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用于证明病原体和细胞的快速检验和方法

阅读：872发布：2020-05-25

专利汇可以提供用于证明病原体和细胞的快速检验和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种检验系统，包括以下机构中的至少一个：用于至少一个病原体(10)和/或至少一个细胞(10)的透化(110)和/或溶解的机构，用于病原体(10)和/或细胞(10)的部分(20和/或40和/或50)的捕获(80)和/或标记(90)的机构，用于病原体(10)和/或细胞(10)的至少一个组成部分(40和/或50和/或20和/或10)的位置确定、固定和/或富集的机构(120)，优选包括光学放大单元(161)的图像处理机构(160)，由此可以进行至少一个用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)的光学读取。，下面是用于证明病原体和细胞的快速检验和方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种检验系统，包括以下机构中的至少一个：
用于至少一个病原体(10)的和/或至少一个细胞(10)的透化和/或溶解的机构(110)，用于病原体(10)和/或细胞(10)的部分(20和/或40和/或50)的捕获(80)和/或标记(90)的机构，
用于病原体(10)和/或细胞(10)的至少一个组成部分(40和/或50和/或20和/或10)的位置确定、固定和/或富集的机构(120)，
用于图像处理的机构(160)，优选包括光学放大单元(161)，由其能执行至少一个用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)的光学读取。
2.根据权利要求1所述的检验系统，其特征是，用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)具有用于接纳样流尤其是体液和/或食品样本和/或饮用水的元件。
3.根据前述权利要求之一所述的检验系统，其特征是，通过用于透化的机构(110)能获得配体(60,80)到达至少一个目标组织(40和/或50)如生物分子和/或病原体的至少一个组织(20)和/或至少一个细胞(10)/病原体(10)的路径，其中，尤其能产生尺寸在约1纳米和约
12微米之间的至少一个开口(31)和/或接纳机制(31)和/或细胞(10)完全溶解(31)，或者自细胞(10)释出寄生物。
4.根据前述权利要求之一所述的检验系统，其特征是，能使用用于病原体(10)和/或细胞(10)的至少一个组成部分的位置确定、固定和/或富集的机构(120)，其中，病原体(10)和/或细胞(10)的至少一个组成部分(40和/或50和/或20和/或10)能被富集，和/或，用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)具有用于物质的溶解(220)和/或添加(230)和/或混合(240)和/或繁殖(240)的微流结构(140和/或200)。
5.根据前述权利要求之一所述的检验系统，其特征是，用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)具有用于含有捕获剂配体(60)和/或标记配体(80)的样流的繁殖的至少一个微流结构(140和/或200)和至少一个检测区域(280)，其中，在用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)上能接纳至少一个标记的病原体(10)和/或至少一个标记的细胞(10)的至少一个组成部分。
6.根据前述权利要求之一所述的检验系统，其特征是，用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)包括由PET构成的至少一个微流结构(140,200)，含水液体能优选在没有其它涂层情况下被动地流入该微流结构中，其中，尤其是该机构至少部分能用膜被封闭和/或能被分为一个或多个区域，所述区域首先是封闭的，由此该液体无法继续流过该机构且在穿刺出一个在后的通风口后能被液体流过，
尤其被分为采样区域，其内能容纳规定的样本量如来自手指肚的全血，
和/或混合区域，其内样本优选能与冻干物质如阻凝剂和/或带有或不带磁珠的捕获剂配体和/或一个或多个标记配体和/或稳定剂和/或用于溶解和/或透化的机构混合，和/或检测区域，其内病原体能被确定位置和/或富集和/或优选通过外磁场被固定住。
7.根据前述权利要求之一所述的检验系统，其特征是，用于结合的机构包含至少一个捕获剂配体(60)和/或至少一个标记配体(80)用于标记且尤其是染色，其中，尤其包含至少一个抗体、适体和/或配体和/或包含可与抗体、适体、配体结合的微粒(70)、纳米粒(70)、磁微粒(70)、磁纳米粒(70)，
其中，优选至少磁纳米粒(70)最好是Turbobead和/或金属芯能通过结合的捕获剂配体(60)被结合至病原体(10)和/或细胞(10)的至少一个组成部分(如20和/或40和/或50)，其中，优选能产生由至少一个捕获剂配体(60)和至少一个标记配体(80)构成的夹层结构。
8.一种用于疾病诊断的检验方法，尤其利用具有至少其中一个上述权利要求的特征的检验系统，包括以下步骤中的至少一个：
a)施加样流尤其是液体到用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)，
b)施加和/或释放用于透化的机构(110)至用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)，由此获得配体(如60和/或80)到达样流所含的至少一个病原体(10)和/或至少一个细胞(10)的组织，
c)施加和/或释放标记配体(80)尤其是荧光染料到至少一个抗体和/或DNA染料，和/或施加和/或释放捕获剂配体(60)到用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)，d)标记至少一个病原体(10)和/或至少一个细胞(10)的至少一个组成部分(40和/或50和/或20)，
e)富集病原体(10)和/或细胞(10)的至少一个组成部分(40和/或50和/或20)，尤其借助在用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)中的蓄积和/或磁分离，
f)通过显微镜放大和/或图像拍摄证明该病原体(10)和/或细胞(10)。
9.根据权利要求8所述的检验方法，其特征是，能获得传染病、疾病的证明，所述疾病的起因是真菌、病毒和/或细菌和/或病菌和/或病原体，尤其是腺病毒，钩虫，蛔虫，巴贝虫，炭疽杆菌，百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌，回归热螺旋体，布鲁氏菌属，弯曲杆菌属，绦虫，鹦鹉热衣原体，肉毒杆菌，白喉棒状杆菌，贝纳特氏立克次体，人致病隐孢子虫属，埃博拉病毒，多房棘球绦虫，细粒棘球绦虫，大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌(EHEC)，真绦虫，土拉热弗朗西丝菌，FSME病毒，黄热病毒，蓝氏贾第鞭毛虫，流感嗜血杆菌，汉塔病毒，甲肝病毒，乙肝病毒，丙肝病毒，丁肝病毒，戊肝病毒，流感病毒，拉沙病毒，军团菌属，人致病钩端螺旋体属，单核细胞增多性李司特氏菌，马尔堡病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，麻风分歧杆菌，结核分歧杆菌/非洲分歧杆菌，牛型结核菌，脑膜炎奈瑟菌，诺瓦克样病毒，脊髓灰质炎病毒，绿脓杆菌，狂犬病毒，普氏立克次氏体，轮状病毒，风疹病毒，副伤寒沙门氏菌，伤寒沙门氏菌，血吸虫，志贺氏菌属，牛肉绦虫，猪肉绦虫，鞭虫，锥体虫，布氏锥体虫，刚果锥体虫，活动锥体虫，旋毛虫，水痘-带状疱疹病毒，1群和139群霍乱弧菌，结肠炎耶尔森杆菌，鼠疫杆菌，梅毒螺旋体，HIV，棘球绦虫属，疟原虫属，刚地弓形虫，肺炎链球菌和/或金黄色葡萄球菌，尤其证明尤其在血样中的疟疾病原体。
10.根据权利要求8或9所述的检验方法，其特征是，用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)能被用于证明血样中的疟疾病原体，其中，尤其是，在感染的红细胞(20和/或40和/或50)中的至少一个组织在透化机构(110)尤其是皂甙和/或氯化铵作用之后，可供用于优选能结合到至少一个磁微粒或纳米粒(70)尤其是Turbobead上的至少一个捕获剂配体(60)尤其至少一个疟原虫蛋白质抗体，和/或用于至少一个标记配体(80)优选至少一个疟原虫蛋白质荧光标记抗体和/或至少一个疟原虫DNA的DNA染料，以便由此尤其证明疟原虫(20)和/或至少被一个或多个疟原虫(20)感染的红细胞(10)的至少一个组织(40和/或50和/或
20)和/或借助蓄积和/或磁分离在用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)中捕获至少一个感染的红细胞(10)和/或疟原虫的至少一个组织(40和/或50和/或20)。
11.根据权利要求8或9所述的检验方法，其特征是，用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)能被用于证明血样中的疟疾病原体且尤其是恶性疟原虫，其中，尤其在透化机构(110)尤其是皂甙作用后，病原体连同在感染的红细胞中的包裹的寄生泡(20、40、50)可接近，优选能从红细胞中被释放，
并且至少一个机构可供使用，其用于至少一个捕获剂配体(60)尤其是针对疟原虫蛋白如RAP1或EXP2的至少一个抗体如单克隆抗体抗RAP-1Klon 2.29或者单克隆抗体抗EXP-
2Klon 2.2，其优选能结合到至少一个磁微粒或纳米粒(70)尤其是Dynabead或者Dynabead Myone，和/或用于至少一个或多个标记配体(80)、优选至少一个或多个标记抗体如针对疟原虫蛋白例如RAP1或者EXP2的单克隆抗体抗RAP-1Klon 2.29和/或单克隆抗体抗EXP-
2Klon 2.2，和/或针对疟原虫DNA的至少一个优选荧光的DNA染料可供使用，以便借此证明尤其疟原虫(20)和/或至少被一个或多个疟原虫(20)感染的红细胞(10)的至少一个组织(40、50、20)和/或借助蓄积和/或磁分离在用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)如具有至少96阱尤其是1536阱的微滴定板、微量吸收池或简单的流体结构中固定至少一个感染的红细胞(10)和/或疟原虫的至少一个组织(40、50、20)。
12.根据权利要求8或9所述的检验方法，其特征是，尤其是体液如尿和/或粪便和/或食品取样和/或饮用水的样本能与缓冲剂混合，
和/或坚固的组成部分能例如通过过滤、沉淀和/或离心分离被分离出，
和/或病原体如噬肺性军团杆菌或病原体如蛔虫、鞭虫、钩虫、绦虫的卵能利用用于溶解和/或透化的机构(110)被透化，
和/或病原体、病原体的卵或其组成部分能通过用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)如过滤结构或磁粒被富集，
和/或其能用标记配体(80)被标记，
和/或能借助成像显微镜被发现。
13.根据权利要求8至12之一所述的检验方法，其特征是，用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)包含至少一个微量吸收池，样液优选来自手指肚的规定量全血能容纳在该微量吸收池中，
和/或该样液优选与冻干物质如阻凝剂和/或带有或不带磁珠(80)的捕获剂配体和/或一个或多个用于标记(90)的机构和/或稳定剂和/或用于溶解和/或透化的机构(110)混合，其中，该混合例如能通过加载一个可切换的外磁场进行，从而所含磁粒能被引导经过所述溶液，
其中，尤其进行结合至用于固定(80)的机构的病原体的随后固定和/或经视窗的显微镜探查。
14.根据权利要求8至12之一所述的检验方法，其特征是，用于位置确定、固定和/或富集的机构(120)包含与过滤结构组合的至少一个微流结构(140,200)且优选是抽吸结构，和/或能将液体且尤其是规定量的全血加入该微流结构中，
和/或该样液优选能与冻干物质如阻凝剂和/或一个或多个用于标记(90)的机构例如带有荧光标记或金粒和/或稳定剂和/或用于溶解和/或透化的机构(110)的抗体混合，其中，尤其例如通过打开通风口和/或例如通过移动和/或通过弯折芯片和/或通过克服流阻能使该液体接触该过滤结构，
其中，尤其随后该液体自毛细管能被抽吸经过该过滤结构，
其中，尤其捕获剂配体(80)在该过滤结构上能被固定住，
其中，尤其能使该病原体接触捕获剂配体(80)，
其中，尤其出现一个由标记病原体和/或其组成部分构成的条带，
其中，尤其该条带能通过显微镜和/或照相和/或用肉眼来分析。
15.将根据权利要求1至7之一所述的检验系统和/或根据权利要求7至14之一所述的检验方法用于疾病诊断的用途。

说明书全文

用于证明病原体和细胞的快速检验和方法

[0001] 本发明涉及根据独立权利要求1的用于疾病诊断的检验系统和根据独立权利要求8的用于疾病诊断的检验方法以及根据独立权利要求15的将检验系统和/或检验方法用于疾病诊断的用途。

[0002] 用于疾病诊断的检验系统在现有技术中是已知的。例如采用了许多分析程序和方法以引起抗体反应即所谓免疫反应，其被用于确定(生物)标志物和许多其它物质/被分析物。另外，描述了在诊断领域的显微镜辅助方法。

[0003] 患者近旁或床旁(PoC)检验方法是：不在中央实验室进行，而是在短暂时间里现场单独直接在患者/被测试者处进行的诊断检验。对少数几个参数，适用PoC-检验系统如免疫色析试条，其通过抗体结合证明可溶解生物分子，例如在血、尿或唾液中的荷尔蒙或蛋白质借助颜色反应被证明。已知的PoC试条例如是妊娠检验、凝血检验，它们带有或不带测试仪地被提供。此外知道了对应的快速检验方法如侧流检测(LFT)、流通检测(FTT)、凝集检测(AT)或固相检测(SPT)。所有这些方法用于被分析物的快速证明且适用于在PoC领域的目测分析。在PoC领域需要快速且鲁棒的诊断技术，满足例如紧急医疗的特殊要求，不需要高度灵活和/或与药品医治专业人员的沟通。

[0004] 但不利的是，没有PoC检验能用于大量作为病原体或细胞诊断学对象的疾病(有时威胁生命)。其包括可能导致败血症的严重细菌感染、病毒性疾病如流感或腹泻病原体、像疟疾、霍乱和肺结核这样的疾病或者用于定量的血细胞(如癌症患者的淋巴细胞)。为了病原体和细胞检查，在诊断实验室内的设备和人员的高成本检验是不可避免的，其相应地是时间和成本密集的并还造成对个体处理或治疗的启动延迟。尤其在疟疾疾病情况下，现有技术的诊断标准方法基于显微镜。取得少量血液，从中准备出呈所谓厚滴形式的涂片或切片并用吉姆萨染料染色。在切片固定和干燥后，在显微镜下可在红血球(红细胞)中识别出寄生物并由技术人员加以区分。该方法不仅以受过培训的执行者为前提，也以实验室环境和昂贵的显微镜为前提。在大多数的疟疾环境中本来就没有这样配备的实验室。此外，已有的分子生物学检验是昂贵的且也需要深奥的用户知识。还知道了侧流快速检测(supra)，其虽然能证明寄生物特异抗原，但无法将证明这样的寄生物或受损细胞，因而不允许病原体或细胞诊断。在食品和饮用水分析学领域也需要快速且鲁棒的诊断以在采样现场快速证明病原体而确定感染源，启动患病者的相应治疗并阻止人的进一步感染。

[0005] 但是，对于大量病原体来说，没有在分析现场的快速检验方式，因此需要复杂的实验室检验。其中包括例如沙门氏菌、噬肺性军团杆菌、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、结肠弯曲杆菌和空肠弯曲菌、单核细胞增多性李司特氏菌、副结核分枝杆菌或流感病毒。尤其表面抗原的多样性是基于通过其表面抗原发现病原体的任何分析证明的一个问题。其中包括例如在快速检验如侧流检测(LFT)、通流检测(FTT)、凝集检测(AT)或固相检测(SPT)中的病原体免疫证明。因此，具有与表面抗原无关的病原体和细胞分析的且可被用作PoC和/或快速检验的系统是特别有意义的。通过借助例如PCR的DNA或RNA分析学或者病原体培养的证明方法在设备和时间方面复杂且成本高昂。因此人们非常需要研发出一种具有与表面抗原无关的分析的检验系统作为PoC检验和/或快速检验，其允许复杂诊断。复杂诊断尤其应该允许来自体液或食品和/或饮用水的病原体和细胞诊断。

[0006] 因此，本专利申请的任务是提供一种检验系统以及一种检验方法和检验系统和/或检验方法的用途，其至少部分消除上述缺点。本发明的任务尤其是在最短时间里以廉价方式证明各种不同的病原体和/或细胞，尤其与检验室装备无关。

[0007] 为了完成该任务，提出一种具有权利要求1的技术特征的用于疾病诊断的检验系统以及一种具有权利要求8的特征的用于疾病诊断的检验方法以及具有权利要求15的特征的检验系统和/或检验方法的用途，其有着如下意义。在此，针对根据本发明的用于疾病诊断的检验系统所公开的所有技术特征也适用于根据本发明的用于疾病诊断的检验方法以及检验系统和/或检验方法的用途，反之亦然，因而，与此相关地分别相互参照和/或可相互参照。在从属权利要求中阐明了本发明的合适实施方式。

[0008] 根据本发明，它是用于疾病诊断的检验系统。在此，该检验系统包括至少一个用于透化和/或溶解至少一个病原体和/或至少一个细胞的机构和/或用于结合和/或标记病原体和/或细胞的一部分的机构和/或用于位置确定、固定和/或富集病原体和/或细胞的至少一个组成部分的机构和/或图像处理机构，由此可以进行至少一个用于位置确定、固定和/或富集的机构的光学读取。优选地，读取可以通过所设置的光学放大单元进行。替代地和/或附加地可以想到，读取可以通过便携式计算机单元进行。通过本发明的病原体和/或细胞的透化和/或溶解，可以让用于结合和/或标记优选荧光标记的机构“接近”组织，所述组织如果没有所述机构则因分隔组织如脂质膜或细胞壁是无法被接触到的。与用于位置确定、固定和/或富集的机构相结合地，可布置来自液样的病原体和/或细胞的一部分。由此可以借助图像处理机构来光学读取所述标记且获得用于一个或多个图像的足够高的强度和对比作用，其可以通过光学放大单元便携式计算机单元中的图像处理装置被读取，从而可进行有效图像处理且进而可以成像发现所搜寻的病原体和细胞。在具体的免疫染色和/或特异DNA染色情况下，感染细胞在弱染色和/或弱显荧光的背景下对比看起来是染色的和/或荧光的点和/或面，而未感染的细胞是看不到的和/或只能很弱地看到。在照明且尤其是激发照明机构作用下，可以进行染色的和/或荧光的细胞在弱染色和/或弱显荧光的背景映衬下的颜色对比图像分析。通过确定较亮的点和/或面，可以通过计数和计算来求出每升样本的感染细胞数量。在本发明范围内，光学放大单元可以是如下单元，其包含至少一个物镜和/或可包含一个或多个物镜和/或透镜的组合，类似于显微镜，其可以有足够大的放大倍数。这样的放大倍数例如可以通过与显微镜相关联来获得。当使用这样的显微镜时，也可以替代地将图像数据传输至计算机单元。

[0009] 在本发明范围内可以想到：最好在存在图像处理装置的情况下，具有约2.5倍至约5倍、最好约10倍至约1000倍的放大倍数的光学放大单元的性能。此时，分辨率可以为约5微米、优选约0.1微米至约2微米、尤其是大约小于0.5微米。因此，可以获得足够高的细胞和/或病原体的放大倍数。放大倍数可以是固定的或可变的。为了调节焦平面和/或放大倍数，可以使用可变透镜如例如Optotune瑞士股份公司或者Vario-Optics股份公司的液体透镜。
该光学放大单元或图像处理装置优选可以具有一个或多个任意光源，例如白光照明和/或荧光照明。在此，荧光照明可以被用作荧光染料的激发光。

[0010] 另外，图像处理机构根据本发明可以设置用于便携式计算机单元，尤其以照相机形式。图像处理装置可以被用来采集来自光学放大单元的图像数据。在本发明范围内，便携式计算机单元可以是如下单元，其例如通过具有计算机功能的移动电话(智能手机)和/或笔记本电脑和/或平板电脑(平板计算机)来提供。便携式计算机单元基本上可以具有中央单元和/或处理器，其可以执行图像处理所需的计算和处理步骤。

[0011] 图像处理还可以包括分析模块，其中可以测得在图像局部中的总灰度、色值和/或颜色对比度优选荧光信号。这种测得此时可以是定性的和/或定量的。在简单的定量分析范围内，例如可以说明在所述区域内是否超过所规定的强度关键值。针对该检验系统是依据经验来确定该关键值的，该关键值例如用于区分还存在于溶液中的标记配体的背景信号与免疫荧光中的特异结合的标记配体。图像处理质量可被如下提高：先后检查一个较大区域的几个图像部分。这可以通过在图像处理中的单纯选择完成。替代地或附加地，图像处理质量也可以通过各个图像部分的光学放大来完成，在这里，例如一个具有高于关键值的强度的界限清晰的物体可以被限定为病原体。

[0012] 还可以在图像分析范围内想到执行质量分析。在此，在多个图像片段中获得结果的标准偏差。替代地或附加地，也可以确定计算值离关键值多近。在计算值离关键值很近或标准偏差大的情况下，可以推断出测量质量差。另外也可以请求一次新的检验。为了本发明的使用，因此也可以在计算机单元例如智能手机上的App上执行程序，其具有至少其中一个以下基本功能：读入图像数据，图像处理，定量和/或定性输出图像处理和/或分析结果。附加地，该程序可以包含与样本分析质量相关的质量分析。还考虑进一步信息的逻辑关联，尤其是关于病症、药品服用地址、病原体图像发送至药品专业人员等的内数据库或外数据库。

[0013] 也可以想到，该检验系统中，用于位置确定、固定和/或富集的机构具有容纳样流的元件。尤其有利的是，样流源自体液和/或食品取样和/或饮用水。体液优选可以是血、全血、尿、唾液、滑液、脑脊液、血浆和/或血清和/或泪水、汗、淋巴液和/或细胞间液。在此，例如患者体液样本可以用任何化学物质、试剂尤其是染色剂和染料尤其是荧光染料且或许连同常见的助剂和添加剂如阻凝剂、蛋白酶抑制剂、稳定剂和/或酶阻遏剂来处理。此时，患者是任何被检测者，与症状和/或疾病无关，甚至是人和动物且尤其是哺乳动物。这样的体液包含被分析物尤其细胞，其可以包含这样的感染的细胞和/或病原体。病原体在此尤其是细菌、真菌、病毒和/或寄生物。在此，食品取样的样流可以包含任何稀释物、溶液、提取物和/或食品涂片。饮用水的样流还可以包含不变的和/或浓缩的和/或稀释的样本和/或过滤残余物的流态吸取物。

[0014] 还可能有利的是，该检验系统具有透化机构，其中优选可以实现配体接近至少一个生物分子和/或病原体的至少一个组织和/或至少一个细胞。尤其可以想到，该组织和/或细胞可以具有至少一个尺寸在约1纳米和约12微米之间的开口。也可以产生细胞完全溶解。病原体和/或细胞的透化和/或溶解此时可以是用于产生外和/或内细胞膜、细胞壁、胞壁质壳、病毒衣壳和/或脂质膜和/或其它分隔结构的临时的和/或永久的透过性的过程，以允许抗体、标记抗体、配体和/或带有配体的磁粒可接近病原体和/或细胞的内部组织、抗原和/或生物分子。病原体和/或细胞的透化和/或溶解机构可包含：“提供至病原体和/或细胞的生物分子和/或组织的接近性”的单元和/或物质，该生物分子和/或组织一般例如在活的病原体和/或细胞中通过脂质膜、细胞壁、病毒衣壳和/或其它细胞包围膜分隔开并因此例如无法让免疫分析接近。这样的机构例如可以通过多孔蛋白在膜内提供孔和/或通过胆固醇提取而使膜失稳并在膜中产生开口和/或通过渗透作用如细胞隆破而导致细胞膜内的开口和/或通过电脉冲和/或机械冲力产生开口。另外，一个机构也可以包括所有其它机构，其能在细胞膜、细胞壁、病毒衣壳、脂质膜中提供一个或多个开口和/或例如通过用起来像转染的机构如融合的和/或加入的疱囊、磁粒和/或侵入的纳米粒来实现穿透它。所述机构可以是用于所述透化和/或溶解的物质如用于溶解红细胞、细菌、真菌细胞和/或其它真核细胞的皂甙、用于例如真核细胞临时透过的毛地黄皂苷、例如用于透化脂质膜的孔蛋白、链球菌溶血素O和海葵毒素II、例如用于红细胞溶解的氯化铵、去污剂如脱氧胆酸盐、Triton X100、NP-40和/或其它物质如用于使细胞膜失稳的丙酮和/或乙醇、用于革兰氏阴性细菌外膜透化的乙二胺四乙酸、例如用于溶解革兰氏阳性肽聚糖细胞壁的溶菌酶和/或自溶素、乳铁蛋白、革兰氏阴性细菌的防御素和内源性抗菌多肽和其它物质，但也可以是类似于电穿孔地可暂时和/或长久地使细胞膜可透过的电场和/或导致透化和/或溶解且提供配体更好地接近病原体和/或细胞的生物分子的可能性的机械作用和/或其它作用。所述机构可以与固定用物质如多聚甲醛、戊二醛、丙酮、甲醇、乙醇组合。所产生的开口的尺寸可以在约1纳米至约12微米范围内并且导致暂时透化几微秒直至细胞永久溶解。也可以想到以下机构，它可用于容纳配体和/或磁粒而没有形成开口，例如在转染时也可使用的机构如疱囊、磁粒、入侵的纳米粒、触发引入的物质。此外，它可以是病原体和/或细胞的、如果没有该机构则留在细胞和/或病原体内且因此被遮挡而无法被免疫系统识别的生物组织和/或分子和/或其它部分释放的机构。这可以包括病原体和/或细胞的溶解和/或其它分解和/或生物组织和/或分子通过输出口和/或孔和/或开口的诱导排出和/或释放。

[0015] 在本发明范围内也可能有利的是，对于该检验系统可采用用于病原体和/或细胞至少一个组成部分的位置确定、固定和/或富集的机构。此时可富集病原体和/或细胞的至少一个组成部分。在一个实施方式中，用于位置确定、固定和/或富集的机构可以是反应器皿如Eppendorf-反应器皿和/或滤柱。样本和/或透化机构和/或结合机构和/或标记机构可在其中相互混合并且例如可以通过磁体被固定住并通过图像处理机构如荧光光谱计和/或成像荧光显微镜被证明。附加地或替代地也可想到，用于位置确定、固定和/或富集的机构可具有用于溶解和/或混合物质的微流结构。这种用于位置确定、固定和/或富集的机构优选可以是带有微流结构的试条。这样的试条优选由一个或多个透明材料如平面塑料和/或玻璃构成，其能够容纳体液和/或其它流样。样本可以在一个优选实施方式中经过试条，尤其借助至少一个所开设的和/或所加入的尤其具有矩形、梯形和/或弧形的横截面的流道和/或微流道。流道可以是毛细管和/或通过重力作用和/或毛细管力和/或泵力和/或其它力允许层流和/或非层流。

[0016] 试条优选可以包括病原体和/或细胞的证明方法的执行，其由取样、添加并混合一个或多个透化机构、添加和混合一个或多个用于结合和/或标记病原体、细胞和/或其组成部分的组织的机构、样本繁殖、病原体和/或细胞和/或其组成部分在检测区域内的随后位置确定、固定和/或富集。对于几微升的小体积，试条另外优选可以提供流动维持装置，而对于高达几升的较大体积，可以提供至外界泵系统的接口。取样部在最简单情况下可以具有容器，规定量尤其是几微升的样本例如以微移液管可被加入该容器中。在几升体积的情况下，它们可以通过接口自外界系统来添加。取样部可以具有(干透的)化学物质如EDTA、阻凝肝素和/或用于组织细胞染色的染料，其可通过所添加的样本被溶解。在来自手指肚的毛细管全血情况下，吸收优选可以借助具有规定体积和充量指示件的毛细管进行。全血优选可以被吸入其中直到充满，因此提供规定的体积。如果毛细管例如位于适配于试条的盖中，则规定血量随后可通过将盖插套到试条上而被施加入其中。在此实施方式中，所述盖优选可以包括在插套到试条上时不可逆地锁定的结构。另一个实施方式可以包括属于试条的具有规定体积的微流结构，全血被吸入其中且例如通过毛细管移动和/或通过微阀和/或其它装置根据体积限定可做到接触其它微流系统，使得全血可被施加入其中。用于特异组织的透化和/或溶解的机构和用于其结合和/或标记的机构的应用可以通过由旁流样本溶解冻干物质进行。此时要区分在运动前锋之后的在前样本体积与在后的样本体积。在此做法中，在试条中在前体积可以包含比在后体积更多溶解的物质。因此缘故，试条优选可以具有至少一个混合结构，其可以将溶解物质与样本混合。在微流结构情况下，它可以是带有和/或不带外部机械作用的混合腔、锯齿状结构和/或其它混合装置。另一个实施方式可以包括将微流样本流分开到至少两个流道，在这里，在第一流道中可以给冻干物质添加一部分样本，在第二流道中可以将一部分样本在冻干物质旁流过。接着，这些流道可以至少部分又会聚且两部分样本在混合结构中混合。流量优选可以通过流道尺寸来定。利用这样的实施方式可以做到来自第二流道的在后样本体积还是能与来自第一流道的包含物质的样本体积混合。在此情况下可同时进行用标记配体的免疫荧光染色。可如此实现感染的细胞和/或病原体的染色，即添加标记配体到其间排空的样本口，溶解冻干物质和/或自可通过机械作用被打开的疱库，其内容物可被部分或完全释放入试条。试条优选可以针对几微升的小体积提供流动维持装置，针对达到几升的较大体积提供至外泵系统的接口。在另一个实施方式中，微流流动维持装置可以优选包括跟在检测区域之后的毛细管泵，其通过毛细管力将液体吸入也以微结构被分开的废物腔。在另一个实施方式中，施加吸力的材料例如过滤毛毡和/或抽吸毛毡可以被集成到试条中，从而它可以至少暂时获得与微流道的接触且优选拉动液体经过试条。在另一个实施方式中，优选可以将微泵集成到试条中，其可以控制流动。它可以是压杆，其将液体从疱中压出到微流道中，即抽吸装置，其通过负压将液体吸出流道和/或其它装置例如Bartels Mikrotechnik股份有限公司的微型泵mp6。此外，可以在试条上印纱条形码和/或装入RFID元件，其可以包含关于试条的常用信息，例如检验类型(如疟疾病原体、军团杆菌和/或败血症的诊断)和/或试条失效日期等。

[0017] 另外，该检验系统可以包括用于位置确定、固定和/或富集的机构，其一方面可以具有用于样流随捕获配体和/或标记配体的繁殖的微流结构和至少一个检测区域。在此，在用于位置确定、固定和/或富集的机构上可以容纳至少一个组成部分、至少一个标记病原体和/或至少一个标记细胞。用于位置确定、固定和/或富集的机构可以通过添加标记配体和/或优选冻干标记配体的溶液容许病原体、细胞和/或其组成部分的特异标记，优选利用染料和/或荧光染料、荧光和/或非荧光的纳米粒等和/或与配体如抗体组合。尤其有利的是，根据本发明可以不需要附加清洗步骤。染色可以根据被分析物和/或检验实施的不同优选是细胞质、脂质膜、细胞壁的简单组织染色和/或DNA和/或免疫化学染色如荧光染色。通过例如留在流道内的染色液的特异标记的背景信号可能在测量中是无关的，因为染色液优选可以是低浓度的。一旦染色液在流道内分散和/或流过流道，则一个或多个未结合的标记配体可以分散位于流道内，它们可以结合到病原体和/或细胞的因透化而可接近的标志物。优选如此须选择标记配体在染色液中的浓度，标记配体可以在感染的细胞、病原体和/或其组成部分上相对于在液体内的游离标记配体被富集。由此，病原体、细胞、感染的细胞和/或其组成部分优选可以在染色背景/荧光背景的映衬下对比看起来染色更亮/荧光更亮的点和/或面，而其它液体组成部分如未感染细胞是看不到的和/或只能微弱看到。样本繁殖例如可以通过试条的一个可包含繁殖结构的实施方式获得。它例如可以是锯齿结构，其在几秒到几分钟时间中可被流过且不仅混合样本，也可允许繁殖。在另一个实施方式中，用于病原体和/或细胞的透化和/或溶解的物质能以冻干状态存在并且如所述地通过样本体积的一部分被溶解，混入样本中且繁殖。如果病原体和/或细胞随后在微流结构中非特异地或特异地被截留、固定和/或捕获，则也可以进行标记配体的依序添加以标记所搜寻的组织。在一个实施方式中，可以外部加入清洗用液体和/或捕获剂配体和/或标记配体。在另一个实施方式中，试条可以包含充有液体的疱，疱可以被使用者和/或装置例如在试条采集机构如光学读取器中的机械冲杆被打开。所述液体此时可到达微流流道且可能或是已包含配体和/或其可以从预装冻干形态在流道内溶解且随后冲刷病原体和细胞。这样的试条优选可以具有微流流道系统的检测区域，在该检测区域内优选荧光标记的病原体、细胞和/或其组成部分可被固定并且优选被如此富集，它们被固定住，而其余液体可以进一步流道收集容器。此时检测区域可被设计成表明任意大小和任意证明。但优选以下规模，其可在放大光学组件的一个或多个视野内被采集。在本发明试条的另一个实施方式中，在检测区域内和/或旁边可以优选垂直于流动方向地印上条和/或标记。它们可以用于目测分界和/或划分图像处理用检测区域和/或用于确定所执行的试条穿过分析软件的速度。

[0018] 另外，该检验系统中，用于位置确定、固定和/或富集的机构可包括由PET构成的至少一个微流结构，在微流结构中，含水液体通过PET的材料性能在没有其它涂层的情况下优选被动流入。微流结构可以完全和/或部分用膜(代替用硬盖)来封闭。该结构可以被分为一个或多个区域，其首先是封闭的即形成死巷，由此液体基本上未流过它且在打开之后例如膜刺破后经在后的通风口可被液体流过。它尤其可以形成分为采样区域、混合区域和检测区域。在采样区域内，可以因毛细管力容纳规定量的液体样本例如取自手指肚的全血。一旦达到第一通风口，则流动停止，使用者可以在视窗处看到液面。随后或至少部分同时地可以布置一混合区域，在混合区域后可以设有第二通风口，其首先是封闭的。如果其上的膜被打开且例如刺破，则样本流入混合区域，样本在混合区域内优选可与冻干物质如阻凝剂和/或带有或不带磁珠的捕获剂配体和/或一个或多个标记配体和/或稳定剂和/或用于溶解和/或透化的机构混合。为了增强混合，可同时采用混合结构如流道内的人字形纹路、换向外磁场、振动、声波或其它混合方法。采样区域和混合区域也可以是重叠的或相同的。随后可以布置一个检测区域，其提供成像显微镜测量用视窗。如果位于检测区域后的例如用膜封闭的另一个通风口被打开，则样本流入该检测区域。病原体可以在该区域内被位置确定和/或富集和/或优选通过外磁场被固定住且被成像显示。

[0019] 另外，检验系统也可以具有一机构，用于结合至少一个捕获剂配体和/或至少一个标记配体，用于标记且尤其是染色。为此尤其可以包含至少一个抗体、适体和/或配体，和/或包含可与抗体、适体、配体结合的微粒、纳米粒、纳米磁粒。至少磁纳米粒最好是Turbobead和/或金属芯还优选可以通过结合的配体结合到病原体和/或细胞的至少一个组成部分。在此，优选可以产生由至少一个捕获剂配体和至少一个标记配体构成的夹层结构。用于结合和/或标记的机构可以包括一个或多个捕获剂配体和/或标记配体，其优选可以结合至全部或部分的细胞和/或病原体的抗原和/或生物分子。配体优选可以是抗体、适体、肽、蛋白质配体、微粒、纳米粒、磁珠、反应性物质，但也可以是其它配体和/或上述物质的组合，其可以特异结合至所谓标志物如病原体和/或细胞和/或其组成部分的抗原、生物分子和/或其它组织。配体可只通过透化机构与若没有透化机构则通过细胞壳、细胞膜、细胞壁、病毒衣壳、脂质膜和/或其它分隔结构与配体分隔开的标志物如病原体和/或细胞的生物分子、组织和/或抗原接触。捕获剂配体此时可以用于固定病原体、细胞和/或其组成部分，以便优选获得在检测区域的富集。在磁粒如优选磁微粒且尤其是Dynabead或磁纳米粒(MNP)尤其是Turbobead、也可以是带有或不带结合的抗体、适体和/或配体的其它非荧光MNP和/或荧光MNP情况下，这可以意味着结合的病原体、细胞和/或其组成部分优选在微流道的底面和/或顶面在检测区域内借助磁体固定。在免疫化学染色情况下可以采用标记配体，其优选能结合至病原体、细胞和/或其组成部分的无关的第二结合位点。所述配体优选可以与荧光染料、荧光纳米粒如量子点和/或还有颜料、磁粒和/或金粒结合，从而因其结合至细胞表面而出现充分的信号且优选是荧光信号，其优选可借助光学放大而突显于背景，从而可以出现一些能成像的色值、灰度和/或对比度。因此本发明也可以涉及一种检验系统，其中结合在试条上的被分析物、细胞、病原体借助结合到染料优选荧光染料、染色剂、纳米粒、磁粒和/或金粒上的标记配体被标记并且优选可供图像分析所用。优选地，在夹层系统内的双重识别一方面例如可以通过来自在磁粒上的特异抗体的捕获剂配体且另一方面通过标记配体如荧光标记抗体发生。这可以允许感染的细胞和/或病原体的明确分类并且排除由其它细胞的非特异结合和/或其它细胞的非特异染色造成的假阳性。例如感染细胞(如在疟疾时)和/或病原体(如噬肺性军团杆菌、沙门氏菌、链球菌等)可以具有相应的标志物，其在透化之后可让配体(捕获剂配体和标记配体)接近且可被其发现。该方法可以允许富集和明确目测识别细胞类型如疟疾感染的红细胞、CD4+细胞和/或还有在HIV诊断中的感染细胞，以及例如败血症、军团杆菌、霍乱、肺结核等诊断中的细菌识别和分类。另外，作为标记配体可以采用结合酶用于酶证明反应，从而可以出现可被发现的颜色反应和/或电化学反应。在试条的一个实施方式中设有例如由过滤材料例如Pall集团的“Vivid”胞质分离膜构成的过滤装置、具有亚细胞孔径的微孔膜和/或纳米孔膜和/或具有筛分功能的其它结构。它可以允许液体流过，但与大小相关地非特异地拦截住病原体和/或细胞或还有其组成部分。它可以在流道一端被加入和/或侧向被集成到流道壁中。蓄积的病原体、细胞、感染的细胞和/或其组成部分可以通过一个或多个标记配体被特异标记。当使用标记配体例如荧光标记的抗体、适体和/或其它配体时，可以进行病原体、细胞和/或其组成部分的所搜寻的组织的特异染色。在本发明的一个实施方式中，试条可以包含过滤材料以非特异蓄积所有细胞和/或病原体，而所搜寻的病原体的标记优选可通过在免疫荧光染色中的荧光标记配体的特异结合进行。如果仅所搜寻的病原体具有DNA，例如就像在不同于无DNA红细胞的疟原虫时那样，则也可以进行DNA的荧光染色，其可以特异标记该疟原虫。作为对照，可以同时进行膜染色以借助白光和/或通过光谱分开的荧光探测识别所有细胞轮廓。在一个实施方式中，磁粒优选可以被结合到可特异结合到细胞组织的配体，从而其磁捕获和富集可通过施加外磁场实现。如果磁体在检测区域内被集成到试条和/或试条容纳机构如读取器中，则磁力优选可以导致磁粒在试条中固定不动，就像例如固定在微流道的底面和/或顶面上。通常可被用于借助抗体、适体和/或配体经由表面抗原捕获细胞的商用磁粒尤其可具有约1纳米至约12微米的直径。Thermo Fisher Scientific公司提供例如具有1微米直径的磁微粒Dynabeads Myone或具有2.8微米直径的Dynebead，其具有各种不同的表面基如链霉亲和素、生物素和/或化学结合基如叠氮化物基和/或氨基以结合生物分子、抗体、适体和/或配体。

[0020] 所述微粒可能过大，以致不能经所产生的开口进入透化的病原体和/或细胞和/或通过其它技术所吸纳。这例如可以只在病原体和/或细胞被溶解破碎时进行，从而内部组织可以让微粒接近。病原体和/或细胞最好可被透化，但其形状通过细胞骨架获得，因此在生理学上保持可识别。磁纳米粒(MNP)可以具有约5纳米至约500纳米的直径，因此通过开口进入透化的病原体和/或细胞。在另一个实施方式中，可采用非荧光MNP连同结合的抗体、适体和/或配体，以便在透化之后能将所搜寻的病原体和/或细胞特异结合到抗原和/或组织。借助磁力，MNP连同所结合的病原体、细胞和/或其组成部分在检测区域内被固定住，例如在流道顶面和/或流道底面。优选通过标记配体可以在所搜寻的病原体、细胞和/或其组成部分上产生可探测的特殊信号。在使用荧光标记的抗体、适体、纳米粒和/或配体情况下，免疫荧光可在夹层结构中出现。或者，疟原虫的DNA可借助荧光的和/或非荧光的DNA染料被染色。Nvigen公司的MagVigen颗粒具有例如200-500纳米直径且可以在其表面具有结合基和/或蛋白。因此，为了特异抗体、适体和/或配体的结合，不仅可以实现化学结合，也可以借助在MNP上存在的蛋白如亲和素和/或第二抗体。Ocean Nanotech公司提供从50纳米直径起且也具有例如用于抗体结合的表面基的各种不同的para磁珠。Turbobeads公司也提供称为Turbobead的磁纳米粒，其具有各不同的表面基如链霉亲和素、生物素和/或化学结合基如叠氮化物基和/或氨基以结合生物分子、抗体、适体和/或配体。Turbobead可以具有约30纳米直径，但通过使用金属芯代替在MNP中常见的铁氧体芯而具有优选约3倍强的磁性能。磁分离因此可以比在常见MNP中快速和高效许多地进行。同时发荧光的磁纳米粒可以通过结合的抗体、适体和/或配体结合目标组织，且不仅用于磁捕获，也用于荧光标记。也提供具有如用于抗体结合的各不同表面基的Nvigen公司的磁粒和MyQuVigen荧光粒和还有
Chemicell有限公司的NanoScreenMag-MNP。所述组合可以具有通过磁体和荧光标记同时固定所标记的病原体的方法简单的优点。但因为所有荧光磁纳米粒可被拦截，故可能因一些未结合颗粒而出现荧光背景，所述颗粒必须可靠地与结合至病原体的MNP区分开。病原体、细胞和/或其组成部分的固定优选可以与所述标记分开，即采用分开的捕获剂配体和标记配体。

[0021] 另外，该任务通过一种用于疾病诊断的方法完成。本发明的方法此时带来与关于本发明的系统所明确描述的一样的优点。

[0022] 根据本发明，用于疾病诊断的检验方法包括至少其中一个下述步骤：施加样流尤其是液体到用于位置确定、固定和/或富集的机构。这可在微流结构情况下容许临床应用，例如通过即便由未经训练的人简单吸走来自手指肚的毛细管血的血滴和在用于位置确定、固定和/或富集的收尾机构中的样本自动化处理，此时无需使用者进一步干预和/或例如用于准确物质添加、病原体培养、离心分离等的实验室装备。

[0023] 作为其它步骤，可以执行透化机构至用于位置确定、固定和/或富集的机构的施加和/或释放，由此获得配体接近至少一个包含在样流内的病原体和/或至少一个细胞的组织。这优选可以通过溶解在用于位置确定、固定和/或富集的机构内冻干的物质和/或通过打开含有预装物质的疱而无需使用者干预地进行。用于位置确定、固定和/或富集的机构可以提供样本与透化机构的所需混合和繁殖。它可以导致病原体和/或细胞的分隔组成部分如脂质膜和/或细胞壁的透化和/或溶解。

[0024] 作为其它步骤，可以进行施加和/或释放标记配体、尤其是在至少一个抗体上的荧光染料和/或DNA染料，和/或施加和/或释放捕获剂配体到用于位置确定、固定和/或富集的机构。这优选可以无使用者干预地通过溶解在用于位置确定、固定和/或富集的机构中的冻干物质和/或通过打开含有预存物质的疱进行。用于位置确定、固定和/或富集的机构此时可以提供样本与结合机构和标记机构的所需混合和繁殖。

[0025] 作为其它步骤，可以想到标记至少一个病原体和/或至少一个细胞的至少一个组成部分。通过细胞的透化和/或溶解，用于结合和/或标记的机构可以接近例如在细胞内的病原体和/或细胞的组织，从而可以进行例如抗体特异结合至抗原。在荧光标记的抗体情况下，这可以产生特异免疫染色。

[0026] 作为其它步骤，可以想到在用于位置确定、固定和/或富集的机构中尤其借助蓄积和/或磁分离的病原体和/或细胞的至少一个组成部分的富集。在使用例如磁纳米粒作为结合机构时，它们例如可以通过特异抗体结合到病原体的和/或细胞的组织，由此它们可以借助磁分离被富集。或者，例如借助样液过滤的蓄积可以导致病原体和/或细胞的组成部分的富集。

[0027] 作为其它步骤，可规定通过显微镜放大和/或尤其利用照相机的拍照、在图像处理机构和/或便携式计算机单元中的图像处理和/或分析的病原体和/或细胞的成像证明。它尤其包括物体识别，或许在抠除荧光背景后和/或或许计算出由检验系统结构引起的光学人工产物后。在免疫荧光标记情况下可在采用照明单元情况下通过优选包含放大单元和照相机的图像处理机构成像记录荧光信号，从而在显微镜图像中能看到病原体和/或细胞的荧光组织。借助图像处理机构和/或便携式计算机单元，无需使用者干预就可进行荧光结构的物体识别和基本分析如自动估算单位样本体积内病原体数量。该结果也可借助便携式计算机单元被传输给医学专业人员，其完成诊断并可以启动相应治疗。

[0028] 此时可以想到的是可以本身单独地和/或以任何顺序执行一些步骤。

[0029] 该检验方法优选可以被用作疾病证明。在此，尤其是可以想到以下疾病，传染病，由真菌、病毒和/或细菌和/或病菌和/或病原体引起的疾病。作为病原体，此时还尤其想到以下病原体：腺病毒，钩虫，蛔虫，巴贝虫，炭疽杆菌，百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌，回归热螺旋体，布鲁氏菌属，弯曲杆菌属，绦虫，鹦鹉热衣原体，肉毒杆菌，白喉棒状杆菌，贝纳特氏立克次体，人致病隐孢子虫属，埃博拉病毒，多房棘球绦虫，细粒棘球绦虫，大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌(EHEC)，真绦虫，土拉热弗朗西丝菌，FSME病毒，黄热病毒，蓝氏贾第鞭毛虫，流感嗜血杆菌，汉塔病毒，甲肝病毒，乙肝病毒，丙肝病毒，丁肝病毒，戊肝病毒，流感病毒，拉沙病毒，军团菌属，人致病钩端螺旋体属，单核细胞增多性李司特氏菌，马尔堡病毒，梅寿病毒，腮腺炎病毒，麻风分歧杆菌，结核分歧杆菌/非洲分歧杆菌，牛型结核菌，脑膜炎奈瑟菌，诺瓦克样病毒，脊髓灰质炎病毒，绿脓杆菌，狂犬病毒，普氏立克次氏体，轮状病毒，风疹病毒，副伤寒沙门氏菌，伤寒沙门氏菌，血吸虫，志贺氏菌属，牛肉绦虫，猪肉绦虫，鞭虫，锥体虫，布氏锥体虫，刚果锥体虫，活动锥体虫，旋毛虫，水痘-带状疱疹病毒，1群和139群霍乱弧菌，结肠炎耶尔森杆菌，鼠疫杆菌，梅毒螺旋体，HIV，棘球绦虫属，疟原虫属，刚地弓形虫，肺炎链球菌和/或金黄色葡萄球菌，尤其是尤其在血样中的疟疾病原体如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫。

[0030] 在该检验方法中优选可以想到证明尤其出现在血样中的疟疾病原体。

[0031] 在本发明范围内也可能有利的是，该检验方法可被用于位置确定、固定和/或富集的机构以证明血样中的疟疾病原体。此时可行的是，在感染的红细胞内的至少一个组织可供使用。检验方法可以包含透化剂尤其是皂甙和/或氯化铵，并且为了至少一个捕获剂配体尤其包含至少一个优选可结合到至少一个磁粒尤其是Turbobead的针对疟原虫蛋白的抗体，和/或为了标记配体而包含最好至少一个针对疟原虫蛋白的荧光标记抗体和/或至少一个针对疟原虫DNA的DNA染料。因此，疟原虫的和/或至少一个感染红细胞的至少一个组织在夹层结构中被证明和/或至少一个感染红血球和/或疟原虫的至少一个组织可借助蓄积和/或磁分离在用于位置确定、固定和/或富集的机构中被捕获。

[0032] 另外，该检验方法可以配备有用于位置确定、固定和/或富集的机构，其包含至少一个也与微流结构组合的微量吸收池，样液、优选来自手指肚的规定量全血被收存在其中。在带有或不带微流结构的微量吸收池中，样液优选与冻干物质如阻凝剂和/或带有或不带磁珠的捕获剂配体和/或一个或多个标记机构和/或稳定剂和/或用于溶解和/或透化的机构混合。混合例如可通过加载借以使所含磁粒引导经过溶液的可切换外磁场、流道内的人字形花纹、振动、声波或其它混合方法被加强。随后，结合到固定机构如磁微粒或纳米粒上的病原体或病原体组成部分可以在一视窗中被固定住且通过显微镜发现。此外，该检验方法可以包括带有至少一个与过滤结构如优选是就像在侧流检测中那样的抽吸滤垫组合的微流结构的用于位置确定、固定和/或富集的机构。

[0033] 样液如来自手指肚的规定量的全血可被加入该微流结构。样液优选可以混有冻干物质如抗凝剂和/或一个或多个标记机构例如带有荧光标记或金粒的抗体和/或稳定剂和/或用于溶解和/或透化的机构。接着，可以通过例如打开通风口和/或例如通过移动和/或弯折芯片和/或通过克服流阻而使液体接触到过滤结构。过滤结构随后从毛细管中吸走液体。捕获剂配体如对病原体抗原的特异抗体在过滤结构上被固定住。过滤结构如吸垫的小孔径和液体吸入造成病原体或组成部分接触到捕获剂配体且被固定住。类似于侧流检测，此时出现条带，但其不像侧流检测中那样通常由含有结合的抗体的蛋白质构成，而是由标记的病原体和/或细胞和/或其组成部分构成。根据浓度和例如借助染料、荧光染料金粒、珠的标记方法的不同，该条带可以通过显微镜和/或照相和/或用肉眼来分析。作为可能的膜，例如可采用至少其中一个下述膜：BA83，BA85，CF1，CF3，CF4，CF5，CF6，CF7，LF1，MF1，VF2，Fusion
5，GF/DVA，AE，FF120HPFFHP。

[0034] 根据本发明的另一方面，可以想到借助检验系统和/或检验方法诊断疾病的用途。本发明的用途此时带来了与已经关于本发明的检验系统以及本发明的检验方法所明确描述的一样的优点。尤其是床旁诊断也可以由经验不足的人员进行，因此，可以通过该检验系统在现场及时证明所搜寻的病原体和/或细胞，而不是借助复杂的实验室方法。

[0035] 改善本发明的其它措施来自以下对本发明的几个如图示意所示的实施例的说明。所有来自权利要求书、说明书和/或附图的特征和/或优点包含结构细节、空间布置和方法步骤在内地不仅可以单独地、也可以在各种不同组合中对于本发明是重要的。在此要注意，附图只具有描述特性而不是想要以任何形式限制本发明，其中：

[0036] 图1a是在透化之前的目标细胞的示意图，

[0037] 图1b是在透化之后的目标细胞的示意图，

[0038] 图2a是作为用于位置确定、固定和/或富集的机构的反应器皿的示意图，

[0039] 图2b是作为用于位置确定、固定和/或富集的机构的微流道的示意图，

[0040] 图2c是带有蓄积装置的微流道的示意图，

[0041] 图3是在病原体和/或细胞的透化、标记和捕获后的拍照和处理的示意图，和[0042] 图4是检验系统的示意图。

[0043] 图1a示出了具有特异的内部目标组织40、50如抗原、蛋白质、脂质、糖链、核酸链、缩氨酸或其它的生物分子的病原体和/或感染细胞10。它可以是病原体10如细菌，其具有分隔结构30例如细胞膜和/或细胞壁，其基本上将细胞内外分隔开。它包含有如在一个或多个内组织20上的细菌属特有的目标组织40、50例如类囊体、核糖体、质粒、绿色体、鞭毛基础器官、核苷酸、细胞膜的胞质侧和/或其它组成部分，在其上能找到目标组织如抗原。被加入外溶液中的和/或在那里溶解的捕获剂配体60如例如带有结合的磁纳米粒70如Turbobead的特异抗体和/或标记配体80如带有结合标记90如荧光体、量子点、酶、金粒和/或其它标记物的特异抗体可以因为分隔结构30如细胞壁和/或脂质膜和/或其它结构而不能进入细菌内。

[0044] 细胞10例如也可以是被疟疾病原体20(疟原虫属)感染的红血球10。目标组织40、50也可以是位于红细胞内的疟原虫属组织。

[0045] 红血球被细胞膜包裹，细胞膜作为分隔结构30将细胞内外基本分隔开。它包含有疟原虫属特有的如在一个或多个内组织20上的目标组织40、50，比如在细胞骨架和/或内膜上的疟原虫蛋白。被加入外溶液中的和/或在那里溶解的捕获剂配体60如例如带有结合的磁纳米粒70如Turbobead的特异抗体和/或标记配体80如带有结合标记物如荧光体、量子点、酶、金粒的特异抗体可能因为分隔结构30而无法进入红细胞内。

[0046] 图1b示出了添加透化机构110之后的细胞10，透化机构例如是皂甙、成孔剂、溶解剂、引入触发剂、低张溶液或高张溶液和/或其它物质。通过透化机构，可以出现呈裂纹、微孔、孔、如不含胆固醇的失稳膜部形式的开口31和/或吸收过程31如在分隔结构30中的输送机制。其结果就是，加入外溶液中的捕获剂配体60可以连同结合的磁纳米粒70和/或带有结合标记物90的标记配体80进入细胞和/或病原体并在那里特异结合至各自目标组织40和/或50。捕获剂配体60和标记配体80优选没有交叉反应性，即它们结合至各种不同的目标组织40、50，从而优选可以出现夹层结构。优选可以通过标记配体80例如荧光标记抗体结合至目标组织40例如病原体类抗原出现免疫染色。

[0047] 图2a是作为用于位置确定、固定和/或富集的机构连同所装的带有细胞10、11的样本的反应器皿121的示意图。

[0048] 在此，细胞10优选可以是目标细胞，而细胞11是非目标细胞。反应器皿121例如可以是微反应器皿如Eppendorf反应器皿和/或色谱分析液柱。对应的磁体130如高梯度磁体和/或永磁体和/或电磁体和/或其它磁体可以在反应器皿121内产生磁吸力131。吸力131此时可以作用于磁纳米粒70，由此磁纳米粒和通过捕获剂配体被结合的目标组织50可被吸引，按空间靠近磁体的方式(就反应器皿10内可行程度而言)被富集和固定。结合的目标组织50优选可以与细胞和/或病原体10的组成部分和/或大部分结合，从而结合的目标组织50连同所附的其它组成部分按空间靠近磁体的方式富集在例如反应器皿的朝向磁体的壁上。非目标细胞如未感染的红细胞可能无法通过捕获剂配体被结合且无法被富集。通过结合标记配体如荧光标记的抗体和/或荧光DNA染料，可以进行目标细胞组织的标记。

[0049] 图2b示出了微流结构140(作为用于位置确定、固定和/或富集的机构)连同所含样本的示意图，此时采用了具有磁纳米粒的捕获剂配体。微流结构由具有所含的毛细管和/或微结构和/或一个或多个微流道的构件构成。样液连同所含细胞10、11可以在流动方向141上流过微流结构140。对应的磁体130可以在微流结构区域内产生磁力131。该力可以吸引磁纳米粒70，如图2a所示，因此作用于结合的捕获剂配体60和结合的目标组织50和/或优选所结合的大部分组织20和/或10。这可能导致目标组织和优选细胞10和/或组成部分在微流结构140尤其在顶面、侧壁和/或底面上富集。细胞11如未感染的红细胞无法通过捕获剂配体60被结合和富集。通过标记配体80如荧光标记的抗体和/或荧光DNA染料的结合，可以进行目标细胞10的目标组织40的标记。

[0050] 图2c是用于微流结构140(作为位置确定、固定和/或富集的机构)连同在微流道内的所含样本和蓄积装置的示意图。样液连同所含细胞10、11可以在流动方向141上流过微流结构140。在微流结构区域内的蓄积装置可以截住所含的细胞10、11(目标细胞和非目标细胞)和/或目标病原体10，而余液可以部分流入/流过蓄积装置。通过标记配体80如荧光标记的抗体和/或荧光DNA染料的结合，还可以进行细胞10结构的标记。在蓄积细胞10、11(目标细胞和非目标细胞)下方的标记细胞10(目标细胞)可借助图像处理装置被发现。

[0051] 图3示出了在荧光标记和成像探查情况下的透化、标记和/或富集之后的拍照和处理的示意图。样本连同所含细胞10可以用激发照明机构150例如LED和/或激光器和/或照明光源的激发光151如波长在300-950纳米范围内的光来照射。激发照明机构可被如此调谐，即它激发所述标记90以发出荧光152，例如波长在300-1000纳米范围的光。荧光152可以随后被图像处理机构160采集。图像处理机构160可以配有放大单元161和照相机162。照相机的图像数据可以被处理并借助数据传输装置164优选无线地被发送至便携式计算机单元163如智能手机。便携式计算机单元163可以分析该图像数据且还执行用户提示和图像处理机构的控制。结果，所含的细胞和/或病原体可以在图像上被确定位置和显示。诊断检查例如可以通过传输病原体图像至计算机单元164如医学专业人员的另一移动智能手机来由其进行。

[0052] 图4示出了微流结构200的示意图，其例如包括毛细管和/或微流道和/或其它微流结构。它可以包括取样部210，一定量液样被加入其中。它例如可以是具有规定体积的毛细管。取样部210可以包含冻干物质如阻凝剂。样本随后可以例如因毛细管力而流过微流结构200。样本例如可以在那里借助微流道的分支被划分开，使得第一样本部分可以流过用于所供给的固态物质220的储库并在那里例如可溶解冻干配体。在混合/繁殖结构中，第一样本部分与所述物质混合和繁殖。第一样本部分可以与第二样本部分汇合并在混合/繁殖结构
240中混合和繁殖。在检测区域内可以进行捕捉、富集和/或固定。图像处理机构可以发现在检测区域内的目标细胞/目标病原体。流动过程优选可通过抽吸装置250如抽吸毛毡和/或微泵来维持，但也可以通过外部装置例如泵进行。溶液随后可以被集中在废物容器260里。
另外，作为试条的微流结构可以包含编码如条形码和/或RFID元件以识别样本身份。

[0053] 疟疾病原体探查例子

[0054] 疟疾病原体在其生命周期中经过多个状态。在来自手指肚的毛细管血中，人们主要在感染红血球(iRBC)中找到处于环形态的疟原虫。不同于未感染的红血球(RBC)地，疟原虫包含有DNA。在iRBC的表面上，人们找到各种寄生抗原如PfEMP-1蛋白。但为了出现免疫反应，在此分别只看到由许多可变基因编码低等形式构成的池中的一个。对于恶性疟原虫病原体，迄今还不知道通用地识别尽量所有变体且因而可被作为通用抗体被用于所有被恶性疟原虫感染的iRBC的诊断识别的抗体。但是，在含有呈环形态的病原体的iRBC内找到少量寄生抗原，其并没有可变地出现在所有恶性疟原虫中。在商业上得到针对疟原虫蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体例如针对恶性疟原虫“所有阶段”的单克隆鼠IgM-抗体以及单克隆抗MSP-1和/或MSP-10-抗体。寄生抗原的另一个例子是环形感染红细胞表面抗原(RESA)，其名不副实地不是在iRBC的表面找到，而是在iRBC细胞骨架组成上的感染红细胞的膜内找到。在寄生膜上且在疟原虫膜透化后也在疟原虫细胞质能找到其它的抗原，其通过特异抗体可被证明。在一个实施方式中，优选1-10微升的规定量全血自手指肚被加入试条。红细胞通过透化机构且优选皂甙和/或氯化铵被透化和/或溶解，从而标记配体且优选是荧光标记抗体如针对被恶性疟原虫感染的RBC的单克隆鼠IgM抗体、用DyLight 488标记的Klon IIIB6和/或荧光标记的抗RESA抗体可扩散到iRBC中。在那里，其结合至感染的RBC并产生免疫荧光标记。或者，通过荧光DNA染料如Hoechst 33342可以标记寄生虫DNA。过滤件现在截留所有的细胞和细胞组成部分。荧光标记可以利用作为荧光显微镜的具有图像处理单元的放大单元被看到。在另一个实施方式中，作为结合机构采用磁纳米粒如Turbobead-PEG链霉亲和素，生物亲和化抗体如针对被恶性疟原虫感染的RBC的单克隆鼠-IgM-抗体、Klon IIIB6被生物亲和化地结合至其上。在RBC和iRBC透化后，MNP扩散到红细胞中且在那里特异结合至感染的RBC的组织。作为第二标记机构，添加入荧光DNA染料和/或荧光标记的抗体，其产生iRBC和/或疟原虫的免疫荧光。在检测区域内，iRBC借助磁体被固定和富集并且可借助荧光显微镜被成像发现。在另一个实施方式中，纳米粒如Chemicell股份有限公司的NanoScreenMag粒和/或Nvigen公司的MyQuVigen纳米粒作为结合和标记机构被加入经过透化的iRBC。它在检测区域可借助磁体被固定住并借助荧光显微镜由光学放大单元成像证明。包含荧光标记的iRBC的图像数据总是可以通过图像处理装置接受第一处理，例如背景修正和/或压缩。在下一步骤中可以借助物体识别App在图像中搜索物体，其强度高于关键值且可以具有规定的大小和/或像素数，因此可以被限定为病原体。所述分析可以在图像处理装置和/或便携式计算机单元中进行。物体发现可以通过相应的检查如白光照明下的细胞识别和/或根据膜染色的荧光识别被进一步确保。可以从病原体发现中推断出患者诊断。

[0055] 作为用于发现疟疾病原体的应用例子的另一个可能方式是将作为用于溶解和透化的机构的皂甙添加至全血样本中的被疟原虫感染的红细胞。皂甙的作用使得外红细胞膜溶解，寄生物可以从中被释放出，在此保持获得寄生泡。在寄生膜上有至少一个组织如寄生抗原如蛋白RAP1或EXP2。它们例如积蓄在棒状体、微线体或致密粒子中并因此也在早期的滋养体中已有。至少一个捕获剂配体60尤其至少一个针对疟原虫蛋白如RAP1或EXP2的抗体如单克隆抗体抗RAP-1Klon 2.29或者单克隆抗体抗EXP-2Klon 2.2可结合至其上。该抗体优选结合到至少一个磁微粒或纳米粒70尤其是Dynabead磁珠或Dynabead Myone和/或至少一个或多个标记配体80优选至少一个或多个标记抗体如抗疟原虫蛋白的单克隆抗体抗RAP-1Klon 2.29或单克隆抗体抗EXP-2Klon 2.2例如RAP1或EXP2。所述抗体优选可以用光谱可区分的荧光染料例如Dyomics股份有限公司的DY-396XL或者量子点如Thermo Fisher Scientific的Qdots或Candots股份有限公司的Candots来标记。也可以针对疟原虫DNA采用至少一个(优选荧光)DNA染料，以便由此尤其证明疟原虫20的和/或至少被一个或多个疟原虫20感染的红细胞10的至少一个组织40、50、20和/或借助蓄积和/或磁分离在用于位置确定、固定和/或富集的机构120如至少96阱、尤其1536阱的微滴定板、微量吸收池、不带或涂有捕获剂配体的过滤结构或者流体结构中捕获至少一个感染的红细胞10和/或疟原虫的至少一个组织40、50、20。

[0056] 败血症病原体探查例

[0057] 败血症每年出现在例如约一千八百万患者身上并且有约50％的致死率。超过25种不同的病原体可能对败血症负责，例如细菌(脑膜炎双球菌、链球菌等)和/或真菌感染。例如对于链球菌，已经存在商用的快速检验。但它通常由多个步骤组成，因为借助多个试剂首先必须从细胞壁中溶解出抗原，随后在指标物反应中来证明。95-100％的高特异性被良好登记在案。但检测灵敏性例如只有70-90％，即结果的10-30％是假阴性。在传染性细菌情况下，一般看到表面抗原的区域性和实践性变化。本发明的快速检验可在结合并标记若无细胞透化就无法让配体接近的其它抗原情况下进行。与在疟疾病原体例子中的探查相似地，在此有各种不同的实施方式，例如A)蓄积所有细胞并且借助荧光标记抗体针对早期保藏的内部抗原的免疫荧光证明，B)磁捕获和同时借助与特异抗体结合的荧光MNP的荧光标记和/或C)借助带有特异抗体的MNP、优选Turbobead的磁捕获和借助另一个荧光标记抗体和/或DNA染料的荧光标记。

[0058] 用于食品和/或饮用水分析的本发明用途的例子

[0059] 在饮用水中的噬肺性军团杆菌的证明

[0060] 噬肺性军团杆菌是具有2-5微米平均长度和0.5-0.8微米直径的活动杆状菌。它们分许多类和血清组地在世界范围内流传地存在于水面和还有饮用水管中。嗜肺性军团病杆菌感染通过粉碎喷雾水进行并可能导致所谓的军团病即重肺炎，其具有10-15％的致死率。商用快速检验大多包含取样部，其被提供给实验室并在那里借助琼脂板细菌培养在10天后被分析。本发明的一个实施方式例如可以包含试条，其设计用于过滤在微升至几升和/或立方米范围内的饮用水体积，从而所有所含的细胞、细菌和病原体被截住且排列在检测区域内。这例如可以用具有0.45微米孔径的微孔滤膜进行。接着，病原体透化机构例如自试条所含的疱被引入，使得滤膜随之繁殖。另外例如给荧光标记抗体和/或荧光纳米粒添加特异结合至噬肺性军团杆菌的抗原和/或细胞组织的抗体，其若无透化机构则无法接近且具有就地点和实践而言恒定的结构。病原体可借助免疫荧光通过具有图像处理装置的放大单元被成像发现。在另一实施方式中，首先在混合腔中将体积在微升至几升和/或立方米范围内的饮用水与透化机构和与针对噬肺性军团杆菌抗原的特异抗体结合的磁微粒如Dynabead或纳米粒如Turbobead混合。繁殖后，混合物在试条内排布在磁体is行地在检测区域旁经过。
MNP在此从溶液中被捕获，由此，结合的噬肺性军团杆菌和/或其组成部分被固定住。荧光染色可以通过标记配体如荧光DNA染料和/或荧光标记的抗体和/或结合有抗体的荧光纳米粒进行。所述发现可以又借助成像免疫荧光进行。

[0061] 作为该应用例的扩展，采用尤其是体液如尿和/或粪便的样本和/或食品样本和/或饮用水样本，其可被混有缓冲剂以溶解。固体组成部分可以随后例如通过过滤、沉淀和/或离心分离被分离。病原体如噬肺性军团杆菌和/或病原体的卵、蛔虫、鞭虫、钩虫、绦虫的蠕虫可以通过用于溶解和/或透化的机构110被溶解和/或透化。病原体、病原体的卵和/或其组成部分可以随后用标记配体80来标记和/或通过用于位置确定、固定和/或富集的机构120如过滤结构和/或磁粒被富集和/或借助成像显微镜被发现。

[0062] 以上对实施方式的说明仅在例子范围内描述了本发明。显然，多个实施方式的一些特征只要在技术上有意义就可以相互自由组合，而没有超出本发明的范围。

[0063] 附图标记列表

[0064] 10 目标细胞或目标病原体

[0065] 11 细胞

[0066] 20 细胞的和/或病原体的组织

[0067] 30 分隔结构

[0068] 31 在30中产生的开口和/或通过30的吸收机制

[0069] 40 目标组织

[0070] 50 目标组织

[0071] 60 捕获剂配体

[0072] 70 磁纳米粒

[0073] 80 标记配体

[0074] 90 标记

[0075] 110 透化机构

[0076] 120 用于位置确定、固定和/或富集的机构

[0077] 121 反应器皿

[0078] 122 蓄积装置

[0079] 130 磁体

[0080] 131 磁吸力

[0081] 140 微流结构

[0082] 141 流动方向

[0083] 150 照明单元

[0084] 151 激发光

[0085] 152 荧光

[0086] 160 图像处理机构

[0087] 161 放大单元

[0088] 162 照相机

[0089] 163 便携式计算机单元

[0090] 164 数据传输装置

[0091] 165 便携式计算机单元

[0092] 200 微流结构

[0093] 210 取样部

[0094] 220 库

[0095] 230 疱库

[0096] 240 混合结构，繁殖结构

[0097] 250 抽吸装置

[0098] 260 废物容器

[0099] 270 编码

[0100] 280 检测区域

标题	发布/更新时间	阅读量
蛔甙△C9在松墨天牛防治和阻截松材线虫传播中的应用	2020-05-16	197
蛔甙△C7在松墨天牛防治和阻截松材线虫传播中的应用	2020-05-17	613
蛔甙C8在松墨天牛防治和阻截松材线虫传播中的应用	2020-05-20	863
一种声韵意调编码的汉字输入方法	2020-05-28	460
计算机拼音汉字的输入方法	2020-05-29	609
用于证明病原体和细胞的快速检验和方法	2020-05-25	872
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自身免疫性和炎性疾病的蛔甙治疗	2020-05-11	230

用于证明病原体和细胞的快速检验和方法

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