携带tPA信号肽及密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗
阅读：4发布：2022-01-13
专利汇可以提供携带tPA信号肽及密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 医药技术领域，涉及携带tPA 信号 肽及密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸 疫苗 。所涉及的严重发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白Gn核酸疫苗由密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白Gn基因序列和真核表达载体pJW4303组成，其5’端连接tPA信号肽序列。相对于野生型状态下的核酸疫苗，该核酸疫苗在体外表达中可更高效地表达目的蛋白且可将目的蛋白有效地分泌到胞外，在免疫 哺乳动物 后可有效地刺激免疫系统产生较好的体液免疫应答。，下面是携带tPA信号肽及密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗专利的具体信息内容。
携带tPA信号肽及密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其
核酸疫苗
技术领域
背景技术
[0002] 严重发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)是我国学者在2010年首次发现并鉴定的一种新型病毒。发热伴血小板减少综合征(SFTS)是由SFTSV感染引起的一种以发热、血小板减少、白细胞减少为主要特征的新发传染病，病情严重者可出现神经系统损伤、噬血细胞现象、多器官功能衰竭等，病死率可达12％-16.3％，甚至有报道为30％。
[0003] SFTSV属于布尼亚病毒科白蛉病毒属。基因组序列分析显示，其基因组为单股负链RNA，由大片段L、中片段M和小片段S三个片段构成，分别编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，氨基端糖蛋白(Gn)和羧基端糖蛋白(Gc)，核蛋白(NP)和非结构蛋白(NSs)。作为一种新发现的病毒，其基因组编码的各种蛋白尤其是Gn的生物学特性、在疾病发生发展过程中的作用、以及免疫学特点还知之甚少；同时，从流行病学及临床诊疗过程的需求来看，亟需开发SFTS相关的预防用疫苗、诊断用抗体及治疗性抗体。
[0004] 核酸疫苗，又称DNA疫苗，其作用机制主要有以下三种：DNA编码的抗原通过体细胞经MHC Ⅰ类途径递呈给CD8+T细胞；DNA免疫直接转染专职的抗原递呈细胞(如树突状细胞)经MHC Ⅰ/Ⅱ类途径将抗原递呈给CTL、CD4+T细胞，并激活B细胞应答；被转染的体细胞被抗原递呈细胞吞噬后，发生交叉激活，将抗原递呈给T细胞。它具有如下优点：能够充分模拟自然感染状态，在动物体内合成具有相应空间构象的蛋白，不仅可以激发机体产生体液免疫反应还能够诱导产生特异性的细胞免疫反应；和重组蛋白免疫相比，核酸疫苗可在DNA水平对密码子进行优化、修饰，能更好的保证抗原蛋白的纯度，而且成本低廉，稳定性好，同时可以避免蛋白免疫原半衰期短的缺陷而建立更有效的长期免疫应答；基因免疫通过扩增的基因序列来编码蛋白抗原，能够避免直接接触危险性较高的病原体。
[0005] 但核酸疫苗也存在着诸多缺点，其中最主要的是核酸疫苗研究和应用的对象主要为真核生物，而目的基因绝大多数来自于病毒或细菌等原核生物，而原核生物与真核生物在密码子使用偏好上存在明显差异，这就导致了核酸疫苗的外源基因在真核细胞内不能高效地表达，不能有效地刺激机体的免疫系统产生应答。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种携带tPA信号肽并进行密码子优化的SFTSV Gn的核酸疫苗。
[0008] 本发明的目的通过如下技术方案实现：
[0009] 一种含有野生型信号肽(WSP)的SFTSV糖蛋白Gn的原始基因序列，序列为SEQ ID NO.1。
[0010] 一种密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn的基因序列，序列为SEQ ID NO.2。
[0011] 一种SFTSV糖蛋白Gn的核酸疫苗，由序列为SEQ ID NO.1的SFTSV Gn的基因序列插入到真核表达载体HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点之间所得。
[0012] 一种SFTSV糖蛋白Gn的核酸疫苗，由序列为SEQ ID NO.2的SFTSV Gn基因序列插入到真核表达载体Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点之间所得，其5’端连接tPA信号肽序列。
[0013] 所述的真核表达载体为pJW4303。
[0014] 本发明提供的基因修饰的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗的构建步骤如下：
[0015] (1)含WSP信号肽的SFTSV Gn原始序列基因片段的获得
[0016] 以SFTSV HB29株为参考序列(GenBank:HM745931.1)，选取含WSP信号肽的糖蛋白Gn编码基因(即优化前的原始序列SEQ ID NO.1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并装入载体pUC57，即pUC57-WSP-Gn。设计引物WSP-Gn-F：CCCAAGCTTATGATGAAAGTCATCTGG(SEQ ID NO.3)；WSP-Gn-R：GAGCTCGGATCCC TAT TACTCAATCCTAACATCATC(SEQ ID NO.4)。通过PCR扩增，分别引入HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点。扩增产物用HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切，并用DNA凝胶回收试剂盒(Omega Agarose Gel DNA Purification Kit，美国Omega公司)回收纯化目的片段，该片段为含有WSP信号肽的原始序列的SFTSV糖蛋白Gn基因序列，两端分别连接有HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点，以便于核酸疫苗pJW4303-WSP-Gn的构建。
[0017] (2)密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列的设计和合成
[0018] 以SFTSV HB29株为参考序列(GenBank:HM745931.1)，首先选取含WSP信号肽基因的SFTSV Gn基因，全长1605bp，然后运用软件OptimumGeneTM分析其基因序列，找出其密码子使用偏好同时找出与哺乳动物密码子使用偏好不同的密码子位点，用哺乳动物偏好的密码子替代SFTSV糖蛋白Gn基因中使用偏好不同的密码子，然后设计出密码子优化的SFTSV Gn基因序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并装入载体pUC57，即pUC57-WSP-Gn-opt。密码子优化的基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列与原有的氨基酸序列保持一致。密码子优化后的SFTSV Gn基因序列为SEQ ID NO.2。
[0019] (3)携带tPA信号肽并密码子优化后的SFTSV Gn基因片段的获得
[0020] 对南京金斯瑞生物科技有限公司提供的含有目标序列的重组载体pUC57-WSP-Gn-opt，设计引物tPA-Gn-opt-F：GTCACTTCGCTAGCGACAGTGGACCTATTATCTGCG(SEQ ID NO.5)；tPA-Gn-opt-R：GAGCTCGGATCCCTATTACTCAATCCGCACATCGTCC(SEQ ID NO.6)。通过PCR扩增，在优化Gn序列的5’端和3’端分别引入酶切位点Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ，将Gn-opt基因序列连在质粒pJW4303的tPA信号肽序列下游。扩增产物用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，并用DNA凝胶回收试剂盒(Omega Agarose Gel DNA Purification Kit，美国Omega公司)回收纯化目的片段，该片段为优化的SFTSV Gn基因序列，两端分别连接有Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点，以便于核酸疫苗pJW4303-tPA-Gn-opt的构建。
[0021] (4)将步骤(1)得到的基因片段克隆到真核表达载体pJW4303中，得到重组质粒pJW4303-WSP-Gn。将步骤(3)得到的基因片段克隆到真核表达载体pJW4303中，得到重组质粒pJW4303-tPA-Gn-opt。经对重组质粒抽提、酶切、测序后，确定得到了与预期相符的质粒，即为本发明所述的SFTSV糖蛋白Gn核酸疫苗。
[0022] 本发明的有益成果：
[0023] SFTSV是一种新发现的病原体，目前对其基因组编码的各种蛋白尤其是Gn的生物学特性、在疾病发生发展过程中的作用、其抗体是否合适临床及流行病学运用等都尚不清楚。此外，由于自然界生物体存在密码子的偏好性，从病原体来源的SFTSV Gn基因克隆在异源宿主体内难以有效表达，因此就不能有效的刺激异源宿主的免疫系统，使之产生较好的免疫保护作用。为了提高异源基因在哺乳动物中的表达效率，往往需要对核苷酸编码序列进行优化。由于目前对核苷酸序列的优化尚没有统一的标准或原则。因此针对相同的氨基酸序列，不同的研究人员完全会设计出不同的核苷酸序列用于目标多肽或蛋白的表达和制造，相应地表达效率也可能存在差异。发明人以SFTSV HB29株的SFTSV Gn基因为基础，设计了多条密码子优化后的SFTSV Gn序列，并通过实验筛选出表达效率最高的一条。同时，发明人将SFTSV Gn原有信号肽(WSP)置换为tPA。与野生型基因相比，经过tPA信号肽引入及密码子优化的基因中哺乳动物细胞偏好的密码子出现频率增加，但是其编码的SFTSV Gn氨基酸序列不变。利用体外基因重组将目的蛋白的基因序列克隆入真核表达载体pJW4303构建了SFTSV的核酸疫苗pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt。
[0024] 通过体外转染的方法研究Gn的表达，发明人发现核酸疫苗pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt均能够在真核细胞293T细胞中表达，但pJW4303-tPA-Gn-opt的目的蛋白Gn表达量更高，且仅pJW4303-tPA-Gn-opt可以将Gn可以分泌到293T细胞外。由此可见，相较于野生型状态的pJW4303-WSP-Gn，经过我们的基因改造后的pJW4303-tPA-Gn-opt更适于在哺乳动物细胞中的蛋白表达。
[0025] 通过DNA免疫动物的方法研究Gn的体液免疫原性，发明人发现核酸疫苗pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt均能够诱导机体产生特异性体液免疫应答，但pJW4303-tPA-Gn-opt能更快地诱导机体产生体液免疫应答且产生的特异性抗体滴度更高。由此可见，相较于野生型状态的pJW4303-WSP-Gn，经过我们的基因改造后的pJW4303-tPA-Gn-opt核酸疫苗具有更好的体液免疫原性。附图说明
[0026] 图1野生型和密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列的密码子偏好性比较结果[0027] 其中，图1A和1B分别为密码子适应指数(CAI)和最优密码子使用频率，两图左侧部分均为优化后的结果，右侧部分均为未经优化的野生型结果，图1A和1B提示密码子优化后SFTSV糖蛋白Gn基因序列编码区同义密码子与哺乳动物细胞中密码子最佳使用的符合程度及所使用的最优密码子比例明显提高；图1C为GC含量的调整，提示经密码子优化后的SFTSV糖蛋白Gn基因序列中碱基组分未见明显变化，保证了基因合成过程中均匀的退火温度，保证了动物体内mRNA的表达水平；图1D为限制性内切酶及顺式作用元件的优化，提示原本会影响质粒构建的特定基因序列通过密码子优化有效清除；图1E为重复序列的优化，提示密码子优化后的基因序列不能形成茎环结构，从而保证了核糖体与核苷酸序列的有效结合及mRNA的稳定。
[0028] 图2目的片段WSP-Gn、tPA-Gn-opt PCR扩增后双酶切电泳图
[0029] A图：1，1kb DNA ladder；2，WSP-Gn经HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切产物；3，100bp DNA ladder；
[0030] B图：1，tPA-Gn-opt经Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切产物；2，100bp DNA ladder；3，1kb DNA ladder。
[0031] 图3 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt的酶切电泳图
[0032] A图：1，1kb DNA ladder；2，pJW4303-WSP-Gn经HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切产物；
[0033] B图：1，1kb DNA ladder；2，pJW4303-tPA-Gn-opt经Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切产物。
[0034] 图4 pJW4303、pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt转染293T细胞后目的蛋白Gn表达的Western Blot结果
[0035] 1，pJW4303转染293T细胞上清；2，pJW4303转染293T细胞裂解液；3，pJW4303-WSP-Gn转染293T细胞上清；4，pJW4303-WSP-Gn转染293T细胞裂解液；5，pJW4303-tPA-Gn-opt转染293T细胞上清；,6，pJW4303-tPA-Gn-opt转染293T细胞裂解液。一抗为1:300稀释的pJW4303-tPA-Gn-opt免疫BALB/c小鼠血清。
[0036] 图5 pJW4303、pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt免疫BALB/c小鼠后血清中特异性IgG应答时间曲线
[0037] pJW4303表示空载体pJW4303免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG抗体时间曲线，共7只；
[0038] pJW4303-WSP-Gn表示pJW4303-WSP-Gn免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG抗体时间曲线，共7只；
[0039] pJW4303-tPA-Gn-opt表示pJW4303-tPA-Gn-opt免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG抗体时间曲线，共7只。
[0040] 图6 pJW4303、pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt免疫BALB/c小鼠后第10周特异性IgG抗体滴度
[0041] pJW4303表示空载体免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG滴度，共7只；
[0042] pJW4303-WSP-Gn表示pJW4303-WSP-Gn免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG滴度，共7只；
[0043] pJW4303-tPA-Gn-opt表示pJW4303-tPA-Gn-opt免疫BALB/c小鼠后的特异性IgG滴度，共7只。
具体实施方式
[0044] 实施例1.密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列的设计与合成
[0045] 用软件OptimumGeneTM分析编码SFTSV糖蛋白Gn的基因序列SEQ ID NO.1，找出其密码子使用偏好以及与哺乳动物使用偏好不同的位点。对于使用偏好不同的密码子位点，用哺乳动物细胞偏好的密码子替代，设计筛选出密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列SEQ ID NO.2。上述密码子优化的基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列与其原有的氨基酸序列一致。上述密码子优化的基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，装入载体pUC57，构建成重组质粒pUC57-WSP-Gn-opt。经测序证实合成的序列正确。
[0046] 为了明确显示进行密码子优化的位点，现将密码子优化后的核酸序列WSP-Gn-opt与密码子优化前的核酸序列WSP-Gn进行对比。比较结果如下(*为终止密码子)：
[0047]
[0048]
[0049]
[0050]
[0051]
[0052] 上述密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列与野生型序列比较密码子偏好性发生了改变。从图1中由软件OptimumGeneTM模拟出的结果可以看出，与野生型基因序列相比，密码子优化的基因中哺乳动物细胞偏好的密码子出现频率增加，但是它们所编码的氨基酸序列不变，从而使SFTSV糖蛋白Gn更适于在哺乳动物细胞中的蛋白表达。
[0053] 实施例2.真核表达载体pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt的构建
[0054] (1)目的片段和载体的获得
[0055] 1)WSP-Gn片段、质粒pJW4303线性大片段的获得：以pUC57-WSP-Gn为模板，用引物WSP-Gn-F(CCCAAGCTTATGATGAAAGTCATCTGG)和WSP-Gn-R(GAGCTCGGATCCCTATTAC TCAATCCTAACATCATC)PCR扩增SFTSV糖蛋白Gn基因序列，扩增产物用HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切。并用HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切载体质粒pJW4303。酶切反应体系为：10×Buffer TangoTM 4μl，pJW4303或相应PCR产物10μl，HindⅢ 2μl，BamH Ⅰ 2μl，补水至40μl，37℃，2h。
[0056] 2)tPA-Gn-opt片段、质粒pJW4303线性大片段的获得：以pUC57-WSP-Gn-opt为模板，用引物tPA-Gn-opt-F(GTCACTTCGCTAGCGACAGTGGACCTATTATCTGCG)和tPA-Gn-opt-R(GAGCTCGGATCCCTATTACTCAATCCGCACATCGTCC)PCR扩增密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列，扩增产物用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切。并用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切载体质粒pJW4303。酶切反应体系同1)。
[0057] (2)酶切产物纯化：TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶，酶切产物进行电泳，100V，1h；称重空1.5mlEp管，紫外灯下切下含目的DNA的凝胶置入Ep管；切碎胶块，分析天平称胶块的质量，按100mg＝100μl进行计算胶块的体积；加入至少1倍等体积的Binding Buffer；把混合物置于55℃～65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次；转移
700μl冷却的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTM DNA柱子，并把柱子装在一个干净的2ml收集管内，室温下，10,000×g离心1min，弃去液体；将柱子重新套回收集管中，加300μl Binding Buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10,000×g离心1分钟，弃去滤出液；将柱子重新套回收集管中，加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10,000×g离心1分钟，弃滤出液；重复洗涤一次，将空柱子重新套回收集管中，10,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体；把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入30～50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上，10,000×g离心1分钟，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，测定DNA浓度并保存于-20℃。
700μl冷却的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTM DNA柱子，并把柱子装在一个干净的2ml收集管内，室温下，10,000×g离心1min，弃去液体；将柱子重新套回收集管中，加300μl Binding Buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10,000×g离心1分钟，弃去滤出液；将柱子重新套回收集管中，加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10,000×g离心1分钟，弃滤出液；重复洗涤一次，将空柱子重新套回收集管中，10,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体；把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入30～50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上，10,000×g离心1分钟，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，测定DNA浓度并保存于-20℃。
[0058] (3)连接反应：用T4DNA连接酶将各目的片段与相应的质粒pJW4303线性大片段连接，得到pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt重组表达质粒，即为本发明所提供的SFTSV糖蛋白Gn的核酸疫苗。连接反应体系为：10×T4DNA Ligase Buffer 1μl，线性化的pJW4303 1μl，纯化的Gn相关目的片段7μl，T4DNA Ligase 1μl，混匀，4℃放置16h。连接物转化HB101感受态细胞。
[0059] 实施例3.重组质粒pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt的鉴定
[0060] 3.1 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt分别转化HB101感受态细胞
[0061] 1)无菌条件下，将5μl的pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt分别加入到100μl大肠杆菌HB101感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。
[0062] 2)将含细胞悬浮液的Ep管置于42℃水浴热击90s。
[0063] 3)热冲击处理后细胞迅速置于冰上2～3min。
[0064] 4)加入不含氨苄青霉素的LB培养液800μl，置于恒温振荡培养箱中，37℃，100rpm，培养50min。
[0065] 5)用移液器取0.2ml pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt转化菌液涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂培养板上。
[0066] 6)将培养皿正面朝上并置于室温20min左右，待涂布的菌液干燥后倒置放于隔水式恒温箱中，37℃培养过夜。
[0067] 3.2筛选阳性克隆
[0069] 1)细菌接种：挑取pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt转化平皿上的单菌落接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，180rpm，过夜培养。
[0070] 2)将小摇过夜的细菌在无菌超净台中缓慢吸到1.5ml离心管中，培养试管中剩下少量菌液保存于4℃。
[0071] 3)菌体收集：离心管中菌液，常温下13,000g离心1min，弃上清。
[0072] 4)悬浮菌体：加入250μl buffer P1充分悬浮细菌沉淀。
[0073] 5)碱变性：加入250μl buffer P2，温和颠倒5-6次，形成透明溶液。
[0074] 6)复性：加入400μl 4℃预冷的buffer N3，温和颠倒5-6次，然后室温静置2min。
[0075] 7)质粒与蛋白、基因组核酸的分离：室温13,000g，离心10min。
[0076] 8)质粒的吸附：Spin Column安置于Collection Tube上，将步骤7中上清液加入到Spin Column中，13000g离心1min，弃滤液。
[0077] 9)充分去除蛋白：将500μl buffer PB加入Spin Column中，13,000g离心30s，弃滤液。
[0078] 10)洗涤：将700μl wash buffer加入Spin Column中，13,000g离心30s，弃滤液。
[0079] 11)重复洗涤一次：重复步骤10。
[0080] 12)将Spin Column安置在1.5ml Ep上，在膜中央滴加50μl的灭菌蒸馏水，室温静置1min。
[0081] 13)13000g离心1min，洗脱液即为含有质粒的溶液。
[0082] 3.3酶切鉴定质粒pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt
[0083] pJW4303-WSP-Gn用HindⅢ和BamH Ⅰ进行双酶切，pJW4303-tPA-Gn-opt用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，总反应体系(10μl)：10×Buffer TangoTM 1μl，质粒(约0.20μg/μl)2μl，Nhe Ⅰ或HindⅢ 0.5μl，BamH Ⅰ 0.5μl，用灭菌ddH2O补足反应体系至10μl。37℃，孵育2h，加入1μl10×Loading buffer终止酶切反应，10g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果，酶切后电泳图谱见图3。图3显示两种核酸疫苗的克隆均构建正确。将酶切鉴定正确的细菌克隆连续划三次平板，然后送上海生工生物公司测序，测序正确的单克隆细菌于-80℃保存。
[0084] 实施例4.pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt的大量制备(质粒大提试剂盒为QIAGEN Plasmid Mega Kit(5)，Qiagen公司)
[0085] 1)吸取鉴定正确的细菌保存液10μl接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，180rpm，过夜生长。
[0086] 2)按1:500将前一天培养菌液接种于500ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，180rpm，过夜生长。
[0087] 3)第二天将细菌移到250ml离心瓶中，4℃、6,000g离心15min，弃上清，收集细菌。
[0088] 4)加入50ml缓冲液P1，反复振摇，直至细菌全部重悬于溶液中。
[0089] 5)加入50ml缓冲液P2，温和颠倒5-6次，溶液呈均匀蓝色，静置5min。
[0090] 6)加入50ml缓冲液P3，温和颠倒5-6次，蓝色溶液消失，溶液分层，上层为结实的乳白色团块，下层为清亮液体，冰上放置30min。
[0091] 7)4℃，21,000g离心30min，将上清转移至另一离心瓶，该条件下再将上清液离心10min。
[0092] 8)取缓冲液QBT 35ml平衡提取柱。
[0093] 9)将(7)中得到的上清加入到提取柱内，自然过柱，弃去滤过液体。
[0094] 10)加入洗涤缓冲液QC 200ml，自然过柱，弃去滤过液体。
[0095] 11)加入洗脱缓冲液QF 35ml，自然过柱，收集滤过液体。
[0096] 12)在收集液体中加入24.5ml异丙醇，4℃，16,000g离心30min，弃上清。
[0097] 13)7ml 70％乙醇重悬离心管中沉淀，4℃，16,000g离心10min。
[0098] 14)将有沉淀的离心管于超净台内自然晾干，1ml Elution Buffer溶解沉淀。
[0099] 15)紫外分光光度法测定抽提所得溶液中的质粒浓度及260/280比值，分装后冻存于-70℃。
[0100] 实施例5.细胞转染
[0101] 293T细胞用含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素及10％胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃，5﹪CO2饱和湿度培养箱内培养至对数生长期，用2.5g/L胰酶消化后，以5.0×106个细胞(6mL)接种于10cm培养皿中，待生长至80％融合时，依据PEI转染法进行细胞转染。取PEI 75μl，pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt 20μg，加含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基至825μl，充分混匀，室温孵育15min，然后将上述混合液加到培养皿中并轻轻摇动使混合均匀，同时以pJW4303空质粒转染293T细胞作为阴性对照。8h后更换仅含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液。继续培养48h后收获细胞裂解物进行Western blot分析。其中，转染细胞的细胞裂解产物收获步骤为：弃细胞培养上清液，用PBS(浓度10mM，pH7.2)将细胞从培养皿中洗脱，收集细胞悬液，2,500rpm，室温，离心10min，弃上清，加入裂解液(50mM Tris-HCl PH7.6，150mM NaCl，1％Triton，临用前加入1％100mM PMSF(苯甲基磺酰氟))，冰上孵育15min，12.000rpm，4℃，离心60min，收集上清液，-20℃冻存。
[0102] 实施例6.Western Blot检测pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt的体外表达[0103] 1)样品的制备：pJW4303、各重组质粒转染293T细胞的裂解物20μl，加入5x上样缓冲液5μl，100℃，煮沸8min。
[0104] 2)制备分离胶：7.5ml 30％丙烯酰胺溶液，3.7ml Tris/Cl PH8.8，150μl 10％SDS，150μl 10％过硫酸铵，6μl TEMED，灌胶，在分离胶上方加入ddH2O液封，室温下聚合30min。
[0105] 3)制备浓缩胶：倒弃液封水，制备5％的浓缩胶(4.1ml ddH2O，1ml 30％丙烯酰胺溶液，750μl Tris/Cl PH6.8，60μl 10％SDS，60μl 10％过硫酸铵，6μl TEMED)，灌胶，插入梳齿，待胶完全凝聚后，拔下梳齿，将胶转移固定至电泳槽中。
[0106] 4)上样：将上述处理好的蛋白样品加入到加样孔中进行电泳，先20mA 1h，然后40mA继续电泳2h。
[0107] 5)转膜：甲醇激活PVDF膜，在Tris-Glycine缓冲液中平衡，以100V，1h将胶上的蛋白转到PVDF膜上。
[0108] 6)封闭：转好的膜用5％脱脂奶粉封闭，37℃，1h。
[0109] 7)用PBST洗膜两次。
[0110] 8)孵育一抗：将膜浸在1:300稀释的BALB/c小鼠免疫血清中，4℃，孵育过夜。
[0111] 9)洗膜：弃血清，PBST洗膜6次，每次10min。
[0112] 10)孵育二抗：弃洗涤液，加入HPR标记的羊抗鼠IgG(1:10.000稀释)，37℃，1h。
[0113] 11)弃二抗，用PBST洗膜6次，每次10min。
[0114] 12)ECL化学发光底物均匀加到膜上，Bio-Rad成像系统显影拍照。
[0115] 结果见图4，pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt转染293T细胞后均可在细胞裂解液中检出目的蛋白的表达，但pJW4303-tPA-Gn-opt组目的蛋白表达量更高且可同时分泌到胞外，目的蛋白Gn表观分子量约为61kDa。阴性对照空载体pJW4303转染293T细胞的上清及裂解液均没有检出目的蛋白的存在。
[0116] 实施例7.pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt核酸疫苗体液免疫原性的研究[0117] 在核酸疫苗构建和表达成功后，对BALB/c小鼠进行免疫，通过ELISA方法检测其免疫原性。7.1pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt免疫BALB/c小鼠，实验设计如下：
[0118] 表1 pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt免疫BALB/c小鼠
[0119]
[0120] 如表1，用pJW4303、pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt各免疫一组BALB/c小鼠。肌肉注射100μg相应质粒，注射后立即于注射部位用WJ-2002活体基因导入仪进行体内电转染(针头插入深度至少2mm，电转染参数：电压50V，脉冲次数正反各3次，波宽30ms，频率30Hz)，以小鼠腿部肌肉发生抖动视为电转染有效。于第0、2、4、8周进行DNA免疫，于每次免疫前、第6周、末次免疫后两周采血。
[0121] 7.2ELISA检测血清中Gn特异性IgG
[0122] 用ELISA方法检测血清中特异的IgG抗体反应，评价pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt核酸疫苗在BALB/c小鼠模型中诱导产生体液免疫的能力。
[0123] 1)抗原包被：pJW4303-tPA-Gn-opt转染上清作为抗原包被ELISA板(使用PBS pH7.2-7.4作为稀释液)，每孔100μl，4℃，过夜。
[0124] 2)洗板：弃掉包被液，用0.05％PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗板5次。
[0125] 3)封闭：1％BSA和4％Whey(含0.05％Tween-20、1％BSA和4％Whey的PBS)，每孔200μl，37℃，封闭1h。
[0126] 4)洗板：弃掉封闭液，用0.05％PBST洗板5次。
[0127] 5)加入待测样本：加入待检测血清，即一抗，起始稀释度为1:200，再进行1:2倍比稀释。每孔加入100μl，37℃，孵育1h(一抗稀释液为含4％whey和0.5％Tween-20的PBS)。
[0128] 6)洗板：弃一抗，用PBST洗板5次。
[0129] 7)加生物素标记的二抗：生物素标记的羊抗鼠IgG(1:5,000稀释)，每孔加入100μl，37℃，孵育1h(抗体稀释液为含4％whey和0.5％Tween-20的PBS)。
[0130] 8)洗板：弃生物素标记的羊抗鼠IgG，PBST洗板5次。
[0131] 9)加HRP-标记的链亲和素：HRP标记(1:4,000稀释)，每孔加入100μl，37℃，孵育1h(稀释液为含4％whey和0.5％Tween-20的PBS)。
[0132] 10)弃HRP标记的链亲和素，PBST洗板5次。
[0133] 11)TMB显色：TMB溶液配方，TMB片剂1片，0.1M磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液5ml，双蒸水5ml，30％双氧水2μl。每孔加入100μl，室温下静置3.5min，每孔加入50μl 1M的H2SO4终止显色。
[0134] 12)酶标仪设定630nm为参考波长，450nm为测试波长，测定并记录各孔A450值，计算复孔平均值，以免疫前血清吸光度值的2.1倍作为cut-off值，而且免疫后血清吸光度值小于0.05的孔也去除。
[0135] BALB/c小鼠血清Gn特异性IgG应答时间曲线如图5所示。pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt核酸疫苗免疫组小鼠血清中均可检测到Gn特异性IgG，且随着免疫次数的增加，免疫应答强度逐步提高。pJW4303空载体组小鼠的血清中未能检测到Gn特异性IgG应答。
[0136] BALB/c小鼠血清Gn特异性IgG抗体最高滴度如图6所示。图中显示第四次免疫后2周的BALB/c血清中，pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt免疫组均有较高滴度的特异性抗体，而pJW4303空载体免疫组则未检测到抗体应答。pJW4303-tPA-Gn-opt组与pJW4303-WSP-Gn组、pJW4303组比较具有统计学差异(P<0.05)。pJW4303-WSP-Gn组和pJW4303组比较具有统计学差异(P<0.05)。
[0137] 本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。
[0138] 实施例中所涉及的试剂信息如下表：
[0139]
[0140]
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