含有杀线虫剂组合物的协同查尔酮
阅读：164发布：2020-05-13
专利汇可以提供含有杀线虫剂组合物的协同查尔酮专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 杀 线虫 剂 的一协同组合物，所述 杀线虫剂 由一杀线虫胜肽及查 耳 酮 类化合物组成，所述杀线虫胜肽源自于CED-4蛋白序列，所述CED-4蛋白序列为胜肽2、或胜肽3或胜肽12；查耳酮类化合物为查耳酮17、查耳酮25或查耳酮30。所述杀线虫肽在1毫克/毫升的浓度下单独显示出100％的杀线虫活性，而当所述杀线虫肽与查耳酮类化合物组合时，在低至0.8毫克/毫升的浓度下观察到100％的杀线虫活性并产生一协同作用。本发明的另一 实施例 提供了一种制备查耳酮类化合物在例如 水 的水性 溶剂 中的多个工作溶液的方法，所述方法是通过在 乙醇 及水中依次稀释被制备在二甲基亚砜中的查耳酮类化合物的储备溶液制备而成。所述杀线虫的组合物中的查耳酮类化合物的最终浓度约为10-4至10-5摩尔浓度，所述协同杀线虫组合物对环境安全且对人及动物无毒。，下面是含有杀线虫剂组合物的协同查尔酮专利的具体信息内容。
1.一种用于防治多个线虫的组合物，其特征在于：所述组合物包括：
a)一有效量的至少一源自于CED-4蛋白的胜肽，所述胜肽包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列选自于SEQ ID NO.2至4；及
b)一有效量的化学式1的至少一化合物；
其中，
环A为
其中所述组合物在所述胜肽的浓度为约0.8毫克/毫升及化学式1的化合物的浓度为约
104至106摩尔浓度下的协同抗线虫效率为100％。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物包括由下述组成的胜肽：具有
15个氨基酸长度的SEQ ID No.2的氨基酸序列；及所述氨基酸序列的所有类似物、同系物、衍生物及保守性变体。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物包括由下述组成的胜肽：具有
16个氨基酸长度的SEQ ID No.3的氨基酸序列；及所述氨基酸序列的所有类似物、同系物、衍生物及保守性变体。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物包括由下述组成的胜肽：具有
12个氨基酸长度的SEQ ID No.4的氨基酸序列；及所述氨基酸序列的所有类似物、同系物、衍生物及保守性变体。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括至少一增效剂、乳化剂及/或表面活性剂。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包含至少一农业化学活性化合物。
7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述农业化学活性化合物选自但不限于能够对多个植物进行处理的物质、杀真菌剂、杀菌剂、杀虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、安全剂、植物生长调节剂、植物营养剂及生物防治剂。
含有杀线虫剂组合物的协同查尔酮
技术领域
[0001] 本发明涉及多种杀线虫剂，其在农业领域中用于杀死多个植物寄生虫的多个组合物，特别是多个线虫。更具体地，本发明涉及一种杀线虫剂的一协同组合物，所述协同组合物包括源自于CED-4蛋白的一杀线虫胜肽及查耳酮类化合物。
背景技术
[0002] 线虫为农业的一主要威胁，由于线虫对产量造成多个严重的损失，从而对经济产生一重大影响。众所周知，线虫为仅次于昆虫会对例如西红柿及其他蔬菜、柑橘类水果、土豆、大米、椰子、小麦及其他谷物、观赏植物等农作物造成严重的破坏。线虫单独或与其他土壤微生物结合已被发现会侵袭植物的几乎每个部分，包括：根、茎、叶、果实及种子。线虫在全球导致的一预测产量损失为12.3％($1570亿美元)，其中有4030万美元被报导为来自印度(Singh等人，2015)。
[0004] 多个杀线虫剂是用于杀死所述多个植物寄生虫、所述多个线虫的多个组合物，所使用的大多数杀线虫剂是对人类有高毒性且也对有用的土壤细菌有害的多个化学组合物。多种杀线虫剂还显示出污染地下水，并导致臭氧层的消耗。一著名的杀线虫剂甲基溴在包括美国及印度在内的多个国家中被禁止使用。另一广泛用于农作物的高毒性杀线虫剂为呋喃丹；一单一颗粒的呋喃丹可以在几分钟内杀死鸟类。例如福瑞松等的多个杀线虫剂很容易穿过土壤进入地下水并污染地下水。
[0005] 与多个化学杀线虫剂有关的多个严重缺点使得必须开发多种用于防治多个线虫的新技术。所述方法中的一个是生成表达抗线虫性的多个转殖基因的转基因植物品系。然而，这是耗时且昂贵的方法，需要大量的先前研究活动。在包括印度在内的许多国家，基于一些道德、伦理及未见的环境问题而强烈反对引入多个转基因品系。
[0006] 一种有效的方法涉及生成多个杀线虫剂的多个组合物，其对环境安全、无毒并且易于生成及使用。
[0007] US9125413B1描述了源自于秀丽隐杆线虫的CED-4蛋白的多个胜肽，具有强大的杀线虫活性。CED-4蛋白由SEQ ID NO.1组成，属于凋亡蛋白家族。所述SEQ ID NO.1包括：
[0008] MLCEIECRALSTAHTRLIHDFEPRDALTYLEGKNIFTEDHSELISKMSTRLERIANFLRIYRRQASELGPLIDFFNYNNQSHLADFLEDYIDFAINEPDLLRPVVIAPQFSRQMLDRKLLLGNVPKQMTCYIREYHVDRVIKKLDEMCDLDSFFLFLHGRAGSGKSVIASQALSKSDQLIGINYDSIVWLKDSGTAPKSTFDLFTDILLMLKSEDDLLNFPSVEHVTSVVLKRMICNALIDRPNTLFVFDDVVQEETIRWAQELRLRCLVTTRDVEISNAASQTCEFIEVTSLEIDECYDFLEAYGMPMPVGEKEEDVLNKTIELSSGNPATLMMFFKSCEPKTFEKMAQLNNKLESRGLVGVECITPYSYKSLAMALQRCVEVLSDEDRSALAFAVVMPPGVDIPVKLWSCVIPVDICSNEEEQLDDEVADRLKRLSKRGALLSGKRMPVLTFKIDHIIHMFLKHVVDAQTIANGISILEQRLLEIGNNNVSVPERHIPSHFQKFRRSSASEMYPKTTEETVIRPEDFPKFMQLHQKFYDSLKNFACC。
[0009] 源自于SEQ ID NO.3的三种胜肽已显示在多个有效浓度为约1毫克/毫升(mg/ml)时具有杀线虫活性，所述胜肽包括以下序列：
[0010] 1)胜肽2，由15个氨基酸DLLRPVVIAPQFSRQ(99至113个氨基酸序列段，SEQ ID NO.2)组成，
[0011] 2)胜肽3，由19个氨基酸RQMLDRKLLLGNVPKQMTC(112至130个氨基酸序列段，SEQ ID NO.3)组成，及
[0012] 3)胜肽12，由12个氨基酸FPKFMQLHQKFY(529至540个氨基酸序列段，SEQ ID NO.4)组成。
[0013] 本发明考虑了现有技术的多个缺点，并且提供了一种使用多个抗寄生虫胜肽及一组无毒且对环境安全的化合物——查耳酮来防治多个线虫的方法。
[0014] 本发明的目的：
[0015] 因此，本发明的主要目的是提供一种对环境安全、易于生成及使用的一杀线虫剂的一组合物。
[0016] 本发明的另一个目的是提供一种协同杀线虫组合物，其包括：
[0017] 1.源自于CED-4蛋白的至少一胜肽、胜肽2、胜肽3或胜肽12，其中：
[0018] a.胜肽2，长度为15个氨基酸的一胜肽，包括：DLLRPVVIAPQFSRQ序列(SEQ ID NO.2)，
[0019] b.胜肽3，长度为19个氨基酸的一胜肽，包括：RQMLDRKLLLGNVPKQMTC序列(SEQ ID NO.3)，及
[0020] c.胜肽12，长度为12个氨基酸的一胜肽，包括：FPKFMQLHQKFY序列(SEQ ID NO.4)；
[0021] 及
[0022] 2.至少一个属于查耳酮类化合物的查耳酮，其中所述查耳酮为查耳酮17、查耳酮25或查耳酮30。
[0023] 本发明的另一目的为提供一种显示杀线虫活性的协同杀线虫组合物，所述多个胜肽的浓度小于1毫克/毫升，并且所述查耳酮类化合物的浓度为10-4至10-5的范围之间。
[0024] 本发明的另一目的是提供一种用于溶解查尔酮类化合物的方法，并且提供一种用于提供查尔酮类化合物在例如水等的多个水性溶剂中的多个工作溶液以作为一杀线虫剂的方法。
[0025] 本发明的另一目的是提供一种对人类无毒的协同杀线虫组合物。
[0026] 本发明的另一目的是提供一种不具有广谱活性且对多个土壤微生物无害的协同杀线虫组合物。
[0027] 本发明的另一目的是提供一种易于合成、不需要产生多个转基因植物并且非常经济的协同杀线虫组合物。
发明内容
[0028] 本发明涉及一种杀线虫剂的一组合物，其用于农业目的，以杀死多个植物寄生虫，特别是多个线虫。更具体地，本发明涉及一种杀线虫剂的协同组合物，所述协同组合物包括多个杀线虫胜肽及查耳酮类化合物。
[0029] 在本发明的主要实施例中，本发明提供了一种杀线虫剂的组合物，其包括：
[0030] 1.源自于CED-4蛋白的至少一胜肽、胜肽2、胜肽3或胜肽12，其中：
[0031] a.胜肽2，长度为15个氨基酸的一胜肽，包括：DLLRPVVIAPQFSRQ序列(SEQ ID NO.2)，
[0032] b.胜肽3，长度为19个氨基酸的一胜肽，包括：RQMLDRKLLLGNVPKQMTC序列(SEQ ID NO.3)，及
[0033] c.胜肽12，长度为12个氨基酸的一胜肽，包括：FPKFMQLHQKFY序列(SEQ ID NO.4)；
[0034] 及
[0035] 2.至少一个属于查耳酮或查耳酮类化合物的查耳酮，其中所述查耳酮为查耳酮17{(2E)-1-(2,4-二氯苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮}、查尔酮25{((2E)-1-(4-乙氧基苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮或查尔酮30{(2E)-3-苯基-1-(2-噻吩基)-2-丙烯-l-酮}。
[0036] 所述多个胜肽、胜肽2、胜肽3及胜肽12在低至1毫克/毫升的多个浓度下分别显示出100％杀线虫活性。然而，所述多个胜肽中的任一种与查耳酮类化合物、查尔酮17、查尔酮25或查尔酮30的组合以一协同的方式作用，对于100％杀线虫活性，所述多个胜肽的浓度可降低至0.8毫克/毫升，其中多个查耳酮类化合物的浓度为降低至10-4至10-5摩尔浓度(M)。
活性所需的胜肽的含量的显着减少大幅降低了生产成本，从而使独特的组合物非常经济。
活性所需的胜肽的含量的显着减少大幅降低了生产成本，从而使独特的组合物非常经济。
[0037] 查尔酮类化合物为多个复杂的有机化合物，查尔酮类化合物不易溶于水性溶剂(例如：水)中。多个有机溶剂，例如：二甲基亚砜及乙醇通常用于溶解查耳酮类化合物。然而，所述多个溶剂对人类及动物有毒，并且对环境有害。
[0038] 因此，在本发明的另一实施例中，本发明提供了一种通过连续稀释法将浓缩的查尔酮储备液溶解在水中的方法，所述查尔酮储备液在DMSO中制备，然后在乙醇中依次稀释，随后以水稀释，以制备作为一杀线虫剂的一工作溶液。查耳酮类化合物的所述工作溶液在10-4至10-5摩尔浓度的范围内，其中DMSO及乙醇的最终浓度分别在0.01至0.1％及0.5至5％之间，所述最终浓度对环境安全且对人类及动物无毒。
附图说明
附图说明
[0039] 图1示出了在一96孔盘的实验中的胜肽2与查尔酮17或查尔酮25组合对多个线虫的效果的一图示。
[0040] 图2示出了在一96孔盘的实验中的胜肽2与查尔酮30组合对多个线虫的效果的一图示。
[0041] 图3示出了在一96孔盘的实验中胜肽3与查尔酮17或查尔酮25组合对多个线虫的效果的一图示。
[0042] 图4示出了在一96孔盘的实验中胜肽3与查耳酮30组合对多个线虫的效果的一图示。
[0043] 图5示出了在一96孔盘的实验中胜肽12与查尔酮17或查尔酮25组合对多个线虫的效果的一图示。
[0044] 图6示出了在一96孔盘的实验中胜肽12与查耳酮30组合对多个线虫的效果的一图示。
[0045] 图7示出了在一96孔盘的实验中孵化多个线虫的多个虫卵时胜肽2单独或与查耳酮类化合物结合的一图示。
[0046] 图8示出了在一96孔盘的实验中孵化多个线虫的多个虫卵时胜肽3单独或与查耳酮类化合物组合的一图示。
[0047] 图9示出了在一96孔盘的实验中孵化多个线虫的多个虫卵时胜肽12单独或与查耳酮类化合物组合的一图示。
具体实施方式
[0048] 现在将在下文中更全面地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式来实施，并且不应被解释为限制于在此阐述的实施例，而是提供所述实施例使得本揭露将是透彻的，并且将本发明的范围充分传达给本领域技术人员。
[0049] 查耳酮或查耳酮类化合物是一组具有由一个芳香族酮及一个烯酮组成的具有中心核的多个化合物。亚苄基苯乙酮为查耳酮系列的母体。查尔酮及其多个衍生物是具有广谱的生物活性的多个分子，例如：抗逆转录病毒、抗炎、抗寄生虫、抗疟疾、抗氧化、抗真菌、抗原生动物、抗细菌、抗甾体、心脏保护、抗肿瘤、抗癌等。已知多种查耳酮天然存在于多种双子叶植物中，以及一些单子叶植物、蕨类植物及裸子植物中。
[0050] 查尔酮，(2E)-1,3-二苯丙-2-烯-1-酮具有化学式C15H12O，而其他查耳酮通常是具有化学式X的一结构的所述母体化合物的多个衍生物：
[0051]
[0052] 化学式X
[0054] 表1提供了三十种查耳酮的结构——查耳酮1至查耳酮30，其中基本结构为化学式X中提供的结构。
[0055] 表1：
[0056] 多个天然的查耳酮的名称及结构
[0057]
[0058]
[0059] Attar等人已经表明，查耳酮类化合物具有杀线虫活性，然而，各个查耳酮的功效的差异很大，在多个不同的浓度下具有从低至5％到高达100％的杀线虫活性。此外，仅有在非寄生模型线虫——秀丽隐杆线虫上测试了查耳酮的作用。在高于10-2摩尔浓度(M)的多个浓度下观察到各个查耳酮的活性。由于毒性、土壤污染、渗入地下水及其他相关问题，因此，为了实现最小抑制作用而使用多个高浓度的化合物变得非常受限。
[0060] 一查耳酮群组可以统称为结构式1：
[0061]
[0062] 化学式1
[0063] 查耳酮17的化学名称为(2E)-1-(2,4-二氯苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮，并且化学式如化学式2所示：
[0064]
[0065] 化学式2
[0066] 查耳酮25的化学名称为(2E)-1-(4-乙氧基苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮，化学式如化学式3所示：
[0067]
[0068] 化学式3
[0069] 查尔酮30的化学名称为(2E)-3-苯基-1-(2-噻吩基)-2-丙烯-1-酮，化学式如化学式4所示：
[0070]
[0071] 化学式4
[0072] 查耳酮类化合物及多个类查尔酮的结构自然存在于许多植物中，此使查耳酮及多个类查尔酮的结构对生态友好；查耳酮及多个类查尔酮的结构与多种生物活动的联系大大增加了其在农业中的潜在用途。然而，查耳酮类化合物的主要限制为其溶解性。查耳酮类化合物不易溶于多个水性溶剂中，例如：水，因此必须溶解在一有机溶剂，例如：二甲基亚砜(DMSO)中。DMSO被认为对人类及动物有毒性，并且急性口服毒性(LD50)为7920毫克/千克(mg/kg)[小鼠]，而急性皮肤毒性(LD50)为40000毫克/千克[大鼠]。因此，溶解在DMSO中的查耳酮类化合物不适合直接施用于多个土壤，由于对接触所述溶解在DMSO中的查耳酮类化合物的使用者及动物具有危害。同样地，另一种溶剂乙醇的急性口服毒性(LD50)为7060毫克/千克[大鼠]，此对多个使用者也不安全。因此，需要一种以对环境安全的解决方案来使用查耳酮的方法。
[0073] 本发明涉及一种具有杀死多个植物寄生虫的能力的协同组合物，特别是多个线虫。更具体地，本发明涉及一种包含一杀线虫胜肽及查耳酮类化合物的一杀线虫剂的一协同组合物，所述胜肽源自于所述CED-4蛋白序列。一个杀线虫胜肽及查耳酮类化合物的结合是独特的，并且与用于线虫防治的其他现有的安全方法(如转基因品系)相比更经济实惠。尽管所述多个胜肽单独显示杀线虫活性，但是与查耳酮类化合物的组合增加了效率，并带来了一协同作用，并且还减少了实现活性所需的胜肽量，因此降低了所述组合物的生产成本。
[0074] 在本发明的主要实施例中，本发明提供了一杀线虫剂的一协同组合物，其包括：
[0075] 1.源自于CED-4蛋白的至少一胜肽、胜肽2、胜肽3或胜肽12，其中：
[0076] a)胜肽2，长度为15个氨基酸的一胜肽，包括：DLLRPVVIAPQFSRQ序列(SEQ ID NO.2)，
[0077] b)胜肽3，长度为19个氨基酸的一胜肽，包括：RQMLDRKLLLGNVPKQMTC序列(SEQ ID NO.3)，及
[0078] c)胜肽12，长度为12个氨基酸的一胜肽，包括：FPKFMQLHQKFY序列(SEQ ID NO.4)；
[0079] 及
[0080] 2.至少一个属于查耳酮或查耳酮类化合物的查耳酮，其中所述查耳酮为查耳酮17{(2E)-1-(2,4-二氯苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮}、查尔酮25{((2E)-1-(4-乙氧基苯基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮。
[0081] 当与化学式2至4中的至少一查尔酮组合时，所述多个胜肽在0.8毫克/毫升的一胜肽浓度下显示100％的杀线虫活性。与多个胜肽SEQ ID NO.2至4组合时，所述查耳酮类化合物在低至10-4至10-5摩尔浓度的多个浓度下也显示出100％的杀线虫酸度。所述多个杀线虫胜肽SEQ ID No.2至4与化学式2至4的查耳酮的组合产生一协同作用，并且与单独的所述胜肽相比，所述组合在一较低的浓度下起作用。
[0082] 查尔酮类化合物不易溶于水或其他水溶液，此使查尔酮类化合物的可用性受到很大限制。将查尔酮类化合物溶解在多个非水溶液中会降低查尔酮类化合物对环境的友好性。通常地，将查尔酮类化合物溶解在对人类及动物有剧毒的有机溶剂(例如：DMSO及乙醇)中。
[0083] 因此，在本发明的另一实施例中，本发明提供了一种以最少的DMSO浓度及乙醇浓度的一环境安全溶液中使用查耳酮类化合物的方法，查耳酮类化合物的工作溶液是在含水溶剂(例如：水)中制成，所述方法包括以下多个步骤：
[0084] 1.制备浓度为10-1摩尔浓度的查耳酮在DMSO中的一储备溶液，例如：通过在1000微升的DMSO中添加13.8毫克(mg)的查尔酮17或12.65毫克的查尔酮25；
[0085] 2.例如，以100％乙醇稀释所述查耳酮储备液，以制备浓度为10-2摩尔浓度的查耳酮溶液，将来自于步骤1的100微升(μl)查尔酮储备液添加到900微升的100％乙醇中；
[0086] 3.将步骤2中的所述查耳酮溶液稀释在50％乙醇水溶液中，得到浓度为10-3摩尔浓度的查耳酮溶液，例如：将来自步骤2的100微升查尔酮溶液添加到900微升的50％乙醇水溶液中；及
[0087] 4.将步骤3中的查耳酮溶液稀释在纯净蒸馏水中，以得到浓度为10-4摩尔浓度的查尔酮水溶液作为所述工作溶液，例如：将步骤2中的查尔酮溶液1毫升(mL)添加到900毫升的50％乙醇水溶液中，然后进一步在蒸馏水中稀释所述溶液，以获得多个较低浓度的查耳酮溶液，例如：10-5摩尔浓度或更低；
[0088] 其中，查耳酮类化合物的所述工作溶液中的DMSO及乙醇的最终浓度分别在0.01至0.1％及0.5至5％之间，所述最终浓度大大低于所述多个溶剂的多个致死浓度。所述方法提供了一种用于将查耳酮类化合物溶解在多个浓度为小于10-4摩尔浓度的多个水溶液中的稀释方法。
[0089] 示例1：
[0090] A)南方根瘤线虫的繁殖
[0091] 多个番茄植株接种了多个南方根瘤线虫(M.incognita)的幼虫，并保持在一生长室中。至少两个月后，从所述多个根中提取南方根瘤线虫卵进行多个实验，下面说明了提取南方根瘤线虫卵的步骤。
[0092] 所述多个根部组织可以使用一手术刀片及一观察镜而用手切碎，也可以使用一食物加工机来切碎，然后将所述切碎的组织放置在一瓶子中，并用一10％稀释的漂白剂洗涤。然后在多个无菌条件下，将所述根部溶液倒入多个筛子中(顶部为60号筛子，底部为500号筛子)。从所述500号筛子的底部收集粗虫卵，并在15毫升的猎鹰(Falcon)管中分别放入5毫升的漂白剂及虫卵混合物。然后将5毫升的70％的蔗糖溶液放置在每一猎鹰管中，然后将1毫升的双重蒸馏无菌水层轻轻地放置在每一猎鹰管中的多个蔗糖混合物上。然后将所述多个样品以1200每分钟转速(rpm)离心5分钟。将悬浮在所述蔗糖溶液及1毫升的水层之间的多个胚胎从每一猎鹰管中总共收集3毫升(3毫升的所述溶液的顶层)收集到多个新的15毫升的猎鹰管中，加入10毫升的5％漂白剂溶液，并将所述多个虫卵进行涡旋振荡10分钟。然后将所述猎鹰管以2000rpm离心5分钟。然后除去上清液，并将所述多个虫卵在10毫升的无菌双重蒸馏水中漂洗，并在2000rpm下再次离心5分钟。所述过程再重复两次。在最后的洗涤后，去除5毫升的上清液，而将剩余的5毫升水与所述多个虫卵混合，并放置在一个5毫升的培养皿中。然后将所述多个虫卵放置在25至27℃的一培养箱中，约10天后孵化出多个幼虫(J2期)，将所述幼虫保存在25至27℃的恒温箱中进行保存。
[0093] B)制备多个测试溶液及放置多个线虫
[0094] 将待测试的查耳酮放置在一个1.5毫升的艾本德(eppendorf)管中，并且加入1毫-1升的二甲基亚砜(DMSO)，以制成一10 的摩尔浓度的溶液。所述储备溶液用于在无菌双重蒸馏水(10-4摩尔浓度至10-5摩尔浓度)中进一步稀释。例如：将在DMSO溶液中的10微升的10-1的摩尔浓度的查耳酮添加到9990微升的无菌双重蒸馏水中，以制成10-4摩尔浓度的溶液，以用于所述多个线虫的多个测定。将在水中的100微升的稀释液吸移到一96孔盘的30孔中，然后从提取的J2期的南方根瘤线虫的一储备液中将一幼虫转移到每一孔中。对于一阴性对照组，为了确认DMSO的浓度不会杀死线虫，在每一实验中，将30只幼虫放置100微升的在无菌双重蒸馏水中的1％DMSO中(过去的工作表明多个秀丽隐杆线虫可以在所述DMSO浓度中生存(Attar等人，2011)。
[0095] C)监测多个线虫
[0096] 所述生物测定法旨在测试所述多个胜肽及查耳酮类化合物杀死所述多个幼虫的能力(死亡率％)。每一测试均在一96孔盘中进行，每一孔中都有一线虫(共30孔)。所述多个线虫在所述多个处理溶液中温育5天。通过在以一探针进行干扰后检查每一线虫的运动，在一解剖显微镜下检查所述多个线虫的活力。
[0097] D)虫卵孵化实验
[0098] 所述生物测定法旨在测试多个胜肽与查尔酮的所述混合物预防虫卵孵化的能力(未孵化的虫卵％)。每一测试均在一96孔盘中进行，每一孔10个虫卵。在每一处理中，所述多个虫卵被温育16天，通过显微镜图像确定多个已孵化的虫卵与多个未孵化的虫卵。
[0099] 示例2：
[0100] 包含多个胜肽及多个查耳酮的杀线虫组合物的功效：
[0101] 如前所述，将多个相同数量的线虫在一96孔盘的各种处理溶液中温育5天，并且通过计算在第5天死亡或存活的多个线虫的数目来测试多个不同的杀线虫剂组合的效力。同样地，还计算了杀线虫剂组合物的不同组合对孵化多个线虫卵的影响。
[0102] 如图1至6所示，在水或1％DMSO中温育的J2期的幼虫线虫在第5天导致10至15％的多个线虫死亡，所述多个处理作为多个阴性对照组。然而，将多个幼虫线虫温育在由氯吡硫磷与吡虫啉(比例为1：1)组成的一化学混合物中在第5天导致约50％的死亡，所述多个处理作为一阳性对照。仅以10-4至10-5摩尔浓度之间的查耳酮17、查耳酮25或查耳酮30处理多个线虫导致幼虫线虫70至85％之间的死亡。
[0103] 同样地，如图7、图8及图9所示，在水中温育虫卵导致70％的虫卵被孵化，将以此作为一阴性对照。在第16天时，以浓度为10-4至10-5摩尔浓度的查耳酮17或查耳酮25的多个线虫卵进行处理，仅导致约50％的虫卵被孵化。
[0104] 如图1及图2所示，将多个幼虫线虫温育在浓度为0.8毫克/毫升的单独的胜肽2中，在第5天导致大约60至80％的死亡。然而，胜肽2与查尔酮17、查尔酮25或查尔酮30的所述组合在第5天导致多个幼年线虫的接近100％死亡，所述胜肽的所述浓度为0.8毫克/毫升，而所述查耳酮类化合物的所述浓度为低至10-4至10-5摩尔浓度。此外，如图2所示，胜肽2(0.8毫克/毫升)与查尔酮17及查尔酮30以1：1的比例的所述组合在10-4至10-5摩尔浓度的一浓度下非常有效。
[0105] 同样地，图3及图4示出了与胜肽3与查耳酮类化合物的组合相比，单独的胜肽3在杀死多个幼虫线虫方面不太有效。对于胜肽3，与查尔酮25或查尔酮30的组合比与查尔酮17的组合更有效。此外，如图4所示，胜肽3(0.8毫克/毫升)与查尔酮17及查尔酮30的组合以1：-4 -5
1的比例在10 至10 摩尔浓度的一浓度下非常有效。
1的比例在10 至10 摩尔浓度的一浓度下非常有效。
[0106] 图5及6示出了单独的胜肽12在0.8毫克/毫升的一浓度下在杀死多个幼虫线虫方面非常有效，然而，所述胜肽与至少一查耳酮的组合显着地增强了所述杀线虫剂组合物的效力。
[0107] 如图7所示，在第16天中，以浓度为0.8毫克/毫升的胜肽2处理多个线虫卵时导致约30％孵化的虫卵，而胜肽2(0.8毫克/毫升)与查尔酮(10-4至10-5摩尔浓度)在第16天时导致10至25％孵化的虫卵。
[0108] 如图8所示，在第16天时，以浓度为0.8毫克/毫升的胜肽3处理多个线虫卵时导致约10％的孵化的虫卵，而胜肽3(0.8毫克/毫升)与查尔酮(10-4至10-5摩尔浓度)在第16天时导致10至20％的孵化的虫卵。
[0109] 如图9所示，到第16天，用浓度为0.8毫克/毫升的胜肽12处理线虫卵时导致约20％的孵化的虫卵，而胜肽12(0.8毫克/毫升)与查尔酮(10-4至10-5摩尔浓度)在第16天时导致10至15％的孵化的虫卵。
[0110] 所述多个结果进一步表明，源自于CED-4蛋白的多个胜肽、胜肽2或胜肽3或胜肽12及查耳酮类化合物具有多个有效的杀线虫活性，并且具有杀死所述多个线虫，并破坏所述多个线虫的虫卵的能力。
[0111] 然而，所述多个胜肽与查耳酮类化合物(特别是查尔酮30)的组合在杀死多个线虫上显示出的严重的协同作用。
[0112] 所述多个结果表明，浓度为0.8毫克/毫升的多个杀线虫胜肽、胜肽2或胜肽3或胜肽12与查尔酮类化合物、查尔酮17、查尔酮25或查尔酮30的组合在低至10-4至10-5摩尔浓度的一浓度下在杀死多个线虫上具有一协同作用，并且作为多个杀线虫组合物非常有效。
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