表达盒
阅读：3发布：2021-06-19
专利汇可以提供表达盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及：(1)具有对应于转录激活因子结合域的序列的表达控制区；和(2)编码能够结合至所述表达控制区的转录激活因子的核酸。本发明提供了：包括以能够发挥功能的方式连接至所述表达控制区的核酸的表达盒；用于在 哺乳动物 细胞中表达目的产物的方法，所述方法使用了所述表达盒；用于生产表达目的产物的细胞的方法；用于在哺乳动物细胞中生产目的产物的方法；和包括所述表达盒的 试剂 盒 。，下面是表达盒专利的具体信息内容。
1.以下(1)和(2)的核酸构建体的组合：
(1) 包含第一表达盒的第一核酸构建体，其包含：
(i) 具有启动子和对应于转录激活因子结合区的序列的第一表达调节区，其中所述启动子选自CMV启动子、SV40启动子、EF-1α启动子、CAG启动子和PGK启动子；和(ii) 编码能够结合至所述表达调节区的转录激活因子的核酸，其中所述核酸可操作地连接至所述表达调节区；和
(2) 包含第二表达盒的第二核酸构建体，其包含：
(i) 具有启动子和对应于转录激活因子结合区的序列的第二表达调节区，其中所述启动子选自CMV启动子、SV40启动子、EF-1α启动子、CAG启动子和PGK启动子；和(ii) a) 用于表达目标产物的核酸，其可操作地连接至第二表达调节区；或b) 可插入用于表达目标产物的核酸，从而使所述核酸可操作地连接至第二表达调节区的位点。
2.权利要求1所述的核酸构建体的组合，其中所述转录激活因子是免疫缺陷病毒的Tat或其功能同源变体。
3.权利要求1或2所述的核酸构建体的组合，其中所述转录激活因子结合区是免疫缺陷病毒的反式激活应答区或其功能同源序列。
4.在哺乳动物细胞中表达目标产物的方法，其包括以下步骤(a)和(b)：
(a) 将权利要求1所述的核酸构建体的组合引入细胞；和
(b) 培养步骤(a)中获得的所述细胞。
5.权利要求4所述的方法，其中所述转录激活因子是免疫缺陷病毒的Tat或其功能同源变体。
6.权利要求4或5所述的方法，其中所述转录激活因子结合区是免疫缺陷病毒的反式激活应答区或其功能同源序列。
7.用于生产表达目标产物的细胞的方法，其包括：将权利要求1所述的核酸构建体的组合引入至哺乳动物细胞中的步骤。
8.权利要求7所述的方法，其中所述转录激活因子是免疫缺陷病毒的Tat或其功能同源变体。
9.权利要求7或8所述的方法，其中所述转录激活因子结合区是免疫缺陷病毒的反式激活应答区或其功能同源序列。
10.在哺乳动物细胞中生产目标产物的方法，其包括以下步骤(a)和(b)：
(a) 通过权利要求4或5所述的方法表达所述目标产物；和
(b) 获得表达的所述目标产物。
11.在哺乳动物细胞中生产目标产物的方法，其包括以下步骤(a)和(b)：
(a) 通过权利要求6所述的方法表达所述目标产物；和
(b) 获得表达的所述目标产物。
12.试剂盒，其包括权利要求1所述的核酸构建体的组合。
13.权利要求12所述的试剂盒，其中所述转录激活因子是免疫缺陷病毒的Tat或其功能同源变体。
14.权利要求12或13所述的试剂盒，其中所述转录激活因子结合区是免疫缺陷病毒的反式激活应答区或其功能同源序列。
表达盒
技术领域
[0001] 本发明涉及可用于生产基因工程化的产物的表达盒，和所述表达盒的用途。
背景技术
[0002] 为了生产多肽，诸如重组蛋白，使用了通过使用质粒载体或病毒载体将编码多肽的核酸引入原核生物、酵母、昆虫细胞、原生动物、哺乳动物细胞等，并且通过使用宿主细胞中的蛋白质生产系统转录和翻译所述核酸的方法。特别地，使用哺乳动物细胞的方法不但适合于在蛋白质工程和分子遗传学，还适合于在免疫工程、基因治疗和药物产品生产的领域中的研究或临床应用，因为翻译后修饰与人的相同，和来源于哺乳动物的蛋白质可以被正确地折叠等。
[0003] 然而，相比于使用原核生物或酵母的方法，在使用哺乳动物细胞生产重组蛋白的方法中，获得的产物通常不足。作为解决该问题的技术，例如，已知在使用人细胞的重组蛋白质表达系统中，将附加型维持系统(episomal maintenance system)和强力的启动子/增强子添加至具有反式激活系统的蛋白质表达系统的技术(专利文献1)，和通过人TRBP (其是1型人免疫缺陷病毒(在下文中，称为HIV-1) TAR的结合因子)至TAR的结合作用，在具有CMV启动子和反式激活应答区(在下文中，称为TAR)的表达调节区的控制下，改善蛋白质表达的技术(非专利文献1)。
[0004] 引用列表
[0005] 专利文献
[0006] 专利文献1：WO2002/027005
[0007] 非专利文献
[0008] 非专利文献1：The Journal of Biological Chemistry, Vol. 278, pp. 4440-4448 (2003)。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明解决的问题
[0011] 本发明的目标是提供用于高表达目标产物等而没有复杂操作的方法。
[0012] 问题的解决方案
[0013] 本发明人深入研究了用于改善目标产物表达量的方法。结果，本发明人构建了表达盒，其中编码结合于转录激活因子结合区的转录激活因子的核酸可操作地连接至具有对应于转录激活因子结合区的序列的表达调节区。随后，本发明人发现通过下述的组合改善了目标产物的表达量：将所述盒作为第一表达盒(在下文中，也称为“转录激活因子表达盒”)引入至哺乳动物细胞和将其中用于表达目标产物的核酸可操作地连接至具有对应于与转录激活因子表达盒的相同的转录激活因子结合区的序列的表达调节区的第二表达盒(在下文中，也称为“目标产物表达盒”)引入至哺乳动物细胞，并且因此完成本发明(图1)。根据本发明，不但多肽的生产，而且RNA或病毒载体的生产也以高效率实现。
[0014] 本发明概述如下。本发明涉及：
[0015] [1] 表达盒，其包含以下(1)和(2)：
[0016] (1)具有对应于转录激活因子结合区的序列的表达调节区；和
[0017] (2) 编码能够结合至所述表达调节区的转录激活因子的核酸，其中所述核酸可操作地连接至表达调节区；
[0018] [2] [1]的表达盒，其中用于表达目标产物的核酸进一步可操作地连接至所述具有对应于转录激活因子结合区的序列的表达调节区；
[0019] [3] [1]或[2]的表达盒，其中所述转录激活因子是免疫缺陷病毒的Tat或其功能同源变体；
[0020] [4] [1]-[3]中任一项的表达盒，其中所述转录激活因子结合区是免疫缺陷病毒的反式激活应答区或其功能同源序列；
[0021] [5] 在哺乳动物细胞中表达目标产物的方法，其包括以下步骤(a)和(b)：
[0022] (a) 将第一表达盒和第二表达盒引入细胞，所述第一表达盒包含第一表达调节区和可操作地连接至所述第一表达调节区的编码转录激活因子的核酸，所述第二表达盒包含第二表达调节区和可操作地连接至所述第二表达调节区的用于表达目标产物的核酸；和[0023] (b) 培养在步骤(a)中获得的细胞，
[0024] 其中所述第一表达调节区和所述第二表达调节区具有对应于在第一表达盒中编码的转录激活因子所结合的转录激活因子结合区的序列；
[0025] [6] 在哺乳动物细胞中表达目标产物的方法，其包括以下步骤(a)和(b)：
[0026] (a) 将[1]的表达盒引入细胞，其中用于表达目标产物的核酸进一步可操作地连接至具有对应于转录激活因子结合区的序列的表达调节区；和
[0027] (b) 培养步骤(a)中获得的细胞；
[0028] [7] [5]或[6]的方法，其中所述转录激活因子是免疫缺陷病毒的Tat或其功能同源变体；
[0029] [8] [5]-[7]中任一项的方法，其中所述转录激活因子结合区是免疫缺陷病毒的反式激活应答区或其功能同源序列；
[0030] [9] 生产表达目标产物的细胞的方法，其包括：
[0031] 将包含第一表达调节区和编码可操作地连接至所述第一表达调节区的转录激活因子的核酸的第一表达盒，和包含第二表达调节区和可操作地连接至所述第二表达调节区的用于表达目标产物的核酸的第二表达盒引入至哺乳动物细胞中的步骤，[0032] 其中所述第一表达调节区和所述第二表达调节区具有对应于在第一表达盒中编码的转录激活因子所结合的转录激活因子结合区的序列；
[0033] [10] 生产表达目标产物的细胞的方法，其包括：
[0034] 将[1]的表达盒引入至哺乳动物细胞中的步骤，其中用于表达目标产物的核酸进一步可操作地连接至具有对应于转录激活因子结合区的序列的表达调节区；
[0035] [11] [9]或[10]的方法，其中所述转录激活因子是免疫缺陷病毒的Tat或其功能同源变体；
[0036] [12] [9]-[11]中任一项的方法，其中所述转录激活因子结合区是免疫缺陷病毒的反式激活应答区或其功能同源序列；
[0037] [13] 在哺乳动物细胞中生产目标产物的方法，其包括以下步骤(a)和(b)：
[0038] (a) 通过[5]-[8]中任一项的方法表达目标产物；和
[0039] (b) 获得表达的目标产物；
[0041] (1) 第一表达盒，其包含第一表达调节区和可操作地连接至所述第一表达调节区的编码转录激活因子的核酸；和
[0042] (2) 第二表达盒，其包含第二表达调节区和可插入用于表达目标产物的核酸，从而使所述核酸可操作地连接至所述第二表达调节区的位点，
[0043] 其中所述第一表达调节区和所述第二表达调节区具有对应于在第一表达盒中编码的转录激活因子所结合的转录激活因子结合区的序列；
[0044] [15] [14]的试剂盒，其中所述第一表达盒和第二表达盒分别包含在不同的核酸构建体中；
[0045] [16] [14]的试剂盒，其中所述第一表达盒和第二表达盒包含相同的核酸构建体中；
[0046] [17] 包括[1]的表达盒的试剂盒，其中所述第一表达盒进一步包含可插入用于表达目标产物的核酸，从而使所述核酸可操作地连接至第一表达调节区的位点；
[0047] [18] [14]-[17]中任一项的试剂盒，其中所述转录激活因子是免疫缺陷病毒的Tat或其功能同源变体；和
[0048] [19] [14]-[18]中任一项的试剂盒，其中所述转录激活因子结合区是免疫缺陷病毒的反式激活应答区或其功能同源序列。
[0049] 本发明的效果
[0050] 根据本发明，提供了可用于在细胞中供应转录激活因子的转录激活因子表达盒。此外，提供了用于表达目标产物的方法和用于生产目标产物的方法以及用于生产表达目标产物的细胞的方法，其使用该转录激活因子表达盒和在表达调节区中具有对应于所述转录激活因子所结合的转录激活因子结合区的序列的目标产物表达盒。此外，还提供了在所述方法中使用的试剂盒。本发明不但对蛋白质工程和分子遗传学，还对免疫工程、基因治疗和药物生产领域的基础研究或临床应用非常适用。
[0052] [图1] 图1显示了本发明的构思。图A是一般目标产物表达盒的示意图。图B是使用表达Tat的转录激活因子表达盒和包含具有对应于TAR的序列的表达调节区的目标产物表达盒的根据本发明的表达方法的示意图。
[0055] 本发明的实施方式
[0056] 如在本文中使用的，表达盒是指包含表达目标产物所需元件的核酸构建体。具体地，这是指包括至少包含启动子的表达调节区和可操作地连接至所述表达调节区的用于表达目标产物的核酸的核酸构建体。
[0057] 如在本文中使用的，关于用于表达目标产物的核酸，“可操作地连接”意指用于表示目标产物的核酸位于相对于表达调节区合适的位置，从而可以表达目标产物。一般地，所述表达调节区被可操作地定位，以相对于表达目标产物的核酸置于顺式的位置。然而，其不需要直接相邻用于表达目标产物的核酸。其还可以通过IRES (内部核糖体进入位点)序列、2A肽编码序列等进行定位，定位至用于表达目标产物的数个核酸。当定位了数个用于表达目标产物的核酸时，可以定位表达相同目标产物的数个核酸，或可以定位表达不同目标产物的数个核酸。
[0058] 如在本文中使用的，表达调节区是指在表达盒中控制目标产物表达的区域。具体地，其是指包含启动子的区域。表达调节区可以进一步包含参与转录调节的多种调节序列。在本发明中启动子的实例包括，但不特别限于，在哺乳动物中发挥作用的任何启动子，并且优选的实例包括：组成型表达启动子，诸如CMV启动子、SV40启动子、EF-1α启动子、CAG启动子和PGK启动子、U3启动子、U6启动子、H1启动子等。除了这些启动子，在本发明中可以使用已知的诱导型启动子、组织或器官特异的启动子、时间特异的启动子或其功能上等效的变体序列等。在本发明中启动子优选的实例包括来源于与下文描述的转录激活因子结合区不同来源的启动子，并且特别地，优选的实例包括具有高转录效率的CMV启动子。
[0059] 在本发明表达盒中的表达调节区中，为了增加转录效率的目的，对应于转录激活因子结合区的序列定位于启动子附近或在转录起始位点下游的非翻译区中。对应于转录结核因子结合区的序列的实例包括转录激活因子结合区的碱基序列，其是对应于所述序列的RNA或DNA。转录激活因子结合区是通过与特异的转录激活因子相互作用(缔合/解离)增加包含于表达盒内基因的转录效率的序列。按需要，对应于转录激活因子结合区的序列可以在表达载体中的数个位置或作为重复序列使用。相互作用发生在从转录激活因子结合区转录的RNA和转录激活因子之间。转录激活因子结合区的实例包括存在于免疫缺陷病毒诸如HIV-1、HIV-2和SIV的5'-端重复系列(LTR)的TAR。TAR是存在于免疫缺陷病毒的LTR中的区域，并且形成了较高级结构，并且转录激活因子Tat (反式激活因子)结合至所述区域促进了免疫缺陷病毒RNA的转录。因此，在本发明的方面中，构建了上文提及的表达调节区，从而在通过转录产生的mRNA上形成转录激活因子结合区。在本发明中对应于转录激活因子结合区的序列的优选实例特别地包括包含对应于源自HIV-1的TAR的序列(其显示在序列表的SEQ ID NO: 2中)的核酸。此外，在本发明中使用的TAR的碱基序列可以是来源于野生型的碱基序列或者可以是其功能同源的碱基序列。对功能同源碱基序列没有具体限制，只要其具有对Tat的结合能力，并且实例包括与序列表中SEQ ID NO: 2碱基序列具有95%或更多，优选地98%或更多同源性的序列。
[0060] 如在本文中使用的，转录激活因子是指具有RNA结合能力的蛋白质的因子，其单独地或通过形成二聚体或复合体而结合至RNA，并且发挥作用从而进一步增加依赖启动子的转录效率。转录激活因子的实例包括Tat，其是免疫缺陷病毒诸如HIV-1、HIV-2和SIV的转录激活因子，和TRBP，其是来源于人的反式激活因子。在本发明中转录激活因子的优选的实例包括Tat，其是HIV-1的转录激活因子并且显示在序列表的SEQ ID NO: 1中。Tat是通过结合至包含于免疫缺陷病毒的LTR中的TAR促进免疫缺陷病毒RNA转录的因子。因此，Tat促进从在转录起始位点下游具有TAR的表达调节区的转录。此外，在本发明中使用的TAR可以是野生型或其变体。对变体没有具体限制，只要其具有对TAR的结合能力，并且实例包括由与序列表中SEQ ID NO: 1的碱基序列编码的氨基酸序列具有95%或更多，优选地98%或更高同一性的氨基酸序列组成的变体。
[0061] 本发明提供的转录激活因子表达盒可以通过将编码转录激活因子(所述转录激活因子结合至转录激活因子结合区)的核酸可操作地连接至具有启动子和对应于所述转录激活因子结合区的序列的表达调节区域产生，优选地通过将其连接从而将对应于转录激活因子结合区的序列定位于转录起始位点和翻译起始位点之间。更优选地，其可以通过例如500bp或更小，优选地300bp或更小，更优选地100bp或更小的DNA片段连接对应于转录激活因子结合区的序列和编码转录激活因子的核酸而产生。以这样的方式产生的转录激活因子表达盒，其特征在于其通过表达的转录激活因子和从相同盒转录的mRNA上的转录激活因子结合区的相互作用，而具有促进转录激活因子进一步表达的正反馈作用。
[0062] 在本发明中用于目标产物的表达盒可以通过将用于表达目标产物的核酸可操作地连接至具有启动子和对应于转录激活因子结合区的序列的表达调节区而产生。该核酸可以是天然来源的或人工合成的，只要获得期望的产物。此外，该核酸的碱基序列可以是天然碱基序列或可以是在天然碱基序列取代、缺失和/或插入一个或多个碱基的碱基序列。上文提及的转录激活因子结合区是与一同使用的转录激活因子表达盒表达的转录激活因子结合的序列。目标产物的实例包括，但不特别限于，例如，多肽诸如荧光蛋白质、各种生长因子、酶和抗体。此外，目标产物不必需要是通过翻译生产的产物，并且其可以是作为转录物的核酸，诸如rRNA、tRNA、小核RNA、shRNA、siRNA和反义RNA。
[0063] 根据本发明的表达方法通过将转录激活因子表达盒和目标产物表达盒引入细胞并且培养所得细胞而实现。在根据本发明的表达方法中，两种类型的盒(即，转录激活因子表达盒和目标产物表达盒)的表达调节区，具有对应于转录激活因子结合区的序列，其分别结合由转录激活因子表达盒表达的转录激活因子。
[0064] 根据本发明，用于生产表达目标产物的细胞的方法通过将转录激活因子表达盒和目标产物表达盒引入细胞而实现。
[0065] 在本发明中的两种类型的盒，即，转录激活因子表达盒和目标产物表达盒，可以分别包含在不同的核酸构建体中，或可以包含在相同的核酸构建体中。如果所述盒包含在相同的核酸构建体中，则所述第一表达调节区和第二表达调节区可以由单个表达调节区覆盖。也就是，编码转录激活因子的核酸和表达目标产物的核酸都可以可操作地连接至单个表达调节区。在这种情况下，IRES序列或编码2A肽的序列可以插入在例如，编码转录激活因子的核酸和用于表达目标产物的核酸之间。如果插入IRES序列或编码2A肽的序列，用于表达目标产物的核酸序列可以定位于这些序列的上游，并且编码转录激活因子的核酸序列可以定位于下游，并且反之亦然。
[0066] 在本发明优选的方面中，所述表达盒包含在质粒载体或病毒载体中并使用。质粒载体的优选实例包括，但不特别限于，例如pBApo-CMV DNA和pIRES Bicistronic Expression Vector (均由Takara Bio Inc.生产)，其为用于哺乳动物的表达载体。此外，病毒载体的优选实例包括，但不特别限于，例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体和腺病毒载体，并且商业产品可以作为每种载体使用。此外，可以使用两种表达盒的各一种类型，或者可以使用表达盒的数种类型。例如，如在下文实施例10中描述的，可以在根据本发明的表达方法中使用包含两种或更多种不同类型目标产物表达盒的核酸构建体，或者可以在本发明的方法中使用包含shRNA文库的表达盒的核酸构建体，或包含siRNA文库的表达盒的核酸构建体等。此外，在本发明的方法中可以使用包含多个一种类型的目标产物表达盒的核酸构建体。
[0067] 在本发明的方法中，将表达盒引入其中的细胞的优选的实例包括，但不特别限于，哺乳动物细胞。对所述哺乳动物细胞没有限制，只要通过本发明的方法实现目标产物的表达。例如，哺乳动物细胞的实例包括，贴壁的或悬浮的HEK293细胞或293T细胞、293F细胞或293FT细胞(全部由Life Technologies生产)、G3T-hi细胞(由TAKARA Bio Inc.生产: WO06/035829)、HeLa细胞(ATCC CCL-2)、MOLT-4细胞(ATCC CRL-1582)和PER.C6 (注册商标)细胞(ATCC CCL-2)。除人细胞外的灵长类动物细胞的实例包括，例如，COS-1细胞(ATCC CRL-1650)和COS-7细胞(ATCC CRL-1651)，并且啮齿动物细胞的实例包括，例如，CHO细胞(ATCC CCL-61)和HePa1-6细胞(ATCC CRL-1830)。
[0068] 在本发明中，将表达盒引入细胞的方法的实例包括，但不特别限于，已知引入方法，其中使引入的包含表达盒的核酸构建体在细胞中瞬时或稳定维持。例如，用于引入质粒载体的方法的实例包括磷酸钙方法、脂质转染方法、DEAE-葡聚糖方法、聚乙烯亚胺方法和电穿孔方法。对于引入，可以使用可商购获得的试剂，诸如TransIT (注册商标)-293试剂(由Mirus Bio LLC生产)、Lipofectamine 2000试剂(由Life Technologies生产), FuGene (注册商标) (由 Promega Corporation生产)。此外，在其染色体上具有引入的核酸构建体的细胞可以通过以下的方法获得：将核酸构建体引入细胞并且随后选择性地增殖将引入的核酸构建体并入其基因组的细胞。此外，如果使用病毒载体，取决于病毒载体性质，可以通过合适的方法使用病毒载体感染细胞。不言而喻，可商购获得的试剂盒等可以用于这些核酸引入方法。
[0069] 根据本发明，所述表达方法中的培养条件没有特别限制，只要其实现期望细胞的增殖和目标产物的获得。例如，可以执行在通常细胞培养中使用的条件。例如，培养条件的实例包括在30℃至37℃的温度，和90%至100%的湿度和3%至10%的CO2浓度下培养的培养条件。
[0070] 根据本发明，用于生产目标产物的方法是通过使用根据本发明的表达方法和获得目标产物而实现的。对获得目标产物的方法没有特别限制，并且，例如，可以使用对本领域那些技术人员已知的技术从细胞和/或培养上清液获得目标产物。根据本发明，在用于生产的方法中，目标产物不一定是分离的。也就是说，在本发明中“获得目标产物”也意指获得包含目标产物的培养物本身，和从培养物获得粗产物(例如，获得培养上清液)。此外，可以通过进一步使用已知方法提取、浓缩或纯化目标产物。
[0071] 本发明的方法不限于获得单一多肽或RNA的方面。例如，用于生产由数种蛋白质和核酸组成的病毒载体，诸如逆转录病毒载体的方法，也是本发明的一个方面。生产病毒载体的方法的实例包含以下的方法：其包括向细胞引入病毒载体生产所需的一种或多种蛋白质的一个或多个表达盒，和有待于和转录因子表达盒一同包装在病毒颗粒中的核酸的表达盒；在适合病毒载体生产的条件下培养所得细胞；并且在细胞和/或培养上清液中获得所生产的病毒载体。
[0072] 此外，在本发明的方法中，可以使用例如，增加本发明表达盒的转录效率的多肽。所述多肽的实例包括，例如，ELL2、AFF4、ENL、AF9和p-TEFb和转录延长因子诸如构成p-TEFb的细胞周期蛋白T1和cdk9。此外，可以使用RNA聚合酶II。这些多肽可以通过使用已知方法在细胞中表达。
[0073] 根据本发明，还提供了包括本发明表达盒的试剂盒。在一个方面中，本发明的试剂盒是包括转录激活因子表达盒的试剂盒。在另一个方面中，本发明的试剂盒是包括上文提及的转录激活因子表达盒，和包括具有对应于转录激活因子结合区(其与该转录激活因子结合)的序列的表达调节区和可插入用于表达目标产物的核酸，从而使所述核酸可操作地连接至所述表达调节区的位点的表达盒(用于表达目标产物的盒)的试剂盒。例如，本发明的试剂盒的方面的实例包括含有转录激活因子表达盒的载体和含有用于表达目标产物的盒的载体的组合，和含有两种盒的载体。在含有两种盒的载体中，转录激活因子和目标产物可以通过单一表达调节区表达。在本发明的试剂盒中使用的载体的实例包括，但不特别限于，质粒载体和病毒载体。此外，本发明的试剂盒可以进一步包括，例如说明书、用于引入核酸或用于克隆的试剂，和/或宿主细胞。当试剂盒进一步包括宿主细胞时，本发明的转录激活因子表达盒可以预先引入至宿主细胞中。本发明的试剂盒特别地可用于实施上文提及的本发明的方法。实施例
[0074] 在下文中，本发明更具体地通过实施例的方式进行解释。然而，本发明并不限于这些实施例。
[0075] 实施例1：使用Tat和TAR的转录激活因子表达盒和目标产物表达盒的构建[0076] (1) 转录激活因子表达盒的构建：pCMVTAR-Tat质粒
[0077] 将编码来源于HIV-1毒株NL4-3的Tat的核酸(SEQ ID NO: 1)插入pBApo-CMV DNA (由Takara Bio Inc.生产)的多克隆位点以构建pCMV-Tat质粒。pBApo-CMV DNA是用于哺乳动物细胞的基因表达质粒，其包含源自巨细胞病毒的启动子(CMV IE启动子)和单纯疱疹病毒胸苷激酶的poly A信号。随后，通过使用PCR获得包含对应于源自HIV-1的LTR的TAR的序列(SEQ ID NO: 3)的核酸，并且将该核酸插入pCMV-Tat质粒中CMV启动子和编码Tat的核酸之间以产生pCMVTAR-Tat质粒。pCMVTAR-Tat质粒的特征在于其通过将从质粒表达的Tat结合在相同质粒的TAR上而具有进一步促进Tat表达的正反馈作用。
[0078] (2) 目标产物表达盒的构建：pCMVTAR-AcGFP1质粒
[0079] 将SEQ ID NO: 3中显示的核酸插入pBApo-CMV DNA的多克隆位点中以构建pCMV-TAR质粒。随后，将编码荧光蛋白AcGFP1的核酸插入位于pCMV-TAR质粒上的TAR下游的多克隆位点以构建pCMVTAR-AcGFP1质粒。此外，作为对照，将编码AcGFP1的核酸插入pBApo-CMV DNA的多克隆位点以构建pCMV-AcGFP1质粒。
[0080] 实施例2：通过Tat表达增强AcGFP1表达
[0081] (1) 通过AcGFP1荧光强度的评估
[0082] 将贴壁293T细胞以每孔2.5 x 105个细胞/1ml接种于表面处理的12孔板(由Becton, Dickinson and Company生产)中，并且在CO2培养箱中培养(在37℃，具有95%湿度和5%的CO2浓度)。作为培养基，使用了添加胎牛血清(FBS，由Life Technologies生产)至10%的DMEM培养基(由Sigma-Aldrich Co. LLC生产)。孵育24小时后，将质粒引入培养的细胞。在9个不同测试条件下执行所述引入，其中使用的质粒的类型和量(每1孔)是不同的。表
1显示了在每个测试条件下使用的质粒的类型和量。此外，根据附在试剂盒的方案使用TransIT-293执行质粒的引入。
1显示了在每个测试条件下使用的质粒的类型和量。此外，根据附在试剂盒的方案使用TransIT-293执行质粒的引入。
[0083] [表1]
[0084] 。
[0085] 将引入后的细胞在CO2培养箱中培养2天。在引入的次日，将每个孔中的培养基替换为添加10% FBS的DMEM培养基，并且在孵育两天后，收获细胞。在使用PBS (由Life Technologies生产)洗涤收获的细胞的5 x 105个细胞后，向其添加50µL 1 x SDS样品缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 6.8，10%丙三醇、2%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.005%溴酚蓝、100 mM二硫苏糖醇)，并且执行在95℃的热处理5分钟以将生成物作为细胞裂解物使用。对剩余的细胞进行流式细胞术以通过细胞中的AcGFP1表达测量荧光。表2显示了观察到荧光的细胞的平均荧光强度。
[0086] [表2]
[0087] 。
[0088] 结果，在没有使用Tat表达质粒的条件下(测试条件1)，AcGFP1荧光强度是低的。在另一个方面，AcGFP1荧光强度的增加与使用Tat表达质粒的条件下(测试条件3-8)，各Tat表达质粒的使用量相关。此外，在将具有本发明的转录激活因子表达盒的pCMVTAR-Tat质粒作为Tat表达质粒使用的条件下(测试条件6-8)，荧光强度显著增加。特别地，在使用0.2 µg pCMVTAR-Tat的条件下(测试条件8)，获得的荧光强度比在测试条件1下高10倍。这显示AcGFP1表达的增加是由于Tat的存在并且和Tat表达量相关。此外，其显示通过pCMVTAR-Tat质粒的正反馈作用，Tat表达增加，并且从而使AcGFP1表达显著增强。
[0089] (2) 通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的评估
[0090] 将实施例2-(1)中制备的细胞裂解物以每泳道2 x 104个细胞上样在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并且进行电泳。在电泳后，使用考马斯亮蓝将凝胶染色。图2显示了染色的凝胶图像。随后，通过扫描仪获取染色的凝胶图像，并且使用图像分析软件LuminoShot (注册商标) Analyzer 2.0 (由Takara Bio Inc.生产)计算AcGFP1条带的信号强度。信号强度的计算按以下执行。首先，将每个泳道中在接近25kDa存在AcGFP1的条带和源自293T细胞的接近15kDa的蛋白质条带的信号强度转换为数值。随后，基于源自293T细胞的接近15kDa的蛋白质条带的信号强度，修正AcGFP1条带的信号强度。此外，从AcGFP1条带的信号强度的修正值中减去阴性对照(泳道9)的接近25kDa的信号强度，并且将获得的值作为AcGFP1条带的信号强度使用。表3显示了结果。
[0091] [表3]
[0092] 。
[0093] 如在图2中显示的，在使用pCMV-AcGFP1质粒的条件下(泳道1)没有发现AcGFP1的条带。在另一方面，在使用Tat表达质粒的条件下(泳道3-8)，发现AcGFP1是主要条带。
[0094] 此外，如在表3中显示的，信号强度的增加与使用Tat表达质粒的条件下(测试条件3-8)，各Tat表达质粒的使用量相关。此外，相比使用pCMV-Tat的条件(测试条件3-5)，在使用pCMVTAR-Tat的条件下(测试条件6-8)信号强度显著增加。这显示AcGFP1表达增加是由于Tat的存在并且和Tat表达量相关。此外，其推导出Tat表达通过pCMVTAR-Tat质粒的正反馈增加，并且从而显著增强了AcGFP1表达。
[0095] 实施例3：通过pCMVTAR-Tat的Tat蛋白表达增强的效果
[0096] 与实施例2相似，将AcGFP1表达质粒和Tat表达质粒引入贴壁293T细胞。在该实施例中，将表面处理的6孔板(由Becton, Dickinson and Company生产)作为培养载体使用，并且接种细胞的条件为每孔6 x 105个细胞/2.5 mL。表4显示了用于引入的质粒的类型和量。
[0097] [表4]
[0098] 。
[0099] 在引入后，将细胞在CO2培养箱中培养一天，并随后收获。对所收获的细胞的一部分进行流式细胞术，并且发现了与实施例2相似的AcGFP1表达的显著增强。在剩下的细胞中，按实施例2相同的方式，使用1 x 106个细胞制备细胞裂解物。对这些裂解物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并且使用抗HIV-1 Tat抗体(由abcam生产)和抗-α-微管蛋白抗体(由Cell Signaling Technology, Inc.生产)进行蛋白质印迹，其中后者被用于样品之间进行电泳的量的评估。使用SuperSignal (注册商标) West Femto Maximum Sensitivity Substrate (由Thermo Fisher Scientific Inc.生产)检测抗体，并且使用化学发光检测设备LuminoShot (注册商标) 140 (由 Takara Bio Inc.生产)获取检测结果。将每个信号强度转换为数值，并且计算(Tat信号强度/α-微管蛋白信号强度)并作为修正的Tat信号强度使用。图3显示了所述结果。
[0100] 根据图3，其显示相比于pCMV-Tat，通过使用具有本发明的转录激活因子表达盒的pCMVTAR-Tat作为Tat表达质粒明显改进了Tat的表达量。因此，其显示AcGFP1表达的增强是由于Tat表达的增强。
[0101] 实施例4：在悬浮293细胞中AcGFP1表达的增强
[0102] (1) 通过AcGFP1荧光强度的评估
[0103] 使用FreeStyle293表达系统(其是悬浮293细胞培养系统，由Life Technologies生产)，并且将悬浮293细胞以2 x 107个细胞/20 mL接种于125 mL摇瓶中，并且根据附在试剂盒中的方案培养。随后，将AcGFP1表达质粒引入细胞。表5显示了在每个测试条件下使用的质粒的类型和量。
[0104] [表5]
[0105] 。
[0106] 在引入后，将细胞在CO2培养箱中培养两天。随后，对培养的细胞进行流式细胞术以通过细胞中表达的AcGFP1测量荧光。表6显示了观察到荧光的细胞中的平均荧光强度。
[0107] [表6]
[0108]测试条件 平均荧光强度
1 4,051
2 15,072
3 32,872
4 37,447
5 0
1 4,051
2 15,072
3 32,872
4 37,447
5 0
[0109] 结果显示，与贴壁293T细胞相似，在悬浮293细胞中使用pCMVTAR-Tat和pCMVTAR-AcGFP1的条件(测试条件3、4)下，AcGFP1表达显著增强。
[0110] 实施例5：在相同分子上具有转录激活因子表达盒和目标产物表达盒的质粒的构建
[0111] 构建了将源自小核糖核酸病毒的IRES序列和编码Tat的核酸(SEQ ID NO: 1)插入pCMVTAR-AcGFP1质粒编码AcGFP1的序列的下游的质粒，并且命名为pCMVTAR-AcGFP1-IRES-Tat。
[0112] 实施例6：通过Tat表达的AcGFP1表达的增强
[0113] 使用实施例5中构建的pCMVTAR-AcGFP1-IRES-Tat在贴壁293T细胞中评估AcGFP1表达增强作用。该评估以按照实施例2中相同的方式执行。然而，接种细胞的条件是每孔1.5 x 105个细胞/1 mL。表7显示了在每个测试条件下使用的质粒的类型和量。
[0114] [表7]
[0115] 。
[0116] 在引入后，将细胞在CO2培养箱中培养两天。随后，对培养的细胞进行流式细胞术以通过细胞中表达的AcGFP1测量荧光。表8显示了观察到荧光的细胞中的平均荧光强度。
[0117] [表8]
[0118] 。
[0119] 结果显示，在使用pCMVTAR-AcGFP1-IRES-Tat的条件下(测试条件2)，AcGFP1表达显著增强。也就是说，即便包含在单个质粒中，本发明的转录激活因子表达盒和本发明的目标产物表达盒也提高了目标产物的表达量。
[0120] 实施例7：分泌蛋白G-CSF表达质粒的构建
[0121] 构建了将编码粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的核酸代替编码AcGFP1的核酸插入到pCMV-AcGFP1、pCMVTAR-AcGFP1和pCMVTAR-AcGFP-IRES-Tat中的质粒，并且分别命名为pCMV-G-CSF、pCMVTAR-G-CSF和pCMVTAR-G-CSF-IRES-Tat。
[0122] 实施例8：通过Tat表达增强G-CSF表达
[0123] 使用实施例7中构建的G-CSF表达质粒，在贴壁293T细胞和悬浮293细胞中评估G-CSF表达增强作用。按照实施例2中相同的方式，进行对贴壁293T细胞的引入。然而，接种细胞的条件为5 x 105个细胞/2 mL。按照实施例4中相同的方式，进行对悬浮293细胞的引入。然而，接种细胞的条件为在125 ml摇瓶中4.5 x 107个细胞/30 mL。表9显示了在每个测试条件下使用的质粒的类型和量。
[0124] [表9]
[0125] 。
[0126] 在引入后，将细胞在CO2培养箱中培养，并且在第2、5和7天对培养上清液取样，各0.08 ml。将取样的培养上清液用于测量G-CSF的量。根据附在试剂盒的方案，使用人G-CSF测定试剂盒(由IBL Co., Ltd.生产)执行测量。表10显示了结果。
[0127] [表10]
[0128] 。
[0129] 结果，在使用了使用TAR和Tat的本发明的表达盒的条件下(测试条件3-5、9-11)，关于分泌蛋白G-CSF，也显示了表达量的显著改善。
[0130] 实施例9：抗-人CD3抗体表达质粒的构建
[0131] 分别构建将编码抗-人CD3抗体的重链或轻链的核酸插入，代替编码pCMVTAR-AcGFP1的AcGFP1的核酸的质粒，并且分别命名为pCMVTAR-HC和pCMVTAR-LC。
[0132] 实施例10
[0133] 使用在实施例9中构建的抗-人CD3抗体表达质粒，以评估在贴壁293T细胞和悬浮293细胞中抗-人CD3抗体表达的增强。按照实施例2中相同的方式，执行对贴壁293T细胞的引入，并且按照实施例8中相同的方式执行，对悬浮293细胞的引入。表11显示了在每个测试条件下使用的质粒的类型和数量。
[0134] [表11]
[0135] 。
[0136] 在引入后，将细胞在CO2培养箱中培养，并且在第2、5和7天对培养上清液取样，各0.04ml。将取样的培养上清液用于测量抗-人CD3抗体的产量。根据附在试剂盒的方案使用小鼠IgG EIA试剂盒(由Takara Bio Inc.)执行测量。表12显示了结果。
[0137] [表12]
[0138] 。
[0139] 结果，在使用了使用TAR和Tat的本发明的表达盒的条件下(测试条件2、5)，关于抗-CD3抗体，也显示了显著改善的表达量。
[0140] 工业实用性
[0141] 本发明不但非常适用于蛋白质工程和分子遗传学领域，还非常适用于免疫工程、基因治疗和药物生产领域的基础研究或临床应用。
[0142] 序列表自由文本
[0143] SEQ ID NO: 1: Tat编码序列
[0144] SEQ ID NO: 2: 对应于TAR的核酸序列
[0145] SEQ ID NO: 3: 包括对应于TAR的序列的核酸序列。
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