发育阶段，有时也可以移植到子宫。移植了受精卵的受体动物可以生产基因修饰动物。基因修饰动物的制作方法对于本领域技术人员是公知的，例如使用通过引用而作为本说明书的一部分的Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,Fourth Edition(Cold Spring Harbor Press)中记载的方法。
[0138] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0139] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物；
[0140] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约20V以上的电压约15msec以上或每1mm电极间距离约30V以上的电压约9msec以上，
[0141] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约990Vmsec以下。
[0142] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0143] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物；
[0144] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0145] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约990Vmsec以下。
[0146] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0147] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约50ng/μl以上的Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物；
[0148] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约990Vmsec以下。
[0149] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0150] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物；
[0151] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约20V以上的电压约15msec以上或每1mm电极间距离施加约30V以上的电压约9msec以上，
[0152] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0153] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0154] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物；
[0155] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0156] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0157] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0158] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约50ng/μl以上的Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物；
[0159] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0160] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0161] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0162] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0163] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约20V以上的电压约15msec以上或每1mm电极间距离约30V以上的电压约9msec以上，
[0164] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0165] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0166] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0167] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0168] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0169] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0170] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约50ng/μl以上的Cas9 mRNA的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0171] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0172] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0173] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0174] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA和gRNA的溶液与受精卵的混合物，
[0175] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约20V以上的电压约15msec以上或每1mm电极间距离约30V以上的电压约9msec以上，
[0176] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0177] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0178] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA、crRNA和tracrRNA的溶液与受精卵的混合物；
[0179] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约20V以上的电压约15msec以上或每1mm电极间距离约30V以上的电压约9msec以上，
[0180] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0181] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0182] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA、gRNA和ssODN的溶液与受精卵的混合物；
[0183] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约20V以上的电压约15msec以上或每1mm电极间距离约30V以上的电压约9msec以上，
[0184] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0185] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0186] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA、crRNA、tracrRNA和ssODN的溶液与受精卵的混合物；
[0187] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约20V以上的电压约15msec以上或每1mm电极间距离约30V以上的电压约9msec以上，
[0188] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0189] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0190] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA和gRNA的溶液与受精卵的混合物；
[0191] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0192] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0193] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0194] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA、crRNA和tracrRNA的溶液与受精卵的混合物；
[0195] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0196] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0197] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0198] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA、gRNA和ssODN的溶液与受精卵的混合物；
[0199] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0200] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0201] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0202] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA、crRNA、tracrRNA和ssODN的溶液与受精卵的混合物；
[0203] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0204] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0205] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0206] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约50ng/μl以上的Cas9 mRNA和gRNA的溶液与受精卵的混合物；
[0207] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0208] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0209] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0210] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约50ng/μl以上的Cas9 mRNA、crRNA和tracrRNA的溶液与受精卵的混合物；
[0211] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0212] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0213] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0214] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约50ng/μl以上的Cas9 mRNA、gRNA和ssODN的溶液与受精卵的混合物；
[0215] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0216] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0217] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0218] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约50ng/μl以上的Cas9 mRNA、crRNA、tracrRNA和ssODN的溶液与受精卵的混合物；
[0219] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0220] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0221] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0222] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA和gRNA的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0223] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约20V以上的电压约15msec以上或每1mm电极间距离约30V以上的电压约9msec以上，
[0224] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0225] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0226] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA、crRNA和tracrRNA的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0227] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约20V以上的电压约15msec以上或每1mm电极间距离约30V以上的电压约9msec以上，
[0228] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0229] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0230] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA、gRNA和ssODN的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0231] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约20V以上的电压约15msec以上或每1mm电极间距离约30V以上的电压约9msec以上，
[0232] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0233] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0234] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA、crRNA、tracrRNA和ssODN的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0235] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约20V以上的电压约15msec以上或每1mm电极间距离约30V以上的电压约9msec以上，
[0236] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0237] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0238] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA和gRNA的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0239] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0240] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0241] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0242] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA、crRNA和tracrRNA的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0243] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0244] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0245] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0246] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA、gRNA和ssODN的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0247] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0248] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0249] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0250] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约200ng/μl以上的Cas9 mRNA、crRNA、tracrRNA和ssODN的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0251] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0252] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0253] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0254] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约50ng/μl以上的Cas9 mRNA和gRNA的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0255] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0256] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0257] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0258] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约50ng/μl以上的Cas9 mRNA、crRNA和tracrRNA的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0259] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0260] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0261] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0262] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约50ng/μl以上的Cas9 mRNA、gRNA和ssODN的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0263] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0264] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0265] 在某实施方案中，本发明的方法包括如下的各阶段：
[0266] (a)在电穿孔用电极之间放置包含约50ng/μl以上的Cas9 mRNA、crRNA、tracrRNA和ssODN的溶液与1细胞期的受精卵的混合物；
[0267] (b)对电极间施加每1mm电极间距离约30V以上的电压约21msec以上，
[0268] 其中，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0269] 下面将示例本发明的实施方式。
[0270] [1]一种向哺乳动物的受精卵导入编码Cas9蛋白的mRNA(Cas9 mRNA)的方法，包括如下的各阶段：
[0271] (a)在电穿孔用电极之间放置包含Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物，
[0272] (b)以实现最低mRNA导入效率(Rmin)以上的mRNA导入效率(R)的电压和通电时间对电极间施加电压，所述最低mRNA导入效率(Rmin)通过下式(A)由Cas9 mRNA浓度c(ng/μl)算出，
[0273] 式(A) Rmin＝882/c
[0274] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约30V时，mRNA导入效率(R)是通过式(I)R＝0.0005×t3-0.0057×t2+0.2847×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0275] 每1mm电极间距离的电压为约30V～约40V时，mRNA导入效率(R)是通过式(II)R＝3 2
0.0015×t-0.0191×t+0.9489×t由通电时间t(msec)算出的值，
0.0015×t-0.0191×t+0.9489×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0276] 每1mm电极间距离的电压为约40V～约50V时，mRNA导入效率(R)是通过式(III)R＝0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0277] 每1mm电极间距离的电压为约50V以上时，mRNA导入效率(R)是通过式(IV)R＝3 2
0.0078×t-0.1414×t+3.0103×t由通电时间t(msec)算出的值，
0.0078×t-0.1414×t+3.0103×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0278] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约990Vmsec以下。
[0279] [2]根据项目[1]所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约40V。
[0280] [3]根据项目[1]或项目[2]所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约25V～约35V。
[0281] [4]根据项目[1]～项目[3]中任一项所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约30V。
[0282] [5]根据项目[1]～项目[4]中任一项所述的方法，其中，mRNA浓度为约50ng/μl～约1000ng/μl。
[0283] [6]根据项目[1]～项目[5]中任一项所述的方法，其中，mRNA浓度为约50ng/μl-约200ng/μl。
[0284] [7]根据项目[1]～项目[6]中任一项所述的方法，其中，mRNA浓度为约50ng/μl以上，mRNA导入效率为约25以上。
[0285] [8]根据项目[7]所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约20V以上，通电时间为约36msec以上。
[0286] [9]根据项目[7]所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约30V以上，通电时间为约21msec以上。
[0287] [10]根据项目[7]所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约40V以上，通电时间为约14msec以上。
[0288] [11]根据项目[7]所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约50V以上，通电时间为约11msec以上。
[0289] [12]根据项目[1]～项目[6]中任一项所述的方法，其中，mRNA浓度为约200ng/μl以上，mRNA导入效率为约4.41以上。
[0290] [13]根据项目[12]所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约20V以上，通电时间为约15msec以上。
[0291] [14]根据项目[12]所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约30V以上，通电时间为约5msec以上。
[0292] [15]根据项目[12]所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约30V以上，通电时间为约9msec以上。
[0293] [16]根据项目[12]所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约40V以上，通电时间为约3.8msec以上。
[0294] [17]根据项目[12]所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压为约50V以上，通电时间为约1.6msec以上，。
[0295] [18]根据项目[1]～项目[17]中任一项所述的方法，其中，电压是恒定的。
[0296] [19]根据项目[1]～项目[18]中任一项所述的方法，其中，每1mm电极间距离的电压与总通电时间的积为约630Vmsec以下。
[0297] [20]根据项目[1]～项目[19]中任一项所述的方法，其中，将电压分成2次～15次的脉冲来施加。
[0298] [21]根据项目[1]～项目[20]中任一项所述的方法，将电压分成5次～11次的脉冲来施加。
[0299] [22]根据项目[20]或项目[21]所述的方法，其中，在脉冲间空出约10～约150msec的间隔。
[0300] [23]根据项目[20]～项目[22]中任一项所述的方法，其中，各脉冲的方向相同。
[0301] [24]根据项目[20]～项目[22]中任一项所述的方法，其中，至少1个脉冲的方向与其它脉冲相反。
[0302] [25]一种向哺乳动物的受精卵导入Cas9 mRNA的方法，包括如下的各阶段：
[0303] (a)在电穿孔用电极之间放置包含Cas9 mRNA的溶液与受精卵的混合物；
[0304] (c)以实现最低mRNA导入效率(Rmin)以上的mRNA导入效率(R)的电压和通电时间对电极间施加电压，所述最低mRNA导入效率(Rmin)通过下式(B)由Cas9 mRNA浓度c(ng/μl)算出，
[0305] 式(B) Rmin＝441/c
[0306] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约30V时，mRNA导入效率(R)是通过式(I)R＝0.0005×t3-0.0057×t2+0.2847×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0307] 每1mm电极间距离的电压为约30V～约40V时，mRNA导入效率(R)是通过式(II)R＝0.0015×t3-0.0191×t2+0.9489×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0308] 每1mm电极间距离的电压为约40V～约50V时，mRNA导入效率(R)是通过式(III)R＝0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0309] 每1mm电极间距离的电压为约50V以上时，mRNA导入效率(R)是通过式(IV)R＝0.0078×t3-0.1414×t2+3.0103×t由通电时间t(msec)算出的值，
[0310] 其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下，电压可以分成2次以上的脉冲来施加；
[0311] (d)以实现最低mRNA导入效率(Rmin)以上的mRNA导入效率(R)的电压和通电时间对电极间施加与阶段(c)方向相反的电压，所述最低mRNA导入效率(Rmin)由式(B)算出，其中，每1mm电极间距离的电压为约20V～约55V，每1mm电极间距离的电压与通电时间的积为约630Vmsec以下，电压可以分成2次以上的脉冲来施加，
[0312] 在阶段(c)和(d)中将电压分成2次以上的脉冲来施加时，可以在连续地施加一个方向的脉冲后施加相反方向的脉冲，也可以交替施加各方向的脉冲，还可以随机施加各方向的脉冲。
[0313] [26]根据项目[1]～项目[25]中任一项所述的方法，其中，受精卵为1细胞期或2细胞期的受精卵。
[0314] [27]根据项目[1]～项目[26]中任一项所述的方法，其中，受精卵为1细胞期的受精卵。
[0315] [28]根据项目[1]～项目[27]中任一项所述的方法，其中，在受精约12小时后实施电穿孔。
[0316] [29]根据项目[1]～项目[28]中任一项所述的方法，其中，使用啮齿目的受精卵。
[0317] [30]根据项目[1]～项目[29]中任一项所述的方法，其中，使用小鼠的受精卵。
[0318] [31]根据项目[1]～项目[30]中任一项所述的方法，其中，Cas9蛋白为如下的蛋白质：包含与序列号1～序列号4中的任一氨基酸序列具有约90％以上的序列同源性的氨基酸序列且gRNA依赖性地与DNA结合。
[0319] [32]根据项目[1]～项目[31]中任一项所述的方法，其中，Cas9蛋白具有RuvC核酸酶活性和HNH核酸酶活性中的任一者或两者。
[0320] [33]根据项目[1]～项目[32]中任一项所述的方法，其中，Cas9蛋白包含序列号1～序列号4中的任一氨基酸序列。
[0321] [34]根据项目[1]～项目[33]中任一项所述的方法，其中，Cas9蛋白包含序列号1的氨基酸序列。
[0322] [35]根据项目[1]～项目[34]中任一项所述的方法，其中，溶液包含1种或1种以上的进一步的核酸分子，该核酸分子与Cas9 mRNA一起被导入受精卵。
[0323] [36]根据项目[35]所述的方法，其中，进一步的核酸分子为gRNA、或crRNA与tracrRNA的组合。
[0324] [37]根据项目[35]或项目[36]所述的方法，其中，进一步的核酸分子为gRNA。
[0325] [38]根据项目[36]或项目[37]所述的方法，其中，溶液进一步包含ssODN。
[0326] [39]根据项目[1]～项目[38]中任一项所述的方法，其中，进一步包括培养经电穿孔的受精卵来确认受精卵的存活的阶段。
[0327] [40]一种表达Cas9的哺乳动物的受精卵的制造方法，包括通过项目[1]～项目[39]中任一项所述的方法向哺乳动物的受精卵导入Cas9 mRNA。
[0328] [41]一种以哺乳动物的受精卵进行基因组编辑的方法，包括通过项目[35]～项目[38]中任一项所述的方法向哺乳动物的受精卵导入Cas9 mRNA和进一步的核酸分子。
[0329] [42]根据项目[41]所述的方法，其中，进一步包括确认引起基因组编辑的阶段。
[0330] [43]一种经基因组编辑的哺乳动物的受精卵的制作方法，包括通过项目[35]～项目[38]中任一项所述的方法向哺乳动物的受精卵导入Cas9 mRNA和进一步的核酸分子。
[0331] [44]一种基因修饰动物的制备方法，包含向受体动物移植通过项目[43]所述的方法而得到的受精卵。
[0332] 根据本发明，能够通过电穿孔将Cas9 mRNA有效且迅速地导入到哺乳动物的受精卵。电穿孔是优点为胚胎的成活率高以及不需要特别的手技且不耗费时间的技术。向100个受精卵的细胞质或原核显微注射mRNA时，即使是熟练者也需要1小时以上，但电穿孔能够通过简单的操作以几分钟实现该导入。此外，市售的电穿孔系统的价格一般比显微注射系统便宜。因此，本发明有助于提高基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑和利用该基因组编辑的基因修饰动物的制作效率、迅速化、降低成本。
[0333] 实施例
[0334] 材料和方法
[0335] mRNA和gRNA的制备
[0336] pCS2-mCherry由木下典行博士(基础生物学研究所，日本)提供。hCas9质粒(pX330)从Addgene(马萨诸塞州剑桥市，美国)购入。将从pX330切下的hCas9连接在pSP64载体(Promega)的SP6启动子的下游(pSP64-hCas9)，用于mRNA合成。各自使用NotI和SalI将pCS2-mCherry和pSP64-hCas9制成直链状。以直链状质粒为模板，使用体外RNA转录试剂盒(mMESSAGEmMACHINE SP6Transcription Kit,Ambion,德克萨斯州奥斯汀市，美国)合成mCherry和hCas9的mRNA。
[0337] 对以Fgf10或mCherry为靶的寡核苷酸对进行退火，插入到pDR274载体(addgene)的BsaI限制酶位点。寡核苷酸的序列如下所述。Fgf10(5’-GGAGAGGACAAAAAACAAGA-3’(序列号5)和其互补序列)和mCherry(5’-GGCCACGAGTTCGAGATCGAGGG-3’(序列号6)和其互补序列)。利用DraI切断后，使用MEGAshortscript T7 Transcription Kit(Ambion，德克萨斯州奥斯汀市，美国)合成gRNA。
[0338] 合成的RNA(mRNA和gRNA)通过苯酚-氯仿-异戊醇萃取和异丙醇沉淀来纯化。以2～4μg/μl的浓度将沉淀的RNA溶解于Opti-MEM I，在-20℃下保存直到使用为止。通过吸光光度计和琼脂糖凝胶电泳对RNA进行定量。从Sigma以干燥状态购入ssODN，以1μg/μl的浓度溶解于Opti-MEM I，在-20℃下保存直到使用为止。
[0339] 小鼠品系
[0340] 使用ICR(日本CLEA)或B6D2F1(C57BL/6xDBA2F1)(日本SLC)的雌性小鼠。ICR系统主要用于决定电穿孔条件，B6D2F1系统用于基因组编辑。
[0341] 受精卵的回收
[0342] 在E0.5(E后的数字表示受精后的天数。E0.5是指从确认到阴道栓的日期的暗期的中间点起12小时后)从与相同系统的雄性自然交配的ICR或B6D2F1雌性的输卵管回收受精卵。利用1％透明质酸酶/M2培养基(Sigma)进行培养，由此除去覆盖受精卵的卵丘细胞。在以H2b-mCherry为靶的基因组编辑实验中，使用源自与R26-H2b-mCherry的雄性(RIKEN CDB，日本)交配的B6D2F1雌性的受精卵。回收的受精卵在mWM培养基(ARK RESOURCES公司，日本)或KSOM培养基(95mM NaCl、2.5mM KCl、0.35mM KH2PO4·7H2O、0.2mMMgSO4·7H2O、0.2mM葡萄糖、10mM乳酸钠、25mM NaHCO3、0.2mM丙酮酸钠、1.71mM CaCl2·2H2O、0.01mM Na2-EDTA·2H2O、1mM L-谷氨酰胺、1mg/mlBSA)中培养直到用于电穿孔为止。
[0343] 电穿孔
[0344] 订购铂块电极(长：10mm，宽：3mm，高：0.5mm，间隔：1mm)(株式会社BEX(下面称为BEX)、日本东京)而使用(图2a)。将与CUY21EDIT II(BEX)或CUY21Vivo-SQ(BEX)连接的电极设置于实体显微镜。用Opti-MEM I(Lifetechnologies)对mWM培养基中培养的受精卵清洗3次，除去含有血清的培养基。接着，在用含有RNA的Opti-MEM I溶液(5μl)充满的电极的间隙排列受精卵，进行电穿孔。作为电气条件，只要没有特别说明，则是30V(3msec的脉冲+97msec的间隔)×7次。电穿孔后，立刻从电极回收受精卵，用M2培养基清洗4次，用mWM培养基清洗2次。接着，在mWM培养基中，在37℃下，在5％CO2培养箱内将受精卵培养至2细胞期。
[0345] 荧光信号的检测和分析
[0346] 在电穿孔15小时后测定mCherry荧光的信号强度。使用具备尼普科夫圆盘共聚焦单元CSU-W1(横河电机，日本)的Axio Observer.Z1倒置显微镜(Zeiss，德国)。荧光信号通过EM-CCD相机ImageM(滨松Photonics，日本)进行检测，数据通过HC图像软件和NIH ImageJ(http://imagej.nih.gov/ij/)进行分析。测定的荧光强度是依赖于荧光信号的获得和解析的条件的相对值，仅在条件完全一致时能够比较。
[0347] Fgf10和H2b-mCherry的基因组编辑
[0348] 如上所述，在E0.5通过电穿孔将Cas9 mRNA和以Fgf10或H2b-mCherry为靶的gRNA导入到从B6D2F1雌性回收的受精卵。对于基于HDR的敲入的研究，与Cas9 mRNA和gRNA一起导 入 s s O D N 。H 2 b - m C h e r r y 用的 s s O D N 序 列 如 下 所 述 ：5’-AGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAATTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCC-3’(序列号7)和5’-CGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCC-3’(序列号8)。将存活的2细胞期胚胎在产生阴道栓的日期移植到假孕小鼠的输卵管。或者将胚胎在体外培养至囊胚期(E4.5)。
[0349] 为了调查基于CRISPR/Cas9的Fgf10或H2b-mCherry基因的突变，由胚胎的卵黄囊制备基因组。通过使用特异性引物的PCR来扩增与gRNA靶邻接的基因组区域：Fgf10Fwd(5’-CAGCAGGTCTTACCCTTCCA-3’(序列号9))及Fgf10Rev(5’-TACAGGGGTTGGGGACATAA-3’(序列号10))、H2b-mCherryFwd(GAGGGCACTAAGGCAGTCAC(序列号11))及H2b-mCherryRev
(CCCATGGTCTTCTTCTGCAT(序列号12))。将Fgf10或H2b-mCherry的PCR扩增产物克隆到pMD20(TAKARA BIO株式会社，日本滋贺县)载体。从各胚胎分离出10种质粒，对基因组区域进行测序。测序使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver.3.1及ABI 3500
GeneticAnalyser(Applied Biosystems,美国加利福尼亚州福斯特城)进行。
(CCCATGGTCTTCTTCTGCAT(序列号12))。将Fgf10或H2b-mCherry的PCR扩增产物克隆到pMD20(TAKARA BIO株式会社，日本滋贺县)载体。从各胚胎分离出10种质粒，对基因组区域进行测序。测序使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver.3.1及ABI 3500
GeneticAnalyser(Applied Biosystems,美国加利福尼亚州福斯特城)进行。
[0350] 实施例1
[0351] 用于将mRNA导入到小鼠受精卵的电穿孔条件
[0352] 对在不用酸对透明带进行处理的情况下用于将mRNA导入到小鼠受精卵的电穿孔的条件进行了调查。准备图2a所示的电穿孔系统。将铂块电极(图2c)设置于实体显微镜(图2a左)并与电穿孔仪(CUY21EDIT II)(图2a右)连接，所述铂块电极的间隙距离为1mm，长度为10mm，宽度为3mm，高度为0.5mm，能够在电极间保持5μl溶液。使用该系统，能够同时处理约40个～50个受精卵。在电穿孔之前，通过手技将小鼠的受精卵排成一列。通过电穿孔将在体外转录的400ng/μl的mCherry mRNA导入到受精卵，监测mCherry的荧光强度和到囊胚期为止的胚胎的存活率，由此评价mRNA导入效率。图2a为该实验中使用的电穿孔装置的照片。
图2b为图2a的被四方形包围的部分的放大图。图2c为铂块电极的示意图。受精卵放置在电极间的间隙中的mRNA溶液中。图2d为放置在电极间的间隙内的受精卵的显微镜图像。图2e为用于向小鼠受精卵导入mRNA的电穿孔条件的示意图，表示以97msec的间隔重复进行3次～11次的10V-50V、3msec的矩形脉冲。
图2b为图2a的被四方形包围的部分的放大图。图2c为铂块电极的示意图。受精卵放置在电极间的间隙中的mRNA溶液中。图2d为放置在电极间的间隙内的受精卵的显微镜图像。图2e为用于向小鼠受精卵导入mRNA的电穿孔条件的示意图，表示以97msec的间隔重复进行3次～11次的10V-50V、3msec的矩形脉冲。
[0353] 使用E0.5的受精卵，将脉冲时间固定为3msec，脉冲次数固定为5次，在各种电压(10V～50V)下进行电穿孔。图3a为将在各种电压下进行了电穿孔的胚胎的mCherry荧光强度(●)和到囊胚期为止的存活率(■)绘制而得到的图。在20V以上的电压下观察荧光，荧光强度在20V为4.41，在30V为14.7，在40V为26.46，在50V为39.69，随着电压而上升。荧光强度的相对比率为20V：30V：40V：50V＝0.3：1.0：1.8：2.7。存活率到30V为止为100％，40V以上时随着电压而降低，50V时达到约50％。
[0354] 将电压和脉冲时间固定为30V和3msec，改变脉冲的重复次数(3次、5次、7次、9次和11次)。图3b为将以各种脉冲的重复次数进行了电穿孔的胚胎的mCherry荧光强度(●)和到囊胚期为止的存活率(■)绘制而得到的图。mCherry荧光强度在3次时为7.9，在5次时为
14.7，在7次时为27.1，在9次时为40.6，在11次时为65.9，随着脉冲的次数而增大。到囊胚期为止的存活率在重复7次时开始降低，在重复11次时达到约50％。
14.7，在7次时为27.1，在9次时为40.6，在11次时为65.9，随着脉冲的次数而增大。到囊胚期为止的存活率在重复7次时开始降低，在重复11次时达到约50％。
[0355] mCherry荧光强度与mCherry mRNA的导入量成正比，因此，可以将上述实验中测定的荧光强度看作mRNA导入效率的相对值。图4为基于图3b所示的在电压30V的各通电时间的荧光强度和由图3a导出的各电压的荧光强度的相对比率(20V：30V：40V：50V＝0.3：1.0：1.8：2.7)在各电压预测各通电时间下的mRNA导入效率R的图表。
[0356] 使用Excel软件制作图4所示的图表的近似式。各电压下的mRNA导入效率R使用通电时间t(msec)由以下的近似式表示。
[0357] 20V R＝0.0005×t3-0.0057×t2+0.2847×t
[0358] 30V R＝0.0015×t3-0.0191×t2+0.9489×t
[0359] 40V R＝0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×t
[0360] 50V R＝0.0078×t3-0.1414×t2+3.0103×t
[0361] 实施例2
[0362] 使用两个方向脉冲的电穿孔
[0363] 与实施例1同样地通过电穿孔向E0.5的受精卵导入mCherry mRNA。将电压和脉冲时间固定为30V和3msec，如图5c所示那样改变脉冲的重复次数和电压方向。在图5中，×6表示从一个方向赋予6次脉冲。×+3-3表示从一个方向赋予3次脉冲后，接着从相反方向赋予3次脉冲。×alt±3表示交替赋予来自两个方向的脉冲各3次。×+6-6和×alt±6也同样。不论电压的方向，mCherry的荧光强度均随着脉冲的次数而增加(图5a)。到囊胚期为止的存活率均高(图5b)，特别是与从一个方向赋予12次脉冲时相比，×+6-6和×alt±6时存活率高。
[0364] 实施例3
[0365] 基于Cas9 mRNA和gRNA的电穿孔的Fgf10基因的基因组编辑
[0366] 对上述的电穿孔条件是否能够用于利用CRISPR/Cas9的基因组编辑进行调查。
[0367] 将四肢发育所必须的Fgf10基因作为靶。已明确例如Fgf10的纯合性突变胚胎在没有四肢的状态下发育(通过引用而作为本说明书的一部分的Sekine,K.et al.,Nature Genetics 21,138-141(1999))，可以通过表型来容易地确认基因的破坏。进而，基于CRISPR/Cas系统的该基因的破坏通过显微注射Cas9mRNA和gRNA来实施(通过引用而作为本说明书的一部分的Yasue,A.et al.,Scientific Reports 4,5705(2014))。
[0368] 将与Yasue,A.et al.中使用的物质相同且被称为#563的具有Fgf10的靶序列的gRNA(包含序列号5的核苷酸序列)和Cas9 mRNA以各种浓度通过重复7次30V、3msec的电脉冲的电穿孔导入到E0.5的受精卵。图6a表示包含本实验中使用的靶序列(下划线)和PAM序列(AGG，大写字母)的Fgf10基因座的基因组结构。使胚胎发育至2细胞期，移植到假孕的雌性。在E15或E16时将小鼠解剖，观察胚胎的形态。根据四肢的异常，将胚胎分成3个表型的类别：类型I的胚胎没有四肢，类型II的胚胎形态具有各种异常(例如，后肢缺失、前肢和后肢缩短等)，类型III的胚胎看起来正常。图6b是表示不同的四肢的表型的3个类别的胚胎的代表例，即，表示没有四肢、四肢异常(左：后肢缺失；右：前肢和后肢缩短)或正常。图6c是将Cas9和gRNA的电穿孔对四肢发育的影响汇总而得到的图表。各实验中使用的RNA的浓度示于图表的左侧。各列的数字表示示出各类别的表型的胚胎的数量。
[0369] 表1示出所使用的Cas9 mRNA和gRNA的浓度、2细胞期的存活率，在E15或E16时的胚胎的存活率。表2示出基于Cas9RNA和gRNA的电穿孔的Fgf10的突变胚胎的产生。
[0370] 表1：经电穿孔的胚胎的存活率
[0371] [表1]
[0372]
[0373]
[0374] 表2：经电穿孔的胚胎的形态异常
[0375] [表2]
[0376]
[0377] 与显微注射的情况相比(在Yasue,A.et al.中为34～35％)，经电穿孔的受精卵的2细胞期存活率(在表1中为94～95％)显著提高。
[0378] 若将400ng/μl的Cas9 mRNA和200ng/μl的gRNA用于电穿孔，则97％(38/39)的胚胎显示特异性的四肢异常。这些胚胎中，34个胚胎完全失去前肢和后肢，与以往的通过靶基因重组而得到的Fgf10的纯合性突变体的表型同样。剩余4个胚胎具有各种四肢异常。若将200ng/μl的Cas9 mRNA和100ng/μl的gRNA用于电穿孔，则82％(31/38)的胚胎显示四肢异常。在100ng/μl的Cas9 mRNA和50ng/μl的gRNA时，46％(19/41)的胚胎显示全部或一部分的四肢异常。在50ng/μl的Cas9 mRNA和25ng/μl的gRNA时，在形态观察时大部分胚胎看起来正常。
[0379] 为了对这些胚胎中Fgf10基因是否被破坏进行调查，对胚胎的基因组序列进行分析。在源自4个随机选择的胚胎的各10个克隆中，扩增靶序列周边的基因组区域并对序列进行测序。靶序列周边的基因组区域的野生型序列为tgaatggaaaaggagctcccaggagaggacaaaaaacaagaAGGaaaaacacctctgctca(下划线表示作为靶使用的序列。大写字母表示PAM序列(AGG))(序列号13)。将结果示于表3。
[0380] 表3：Fgf10突变体的序列分析
[0381] [表3-1]
[0382]
[0383]
[0384] [表3-2]
[0385]
[0386] 表中，关于同一受精卵记载有2次以上相同的突变类型时，各克隆的序列不同。
[0387] 若使用400ng/μl的Cas9 mRNA和200ng/μl的gRNA，则测序的全部克隆具有碱基的插入或缺失(插入缺失)或突变，未检测出野生型序列。这些结果表示Fgf10基因的两个等位基因被使用400ng/μl的Cas9 mRNA和200ng/μlg的gRNA的电穿孔破坏。进而，各胚胎具有4种以下的插入缺失。因此，可以推测在电穿孔后在1细胞期或2细胞期非常迅速地引起基因组编辑。若使用50ng/μl的Cas9 mRNA和25ng/μl的gRNA，则大部分胚胎看起来正常，但通过序列分析，源自这些胚胎的几个克隆中检测出插入缺失或突变。
[0388] 这些结果表示基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑能够利用电穿孔、以及基因组编辑的效率依赖于RNA浓度，表明在高浓度的Cas9 mRNA和gRNA时，两个等位基因在大致全部的细胞中被破坏，但在低浓度时，可以得到突变细胞(在任一个或两个等位基因具有突变的细胞)与野生型细胞的嵌合胚胎。
[0389] 实施例4
[0390] 基于Cas9 mRNA和gRNA的电穿孔的mCherry基因的基因组编辑
[0391] 将在Rosa26基因座具有Histon2b(H2b)-mCherry基因的受精卵(通过引用而作为本说明书的一部分的Abe et al.,Genesis 49,579-590(2011))用于电穿孔。在由该受精卵发育而成的胚胎中，在Rosa26启动子的控制下，H2b-mCherry普遍性地表达，在4～8细胞期的全部核中观察到mCherry荧光。若引起以H2b-mCherry为靶的基因组编辑、基因被破坏，则mCherry荧光消失。
[0392] 在该实验中，对能够通过重复7次30V、3msec的电脉冲的电穿孔进行基因组编辑的RNA浓度的下限进行调查。将Cas9 mRNA和以H2b-mCherry为靶的gRNA导入到受精卵(E0.5)，在KSOM培养基中，在体外培养至囊胚期(E4.5)，对核的mCherry荧光进行调查。若以200ng/μl以上的Cas9 mRNA浓度和100ng/μl以上的mCherry gRNA的浓度对受精卵进行电穿孔，则mCherry荧光完全消失。在50～100ng/μl的Cas9 mRNA浓度和25～50ng/μl的gRNA浓度时，几个卵裂球为mCherry荧光阴性，几个为阳性。以25ng/μl的Cas9 mRNA和12.5ng/μl的gRNA的电穿孔不会对H2b-mCherry的表达造成影响，因此表示，对通过重复7次30V、3msec的电脉冲的电穿孔实现基因组编辑而言，该浓度过低。
[0393] 接着，对Cas9 mRNA和gRNA中的哪个浓度决定基因组编辑的成功和失败进行调查。将Cas9 mRNA浓度固定为25ng/μl、使gRNA变动，结果即使使用200ng/μl的gRNA也不会引起基因组编辑。另一方面，若使用200ng/μl的Cas9 mRNA时，即使将gRNA减少至10ng/μl也会引起基因组编辑。即使使用以Fgf10为靶的gRNA，也得到相同的结果。这些结果表示基于电穿孔的基因组编辑的成功和失败依赖于Cas9 mRNA的浓度，而不依赖于gRNA的浓度。
[0394] 实施例5
[0395] 基于使用高浓度的Cas9 mRNA的电穿孔的基因组编辑
[0396] 通过与实施例4同样的实验对使用2000ng/μl的Cas9 mRNA和1000ng/μl gRNA实现基因组编辑的电气条件进行调查。将Cas9 mRNA和gRNA导入到E0.5的小鼠受精卵，在体外培养至囊胚期(E4.5)，对核的mCherry荧光进行调查。将结果示于图7。在未进行电穿孔的胚胎中，在全部卵裂球中看到mCherry的荧光(图7a)。在30V、0.05msec×2次时，在一部分卵裂球中mCherry的荧光消失，在30V、0.10msec×2次时，在全部卵裂球中mCherry的荧光消失(图7b)。在20V、0.05msec×2次时，在全部卵裂球中残留mCherry的荧光，在20V、0.20msec×2次时，在一部分卵裂球中mCherry的荧光消失(箭头)，在20V、1.00msec×2次时，在全部卵裂球中mCherry的荧光消失(图7c)。
[0397] 实施例6
[0398] 用于基因组编辑的电穿孔条件的研究
[0399] 通过与实施例4同样的实验对使用200ng/μl的Cas9 mRNA和100ng/μl的gRNA实现基因组编辑的电穿孔的条件进行研究。通过各种电压(20～50V)和脉冲时间(6～33msec)的电穿孔向5～12个E0.5的受精卵同时导入Cas9mRNA和gRNA。根据表3所示的电穿孔条件，在E4.5的时刻观察到mCherry的荧光消失的卵裂球，表示引起基因组编辑。
[0400] 表4：实现基因组编辑的电穿孔条件
[0401] [表4]
[0402]电压(V) 通电时间(msec)
20 15
20 18
20 30
20 33
30 9
30 12
30 15
30 21
30 24
50 6
50 9
20 15
20 18
20 30
20 33
30 9
30 12
30 15
30 21
30 24
50 6
50 9
[0403] 若使用200ng/μl的Cas9 mRNA，则在电压20V、通电时间15msec时引起基因组编辑。如实施例1中测定那样，该电气条件下的mRNA导入效率为4.41。
[0404] 实施例7
[0405] 基于电穿孔的ssODN的导入和HDR
[0406] 对是否能够通过电穿孔将ssODN导入到小鼠的受精卵，并且是否能够生成基于HDR的敲入等位基因进行调查。使用117碱基的ssODN(序列号7)，该117碱基的ssODN(序列号7)具有与loxP和EcoRI识别序列(37碱基)的两侧邻接的40碱基长的同源区域。将Cas9 mRNA、以mCherry基因为靶的gRNA和ssODN电穿孔到与实施例4中使用的受精卵同样的具有H2b-mCherry基因的受精卵。使胚胎发育至2细胞期，移植到假孕的雌性。图8a是靶序列、以及用于插入37碱基的loxP序列和EcoRI识别位点的ssODN的示意图。经置换的等位基因由于loxP序列中的终止密码子而丧失功能，核的mCherry荧光消失。通过EcoRI切断和RFLP(限制性片段长度多态性)对基于ssODN的置换进行筛选。
[0407] 在经电穿孔的全部11个胚胎中，mCherry荧光消失。图8b是经电穿孔的代表性的胚胎的照片。在经电穿孔的胚胎中，mCherry荧光完全消失，另一方面，未进行电穿孔的对照的胚胎显示荧光信号。图8c示出回收的胚胎的RFLP分析的结果。插入有EcoRI识别位点的等位基因被EcoRI切断成2条带(138bps和374bps)。未被切断的等位基因为497bps。在#3、6、8和9的胚胎中观察到被切断的带。即，mCherry荧光消失的胚胎中，4个为EcoRI切断阳性。#1和7的意料之外的带表示靶基因的长缺失。
[0408] 将EcoRI切断阳性的胚胎的序列分析的结果示于表5。靶序列周边的基因组区域的野生型序列为gtgaacggccacgagttcgagatcgaGGGcga(下划线表示用作靶的序列。大写字母表示PAM序列(GGG))(序列号14)。
[0409] 表5：基于HDR的敲入loxP和EcoRI位点的胚胎的序列分析
[0410] [表5]
[0411]
[0412]
[0413] 通过序列分析明确这些胚胎全部具有经HDR置换的等位基因。其中，3个胚胎(#6、8、9)除经HDR置换的等位基因以外还包含1种～3种具有插入缺失的等位基因。剩余1个胚胎(#3)仅具有经HDR置换的等位基因。这表示全部细胞的两个等位基因具有经HDR置换的序列。
[0414] 另外，也成功地通过HDR向H2b-mCherry基因敲入EcoRV位点(表6和图9)。图9a是靶序列和用于插入EcoRV识别位点的ssODN(序列号8)的示意图。图9b表示回收的胚胎的RFLP分析的结果。插入有EcoRV的等位基因被切断成2条带(341bps和92bps)。未被切断的等位基因为431bps。在#2、3、5和6的胚胎中观察到被切断的带。
[0415] 将这些胚胎的序列分析的结果示于表6。靶序列周边的基因组区域的野生型序列为gtgaacggccacgagttcgagatcgaGGGcga(下划线表示用作靶的序列。大写字母表示PAM序列(GGG))(序列号14)。
[0416] 表6：基于HDR的敲入EcoRV位点的胚胎的序列分析
[0417] [表6]
[0418]
[0419]
[0420] 表中，关于同一受精卵记载有2次以上的相同的突变类型时，各克隆的序列不同。
[0421] 另外，也成功地向Fgf10基因敲入XbaI位点(未公开数据)。这些结果表示通过电穿孔不仅能够将Cas9 mRNA和gRNA导入到受精卵，还可以将ssODN导入到受精卵，能够得到基于HDR的敲入等位基因。
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