用于调节植物免疫的组合物和方法
阅读：313发布：2020-05-23
专利汇可以提供用于调节植物免疫的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且涉及农业领域，公开了增强 植物 疾病 抗性的组合物和方法，包括小分子 杀虫剂 和植物疾病抗性。本 发明 提供称为 蛔甙 的一组小分子及使用其调节多种植物物种病原体或 病原体抗性 的方法。，下面是用于调节植物免疫的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种调节植物抗病性的方法，所述方法包括使所述植物或植物部分接触有效量的至少一种蛔甙，所述蛔甙提高对一种或多种病原体的植物抗性，和/或诱导一种或多种植物防御反应，这可以有效地抑制病原体的生长和/或侵染，
其中所述方法包括使所述植物或植物部分接触ascr#18:
2.权利要求1所述的方法,所述方法还包括检测至少一种植物疾病反应参数。
3.权利要求2所述的方法,其中所述植物防御反应是植物基础免疫反应或先天免疫反应。
4.权利要求3所述的方法,其中所述植物防御反应选自至少一个系统获得性抗性的激活，水杨酸，茉莉酮酸酯和乙烯疾病反应途径。
5.权利要求1所述的方法,其中所述植物疾病反应参数选自相关基因表达改变。
6.权利要求5所述的方法,其中所述植物防御相关基因是PR-1或PDF1.2。
7.权利要求1所述的方法,其中所述植物部分选自根，茎，叶，种子和花。
8.权利要求1所述的方法,其中所述植物选自烟草，拟南芥，番茄，大麦，马铃薯，甘薯，山药，棉花，大豆，草莓，甜菜，玉米，水稻，小麦，黑麦，燕麦，高粱，小米，绿豆，豌豆，苹果，香蕉，梨，樱桃，桃，李，杏，杏仁，葡萄，猕猴桃，芒果，甜瓜，木瓜，核桃，榛子，开心果，覆盆子，黑莓，罗甘莓，越桔，蔓越橘，橘子，柠檬，葡萄柚，莴苣，胡萝卜，洋葱，西兰花，卷心菜，鳄梨，可可，木薯，和亚麻。
9.权利要求1所述的方法,其中所述植物是蜜桔。
10.权利要求1所述的方法,其中所述蛔甙可以引起所述植物的免疫反应。
11.权利要求1所述的方法,其中所述接触导致整个所述植物的系统性疾病抗性。
12.权利要求1所述的方法,其中所述接触导致所述植物的局部抗性。
13.权利要求1所述的方法,其中所述病原体是真菌。
14.权利要求1所述的方法,其中所述病原体是卵菌。
15.权利要求1所述的方法,其中所述病原体是细菌。
16.权利要求1所述的方法,其中所述病原体是线虫。
17.权利要求1所述的方法,其中所述病原体是昆虫。
18.权利要求1所述的方法,其中所述方法还包括使所述植物或植物部分接触至少一种选自以下的蛔甙：ascr#16,ascr#20,ascr#22,ascr#24,ascr#26,ascr#15,ascr#17,ascr#
19,ascr#21,ascr#23,ascr#25,ascr#10,ascr#3,ascr#7,ascr#1,ascr#8,ascr#9,ascr#2,ascr#4,ascr#5,icas#9,oscr#10,mbas#3,bhas#18和hbas#3:
19.权利要求1-18任一项所述的方法,其中所述植物接触具有两种或多种蛔甙,其加和地或协同地作用以增加植物病原体抗性和/或抑制病原体的生长。
20.权利要求19所述的方法,其中所述两种蛔甙是ascr#18和ascr#9。
21.权利要求1所述的方法,其中所述蛔甙是ascr#18,其中所述的病原体是烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)，并且其中所述植物是烟草。
22.权利要求1所述的方法,其中所述的病原体是丁香假单胞杆菌番茄致病变种
(Pseudomonas syringae pv.tomato)，并且其中所述植物是拟南芥。
23.权利要求1所述的方法,其中所述蛔甙是ascr#18,其中所述的病原体是致病疫霉菌(Phytophthora infestans)，并且其中所述植物是马铃薯。
24.权利要求1所述的方法,其中所述两种蛔甙,是ascr#18,其中所述的病原体是致病疫霉菌，并且其中所述植物是番茄。
用于调节植物免疫的组合物和方法
[0002] 本发明根据美国农业部授予的批准号G14603-R50-01821的政府支持完成。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
背景技术
[0005] 在过去的二十年中，已经证明特定分子模式的识别在植物和动物的免疫反应中发挥核心作用(Boller and Felix,2009；Ronald and Beutler,2010)。已经证明植物和动物具有模式识别受体,该受体可用于检测与微生物的特定类相关的多个不同分子特征识别鞭毛蛋白，脂多糖，肽聚糖，和其它病原体相关分子模式(PAMP)的细菌。例如，拟南芥识别细菌,该细菌用特定的模式识别受体(PRRs)识别鞭毛蛋白，脂多糖，肽聚糖，和其它病原体相关分子模式(PAMP)。PAMP感知触发防御反应的开始,其表示植物中活跃微生物防御的第一道防线。此外，PAMP感知可以导致植物的长期敏化，导致未来防御反应更快速和/或更强烈的激活,这可以使植物对生物和非生物胁迫反应的抵抗增强(Conrath et al.,2006)。类似防御反应可以通过源自植物本身的分子种类触发，所谓损伤相关分子模式(DAMPS；(Bianchi,2007)，其例如会起因于昆虫取食。与此相反，虽然发现有少数来自昆虫口腔分泌物的脂质衍生的小分子物种或属特异性家族可以触发植物防御反应，但还没有已知的保守昆虫或由植物识别的线虫相关分子模式(Schmelz et al.,2009；Schroder,1998)。
[0006] 线虫可以说是地球上数量最多的动物。它们普遍存在于土壤并寄生于大多数植物和动物，并因此导致全世界每年超过1000亿美元的农业损失(Blumenthal and Davis,2004)。在最近的工作中，Schroeder实验室已经表明蛔甙代表线虫衍生的小分子的进化上保守的家族,其在规范发展和社会行为中起至关重要的作用(Choe et al.,2012b；
Pungaliya et al.,2009；Srinivasan et al.,2008；von Reuss et al.,2012)蛔甙是从线虫中发现的具有脂肪酸衍生的亲脂性侧链的双脱氧糖蛔糖甙。虽然某些线虫蛔甙(NAS)被不同种类的线虫广泛生产，但其它NAS具有高度的种特异性或主要与特定的生态学相关。例如,NAascr#9在昆虫(昆虫寄生)线虫中尤为常见(Choe et al.,2012b),而较长链的ASCR#
18由几种植物寄生属的根结线虫产生。不同的结构变异往往与截然不同的活动概况相关，并且可以在非常低的浓度经常观察到生物活性。我们已经确定了来自20种不同线虫的超过
200种的不同NA结构，这证明NA广泛分布于包括人类寄生虫和植物寄生线虫的线虫动物门(Bose et al.,2012；Choe et al.,2012b；von Reuss et al.,2012)。这些结果表明NA是线虫高度保守的分子信号。根据这些结果，NA也可能通过与线虫相互作用的生物感知,包括它们的植物和动物宿主以及线虫相关的微生物。
Pungaliya et al.,2009；Srinivasan et al.,2008；von Reuss et al.,2012)蛔甙是从线虫中发现的具有脂肪酸衍生的亲脂性侧链的双脱氧糖蛔糖甙。虽然某些线虫蛔甙(NAS)被不同种类的线虫广泛生产，但其它NAS具有高度的种特异性或主要与特定的生态学相关。例如,NAascr#9在昆虫(昆虫寄生)线虫中尤为常见(Choe et al.,2012b),而较长链的ASCR#
18由几种植物寄生属的根结线虫产生。不同的结构变异往往与截然不同的活动概况相关，并且可以在非常低的浓度经常观察到生物活性。我们已经确定了来自20种不同线虫的超过
200种的不同NA结构，这证明NA广泛分布于包括人类寄生虫和植物寄生线虫的线虫动物门(Bose et al.,2012；Choe et al.,2012b；von Reuss et al.,2012)。这些结果表明NA是线虫高度保守的分子信号。根据这些结果，NA也可能通过与线虫相互作用的生物感知,包括它们的植物和动物宿主以及线虫相关的微生物。
发明内容
[0007] 本发明提供一种调节植物抗病性的方法。示例性方法包括植物或植物部分接触至少一种蛔甙的有效量,蛔甙能有效地提高植物对一种或多种病原体的抗性，从而抑制病原体生长和/或侵袭，该方法可以进一步包括测定至少一种植物的疾病反应参数。在具体的实施方案中,植物防御反应是基础或先天性免疫反应,并选自系统获得抗性的活化，水杨酸，茉莉酮酸酯，乙烯和一氧化氮疾病反应途径中的至少一个。在某些情况下，至少一种所述蛔甙可以有效的触发植物防御反应。在另一个实施方案中，植物接触两个或更多种蛔甙和/或水杨酸,其相加作用或协同作用以增加植物病原体抗性和/或抑制病原体的生长。抗性诱导可以是系统的或局部的。根据本文描述的方法进行评估的疾病响应参数包括但不限于：防御相关基因表达的改变,胼胝质沉积,活性氧的产生,Ca2+内流,和MAP激酶活化。
[0008] 可以使用本文所公开的方法治疗多种植物。此类植物包括但不限于，烟草，拟南芥，番茄，大麦，马铃薯，甘薯，山药，棉花，大豆，草莓，甜菜，玉米，水稻，小麦，黑麦，燕麦，高粱，小米，绿豆，豌豆，苹果，香蕉，梨，樱桃，桃，李，杏，杏仁，葡萄，猕猴桃，芒果，哈密瓜，木瓜，核桃，榛子，开心果，覆盆子，黑莓，杨莓，蓝莓，蔓越莓，橙，柠檬，柚子，橘子，生菜，胡萝卜，洋葱，西兰花，卷心菜，鳄梨，可可，木薯，棉花，和亚麻。附图说明
[0009] 图1.在昆虫病原线虫(e.g.ascr#9),植物寄生线虫根结线虫属(ascr#18),及动物寄生虫巴西诺卡菌和锡兰钩口线虫中发现了NA。
[0010] 图2.线虫蛔甙ascr#18可以提高植物烟草W38中SA诱导的PR-1蛋白表达。用注射器将缓冲液，SA，或SA的混合物(50μM或500μM后)和降低浓度的ascr#18(10,0.3,和0.01μM)渗入四周龄的烟草植物。使用抗PR-1抗体通过免疫印迹处理48小时后检测PR-1。考马斯亮蓝(CB)染色对照表明所有样本的上样量相同。
[0011] 图3A和3B.用ascr#18处理烟草根可以提高SA处理的草叶中SA诱导的PR-1蛋白的转录(图.3A)和表达(图.3B)。用NA(0.01μM)浸泡根，而同时通过用注射器将SA(250μM)渗入处理测试叶片。分析SA处理48小时后的PR-1表达。EF1-α对照和考马斯亮蓝(CB)上样对照表明所有样本的上样量相同。
[0012] 图4A和4B.ascr#18可以提高烟草对致命的烟草野火病菌(Pt)的抵抗力。(图.4A)通过注射器将ascr#18(0.01μM)和/或不同浓度的SA(50μM或250μM)渗入处理叶片24小时后,接种P.t.。(图.4B)另外，用NA(0.01μM)浸泡根，而同时通过注射器将不同浓度的SA(50μM或250μM)渗入处理测试叶片。SA处理测试叶片24小时后接种P.t。接种48小时后,确定细菌生长。*P<0.05,**P<0.005(t检验)。
[0013] 图5.ascr#18可以改变拟南芥中PR-1和PDF1.2的表达。(Fig.5A)用注射器将缓冲液，SA(50μM),ascr#18(0.01或0.3μM)或SA和ascr#18的混合物渗入四周龄拟南芥生态型Col-0的叶子。半定量PCR检测PR-1和PDF1.2的表达。用β微管蛋白作内部对照，表明所有样本的上样量相同。(Fig.5B)另外，用ascr#18浸泡拟南芥根部，而同时用缓冲液或SA处理测试叶片。处理24小时后，提取叶片RNA。
[0014] 图6.ascr#18提高拟南芥对致命野火病菌番茄DC3000(PST)的抵抗力。用注射器将ascr#18(0.3μM)和/或SA(50μM)渗入拟南芥生态型Col-0的叶子24小时后,接种Pst。接种48小时后,确定细菌生长。*P<0.05,**P<0.006,***P<0.006(t检验)。
[0015] 图7.ascr#10,ascr#3,和ascr#7的结构。结构命名可以在www.smid-db.org找到。
[0016] 图8.NAs北方根结线虫侵染期幼虫发现NAs。在缓冲液中孵育线虫24小时，并且收集上清用于HPLC-MS分析。显示的是NAs ascr#16至ascr#26[M-H]的-对应离子色谱图。此外，北方根结线虫产生少量的短链ascr#10。
[0017] 图9.scr#9和NA衍生物icas#9,mbas#3及ascr#8的结构。
[0018] 图10.NA可以提高马铃薯品种Désirée对马铃薯疫霉致命US22株的抵抗力。用水(对照)或NA(0.01μM)浸泡马铃薯植物的根48h后,用离体叶片接种法接种马铃薯疫霉菌,。(A)接种5天后马铃薯叶片的照片。接种区域圈了出来。(B)接种5天后,马铃薯疫霉引起的病变大小。*P<0.05(t-检验)。
[0019] 图11A,11B,和11C.NA可以提高番茄品种M82和Rio Grande对致病力强的马铃薯疫霉致命US22株的抵抗力。用水(-)或0.01μM NA(+)浸泡番茄植物的根48h后,用离体叶片接种法接种马铃薯疫霉菌。图11A.接种6天后番茄叶片的照片。图11B.接种4天和5天后,两个番茄品种中马铃薯疫霉菌引起的病变大小。图11C.接种6天后计数的每ml孢子囊数。*P<0.05(t-检验)。
[0020] 图12A,12B,和12C.图12A:ascr#18的各种处理方法可以提高烟草对烟草野火病菌的抵抗力。用注射器将ascr#18(0.01μM；NA)渗入烟叶。ascr#18作用24小时后,用注射器将水杨酸(50μM；SA)渗入叶片。ascr#18作用48小时后接种烟草野火病菌，并在接种2天后检测细菌生长。*P<0.05(t-检验)。图12B:用烟草植物喷洒ascr#18(0.01μM)24小时(a)或48小时(b)后接种烟草野火病菌。*P<0.05(t检验)。图.12C:用ascr#18(0.01μM或0.03μM),SA(250μM),BTH/苯并噻二唑(0.075g/L)溶液或其组合在指定的时间浸泡烟草植物的根后,接种烟草野火病菌。*P<0.05(t-检验)。
[0021] 图13A-13I.图13A:用ascr#18处理根部可以提高拟南芥对丁香假单胞杆菌番茄致病变种的抵抗力。用ascr#18(0.3μM,1μM,or 5μM)溶液浸泡拟南芥的根24小时后,接种丁香假单胞杆菌番茄致病变种。*P<0.05,***P<0.0005(t-检验t)。Fig.13B:示出ascr#18处理过的拟南芥根PR-1和FRK1基因的表达。Fig.13C:示出ascr#18可以提高拟南芥对甜菜胞囊线虫的抵抗力。*P<0.02(t-检验)。Fig.13D:示出ascr#18可以提高拟南芥对丁香假单胞杆菌番茄致病变种的抵抗力。用注射器将ascr#18(0.3μM),easc18(0.3μM)和/或SA(50μM)溶液渗入拟南芥叶片24小时后，接种丁香假单胞杆菌番茄致病变种。接种3天后，检测细菌生长。*P<0.01,**P<0.001,***P<0.0001,****P<0.00005(t-检验)。
[0022] 图13E:显示ascr#3可以改变拟南芥PR-1和PDF1.2的表达。50μM SA与ascr#3一起或单独施用。微管蛋白作为内部对照。图.13F:显示ascr#9可以改变拟南芥PR-1和PDF1.2的表达。50μM SA与ascr#9一起或单独施用。微管蛋白作为内部对照。图13G:用ascr#3处理可以提高对丁香假单胞杆菌番茄致病变种的抵抗力。用注射器将ascr#3(0.3μM)和/或SA(50μM)溶液渗入拟南芥叶片24小时后，接种丁香假单胞杆菌番茄致病变种。接种3天后，检测细菌生长。*P<0.05,**P<0.001(t-检验)。图13H:显示ascr#10改变拟南芥PR-1和PDF1.2的表达。微管蛋白作为内部对照。图13I:显示ascr#9改变拟南芥PR-1和PDF1.2的表达。微管蛋白作为内部对照。
[0023] 图14A-14G.图14A:示出了用乙醇处理90分钟后番茄悬浮细胞的pH变化，Flg22肽(阳性对照)，或与所示ascr#18浓度(μM)。图14B:ascr#18处理可以提高番茄对灰霉病菌的抵抗力。用水(-)或0.01μM ascr#18或0.01μM easc18浸泡番茄植物的根部48小时后，用离体叶片接种法接种致病力强的灰霉病菌B05.01株。接种3天后被确定灰霉病菌引起的病变大小。图14C:接种3天后灰霉病病变的照片。图14D:ascr#18或easc18可以提高番茄对致病疫霉的抵抗力。用水(-)或0.01μM ascr#18或easc18或两者的组合物处理番茄品种Rio Grande 48小时后用例体叶片接种法接种致病疫霉。接种5天后确定致病疫霉引起病变的大小。***P<0.0009(t-检验)。图14E:接种6天后确定致病疫霉孢子囊数量。***P<0.0009,**P<0.001,*P<0.01(t-检验)。图14F:用指定浓度的乙醇(ETOH)或蛔甙处理番茄悬浮细胞，并在加入蛔甙后检测培养基PH变化12小时。图14G:通过水(-)或1μM ascr#9浸泡根处理番茄品种M82 48小时后用离体叶片接种法接种致病力强的致病疫霉菌US22株。接种7天后确定致病疫霉引起病变的大小。*P<0.0005(t-检验)。
[0024] 图15A,15B和15C.图15A:示出1μM ascr#18处理48小时后大麦叶片PR-1叶片的诱导。图15B:用ascr#18处理大麦叶片可以提高其对大麦白粉病菌的抵抗力。用指示浓度的ascr#18喷洒大麦叶片48小时后接种大麦白粉病菌。接种7天后，大麦叶片感染部分的照片。图15C:接种7天后，统计BGH脓疱的数量。
具体实施方式
[0025] 线虫蛔甙(NA),一个高度保守线虫衍生的小信号分子家族，充当小鼠免疫抑制剂并诱发捕食线虫的真菌的形态变化。本文中所呈现的结果表明NA还改变植物对病原微生物的防御反应。因为线虫普遍存在于土壤，所以它们通过根与几乎所有的植物联系。NA改变防御反应的识别机制为植物免疫力提供新的见解并促进加强植物保护，防治线虫和其他病原体的战略发展。因此，本发明也可以提高粮食安全和减少农药使用，从而提高农业经济和环境的可持续性。
[0026] 选择天然存在的NA变体以及合成其它的合成变体和衍生物，并检测其在在烟草，拟南芥，番茄，马铃薯和其他作物品种中的防御反应调节活性，为进一步发展做最有效的选择。为了进一步表征分子机制，探讨NA调节植物的防御反应的几种途径将。因为NA激活水杨酸(SA)介导和茉莉酸(JA)介导的防御反应并增强对植物病毒的抵抗力，所以用SA-，JA-和/或乙烯(ET)-缺失突变体和全局转录组分析探讨NA的信号机制。已经确定的是，NA分别通过JA/ET-或SA-依赖途径提高对死体和活体营养型病原抵抗力，以及其在抗性基因介导的对微生物的免疫和对囊肿及根结线虫抗性中的作用。使用放射性示踪研究确定NA是否通过NA易位诱导系统抗性。可以通过分析防御基因表达和抗病性进一步测试NA对多种作物的适用性。
[0027] 提供下列定义，,便于大家快速理解。
[0028] 术语“蛔甙”是指大多数线虫存在的任何一组含有蛔糖甙的糖脂。
[0029] 术语“病原体”是指任何可以使植物致病的细菌，真菌，卵菌，病毒，线虫，或昆虫。
[0030] 术语“病原体接种”是指将病原体接种到植物。
[0031] 术语“疾病的防御反应”是指植物代谢，生物合成活性或基因表达的变化，这些变化可以增强其抑制病原体复制和扩散的能力(即，抵抗病原体)。植物病害防御反应的例子包括，但不限于:产生具有抗微生物活性的低分子量化合物(称为植物抗毒素)和诱导防御(或防御相关)基因的表达，其产物包括，例如，过氧化物酶，细胞壁蛋白，蛋白酶抑制剂，水解酶，病程相关(PR)蛋白和植物抗毒素生物合成酶，例如苯丙氨酸解氨酶和查尔酮合酶(Dempsey and Klessig,1995；Dempsey et al.,1999)。植物中此类防御反应可能由涉及二次防御信号分子产生的多个信号转导途径诱导。其中某些防御反应途径具有SA依赖性，而另一些部分有SA依赖性，有的则是不依赖于SA。.已知的诱发植物疾病防御反应的因素包括，但不限于：(1)微生物病原体，如真菌，卵菌，细菌和病毒，(2)微生物成分和其它防御反应激发子，如蛋白质和蛋白质片段，小分子肽，β葡聚糖，激发素，过敏素类蛋白和低聚糖。防御信号通过几种植物激素，如SA，乙烯，和茉莉酮酸酯介导。
[0032] 术语“防御相关的基因”和“防御相关的蛋白质”是指感染病原体后表达或合成的基因及其编码的蛋白质。
[0033] 本文所述的含有蛔甙的植物和土壤的处理，可以直接地或通过某些化合物通过惯用的处理方法作用于周围的环境，环境或存储空间进行，例如通过浸泡，喷雾，蒸发，雾化，散射，画上，至于繁殖材料，特别是种子，通过施加一个或多个涂层进行。根据植物物种或植物品种，其所在地和生长条件(土壤，气候，生长期，饮食)，根据本发明的处理也可能产生超加性(“协同”)效应。因此，例如，施用率的降低和/或活性谱的增宽和/或使用的物质和组合物的活性增加，植物生长更好，对高或低温的耐受性增加，对干旱或者对水或土壤盐含量的耐受性增加，花开的增多，易于收获，加速成熟，收获率提高，质量更好和/或采收产品的营养价值更高，贮存稳定性提高和/或收获的产品的加工超出了预期影响。
[0034] 本文所描述的蛔甙可以以不变的形式或与农业上可接受的载体一起使用。术语“农学上可接受的载体”包括适于施用到植物或土壤的任何载体，例如，配制技术中常用的赋形剂，如溶液(例如，可直接喷雾或可稀释的溶液)，乳液，(如，乳液浓缩物和稀释的乳剂)，可湿性粉剂，悬浮剂，可溶性粉剂，粉剂，粉剂，糊剂，可溶性粉剂，颗粒剂，悬浮液-乳液浓缩物，封装成聚合材料，可涂布膏剂，浸有活性化合物的天然和合成材料和聚合物质的微胶囊化。这些制剂以已知的方式产生，例如通过混合化合物与农学上可接受的载体，如液体溶剂或固体载体，任选地使用表面活性剂，包括乳化剂，分散剂，和/泡沫剂。
[0035] 如果农学上可接受的载体是水，它也可以采用，例如，有机溶剂作为助溶剂。合适的液体溶剂包括，例如，芳烃(如二甲苯，甲苯和烷基萘)；氯化芳烃或氯化脂族烃(如，氯苯，氯乙烯和二氯甲烷)；脂族烃(例如，环己烷)；链烷烃(如石油馏分，矿物油和植物油)；醇(例如，丁醇或乙二醇以及它们的醚和酯)；酮(例如，丙酮，甲基乙基酮，甲基异丁基酮和环己酮)和强极性溶剂(例如，二甲基甲酰胺和二甲基亚砜)。优选的是,本发明中使用无毒载体。
[0036] 合适的固体农学上可接受的载体包括，例如，铵盐和地面天然矿物质(如高岭土，粘土，滑石，白垩，石英，绿坡缕石，蒙脱土和硅藻土)；地面合成矿物(例如，高度分散的二氧化硅，氧化铝和硅酸盐)；粉碎和分级的天然岩石(如方解石，大理石，浮石，海泡石和白云石)；无机和有机食品的合成颗粒；有机材料颗粒(例如，锯末，椰子壳，玉米穗轴和烟草茎)。
[0039] 增粘剂例如羧甲基纤维素和天然及合成聚合物以粉末，颗粒或胶乳的形式用于制剂，例如阿拉伯胶，聚乙烯醇和聚乙酸乙烯酯，以及天然磷脂，如脑磷脂和卵磷脂，和合成的磷脂。其它添加剂可以包括，例如，矿物油和植物油。
[0041] 植物防御诱导组合物可以通过本领域中已知的任何技术，包括，例如，喷雾，雾化，喷粉，撒播，包衣或灌注给药到植物或土壤。本领域技术人员根据抵抗特定的有害生物要对抗，使用化合物的具体化学成分和制剂，使用化合物/制剂的方法，和处理轨迹,不需要过多的实验就可以确定施用合适的技术。
[0042] 在一个实施方案中，植物防御反应的诱导剂可通过叶面喷施来施用。在另一个实施方案中，该组合物还可以通过用液体制剂浸湿植物所在地或通过固体形式掺入土壤,在经由土壤(系统作用)到达到植物的根系，例如，以颗粒的形式(土壤施用)。在水稻栽培中，这些颗粒可用于淹没的稻田。本发明的组合物也可以施加到块茎或种子粒，例如，通过含组合物的液体蛔甙浸泡，喷雾或浸湿种子粒或块茎，或通过用固体蛔甙组合物涂布块茎或籽粒。
[0043] 本文公开的组合物通常包含的活性化合物在0.1和95％之间(重量)，优选在0.5和90％之间。良好的应用率通常是指0.1g到2kg活性物质(AS)每公顷(公顷)，例如，1g到1kg AS/ha或2g到600g AS/ha。块茎或籽粒的应用可以按照1mg到1g剂量活性物质每kg块茎或籽粒。
[0044] 术语“基本上纯”是指一种制剂，其包含给定材料的至少50-60％(重量)(例如，小分子，核酸，寡核苷酸，蛋白质等)。更优选地，制剂包含至少75％(重量)，且最优选给定化合物的90-95％(重量)。给定化合物的纯度通过适当的方法测定(如色谱法，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，HPLC-MS分析，等等)。
[0045] 本文所用的术语“功能性”是指蛔甙对于所列举的检测或目的是有用的，例如，对于植物免疫力和抗病性的调节。
[0046] 用本文所述的组合物和方法处理的植物和植物细胞胞包括，但不限于：烟草，拟南芥，番茄，大麦，马铃薯，甘薯，山药，木薯，棉花，大豆，草莓，甜菜，玉米，水稻，小麦，黑麦，燕麦，高粱，小米，油菜，豆类，豌豆，苹果，香蕉，梨，樱桃，桃，李，杏，杏仁，葡萄，猕猴桃，芒果，甜瓜，木瓜，核桃，榛子，开心果，覆盆子，黑莓，罗甘莓，越桔，蔓越橘，橘子，柠檬，柚子，橘子，莴苣，胡萝卜，洋葱，西兰花，卷心菜，鳄梨，和可可。
[0047] 本文所述的方法中使用的蛔甙可以在结构上有所不同。术语“烷基”是指可以是直链，支链或环状烃结构或其组合的脂族烃基。代表性的烷基具有24个或更少的碳原子，例如，甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，异戊基，正己基等元素。低级烷基是指在链中具有约1至约6个碳原子的烷基。支链烷基是指一个或多个低级烷基如甲基，乙基或丙基连接到线性烷基链。
[0048] 烷基包括直链，支链，或环状烃结构及其组合是指一个“烷基”还包括直链和环状的结构元件的下列组合 (以及类似的组合)。
[0049] “烯基”是指烷基，如上所定义的，相邻的碳原子之间包含至少一个双键。烯基包括顺式和反式异构体。支链烯基是指一个或多个低级烷基如甲基，乙基，或丙基连接到线性烯基链。代表性的直链和支链烯基是链中具有约2至约6个碳原子的烯基，例如，亚乙基，丙烯基，I-丁烯基，2-丁烯基，异丁烯基，I-戊烯基，2-戊烯，3-甲基-1-丁烯基，2-甲基-2-丁烯基，2,3-二甲基-2-丁烯基，等等。
[0050] 术语“卤素”是指氟，氯，溴和碘。
[0051] 术语“卤代烷基”是指被一个或多个卤素取代的上述支链或直链烷基，。
[0052] 术语“卤代烯基”是指被一个或多个卤素取代的上述支链或直链烯基，。
[0053] 术语“芳基”指6至约19个碳原子的芳族单环或多环环系统，例如，约6至约10个碳原子，并包括芳烷基。代表性的芳基包括，但不限于例如苯基，萘基，薁基，菲基，蒽基，芴基，芘基，三亚苯基，草屈基和四苯基的基团。
[0054] 术语“芳烷基”指连接于芳环的烷基残基。例子有苄基，苯乙基等。
[0055] 术语“杂芳基”是指约5至约19个环原子例如约5至约10个环原子的芳族单环或多环环体系，其中所述环体系中的一个或多个原子是除碳以外的元素，例如，氮，氧和/或硫。本领域技术人员中熟知的是杂芳环与它的全碳对应物相比有较少的芳香性。因此，根据本发明的目的，“杂芳基”只需要具有一定的芳族特性。例如，在多环环系的情况下，只有一个环需要是芳族的环系被定义为“杂芳基”。典型杂芳基含有约5至6个环原子。杂芳基前的的前缀氮杂，氧杂，硫杂，或硫代分别指至少一个氮，氧或硫原子作为环原子。杂芳基中的环氮，碳或硫原子可以任选被氧化；所述氮可任选被季铵化。代表性杂芳基包括，但不限于：嘌呤基，吡啶基，2-氧代吡啶基，嘧啶基，哒嗪基，吡嗪基，三嗪基，呋喃基，吡咯基，噻吩基，吡唑基，咪唑基，恶唑基，异恶唑基，噻唑基，异噻唑，三唑基，恶二唑基，噻二唑基，四唑基，吲哚基，异吲哚基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，二氢吲哚基，2-氧吲哚基，二氢苯并呋喃基，二氢苯并噻吩，吲唑，苯并咪唑，苯并恶唑，苯并噻唑，苯并异恶唑，苯并噻唑基，苯并三唑基，喹啉基，异喹啉基，喹唑啉基，噌啉基，酞嗪基，喹喔啉基，和类似基团。
[0056] 术语“环烷基”和“环烯基”是指非芳族的,饱和的(环烷基)或不饱和的(环烯基)，单或多环状环系统，约3至8个碳原子，例如约5至7个碳原子。典型的环烷基和环烯基包括，但不限于:环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，降冰片基，环丙烯基，环丁烯基，环戊烯基，环己烯基，环苯基，反式联环丙烷，顺式三环丙烷，和类似基团。
[0057] 如本文所用，“杂环”或“杂环基”是指稳定的饱和，不饱和，或芳族的3-至18元环(根)，它由碳原子和选自氮，氧和硫的一至五个杂原子组成。就本发明而言，所述杂环可以是单环，双环或多环环系，其可以包括融合，桥接或螺环系统，包括双环，其中上述任何杂环被融合到苯环上。杂环中的氮，碳或硫原子可以任选被氧化；氮原子可以任选被季铵化；并且该环可以是部分或完全饱和。该杂环可以通过任何杂原子或碳原子连接。杂环包括定义如下的杂芳基。此类的杂环的实例包括，但不限于:吗啉基，吡咯烷酮基，吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，乙内酰脲，戊内酰胺基，环氧乙烷基，氧杂环丁基，四氢呋喃基，四氢吡喃，四氢吡啶基，四氢嘧啶碱基，四氢噻吩，四氢噻，四氢嘧啶基，四氢噻吩，四氢噻喃，和类似基团。Katritzky et al.,eds.中进一步介绍杂环和杂芳基。综合杂环化学：杂环化合物的结构，反应，合成和应用，卷.1-8,Pergamon出版,N.Y.(1984),在此通过引用以其整体并入。
[0058] 术语“酰基”指的是1至8个碳原子基团构成的直链，支链，或环状结构，可以是饱和的，不饱和的，或芳族的，及其组合，通过羰基官能团连接到母体结构。只要与母体的连接点是羰基，酰基残基中的一个或多个碳可以被氮，氧或硫代替。实例包括乙酰基(Ac)苯甲酰基，丙酰基，异丁酰基，叔丁氧基羰基，苄氧基羰基，和类似基团。
[0059] 术语“氨基酸”是指保留通过氨基酸的羧基与另一分子的氨基反应形成的酰胺键的氨基酸片段。氨基酸可以是D-或L-构型。合适的氨基包括α氨基酸，β氨基酸，γ氨基酸，δ型氨基酸，和ε氨基酸，并且不仅包括天然氨基酸(即，那些在生物系统中发现，包括在天然蛋白质中发现的20个氨基酸中)，也包括这些氨基酸天然存在的变异体，以及本领域技术人员知道的合成氨基酸和它们的类似物。典型的氨基酸包括20种天然氨基酸，4-羟基脯氨酸，羟基赖氨酸，锁链赖氨素，异锁链素，3-甲基组氨酸，正缬氨酸，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，瓜氨酸，高半胱氨酸，高丝氨酸，鸟氨酸和甲硫氨酸砜。
[0060] 术语“嘧啶”指的是含有两个碳原子被两个氮原子取代的苯环(二氮杂苯)的杂芳族化合物。例如，认为1和3位点中的碳原子被氮原子取代的下列基团是嘧啶 本文所定义的这个术语，也包括异构形式二氮杂苯，例如在1和2位点是氮原子的邻二氮杂苯；和在1和4位点是氮原子的氮(杂)苯。术语“嘧啶”通常包括其类似物和衍生物。例如，天然的核碱基，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(D)是嘧啶衍生物。术语“嘌呤”是指融合到咪唑环含有嘧啶环的杂芳族化合物。术语“嘌呤”也一般包括其类似物和衍生物。例如，天然的核酸碱基，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)。天然存在的嘌呤衍生物的其他例子是次黄嘌呤，黄嘌呤，可可碱，咖啡因，尿酸，和异鸟嘌呤。典型的嘌呤和嘧啶公开在美国专利3,687,808；高分子科学与工程简明百科全书，858-859页；30 Kroschwitz,1.1.,ed.John Wiley&Sons,1990；和Englisch等人,应用化学，国际版，1991,30,613，其中每一个在此通过引用并入其全文。
[0061] 术语“核碱基”包括所有的天然和合成的核碱基以及通用的核碱基。典型的天然核碱基包括腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，和胸腺嘧啶。合成核碱基通常包括肌苷，黄嘌呤，次黄嘌呤，nubularine，异鸟嘌呤核苷，或杀结核菌素。如本文所用，通用核碱基是任何修饰的，未修饰的，天然存在的或非天然存在的核碱基，它可以代替一个以上的天然核碱基。通用碱基通常含有芳香环基团，其可含有或不含有氮原子，并且一般采用芳环堆积来稳定寡核苷酸双链。一些通用碱可以共价连接到戊糖的氯'碳形成通用核苷酸。一些通用碱基不氢键专门与另一碱基。一些通用碱基与所有天然存在的核碱基配对。一些通用碱基可与相邻的核苷酸通过疏水堆叠在相同的核酸链相互作用。典型的通用核碱基包括，但不限于：2,4-二氟甲苯，硝基，硝基吲哚，8-氮杂-7-脱氮腺苷，4-氟-6-甲基苯并咪唑，4-甲基苯并咪唑，3-甲基异喹诺酮，5-甲基异喹诺酮，3-甲基-7-正丙基异喹诺酮，7-氮杂吲哚基，6-甲基-7-氮杂吲哚基，咪唑基，9-甲基咪唑，吡咯并吡嗪，异喹诺酮，7-丙炔基异喹诺酮，丙炔基-7-氮杂吲哚基，2,4,5-三甲基苯基，4-甲基亚油，4,6-二甲基亚油，苯基，萘基，蒽基，啉蒽，芘基，stilbenzyl，四苯，并五苯，和结构衍生物。
[0062] 合适的核碱基包括但不限于：2-氨基，6-甲基和腺嘌呤和鸟嘌呤，2-丙基和腺嘌呤和鸟嘌呤的其他烷基衍生物，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，5-卤代尿嘧啶，5-(2氨丙基)尿嘧啶，5-氨基烯丙基尿嘧啶，8-卤代，氨基，巯基，硫代烷基，羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤，5-取代嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2，N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶，二氢尿嘧啶，3-脱氮-5-氮杂胞嘧啶，2-氨基嘌呤，5-烷基尿嘧啶，7-鸟嘌呤，5-烷基胞嘧啶，7-脱氮腺嘌呤，N6，N6--二甲基腺嘌呤，2,6-二氨基嘌呤，5-氨基烯丙基-尿嘧啶，N3甲基尿嘧啶，取代的1,2,4-三唑，2-吡啶酮，5-硝基吲哚，3-硝基吡咯，5-5-甲氧基，尿嘧啶-5-氧乙酸，甲氧羰基甲基尿嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，5-甲氧羰基甲基2-硫氧嘧啶，5-甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧啶，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N 4-乙酰胞嘧啶，2-硫代胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，N 6-异戊烯基腺嘌呤，2-甲硫基-N-6-异戊烯基，N-甲基鸟嘌呤，和O-烷基化碱基。典型的嘌呤和嘧啶公开在美国专利3,687,808；高分子科学与工程简明百科全书，858-859页；30Kroschwitz,1.1.,ed.John Wiley&Sons,1990；和Englisch等人,应用化学，国际版，1991,30,613，其中每一个在此通过引用并入其全文。
[0063] 如本文所定义，术语“核苷”是指一种包括核碱基的化合物，在此，可以在l'-位点连接戊糖。当该核碱基是嘌呤衍生物或类似物，通常在所述嘌呤衍生物或类似物的的9-位点戊糖连接到核碱基。当该核碱基是嘧啶衍生物或类似物，通常在所述嘧啶衍的I-位点戊糖连接到核碱基。(例如，Kornberg和Baker，DNA复制，第二版，Freeman，旧金山，1992年，其通过引用将其整体并入)。当一个核苷存在于R3,R4,或R5，该核苷可以通过碱基或戊糖的任何原子连接到相邻的原子。
[0064] 术语“脂肪酸”通常是指有脂肪族尾巴(链)的羧酸。脂族链的长度可以约2至36个碳原子。脂肪酸可以是饱和的，不饱和的，或多不饱和的。该脂族链可以直链或支链。本文中的术语“脂肪酸”指“脂肪酸衍生物“，它可以包括一种或更多种不同的脂肪酸衍生物，或脂肪酸衍生物的混合物。典型的脂肪酸包括不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸酸和二元酸；具有羧酸功能的蛔甙单、二和三甘油酯；羟基酸，共羟基酸，共余羟基酸，二羟基脂肪酸(例如，ω-或ω-升羟基化的二羟基脂肪酸以及α-或β-羟基化脂肪酸)。
[0065] 术语“糖”是指一种化合物,此化合物或者是一个或多个单糖单元组成的碳水化合物本身,含有至少5个碳原子(可以是直链，支链，或环状)，氧，氮或硫原子结合到每个碳原子；或者是一个或多个单糖单元组成的碳水化合物部分作为其一部分,含有至少5个碳原子(可以是直链，支链，或环状)，氧，氮或硫原子结合到每个碳原子。代表性糖包括单糖，二糖，三糖，和寡糖,含大约4-9个单糖单元，和多糖，例如淀粉，糖原，纤维素，和多糖胶。示例性单糖包括C，和上述(例如，C5-C8或C5-C 6)糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单位。
[0066] 术语“单糖”是指一种具有3-10个碳原子的链的糖分子,它以醛(醛糖)或酮(酮糖)的形式存在。合适的单糖包括天然存在的和合成的单糖。适合的单糖包括丙糖，如甘油糖和二羟基丙酮；丁糖如赤藓糖和赤藓；戊糖，例如木糖，阿拉伯糖，核糖，木酮糖核酮糖；甲基戊糖(6-脱氧己糖)，如鼠李糖和岩藻糖；己糖，如蛔糖，葡萄糖，甘露糖，半乳糖，果糖，山梨糖和；和庚糖，如葡萄庚糖，半乳甘露庚糖，景天庚酮，和甘露庚酮糖。典型的单糖拥抱阿洛糖，阿卓糖，阿拉伯糖，克拉定糖，赤藓糖，赤藓酮糖，果糖，D-岩藻糖醇，L-岩藻糖醇，岩藻糖胺，岩藻糖，墨角藻糖，半乳糖胺，D-半乳糖糖胺醇，N-乙酰基-半乳糖胺，半乳糖，葡糖胺，N-乙酰基-葡糖胺，葡糖胺醇，葡萄糖，葡萄糖-6-磷酸，古洛甘油醛，L-甘油-D-曼诺-庚糖，甘油，甘油酮，古洛糖，艾杜糖，来苏糖，甘露糖胺，甘露糖，甘露糖-6-磷酸，阿洛酮糖，奎诺糖，奎诺氨基半乳糖，鼠李糖醇，鼠李糖胺，鼠李糖，核糖，核酮糖，景天庚酮糖，山梨糖，塔格糖，塔罗糖，酒石酸，苏糖，木糖，木酮糖和。该单糖可以是D-或L-构型。这里所用的典型的单糖是己糖。单糖还可以是脱氧糖(氢取代醇羟基)，氨基糖(由氨基取代醇羟基),硫代糖(巯基取代醇羟基，或C＝S取代丁香油,或硫取代环状形式的环氧),硒糖，碲糖，氮杂糖(氮取代环碳)，亚氨基糖(氮气置换环氧)，膦基糖(磷取代环氧)，磷糖(磷取代环碳),C-取代的单糖(碳取代非末端碳原子的氢),不饱和单糖，糖醇(CHOH基团取代羰基)，醛糖酸(羧基取代醛基)，酮醛糖酸，糖醛酸，醛糖二酸，等等。氨基糖包括氨基单糖，如半乳糖胺，葡糖胺，甘露糖胺，岩藻糖胺，quinovasamine，神经氨酸，胞壁酸，乳糖二胺，盐酸葡萄糖胺，bacillosamine，柔红糖胺，desosamine，forosamine，garosamine，kanosamine，kansosamine，碳霉，海藻糖胺，perosamine，pneumosamine，purpurosamine，rhodosamine。
可以理解的是，单糖及类似物可以进一步取代。
可以理解的是，单糖及类似物可以进一步取代。
[0067] 术语“二糖”，“三糖”和“多糖”包括阿比可糖，阿卡波糖，amicetose，支链淀粉，直链淀粉，芹菜糖，arcanose，ascarylose，抗坏血酸，boivinose，纤维二糖，纤维三糖，纤维素，马铃薯三糖，chalcose，几丁质，可立糖，环糊精，磁麻糖，糊精，2-脱氧核糖，2-脱氧葡萄糖，2-脱氧毛地黄糖，洋地黄糖，洋地黄毒糖，evalose，evemitrose，低聚果糖，寡糖，低聚龙胆糖，，葡聚糖，糖原，金缕梅糖，肝素，菊粉，isolevoglucosenone，异麦芽糖，异麦芽三糖，异葡糖基麦芽糖，曲二糖，乳糖，乳糖胺，lactosediamine，昆布二糖，左旋葡聚糖，左旋葡萄糖酮，麦芽糖，棉子糖，甘露寡糖，甘露三糖，松三糖，蜜二糖，胞壁酸，霉菌糖，碳霉糖胺，神经氨酸，黑曲霉糖，野尻霉素，moviose，齐墩果糖，潘糖，泊雷糖，车前糖，樱草糖，棉子糖，rhodinose，芸香糖，长匐茎糖，景天庚酮糖，茄三糖，槐糖，水苏糖，链霉糖，蔗糖，α-海藻糖，海藻糖胺，松二糖，泰威糖，木二糖和伞形糖，等基团。此外，可以理解的是，“二糖”，“三糖”和“多糖”和类似物可以进一步被取代。二糖还包括氨基糖类和它们的衍生物，具体地讲，一个碳霉糖衍生在C-4'位点或4-脱氧-3-氨基-葡萄糖衍生在C-6'位点。
[0068] 本文所用的术语“多环”或“多环”表示具有两个或多个环的分子结构，其包括，但不限于:融合，桥接或螺环。
[0069] 上述“烷基”，“链烯基”，“环烷基”，和“环烯基”基团，以及上述芳基，杂环基，或杂芳基基团，可任选被取代。
[0070] 术语“取代的”或“任选取代的”用来表示一个基团的每个可取代的原子都可以具有取代基(包括每个原子的不止一个取代基),条件是不超过指定原子的正常价并且每个取代基的性质是相互独立的。按照用本发明，在每一个残基最多三个H原子可以被替换为烷基，卤素，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，环烷基，环烯基，羟基，烷氧基，酰基，羧基，烷氧羰基(也被称为烷氧基羰基)，甲酰胺基(也被称为烷基氨基羰基)，氰基，羰基，硝基，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，巯基，烷硫基，亚砜，砜，酰基氨基，脒基，芳基，杂芳基，杂环基，芳氧基，杂芳氧基，嘌呤或嘧啶或其类似物或它们的衍生物(定义为“核酸碱基”)，或糖，例如具有5或6个碳原子的单糖(定义为“单糖”)。“未取代”原子按规定化合价的承担全部氢原子。当取代基为酮基(即＝0)，则该原子上的两个氢被取代。取代基组合和/或变量产生的条件是该组合产生稳定的化合物；由“稳定的化合物”或“稳定结构”是指足够稳定的化合物,能从反应混合物中将其残存隔离到有用纯度,并配制成有效试剂。
[0071] 根据某些取代基的表征，某些取代基可以结合形成环。除非另有说明，此类环可以表现出不同的不饱和度(从完全饱和至完全不饱和的)，可以包括杂原子，并且可如上所述被取代成其他取代基。本文所述的化合物可含有一个或多个不对称中心并可以因此产生对映体，非对映体，以及其它立体异构形式。根据绝对立体化学,每手性中心可以被定义为(R)-或(S)-。本发明意在包括所有这些可能的异构体，以及它们的混合物，包括外消旋和光学纯形式。光学活性的(R)-和(S)-，(-)-和(+)-或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成或手性试剂来制备，或使用常规技术解析。当本文所述的化合物含有烯双键或其它几何不对称中心时，除非另有说明，它是指化合物包括E和Z几何异构体。同样地，也包括所有互变异构形式。本文所选择的任何碳-碳的构双键仅是为了方便,不是为了指定特定的构型；因此本文任一个反式碳-碳双键可以是Z，E，或两者任意比例的混合物。
[0072] 除非另有规定,术语“本发明的化合物”和等效表述是指包含前药，药学上可接受的盐，氧化物，溶剂化物，例如水合物和该化合物的包合物，其中上下文允许，以及如任何立体异构体形式，或以任何比率的任何此类形式的化合物的混合物。包合物在雷明顿，科学描述和药学实践，第19版。1：176-177(1995)，在此通过引入其全文作为参考。最常用的包合配合物是那些具有环糊精，和所有的环糊精复合物，天然和合成的，特别是权利要求书内包含的。因此，依照发明中的一些实施例，如本文所述的化合物，包括上下文中被提供为盐形式的生物相容组合物，治疗方法，以及化合物本身。同样，参照中间体，不论它们本身是否要求,是指包括其盐和溶剂化物，其中上下文允许。为了清晰起见,在允许的范围内，文本中有时表示特定实例,但这些实例纯粹是说明性的，在允许的范围内它并不是为了排除其他情况下。
[0073] 本文发现的化合物任何碱性含氮基团的“季铵化”是可以预见的。碱性氮可以被任何那些普通技术人员熟知的试剂季铵化包括，例如，低级烷基卤化物，如甲基，乙基，丙基和丁基氯化物，溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐包括甲基，二乙基，二丁基和二戊基硫酸盐；长链卤化物如癸基，月桂基，肉豆蔻基和硬脂基的氯化物，溴化物和碘化物；和芳烷基卤化物25，包括苄基和苯乙基溴化物。水或油溶性或可分散的产品可以通过这类季铵化获得。
[0074] 本文所用的术语“蛔甙”可以指式I的化合物：
[0075]
[0076] 或药物等价物，衍生物，类似物，和/或其盐。如本领域技术人员可明了的,该化合物可进一步用各种R基团定义。
[0077] 本发明的方法中使用的蛔甙具体实例，包括但不限于：
[0078]
[0079] 本发明还考虑用以下所提供的化合物(也参见图1，图7和9)，以及除了脂肪酸类侧链的碳原子数量(例如，3-24碳),与以下提供的化合物结构相同的化合物。本发明考虑用含有3-24碳原子的脂肪酸状侧链化合物。
[0080]
[0081] 判别非自体与自体是生存的重要方面,此功能普遍存在于基本上所有来自细菌的活生物体,其利用限制修饰系统破坏侵入的外源DNA，对于有复杂、多层次免疫系统的脊椎动物的此功能包括先天免疫和适应性免疫与B细胞，T细胞和提供精致特异性的辅助细胞。植物也有多个级别的免疫力，包括非宿主抗性，基础抗性，PAMP触发免疫(PTI)，抗性(R)基因介导的抗性(也称为效应器触发的免疫力；ETI)，以及系统获得性抗性(SAR)。通过PRR或R蛋白的外来化合物识别造成可以使分子和细胞改变的激素信号网发生显著(往往是巨大的)变化，该变化包括胼胝质沉积，活性氧的产生，钙离子，活化MAP激酶的子集，和转录重编程(Knepper and Day,2010)。这些和其他的变化表征植物免疫或防御反应。
[0082] 以下描述阐述涉及实施本发明的步骤。提到的具体材料内容仅仅是用来说明本发明的,但不限制本发明。除非另有说明，一般的生物化学和分子生物学方法，例如使用那些列于Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室(1989)(下文称为“Sambrook等人”)或Ausubel等人(编)当前分子生物学方法，约翰·威利父子(1997)(以下简称“Ausubel等人”)。
[0083] 用下列实施例来说明本发明的某些实施方案。并不在任何方面限制本发明。
[0084] 实施例I
[0085] 线虫衍生的小分子可以用作防御诱导剂，以提高农作物对病原体的抵抗力
[0086] 几种病原体相关分子模式(PAMP-也称为微生物相关分子模式的MAMP)已经确定，并可以通过它们的同源受体识别诱导和/或引导免疫反应。典型的例子是通过拟南芥FLS2感知细菌鞭毛蛋白。植物识别线虫蛔甙(NA)为PAMP。因此，本发明提供了使用强效，天然存在的小分子诱导防御反应的方法,这通过提高农作物抗病性极大地改善农业生产。
[0087] NA动物和真菌对NA的反应
[0088] 最近的两项研究表明，动物和真菌可以感知纳摩尔浓度的NA。食线虫真菌，它们是土栖线虫的天敌，使用专门的捕食器捕获并吸收线虫(Barron,1977)。以往的研究表明，大多数真菌不是组成性产生捕食，，而是捕食猎物(Pramer and Stoll,1959).Co-PD Schroeder,与Sternberg实验室合作，表明纳摩尔浓度特定NA可以使食线虫真菌进行捕食,并且在食线虫真菌的几个密切相关的物种中NA诱导的形态建成是保守的(Hsueh et al.,
2012)。特定NA也可以调节哺乳动物的免疫反应。与Sternberg和Nakayama合作(千叶大学，日本)，Schroeder实验室检测了动物寄生线虫广泛生产的4种NA,发现NA ascr#1和ascr#7强烈抑制小鼠模型系统的哮喘发展。
2012)。特定NA也可以调节哺乳动物的免疫反应。与Sternberg和Nakayama合作(千叶大学，日本)，Schroeder实验室检测了动物寄生线虫广泛生产的4种NA,发现NA ascr#1和ascr#7强烈抑制小鼠模型系统的哮喘发展。
[0089] NA调节植物防御信号通路
[0090] 线虫普遍存在于土壤中。因此，它们与几乎所有植物的根有接触。随着植物根系定殖，一些线虫引起严重的疾病。线虫可以引起全世界每年超过1000亿美元的农业损失(Blumenthal and Davis,2004)。其他种类的线虫不致病，甚至可能是有益的。最近的研究表明,即使不是全部亦是大多数的线虫物种可以产生的一种称为蛔甙的小分子信号,其可以引起哺乳动物和真菌特异性反应。
[0091] 以往的研究表明植物感知线虫的存在并加强对他们的防御反应。例如，使用番茄分根法,Ogallo和McClure研究发现提前接种宿主不相容(无毒)的南方根结线虫可以降低宿主相容性(毒力)的敏感性(Ogallo and McClure,1995昆虫病原线虫对植物寄生线虫的的拮抗作用(Molina et al.,2007)也可能是由于植物防御反应的诱导,如PR-1基因表达和过氧化氢酶和过氧化物酶活性，不仅在根部，而且在叶片(Jagdale et al.,2009a,b)。然而，线虫衍生信号的性质,其寄主植物的感知,和随后导致防御反应的信号传导途径还不清楚。.
[0092] 由于NA对动物和真菌的影响,本研究发明者开始努力评估NA’对植物免疫力的影响。在这项研究中,我们选择在两种植物，烟草和拟南芥中,检测在几种植物寄生线虫属的根结线虫中尤其普遍的NA ascr#18。
[0093] 烟草
[0094] 为了确定ascr#18是否影响原型SA反应PR-1基因/蛋白质的水平,加或不加SA,分别用不同浓度的ascr#18处理烟草植物(图2)。单独给叶片施用0.01,0.3,或10μM ascr#18没有引起PR-1蛋白的积累。然而，加入高水平(500μM)或次优水平(500μM)的SA，0.01或0.3μM的ascr#18可以提高PR-1积累到比仅用SA处理的植物更高的水平。有趣的是，最低浓度的ascr#18增强作用最强，这说明植物能够在非常低的浓度检测NA，甚至低于10nM的浓度也有效。相比之下，高浓度的ascr#18(10μM)能够抑制50μM SA诱导低水平PR-1积累的能力。对NA的双相“矛盾”的反应在线虫化学通信的几项研究中已经发现(Pungaliya et al.,2009；Srinivasan et al.,2008；Srinivasan et al.,2012)。与SA处理的植物相比，SA和ascr#18同处理过的植物PR-1表达/蛋白质积累较高,这可能是由于这些化合物或NA诱导的启动效应之间的协同效应。
[0095] 对根部施用ascr#18可以提高烟草叶中SA介导的PR-1表达/蛋白质积累诱导(图3)。这个结果表明ascr#18作用于整个系统。与在PR-1表达中ascr#18的SA依赖效应相比,ascr#18自身足以提高对致病力强的烟草野火病菌的抵抗力(P.T.)(图4)。NA处理的叶或根与250μM SA处理的叶片中强致病力P.T.的增殖水平同样降低，而同时加入这两种化合物时没有发现更大的减少。
[0096] 拟南芥和其他植物
[0097] ascr#18对拟南芥的影响分析表明，虽然该品种的反应与烟草不同,但它也能感知NA。甚至在没有SA的情况下,试验叶或根的Ascr#18处理也可诱导PR-1的表达(图5)。此外，ascr#18处理诱导原型JA响应PDF1.2基因的表达。有趣的是，ascr#18抑制SA介导的PR-1表达，当NA和SA共施加到测试叶或当ascr#18通过根部施加时可以观察到该效果。如同烟草，用ascr#18预处理拟南芥的叶片可以提高对致命的细菌病原体丁香假单胞菌番茄DC3000(PST)的抵抗力(图6)。与次优水平的SA(50μM)联合处理可以进一步提高抵抗力。
[0098] 马铃薯和番茄，两个重要的作物的进一步研究证明用ascr#18预处理其根可以提高其对最具破坏性的植物病原体致病疫霉晚疫病的病原体19世纪40年代爱尔兰土豆大饥荒的抵抗力(参见图10和图11)。,
[0099] NA调节植物免疫反应的结论提供了关于植物免疫力的重要见解,并提供了植物抵抗线虫及其他病原体的机会。把NA用于植物保护的潜力很大,因为它们i)在非常低的浓度具有活性(nM范围)，ⅱ)可大量容易地合成，ⅲ)可生物降解，并且iv)因为它们是天然的产品,所以审批面临较低的监管障碍。因此，本发明将显著加强世界粮食安全，并且还可以减少使用可能有害于人类和/或环境的化学杀虫剂。使用潜在病原体的小信号分子启动或激活植物免疫系统的新颖方法也将提高农业经济和环境的可持续发展。
[0100] 实施例II
[0101] 植物的防御反应中最活跃的NA变异体
[0102] 用NAS和线虫，真菌或哺乳动物的生物测定已经证明，即使NA结构的微小变化也会严重影响生物活性(Hsueh et al.,2012；Ludewig and Schroeder,2013)。例如，在ascr#10和它的不饱和衍生物ascr#3结构中看似微小的差别与秀丽线虫(C.elegans)生物反应的巨大差异有关:雌雄同体生产的ascr#3排斥雌雄同体，而雄性产生的ascr#10可以强烈吸引雌雄同体(Izrayelit et al.,2012b)。类似地，所述不饱和蛔甙ascr#7可以强烈抑制小鼠卵白蛋白特异性T辅助细胞反应，然而通过一个长两个碳的侧链与ascr#7区分的ascr#3没有显著效果。基于这些发现,ascr#18很可能不是唯一影响植物防御反应的NA,而且存在更有效的或不同活性谱的NA。因此，我们将在对ascr#18反应的几种植物物种中，如烟草，马铃薯，番茄，和拟南芥,进行NA化学多样化的的生物活性筛选。
[0103] 用于生物活性筛选的NA的选择
[0104] 我们集中初步研究植物寄生线虫中普遍存在的NA以及线虫门不同分支物种广泛产生的NA(Choe et al.,2012a；Choe et al.,2012b；Izrayelit et al.,2012a；Srinivasan et al.,2012)。迄今为止发现了200种化学性质不同的NA,选取代表并检测其诱导或“启动”植物免疫或防御性反应的能力。
[0105] 最近，我们确定属于根结线虫属的几种植物寄生线虫产生最丰富的NA。从南方根结线虫，爪哇根结线虫，和两种不同北方根结线虫菌株的感染性幼虫获得的代谢物提取物的HPLC-MS分析始终显示这三个物种都产生丰富的ascr#16,ascr#18,ascr#20,ascr#22,和ascr#26(图8)。除了评估这5种NA的生物活性，我们将测试ascr#10和它的不饱和衍生物ascr#3，以及短链ascr#9，所有这些由寄生和自由生活的线虫广泛产生(Choe et al.,2012b)。此外，我们将测试icas#9，mbas#3和ascr#8,其中icas#9是NA衍生的最具代表性的吲哚蛔甙,mbas#3和ascr#8包括隐杆属线虫的自由生活线虫大量产生的NA家族代表
(Pungaliya et al.,2009；Srinivasan et al.,2012)。根据这10种NA的活性筛选结果,我们选择另外多至10种NA进行测试。例如，如果吲哚蛔甙ICAS#9表现出高生物活性，我们将测试另外的吲哚蛔甙，包括icas#1,icas#3,和icas#10(Srinivasan et al.,2012)。如果短链蛔甙如ascr#9或ascr#3有有价值的活性,我们将检测其他化学性质多样性的短链蛔甙(von Reuss et al.,2012)。本文发现的任何蛔甙可能是为了植物抗病性调节进行评估。
(Pungaliya et al.,2009；Srinivasan et al.,2012)。根据这10种NA的活性筛选结果,我们选择另外多至10种NA进行测试。例如，如果吲哚蛔甙ICAS#9表现出高生物活性，我们将测试另外的吲哚蛔甙，包括icas#1,icas#3,和icas#10(Srinivasan et al.,2012)。如果短链蛔甙如ascr#9或ascr#3有有价值的活性,我们将检测其他化学性质多样性的短链蛔甙(von Reuss et al.,2012)。本文发现的任何蛔甙可能是为了植物抗病性调节进行评估。
[0106] 用于生物活性筛选的NA的合成
[0107] 北方根结线虫培养的NA生理浓度可高达100nM,并发现许多其他NA的浓度达到10μM,大致认为是生理浓度范围的上限。在土壤中，NA浓度一般要低得多。我们发现皮摩尔和低纳摩尔浓度的ascr#18就可以诱导反应。值得注意的是，在线虫，食线虫真菌和老鼠中这种浓度范围就有作用。预期需要提供高达几升含有摩尔至低微摩尔浓度的NAS用于生物测定,我们将准备NA母体化合物的毫克级样品,然后进一步修饰蛔糖,用先前描述的方法产生图7-9所示的不同化合物(Pungaliya et al.,2009；Srinivasan et al.,2012；von Reuss et al.,2012)。
[0108] 使用烟草和拟南芥进行生物测定
[0109] 我们的初步结果表明ascr#18诱导拟南芥中SA-调节的PR-1和JA响应PDF1.2基因的表达(图5),并提高烟草中SA诱导的PR-1表达(图2和3)。因此，评估各种NA的生物活性最初将通过监测它们的以下能力(ⅰ)加或不加50μM SA,诱导或提高拟南芥和烟草中PR-1的表达and(ii)诱导拟南芥中PDF1.2的表达在或烟草中尚未确定的JA反应基因，其中同源PDF1.2未检测到。用注射器将1μM,0.01μM,或0.0001μM NA浸润到叶片进行筛选。将进一步测试最高活性的NA提高拟南芥和烟草对致病力强的丁香假单胞菌抵抗力的能力。
[0110] 我们预计，某些情况下，检测NA的具体结构特点与特别强的植物反应有关。在这种情况下，其它NA变体将被合理设计，合成并测试活性。此外，如果几个结构不同的NA表现出明显活性,我们将测试这些NA的混合物，以评估协同作用,已经在真菌和线虫证明(Pungaliya et al.,2009；Srinivasan et al.,2008)。
[0111] 呈现最高生物活性的NA也可用于拟南芥和烟草中直接或SA诱导的PR-1表达的更详细剂量-反应分析。将使用PDF1.2或合适的JA标记基因进行类似分析，以评估拟南芥和烟草JA介导的信号中NA的作用。如果发现其中一种低纳摩尔浓度的NA活性很高,检测其更低(皮摩尔和飞摩尔)浓度的活性(皮摩尔和飞摩尔)的浓度将被检测的高活性(有些NA在秀丽线虫中有飞摩尔活性，如见(Izrayelit et al.,2012b；Srinivasan et al.,2012；von Reuss et al.,2012))。
[0112] 实施例III
[0113] 信号通路介导NA反应的表征
[0114] 研究烟草和拟南芥中最活跃的NA化合物介导其效应的信号通路。该分析可能会延伸到第二NA，它不仅具有高活性，而且在拟南芥vs烟草中SA-vsJA响应防御基因的激活或抗性的提高过程中起到了与第一NA不同的作用。，选择的NAS将被应用到叶子和根,以评估结果是否与下列叶片相同。另外，表征NA介导的系统信号，以及评估NA对植物抗线虫作用，包括监测以下施用叶片或根的植物响应。
[0115] NA反应的转录谱
[0116] NA对烟草和拟南芥全基因表达的影响的综合分析采用用RNA测序分析(Wang et al.,2009)。用RNA测序进行转录组分析,由于其ⅰ)低背景噪声,ⅱ)动态范围的定量基因表达，iii)能够区分等位基因表达和同源表达,iv)RNA的需要量低，和v)成本相对低。RNA测序实验的设计是基于:不同的NA在一种植物比另一种更有活性,和/或不同的NA在不同的植物物种产生的表型不同。以下发现可以解释所述可能性,高浓度的ascr#18(10μM)可以抑制烟草SA诱导的PR-1的表达，而比这浓度低100倍的NA(0.01μM)可以抑制拟南芥中SA诱导的PR-1的表达。此外，虽然低浓度的ascr#18(0.01或0.3μM)可以诱导拟南芥中PR-1的表达，但是除非同时施用SA,它们不能诱导烟草中PR-1蛋白的积累。这些结果表明，拟南芥对ascr#18更敏感，双相剂量-反应曲线中能提高烟草中SA激活的PR-1蛋白的表达的浓度可以诱导拟南芥自身的防御基因表达。
[0117] 在烟草和拟南芥中都有一或两个高活性NA(如ascr#18)的情况下,我们使用这些NA通过两种植物的RNA测序得到转录谱。如果事实证明，这些NA中的一个在拟南芥中比烟草中更有活性,反之亦然，我们用其中最高活性的NA对两种植物进行RNA测序。不管NA的活性或烟草和拟南芥中得到的表型是否不同,两种植物的平行转录谱有显著优势。如果一或两个NA在拟南芥和烟草中产生相似的表型，那么这两个物种介导反应的途径可能相同,其有助于受NA影响的一个或多个调控中心的识别的。相反地，如果一或两个NA在拟南芥和烟草中活性不同或产生不同的表型,结合两种植物的RNA测序数据分析,有利于观测反应相关基因表达的变化和。考虑所有条件,至少一式三份生物将被使用。
[0118] 其他转录组分析将NA处理与SA或JA处理相结合。例如,拟南芥中最有效的NA在非常低的浓度与SA协同作用诱导PR-1表达，施用产生最大协同作用浓度的NA和SA后进行转录谱。为了检测病原体反应中NA调节的变化，NA处理的拟南芥感染Pst前后进行转录组分析。拟南芥比烟草有优势是因为其有非常广泛转录的数据库,特别是那些病原体感染和/或涉及影响植物免疫的突变体后获得的。。然而，如以上强调的，两个不同物种转录数据的可用性大大有助于的RNA测序结果的解释，因此阐明NA的普遍和具体物种影响对其长期实际(商业的)的应用至关重要。
[0119] 参与NA诱导反应途径的详细表征
[0120] 上述转录分析概述的结果可以确定参与NA反应的信号通路。根据初步结果，我们预计涉及SA和JA途径。为了证实它们的参与，采用双管齐下的方式,包括(i)测定基础病原性中NA引起的变化，和(ii)监测NA诱导各种防御信号突变体的标记基因，如PR-1和PDF1.2,表达的能力。丁香假单胞菌最初的实验表明，ascr#18处理可以提高烟草和拟南芥对活体营养病原体的基础抗性(图4和6)。结果与ascr#18对SA介导的信号(即诱导/增强PR-1的表达)的影响一致，这是因为抗活体营养病原体是SA依赖性。拟南芥通过ascr#18诱导PDF1.2说明JA介导的防御信号也会受到影响。因为对死体营养型病原体的抗性是JA依赖性的，我们检测拟南芥中NA对腐生菌如灰霉病(或甘蓝链格孢菌)的基础抗性的影响。评估NA提高对其他病原体抗性的能力和/或激活其他抗性水平,包括抗病基因介导的免疫功能。对于后者的分析，我们使用无致病力的Pst AvrRPT2或Pst AvrRPM1及拟南芥，和烟草花叶病毒(TMV)与黄原品种的烟草，它们携带N基因，因此具有TMV抗性。
[0121] 为了进一步研究通过NA(s)发挥作用的信号通路，使用SA介导的防御信号(如ISC1-SA合成；NPR1-SA反应)或JA介导的防御信号(如jar1或jin1-JA响应)受损的拟南芥突变体,评估其中NA介导的PR-1和PDF1.2诱导和对Pst和灰霉病的抵抗力的提高。乙烯(ET)是另一种重要的防御信号激素,它与JA协同作用激活防御基因，如PDF1.2，并抵抗腐生菌(Ronald and Beutler,2010)。为了评估NA(s)是否也利用ET信号网，在ET突变体监测NA诱导PDF1.2表达和对灰霉菌抗性的能力(例如etr1和ein2-ET响应)。
[0122] 评估NA对植物激素水平的影响
[0123] 为了评估最活跃的NA是否直接(或间接)影响SA或JA的水平，感染Pst前后量化这些激素。如先前已经完成(Liu et al.,2010),SA和其糖苷(SAG)经HPLC测定，而JA水平将通过质谱测定(Creelman and Mullet,1995)。RNA序列分析表明参与代谢物产生基因的上调或下调，例如进一步代谢的研究可以进行拟南芥中芥子油苷的生物合成或烟草中生物碱(烟碱)的生物合。
[0124] 植物NA反应中的系统信号的表征
[0125] 我们的结果表明NA可以系统地作用,因为ascr#18处理拟南芥或烟草根可以提高防卫基因表达并提高叶片对抗丁香假单胞菌的抗性(图3-5)。同样地，在未经处理以及处理叶片中用ascr#18处理拟南芥叶片子集诱导PDF1.2表达。这些结果表明，一个信号，或许NA本身，从处理的根或叶至全身，未经处理的叶片。放射性标记的NA通过在侧链通过碱催化的质子到氚交换简单产生,其可用于检测NA本身是否移动或通过不清楚的移动信号替代作用,以引起全身防御反应。放射性标记的NA将被应用到根；处理24或48小时后，均质/溶解处理和未处理(对照)植物的根和叶将，并通过闪烁计数分析。如果该结果表明NA是移动的，进一步的分析需要确定NA本身或放射性标记的衍生物是否易位到叶子。为了这个目的，我们将稳定同位素标记与比较HPLC-MS相结合。双重标记的氘(d2)NA(氚标记产生)和未标记的NA注入植物；处理24或48小时后，采集NA处理和NA-d2处理植物的根和叶,用甲醇提取,并采用了蛔甙检测的优化条件通过HPLC-MS/MS分析(von Reuss et al.,2012)。HPLC-MS基于从NA处理和NA-d2的处理的植物中提取的样品的比较,发现NA-d2的处理植物样品中任何NA衍生物其峰质量增加2个质量单位。如果检测到这样的物种，通过高分辨率MS进一步表征并通过制备性HPLC分离进行2D NMR谱鉴定,如通过Pungaliya et al.,2009)描述的。
[0126] NA应用对多种农作物病原体抗性的影响
[0127] 为了测试对其他作物物种的适用性,分析NA处理番茄，马铃薯,大麦PR-1表达的改变和适当的JA-响应标记基因及提高的病原体抗性。在携带PTO的品种接种PstDC3000+/-AvrPto后评估NA提高番茄抗性的能力(基础和R基因介导)。评估NA是否可以提高马铃薯和番茄对致病疫霉,晚疫病和19世纪40年代爱尔兰马铃薯大饥荒病原体的抵抗力，作为研究资助的马铃薯和番茄晚疫病项目的一部分，Klessig组目前正在评估CRT1对毁灭性卵菌病原体基础抗性和R基因介导的抗性的作用(Kang et al.,2012；Kang et al.,2008；Kang et al.,2010)。因此，研究NA抵抗这种病菌的有效性需要所有番茄品种(+/-所述R基因Ph2和Ph3)和po(Kang et al.,2012；Kang et al.,2008；Kang et al.,2010)tato(+/-RB)和致病疫霉分离群(US11，22和23)。早期的实验表明，早期的实验表明，马铃薯和番茄的NA处理可以显着地降低其对马铃薯晚疫病菌的易感性(图10和11A-11C)。确定NA提高大麦对白粉菌抗性的能力,白粉病的病原体。Ascr#18可以提高大麦对白粉病的抗性(图15B-15C)。用番茄，马铃薯，寄生根结线虫的大豆(RKN，根结线虫)和寄生甜菜胞囊线虫的甜菜(BCN,甜菜胞囊线虫)进行NA提高对线虫抗性的能力评估.。结果表明ascr#18可以提高拟南芥对甜菜胞囊线虫的抵抗力(图13C)。
[0128] NA对植物线虫抗性的影响
[0129] 以前的研究表明，提前接种宿主不兼容(无致病力)南方根结线虫可以降低对宿主兼容(致病力强)北方根结线虫的敏感性(Ogallo and McClure,1995)。为了检测NA是否有产生这种作用，在拟南芥中检测最初筛选的作为防御信号强诱导剂的两三种NA。种子在垂直板发芽,用普通介质或含选定NA(nM至μM浓度)的介质；给7天龄的幼苗接种BCN(甜菜胞囊线虫)或RKN(南方根结线虫)的表面灭菌幼体(Wang et al.,2007)。接种线虫三-四周后，统计线虫囊肿(甜菜胞囊线虫)或卵(南方根结线虫)的数量，并与对照植物比较，以确定NA处理是否降低植物对线虫感染的易感性。
[0130] 此外，线虫感染测定在温室盆栽植物进行。我们也捡测NA处理是否改变农作物如大豆，番茄，马铃薯对RKN感染的易感性及胞囊线虫感染的马铃薯的易感性。植物在2英寸的盆生长,并在植物出苗约一周后将NA(1nM至10μM浓度)通过每日浇水施加到幼苗根部一周。然后给这些NA处理的和未处理植物接种RKN或孢囊线虫卵(Chronis et al.,2013；Wang et al.,2007)。接种RKN4-5周后和接种胞囊线虫10-12周后，从植物根部或土壤中提取RKN卵和囊肿,并与对照植物比较,以确定植物的易感性。
[0131] 实施例IV
[0132] 烟草
[0133] 当单独施用时,Ascr#18可以提高烟草对病原体丁香假单胞菌的抵抗力(图12A)。ascr#18预处理后加入SA并不能进一步提高抗性。用注射器将ascr#18(0.01μM)渗透到烟草叶片。NA处理24小时后用注射器将SA(50μM)渗透到叶片。线虫蛔甙(NA)处理48小时后进行细菌接种,接种2天后检测细菌生长。
[0134] 当接种前施用48小时而不是24小时时，应用ascr#18喷雾可以提高对细菌病原体烟草野火病菌(Pt)的抵抗力(图12B)。ascr#18和SA结合喷雾不能进一步提高抗性。具体来说，烟草植物喷洒ascr#18(0.01μM)24，48小时后接种Pt。喷洒ascr#18的同时用注射器将SA(50μM)渗入叶片，48小时后接种。接种2天后检测细菌生长。
[0135] 用ascr#18浸泡根部可以提高对细菌病原体烟草野火病菌(Pt)的抵抗力(图12C)。这种保护跟由BTH(苯并噻二唑)的根浸泡所给予的保护效果一样。在不同的时间，用0.01μM或0.03μM ascr#18,250μM SA,0.075g/L BTH苯并噻二唑,或BTH和ascr#18(0.01μM)混合浸泡烟草植物的根后，接种Pt。接种2天后检测细菌生长。
[0136] 拟南芥
[0137] 用ascr#18浸泡根部可以提高对致病力强的细菌病原体丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pst)的抵抗力(图13A)。用三种浓度的ascr#18(0.3,1,and 5μM)通过根浸泡处理拟南芥属生态型Col-0 24小时后接种Pst。接种3天后检测细菌生长。
[0138] ascr#18处理拟南芥的根可以诱导根中PR-1和PTI标记基因FRK1(图13B)。用水(CK)或各种浓度的ascr#18处理拟南芥幼苗的根48小时。然后收集根并提取RNA进行定量RT-PCR分析。
[0139] ascr#18可以提高拟南芥对胞囊线虫甜菜胞囊线虫的抵抗力(图13C)。在没有ascr#18的培养基中生长的拟南芥或在含50nM或600nM ascr#18的培养基中生长的拟南芥接种甜菜胞囊线虫，接种19天后计数雌性线虫。
[0140] Easc18可以提高对致病力强的丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pst)DC3000的抵抗力(图13D)。用注射器将ascr#18(0.3μM),easc18(0.3μM)and/or SA(50μM)渗入拟南芥生态型Col-0l叶片24小时后接种Pst。接种3天后检测细菌生长。
[0141] Ascr#3,ascr#9,oscr9,或ascr#10可以单独诱导拟南芥中PR-1的表达(图13E，13F，13H和13I)。低浓度的Ascr#3,ascr#9,oscr9,或ascr#10和SA一起施用可以提高SA诱导的PR-1表达。然而，施用高浓度ascr#3或ascr#9降低SA诱导PR-1表达(虽然低浓度没有显著增加烟草品种W38中PR-1的表达，但是施用ascr#3,ascr#9,和ascr#10的烟草中有类似结果)。Ascr#3,ascr#9,或ascr#10也可以单独诱导拟南芥中PDF1.2的表达简要地说。用注射器将缓冲液，SA(50μM),ascr#3or ascr#9(0.01or 0.3μM)或SA(50μM)和ascr#3或ascr#9得混合物渗入四个周龄植物的叶片。半定量PCR检测PR-1和PDF1.2表达。β微管蛋白用作内部对照。
[0142] Ascr#3可以提高对致病力强的丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pst)DC3000的抵抗力(图13G)。测试浓度的Ascr#9,oscr9,和ascr#10没有显著提高拟南芥对强的丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pst)DC3000的抵抗力。用注射器将ascr#3(0.3μM)和/或SA(50μM)渗入拟南芥生态型Col-0l的叶片24小时后接种Pst。接种3天后检测细菌生长。
[0143] 番茄
[0144] 用ascr#18处理番茄悬浮细胞可以引起培养基碱化(图14A)。因此，培养基碱化可用于测量番茄中NA的生株物活性。虽然Ascr#18可以提高番茄品种M82和Rio Grande t对致病力强的卵菌病原体致病疫霉US22的抵抗力，但是低浓度的Ascr#18(0.01μM)不能显著提高高番茄品种M82对死体营养型真菌病原体灰霉病菌的抵抗力。高浓度可能会有效。值得注意的是，低浓度的ascr#3(0.01μM)不能显著提高M82对致病疫霉的抵抗力。高浓度可能会有效。
[0145] Easc18可以提高番茄品种M82对死体营养型真菌病原体灰霉病菌的抵抗力(图14B和图14C)。用水(-)或0.01μM ascr#18或0.01μM easc18浸泡番茄的根48小时后用离体叶片接种法接种致病力强的灰霉病菌B05.01株。
[0146] Easc18可以提高番茄品种Rio Grande对致病力强的卵菌病原体致病疫霉US22的抵抗力,这与ascr#18处理提高抗性有可比性(图14D和图14E)。ascr#18和easc18组合不能进一步显著提高对致病疫霉的抵抗力。用水(-)或0.01μM ascr#18,或easc18,或两种NA结合(+)浸泡番茄的根48小时后用离体叶片接种法接种致病疫霉。
[0147] 四种新蛔甙处理番茄悬浮细胞可以引起培养基碱化(图14F)。如上所述，培养基碱化可用于植物中蛔甙生物活性检测。
[0148] 测试浓度的Ascr#9，不是oscr9或ascr#10，可以提高番茄品种M82对致病力强的致病疫霉US22株的抵抗力,这通过通过病灶大小(图14G)和孢子囊数量检测。用水(-)或1μM ascr#9浸泡番茄的根48小时后,用离体叶片接种法接种致病疫霉。接种7天后确定晚疫病。
[0149] 大麦
[0150] 浓度1μM的Ascr#18可以诱导大麦PR-1基因的表达。通过1μM ascr#18与给大麦品种。Golden promise接种真菌病原体大麦白粉病菌(Bgh)结合可以进一步提高诱导(图15A)。用各种浓度ascr#18或水(模拟)喷洒大麦植物的叶子48小时。处理植物48小时后接种Bgh。接种6天后收集叶片并提取RNA做定量RT-PCR分析。
[0151] Ascr#18可以提高大麦品种Golden promise对真菌病原体大麦白粉病菌(Bgh)的基础抗性(图15B和15C)。简言之，所示浓度ascr#18喷洒大麦叶片48小时后,接种Bgh。
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