用于生产重组多克隆蛋白质的方法
阅读：858发布：2020-06-12
专利汇可以提供用于生产重组多克隆蛋白质的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及生产重组多克隆 蛋白质 组合物，特别是重组多克隆 抗体 组合物的方法。所述方法包括：获取用不同核酸序列的文库 转染 的细胞的集合，其中集合中每个细胞都由所述文库中的一个成员转染并且能够表达该成员，所述成员编码不同的结合特定 抗原 的多克隆蛋白质成员并且在所述集合的个 体细胞 基因组内位于相同的单一位点，其中所述核酸序列不是天然地与集合中所述细胞相联系。对所述细胞在适合于表达所述多克隆蛋白质的条件下进行培养，所述多克隆蛋白质从所述细胞或培养上清液中获得。所述核酸序列通过使用用于位点特异性整合的载体文库转染而导入细胞内。本发明方法适合用于生产重组多克隆抗体，因此可以得到优于 血浆 来源 治疗 性免疫球蛋白产物的替代品。，下面是用于生产重组多克隆蛋白质的方法专利的具体信息内容。
1.产生细胞集合的方法，所述细胞集合适合作为重组多克隆生 产型细胞系，所述方法包括：
a)提供了载体文库，所述载体文库包含不同核酸序列的群 体，其中各所述载体包括：1)单拷贝的独特核酸序列，所述核酸序列 编码多克隆蛋白质的独特成员，所述多克隆蛋白质包含与特定抗原结 合的不同成员；和2)一个或多个重组酶识别序列；
b)将所述载体文库导入宿主细胞系，其中所述宿主细胞系 的各单个细胞的基因组包含重组酶识别序列，所述重组酶识别序列位 于其基因组的单个特异性位点，并与载体上的重组酶识别序列匹配。
c)确保在所述细胞中存在一个或更多的重组酶，以使步骤 (a)中的不同核酸序列位点特异性地整合到宿主细胞系的细胞中，其 中所述一个或更多的重组酶是i)由导入了所述核酸序列的所述细胞 表达的；ii)由步骤a中的载体有效地编码；iii)通过第二载体表达而 提供；或iv)作为蛋白质提供给所述细胞；和
d)选择细胞，所述细胞含有来自所述不同核酸序列的文库 的整合的拷贝。
2.权利要求1的方法，其中所述多克隆蛋白质与所述细胞集合 不是天然相关的。
3.权利要求1或2的方法，其中所述多克隆蛋白质是多克隆抗 体或抗体片段。
4.权利要求1或2的方法，其中所述多克隆蛋白质是多克隆T 细胞受体或T细胞受体片段。
5.上述权利要求中任一项的方法，其中通过用所述载体文库整 体转染所述宿主细胞集合而将所述载体文库导入到所述宿主细胞系。
6.权利要求1到4中任一项的方法，其中通过使用包含5到50 个所述载体文库的单个载体的部分来半整体转染所述宿主细胞的等份 物，从而将所述载体文库导入到所述宿主细胞系中，并且在步骤(d) 选择之前或之后将所述细胞合并起来形成适合作为重组多克隆生产型 细胞系的细胞集合。
7.权利要求1到4中任一项的方法，其中通过如下方法将用于 位点特异性整合的所述载体文库导入所述宿主细胞系中：分别使用所 述载体文库的单个成员转染所述宿主细胞，并且在步骤(d)选择之前 或之后将所述细胞合并起来形成适合作为重组多克隆生产型细胞系的 细胞集合。
8.上述权利要求中的任一项的方法，其中借助筛选方法分离或 鉴定步骤(a)中的不同核酸的群体，所述筛选方法能鉴定和/或分离 编码与所述特定抗原结合的核酸。
9.权利要求8的方法，其中所述筛选方法包括生物筛选步骤和 /或免疫检测分析。
10.权利要求8或9的方法，其中所述筛选方法选自噬菌体展示、 核糖体展示、DNA展示、RNA-肽展示、共价展示、细菌表面展示、酵 母表面展示、真核病毒展示、ELISA和ELISPOT。
11.上述权利要求中任一项的方法，其中所述不同核酸序列的文 库包含至少3个不同的核酸序列。
12.上述权利要求中任一项的方法，其中所述不同核酸序列的文 库的单个成员整合到所述细胞集合中细胞个体的单个预先确定的基因 组座位上，所述座位能够介导所述重组多克隆蛋白质各成员的高水平 表达。
13.上述权利要求中任一项的方法，其中各不同的核酸序列包含 成对的基因片段，所述成对的基因片段编码由2个不同多肽链构成的 多克隆蛋白质的成员。
14.权利要求13的方法，其中所述成对的基因片段包含抗体重 链可变区编码序列和抗体轻链可变区编码序列。
15.权利要求13的方法，其中所述成对的基因片段包含T细胞 受体α链可变区编码序列和T细胞受体β链可变区编码序列。
16.权利要求13的方法，其中所述成对的基因片段包含T细胞 受体γ链可变区编码序列和T细胞受体δ链可变区编码序列。
17.上述权利要求中任一项的方法，其中所述不同核酸序列的文 库包含位于不同核酸序列内的天然发生的多样性。
18.权利要求17的方法，其中天然发生的多样性位于所述不同 核酸序列中的CDR区域。
19.上述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞集合来源于哺 乳动物细胞系或细胞类型。
20.权利要求19的方法，其中所述哺乳动物细胞系选自中国仓 鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞、YB2/0、NIH3T3、骨髓瘤 细胞、成纤维细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、PER.C6细胞和其衍生 的细胞系。
21.用于生产多克隆蛋白质的方法，其中所述多克隆蛋白质包含 与特定抗原结合的不同成员，所述方法包括：
a)提供含有不同核酸序列的文库的细胞集合，其中每个所 述核酸序列编码所述多克隆蛋白质的不同成员，并且其中每个所述核 酸序列整合到所述细胞集合中各细胞个体基因组上的相同的单一位点 上。
b)在有利于所述多克隆蛋白质表达的条件下培养所述细胞 集合；和
c)从细胞培养物中的细胞或细胞培养物中的上清液回收所 述表达的多克隆蛋白质。
22.权利要求21的方法，其中步骤(a)中的所述细胞集合是根 据权利要求1-20中任一项的方法产生的。
23.权利要求21或22的方法，其中所述多克隆蛋白质与所述细 胞集合不是天然相关的。
24.权利要求21到23中任一项的方法，其中在较早的步骤中分 离或鉴定步骤(a)中的所述不同核酸的文库，所述分离或鉴定借助于 能够鉴定和/或分离能编码与特定抗原结合的蛋白的核酸的筛选方法。
25.权利要求24的方法，其中所述筛选方法包括生物筛选步骤 和/或免疫检测分析。
26.权利要求24或25的方法，其中所述筛选方法选自噬菌体展 示、核糖体展示、DNA展示、RNA-肽展示、共价展示、细菌表面展示、 酵母表面展示、真核病毒展示、ELISA和ELISPOT。
27.权利要求21到26中任一项的方法，其中所述多克隆蛋白质 是多克隆抗体或抗体片段。
28.权利要求21到26中任一项的方法，其中所述多克隆蛋白质 是多克隆T细胞受体或T细胞受体片段。
29.权利要求21到28中任一项的方法，其中监控所述不同核酸 序列的相对表达水平。
30.权利要求29的方法，其中在mRNA水平和/或蛋白质水平上 监控所述表达水平。
31.权利要求29或30的方法，其中最迟在所述相对表达水平超 出预先确定的范围时结束步骤(b)中的培养。
32.重组多克隆生产型细胞系，所述细胞系包含用不同核酸序列 的文库转染的细胞集合，其中所述集合里的每个细胞用所述文库中的 一个成员转染并能表达该成员，所述成员编码能与特定抗原结合的多 克隆蛋白质的不同成员，并且位于所述集合中细胞个体基因组的相同 单一位点上，其中所述核酸序列与所述集合中所述细胞不是天然相关 的。
33.权利要求32的重组多克隆生产型细胞系，其中所述不同核 酸序列的文库编码多克隆抗体或抗体片段，其中所述多克隆抗体或抗 体片段在其成员个体之间具有天然发生的多样性。
34.权利要求32的重组多克隆生产型细胞系，其中所述不同核 酸序列的文库编码多克隆T细胞受体或T细胞受体片段，所述多克隆 T细胞受体或T细胞受体片段在其成员个体之间具有天然发生的多样 性。
35.权利要求32到34中任一项的重组多克隆生产型细胞系，其 中所述细胞集合来源于哺乳动物细胞系或细胞类型。
36.权利要求35的重组多克隆生产型细胞系，其中所述哺乳动 物细胞系选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞、YB2/0、 NIH3T3、骨髓瘤细胞、成纤维细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、PER.C6 细胞和其衍生的细胞系。
37.用于位点特异性整合的载体文库，所述载体文库包含天然发 生的不同核酸序列的群体，其中每个所述载体包括1)一个拷贝的编 码与特定抗原结合的多克隆蛋白质的不同成员的独特核酸序列和2) 一个或多个重组酶识别序列。
38.权利要求37的文库，其中所述天然发生的不同核酸序列的 群体编码多克隆抗体或抗体片段。
39.权利要求37的文库，其中所述天然发生的不同核酸序列的 群体编码多克隆T细胞受体或T细胞受体片段。
40.权利要求37到39中任一项的文库，其中所述载体文库中的 各成员进一步含有重组酶编码核酸序列。
41.通过权利要求27的方法获得的重组多克隆抗体或抗体片段。
42.通过权利要求28的方法获得的重组多克隆T细胞受体或其 多克隆片段。
43.用于治疗、改善或预防动物中的疾病的方法，其中施用有效 剂量的权利要求41的重组多克隆抗体或抗体片段。
44.用于治疗、改善或预防动物中疾病的方法，其中施用有效剂 量的权利要求42的重组多克隆T细胞受体或T细胞受体片段。
45.重组多克隆抗体或重组多克隆T细胞受体或者抗体或T细胞 受体的片段在制备治疗疾病的组合物中的应用，所述疾病选自癌症、 感染、炎性疾病、过敏、哮喘或其它呼吸疾病、自体免疫疾病、免疫 障碍、心血管疾病、中枢神经系统疾病、代谢疾病、内分泌疾病、移 植排斥和不期望的怀孕。
46.一种药物组合物，其含有由权利要求27的方法获得的重组 多克隆抗体或抗体片段作为活性成分，以及药物上可接受的赋形剂。
47.一种药物组合物，其含有由权利要求28的方法获得的重组 多克隆T细胞受体或T细胞受体片段作为活性成分，以及药物上可接 受的赋形剂。
发明领域
本发明形成了用于生产重组多克隆蛋白质的技术平台的基础，所 述重组多克隆蛋白质可用作治疗、改善或防止各种感染、炎性疾病、 移植排斥、癌症和过敏反应的新型治疗剂，所述多克隆蛋白质有例如 来源于免疫球蛋白超家族的蛋白，例如B或T细胞受体的可溶性和膜 结合形式蛋白。
发明背景
一些感染性疾病和癌症缺乏有效的治疗手段。单克隆抗体通常不 能成功对抗这些靶标，部分原因是所述复杂靶标的可变性和靶标蛋白 的适应性突变导致免疫逃脱单克隆抗体的识别。另一方面多克隆抗体 能靶向多数动态靶标，例如对病毒或癌细胞。此外，如果抗原突变， 多克隆抗体具有保持活性的最大概率。
不同商业购得的多克隆抗体治疗剂包括有：1)从正常人供体的血 液中分离的正常人免疫球蛋白；2)来自单个的人供体的血液中人超免 疫免疫球蛋白，所述供体携带有抗特定病毒靶标例如病毒的抗体，所 述疾病靶标是其以前通过感染或接种疫苗碰到的；和3)来自免疫动 物的动物超免疫免疫球蛋白。
从人血中纯化的免疫球蛋白已证明能有效地对抗肝炎B病毒、呼 吸道合胞病毒、细胞巨化病毒和其它疱疹病毒、狂犬病毒、肉毒杆菌 毒素等感染以及在新生恒河猴D预防中是有效的。将用人T细胞免疫 的兔子的血液中纯化的免疫球蛋白来提供治疗或防止移植排斥(例如， Thymoglobulin)的T细胞免疫抑制。已经使用正常人免疫球蛋白来提 高免疫缺陷病人的免疫系统以及治疗各种自身免疫性疾病。
然而，广泛的免疫球蛋白的应用由于供体血液原料的有限供应、 批与批之间不同的问题和易变的安全性而受到限制。特别是动物来源 的免疫球蛋白面临着与在1980年代和1990年代对动物来源的单克隆 抗体观察到的相同的免疫原性问题。
最后，对于其它血液制品，传播传染性因子例如HIV、疱疹或肝 炎病毒或朊病毒的风险仍然存在。因此，尽管临床医生承认多克隆抗 体在某些情况下是优选的治疗剂，其使用仍非常有限。
通过转基因动物技术产生了生产人免疫球蛋白的新方法。携带人 免疫球蛋白座位的转基因小鼠已被建立(U.S.Patent No. 6,111,166)。这些小鼠产生完全的人免疫球蛋白并且通过常用的免疫 学技术可以生产抗特定靶标的抗体。然而，由于小鼠相对小的个体限 制了更大的抗体产量。更大动物例如母牛、绵羊、野兔和鸡(kuroiwa， Y.等人，Nature Biotechnology；2002；20：889-893)曾被用来进 行人免疫球蛋白基因的转基因。然而，从这些动物的血液中生产用于 治疗的多克隆抗体不是一件简单的事。首先，动物和人类的免疫生理 学可能表现出有相当的不同，导致产生的免疫库(repertoire)、功 能重排和抗体反应多样性的不同。第二，所述导入的免疫球蛋白座位 的有丝分裂不稳定性可能影响抗体的长期生产。第三，删除动物自己 的免疫球蛋白座位以使例如所述动物抗体的产量不会超过人类抗体的 产量在技术上也是具有挑战性的。第四，传播感染性因子例如病毒、 朊病毒或其它致病因子的风险伴随着对产生于动物体内的人类抗体的 施用。
由此就产生了对用于生产重组多克隆蛋白质例如抗体的生产技术 的需要，所述生产技术能产生足够大量和具有最小批与批之间差异同 以便临床安全使用的重组多克隆蛋白质。已经发展了用于通过真核(特 别是哺乳动物)表达细胞系生产同源重组蛋白的有效方法以生产各种 蛋白，包括单克隆抗体、白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、凝血 因子VII、VIII和IX。许多这些技术是基于：将所述目的基因转化并 随机整合到表达细胞系的基因组中，接着选择、扩增和鉴定高产者表 达克隆，然后将这个克隆作为主要表达细胞系进行扩增繁殖。
插入的外来基因的表达可能会受来自其周围基因组DNA的“位置 效应”的影响。在很多情况下，所述基因插入到位置效应强到足以抑 制所导入基因的产物合成的位点。此外，由于周围宿主染色体DNA施 加的沉默机制(即甲基化)原因经常导致表达不稳定。
已经发展了允许在哺乳动物细胞内特定的基因组位置整合和表达 目的基因的系统以表达同源重组蛋白组合物(U.S.Patent Nos. 4,959,317和5,654,182；WO98/41645；WO01/07572)。WO98/41645 描述了用以产生能分泌例如抗体的哺乳动物细胞系的位点特异性整 合。然而，这个表达是单克隆的并且没有表明转染可以用载体文库来 进行。也没有任何关于怎样保持通过文库中特定的VH-VL组合产生的原 始多样性的提示。
不同商业购得的多克隆抗体治疗剂包括有：1)从正常人供体的血 液中分离的正常人免疫球蛋白；2)来自单个的人供体的血液中人超免 疫免疫球蛋白，所述供体携带有抗特定病毒靶标例如病毒的抗体，所 述疾病靶标是其以前通过感染或接种疫苗碰到的；和3)来自免疫动 物的动物超免疫免疫球蛋白。
从人血中纯化的免疫球蛋白已证明能有效地对抗肝炎B病毒、呼 吸道合胞病毒、细胞巨化病毒和其它疱疹病毒、狂犬病毒、肉毒杆菌 毒素等感染以及在新生恒河猴D预防中是有效的。将用人T细胞免疫 的兔子的血液中纯化的免疫球蛋白来提供治疗或防止移植排斥(例如， Thymoglobulin)的T细胞免疫抑制。已经使用正常人免疫球蛋白来提 高免疫缺陷病人的免疫系统以及治疗各种自身免疫性疾病。
然而，广泛的免疫球蛋白的应用由于供体血液原料的有限供应、 批与批之间不同的问题和易变的安全性而受到限制。特别是动物来源 的免疫球蛋白面临着与在1980年代和1990年代对动物来源的单克隆 抗体观察到的相同的免疫原性问题。
最后，对于其它血液制品，传播传染性因子例如HIV、疱疹或肝 炎病毒或朊病毒的风险仍然存在。因此，尽管临床医生承认多克隆抗 体在某些情况下是优选的治疗剂，其使用仍非常有限。
通过转基因动物技术产生了生产人免疫球蛋白的新方法。携带人 免疫球蛋白座位的转基因小鼠已被建立(U.S.Patent No. 6,111,166)。这些小鼠产生完全的人免疫球蛋白并且通过常用的免疫 学技术可以生产抗特定靶标的抗体。然而，由于小鼠相对小的个体限 制了更大的抗体产量。更大动物例如母牛、绵羊、野兔和鸡(kuroiwa， Y.等人，Nature Biotechnology；2002；20：889-893)曾被用来进 行人免疫球蛋白基因的转基因。然而，从这些动物的血液中生产用于 治疗的多克隆抗体不是一件简单的事。首先，动物和人类的免疫生理 学可能表现出有相当的不同，导致产生的免疫库(repertoire)、功 能重排和抗体反应多样性的不同。第二，所述导入的免疫球蛋白座位 的有丝分裂不稳定性可能影响抗体的长期生产。第三，删除动物自己 的免疫球蛋白座位以使例如所述动物抗体的产量不会超过人类抗体的 产量在技术上也是具有挑战性的。第四，传播感染性因子例如病毒、 朊病毒或其它致病因子的风险伴随着对产生于动物体内的人类抗体的 施用。
由此就产生了对用于生产重组多克隆蛋白质例如抗体的生产技术 的需要，所述生产技术能产生足够大量和具有最小批与批之间差异同 以便临床安全使用的重组多克隆蛋白质。已经发展了用于通过真核(特 别是哺乳动物)表达细胞系生产同源重组蛋白的有效方法以生产各种 蛋白，包括单克隆抗体、白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、凝血 因子VII、VIII和IX。许多这些技术是基于：将所述目的基因转化并 随机整合到表达细胞系的基因组中，接着选择、扩增和鉴定高产者表 达克隆，然后将这个克隆作为主要表达细胞系进行扩增繁殖。
插入的外来基因的表达可能会受来自其周围基因组DNA的“位置 效应”的影响。在很多情况下，所述基因插入到位置效应强到足以抑 制所导入基因的产物合成的位点。此外，由于周围宿主染色体DNA施 加的沉默机制(即甲基化)原因经常导致表达不稳定。
已经发展了允许在哺乳动物细胞内特定的基因组位置整合和表达 目的基因的系统以表达同源重组蛋白组合物(U.S.Patent Nos. 4,959,317和5,654,182；WO98/41645；WO01/07572)。WO98/41645 描述了用以产生能分泌例如抗体的哺乳动物细胞系的位点特异性整 合。然而，这个表达是单克隆的并且没有表明转染可以用载体文库来 进行。也没有任何关于怎样保持通过文库中特定的VH-VL组合产生的原 始多样性的提示。
发明内容
本发明提供了用于产生用于表达和生产重组多克隆蛋白质的生产 细胞系的解决方法，避免了在组成所述多克隆蛋白质的单个成员间的 明显差异。
进一步，本发明在所述多克隆蛋白质的生产中没有使用动物，因 此避开了与这种方法相关的伦理和临床上的难题。
发明简述
本发明提供了用于生产重组多克隆生产型细胞系的方法，所述重 组多克隆生产型细胞系用于生产重组多克隆蛋白质，所述蛋白质通常 选自免疫球蛋白超家族。多克隆抗体、多克隆T细胞受体或其多克隆 片段的生产是特别感兴趣的。本发明允许用于药物组合物的重组多克 隆蛋白质的商业生产。本发明的一个重要特征是：在生产过程中组成 多克隆蛋白质的个体分子的差异表达保持在不显著的水平，最小化了 不合需要的批与批之间的变化。
本发明的一个方面涉及生产目的重组多克隆蛋白质的方法，其中 所述多克隆蛋白质包括不同的结合特定抗原的成员或由其构成，所述 方法包括：a)提供了包含不同核酸序列文库的细胞集合，其中各所述 核酸序列编码所述多克隆蛋白质的不同成员并且各所述核酸序列整合 在所述细胞集合的各单一细胞的基因组的同一个单一位点上；b)在有 利于所述多克隆蛋白质表达的条件下培养所述细胞集合；和c)从所述 细胞培养物、细胞级分或细胞培养基中回收所述表达的多克隆蛋白质。
本发明的更进一步方面涉及产生适合作为重组多克隆生产型细胞 系的细胞集合的方法，所述方法包括：a)提供包含不同核酸序列群体 的载体文库，其中各所述载体包含1)一个单拷贝的编码多克隆蛋白 质不同成员的不同核酸序列，所述多克隆蛋白质包括结合特定抗原的 不同成员或由其组成和2)一个或多个重组酶识别序列；b)向宿主细 胞系引入所述载体文库，其中所述宿主细胞系的各细胞的基因组包含 重组酶识别序列，所述识别序列在其基因组的单一特定位点上并与载 体的重组酶识别序列匹配；c)确保所述细胞中一个或多个重组酶的存 在，从而使得步骤(a)中的不同核酸序列能在宿主细胞系的细胞中进 行位点特异性整合，其中所述一个或多个重组酶可以是I)导入所述 核酸序列的细胞表达的；II)由步骤a的载体有效编码的；III)通过 来自第二载体的表达提供的；或IV)作为蛋白质向所述细胞提供的； 和d)筛选包含来自所述不同核酸序列文库的经整合的拷贝的细胞。
在本发明的两个方法中，都应该理解所述多克隆蛋白质通常情况 下是那种与在其中实现表达的细胞天然不相关的蛋白质。
本发明描述几种将不同核酸序列文库导入宿主细胞系以产生适合 作为多克隆生产型细胞系的细胞集合的方法。这些方法包括使用文库 进行的细胞集合的整体转染、使用部分文库的等份细胞的半整体转染 或个体转染，在所述个体转染中使用文库的个体成员转染宿主细胞， 接着汇集通过选择得到的克隆。优选地本发明利用哺乳动物细胞(细 胞系或细胞类型)作为宿主细胞系。
在本发明的一个方面中，多克隆蛋白质的个体成员由成对的独立 基因片段编码。当所述个体成员由两条多肽链组成时，多克隆蛋白质 包括可溶性的或膜结合形式的抗体和T细胞受体。在本发明进一步的 实施方案中，一对基因片段编码抗体的重链和轻链可变区，或T细胞 受体的α链和β链可变区或T细胞受体的γ链和δ链可变区。
本发明进一步提供重组多克隆生产型细胞系，所述细胞系包含用 不同核酸序列文库转染的细胞集合，其中集合中的各细胞用所述文库 中的一个成员转染并且能表达该成员，所述成员编码结合特定抗原的 多克隆蛋白质的不同成员并且位于所述集合中个体细胞基因组的相同 单一位点上，其中所述核酸序列与集合中的所述细胞之间没有天然的 联系。优选地细胞系来自哺乳动物细胞系例如中国仓鼠卵巢(CHO)细 胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤细胞(例如，Sp2/0细胞，NS0)、 YB2/0、NIH3T3、成纤维细胞或永生化的人类细胞例如Hela细胞、 HEK293细胞或PER.C6细胞。不过也可以使用非哺乳动物真核或原核 细胞，例如植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、细菌、真菌等。
本发明也包括用于位点特异性整合的载体文库，所述文库包括天 然产生的各种核酸序列的群体，其中各所述载体包含1)一个拷贝的 编码结合特定抗原的多克隆蛋白质的不同成员的不同核酸序列和2) 一个或多个重组酶识别序列。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包括作为活性成分 的重组多克隆抗体(或其片段)或多克隆T细胞受体(或其片段)， 优选地通过本发明方法获得。所述组合物的重组多克隆蛋白质对预先 确定的疾病靶标具有特异性或反应性。这种药物组合物可用于在哺乳 动物例如人、家养动物或宠物中治疗、改善或预防疾病，例如癌症、 感染、炎性疾病、过敏反应、哮喘和其它呼吸疾病、自身免疫疾病、 免疫机能障碍、心血管疾病、中枢神经系统疾病、代谢和内分泌疾病、 移植排斥或不期望的怀孕。
定义
“蛋白质”或“多肽”是指任何氨基酸链，不管长度或翻译后修 饰。蛋白质可以单体或多聚体形式存在，多聚体包括两个或更多个组 装的多肽链、蛋白质片段、多肽、寡肽或肽。
如此处所使用的，术语“多克隆蛋白质”或“多克隆性 (polyclonality)”是指包含不同但是同源的蛋白质分子的蛋白质 组合物，优选地选自免疫球蛋白超家族。于是各蛋白质分子与所述组 合物中其它的分子同源，但也含有一个或多个可变多肽序列片段，其 特征在于多克隆蛋白质单一成员之间序列的差异。已知的这类多克隆 蛋白质例子包括抗体或免疫球蛋白分子、T细胞受体和B细胞受体。 多克隆蛋白质可能由确定的蛋白质分子亚类构成，所述蛋白质分子亚 类通过共同特征例如对想要的目的靶标的共同结合活性进行定义，例 如在针对想要的目的抗原的多克隆抗体的情况下。
术语“目的多克隆蛋白”包括确定的享有共同特征的多克隆蛋白 质亚类，例如对想要的靶标的结合能力，例如根据对目的抗原的结合 活性或特异性描述的多克隆抗体的情况下，所述抗原是一个或多个例 如分开的蛋白质、微生物、寄生虫、细胞类型、变应原或糖分子或可 能成为特定抗体的结合靶标的任何其它结构、分子或物质，或所述抗 原的混合物。
术语“重组多克隆蛋白质组合物的一个成员”或“重组多克隆蛋 白质的一个成员”是指蛋白质组合物中的一个蛋白质分子，所述蛋白 质组合物包含不同的但同源的蛋白质分子，其中各蛋白质分子与组合 物中的其它分子同源但也含有一个或多个可变多肽序列片段，所述可 变多肽序列片段以所述多克隆蛋白质的单一成员之间的氨基酸序列差 异为特征。
术语“可变多肽序列”和“可变区”可相互替换使用。
术语“重组多克隆蛋白质的不同成员”是指蛋白质组合物中的一 个蛋白质分子，所述蛋白质组合物包括不同的但同源的蛋白质分子， 其中各蛋白质分子与组合物中的其它分子同源，但也含有一个或多个 可变多肽序列片段，所述可变多肽序列片段以所述多克隆蛋白质的单 一成员之间的氨基酸序列差异为特征。
术语“抗体”描述血清的功能性组分并且通常指分子(抗体或免 疫球蛋白)集合或单个分子(抗体分子或免疫球蛋白分子)。抗体分 子能够结合到或与特定抗原决定簇(抗原或抗原表位)反应，这反过 来可以导致免疫效应物机能的诱导。单个抗体分子通常被认为是单特 异性的，而抗体分子组合物可以是单克隆的(即，由相同的抗体分子 构成)或多克隆的(即由不同的抗体分子构成，所述抗体与同一抗原 或甚至不同的抗原上存在的相同或不同的表位起反应)。各抗体分子 具有使其特异性结合到其相应的抗原的独特结构，并且所有天然抗体 分子具有相同的总体基本结构，即由两条一致的轻链和二条一致的重 链组成。抗体也总称为免疫球蛋白。此处所使用的术语抗体也包括嵌 合型的和单链抗体，以及抗体的结合片段(如Fab、Fv片段或scFV 片段)，以及多聚体形式例如二聚IgA分子或五价的IgM。
术语“多克隆抗体”描述了不同抗体分子的组合物，所述不同抗 体分子能与几种在相同或不同抗原上的不同特异性抗原决定簇结合或 反应。通常地，多克隆抗体的可变性被认为位于所谓的多克隆抗体可 变区。然而，在本发明上下文中，要理解多克隆性也描述单一抗体分 子之间存在于所谓恒定区上的差异，例如在包含二个或多个抗体同种 型例如人类同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，或鼠IgG1、 IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA的抗体混合物的情况下。
“重组目的多克隆抗体”描述确定的重组多克隆抗体亚类，所述 亚类是以其与想要的靶标或想要的一组靶标结合的能力为特征的，所 述靶标可以是例如分离的蛋白质、微生物、寄生虫、细胞、变应原或 糖分子，或能成为特异性抗体的结合靶标的其它结构、分子或物质， 或其混合物。
术语“免疫球蛋白”通常用作在血液或血清中发现的抗体混合物 的集体名称，但也可用用来称呼来自其它来源的抗体混合物。
术语“免疫球蛋白分子”表示单一抗体分子，例如作为免疫球蛋 白的一部分或任何多克隆或单克隆抗体组合物的一部分。
当提到多克隆蛋白质的成员与抗原结合时，此处是指具有结合常 数低于1mM的结合，优选地低于100nM，甚至更优选地低于10nM。
术语“不同目的核酸分子文库”用来描述共同编码“重组目的多 克隆蛋白质”的核酸分子集合。当用于转染时，不同目的核酸分子文 库包含于表达载体文库中。这类文库通常具有至少3、5、10、20、50、 1000、104、105或106个不同成员。
如此处所使用的术语“不同目的核酸序列的一个拷贝”并不能从 字面上理解为对应于单一基因片段的单一核酸片段，而是指产生一个 目的蛋白分子的所有亚基所需要的所有基因片段的一个拷贝，并且组 装成一个核酸分子例如载体。一些要求超过一个基因片段来产生目的 蛋白质的完整分子的例子包括B细胞受体、抗体和抗体的片段例如 Fab’s和可变结构域，或T细胞受体。当被导入细胞时，所述一起编 码完整组装的目的蛋白质的基因片段存在于同一个载体上，于是被连 接成一个核酸序列，可能成为在不同启动子控制下的分隔的转录元件。
此处所使用的术语“目的基因”，是指由一个或多个编码目的蛋 白质的一个成员的基因片段(基因组的或cDNA)组成的核酸序列。所 述复数形式的“目的基因”是指编码目的多克隆蛋白质的核酸序列文 库。术语“GOI”用作目的基因的缩写。
如此处所使用的术语“载体”是指核酸分子，所述核酸分子被其 它核酸分子插入以用于在不同遗传环境中进行转运和/或在宿主细胞 中表达。能在基因组中预先确定的、特定位置整合到宿主基因组中的 载体此处称为“位点特异性整合载体”。如果所述载体携带用于调控 插入载体的核酸序列转录的调控元件(至少合适的启动子)，所述载 体此处称为“表达载体”。如果表达载体能够在预先确定的特定座位 上整合到宿主细胞的基因组中，所述表达载体可称为“位点特异性整 合表达载体”。如果插入到上述鉴定的载体中的核酸序列编码此处定 义的目的蛋白质，可用下列的术语“目的载体”、“用于位点特异性 整合的目的载体”、“目的表达载体”和“用于位点特异性整合的目 的表达载体”。术语“同种型编码载体”是指携带编码同种型抗体的 核酸序列的载体。本说明书中，“噬菌粒载体”和“噬菌体载体”可 交换使用。术语“质粒”和“载体”可交换使用。本发明也包括这类 其它形式的载体，所述其它形式的载体具有同等功能，例如能够指导 想要的蛋白在合适的宿主中生产的质粒、噬菌粒和病毒基因组或任何 核酸分子。
术语“目的载体文库的各成员”用于描述具有不同核酸序列 的来自目的载体文库的单一载体分子，其中所述核酸序列编码目的重 组多克隆蛋白质的一个成员。
术语“整体转移”用于描述来自一个载体群体的目的核酸序列向 另一个载体群体的转移并且这样做可同时对各DNA进行转移而无需对 单一目的DNA进行分离。这样的载体群体可以是包含例如目的可变区、 启动子、前导序列或增强元件的文库。接着将这些序列无需预先分离 即可从噬菌体载体上转移到哺乳动物表达载体上。特别地对于抗体序 列来说，这种技术确保了VH和VL多样性之间的连接在将文库从例如选 择载体(例如噬菌体展示载体)转移到哺乳动物表达载体时不丢失。 因此初始的VH和VL配对被保留下来。
术语“转染”在此处用作将外源DNA导入细胞的广义术语。所述 术语也包括其它将外源DNA导入细胞的功能等同的方法，例如转化、 感染、转导或供体细胞和受体细胞的融合。
术语“选择”用来描述方法，所述方法中细胞获得某种特征，该 特征能使其从那些没有获得该特征的细胞分离出来。这类特征可以是 对细胞毒性因子的抗性或产生基本营养物、酶或颜色。
术语“可选择标记基因”、“选择标记基因”、“选择基因”和 “标记基因”用于描述与目的基因一起共导入细胞的编码可选择标记 的基因(例如赋予对某些细胞毒性药物例如某些抗生素以抗性的基因、 能产生在生长培养基上可以耗尽的基本营养物的基因、编码产生可分 析的代谢物的酶的基因或编码有色蛋白质例如可根据FACS分类的蛋 白质的基因)。
术语“重组蛋白质”用来描述用包含所述蛋白的编码序列的表达 载体转染的细胞系表达的蛋白质。
如此处所使用的，术语“有效地连接”是指将片段与另一个片段 连接，同时它们之间保持功能性关系。例如，如果编码信号序列的DNA 表达为参与多肽到内质网的转移的前导肽，则可认为其有效地连接到 编码该多肽的DNA上。此外，如果启动子或增强子刺激编码序列的转 录，则可认为其有效地连接到该编码序列上。
术语“大部分细胞个体”是指所述细胞的百分比，例如超过80％， 优选地超过85％，更优选地超过90％、95％，或甚至99％或更高。
如此处所使用的，术语“基因组”不是按字面上仅理解为存在于 细胞内的正常完备的染色体，还指能被导入并在细胞中维持的染色体 外组分。这类染色体外组分可包括但不限于微型染色体、YACs(酵母 人工染色体)、MACs(小鼠人工染色体)或HACs(人类人工染色体)。
术语“启动子”是指涉及与RNA聚合酶结合以启动转录的DNA区 域。
术语“头对头启动子(head-to-head promoter)”是指被置于非 常近距离的启动子对，以使由所述启动子驱动的两个基因片段转录以 相反的方向发生。头对头启动子也可以用两个启动子之间不相关核酸 的填充物来构建。这种填充物可以容易地含有超过500个核苷酸。
“抗生素抗性基因”是指编码克服抗生素对细胞的抑制或毒性影 响的蛋白的基因，从而在有抗生素存在的情况下确保细胞存活和继续 增殖。
术语“内部核糖体进入位点”或“IRES”描述不同于正常的mRNA 的5’帽子结构的结构。两个结构都可以被核糖体识别以开始扫描寻 找AUG密码子以起始翻译。通过使用一个启动子序列和二个起始AUG， 从单一mRNA可以翻译出第一和第二多肽序列。因此为了从单个双顺反 子mRNA共翻译第一和第二多核苷酸序列，所述第一和第二多核酸序列 可通过连接子序列进行转录融合，所述连接子序列包括能翻译IRES 序列下游多核苷酸序列的IRES序列。在这种情况下，转录出的双顺反 子RNA分子在其戴帽5’端和该双顺反子RNA分子的内部IRES序列都 可进行翻译，由此产生第一和第二多肽。
术语“可诱导表达”用来描述这样的表达，该表达的发生需要诱 导物分子与调控蛋白质的相互作用，或共阻遏分子从调控蛋白质上的 释放。
术语“组成型表达”是指通常不是可诱导的表达。
术语“重组酶”是指催化两个或多个重组位点之间重组的酶。可 在发明中使用的重组酶在特定重组位点催化重组，所述重组位点是由 特定重组酶识别的特定核酸序列。
术语“混杂(scrambling)”描述从单一细胞中表达二个或多个 多克隆蛋白质的不同成员的情形，所述多克隆蛋白质包含二个不同多 肽链，例如来自所述免疫球蛋白超家族。当所述单一细胞已在其基因 组上整合了超过一对基因片段时会产生这种情形，其中每对基因片段 编码所述多克隆蛋白质的不同成员。在这种情况下可产生从所述基因 片段表达的多肽链的非预期组合。这些多肽链的非预期组合可能没有 任何治疗效果。
术语“HH-VL链混杂”是上面定义的混杂的例子。在该例子中，VH 和VL编码基因片段构成了一对基因片段。当非预期的VH和VL多肽组合 从细胞中产生时，就出现了混杂，其中在所述细胞中，两个不同的VH 和VL编码基因片段对被整合入同一细胞中。此类混杂的抗体分子不太 可能保持原来的特异性，因此可能不具有任何治疗效果。
术语“重组多克隆生产型细胞系”是指用不同目的核酸序列的文 库转染的蛋白质表达细胞群体，其中一起组成重组多克隆生产型细胞 系的所述单一细胞只携带一个拷贝的不同的目的核酸序列，所述目的 核酸序列编码所述目的重组多克隆蛋白质的一个成员并且各拷贝整合 到各细胞基因组的相同位点。根据它们保留整合的不同目的核酸序列 拷贝的能力(例如通过抗生素选择)来选择组成重组多克隆生产型细 胞系的所述细胞。能组成这种生产型细胞系的细胞可以是例如细菌、 真菌、真核细胞(例如酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞，特别是永生 化的哺乳动物细胞例如CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤细胞(例 如Sp2/0细胞，NS0)、NIH 3T3、YB2/0和永生化的人类细胞例如HeLa 细胞、NEK293细胞或PER.C6。
术语“热点细胞系”中的“热点(hot spot)”是指所述细胞的基 因组中预先确立的座位，所述座位是被选择出来或产生的并且具有在 将表达载体整合到该座位上后高效转录整合的目的核酸序列的特征。
术语“差异(bias)”用于表示重组多克隆蛋白质生产中的现象， 其中所述多克隆载体、多克隆细胞系或多克隆蛋白质的组成由于随机 遗传突变、单一细胞之间增殖动力学的不同、不同表达构建体序列之 间表达水平的不同或DNA克隆效率的不同导致在一段时间内发生改 变。
术语“RLFP”是指“限制性片段长度多态性”，为一种方法，其 中用限制性酶切割后对凝胶上核酸片段迁移图谱进行分析。
术语“HDS”是指高密度筛选方法，在所述方法中将许多离散的分 子平行在膜上进行测试，这样就可以同时对大量的测试化合物进行筛 选找出具有给定活性的化合物。
如此处所使用的，“TaqMan PCR”是指Holland，P.M.等人，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：7276-7280(1991)中描述的基于TaqMan 体系的PCR检测。
术语“5’UTR”是指mRNA的5’非翻译区域。
术语“Pfu PCR”是指使用Pfu DNA聚合酶(从火球菌(Pyrococcus furiosus)中分离的)进行的PCR反应，使用所述Pfu DNA聚合酶是 因为它在已知的热稳定性聚合酶中具有最高保真度。
缩写词：“CMV”＝(人)细胞巨化病毒(Cytomegalo Virus)。“MSPSV” ＝骨髓增殖肉瘤病毒(Myeloproliferative sarcoma virus)。“AdMLP” ＝腺病毒主要晚期启动子。SV40 poly A＝猿病毒40聚腺苷酸化信号序 列。GFP＝绿色荧光蛋白。PVDF＝聚偏1，1-二氟乙烯。TcR＝T淋巴细胞受 体。ELISA＝酶联免疫吸附检测。LTR＝长末端重复。
附图描述
图1：“头对头启动子”表达载体的示意说明，所述表达载体包 含下列元件：Amp pro＝允许表达氨苄青霉素抗性基因的启动子。Amp＝ 氨苄青霉素抗性基因。pUC origin＝pUC复制起始位点。限制性酶切位 点：NotI和EcoRI。Promoter A/Promoter B＝包含前导序列(例 如CMV/MPSV)的头对头启动子盒。V Heavy＝编码GOI重链可变区的 序列。C Heavy Chain＝编码重链(例如小鼠IgG1或IgG2B重链恒定区 序列)恒定区的序列。R-B-globin pA＝兔β-球蛋白多聚A序列。 bGH polyA＝牛生长激素多聚A序列。V Kappa＝编码GOI可变kappa 的序列。C Kappa chain＝编码kappa链恒定区的序列。FRT site＝FRT 重组位点。Hygromycin＝编码潮霉素抗性的基因。SV40 poly A＝聚腺苷 酸化信号序列。
图2：单向表达的表达载体示意说明，所述表达载体包括下列组 成元件：Amp pro＝允许表达氨苄青霉素抗性基因的启动子。Amp＝氨 苄青霉素抗性基因。pUC ori＝pUC复制起始位点。Promoter A ＝包含 前导序列(例如AdMLP)的哺乳动物启动子。V Heavy＝编码GOI重链 可变区的序列。C Heavy Chain＝编码重链(例如小鼠IgG1重链恒定区 序列)恒定区的序列。hGH polyA＝人生长激素多聚A序列。bGH polyA＝ 牛生长激素多聚A序列。V Kappa＝编码GOI可变kappa轻链的序列。C Kappa＝编码kappa链恒定区的序列。FRT＝FRT重组位点。Hygromycin＝ 编码潮霉素抗性的基因。SV40 poly A＝聚腺苷酸化信号序列。hGH多 聚A和启动子A的序列可以被IRES结构取代。
图3：概述重组多克隆生产型细胞系产生和重组多克隆蛋白质产 生的流程图。1)说明整体转染策略；2)说明半整体转染策略和3) 说明个体转染策略。A)图解载体文库(水平线)，箭头表示载体分组。 在策略1中所述载体分入一大组，在策略2中它们被分入到较小组中 (半整体)，而在策略3中它们保持相互离散的状态(个体)。B)图 解转染，其中试管的数目取决于组成文库的载体的分组。C)图解选择 细胞，所述细胞已位点特异性地将GOI整合到所述宿主细胞基因组中， D)图解多克隆GOI文库母液的产生，将选择出来的组成所述整合文库 的细胞冰冻贮存。可任选地存储单一克隆或将克隆合并。E)图解生产 阶段的开始，此处将来自母液中的克隆融化(可以是单一的、来自转 较小分组或来自合并组)并且使之适应在悬浮液中生长。在筛选阶段 或本阶段，可使其适应在无血清培养基上生长。F)图解生产阶段，在 所述生产阶段所述多克隆细胞系被繁殖以接种入更大的生物反应器 (尽管没有说明，但也可以进行中间的接种步骤)。在策略2和3中， 该阶段为：所述多克隆细胞克隆母液不再保持为单一克隆或半整体分 组，而是合并成细胞集合，形成重组多克隆生产型细胞系。G)图解从 生物反应器生产获得的最终产品。在生产阶段之后，收获所述多克隆 蛋白质组合物以纯化产物和描述产物特征。
图4：说明哺乳动物表达载体产生的流程图。
(A)噬菌体载体pSymvc10的示意说明，所述载体携带编码GOI 成员的序列。P tac和P lacZ＝细菌头对头启动子盒。V Kappa＝编码 GOI可变kappa轻链的序列。C Kappa chain＝编码小鼠恒定kappa轻 链的序列。V Heavy＝编码GOI可变重链的序列。C Heavy Chain＝编 码恒定重链CH1结构域的序列。限制性酶切位点：EcoRI、NotI、SacI 和XhoI。cpIII＝噬菌体蛋白III。Amp pro＝允许表达氨苄青霉素抗 性基因的启动子。Amp＝氨苄青霉素抗性基因。pUC Ori＝pUC复制起始 位点。
步骤1：通过用SacI和XhoI进行限制性消化，所述细菌启动子 从pSymvc 10切下来并通过连接用哺乳动物启动子盒取代(B)取代， 所述哺乳动物启动子盒也是通过用SacI和XhoI进行限制性消化制备 而来。
(C)噬菌体载体pSymvc 12的示意说明，在用哺乳动物头对头启 动子盒交换后所述载体携带来自GOI的序列。Promoter A/Promoter B＝ 所选头对头启动子盒(例如CMV/MPSV)。V Kappa＝编码GOI可变kappa 轻链的序列。C Kappa chain＝编码小鼠恒定kappa轻链的序列。V Heavy＝ 编码GOI可变重链的序列。C Heavy Chain＝编码恒定重链CH1结构域 的序列。限制性酶切位点：NotI、SacI、XhoI和EcoRI。cpIII＝噬 菌体蛋白III。Amp pro＝允许表达氨苄青霉素抗性基因的启动子。Amp＝ 氨苄青霉素抗性基因。pUC Ori＝pUC复制起始位点。
步骤2：通过用EcoRI和NotI限制性消化pSymvc12，可从pSymvc12 上切下包含完整kappa、启动子盒和V重链的核酸片段并连接到同种 型编码载体例如pSymvc20，所述pSymvc20也是通过使用EcoRI和NotI 限制性消化制备，因此产生所述哺乳动物表达载体pSymvc21(E)。
(E)用于抗体表达的哺乳动物表达载体pSymvc21的示意说明， 所述载体具有来自GOI的可变重链和kappa区域。这个哺乳动物表达 载体包含下列组成元件：Amp pro＝允许表达氨苄青霉素抗性基因的启 动子。Amp＝氨苄青霉素抗性基因。pUC ori＝pUC复制起始位点。限 制性酶切位点：EcoRI和NotI。Promoter A/Promoter B＝所选头对 头启动子盒(例如CMV/MPSV)。V Kappa＝编码GOI的可变kappa轻链 的V Kappa序列。C Kappa chain＝编码哺乳动物恒定kappa轻链(例 如小鼠恒定kappa链)的序列。V Heavy＝编码GOI可变重链的V重 链序列。C Heavy Chain＝编码哺乳动物恒定重链(例如小鼠IgG1或 IgG2B恒定重链的序列)的序列。R-B-globin pA＝兔β-球蛋白多 聚A序列。bGH polyA＝牛生长激素多聚A序列。FRT site＝FRT重组 位点。Hygromycin＝编码潮霉素抗性的基因。SV40 poly A＝聚腺苷酸化 信号序列。
本质上，步骤1和2的顺序可以倒转，这样通过利用EcoRI和NotI 进行限制性消化将来自pSymvc10的片段从pSymvc10中切下，接着可 将其连接到同种型编码载体上例如pSymvc20，所述来自pSymvc10的 片段包含整个kappa、细菌启动子盒和V重链。接着通过利用SacI和 XhoI限制性消化pSymvc20并与SacI+XhoI消化的哺乳动物启动子盒 片段进行连接(类似于图4B)以对pSymvc20进行启动子交换。
图5：显示用质粒制备物1转化的TG1细胞中的基因型分布的柱 状图。Em 223-228分别表示具有编码抗β2-微球蛋白(抗-B2M)、抗 -碱性磷酸(抗-AP)、抗卵清蛋白(抗-OVA)、抗-因子VIII(抗-FVIII)、 抗-溶菌酶(抗-LYS)、抗-触珠蛋白(抗-HAP)的启动子的载体。 Em223-228是pSymvc10型的载体。由RFLP确定的片段图谱推出的个 体基因型的数目对应于拣出的菌落的总数中的个体菌落的数目。
图6：显示用质粒制备物2转化的TG1细胞基因型分布的柱状图。 Em 229-234分别表示具有编码抗β2-微球蛋白(抗-B2M)、抗-碱性 磷酸(抗-AP)、抗卵清蛋白(抗-OVA)、抗-因子VIII(抗-FVIII)、 抗-溶菌酶(抗-LYS)、抗-触珠蛋白(抗-HAP)的哺乳动物启动子 (CMV/MPSV)的载体。Em229-234是pSymvc12型的载体。克隆的数目 表示经观察具有与由该Em型(完整的序列分析未进行)的RFLP确定 的序列图谱相似的克隆的数目。
图7：显示用质粒制备物3转化的TG1细胞基因型分布的柱状图。 Em 235-240分别表示编码抗β2-微球蛋白(抗-B2M)、抗-碱性磷酸 (抗-AP)、抗卵清蛋白(抗-OVA)、抗-因子VIII(抗-FVIII)、抗 -溶菌酶(抗-LYS)、抗-触珠蛋白(抗-HAP)的小鼠IgG1哺乳动物表 达载体(包括兔β球蛋白聚腺苷酸化信号)。Em235-240是pSymvc21 型的载体。克隆的数目表示经观察具有与由该Em型(完整的序列分析 未进行)的RFLP确定的序列图谱相似的克隆的数目。
图8：显示TG1细胞基因型分布的柱状图，所述细胞用双酶消化/ 连接质粒制备物进行转化(在质粒制备物1步骤之后整体转移到哺乳 动物表达载体中而不需在大肠杆菌中进行DNA扩增)。
图9：显示用编码六个目的基因的哺乳动物表达载体的混合物转 化(A)16天和(B)34天后的CHO-Flp-In细胞的基因型分布的柱状 图。
图10：来自转染后34天的CHO-Flp-In细胞的上清液的抗原特异 性ELISA，所述细胞用编码六个目的基因的表达载体混合物进行整体 转染。
图11：来自转染后34天的CHO-Flp-In细胞合并物的上清液的抗 kappa涂布ELISA，所述细胞用编码一个目的基因的单一表达载体或编 码六个目的基因的表达载体混合物进行转染。
图12：来自转染后17、31、45、59和73天的CHO-Flp-In克隆 019的上清液的定量抗原特异性ELISA，所述细胞用编码六个目的基因 的表达载体混合物进行整体转染。A、B和C表示三个不同的转染实验。
图13：来自混合后8、17、30、45、57、72和85天后的CHO-Flp-In 细胞培养物的上清液的抗原特异性ELISA，所述混合是表达mini six library的单一成员的CHO-Flp-In细胞系的混合。结果显示为三个独 立实验的平均值±SD。
发明详述
重组多克隆蛋白质表达体系
本发明提供了用于稳定生产重组多克隆蛋白质的方法，所述重组 多克隆蛋白质优选地选自免疫球蛋白超家族，具有免疫球蛋白类似结 构域的蛋白质家族。大多数所述成员涉及细胞表面识别作用。序列同 源性表明抗体、T细胞受体、MHC分子、某些细胞粘连分子和细胞因子 受体具有相近的的同源性。特别地，根据本发明含有可变区的这个家 族成员适合于产生重组多克隆蛋白质。这类成员包括抗体、膜结合抗 体(B细胞受体)、Fab片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、T细 胞受体(TcRs)、可溶性TcRs、TcR可变结构域片段、通过多肽连接 子连接的TcR可变结构域片段或其它抗体或TcR衍生片段。特别地， 可以预期本发明可能用于大规模生产和制造包括重组治疗性多克隆抗 体或TcRs的新一类治疗剂。
本发明生产方法的一个主要有利方面是组成所述重组多克隆蛋白 质的所有成员可以在1个至约10个生物反应器或其等同物中生产。进 一步，所述重组多克隆蛋白质组合物能以单一制备物从所述反应器中 纯化而不需在所述过程中将组成所述重组多克隆蛋白质的单一成员分 离出来。相反，如果有人希望通过混合纯化的单克隆抗体(例如在 WO91/16074中提出的)以模拟重组多克隆抗体混合物，将需要把待包 括在组合物中的各抗体分别在生物反应器中生产，并且很有可能也要 将所述抗体单独纯化。与此处描述的生产重组多克隆抗体或其它多克 隆蛋白质的方法相比，这样的单克隆抗体混合物生产将是非常费钱费 时费空间的。于是，如WO91/16074中所描述的方法导致对包括在混合 物中的单克隆抗体的数目的实际限制，很可能低于10，而此处描述的 技术通常可以生产具有所想要的许多单一成员的多克隆抗体。
为了获得来自重组多克隆生产型细胞系的重组多克隆蛋白质的可 预期表达，应该对基因组整合位点的调控特性进行相当详尽地了解。
使用随机整合的传统的转染和重组蛋白表达技术对生产重组多克 隆蛋白质是不理想的，因为这个方法的随机性本质将导致所述整合的 核酸序列的位置和数目在不同细胞间发生变化。于是，如果通过这种 传统方法生产重组多克隆蛋白质，可能导致具有对多克隆蛋白质单一 成员的不同表达速率的异质细胞培养物和由于所述整合的DNA的位置 效应造成的遗传不稳定性。这将很可能导致组成所述多克隆蛋白质的 成员的差异表达。
因此需要将其引入预定的基因组位点，这原则上可以通过同源重 组来实现。然而，由于非常规重组事件占据主导地位，因此，同源重 组的效率是非常低的。
此外，当所述多克隆蛋白质是抗体或T细胞受体(TcR)时，使用 传统的导致随机整合的转染方法产生另一个问题。抗体和TcRs由成对 的独立基因片段编码，即抗体由轻链和重链编码序列编码，而TcRs 由α和β链或δ和γ链编码序列编码。来自这些基因片段的多肽产物 在抗体分子或TcR的细胞内加工过程中共价连接起来。导致随机整合 的传统转染技术导致将数个拷贝的不同重链和轻链或α和β链导入同 一个细胞，这导致重链和轻链的随机组合，即所谓的VH-VL链混杂或α -β链混杂。结果，这损害了所述表达的抗体或TcRs的性能，造成亲 亲和力和/或特异性的丢失、可能的新特异性和/或减小的特异性活性 的发生。
为了克服这些问题，本发明的表达体系使用位点特异性整合到单 一宿主细胞的基因组中。本发明的体系确保包含所述不同目的核酸片 段的目的载体文库通过重组酶介导的盒式交换方法插入到预知特征的 染色体座位上，由此产生细胞系，其中单个细胞表达所述重组多克隆 目的蛋白的单个不同成员。如下面所描述的，在某些组成重组多克隆 生产型细胞系的细胞中可能发生多处整合。然而，只要大部分细胞个 体表达所述重组多克隆蛋白质的单个不同成员，这就不成其为一个问 题。
可使用重组酶例如Cre、Flp、β-重组酶、Gin、Pin、PinB、PinD、 R/RS、λ整合酶或噬菌体ФC31整合酶。用于整合到所述染色体座位 的合适整合酶可以通过以下方式提供：(i)表达自细胞自身的基因组， 所述基因组导入了所述核酸序列，(ii)由插入到细胞的核酸序列有 效地编码，(iii)表达自第二核酸分子或(iv)作为蛋白。在优选的 实施方案中，包含在所述目的载体中的不同核酸序列整合到介导目的 核酸序列高水平转录和表达的座位(所谓的“热点”)。
所使用的宿主细胞系优选地是包含这些通常用作生物药物蛋白质 表达的哺乳动物细胞系，例如CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤 细胞(例如Sp2/0细胞，NS0)、YB2/0、NIH 3T3和永生化的人类细 胞例如HeLa细胞、HEK293细胞或PER.C6。在本发明中使用了CHO细 胞。然而本领域普通技术人员能很容易地用所述其它哺乳动物细胞取 代CHO细胞，或甚至使用其它类型的细胞，包括植物细胞、酵母细胞、 昆虫细胞、真菌和细菌。于是细胞类型的选择不会限制本发明。在优 选的实施方案中，含有预知特征的热点、介导重组目的多克隆蛋白质 高水平表达的哺乳动物细胞被用于生产。
在本发明进一步实施方案中，利用宿主细胞中的同一个染色体整 合位点将不同目的核酸序列以位点特异性方式进行整合。这种单一特 异性位点的整合最大限度地减小了位置效应，而所述位置效应可以在 用随机整合或基因组上多个位点整合的情形下观察到。特别地，当表 达由超过一个多肽链组成的多克隆蛋白质时具有用于在基因组中进行 位点特异性整合的单个位点是更有用的。这是由于如果单一细胞表达 超过一个整合物就可能在其亚基中发生混杂。
在位点特异性整合体系中，所述单一宿主细胞表达大体相同的蛋 白质结构，但是在重组多克隆目的蛋白的可变区上存在不同，例如抗 体或TcRs的抗原结合区。因此，在这类细胞集合内的大部分细胞对于 生产率和遗传稳定性应该显示出类似的特征，并且因此这个技术提供 了控制重组多克隆蛋白质例如重组多克隆抗体或TcRs生产的可能性。
本发明的重组多克隆蛋白质意欲覆盖包含不同的、但同源的蛋白 质分子的蛋白质组合物，所述蛋白质分子是天然可变的，意思是，在 优选的实施方案中，不同核酸构成的文库包含天然发生的多样性。于 是，各蛋白分子与所述组合物中的其它分子同源，但也含有一个或多 个可变多肽序列片段，所述可变多肽序列片段的特征在于所述多克隆 蛋白质的单一成员间的氨基酸序列差异。组成所述可变多肽序列的氨 基酸序列上的差异可能小到一个氨基酸。优选地氨基酸序列上的差异 超过一个氨基酸。
通常地，多克隆抗体或TcR的天然可变性被认为位于所述多肽链 的所谓的可变区或V区。
在本发明的一个方面，多克隆蛋白质的单一成员包含接近80到 120个氨基酸长度的可变区。所述可变区可能含有超可变结构域，例 如互补决定区(CDR)。
在天然发生的TcRs中，在各可变区存在4种CDRs。在天然发生 的抗体重链上存在3种CDRs，在轻链上存在3种CDRs。
在本发明的另外方面，所述多克隆蛋白质的单一成员的可变区含 有至少一个超可变结构域，所述超可变结构域长度在1和26个氨基酸 之间，优选在4个和16个氨基酸之间。这个超可变结构域可对应于 CDR3区域。对于抗体，各可变区优选地组成3个超可变结构域。这些 可对应于CDR1、CDR2和CDR3。对于TcRs，各可变区优选地组成4个 超可变结构域。这些可对应于CDR1、CDR2、CDR3和CDR4。超可变结 构域可能独自构成在本发明的重组多克隆蛋白质的可变区内的可变序 列。
在本发明的上下文中，应该理解多肽序列的可变性(多克隆性) 也可以描述位于所谓的恒定区或所述抗体多肽链的C区的单一抗体分 子之间的差异，例如在含有2个或多个不同抗体同种型的抗体混合物 的情况下(例如人同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2， 或鼠同种型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA)。于是，重组多克隆 抗体可以包含以单一抗体之间在可变区(V区)或恒定区(C区)或这 两个区域的序列差异为特征的抗体分子。
为了提供编码与特定抗原结合的蛋白的不同核酸序列，可使用许 多本领域已知的方法。一般，本发明将受益于使用能鉴定和/或分离编 码与特定抗原结合的蛋白的核酸的筛选方法。几种这类方法包括所谓 的生物筛选步骤(biopanning step)，可获知于技术例如噬菌体展示 技术(Kang，A.S.等人，1991.Proc Natl Acad Sci USA 88，4363-4366)、 核糖体展示(Schaffitzel，C.等人，1999.J.Immunol.Methods 231，119-135)、DNA展示(Cull，M.G.等人，1992.Proc Natl Acad Sci USA 89，1865-1869)、RNA-肽展示(Roberts，R.W.，Szostak，J.W.，1997. Proc Natl Acad Sci USA 94，12297-12302)、共价展示(WO98/37186)、 细菌表面展示(Fuchs，P.等人，1991.Biotechnology 9，1369-1372)、 酵母表面展示(Boder，E.T.，Wittrup，K.D.，1997.Nat Biotechnol 15，553-537)和真核病毒展示(Grabherr，R.，Ernst，W.，2001.Comb. Chem.High Throughput.Screen.4，185-192)，本领域都公知的方 法并且所有方法都在实践本发明中具有帮助。FACS和通过使用标记抗 原的磁珠分选也可应用于富集(筛选)目的。免疫检测测试例如ELISA (Dreher，M.L.等人，1991.J.Immunol.Methods.139，197-205) 和ELISPOT(Czerkinsky，C.C.等人，1983，J.Immunol.Methods. 65，109-21)也可在生物筛选步骤之后使用或单独使用。
重组目的多克隆蛋白质组合物包括确定的蛋白质亚类，所述蛋白 质亚类通过共同特征来定义，例如对想要的靶标的共有结合活性，例 如在多克隆抗体对想要的目的抗原的情况下。一般地多克隆蛋白质组 合物具有至少3、4、5、10、20、50、100、1000、104、105、或106 个截然不同的成员。在多克隆蛋白质组合物中所需要的不同成员的数 目将取决于所述靶标的复杂性。在抗体的情况下，靶向抗原的复杂性 将影响所述多克隆抗体组合物中所必需的截然不同的成员的数目。对 于小的或不十分复杂的靶标例如小蛋白，包含3到100个不同成员的 多克隆抗体组合物就足够了，并且优选地不同成员的数目不超过90 个或甚至80或70个。在许多情况下，不同成员的数目不超过60或 50个，并且优选地不同成员的数目在5和40个之间，例如在5和30 个之间。而对于更复杂的靶标，例如具有复杂或可交换表面蛋白、或 包含数个病毒亚型的病毒，包含20到500个不同成员的多克隆抗体组 合物就足够了。对于非常复杂的靶标(其中抗原包含许多不同分子)， 可能要求包含50到10,000个不同成员的多克隆抗体组合物。
在哺乳动物中有数种天然发生的多克隆蛋白质的已知例子，所述 多克隆蛋白质有自由地在血液中循环的例如抗体或免疫球蛋白分子， 或存在于细胞表面的例如T细胞受体和B细胞受体。在某些哺乳动物 中，通过对编码这些蛋白质可变区的基因进行遗传重组可获得这些天 然发生的多克隆蛋白质的多样性。进一步知道抗体通过体细胞突变增 加其多样性。通过分离负责所述多样性(例如免疫球蛋白分子或TcRs 的可变结构域或CDR区)的序列和从其产生文库，本发明可利用这些 天然多样性。对由两个独立基因片段编码的蛋白质，例如抗体可变重 链和可变轻链，TcRα链和β链或TcRδ链和γ链，文库中的各载体 将组成这些可变区的编码序列对。可变区的编码序列对文库的产生在 本领域是熟知的。
包含天然发生的多样性的文库是例如组合文库(可变区的编码序 列随机配对)和关联配对文库(来自同一细胞的可变区的编码序列配 对)。从分离的CDR基因片段进一步产生的文库也可用于本发明，其 中所述片段整合到合适的架构区中(例如Soderlind，E.等人，2000. Nat.Blotechnol.18，852-856)例如抗体或TcR可变区。优选地筛 选所述文库以获得具有想要的特异性的亚文库(目的文库)。
蛋白质的多样性也可能通过人工方式获得，例如合成或通过突变。 突变可以是随机的或编码单一蛋白质的核酸序列的定点突变，由此产 生所述单一蛋白的多克隆群体。产生人工抗体文库的另一个例子描述 于EP 0 859 841，该方法基于产生能与另外的CDRs文库组合的可变 区架构文库的方法。
在本发明优选的实施方案中，所述重组多克隆蛋白质是重组多克 隆抗体或抗体片段。
在本发明另一个优选的实施方案中，所述重组多克隆蛋白质是重 组多克隆TcR或TcR片段。
除了通过在所谓的可变区内的遗传和体细胞重组获得的多样性 外，还有根据重链定义的不同同种型的免疫球蛋白。主要的同种型是 IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。
本发明的重组多克隆蛋白质因此也能由不同同种型或更优选的不 同亚类组成。免疫球蛋白的多克隆性可发生在所述免疫球蛋白分子的 恒定部分或可变结构域，或同时发生在恒定部分和可变结构域。
对于抗体的治疗性应用，所谓的恒定区(特别是抗体的重链)中 的多克隆性是令人感兴趣的。各种免疫球蛋白的同种型具有不同的生 物学功能(总结于表1)，当使用抗体用于治疗时所述各种免疫球蛋 白的同种型可能进行合适的组合，因为免疫球蛋白的不同同种型会涉 及到天然免疫应答(Canfield和Morrison 1991.J.Exp.Med.173， 1483-91；Kumpel等人，2002.Transfus.Clin.Biol.9，45.-53； Stirnadel等人，2000.Epidemiol.Infect.124，153-162)的不同 方面。
表1：人免疫球蛋白同种型的生物学功能 人免疫球蛋白 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA1 IgA2 IgM IgD IgE 经典补体活化 +++ ++ ++++ + - - ++++ - - 替代性补体活化 + + + +++ + - - + - 胎盘转移 + ++ + ++ - - - - - 细菌裂解 + + + + +++ +++ + ？ ？ 巨噬细胞/其它 吞噬细胞结合 + - + + + + - - - 肥大细胞/嗜碱 性粒细胞结合性 - - - - - - - - - 葡萄球菌蛋白质 A反应性 + + - + - - - - -
本发明的进一步实施方案是重组的多克隆生产型细胞系，所述细 胞系包含用不同核酸序列构成的文库转染的细胞集合，其中所述集合 中各细胞用所述文库中的一个成员转染并能表达该成员，该成员编码 与特定抗原结合的多克隆蛋白质的不同成员并且位于所述集合中细胞 个体基因组中的相同单一位点，其中所述核酸序列不是天然地与所述 集合中的细胞相关。
在上述实施方案的附加实施方案中，所述编码多克隆蛋白质(优 选地来自免疫球蛋白超家族)的不同核酸序列全都来自天然存在的序 列，例如从供体中分离。
WO 02/44361已描述了含有不同核酸的细胞组合物，所述核酸位 于各细胞内基因组的单一特异性位点。这篇文献公开了使用细胞鉴定 具有想要特性的分子的方法，但该文献没有涉及提供生产体系或提供 以特异性结合抗原为特征的多克隆蛋白质。
克隆多样性
多克隆蛋白质的特征之一是它由许多单一蛋白质分子组成，其中 各蛋白分子与所述多克隆蛋白质的其它分子同源但仍具有可变性，所 述可变性是以所述多克隆蛋白质的单一成员之间氨基酸序列的差异为 特征的。优选地，所述差异限于所述多克隆蛋白质总体结构的独特区 域。这类区域是例如抗体或TcR的可变区，并且可能进一步地限于这 些区域的CDR区。这种可变性也可以描述为多样性，可在核酸和蛋白 质功能两个水平上(例如对靶标的特异性和亲和力差异上)对所述多 样性进行鉴定。
通过对来自表达重组多克隆蛋白质的细胞集合的分离克隆使用 RFLP(或(RT)-PCR产物测序)可以对所述细胞系的克隆多样性进行 分析。也可通过对由所述细胞系产生的重组多克隆蛋白质进行功能检 测(例如ELISA)来分析所述多样性。
克隆差异性(即组成多克隆抗体的单一抗体含量的逐渐变化)， 如果存在，可通过比较用于转染的起始文库的克隆多样性与表达所述 多克隆蛋白质的细胞(细胞系)集合中发现的多样性而进行估计。
由细胞系表达的多克隆蛋白质的克隆多样性可估算为所述多克隆 蛋白质的靶标覆盖。在这种情况下，当接近25-100％的想要的目的分 子被所述的多克隆蛋白质结合，则可认为获得了足够的多样性。例如 在多克隆抗体的例子中，抗体与至少25％的目的抗原表面上的非一致 抗原表位结合，则在组合物中提供了足够的多样性。优选地，由靶标 覆盖确定的克隆多样性至少是50％，而且甚至更优选的是至少75％。对 于抗体，这种靶标覆盖能例如通过表位作图进行估计。
做为选择地，克隆多样性可估计为所述多克隆组合物的单一成员 的分布。这种分布可以被估计为：与转染期间最初导入到所述细胞系 的不同编码序列的数目相比，在所述最终多克隆蛋白质组合物中不同 的单一成员的总数。在这种情况下，当至少50％并且优选地至少75％ 的应用于转染的编码序列被鉴定为所述最终多克隆蛋白质的不同单一 成员时，可认为获得足够的多样性。
所述多克隆组合物的单一成员的分布也可以被估计为所述单一成 员间的相互分布。在这种情况下，如果没有所述组合物的单一成员组 成超过最终多克隆组合物中单一成员总数的75％，就认为获得了足够 的克隆多样性。优选地，没有单一成员超过50％、甚至更优选的25％ 和最优选的10％的最终多克隆组合物的单一成员总数。通过RFLP分析、 序列分析和蛋白分析(例如后面描述的用于确定多克隆组合物特征的 方法)进行基于多克隆组合物中单一成员分布的克隆多样性估计。
克隆差异可能导致克隆多样性的减少，所述克隆差异会产生于a) 克隆过程中，b)作为细胞增殖变化的结果，或c)通过多个整合子的混 杂。如果这种差异产生，通过对此处描述的方法进行较小的改变就可 轻易地挽回每个这种来源的克隆多样性丢失。
为了限制由于将可变结构域克隆到合适的载体上引起的差异，可 设计从一个载体到另一个载体的目的基因转移以限制克隆的差异。整 体转移技术和精心选择用于扩增的大肠杆菌可减少所述克隆差异。另 一个可能性是在本发明的载体间进行各多聚核苷酸的单一转移，所述 多聚核苷酸编码所述多克隆蛋白质的单一成员。
有可能在较长的一段时间内，细胞系内单一细胞的细胞增殖速率 的变化能将差异引入到所述重组多克隆蛋白质的表达中，增加或减少 由细胞系表达的重组蛋白质的某些成员的存在。这种增殖速率变化的 一个原因是构成用于初始转染的起始细胞系的细胞群体是异质性的。 已知细胞系中单一细胞经较长的时间后会差异生长。为了确保更同质 的起始材料，通过使用限制性稀释所述细胞系到单一细胞水平并将各 单一细胞培养成新的细胞群体(所谓的由限制性稀释进行的细胞亚克 隆)以在用目的文库转染前对细胞系进行亚克隆。然后基于其繁殖和 表达特性选出一个或多个这样的细胞体作为起始材料。
更进一步，用于确保只有那些接受位点特异性整合的细胞才能存 活的选择压力可能会影响多克隆细胞系内单一细胞的繁殖速率。这可 能是由于为了适应所述选择压力经受某种遗传改变的细胞的偏好导致 的。于是，选择标记的选择也会影响繁殖速率引起的差异。如果这种 情况发生，应该对不同的选择标记进行测试。在一些情况下，如果选 择是基于对细胞有毒害的物质，应当细致地测试最优浓度以及选择是 否在整个生产时期中都是必需的还是仅在开始阶段需要。
另一个确保良好限定的细胞群体的方法是在转染和选择过程后使 用荧光激活细胞分选(FACS)。荧光标记抗体能用来富集高产的细胞， 所述细胞来自用IgG构建体转染的细胞集合(Brezinsky等人，J.2003. Immunol Methods 277，141-155)。这个方法也可以用于分选表达相 似水平的免疫球蛋白的细胞，由此产生在生产率上均一的细胞群体。 同样，通过使用用荧光染料5，6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯 (CFSE)标记，通过FACS方法可选择出显示有相似繁殖速率的细胞。
甚至当繁殖速率引起的差异确定发生了，单一成员的损失或过度 呈现可能不一定是重要的，这取决于所述最终重组多克隆蛋白质产物 的多样性要求和一段时间内多样性的稳定性。
在位点特异性单一整合体中，所述细胞只在要表达的抗体的可变 区序列上有差异。因此，由整合位点和基因调节元件不同施以的不同 细胞影响被消除并且对细胞繁殖速率只有最小程度的影响。混杂和多 位点整合都不可能在所述生产型细胞系的繁殖速率上产生问题，因为 这些是稀有事件。随机整合通常以接近10-5的效率发生，而位点特异 性整合则以接近10-3的效率发生。如果多位点整合意外地产生了问题， 可选择的方法是重复用目的载体文库转染，因为所述事件再发生的可 能性非常小，如上面所描述的。另一个替换方法在下面的实施例3中 进行描述。
另一个控制不合需要的克隆差异的方法是将整个目的载体文库分 成几个亚群进行转染或在转染较早的时间点上将所述细胞群分成几个 亚群。在这点上，差异应当还不明显并且在统计学上应当有可能获得 缺少具有不合需要的繁殖优势的亚群。作为结果的不合需要的克隆的 排除必需满足最终重组多克隆蛋白质产物多样性的要求。从统计学上 考虑，大量细胞的整体转染也组成了克服不想要的克隆差异的方法。 在这个方法中，用不同核酸序列构成的文库整体转染宿主细胞系。这 样的文库构建了所述文库的各不同成员的众多拷贝。这些拷贝应该优 选地整合到大量的宿主细胞中。优选地用不同核酸序列构成的文库的 多拷贝不同成员对至少100、1000、10000或100000个单独的细胞进 行转染。于是，如果不同核酸序列构成的文库由1000个各自被整合到 1000个单独的细胞中的独特成员构成，那么从转染中应当产生106个 含有位点特异性整合的GOI的克隆。通过这种方法，单一细胞倍增速 率的高斯浅型将只以非常小的程度影响整个群体。这将增加随着时间 流逝保持克隆组合物恒定的概率，即使低百分比的所述生产型细胞展 现异常的生长和/或表达特性。
做为选择地，目的载体文库可以被分成含有大约5到50个所述文 库的单一载体的部分。优选地，所述文库的一部分构成10到15个单 一载体。接着将各部分转染到等份细胞中。接着让所述各等份细胞经 过一段时间以观察它们中任何一个是否发生克隆差异。如果发生，在 将剩下的等份细胞汇集起来重建细胞集合前将这种等份细胞除去。任 选地，在整个生产过程中所述等份细胞保持分离，并且所述多克隆抗 体组合物是通过组合每个等份物的产物形成的，而不是通过在生产前 将等份细胞组合起来。可以操作的汇集体的数目预期在5到10个之间 (参见之前对单克隆抗体的描述)。
做为选择，可以实施高通量方法，在所述高能量方法中用载体分 别转染细胞，细胞基于来自所述目的载体最初文库的单一克隆而选择。 这将在转染和整合期间消除任何可能的序列差异。任意地，可以确定 单一转染子的基因型并且如果合适可以刚好在生产前或更早时候组合 出充分多样性的细胞集合。作为选择，当在生产多克隆蛋白质前将单 独转染的细胞汇集时，大量细胞的单独转染(产生具有不同核酸序列 构成的文库的独特成员的许多克隆)会产生与整体转染相同的统计学 上的有利方面。
宿主细胞
合适的宿主细胞在其基因组区域包含一个或多个适合的重组位 点，即被一个或多个重组酶识别的核酸序列。为能选择整合子，(即 在整合位点上整合了目的核酸序列拷贝的细胞)，将重组位点有效地 连接到位于所述整合位点3’的第一个选择基因(例如抗生素抗性基 因)。此外，弱启动子(例如截短的SV40早期启动子)和转录起始密 码子可以位于组成抗性标记-编码区域的整合部位的重组位点的5’。 于是，在用编码所述多克隆蛋白质的表达载体的文库转染之前，所述 转录起始密码子在宿主细胞内启动所述选择基因的转录。
如上面描述的用于位点特异性整合的宿主细胞可从能将DNA整合 到其染色体或保留染色体外组分例如微型染色体、YACs(酵母人工染 色体)、MACs(小鼠人工染色体)或HAC(人类人工染色体)的任何 细胞中产生。在WO97/40183中详细描述了MACs和HACs，此处引用作 为参考。优选地使用哺乳动物细胞例如CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、 骨髓瘤细胞(例如Sp2/0或NS0细胞)、成纤维细胞例如NIH 3T3和 永生化的人类细胞例如HeLa细胞、HEK293细胞或PER.C6。然而也可 以使用非哺乳动物真核细胞或原核细胞，例如植物细胞、昆虫细胞、 酵母细胞、真菌、大肠杆菌等。
在本发明的一个实施方案中，通过进行所谓的限制性稀释将细胞 系稀释到单个细胞水平，接着在用目的表达载体文库转染前将单个细 胞培养成新的细胞群体，来对用作起始材料的细胞系进行亚克隆。如 果需要，这种亚克隆也可在以后选择适合的细胞系过程中进行。
通过用随机整合的质粒转染可获得用于位点特异性整合的宿主细 胞，所述质粒包含弱启动子(例如截短的SV40早期启动子)、转录起 始密码子、位于所述起始密码子3’的重组位点。优选地，所述整合 质粒也包含与第一个选择基因连接的标记基因。这种整合质粒的一个 例子是来自Invitrogen(Carlsbad，CA)的pFRT/LacZeo2。所述标记 基因可用来估计用于插入目的核酸的基因组位点的相对表达强度。可 将标记基因(例如β-半乳糖苷酶(LacZ)、绿色荧光蛋白(GFP)或 细胞表面标记)以融合基因的形式或通过IRES(内部核糖体进入位点) 转录性地连接到第一个选择基因上，以使第一个选择基因和标记基因 共表达。选择基因与标记的组合使用是确保在基因组内保持所述整合 质粒的高产型细胞的有效方法，所述选择基因对细胞建立起生存压力 (例如药物抗性或营养损耗)，所述标记允许估计从细胞系到细胞系 的相对表达水平。具有重组序列的细胞将导致所述标记基因例如GFP 或LacZ的高度表达，其中所述重组序列插入到具有显著转录活性的位 点上。通过荧光激活的细胞分选(FACS)选择高表达者并进行克隆。 这时也应该分析所述整合子是否是单一整合子。这可以通过实时PCR 和Southern印迹法进行分析。
另一个用于估计来自用整合质粒转染的细胞的相对表达水 平的方法是对如上面描述所产生的细胞进行额外的整合-切除步骤。再 用编码对应于所述整合质粒重组位点的重组酶的质粒和第二质粒转染 这一所选的细胞集合，所述第二质粒含有不具有起始密码子的第二选 择标记，在第二选择标记的编码区之前是同样对应于第一整合质粒的 重组序列。这个第二质粒也含有编码荧光标记蛋白质(例如哺乳动物 启动子驱动的GFP(或同等荧光蛋白))的序列。重组酶介导这种质 粒整合到宿主细胞基因组上，在此之前已通过整合质粒将类似的重组 序列插入到所述宿主细胞基因组中。具有插入在具有显著转录活性位 点上的重组序列的细胞将导致所述荧光蛋白的高度表达。通过荧光激 活细胞分选(FACS)选择高表达者并进行克隆。用重组酶转染并且通 过第一选择标记选择具有一致高表达和含有一个拷贝所述插入质粒的 克隆，鉴定其中第二质粒序列已经被重组酶除去的细胞，使所述第一 选择标记重新工作。这些细胞仍然含有插入到转录热点上的第一重组 序列并且现在能用于表达目的基因。
在单拷贝质粒整合后获得所述标记基因高度表达的细胞系用来进 行目的基因的转染。宿主细胞中的重组位点优选地位于具有显著表达 活性的基因或区域，即位于所谓的热点。
用于位点特异性整合的载体
合适的载体含有连接到合适的选择基因上的合适的重组位点，所 述选择基因不同于用于构建宿主细胞的选择基因。用于哺乳动物细胞 表达的合适选择基因包括但不局限于允许营养选择的基因，例如胸腺 嘧啶脱氧核苷激酶基因(TK)、谷氨酰胺合成酶基因(GS)、色氨酸 合酶基因(trpB)或组氨醇脱氢酶基因(hisD)。进一步，选择标记 是赋予药物抗性的抗新陈代谢物抗性基因，例如可用次黄嘌呤和胸腺 嘧啶脱氧核苷缺乏培养基选择并且进一步用甲氨蝶呤选择的二氢叶酸 还原酶基因(dhfr)、可用霉酚酸选择的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转 移酶基因、在真核细胞中用G418而在原核细胞中可用新霉素或卡那霉 素选择的新霉素磷酸转移酶基因(neo)、可用潮霉素选择的潮霉素B 磷酸转移酶(hyg、hph、hpt)基因、可用嘌呤霉素选择的嘌呤霉素 N-乙酰转移酶基因(pac)或可用杀稻瘟菌素选择的杀稻瘟菌素S脱 氨酶基因(Bsd)。最后，编码能由例如流式细胞仪分选的蛋白的基因 也可以用作选择标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)、神经生长因子受体 (NGFR)或其它膜蛋白或β-半乳糖苷酶(LacZ)。
本发明的一个方面，所述选择基因之前即没有启动子也没配有翻 译起始密码子。在所选的位点特异性重组位点提供启动子和ATG密码 子。如果这个载体整合的位置不是宿主基因组中选择的重组位点，那 么由于缺少启动子和起始密码子使得这第二个选择基因不能表达。如 果整合发生在宿主细胞基因组中选择的重组位点，第二选择基因表达 而第一选择基因不表达。 例如通过使用基因组中和用于位点特异性整合的载体上的所谓 FRT 位 点 (5’-gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3’ (SEQ ID NO 1)和其变体)与来自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Flp重组酶或其突变体一起进行整合。然而，其它重 组酶体系也同样好使，包括那些Cre重组酶和各种lox位点，例如来 自噬菌体P1或其变体或突变体(例如lox66、lox71、lox76、lox75、 lox43、lox44和lox511(C.Gorman和C.Bullock，Curr.Opinion in Biotechnology 2000，11：455-460))的loxP或通过使用噬菌体整合 酶ФC31或λ整合酶，所述λ整合酶在attP和attB位点间进行重组 (A.C，Groth等人，PNAS 2000，97：5995-6000)。进一步可用于本 发明的重组酶体系是但不限于来自细菌质粒pSM19035的β-重组酶-6 体系、来自噬菌体Mu的Gln-gix体系或来自zygosaccharomyces rouxii的R-RS体系。
位点特异性重组的进一步改变是使用非同源性重组位点。在这种 体系中，将二个不一致的重组位点导入到宿主基因组中以产生特异性 目的位点。对应于目的位点两侧序列的重组位点也位于含有目的基因 的构建体两侧。在WO 99/25854中已经描述过这种体系，其全文在此 引用作为参考。非同源性重组位点的使用能抑制GOI从染色体中切除。 所述非一致重组位点可由任何上面描述的重组位点组成，只要提供对 应的重组酶。例如，非一致性重组位点可由利用Flp重组酶整合的FRT 位点和突变体FRT位点组成或利用Flp和Cre重组酶整合的FRT位点 和loxP位点组成。
进一步，在Verhoeyen等人的Hum.Gene Ther.2001 12，933-44 中已描述使用二种不同FRT位点的体系。在这个方法中，通过逆转录 病毒感染将所述整合质粒转入宿主细胞。所述质粒由报告基因和第一 选择标记基因以及感染所需要的逆转录病毒元件的组合构成。所述逆 转录病毒3’LTR含有2个不同的FRT位点。缺少启动子和翻译起始密 码子的无功能的第二选择标记基因位于这些位点的3’。在逆转录病 毒感染过程中3’LTR序列拷贝至5’LTR。这导致报告基因和第一选 择标记基因两侧各为一个不同的FRT位点。在外侧FRT位点之间的序 列可以与在强启动子控制下的GOI进行交换。含有GOI的盒的两侧被 同一套FRT位点侧接。所述反应由Flp重组酶催化。在转染的交换质 粒中IRES元件和翻译起始密码子进一步位于所述GOI的下游。在取代 所述整合盒后，由GOI构建盒提供的翻译起始密码子激活所述无功能 选择标记基因，所述基因位于处于所述FRT位点外侧的3’LTR序列。 如果负选择标记(例如胸腺嘧啶脱氧核苷激酶)存在于所述整合载 体上，交换状况会进一步强化。
也可通过标准转染将整合载体转入所述宿主细胞。在这种情况下 所述整合盒在其5’末端由FRT侧接而在其3’末端由不同的FRT’位 点侧接。缺少ATG的第二抗性标记基因位于3’FRT’位点的更下游。 如对逆转录病毒体系所描述的方法对GOI进行交换。
另一个阻止GOI在其位点特异性整合到染色体后被切除的体系是 所述ФC31整合酶，也在上面提到过。在专利申请WO01/07572和 WO02/08409中已经详尽地描述这个体系，其全文在此引用作为参考。
在本发明的进一步方面，用于目的基因位点特异性整合的载体进 一步包含编码重组目的多克隆蛋白质的一个成员的DNA，任选地在所 述DNA之前加上其自身的哺乳动物启动子指导所述蛋白质表达。如果 目的多克隆蛋白质的成员含有超过一个蛋白链，例如如果成员是抗体 或T细胞受体，在编码所述蛋白质链的DNA之前加上其自身的哺乳动 物启动子指导各链高水平表达(双向的或单向的，分别参见图1和2)。 在双向表达中可以在表达载体中使用头对头启动子构型，而对于单向 表达可使用两个启动子或一个结合例如IRES序列的启动子进行表达。 合适的头对头启动子构型例如为但不限于两个方向的AdMLP启动子与 小鼠金属硫蛋白-1启动子、两个方向的AdMLP启动子与延伸因子-1 启动子或两个方向的CMV启动子与MPSV启动子。
表达载体可以包含编码功能前导序列的核酸序列以指导所述基因 产物到内质网或细胞内特定位置例如细胞器。强多聚腺苷酸化信号可 位于编码蛋白质的DNA序列的3’。多聚腺苷酸化信号确保新生RNA 转录物的终止和多聚腺苷酸化并且与信使稳定性相关。例如，编码重 组多克隆目的蛋白的成员的DNA可同时编码抗体或抗体片段的重链和 轻链，各基因序列任选地在其前面加上其自身的哺乳动物启动子元件 和/或在其后接上强Poly A信号指导两条链中各链的高水平表达。
用于位点特异性整合的表达载体可携带用于增强整合位点表达的 另外的转录调控元件，例如增强子或UCOE(遍在染色质开放元件)。 增强子是特异性地与细胞内参与转录的蛋白质相互作用的核酸序列。 UCOE打开染色质或保持染色质开放状态从而促进有效连接的基因(WO 00/05393中有更详细描述，其全文此处引用作为参考)重复地表达。 当一个或更多的上面描述的调控元件整合到宿主细胞染色体时就称它 们为异源调控元件。
构建用于蛋白质高水平表达的表达体系
用于将核酸序列导入细胞的方法在本领域是熟知的。这些方法通 常包括使用DNA载体将目的序列导入细胞、基因组或染色体外元件。 通过本领域技术人员所熟知的许多方法可实现对细胞的转染，包括磷 酸钙沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体融合、RBC血影融合、原生质 体融合等。
为转染宿主细胞系，使用目的载体文库，其中各载体只包含一个 拷贝的编码重组目的多克隆蛋白质的一个成员的核酸序列。这个目的 表达载体文库共同编码所述重组目的多克隆蛋白质。在前面部分描述 了用于位点特异性整合的合适载体。构成不同目的核酸序列文库的单 一载体可以混合起来形成单一组合物，或者编码各文库成员的单一载 体也可保持为单独的组合物或形成由大约5到50个单一文库载体混合 物的组合物。
可通过几种不同的转染和生产策略获得重组多克隆生产型细胞系 和来自这种细胞系的重组多克隆蛋白质的生产。图3概述了这些策略。
一个方法是利用混合起来形成单一组合物的表达载体文库转染宿 主细胞系。这个方法称为整体转染。通常前面描述的载体和宿主细胞 设计将确保通过合适的选择可获得多克隆细胞系。在这种细胞系中大 部分细胞个体已将一个拷贝来自目的核酸序列文库的核酸分子整合到 基因组中，所述核酸分子编码重组多克隆蛋白质的不同成员。所述单 拷贝的核酸序列整合到细胞集合中各细胞基因组的单一特异性位点， 由此产生了由表达所述目的多克隆蛋白质单一成员的细胞个体构成的 多克隆细胞系。在开始重组多克隆蛋白质生产前制备所述多克隆细胞 系的冷冻贮存物。
另一个方法是利用分成小部分的载体文库进行转染，所述小部分 的载体文库在组合物中含有大约5到50个所述文库的单一载体。优选 地，所述小部分的文库由10到20个单一载体构成。然后将各组合物 转染到等份宿主细胞中。这个方法称为半整体转染。转染的等份细胞 的数量将取决于文库的大小和各小部分中单一载体的数目。例如如果 文库包含100个不同成员，所述文库分成在组合物中含有20个不同成 员的小部分，将需要对5个等份宿主细胞用构成原文库的不同部分的 文库组合物进行转染。选择所述等份宿主细胞以进行位点特异性整合。 优选地，不同等份是分开选择的。然而，它们也可以在选择前汇集。 可对所述等份的克隆多样性进行分析并且只有那些具有充分多样性的 才可用于生产多克隆GOI文库贮存物。为了获得想要的用于生产的多 克隆细胞系，可将所述等份在产生冷冻贮存物前在它们从贮存物中取 出之后或在短暂的增殖和适应时间之后进行混合。任选地，将所述等 份细胞在整个生产中保持分离，并且通过将各等份的产物(而不是生 产前等份细胞)混合以组成所述多克隆蛋白质组合物。
第三种方法是高通量方法，在所述方法中宿主细胞分别用构成目 的文库的单一载体进行转染。这个方法称为个体转染。所述个体转染 的宿主细胞优选地分别根据位点特异性整合而进行选择。然而，在选 择前也可将它们进行汇集。对根据选择产生的单一细胞克隆的繁殖时 间和整合方式进行分析，并且优选地，那些具有相似的生长速率和单 一位点特异性整合的细胞克隆被用来产生多克隆GOI文库贮存物。在 产生贮存物前、在刚从贮存物中取出之后或经过短暂繁殖和适应时间 之后可将所述单一细胞克隆混合起来以获得想要的多克隆细胞系。
这个方法可以在转染、整合和选择期间消除任何可能的残留序列 差异。或者，在进行选择前将所述单独转染的宿主细胞混合，这将确 保对由转染造成的序列差异的控制。
上面概述的生产策略的共同特性是可以在一个或有限数目(最大 大约10个)的生物反应器中生产所有构成重组多克隆蛋白质的单一成 员。仅有的不同是人们选择产生构成重组多克隆生产型细胞系的细胞 集合的阶段。
用于表达和生产重组目的多克隆蛋白质的宿主细胞系具有一个或 更多个被重组酶(例如，如US5,677,177中描述的具有位于基因组 中预先确定座位上的FRT位点的预先制备的细胞)识别的核酸分子。
用于位点特异性整合的载体优选地整合到预先确定的介导高水平 表达的基因组座位(所谓的热点)上。
如果需要增加表达水平，可利用对DHFR基因或谷氨酰胺合成酶 (GS)基因的选择进行基因扩增。这要求使用含有这种选择标记的载 体。
为了生产多克隆蛋白质(其中各蛋白质成员由超过二个多肽链构 成)，所述链的组合对其形成的蛋白质的亲和力、特异性和活性可能 有重要作用。这个可从例如抗体和TcRs中看出来。例如，已知抗体可 变重链和可变轻链的组合影响由所述链形成的抗体的亲和力和特异 性。于是，当选择能产生与某种目的物具有亲和力的抗体的抗体编码 序列文库时，需要确保对应这个的最终产物中可变重链和轻链的组合。 因此将构成多克隆蛋白质的单一成员的多肽链放入用于整合的相同载 体中，由此确保在整个过程中它们始终在一起。
下面的描述是怎样获得重组多克隆抗体表达细胞系的一个例子， 其中所述链的混杂如果存在的话是最小的。
构建具有两个置于相反转录方向的启动子的组成型表达的通用启 动子盒，例如由可变重链和整个kappa轻链包围的头对头结构，以允 许将整个构建体转入用于位点特异性整合的载体中，所述载体包含 FRT位点和潮霉素抗性基因和重链恒定区。可以预期也可以使用诱导 表达的启动子盒。此外，可以尾对尾地放置启动子以造成相反方向的 转录或以尾对头的单方向转录方式放置。本实验中使用能稳定表达 lacZ-Zeocin融合基因的CHO-Flp-In细胞(Invitrogen，Carlsbad， CA)，使得所述细胞抵抗抗生素Zeocin。所述细胞维持在含有Zeocin 的培养基上。所述细胞用编码多克隆抗体和不同选择标记(潮霉素磷 酸转移酶)的用于位点特异性整合的载体文库连同表达Flp重组酶的 质粒进行整体转染。可诱导的启动子也可用来控制表达。转染后，将 所述细胞在有潮霉素存在的情况下进行培养。对潮霉素有抗性的细胞 随后生长在不同的培养体系中，例如传统的小量培养细颈瓶、核酸多 层细胞工厂、小的高产量生物反应器(MiniPerm，INTEGRA-CELLine) 和旋转烧瓶到中空纤维生物反应器。用ELISA检测所述细胞的抗体产 量。将多克隆细胞系长期悬浮培养在无选择压力的无血清培养基上以 选择其生存能力。细胞系贮存物在有潮霉素存在的情况下进行培养。
估计表达体系中多克隆性的保持
根据本发明，通常确保在生产中表达体系的多克隆性不发生严重 改变是重要的，这样当多克隆性确实改变了时就可能要停止生产。根 据本发明通过监控各种核酸序列的相对表达水平来确保这一点。例如 所述表达水平可通过例如使用RLFP分析、阵列或实时PCR在mRNA水 平上或使用例如双相聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱或各种层析技术在蛋 白质水平上进行监控。通过这些技术就可能对许多所有个体表达水平 确立基本值，然后在生产期间从培养物中取样以测量表达水平是否已 经改变(在总体和相对两个方面)。在本发明的正常实践中，可确立 围绕基本值的数值范围，并且如果发现相对表达水平超出范围就终止 生产。
为了能估计表达体系的稳定性和生产力，制备编码具有抗鸡卵清 蛋白、牛碱性磷酸酶(AP)、人β2-微球蛋白(β2m)、人触珠蛋白 (HAP)、人因子VIII(FVIII)和鸡蛋白溶菌酶活性的六个不同Fab 片段的载体(mini six library)。所述不同Fab片段编码序列是不 一致的因此展现出不同的RFLP图谱，因此可用RFLP分析基因型组成。
通过用具有头对头启动子盒的表达载体转染将所述mini six library导入CHO-Flp-In细胞。既可以用编码六个不同抗体的目的表 达载体的混合物整体转染CHO-Flp-In细胞，以产生按已知组合表达所 述六个抗体的多克隆细胞系，也可以用目的表达文库的一个成员单一 地转染细胞，接着混合转染的细胞，产生按已知组合表达所述六个抗 体的重组多克隆抗体表达细胞系。通过这种方式就可能检测出哺乳动 物细胞是否发生转染，并且不会对一个或几个所述重组多克隆抗体表 达细胞系的克隆的产生差异。此外，可能用于检查繁殖差异或由多克 隆抗体组合物的纯化引起的差异。
构建抗卵清蛋白重组多克隆抗体生产型细胞系
通过使用噬菌体展示和ELISA鉴定相关克隆以选择卵清蛋白结合 噬菌体克隆。两种装置用来鉴定来自卵清蛋白结合克隆的抗体，即基 于用卵清蛋白覆盖的ELISA板或基于将卵清蛋白固定在PVDF膜上的高 密度筛选方法(HDS)。通过这种方式获得抗体组，其中的一些识别固 定在ELISA板上的卵清蛋白，而其它则识别固定在PVDF膜上的卵清蛋 白。
选择的卵清蛋白结合噬菌体克隆可能具有其连接到哺乳动物启动 子上的可变重链和kappa链DNA序列，并且转到用于抗体表达的 pSymvc20类型(图4D)载体中以产生pSymvc21类型(图4E)的克隆 集合。所述CHO-Flp-In细胞既可以用pSymvc21克隆混合物进行整体 转染，又可以用单个pSymvc21抗体表达质粒进行个体转染，然后混 合表达其它卵清蛋白结合抗体的转染细胞。可通过对单一抗体表达细 胞进行DNA测序、TaqMan PCR和RFLP分析以及对产生的抗体混合物 进行ELISA、双相(2D)液相层析(LC)和质谱(MS)分析来监控制 造抗卵清蛋白多克隆抗体生产型细胞系的过程。
培养细胞和生产重组多克隆抗体
将如上面描述产生的多克隆细胞系在适合于表达所述目的多克隆 蛋白质的条件下培养在合适的培养基中，所述目的多克隆蛋白质由插 入到细胞基因组中的不同核酸序列编码。可通过几个步骤进行细胞培 养。在第一个步骤中对多克隆细胞系选择位点特异性整合子。当使用 哺乳动物细胞时，优选地使所选择的细胞适应悬浮培养以及无血清条 件。这可以通过一个或两个步骤并且在有或没有选择压力的情况下进 行。当所述多克隆细胞系适应合适条件后可以开始放大实验。这时工 作细胞贮存物可以进行解冻。优选地使用30和100升之间的生物反应 器，但也可使用更小的或更大的生物反应器。适合的生产时间和生物 反应器大小的选择取决于来自该批想要的蛋白质产量和来自所述细胞 系的表达水平。反应时间的变化可以从几天到三个月。将表达的重组 多克隆蛋白质从细胞或上清液中分离出来。根据本领域技术人员所熟 知的方法对所述重组蛋白质进行纯化和鉴定。下面列出纯化和鉴定方 法的例子。
从培养上清液中纯化重组多克隆蛋白质
使用各种层析技术将特定蛋白从培养物上清液中分离是可能的， 所述层析技术是利用蛋白质物理化学特性的不同，例如分子量、静电 荷、疏水性或对特定配体或蛋白质的亲和力的不同。于是可根据分子 量使用凝胶过滤层析或根据静电荷使用离子交换(阳离子/阴离子)层 析或使用层析聚焦分离蛋白质。类似地，根据疏水性使用疏水相互作 用层析或亲和层析可分离蛋白质，所述亲和层析是利用对特定固定配 体或蛋白质的亲和力的差异。于是通过一系列各种层析原理的组合可 以获得对蛋白质复杂混合物的分离。于是根据例如静电荷使用离子交 换层析首先对蛋白质混合物进行分离，而具有相似静电荷的蛋白质接 着根据分子量使用凝胶过滤层析进行分离或根据疏水性在高浓度选择 盐存在的情况下使用相互作用层析进行分离。
亲和层析结合后续纯化步骤例如离子交换层析、疏水相互作用和 凝胶过滤已经常用于从不同材料来源例如腹水液体、细胞培养上清液 和血清中纯化IgG(多克隆的及单克隆的)和TcR。亲合纯化是种快速易 行的方法，其中分离是基于所述蛋白质和连接到层析基质的特定配体 之间的可逆相互作用，其可提供高选择性、高产量并浓缩到较小的体 积中。蛋白质A和蛋白质G是两种细菌细胞表面蛋白，对Fc区域有很 高的亲和力，并且其固定化形式已用于许多常规的应用，包括纯化来 自各物种的多克隆IgG及其亚类和吸收及纯化免疫复合物。
在亲和层析之后，可进行下游层析步骤例如离子交换和/或疏水相 互作用层析以除去宿主细胞蛋白、渗漏的蛋白A和DNA。
作为最后纯化步骤的凝胶过滤可用来除去污染分子例如二聚体和 其它聚集体，并且将样品转入贮存缓冲液中。根据来源和表达条件有 必要包括额外的纯化步骤以获得所要求水平的抗体纯度。于是经常使 用疏水相互作用层析或离子交换层析与蛋白质A和凝胶过滤层析相结 合以纯化用于治疗的抗体。
为了纯化其它种类的抗体，必须使用其它的亲和层析介质，因为 蛋白质A和G不与IgA和IgM结合。可使用免疫亲和纯化(将抗IgA 或抗IgM单克隆抗体连接到固体相)或应用包括离子交换和疏水相互 作用层析的多步骤纯化策略。
结构表征
由于所述混合物的复杂性(多克隆多样性和糖基化)，多克隆蛋 白质例如抗体和TcRs的结构表征要求高分辨率。传统的方法例如凝胶 过滤、离子交换层析或电泳可能没有足够的分辨率区分单个抗体。已 经使用双相聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)及随后的质谱(MS)或液 相色谱(LC)-MS对复杂的蛋白质混合物(例如蛋白质组)进行表征。 已经证明基于蛋白质电荷和质量的分离方法的2D-PAGE在区分血清样 品中的多克隆、寡克隆和单克隆免疫球蛋白上非常有用。然而，这个 方法有一些局限性。层析技术，特别是与电喷射离子化MS偶联的毛细 管和LC赿来赿多地被用来分析复杂的肽混合物。LC-MS已用来鉴定单 克隆抗体的特征并且近年来也用于对多克隆抗体轻链的表征。对非常 复杂样品的分析要求更强的层析系统分辨能力，所述分辨力可通过用 两相(或更多相)分离获得。这种方法可基于在第一相中进行离子交 换和在第二相进行反向相层析(或疏水相互作用)，可选地与MS结合。
功能表征
多克隆蛋白质通过例如与具有对相同目的物特异性结合或相似活 力的多克隆蛋白进行比较研究来鉴定功能上的特征。这种研究可在体 外和体内进行。
多克隆抗体的体外功能表征可以是例如免疫沉淀，所述免疫沉淀 是用于对来自细胞粗提裂解物中的靶抗体分析分离的高度特异性技 术。通过免疫沉淀与其它技术的结合，例如SDS-PAGE之后接着进行蛋 白质染色(考马斯亮兰、银染或生物素标记)和/或免疫印迹，就可能 例如检测和定量抗原，于是估计所述抗体的某些功能特性。尽管该方 法既没有估计抗体分子的数目又没有估计其结合亲和力，但它提供了 目的蛋白质的可视化以及其特异性。这个方法可能用于在表达过程期 间监控抗体对抗原(克隆多样性的完整性)结合的潜在差异。
多克隆抗体的体内功能表征可以通过例如感染研究。实验动物例 如小鼠可用例如特定的病毒感染，针地所述病毒的多克隆抗体已经开 发出来了。感染被抑制的程度可表明所述多克隆抗体的功能。
治疗组合物
在本发明的实施方案中，含有选自免疫球蛋白超家族的重组多克 隆蛋白质作为活性成分的药物组合物可用来治疗或预防动物疾病，例 如选自癌症、感染、炎症疾病、过敏、哮喘和其它呼吸疾病、自体免 疫疾病、免疫障碍、心血管病症、中枢神经系统疾病、代谢和内分泌 疾病、移植排斥和不期望的怀孕等的疾病。所述哺乳动物优选地是人、 驯养的动物或宠物。
在本发明优选的实施方案中，所述药物组合物包括重组多克隆抗 体或抗体片段作为活性成分和药物学可接受的赋形剂。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述药物组合物包含重组多 克隆T细胞受体或T细胞受体片段作为活性成份和药物学可接受的赋 形剂。
为了治疗或预防感染，根据本发明的药物组合物含有能与感染性 微生物例如选自细菌、分枝杆菌、病毒、支原体、立克次氏体、螺旋 体、原生动物、真菌、蠕虫和外寄生物的微生物反应或结合的目的重 组多克隆蛋白质。
重组人多克隆蛋白质可以在药物学可接受的稀释剂、载体或赋形 剂中以单位剂量形式施药。传统的药物学实践可用于提供合适的制剂 或组合物，以将所述混合物施用给遭受例如由于过度细胞增殖造成的 疾病的病人。施药可能在病人有症状之前开始进行。可使用任何合适 的给药途径，例如给药可以是肠胃外的、静脉内的、动脉内的、皮下 的、肌肉的、头颅内的、眶内的、眼的、心室内的、英膜内的、脊柱 内的、池内的、腹膜内的、鼻内的、气雾剂、栓剂、或口服施药。例 如，治疗制剂可以是以液体溶液或悬浮液形式；对于口服施药，制剂 可以是片剂或胶囊咀嚼胶、糊剂的形式，适合应用于皮肤的组合物可 以是霜剂、软膏、洗液、凝胶、垫子或其它形式，适合应用于阴道或 泌尿生殖道粘膜的组合物可以是阴道栓剂(vagitories)、凝胶或其 它形式，而对于鼻内制剂则是粉末、鼻滴或气雾剂形式。
本发明的药物组合物通过已知的方式制备，例如，通过传统的溶 解、冻干、混合、研磨或糖膏(confectioning)加工。根据传统药物 学实践(例如参见，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.)，ed.A.R.Gennaro，2000，Lippincott Willianms & Wilkins，Philadelphia，PA和Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，eds.J.Swarbrick和J.C.Boylan，1988-1999，Marcel Dekker，New York，NY)配制药物组合物。
优选地使用活性成分溶液，还有悬浮液，特别是等渗水溶液或悬 浮液，例如在只含有活性成分或连同载体例如甘露糖的情况下，很可 在使用前制备这类溶液或悬浮液。所述药物组合物可能会灭菌和/或可 能包含赋形剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、用以 调节渗透压的盐和/或缓冲液，并且通过已知的方式进行制备，例如通 过传统的溶解或冻干加工的方法。所述溶液或悬浮液可含有增加粘性 的物质，例如羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯吡 咯烷酮或明胶。
注射组合物在无菌条件按通常方式进行制备；也用同样方式将所 述组合物装入安瓿或小瓶中并且密封容器。
用于口服施药的药物组合物可通过将活性成分与固体载体结合 (如果想要将所得混合物制粒)获得，如果想要或必要，在加入合适 的赋形剂后，将混合物加工成为片剂、糖衣丸(drage core)或胶囊。 也可将其整合到允许活性成分缓慢地扩散或以定量方式释放的塑料载 体中。
所述药物组合物包含从大约1％到大约95％，优选地从大约20％到 90％的活性成分。根据本发明的药物组合物可以是例如单位剂量的形 式，例如以安瓿、小瓶、栓剂、糖衣丸、片剂或胶囊的形式。
所述制剂可以按治疗有效剂量(例如，预防、消除或减轻病理状 况的剂量)给病人施药以对疾病或病理状况提供治疗。用于施药的治 疗药物的优选剂量可能取决于这类参数，如病的种类和程度、具体病 人总的健康状况、化合物赋形剂的制剂和其施药途径。
如果需要，使用重组人多克隆抗体的治疗可以同更多传统治疗方 法结合。例如在癌症的治疗中，这种组合治疗可采取手术或施用化学 治疗剂或其它抗癌药物的形式。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的所述药物组合物包 含与感染性微生物例如选自细菌、分枝杆菌、病毒、支原体、立克次 氏体、螺旋体、原生动物、真菌、蠕虫和外寄生物的微生物反应或结 合的目的重组多克隆蛋白质。
根据本发明的所述组合物的治疗应用
根据本发明的所述药物组合物可以用于治疗、改善或预防哺乳动 物疾病。能用本药物组合物治疗的疾病包括癌症、感染性疾病、炎症 疾病、过敏、哮喘和其它呼吸疾病、自体免疫疾病、免疫障碍、心血 管病症、中枢神经系统疾病、代谢和内分泌疾病、移植排斥和不期望 的怀孕。
本发明的一个方面是用于治疗、改善或预防动物中疾病的方法， 其中施用有效剂量的所述重组多克隆抗体或抗体片段。在进一步的方 面中施用有效剂量的所述重组多克隆T细胞受体或T细胞受体片段。
本发明另外的方面是利用重组多克隆抗体或重组多克隆T细胞受 体、或抗体或T细胞受体的片段制备用于治疗疾病的组合物，所述疾 病选自癌症、感染、炎症疾病、过敏、哮喘或其它呼吸疾病、自体免 疫疾病、免疫障碍、心血管病症、中枢神经系统疾病、代谢疾病、内 分泌疾病、移植排斥和不期望的怀孕。
诊断应用和环境检测应用
本发明的另一个实施方案涉及诊断试剂盒和用于环境检测应用的 试剂盒以及使用这些试剂盒的方法。根据本发明的试剂盒包含根据本 发明制备的重组多克隆蛋白质，其中该蛋白质可以用可检测的标记进 行标记或可以不标记进行非标记检测。如果标记，所述本重组多克隆 蛋白质可加入到怀疑含有靶分子的样品中，并且所述标记的存在或缺 少表明所述靶分子的存在或缺少。被检测的样品可以是体液样品，例 如血液、血清、血浆、脊髓液、淋巴液或尿或非哺乳动物样品，例如 怀疑含有污染物的来自环境来源的样品。非哺乳动物样品可以是水、 空气或污染的土壤。非标记检测包括测量结合后BIAcore的折射的改 变，其中所述重组多克隆蛋白质用于捕获靶分子。
实施例
下列的实施例描述了怎样在高产者细胞系中表达和生产重组多克 隆抗体，其中目的基因/载体通过位点特异性整合已被插入预先鉴定的 染色体“热点”位置。
在所述实施例中，将CHO细胞用作宿主细胞。其有利方面包括容 易获得合适生长培养基、在培养中其有效地长成高密度的能力和其以 生物学活性的形式表达哺乳动物蛋白质例如抗体的能力。
通常，根据传统方法进行根据本发明的大肠杆菌的转化和哺乳动 物细胞的转染。为增进对本发明的理解，在下面的实施例中描述了作 为例子的载体的构建和其在生产用于表达重组多克隆蛋白质的重组多 克隆生产型细胞系中的应用。
下列实施例阐述本发明，但不应该被认为是对本发明的范围的限 制。
实施例1
位点特异性整合对比随机整合
为进行下列转染实验，使用CHO-Flp-In细胞(Invitrogen， Carlsbad，CA)。用人分泌型碱性磷酸酶(SEAP)作为报告基因检测 所述系统的效率。制备两个质粒构建体：
1.将SEAP插入pcDNA3.1 hygro+(Invitrogen，Carlsbad，CA) (用于随机整合)
2.将SEAP插入pcDNA5/FRT(Invitrogen，Carlsbad，CA)(用 于位点特异性整合)
在调控元件(即启动子、多聚腺苷酸化等)方面两个质粒构建体 非常相似，这使得使用所述质粒进行随机整合与位点特异性整合的比 较成为可能。
单独使用质粒构建体1或按照Invitrogen描述的方法使用质粒构 建体2结合重组酶编码质粒pOG44转染CHO Flp-In细胞。使用潮霉素 选择转染体，并且测量来自转染体集合的SEAP的产量。
通过位点特异性整合转染的细胞产生大约比随机整合感染的细胞 多6倍的SEAP，证明了所述系统和所述细胞系的有效性。
实施例2
设计和制备用于在宿主细胞中位点特异性整合的表达载体
适合于位点特异性整合到宿主细胞热点染色体区域的表达载体可 由下列DNA元件组装而成：
a)连接潮霉素抗性基因的FRT重组位点，
b)pUC复制超始位点，
c)氨苄青霉素抗性基因(bla)，
d)允许氨苄青霉素(bla)抗性基因表达的bla启动子，
e)基因，编码目的蛋白质(GOIs)，
f)允许所述GOI表达的启动子，和
g)任选地，附加的转录或翻译调控元件，例如增强子或 UCOE’s，以增加在整合位点或IRES的表达。
为了更好理解表达载体的构建，给予各元件更详细的描述：
a)使用了连接潮霉素抗性基因的FRT重组位点以用于Flp重组 酶介导的整合以及选择具有大多数单一整合子的细胞系。所述潮霉素 基因前没有启动子也没有装配转录起始密码子，只在基因的3’加上 多聚腺苷酸化信号。所使用的FRT位点是 5’-gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3’ (SEQ ID NO 1)。
b)包含了允许在大肠杆菌宿主细胞中高拷贝数量复制的pUC复 制起始位点。
c)包含了允许选择大肠杆菌转化子的氨苄青霉素(bla)抗性基 因(β-内酰胺酶)。
d)允许氨苄青霉素(bla)抗性基因在大肠杆菌中表达的bla- 启动子。
e)包含了编码目的蛋白质例如重组多克隆蛋白质、抗体、抗体 的重链和轻链的GOI以及编码所有或部分抗体分子恒定区或可变区的 核酸序列和任选地所有或部分控制抗体分子表达的调控核酸序列。
重链的免疫球蛋白座位包括但不限于V、D、J和转换区(包括间 插序列，也称作内含子)以及与特定重链恒定区基因相关或相邻的侧 翼序列，它也可以包括位于恒定区内或下游的区域(包括内含子)。
轻链免疫球蛋白座位可包括但不限于V和J区、其上游的侧翼序 列、和与所述轻链恒定区基因相关或相邻的间插序列(内含子)，并 且其可以包括位于所述恒定区内或下游的区域(包括内含子)。
对于所有或部分抗体的恒定区的修饰，本发明的修饰序列可以包 括但不限于具有特定效应物功能、种类和/或来源(例如，人或任何其 它种类的免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD或IgE恒定区)的抗体恒定 区或修饰了抗体恒定区活性或性质的部分恒定区；以及编码赋予修饰 了的抗体以某些新功能的其它分子的基因，例如酶、毒素等。
编码目的蛋白质的基因可以有效地连接到编码指导基因产物到分 泌途径中的有功能的前导序列的核酸序列。
此外，在编码目的蛋白质例如含有重链和轻链的多克隆抗体的 GOI的3’可以具有强多聚腺苷酸化信号。在下面的例子中小鼠同种型 IgG1的应用是用作说明目的的，并不意味要限本发明的范围。
f)提供了允许GOI表达的启动子。因此，描述了含有用于表达 的启动子和增强子元件的盒。在所述表达载体中，各抗体基因前有其 自己的指导两条链中各链高水平表达的哺乳动物启动子元件，无论单 向、双向或尾对尾方向的转录盒都可使用。
在双向表达中，可使用头对头启动子构型(在US Patent No.5, 789,208中详细描述这种系统的结构，其全文引用作为参考)。在单 向表达系统中，两个启动子或一个启动子结合例如IRES序列也可用于 表达。
为了构建头对头启动子，分别对启动子进行Pfu PCR扩增。5’- 引物将从所述启动子的最5’的碱基开始，3’端引物将包括单一限制 性位点，例如XbaI位点。在PCR扩增之后，将所述片段用琼脂糖凝胶 分离并用QiaQuick柱(Qiagen)将其从胶中分离。此后用XbaI限制 性消化、于65℃下进行20分钟热失活，并用QiaQuick对片段进行柱 纯化。然后将所述片段混合并用大肠杆菌连接酶(New England Biolabs(NEB))连接，所述酶优选地连接粘性末端。连接混合物用各 启动子的5’引物进行PCR扩增以产生完整的头对头启动子(启动子 A/启动子B)片段。这个片段用T4多聚核苷酸激酶(PNK)(NEB)进 行磷酸化，所述酶于65℃下进行20分钟热失活，并且用T4连接酶 (NEB)将所述片段连接(平末端)到目的载体上(PCR扩增的 pSymvc10(图4)片段，其中用于扩增的引物与启动子区域的各端退火， 扩增除启动子外的所有区域)。
图1和2显示分别包含用于双向和单向表达的启动子的表达载体。 这些启动子是用于说明的，但不限制本发明中启动子的选择。
g)为了增加整合位点和/或IRES的表达，所述表达载体可以携 带另外的转录和/或翻译调控元件，例如增强子和/或UCOE’s。
实施例3
对开发的生产系统中的多克隆性保存的估量
为了能估计生产系统的稳定性和重复性，制备以已知组合表达不 同抗体的多克隆组合物的细胞系。所述多克隆抗体组合物称为mini six组合物。编码所述mini six组合物的核酸序列文库称为mini six library。
(a)克隆起点
在这个实施例中使用下列编码与抗原1-6反应的Fab片段(目的 基因)的序列：
1.卵清蛋白(OVA)。所述Fab编码片段选自鼠抗OVA噬菌体展 示文库。
2.碱性磷酸酶(AP)。所述Fab编码片段选自鼠抗AP噬菌体展 示文库。
3.β2-微球蛋白(β2m)。所述Fab编码片段克隆自杂交瘤BBM.1 (由Dr.L.Ф.Pedersen赠送，Denmark)，其针对β2m而产生。
4.人触珠蛋白(HAP)。Fab编码片段选自鼠抗人触珠蛋白噬菌 体展示文库。
5.因子VIII(FVIII)。这个Fab片段的亲本单克隆抗体是FVIII F25单克隆抗体(由Novo Nordisk赠送，Denmark)。将编码这个Fab 片段的VH和完整Kappa链的DNA亚克隆到噬菌体中，接着将原核启动 子盒插入构建体中。
6.鸡蛋溶菌酶(LYS)。这个构建体产自D1.3scFv克隆(Boulot， G.等人，J.Mol.Biol.，213(4)(1990)617-619)，通过对VH和Vκ 片段的PCR扩增并克隆到噬菌体中。
所述噬菌体克隆存在于转化的大肠杆菌株系TG1的甘油贮存物中 (保存在-80℃)或作为噬菌体DNA制备物存在。
(b)mini six library的RFLP分析和DNA测序。
如下通过RFLP分析编码所述Fab片段重链的核酸序列：检测通过 用NlaIII和Hinf I酶消化PCR产生的片段获得的条带图谱。不同的 Fab片段编码序列展现非常不同和易区别的图谱。对编码VH和VL片段 的核酸序列测序并且找出对应于RFLP图谱的序列。此外，所述核酸序 列编码开放阅读框并且可翻译成已明确定义的多肽。
(c)mini six组合物的ELISA分析
用ELISA分析由克隆表达的所述Fab片段，其中分析所有Fab片 段对所有抗原的反应性。用抗kappa ELISA监控Fab的表达。所有Fab 片段用ELISA进行二次重复测试。所有克隆都表达Fab片段，并且所 述Fab片段特异性与其相关的抗原发生反应。在ELISA分析中没有发 现背景问题。
所述6个噬菌体克隆分别存在于转化的大肠杆菌株系TG1甘油贮 存物中，在用于如下描述的接种的模式系统中使用所述克隆。
(d)设计具有已知组合的6个不同抗体的多克隆模式系统。
通过检测表达的Fab片段对相关抗原的反应性确定所述6个选择 的Fab表达克隆(表达抗OVA、抗AP、抗β2m、抗HAP、抗FVIII和 抗LYS的Fab片段的克隆)的特性。这些克隆形成了多克隆模式系统 的一部分，所述模式系统用于测试已知组合(所述mini six组合物) 的6个不同抗体的表达和产量。将所有Fab编码核苷酸序列(所述mini six library)转移到噬菌体载体(由pSymvc10所示，图4A)。
(d.1)GOI从噬菌体载体向用于哺乳动物表达的载体的个体转 移。
在这个实施例中，目的基因(所述mini six library)从噬菌体 载体到用于哺乳动物表达的载体的转移是通过2步法进行的。第一步 是用头对头方向的哺乳动物启动子盒取代原核启动子。这个步骤之后 是将GOI’s的可变区、启动子盒和恒定kappa转移到如下详细描述的 表达载体中，并且于图4中说明。
通过使用SacI/XhoI消化，接着通过连接导致来自细菌的启动子 换成来自哺乳动物的启动子，于是将头对头启动子盒(启动子A/启动 子B)插入到各克隆的噬菌体载体上。然后用EcoRI和NotI消化将可 变重链、头对头启动子盒(启动子A/启动子B)和完整kappa链 (EcoRI/NotI片段)从噬菌体载体移到表达载体上。
在图4的流程图给出了各克隆个体转移的例子。该图显示质粒 pSymvc10，其中目的重链和kappa编码序列(例如，gc032 OVA)位于 噬菌体载体上，通过使用SacI/XhoI片段转移将头对头哺乳动物启动 子盒构建体连接到所述噬菌体载体上以取代细菌启动子，产生 pSymvc12。
从这个构建体中，通过使用NotI/EcoRI转移将包括启动子盒和完 整kappa链编码序列的可变重链编码序列转到哺乳动物同种型编码载 体(pSymvc20)上。最终获得的载体(pSymvc21)表达目的小鼠抗体 (例如抗OVA IgG1抗体)。
通过NotI/EcoRI转移分别将来自六个克隆中每个克隆的可变重 链编码序列、哺乳动物启动子盒和完整的kappa链编码序列进行转移， 产生哺乳动物表达载体pSymvc21，其表达每个GOI编码的抗体序列作 为小鼠IgG1抗体。
含有所述6个GOIs的6个单个pSymvc21克隆保存为TG1甘油贮 存物。
为了转染入CHO Flp-In细胞，所述TG1贮存物分别繁殖，并且在 OD600校正大肠杆菌数目后，将所述6个培养物混合并用于质粒制备。 将包含所述6个GOIs的这个质粒制备物(mini six library)用于对 哺乳动物细胞的整体转染，所述哺乳动物细胞用于重组多克隆抗体表 达。
(d.2)将所述GOI’s从噬菌体载体整体转移到用于哺乳动物表 达的载体中。
将位于噬菌体载体中并编码6个不同Fab片段(抗OVA、抗AP、 抗β2m、抗HAP、抗FVIII和抗LYS)的GOIs(所述mini six library) (此处为EcoRI/NotI片段)以所述6个载体构建体的混合物整体转移 到用于哺乳动物表达的载体上，以产生6个不同表达载体的混合物。
涉及整体转移的实验方法和(d.1)中所描述的方法一样，除了其 以整体方式进行，即将所有6个GOIs(编码可变重链，包括头对头启 动子盒和完整kappa链)以6个噬菌体载体混合物的形式同时转移。
mini six library质粒的制备
质粒制备物1是指所述6种噬菌体载体(具有含于载体pSymvc10 上的抗体编码序列)混合的质粒制备物。
质粒制备物2是指在整体转移步骤1(参见图4C)之后具有含于 载体pSymvc12上的编码序列的6种噬菌体载体的质粒制备物，所述步 骤1导致原核启动子与哺乳动物启动子盒构建体的交换。
质粒制备物3是指在整体转移步骤2(参见图4D)后的质粒制备 物，所述步骤2导致可变重链、头对头启动子盒和完整kappa链从 pSymvc12交换到哺乳动物表达载体(pSymvc21)，于是允许6个选择 的抗体作为全长小鼠IgG1抗体而表达。
确定整体转移中使用的质粒制备物转化的TG1细胞的基因型
用电穿孔将mini six library整体转化TG1细胞并且在2xYT (Sigma Y 2627)板上过夜培养之后，将单个克隆挑出。在各实验中 挑出180个克隆并在96孔培养板中于2xYT液体培养基中孵育4小时。 用水稀释等份培养物、变性并用作PCR模板。在所有的实验中，可变 重链得以扩增。用于噬菌体载体(pSymvc10-类型)的引物是：
5’-GCATTGACAGGAGGTTGAGGC-3’(SEQ ID NO 2)和
5’-GCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTC-3’(SEQ ID NO 3)
用于具有哺乳动物启动子盒的载体的引物是(pSymvc12-型)：
5’-GCATTGACAGGAGGTTGAGGC-3’(SEQ ID NO 4)和
5’-GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3’(SEQ ID NO 5)
用于pSymvc21构建体的引物是：
5’-CAAATAGCCCTTGACCAGGC-3’(SEQ ID NO 6)和
5’-GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3’(SEQ ID NO 7)
同时用NlaIII和HinfI消化所有PCR产物以确保明确的基因分 型。用琼脂糖凝胶电泳分析所述消化片段并用溴化乙锭染色显示条带。 RFLP确定的片段图谱鉴定出个体基因型的数目，其对应于在所有挑选 的克隆总数目中代表所述6个抗体中各抗体的单个克隆的数目。
(d.2a)DNA在大肠杆菌中扩增后整体地将其从噬菌体载体转到 哺乳动物载体中(二步扩增法)。
从所述6个大肠杆菌TG1甘油贮存物中的每一个制备所述质粒制 备物1，所述每个贮存物包含构成mini six library的6种噬菌体载 体中的一个。贮存物分别繁殖，并且在OD600校正大肠杆菌数目后，将 所述6种培养物等量混合并用于质粒制备，形成质粒制备物1。通过 将其转化入电感受态的TG1细胞和进行随后的RFLP分析以检测在质粒 制备物1中6种噬菌体载体的基因型分布。图5显示TG1细胞中不同 基因型的分布。
用SacI/XhoI消化含有多克隆噬菌体载体的质粒制备物1，所述 噬菌体载体表达6个选择的Fab片段基因型的等量混合物。然后将头 对头启动子盒(CMV启动子/MPSV启动子)通过连接插入。在用来自连 接步骤(图6)的DNA转化后在TG1细胞中检测载体启动子交换后载 体的基因型分布。
将所述细胞涂到板上并生长在大的(245mmx245mm)2xYT琼脂糖 板上，并且制备质粒制备物2以产生包含头对头启动子盒(pSymvc12) 的噬菌体载体。
从质粒制备物2中，用NotI/EcoRI消化将包含启动子盒和完整 kappa链的可变重链编码序列从噬菌体载体中切下并转到已含有小鼠 IgG1恒定区结构域的载体(pSymvc20)中。这形成了pSymvc21载体 集合，所述载体集合表达作为全长小鼠IgG1抗体的6个所选抗体克隆 的可变区。
或者所述启动子转移可在编码同种型的哺乳动物载体中进行，限 制性酶切的顺序颠倒，开始用NotI/EcoRI消化以将目的DNA转移到 哺乳动物载体中，然后用SacI/XhoI限制性消化片段插入到启动子区 域。
在将可变重链编码序列、启动子盒和整个kappa链编码序列转入 表达载体后，通过用来自第二连接步骤(图7)的DNA转化TG1细胞 以检测基因型的分布。将细胞涂在大的(245mmx245mm)2xYT琼脂糖 板上并且制备(pSymvc21)质粒制备物3，其中于小鼠IgG1抗体构架 区中表达所述6个克隆的可变区。
所述质粒制备物3可用于对哺乳动物细胞进行整体转染以产生用 于重组多克隆抗体表达的重组多克隆生产型细胞系。
DNA在大肠杆菌细胞中扩增后，从噬菌体载体到同种型编码哺乳 动物载体的整体转移的结果显示：在6种载体构建体分别繁殖并混合 (质粒制备物1，图5)后，有可能获得其均衡分布。在启动子盒(质 粒制备物2，图6)交换之后以及在插入小鼠IgG1同种型编码载体(质 粒制备物3，图7)后，以可比的水平可检测到所述6种构建体。
(d.2b)在质粒制备物1步骤之后无需进行大肠杆菌中的DNA扩 增即从噬菌体载体整体转移到用于哺乳动物表达的载体(一步扩增方 法)。
为了交换启动子，用SacI/XhoI消化来自质粒制备物1(此处使 用25μg)的DNA，所述DNA包含表达6种选出的Fab片段基因型的等 量混合物的多克隆噬菌体载体(pSymvc10)。纯化所述SacI/XhoI载 体片段并与头对头启动子盒(CMV启动子/MPSV启动子)连接。交换启 动子后不进行任何扩增，用NotI/EcoRI消化具有CMV/MPSV启动子盒 的载体以从噬菌体载体中切出具有可变重链编码序列的整个区域，所 述可变重链编码序列包括启动子盒和完整kappa链编码序列，再将其 整体转移到用于哺乳动物表达的载体中。在将编码可变重链，所述启 动子盒和kappa链的NotI/EcoRI片段转入小鼠IgG1编码载体 (pSymvc20)中后，获得了在小鼠IgG1全长抗体环境下表达6个选择 克隆的可变区的表达载体。图1说明这种表达载体的组成。
在造成启动子交换的整体转移和转移编码可变重链区、启动子盒 和完整kappa链的核苷酸序列到用于哺乳动物细胞表达的载体中后， 通过用来自第二连接步骤的质粒转化TG1细胞来检测基因型的分布。 将所述细胞涂在大的(245mmx245mm)2xYT琼脂糖板上并且制备这种 双酶切/连接形成的质粒制备物(载体pSymvc21，其中在小鼠IgG1抗 体背景下表达6种克隆的可变区，对应于来自d.2a的质粒制备物3)。 图8显示在用来自一步扩增法的质粒制备物转化的TG1细胞的基因型 分布。
由于所述一步扩增法会由于产生不想要的连接产物，因而可能在 来自所述6种Fab编码序列的重链和轻链中引入一些混杂，正常情况 下在大肠杆菌中扩增期间会避免产生所述混杂。然而，如果发生这种 混杂，可引入筛选步骤以确保维持足够的克隆多样性。
(d.2c)启动子交换后直接转染哺乳动物细胞
为了表达重组多克隆抗体，来自所述mini six library的质粒制 备物的产物可用来直接整体转染哺乳动物细胞，所述mini six library的质粒制备物既可以来自二步扩增法又可来自一步扩增法。
(d.3)检测转染的哺乳动物细胞
所述mini six多克隆模式系统的已知抗体组合可用来检测并确保 对哺乳动物细胞的转移和转染以这样的方式发生：在转染和随后培养 过程中，维持了克隆多样性并不会在所述抗体可变序列基因型组成中 引入差异。整体转移、整体转染和哺乳动物表达整个过程中用于监控 基因型组成的方法包括如下：
-分离克隆的DNA测序
-单个克隆的RFLP分析
-所述产生的抗体混合物的ELISA分析
-所述产生的抗体混合物的质谱分析
-基因组序列和表达不同重链和轻链的mRNA的相对组成的Taqman PCR
在转染过程中引入的基因型组成上的偏差(如果发生)是由于随 机整合或多整合子造成的。如在详细描述中所述的，当使用预先设计 的用于位点特异性整合的宿主细胞时不太可能引起这个问题。然而， 可用多种方法控制这种偏差。使用非常少量的DNA例如当用 Lipofectamine进行转染时DNA为1μg/107细胞或当用电穿孔转染时 DNA为0.2μg/107细胞，可选择除去在随机基因组座位(除了位点特 异性座位的座位)上的整合。还有，还可提供不利于随机整合的超螺 旋形式的DNA进行整合；
通过负选择将位于预先设计的靶位点之外的单个或多个整合消 除，因为可选择的标记将位于基因组中，没有启动子或起始密码子。 于是，这些随机整合事件接受者不能在选择过程中存活。
具有多处整合(其中有一个重组事件发生在所述靶位点)的转化 子能在选择过程中存活下来；然而，这种多处整合类型的概率是极其 低的。于是这种事件导致最小化的多克隆蛋白质混杂。此外，由于存 在100到1000个编码相同重组多克隆蛋白质的其它克隆，即使异位表 达很高，如果多处整合发生则所述混杂将小于大约1％。如前面提到的， 异位整合的概率可通过减少方法中所使用的DNA量予以降低。
最不可能的事件是在靶位点的多个串联整合。通过使用此处描述 的Flp重组酶系统这种事件将很少发生，因为其在染色体上切割活性 明显高于整合活性。然而，如果串联整合以不可接受的高频率发生， 要用其中只能插入单个拷贝的系统(参见，例如，WO99/25854；引用 作为参考)更换所述Flp系统。
(e)在哺乳动物细胞中表达已知组合的6种不同抗体
通常为了最小化繁殖速率的差异，优选地将各特异GOI(在这个 例子中是所述mini six library的各单个成员)整合到至少100个， 优选地1000个和最优选的10000个细胞中。含有大量表达相同GOI(对 所有的GOI’s)的单个细胞的多克隆细胞系预期较少受到单个细胞不 同繁殖速率的影响，并且在最终多克隆蛋白质组合物中能减少差异的 概率。
进一步，确保用于表达的宿主细胞系同源是有利的。这可以通过 在转染前亚克隆所述宿主细胞系实现。在关于克隆多样性的段落中对 这个过程进行了描述。
对于希望对其中差异进一步控制的多克隆文库，通过向所述表达 载体平台引入可诱导的转录控制元件可控制所述多克隆蛋白质产物的 最终组成。合适的可诱导控制元件包括，例如BD Tet on/off(BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ)和GeneSwitch(Invitrogen， Carlsbad，CA)。这些转录开关可在合适的时间点(例如，当细胞集 合充分扩增时)诱导以最小化由于基因表达或蛋白质产物的差异造成 的任何繁殖差异。没有使用这样的控制元件进行本实验。
无论是如(d.1)中所描述的单个地或如(d.2)中所描述的整体地 将所述6种选择的GOI从噬菌体载体转移到哺乳动物表达载体上后， 通过使用位点特异性整合将所述哺乳动物表达载体转染到 CHO-Flp-In细胞系的热点中以如下所述表达6种不同的抗体。
对于个体转移的GOI(d.1)，将质粒DNA’s进行分别繁殖并且 单个地转染到CHO-Flp-In细胞中或将所述TG1贮存物分别繁殖，并在 OD600校准大肠杆菌数目后，将所述6种培养物混合并用于质粒制备。 将这种含有所述6种目的基因的质粒制备物整体转染哺乳动物细胞， 以用于表达重组多克隆抗体。
对于整体转移的GOI(d.2a或d.2b)，将质粒DNA’s转染入 CHO-Flp-In细胞或根据(d.2a或d2.b)描述的方法扩增和纯化(质 粒制备物3)然后用于整体转染。
(e.1)细胞培养
将所述CHO Flp-In宿主细胞(Invitrogen，carlsbad，CA)培养 在Ham’s F-12培养基上，所述培养基添加有谷氨酰胺(2mM)和FCS (10％)和100μg/ml Zeocin(Invitrogen，Carlsbad，CA)。为了亚 培养，根据厂商说明书用胰蛋白酶将所述细胞脱壁并分离出来。将细 胞生长于5％二氧化碳、37℃。培养基和培养基添加物来自Gibco。
这种细胞系稳定地表达lacZ-Zeocin融合基因，使得所述细胞能 抵抗抗生素Zeocin，在外源基因位点特异性整合后该抗性将会丢失。 所述细胞含有单一拷贝的Flp重组靶(FRT)位点，于是适合用作进行 定点整合的宿主细胞系，所述定点整合使用了Flp-In系统 (Invitrogen，Carlsbad，CA)。
(e.2)转染CHO细胞
6孔组织培养板的每个孔中接种4.0x105个CHO-Flp-In细胞，并 且在O/N 37℃/5％二氧化碳条件下进行孵育。根据厂商说明书进行这 些细胞的转染以测试使用FuGENETM6(Roche)、LipofectineTM、 LipofectAmineTM或LipofectAMINE 2000TM(Gibco)的不同转染方法。 在这个实验中，LipofectAMINE 2000TM用作转染试剂。简短地，在转 染前一天，如上面描述的将呈指数生长的CHO-Flp-In细胞进行接种并 且在O/N 37℃/5％二氧化碳条件下进行孵育。具有85-95％细胞汇合的 孔用于共转染。
制备含有下列内含物的二个管子：
管1：将0.5μg具有(d.1)所描述的GOI的单个表达载体(例如 具有OVA的pSymvc21)+4.5μg mp040(pOG44的最大制备物)(表达 重组酶Flp的质粒)加入到250μl的Optimem(1.5ml的Eppendorf 管)。
管2：将7.5μl LipofectAMINE 2000TM加入到250μl的Optimem (1.5ml的Eppendorf管)并在室温下(RT)孵育5分钟。
将管2中的物质转移到管1中，接着在RT下卵育20分钟。
根据厂商说明书将所述DNA-Lipofectamine复合物转移到具有细 胞的孔中。
24小时后，用胰蛋白酶脱落所述细胞，分离(1∶3)并且分配到 T-25烧瓶和100mm培养皿中，并培养在含有900μg潮霉素B/ml作 为选择压力的新鲜营养混合物F-12 Ham+10％FCS+2mM L-谷氨酰胺培养 基中。
(e.3)选择位点特异性整合子并亚培养转染细胞
将细胞在潮霉素B选择压力下培养2到3周，在这个时期每2到 4天更换含有相同浓度的选择剂的新培养基。用胰蛋白酶将在T-25烧 瓶和培养皿中的存活细胞集合脱离下来，分离(1∶6)并且分配到T- 烧瓶中，在上面提到的选择压力下进一步繁殖。从含有转染子的培养 皿中挑取(使用所谓的克隆柱(cloning cylinder))一些单个克隆， 并将其转到新的孔中繁殖和用于表达水平研究，所述转染子根据(d.1) 中描述的方法产生。
能抵抗潮霉素B浓度阈值的各细胞集合或单个克隆在6孔板上长 成汇合，重新将其涂于具有相应烧基外加潮霉素B的培养皿、T-25、 T-80和T-175培养瓶中。当指数生长细胞在T8-组织培养瓶中生长到 80％的汇合时，将各细胞系的小瓶冰冻并贮存于液氮N2(L)冰箱中。
为了用含有6种目的基因的质粒混合物(mini six library)转 染，在OD600处校准所述6种单个培养物的大肠杆菌的数目，将其混合 并用于制备含有所述6种目的基因的多克隆质粒制备物。使用7.5倍 上述的试剂和细胞进行转染，产生表达所述6种不同抗体的混合物的 重组多克隆细胞系。
在培养和繁殖期间，通过使用抗原特异性ELISA对表达单个所选 抗体成员的所述6个细胞系和表达所述6个不同抗体的混合物的细胞 系的抗体产量进行检测。
(f)监控多克隆细胞系的组成，所述细胞系表达已知组合的6 种不同抗体。
通过产生6种所选目的基因的混合物然后将其通过整体转染和 位点特异性整合到CHO-Flp-In细胞中，产生表达6种不同抗体的多克 隆细胞系，所述目的基因位于表达载体上。
在接下来的34天里对所述细胞系的基因型分布、抗体表达和繁殖 速率进行鉴定。结果描述如下：
(f.1)在CHO-Flp-In细胞中所述6种选择的目的基因的基因型 分布，其中所述CHO-Flp-In细胞用来自OD600校准的细胞混合物的质 粒制备物转染。
所述多克隆CHO-Flp-In细胞系用胰蛋白酶处理并将细胞悬浮液 稀释到10个细胞/ml。此后，将200μl转到总共10个96孔板的每个 孔中。大约10天后，通过显微镜鉴定具有单个克隆的孔。用PBS冲洗 具有单个克隆的孔一次并且加入50μl的水。平板在80℃孵育10分 钟将溶解产物转移到另外的96孔板中。将10μl溶解产物和下列引物 用于25μl OneStep RT-PCR(Qiagen)。
5’-CAAATAGCCCTTGACCAGGC-3’(SEQ ID NO 6)和
5’-GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3’(SEQ ID NO 7)
在15μl反应系统中用HinfI和NlaIII对10μl的RT-PCR混合 物进行RFLP，所述反应系统于37℃孵育2小时。将所述消化片段用琼 脂糖凝胶电泳接着用溴化乙锭将凝胶染色显示。一段时间(转染后第 16天和34天)后确定产生抗OVA、抗AP、抗β2m、抗HAP、抗FVIII 和抗LYS的细胞的基因型分布，参见图9。
(f.2)来源于CHO-Flp-In细胞的样品的ELISA，所述CHO-Flp-In 细胞是用来自OD600校准的大肠杆菌(d.1)混合物的质粒制备物转染 的。
用胰蛋白酶处理所述多克隆CHO-Flp-In细胞系(e.3)并将3x106 个细胞涂于装有F-12 HAM+10％FCS+2mM L-谷氨酰胺和900μg潮霉素 的T-75培养瓶中。每隔一天换一次培养基并且在第3天收集上清液进 行ELISA。将抗原(β2-微球蛋白(由Copenhagen大学赠送)、碱性 磷酸酶(Sigma)、卵清蛋白(Sigma)、因子VIII(Novo Nordisk 赠送，Denmark)、鸡蛋清溶菌酶(Sigma)和触珠蛋白(Sigma))在 50mM碳酸盐缓冲液中稀释成10μg/ml。用抗原(每个孔50μl)覆盖 ELISA板并在4℃下孵育O/N。用冲洗缓冲液(1xPBS/0.05％Tween 20) 冲洗孔4次并用冲洗缓冲液配制的2％脱脂奶粉(每个孔100μl)封闭 1小时。将50μl样品加入到孔中并将板在RT下孵育1小时。将板冲 洗4次并加入第二抗体(羊抗小鼠IgG/HRP缀合物(Sigma))进行1 小时接着冲洗4次。ELISA用TMB底物(每个孔50μl，DAKO S1600) 显色5分钟并通过加入50μl 1M硫酸停止反应。立即将板于450nm 处读数。图10显示表明裂解物中所有6个目的抗体都表达的数据，用 编码所述6个目的基因的表达载体混合物转染后第34天获得所述数 据。应当指出的是：因为图10展示的数据来自6个不同的抗原特异性 ELISA分析，所以不能在抗体的量方面对OD450读数进行直接比较。
通过在CHO-Flp-In细胞集合中用抗kappa覆盖的ELISA对抗体表 达水平进行进一步分析，其中用各单个GOI或所述6个GOI的混合物 对所述CHO-Flp-In细胞进行了转染。图11显示结果。这显示在单个 转染的细胞系(例如，与用编码抗AP抗体的载体转染的细胞系相比， 用编码抗β2m载体转染的细胞系表达了可比量的抗体)之间抗体表达 水平是可比的。此处使用术语“用单个GOI转染的CHO-Flp-In细胞集 合”，因为所述单个细胞系不是来自单个克隆而是来自如e.3中所描 述的克隆集合。
(g)实验结论
首先，这些对生产系统中多克隆性保存的估计(测试)表明在不 引入选择或繁殖差异(图7)的情况下，将来自所述mini six library (编码抗OVA、抗AP、抗β2m、抗HAP、抗FVIII和抗LYS)的6个选 择的目的基因从噬菌体载体转移到哺乳动物表达载体中是可能的，于 是最终所述6个选择的目的基因的频率是相当的。
第二，用含有所述6个选择的目的基因的构建体混合物整体转染 CHO-Flp-In细胞也导致在分离的哺乳动物细胞中可比的构建体的分 布。一段时间(转染后第16天和34天)内，所述6个选择的目的基 因的基因型分布也是相似的(图9)，表明到第34天所述表达系统仍 维持所述六个基因型的原始的、相同的分布，而不引入繁殖差异。
第三，用所述6个目的基因的混合物整体转染的细胞显示所有6 个抗体都表达，如对来自转染后第34天的细胞的上清液进行抗原抗异 性ELISA检查所显示的(图10)。由于不同的结合亲和力，不能在抗 体的量方面对不同抗原的ELISA结果进行直接比较。然而，对来自a) 所述6个个体转染的CHO-Flp-In细胞系(如用(d.1)所描述的载体 制备物产生的)的上清液和b)对表达所述6个选择的目的基因的多克 隆细胞系的上清液进行的基于覆盖有羊抗小鼠kappa链抗体的捕获 ELISA表明在所述6个基因型中具有可比的抗体表达水平。
总的说来，已经表明将多克隆GOI整体地从噬菌体载体转移到哺 乳动物表达载体是可行的。这在之前已经由Sharon(US 5,789,208)描 述。此外，可用哺乳动物表达构建体的混合物整体地转染到哺乳动物 细胞中并且至少在转染后34天仍保持可比的频率。
实施例3A
估量细胞培养物中的多克隆性保存，所述细胞培养物由用mini six library整体转染的来自CHO-Flp-In细胞系的亚克隆产生。
(a)“起始”CHO-Flp-In细胞系的亚克隆
如(实施例3的e.1部分)所描述的培养起始CHO-Flp-In细胞系 (Invitrogen)。在胰蛋白酶化后，细胞计数并在96孔培养板上每个 孔中放入1个细胞。大约14天后鉴定具有单个克隆的20个孔，并且 将细胞用胰蛋白酶处理并转移到24孔板中。在鉴定生长行为特征以及 表达水平后，选择其中一个亚克隆CHO-Flp-In克隆019用于进一步研 究。
(b)CHO-Flp-In克隆019细胞的整体转染和选择
进行三次重复的转染，并且基本上如(实施例3，e.2和e.3部分) 所描述的对CHO-Flp-In克隆019细胞进行选择，除了在pSymvc21(图 4.e)中用新霉素选择标记取代潮霉素标记。从而，在细胞选择和培养 期间，用Geniticin(450μg/ml)取代潮霉素B。
(c)从CHO-Flp-In克隆019细胞中获得的样品的ELISA，所述 细胞已用mini six library进行整体转染。
所述细胞在转染后培养73天并且在第17天、31天、45天、59 天和73天对用于ELISA的样品取样。如(实施例3，f.2部分)所描 述的进行定量ELISA(使用分别纯化的mini six抗体作为标准)。图 12显示来自3个独立转染的结果。在不同的转染中观察到不同表达特 性。然而，到第59天在所有的实验中均检测到所有6种抗体。
(d)实验结论
针对CHO-Flp-In克隆019细胞使用新霉素选择系统的实验显示整 体转染两个月后仍较好地保持了单个批次的表达特征(图12)。这样 的稳定期间足以满足生产目的。通过在生产前产生和贮存单批次的大 量冰冻贮存物可解决所观察到的批与批之间的变化。
实施例3B
估量在细胞培养物中多克隆性的保存，所述细胞培养物是在选择 后混合个体转染的CHO-Flp-In细胞而产生的。
(a)CHO-Flp-In细胞的个体转染和选择
之前在(实施例3，e.3部分)中已经描述了产生所述表达mini six library中单个成员的6个细胞系的实验方法。在选择后立刻等量(每 个细胞系5x105)混合表达所述mini six library中单个成员的6个 细胞系并将混合的细胞群体培养85天。从所述单个细胞系分别制备三 个混合物。
(b)从产生于(a)的多克隆细胞培养物中获得的样品的ELISA
每两星期取样并且通过如(实施例3，f.2部分)所描述的ELISA 确定表达自所述mini six library的抗体组成。混合后在第8天、17 天、30天、45天、57天、72天和85天进行ELISA。图13显示所述 结果(三次重复实验的平均值±SD)。所有抗体在混合后第85天可检 测到。如前面提到的(实施例3，f.2部分)，所述不同抗体的读数不 能直接进行比较，但图13中展示的数据显示至少在混合后第45天仍 有相对稳定的表达特性，之后观察到产量总体下降。此外，从3个独 立混合物获得的结果比较显示：一段时间内所述mini six抗体有相似 的表达特性，表明结果是可重复的。
(c)实验结论
由细胞混合物组成的多克隆细胞培养物显示其组成能保持至混合 后至少45天，其中所述细胞用所述mini six library的不同成员单 个地转染。45天的组成保持期在大多数情况下足以满足生产目的。此 外，三次重复的实验给出了相似的结果，因此表明将用不同构建体单 个转染的细胞混合起来导致混合的细胞培养物具有较低的批与批之间 的变化。
实施例4
建立抗卵清蛋白重组多克隆抗体生产型细胞系
(a)表达抗卵清蛋白多克隆抗体组合物
如下鉴定已完全表征的卵清蛋白结合噬菌体克隆集合。用50μg 完全弗氏佐剂中的OVA通过腹腔注射和皮下注射免疫四只8周大小的 雌性BALA/C小鼠，并在免疫(第0天)后第21天和42天用不完全弗 氏佐剂中的OVA加强免疫，并确定所有动物具有血清转换为抗OVA， 这通过抗原特异性ELISA进行测量。在第31天和52天从具有最佳反 应的小鼠获取脾。如前面描述的使用噬菌体载体(Symvc10)从脾RNA 产生Fab展示噬菌体文库。最终产生的文库含有约106个独立克隆。 通过使5x1011个Fab展示噬菌体与覆盖在NUNC免疫管上的OVA反应对 这些文库进行选择，接着冲洗并用酸洗脱结合噬菌体。由于来自第一 轮筛选的洗脱物含有很大比例的OVA结合者，因此从来自第一和第二 轮筛选的洗脱物中筛选OVA结合噬菌体克隆。
最初，通过ELISA鉴定OVA反应性噬菌体克隆。简短地，用OVA 涂布ELISA板并用噬菌体展示Fabs与之反应，接着与HRP连接的第二 抗体反应。作为阴性对照，使用了无关的抗原(BSA)或无关的噬菌体 展示Fabs(抗AP)。
此外，建立基于将OVA固定在PVDF膜上的HDS方法。这两种方法 导致鉴定了不同的克隆亚类，一些克隆识别一个实验(set-up)中的 OVA而不识别另一实验中的OVA，反之亦然。对于通过ELISA或HDS 与OVA起反应的Fab展示噬菌体克隆，通过DNA测序对编码VH可变结 构域的核酸序列进行确定，并且使用Vector NTI软件包通过系统发生 分析对遗传多样性进行估算。最终获得的组包含127个OVA结合克隆， 所有这些克隆的VH可变部分的核酸序列都得以确定。
所有由所述127个OVA-结合克隆表达的Fab片段都具有与天然或 变性形式的卵清蛋白结合的能力。根据这个技术我们已经鉴定了大约 30个含于噬菌体载体例如pSymvc10中的不同克隆，用于整体转移和 哺乳动物表达。这些抗体以小鼠IgA、IgG2A或IgG2B抗体的形式表 达。因为我们已经完全鉴定了这些抗体产生克隆的DNA序列的特征， 所以我们能够在整体转移和哺乳动物表达过程中监控基因型的分布， 所用方法与用于如实施例3描述的具有所述6个不同抗体的模式系统 的方法相同。
(b)将OVA特异性抗体序列整体转移至用于哺乳动物表达的载体
从噬菌体载体将目的基因转移到表达载体有2个步骤(图4中说 明)，其中第一步是用具有头对头朝向的选择的哺乳动物启动子的启 动子盒进行启动子交换，这之后将目的基因的可变区和启动子盒转移 到表达载体上。使用SacI/XhoI消化接着连接，可将头对头启动子盒 (启动子A/启动子B)插入到各克隆中的噬菌体载体中，导致了从细 菌启动子与哺乳动物启动子(pSymvc12)的交换。
接着EcoRI和NotI的消化将把编码可变重链、头对头启动子盒(启 动子A/启动子B)和完整的kappa链的序列从噬菌体载体(pSymvc12) 移到同种型编码载体pSymvc20中。所述pSymvc20载体可接受任何来 自噬菌体载体的NotI/EcoRI片段。这个片段将把编码可变重链的序列 转移连接到pSymvc20上的恒定重链序列以及将整个编码kappa链的序 列与bGH PolyA序列连接。这个整体转移将产生如图1显示的表达载 体，所述载体在整体转移后表达作为小鼠IgG2B抗体的可变重链区和 整个kappa链。
所述载体pSymvc20含有IgA、IgG2A、IgG2B、IgE或IgG1基因 的小鼠重链恒定区，于是能够表达任何相关的目的小鼠免疫球蛋白同 种型。
(c)表达抗卵清蛋白重组多克隆抗体
通过整体转移，将编码重链可变区、启动子和完整kappa链的序 列从噬菌体载体文库移到同种型编码载体上，形成了多克隆哺乳动物 表达载体组合物。这之后通过转染和位点特异性整合整合到 CHO-Flp-In细胞系中，产生了重组多克隆抗体生产型细胞系。后者通 过将编码所述重组多克隆蛋白质的各成员的目的基因靶向整合到各转 染细胞基因组的相同特异性座位而产生，其中在同一时间只有一个拷 贝的含有所述核酸序列的表达构建体整合到各转染的细胞中。
所述细胞培养和转染和选择的方法与实施例3(e.1-e.3)描述的 相同。
(d)监控组合物的稳定性
为了确保整体转移和转染入哺乳动物细胞时不会在单个克隆之间 的克隆、表达和多样性方面引入差异，因此可以用下列方法监控整体 转移和哺乳动物表达的过程：
1)分析来自各转染构建体的细胞集合的传代时间，
2)分析来自各转染构建体的细胞集合的表达水平，
3)对单个细胞进行RFLP分析，
4)对产生的抗体混合物进行ELISA，
5)对产生的抗体混合物进行质谱分析，
6)使用V区特异性引物通过Taqman PCR(实时PCR)对确定的 批次大小进行分析以确定各不同克隆的比例，或
7)使用下列参数对一段时间内用和不用选择压力(潮霉素)培 养的批次进行分析：
a)克隆分布
b)蛋白质表达水平(数量和分布)
c)基因组稳定性
d)对无血清培养基适应性的影响
e)抗卵清蛋白重组多克隆抗体组合物的生产
重组多克隆抗体产生型CHO-Flp-In细胞系培养在不同的培养系 统中，包括传统的小培养瓶、Nunc多层细胞工厂和小型高产量生物反 应器(MiniPerm，INTEGRA-CELLine)。此外，使所述细胞系适应无血 清悬浮培养以随后在旋转瓶、中空纤维和生物反应器中培养。
用于生长选择的细胞系的培养基是如厂商(Invitrogen，B&D， Hyclone)推荐的无血清、无蛋白或化学成分确知的培养基。
收集培养在无选择(潮霉素)压力下的粘附的或悬浮的细胞的上 清液。如(3f)所描述的分析和鉴定收集的上清液的特性。细胞在补 料分批或灌流条件下生长期间或之后对其产生的抗体的产量、功能和 质量进行检测。悬浮生长的细胞用于更大旋转瓶或生物反应器接种。
纯化来自收集的上清液的多克隆抗体为以后在动物实验中使用。
从此处公开的本发明的说明书和实践来考虑，本发明的其它实施 方案和应用对本领域技术人员来说是显而易见的。也就是说所述说明 书和实施例仅被认为是作为例子的，下列权利要求表明本发明的真实 范围和精神。
序列表
<110>Symphogen A/S
<120>用于生产重组多克隆蛋白质的方法
<130>15685PCT00
<160>7
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>48
<212>DNA
<213>啤酒糖酵母
<400>1
gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttc 48
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>2
gcattgacag gaggttgagg c 21
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>3
gctgccgacc gctgctgctg gtc 23
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>4
gcattgacag gaggttgagg c 21
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>5
gtgtccactc tgaggttcag 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>6
caaatagccc ttgaccaggc 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>7
gtgtccactc tgaggttcag 20
进一步，本发明在所述多克隆蛋白质的生产中没有使用动物，因 此避开了与这种方法相关的伦理和临床上的难题。
发明简述
本发明提供了用于生产重组多克隆生产型细胞系的方法，所述重 组多克隆生产型细胞系用于生产重组多克隆蛋白质，所述蛋白质通常 选自免疫球蛋白超家族。多克隆抗体、多克隆T细胞受体或其多克隆 片段的生产是特别感兴趣的。本发明允许用于药物组合物的重组多克 隆蛋白质的商业生产。本发明的一个重要特征是：在生产过程中组成 多克隆蛋白质的个体分子的差异表达保持在不显著的水平，最小化了 不合需要的批与批之间的变化。
本发明的一个方面涉及生产目的重组多克隆蛋白质的方法，其中 所述多克隆蛋白质包括不同的结合特定抗原的成员或由其构成，所述 方法包括：a)提供了包含不同核酸序列文库的细胞集合，其中各所述 核酸序列编码所述多克隆蛋白质的不同成员并且各所述核酸序列整合 在所述细胞集合的各单一细胞的基因组的同一个单一位点上；b)在有 利于所述多克隆蛋白质表达的条件下培养所述细胞集合；和c)从所述 细胞培养物、细胞级分或细胞培养基中回收所述表达的多克隆蛋白质。
本发明的更进一步方面涉及产生适合作为重组多克隆生产型细胞 系的细胞集合的方法，所述方法包括：a)提供包含不同核酸序列群体 的载体文库，其中各所述载体包含1)一个单拷贝的编码多克隆蛋白 质不同成员的不同核酸序列，所述多克隆蛋白质包括结合特定抗原的 不同成员或由其组成和2)一个或多个重组酶识别序列；b)向宿主细 胞系引入所述载体文库，其中所述宿主细胞系的各细胞的基因组包含 重组酶识别序列，所述识别序列在其基因组的单一特定位点上并与载 体的重组酶识别序列匹配；c)确保所述细胞中一个或多个重组酶的存 在，从而使得步骤(a)中的不同核酸序列能在宿主细胞系的细胞中进 行位点特异性整合，其中所述一个或多个重组酶可以是I)导入所述 核酸序列的细胞表达的；II)由步骤a的载体有效编码的；III)通过 来自第二载体的表达提供的；或IV)作为蛋白质向所述细胞提供的； 和d)筛选包含来自所述不同核酸序列文库的经整合的拷贝的细胞。
在本发明的两个方法中，都应该理解所述多克隆蛋白质通常情况 下是那种与在其中实现表达的细胞天然不相关的蛋白质。
本发明描述几种将不同核酸序列文库导入宿主细胞系以产生适合 作为多克隆生产型细胞系的细胞集合的方法。这些方法包括使用文库 进行的细胞集合的整体转染、使用部分文库的等份细胞的半整体转染 或个体转染，在所述个体转染中使用文库的个体成员转染宿主细胞， 接着汇集通过选择得到的克隆。优选地本发明利用哺乳动物细胞(细 胞系或细胞类型)作为宿主细胞系。
在本发明的一个方面中，多克隆蛋白质的个体成员由成对的独立 基因片段编码。当所述个体成员由两条多肽链组成时，多克隆蛋白质 包括可溶性的或膜结合形式的抗体和T细胞受体。在本发明进一步的 实施方案中，一对基因片段编码抗体的重链和轻链可变区，或T细胞 受体的α链和β链可变区或T细胞受体的γ链和δ链可变区。
本发明进一步提供重组多克隆生产型细胞系，所述细胞系包含用 不同核酸序列文库转染的细胞集合，其中集合中的各细胞用所述文库 中的一个成员转染并且能表达该成员，所述成员编码结合特定抗原的 多克隆蛋白质的不同成员并且位于所述集合中个体细胞基因组的相同 单一位点上，其中所述核酸序列与集合中的所述细胞之间没有天然的 联系。优选地细胞系来自哺乳动物细胞系例如中国仓鼠卵巢(CHO)细 胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤细胞(例如，Sp2/0细胞，NS0)、 YB2/0、NIH3T3、成纤维细胞或永生化的人类细胞例如Hela细胞、 HEK293细胞或PER.C6细胞。不过也可以使用非哺乳动物真核或原核 细胞，例如植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、细菌、真菌等。
本发明也包括用于位点特异性整合的载体文库，所述文库包括天 然产生的各种核酸序列的群体，其中各所述载体包含1)一个拷贝的 编码结合特定抗原的多克隆蛋白质的不同成员的不同核酸序列和2) 一个或多个重组酶识别序列。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包括作为活性成分 的重组多克隆抗体(或其片段)或多克隆T细胞受体(或其片段)， 优选地通过本发明方法获得。所述组合物的重组多克隆蛋白质对预先 确定的疾病靶标具有特异性或反应性。这种药物组合物可用于在哺乳 动物例如人、家养动物或宠物中治疗、改善或预防疾病，例如癌症、 感染、炎性疾病、过敏反应、哮喘和其它呼吸疾病、自身免疫疾病、 免疫机能障碍、心血管疾病、中枢神经系统疾病、代谢和内分泌疾病、 移植排斥或不期望的怀孕。
定义
“蛋白质”或“多肽”是指任何氨基酸链，不管长度或翻译后修 饰。蛋白质可以单体或多聚体形式存在，多聚体包括两个或更多个组 装的多肽链、蛋白质片段、多肽、寡肽或肽。
如此处所使用的，术语“多克隆蛋白质”或“多克隆性 (polyclonality)”是指包含不同但是同源的蛋白质分子的蛋白质 组合物，优选地选自免疫球蛋白超家族。于是各蛋白质分子与所述组 合物中其它的分子同源，但也含有一个或多个可变多肽序列片段，其 特征在于多克隆蛋白质单一成员之间序列的差异。已知的这类多克隆 蛋白质例子包括抗体或免疫球蛋白分子、T细胞受体和B细胞受体。 多克隆蛋白质可能由确定的蛋白质分子亚类构成，所述蛋白质分子亚 类通过共同特征例如对想要的目的靶标的共同结合活性进行定义，例 如在针对想要的目的抗原的多克隆抗体的情况下。
术语“目的多克隆蛋白”包括确定的享有共同特征的多克隆蛋白 质亚类，例如对想要的靶标的结合能力，例如根据对目的抗原的结合 活性或特异性描述的多克隆抗体的情况下，所述抗原是一个或多个例 如分开的蛋白质、微生物、寄生虫、细胞类型、变应原或糖分子或可 能成为特定抗体的结合靶标的任何其它结构、分子或物质，或所述抗 原的混合物。
术语“重组多克隆蛋白质组合物的一个成员”或“重组多克隆蛋 白质的一个成员”是指蛋白质组合物中的一个蛋白质分子，所述蛋白 质组合物包含不同的但同源的蛋白质分子，其中各蛋白质分子与组合 物中的其它分子同源但也含有一个或多个可变多肽序列片段，所述可 变多肽序列片段以所述多克隆蛋白质的单一成员之间的氨基酸序列差 异为特征。
术语“可变多肽序列”和“可变区”可相互替换使用。
术语“重组多克隆蛋白质的不同成员”是指蛋白质组合物中的一 个蛋白质分子，所述蛋白质组合物包括不同的但同源的蛋白质分子， 其中各蛋白质分子与组合物中的其它分子同源，但也含有一个或多个 可变多肽序列片段，所述可变多肽序列片段以所述多克隆蛋白质的单 一成员之间的氨基酸序列差异为特征。
术语“抗体”描述血清的功能性组分并且通常指分子(抗体或免 疫球蛋白)集合或单个分子(抗体分子或免疫球蛋白分子)。抗体分 子能够结合到或与特定抗原决定簇(抗原或抗原表位)反应，这反过 来可以导致免疫效应物机能的诱导。单个抗体分子通常被认为是单特 异性的，而抗体分子组合物可以是单克隆的(即，由相同的抗体分子 构成)或多克隆的(即由不同的抗体分子构成，所述抗体与同一抗原 或甚至不同的抗原上存在的相同或不同的表位起反应)。各抗体分子 具有使其特异性结合到其相应的抗原的独特结构，并且所有天然抗体 分子具有相同的总体基本结构，即由两条一致的轻链和二条一致的重 链组成。抗体也总称为免疫球蛋白。此处所使用的术语抗体也包括嵌 合型的和单链抗体，以及抗体的结合片段(如Fab、Fv片段或scFV 片段)，以及多聚体形式例如二聚IgA分子或五价的IgM。
术语“多克隆抗体”描述了不同抗体分子的组合物，所述不同抗 体分子能与几种在相同或不同抗原上的不同特异性抗原决定簇结合或 反应。通常地，多克隆抗体的可变性被认为位于所谓的多克隆抗体可 变区。然而，在本发明上下文中，要理解多克隆性也描述单一抗体分 子之间存在于所谓恒定区上的差异，例如在包含二个或多个抗体同种 型例如人类同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，或鼠IgG1、 IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA的抗体混合物的情况下。
“重组目的多克隆抗体”描述确定的重组多克隆抗体亚类，所述 亚类是以其与想要的靶标或想要的一组靶标结合的能力为特征的，所 述靶标可以是例如分离的蛋白质、微生物、寄生虫、细胞、变应原或 糖分子，或能成为特异性抗体的结合靶标的其它结构、分子或物质， 或其混合物。
术语“免疫球蛋白”通常用作在血液或血清中发现的抗体混合物 的集体名称，但也可用用来称呼来自其它来源的抗体混合物。
术语“免疫球蛋白分子”表示单一抗体分子，例如作为免疫球蛋 白的一部分或任何多克隆或单克隆抗体组合物的一部分。
当提到多克隆蛋白质的成员与抗原结合时，此处是指具有结合常 数低于1mM的结合，优选地低于100nM，甚至更优选地低于10nM。
术语“不同目的核酸分子文库”用来描述共同编码“重组目的多 克隆蛋白质”的核酸分子集合。当用于转染时，不同目的核酸分子文 库包含于表达载体文库中。这类文库通常具有至少3、5、10、20、50、 1000、104、105或106个不同成员。
如此处所使用的术语“不同目的核酸序列的一个拷贝”并不能从 字面上理解为对应于单一基因片段的单一核酸片段，而是指产生一个 目的蛋白分子的所有亚基所需要的所有基因片段的一个拷贝，并且组 装成一个核酸分子例如载体。一些要求超过一个基因片段来产生目的 蛋白质的完整分子的例子包括B细胞受体、抗体和抗体的片段例如 Fab’s和可变结构域，或T细胞受体。当被导入细胞时，所述一起编 码完整组装的目的蛋白质的基因片段存在于同一个载体上，于是被连 接成一个核酸序列，可能成为在不同启动子控制下的分隔的转录元件。
此处所使用的术语“目的基因”，是指由一个或多个编码目的蛋 白质的一个成员的基因片段(基因组的或cDNA)组成的核酸序列。所 述复数形式的“目的基因”是指编码目的多克隆蛋白质的核酸序列文 库。术语“GOI”用作目的基因的缩写。
如此处所使用的术语“载体”是指核酸分子，所述核酸分子被其 它核酸分子插入以用于在不同遗传环境中进行转运和/或在宿主细胞 中表达。能在基因组中预先确定的、特定位置整合到宿主基因组中的 载体此处称为“位点特异性整合载体”。如果所述载体携带用于调控 插入载体的核酸序列转录的调控元件(至少合适的启动子)，所述载 体此处称为“表达载体”。如果表达载体能够在预先确定的特定座位 上整合到宿主细胞的基因组中，所述表达载体可称为“位点特异性整 合表达载体”。如果插入到上述鉴定的载体中的核酸序列编码此处定 义的目的蛋白质，可用下列的术语“目的载体”、“用于位点特异性 整合的目的载体”、“目的表达载体”和“用于位点特异性整合的目 的表达载体”。术语“同种型编码载体”是指携带编码同种型抗体的 核酸序列的载体。本说明书中，“噬菌粒载体”和“噬菌体载体”可 交换使用。术语“质粒”和“载体”可交换使用。本发明也包括这类 其它形式的载体，所述其它形式的载体具有同等功能，例如能够指导 想要的蛋白在合适的宿主中生产的质粒、噬菌粒和病毒基因组或任何 核酸分子。
术语“目的载体文库的各成员”用于描述具有不同核酸序列 的来自目的载体文库的单一载体分子，其中所述核酸序列编码目的重 组多克隆蛋白质的一个成员。
术语“整体转移”用于描述来自一个载体群体的目的核酸序列向 另一个载体群体的转移并且这样做可同时对各DNA进行转移而无需对 单一目的DNA进行分离。这样的载体群体可以是包含例如目的可变区、 启动子、前导序列或增强元件的文库。接着将这些序列无需预先分离 即可从噬菌体载体上转移到哺乳动物表达载体上。特别地对于抗体序 列来说，这种技术确保了VH和VL多样性之间的连接在将文库从例如选 择载体(例如噬菌体展示载体)转移到哺乳动物表达载体时不丢失。 因此初始的VH和VL配对被保留下来。
术语“转染”在此处用作将外源DNA导入细胞的广义术语。所述 术语也包括其它将外源DNA导入细胞的功能等同的方法，例如转化、 感染、转导或供体细胞和受体细胞的融合。
术语“选择”用来描述方法，所述方法中细胞获得某种特征，该 特征能使其从那些没有获得该特征的细胞分离出来。这类特征可以是 对细胞毒性因子的抗性或产生基本营养物、酶或颜色。
术语“可选择标记基因”、“选择标记基因”、“选择基因”和 “标记基因”用于描述与目的基因一起共导入细胞的编码可选择标记 的基因(例如赋予对某些细胞毒性药物例如某些抗生素以抗性的基因、 能产生在生长培养基上可以耗尽的基本营养物的基因、编码产生可分 析的代谢物的酶的基因或编码有色蛋白质例如可根据FACS分类的蛋 白质的基因)。
术语“重组蛋白质”用来描述用包含所述蛋白的编码序列的表达 载体转染的细胞系表达的蛋白质。
如此处所使用的，术语“有效地连接”是指将片段与另一个片段 连接，同时它们之间保持功能性关系。例如，如果编码信号序列的DNA 表达为参与多肽到内质网的转移的前导肽，则可认为其有效地连接到 编码该多肽的DNA上。此外，如果启动子或增强子刺激编码序列的转 录，则可认为其有效地连接到该编码序列上。
术语“大部分细胞个体”是指所述细胞的百分比，例如超过80％， 优选地超过85％，更优选地超过90％、95％，或甚至99％或更高。
如此处所使用的，术语“基因组”不是按字面上仅理解为存在于 细胞内的正常完备的染色体，还指能被导入并在细胞中维持的染色体 外组分。这类染色体外组分可包括但不限于微型染色体、YACs(酵母 人工染色体)、MACs(小鼠人工染色体)或HACs(人类人工染色体)。
术语“启动子”是指涉及与RNA聚合酶结合以启动转录的DNA区 域。
术语“头对头启动子(head-to-head promoter)”是指被置于非 常近距离的启动子对，以使由所述启动子驱动的两个基因片段转录以 相反的方向发生。头对头启动子也可以用两个启动子之间不相关核酸 的填充物来构建。这种填充物可以容易地含有超过500个核苷酸。
“抗生素抗性基因”是指编码克服抗生素对细胞的抑制或毒性影 响的蛋白的基因，从而在有抗生素存在的情况下确保细胞存活和继续 增殖。
术语“内部核糖体进入位点”或“IRES”描述不同于正常的mRNA 的5’帽子结构的结构。两个结构都可以被核糖体识别以开始扫描寻 找AUG密码子以起始翻译。通过使用一个启动子序列和二个起始AUG， 从单一mRNA可以翻译出第一和第二多肽序列。因此为了从单个双顺反 子mRNA共翻译第一和第二多核苷酸序列，所述第一和第二多核酸序列 可通过连接子序列进行转录融合，所述连接子序列包括能翻译IRES 序列下游多核苷酸序列的IRES序列。在这种情况下，转录出的双顺反 子RNA分子在其戴帽5’端和该双顺反子RNA分子的内部IRES序列都 可进行翻译，由此产生第一和第二多肽。
术语“可诱导表达”用来描述这样的表达，该表达的发生需要诱 导物分子与调控蛋白质的相互作用，或共阻遏分子从调控蛋白质上的 释放。
术语“组成型表达”是指通常不是可诱导的表达。
术语“重组酶”是指催化两个或多个重组位点之间重组的酶。可 在发明中使用的重组酶在特定重组位点催化重组，所述重组位点是由 特定重组酶识别的特定核酸序列。
术语“混杂(scrambling)”描述从单一细胞中表达二个或多个 多克隆蛋白质的不同成员的情形，所述多克隆蛋白质包含二个不同多 肽链，例如来自所述免疫球蛋白超家族。当所述单一细胞已在其基因 组上整合了超过一对基因片段时会产生这种情形，其中每对基因片段 编码所述多克隆蛋白质的不同成员。在这种情况下可产生从所述基因 片段表达的多肽链的非预期组合。这些多肽链的非预期组合可能没有 任何治疗效果。
术语“HH-VL链混杂”是上面定义的混杂的例子。在该例子中，VH 和VL编码基因片段构成了一对基因片段。当非预期的VH和VL多肽组合 从细胞中产生时，就出现了混杂，其中在所述细胞中，两个不同的VH 和VL编码基因片段对被整合入同一细胞中。此类混杂的抗体分子不太 可能保持原来的特异性，因此可能不具有任何治疗效果。
术语“重组多克隆生产型细胞系”是指用不同目的核酸序列的文 库转染的蛋白质表达细胞群体，其中一起组成重组多克隆生产型细胞 系的所述单一细胞只携带一个拷贝的不同的目的核酸序列，所述目的 核酸序列编码所述目的重组多克隆蛋白质的一个成员并且各拷贝整合 到各细胞基因组的相同位点。根据它们保留整合的不同目的核酸序列 拷贝的能力(例如通过抗生素选择)来选择组成重组多克隆生产型细 胞系的所述细胞。能组成这种生产型细胞系的细胞可以是例如细菌、 真菌、真核细胞(例如酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞，特别是永生 化的哺乳动物细胞例如CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤细胞(例 如Sp2/0细胞，NS0)、NIH 3T3、YB2/0和永生化的人类细胞例如HeLa 细胞、NEK293细胞或PER.C6。
术语“热点细胞系”中的“热点(hot spot)”是指所述细胞的基 因组中预先确立的座位，所述座位是被选择出来或产生的并且具有在 将表达载体整合到该座位上后高效转录整合的目的核酸序列的特征。
术语“差异(bias)”用于表示重组多克隆蛋白质生产中的现象， 其中所述多克隆载体、多克隆细胞系或多克隆蛋白质的组成由于随机 遗传突变、单一细胞之间增殖动力学的不同、不同表达构建体序列之 间表达水平的不同或DNA克隆效率的不同导致在一段时间内发生改 变。
术语“RLFP”是指“限制性片段长度多态性”，为一种方法，其 中用限制性酶切割后对凝胶上核酸片段迁移图谱进行分析。
术语“HDS”是指高密度筛选方法，在所述方法中将许多离散的分 子平行在膜上进行测试，这样就可以同时对大量的测试化合物进行筛 选找出具有给定活性的化合物。
如此处所使用的，“TaqMan PCR”是指Holland，P.M.等人，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：7276-7280(1991)中描述的基于TaqMan 体系的PCR检测。
术语“5’UTR”是指mRNA的5’非翻译区域。
术语“Pfu PCR”是指使用Pfu DNA聚合酶(从火球菌(Pyrococcus furiosus)中分离的)进行的PCR反应，使用所述Pfu DNA聚合酶是 因为它在已知的热稳定性聚合酶中具有最高保真度。
缩写词：“CMV”＝(人)细胞巨化病毒(Cytomegalo Virus)。“MSPSV” ＝骨髓增殖肉瘤病毒(Myeloproliferative sarcoma virus)。“AdMLP” ＝腺病毒主要晚期启动子。SV40 poly A＝猿病毒40聚腺苷酸化信号序 列。GFP＝绿色荧光蛋白。PVDF＝聚偏1，1-二氟乙烯。TcR＝T淋巴细胞受 体。ELISA＝酶联免疫吸附检测。LTR＝长末端重复。
附图描述
图1：“头对头启动子”表达载体的示意说明，所述表达载体包 含下列元件：Amp pro＝允许表达氨苄青霉素抗性基因的启动子。Amp＝ 氨苄青霉素抗性基因。pUC origin＝pUC复制起始位点。限制性酶切位 点：NotI和EcoRI。Promoter A/Promoter B＝包含前导序列(例 如CMV/MPSV)的头对头启动子盒。V Heavy＝编码GOI重链可变区的 序列。C Heavy Chain＝编码重链(例如小鼠IgG1或IgG2B重链恒定区 序列)恒定区的序列。R-B-globin pA＝兔β-球蛋白多聚A序列。 bGH polyA＝牛生长激素多聚A序列。V Kappa＝编码GOI可变kappa 的序列。C Kappa chain＝编码kappa链恒定区的序列。FRT site＝FRT 重组位点。Hygromycin＝编码潮霉素抗性的基因。SV40 poly A＝聚腺苷 酸化信号序列。
图2：单向表达的表达载体示意说明，所述表达载体包括下列组 成元件：Amp pro＝允许表达氨苄青霉素抗性基因的启动子。Amp＝氨 苄青霉素抗性基因。pUC ori＝pUC复制起始位点。Promoter A ＝包含 前导序列(例如AdMLP)的哺乳动物启动子。V Heavy＝编码GOI重链 可变区的序列。C Heavy Chain＝编码重链(例如小鼠IgG1重链恒定区 序列)恒定区的序列。hGH polyA＝人生长激素多聚A序列。bGH polyA＝ 牛生长激素多聚A序列。V Kappa＝编码GOI可变kappa轻链的序列。C Kappa＝编码kappa链恒定区的序列。FRT＝FRT重组位点。Hygromycin＝ 编码潮霉素抗性的基因。SV40 poly A＝聚腺苷酸化信号序列。hGH多 聚A和启动子A的序列可以被IRES结构取代。
图3：概述重组多克隆生产型细胞系产生和重组多克隆蛋白质产 生的流程图。1)说明整体转染策略；2)说明半整体转染策略和3) 说明个体转染策略。A)图解载体文库(水平线)，箭头表示载体分组。 在策略1中所述载体分入一大组，在策略2中它们被分入到较小组中 (半整体)，而在策略3中它们保持相互离散的状态(个体)。B)图 解转染，其中试管的数目取决于组成文库的载体的分组。C)图解选择 细胞，所述细胞已位点特异性地将GOI整合到所述宿主细胞基因组中， D)图解多克隆GOI文库母液的产生，将选择出来的组成所述整合文库 的细胞冰冻贮存。可任选地存储单一克隆或将克隆合并。E)图解生产 阶段的开始，此处将来自母液中的克隆融化(可以是单一的、来自转 较小分组或来自合并组)并且使之适应在悬浮液中生长。在筛选阶段 或本阶段，可使其适应在无血清培养基上生长。F)图解生产阶段，在 所述生产阶段所述多克隆细胞系被繁殖以接种入更大的生物反应器 (尽管没有说明，但也可以进行中间的接种步骤)。在策略2和3中， 该阶段为：所述多克隆细胞克隆母液不再保持为单一克隆或半整体分 组，而是合并成细胞集合，形成重组多克隆生产型细胞系。G)图解从 生物反应器生产获得的最终产品。在生产阶段之后，收获所述多克隆 蛋白质组合物以纯化产物和描述产物特征。
图4：说明哺乳动物表达载体产生的流程图。
(A)噬菌体载体pSymvc10的示意说明，所述载体携带编码GOI 成员的序列。P tac和P lacZ＝细菌头对头启动子盒。V Kappa＝编码 GOI可变kappa轻链的序列。C Kappa chain＝编码小鼠恒定kappa轻 链的序列。V Heavy＝编码GOI可变重链的序列。C Heavy Chain＝编 码恒定重链CH1结构域的序列。限制性酶切位点：EcoRI、NotI、SacI 和XhoI。cpIII＝噬菌体蛋白III。Amp pro＝允许表达氨苄青霉素抗 性基因的启动子。Amp＝氨苄青霉素抗性基因。pUC Ori＝pUC复制起始 位点。
步骤1：通过用SacI和XhoI进行限制性消化，所述细菌启动子 从pSymvc 10切下来并通过连接用哺乳动物启动子盒取代(B)取代， 所述哺乳动物启动子盒也是通过用SacI和XhoI进行限制性消化制备 而来。
(C)噬菌体载体pSymvc 12的示意说明，在用哺乳动物头对头启 动子盒交换后所述载体携带来自GOI的序列。Promoter A/Promoter B＝ 所选头对头启动子盒(例如CMV/MPSV)。V Kappa＝编码GOI可变kappa 轻链的序列。C Kappa chain＝编码小鼠恒定kappa轻链的序列。V Heavy＝ 编码GOI可变重链的序列。C Heavy Chain＝编码恒定重链CH1结构域 的序列。限制性酶切位点：NotI、SacI、XhoI和EcoRI。cpIII＝噬 菌体蛋白III。Amp pro＝允许表达氨苄青霉素抗性基因的启动子。Amp＝ 氨苄青霉素抗性基因。pUC Ori＝pUC复制起始位点。
步骤2：通过用EcoRI和NotI限制性消化pSymvc12，可从pSymvc12 上切下包含完整kappa、启动子盒和V重链的核酸片段并连接到同种 型编码载体例如pSymvc20，所述pSymvc20也是通过使用EcoRI和NotI 限制性消化制备，因此产生所述哺乳动物表达载体pSymvc21(E)。
(E)用于抗体表达的哺乳动物表达载体pSymvc21的示意说明， 所述载体具有来自GOI的可变重链和kappa区域。这个哺乳动物表达 载体包含下列组成元件：Amp pro＝允许表达氨苄青霉素抗性基因的启 动子。Amp＝氨苄青霉素抗性基因。pUC ori＝pUC复制起始位点。限 制性酶切位点：EcoRI和NotI。Promoter A/Promoter B＝所选头对 头启动子盒(例如CMV/MPSV)。V Kappa＝编码GOI的可变kappa轻链 的V Kappa序列。C Kappa chain＝编码哺乳动物恒定kappa轻链(例 如小鼠恒定kappa链)的序列。V Heavy＝编码GOI可变重链的V重 链序列。C Heavy Chain＝编码哺乳动物恒定重链(例如小鼠IgG1或 IgG2B恒定重链的序列)的序列。R-B-globin pA＝兔β-球蛋白多 聚A序列。bGH polyA＝牛生长激素多聚A序列。FRT site＝FRT重组 位点。Hygromycin＝编码潮霉素抗性的基因。SV40 poly A＝聚腺苷酸化 信号序列。
本质上，步骤1和2的顺序可以倒转，这样通过利用EcoRI和NotI 进行限制性消化将来自pSymvc10的片段从pSymvc10中切下，接着可 将其连接到同种型编码载体上例如pSymvc20，所述来自pSymvc10的 片段包含整个kappa、细菌启动子盒和V重链。接着通过利用SacI和 XhoI限制性消化pSymvc20并与SacI+XhoI消化的哺乳动物启动子盒 片段进行连接(类似于图4B)以对pSymvc20进行启动子交换。
图5：显示用质粒制备物1转化的TG1细胞中的基因型分布的柱 状图。Em 223-228分别表示具有编码抗β2-微球蛋白(抗-B2M)、抗 -碱性磷酸(抗-AP)、抗卵清蛋白(抗-OVA)、抗-因子VIII(抗-FVIII)、 抗-溶菌酶(抗-LYS)、抗-触珠蛋白(抗-HAP)的启动子的载体。 Em223-228是pSymvc10型的载体。由RFLP确定的片段图谱推出的个 体基因型的数目对应于拣出的菌落的总数中的个体菌落的数目。
图6：显示用质粒制备物2转化的TG1细胞基因型分布的柱状图。 Em 229-234分别表示具有编码抗β2-微球蛋白(抗-B2M)、抗-碱性 磷酸(抗-AP)、抗卵清蛋白(抗-OVA)、抗-因子VIII(抗-FVIII)、 抗-溶菌酶(抗-LYS)、抗-触珠蛋白(抗-HAP)的哺乳动物启动子 (CMV/MPSV)的载体。Em229-234是pSymvc12型的载体。克隆的数目 表示经观察具有与由该Em型(完整的序列分析未进行)的RFLP确定 的序列图谱相似的克隆的数目。
图7：显示用质粒制备物3转化的TG1细胞基因型分布的柱状图。 Em 235-240分别表示编码抗β2-微球蛋白(抗-B2M)、抗-碱性磷酸 (抗-AP)、抗卵清蛋白(抗-OVA)、抗-因子VIII(抗-FVIII)、抗 -溶菌酶(抗-LYS)、抗-触珠蛋白(抗-HAP)的小鼠IgG1哺乳动物表 达载体(包括兔β球蛋白聚腺苷酸化信号)。Em235-240是pSymvc21 型的载体。克隆的数目表示经观察具有与由该Em型(完整的序列分析 未进行)的RFLP确定的序列图谱相似的克隆的数目。
图8：显示TG1细胞基因型分布的柱状图，所述细胞用双酶消化/ 连接质粒制备物进行转化(在质粒制备物1步骤之后整体转移到哺乳 动物表达载体中而不需在大肠杆菌中进行DNA扩增)。
图9：显示用编码六个目的基因的哺乳动物表达载体的混合物转 化(A)16天和(B)34天后的CHO-Flp-In细胞的基因型分布的柱状 图。
图10：来自转染后34天的CHO-Flp-In细胞的上清液的抗原特异 性ELISA，所述细胞用编码六个目的基因的表达载体混合物进行整体 转染。
图11：来自转染后34天的CHO-Flp-In细胞合并物的上清液的抗 kappa涂布ELISA，所述细胞用编码一个目的基因的单一表达载体或编 码六个目的基因的表达载体混合物进行转染。
图12：来自转染后17、31、45、59和73天的CHO-Flp-In克隆 019的上清液的定量抗原特异性ELISA，所述细胞用编码六个目的基因 的表达载体混合物进行整体转染。A、B和C表示三个不同的转染实验。
图13：来自混合后8、17、30、45、57、72和85天后的CHO-Flp-In 细胞培养物的上清液的抗原特异性ELISA，所述混合是表达mini six library的单一成员的CHO-Flp-In细胞系的混合。结果显示为三个独 立实验的平均值±SD。
发明详述
重组多克隆蛋白质表达体系
本发明提供了用于稳定生产重组多克隆蛋白质的方法，所述重组 多克隆蛋白质优选地选自免疫球蛋白超家族，具有免疫球蛋白类似结 构域的蛋白质家族。大多数所述成员涉及细胞表面识别作用。序列同 源性表明抗体、T细胞受体、MHC分子、某些细胞粘连分子和细胞因子 受体具有相近的的同源性。特别地，根据本发明含有可变区的这个家 族成员适合于产生重组多克隆蛋白质。这类成员包括抗体、膜结合抗 体(B细胞受体)、Fab片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、T细 胞受体(TcRs)、可溶性TcRs、TcR可变结构域片段、通过多肽连接 子连接的TcR可变结构域片段或其它抗体或TcR衍生片段。特别地， 可以预期本发明可能用于大规模生产和制造包括重组治疗性多克隆抗 体或TcRs的新一类治疗剂。
本发明生产方法的一个主要有利方面是组成所述重组多克隆蛋白 质的所有成员可以在1个至约10个生物反应器或其等同物中生产。进 一步，所述重组多克隆蛋白质组合物能以单一制备物从所述反应器中 纯化而不需在所述过程中将组成所述重组多克隆蛋白质的单一成员分 离出来。相反，如果有人希望通过混合纯化的单克隆抗体(例如在 WO91/16074中提出的)以模拟重组多克隆抗体混合物，将需要把待包 括在组合物中的各抗体分别在生物反应器中生产，并且很有可能也要 将所述抗体单独纯化。与此处描述的生产重组多克隆抗体或其它多克 隆蛋白质的方法相比，这样的单克隆抗体混合物生产将是非常费钱费 时费空间的。于是，如WO91/16074中所描述的方法导致对包括在混合 物中的单克隆抗体的数目的实际限制，很可能低于10，而此处描述的 技术通常可以生产具有所想要的许多单一成员的多克隆抗体。
为了获得来自重组多克隆生产型细胞系的重组多克隆蛋白质的可 预期表达，应该对基因组整合位点的调控特性进行相当详尽地了解。
使用随机整合的传统的转染和重组蛋白表达技术对生产重组多克 隆蛋白质是不理想的，因为这个方法的随机性本质将导致所述整合的 核酸序列的位置和数目在不同细胞间发生变化。于是，如果通过这种 传统方法生产重组多克隆蛋白质，可能导致具有对多克隆蛋白质单一 成员的不同表达速率的异质细胞培养物和由于所述整合的DNA的位置 效应造成的遗传不稳定性。这将很可能导致组成所述多克隆蛋白质的 成员的差异表达。
因此需要将其引入预定的基因组位点，这原则上可以通过同源重 组来实现。然而，由于非常规重组事件占据主导地位，因此，同源重 组的效率是非常低的。
此外，当所述多克隆蛋白质是抗体或T细胞受体(TcR)时，使用 传统的导致随机整合的转染方法产生另一个问题。抗体和TcRs由成对 的独立基因片段编码，即抗体由轻链和重链编码序列编码，而TcRs 由α和β链或δ和γ链编码序列编码。来自这些基因片段的多肽产物 在抗体分子或TcR的细胞内加工过程中共价连接起来。导致随机整合 的传统转染技术导致将数个拷贝的不同重链和轻链或α和β链导入同 一个细胞，这导致重链和轻链的随机组合，即所谓的VH-VL链混杂或α -β链混杂。结果，这损害了所述表达的抗体或TcRs的性能，造成亲 亲和力和/或特异性的丢失、可能的新特异性和/或减小的特异性活性 的发生。
为了克服这些问题，本发明的表达体系使用位点特异性整合到单 一宿主细胞的基因组中。本发明的体系确保包含所述不同目的核酸片 段的目的载体文库通过重组酶介导的盒式交换方法插入到预知特征的 染色体座位上，由此产生细胞系，其中单个细胞表达所述重组多克隆 目的蛋白的单个不同成员。如下面所描述的，在某些组成重组多克隆 生产型细胞系的细胞中可能发生多处整合。然而，只要大部分细胞个 体表达所述重组多克隆蛋白质的单个不同成员，这就不成其为一个问 题。
可使用重组酶例如Cre、Flp、β-重组酶、Gin、Pin、PinB、PinD、 R/RS、λ整合酶或噬菌体ФC31整合酶。用于整合到所述染色体座位 的合适整合酶可以通过以下方式提供：(i)表达自细胞自身的基因组， 所述基因组导入了所述核酸序列，(ii)由插入到细胞的核酸序列有 效地编码，(iii)表达自第二核酸分子或(iv)作为蛋白。在优选的 实施方案中，包含在所述目的载体中的不同核酸序列整合到介导目的 核酸序列高水平转录和表达的座位(所谓的“热点”)。
所使用的宿主细胞系优选地是包含这些通常用作生物药物蛋白质 表达的哺乳动物细胞系，例如CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤 细胞(例如Sp2/0细胞，NS0)、YB2/0、NIH 3T3和永生化的人类细 胞例如HeLa细胞、HEK293细胞或PER.C6。在本发明中使用了CHO细 胞。然而本领域普通技术人员能很容易地用所述其它哺乳动物细胞取 代CHO细胞，或甚至使用其它类型的细胞，包括植物细胞、酵母细胞、 昆虫细胞、真菌和细菌。于是细胞类型的选择不会限制本发明。在优 选的实施方案中，含有预知特征的热点、介导重组目的多克隆蛋白质 高水平表达的哺乳动物细胞被用于生产。
在本发明进一步实施方案中，利用宿主细胞中的同一个染色体整 合位点将不同目的核酸序列以位点特异性方式进行整合。这种单一特 异性位点的整合最大限度地减小了位置效应，而所述位置效应可以在 用随机整合或基因组上多个位点整合的情形下观察到。特别地，当表 达由超过一个多肽链组成的多克隆蛋白质时具有用于在基因组中进行 位点特异性整合的单个位点是更有用的。这是由于如果单一细胞表达 超过一个整合物就可能在其亚基中发生混杂。
在位点特异性整合体系中，所述单一宿主细胞表达大体相同的蛋 白质结构，但是在重组多克隆目的蛋白的可变区上存在不同，例如抗 体或TcRs的抗原结合区。因此，在这类细胞集合内的大部分细胞对于 生产率和遗传稳定性应该显示出类似的特征，并且因此这个技术提供 了控制重组多克隆蛋白质例如重组多克隆抗体或TcRs生产的可能性。
本发明的重组多克隆蛋白质意欲覆盖包含不同的、但同源的蛋白 质分子的蛋白质组合物，所述蛋白质分子是天然可变的，意思是，在 优选的实施方案中，不同核酸构成的文库包含天然发生的多样性。于 是，各蛋白分子与所述组合物中的其它分子同源，但也含有一个或多 个可变多肽序列片段，所述可变多肽序列片段的特征在于所述多克隆 蛋白质的单一成员间的氨基酸序列差异。组成所述可变多肽序列的氨 基酸序列上的差异可能小到一个氨基酸。优选地氨基酸序列上的差异 超过一个氨基酸。
通常地，多克隆抗体或TcR的天然可变性被认为位于所述多肽链 的所谓的可变区或V区。
在本发明的一个方面，多克隆蛋白质的单一成员包含接近80到 120个氨基酸长度的可变区。所述可变区可能含有超可变结构域，例 如互补决定区(CDR)。
在天然发生的TcRs中，在各可变区存在4种CDRs。在天然发生 的抗体重链上存在3种CDRs，在轻链上存在3种CDRs。
在本发明的另外方面，所述多克隆蛋白质的单一成员的可变区含 有至少一个超可变结构域，所述超可变结构域长度在1和26个氨基酸 之间，优选在4个和16个氨基酸之间。这个超可变结构域可对应于 CDR3区域。对于抗体，各可变区优选地组成3个超可变结构域。这些 可对应于CDR1、CDR2和CDR3。对于TcRs，各可变区优选地组成4个 超可变结构域。这些可对应于CDR1、CDR2、CDR3和CDR4。超可变结 构域可能独自构成在本发明的重组多克隆蛋白质的可变区内的可变序 列。
在本发明的上下文中，应该理解多肽序列的可变性(多克隆性) 也可以描述位于所谓的恒定区或所述抗体多肽链的C区的单一抗体分 子之间的差异，例如在含有2个或多个不同抗体同种型的抗体混合物 的情况下(例如人同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2， 或鼠同种型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA)。于是，重组多克隆 抗体可以包含以单一抗体之间在可变区(V区)或恒定区(C区)或这 两个区域的序列差异为特征的抗体分子。
为了提供编码与特定抗原结合的蛋白的不同核酸序列，可使用许 多本领域已知的方法。一般，本发明将受益于使用能鉴定和/或分离编 码与特定抗原结合的蛋白的核酸的筛选方法。几种这类方法包括所谓 的生物筛选步骤(biopanning step)，可获知于技术例如噬菌体展示 技术(Kang，A.S.等人，1991.Proc Natl Acad Sci USA 88，4363-4366)、 核糖体展示(Schaffitzel，C.等人，1999.J.Immunol.Methods 231，119-135)、DNA展示(Cull，M.G.等人，1992.Proc Natl Acad Sci USA 89，1865-1869)、RNA-肽展示(Roberts，R.W.，Szostak，J.W.，1997. Proc Natl Acad Sci USA 94，12297-12302)、共价展示(WO98/37186)、 细菌表面展示(Fuchs，P.等人，1991.Biotechnology 9，1369-1372)、 酵母表面展示(Boder，E.T.，Wittrup，K.D.，1997.Nat Biotechnol 15，553-537)和真核病毒展示(Grabherr，R.，Ernst，W.，2001.Comb. Chem.High Throughput.Screen.4，185-192)，本领域都公知的方 法并且所有方法都在实践本发明中具有帮助。FACS和通过使用标记抗 原的磁珠分选也可应用于富集(筛选)目的。免疫检测测试例如ELISA (Dreher，M.L.等人，1991.J.Immunol.Methods.139，197-205) 和ELISPOT(Czerkinsky，C.C.等人，1983，J.Immunol.Methods. 65，109-21)也可在生物筛选步骤之后使用或单独使用。
重组目的多克隆蛋白质组合物包括确定的蛋白质亚类，所述蛋白 质亚类通过共同特征来定义，例如对想要的靶标的共有结合活性，例 如在多克隆抗体对想要的目的抗原的情况下。一般地多克隆蛋白质组 合物具有至少3、4、5、10、20、50、100、1000、104、105、或106 个截然不同的成员。在多克隆蛋白质组合物中所需要的不同成员的数 目将取决于所述靶标的复杂性。在抗体的情况下，靶向抗原的复杂性 将影响所述多克隆抗体组合物中所必需的截然不同的成员的数目。对 于小的或不十分复杂的靶标例如小蛋白，包含3到100个不同成员的 多克隆抗体组合物就足够了，并且优选地不同成员的数目不超过90 个或甚至80或70个。在许多情况下，不同成员的数目不超过60或 50个，并且优选地不同成员的数目在5和40个之间，例如在5和30 个之间。而对于更复杂的靶标，例如具有复杂或可交换表面蛋白、或 包含数个病毒亚型的病毒，包含20到500个不同成员的多克隆抗体组 合物就足够了。对于非常复杂的靶标(其中抗原包含许多不同分子)， 可能要求包含50到10,000个不同成员的多克隆抗体组合物。
在哺乳动物中有数种天然发生的多克隆蛋白质的已知例子，所述 多克隆蛋白质有自由地在血液中循环的例如抗体或免疫球蛋白分子， 或存在于细胞表面的例如T细胞受体和B细胞受体。在某些哺乳动物 中，通过对编码这些蛋白质可变区的基因进行遗传重组可获得这些天 然发生的多克隆蛋白质的多样性。进一步知道抗体通过体细胞突变增 加其多样性。通过分离负责所述多样性(例如免疫球蛋白分子或TcRs 的可变结构域或CDR区)的序列和从其产生文库，本发明可利用这些 天然多样性。对由两个独立基因片段编码的蛋白质，例如抗体可变重 链和可变轻链，TcRα链和β链或TcRδ链和γ链，文库中的各载体 将组成这些可变区的编码序列对。可变区的编码序列对文库的产生在 本领域是熟知的。
包含天然发生的多样性的文库是例如组合文库(可变区的编码序 列随机配对)和关联配对文库(来自同一细胞的可变区的编码序列配 对)。从分离的CDR基因片段进一步产生的文库也可用于本发明，其 中所述片段整合到合适的架构区中(例如Soderlind，E.等人，2000. Nat.Blotechnol.18，852-856)例如抗体或TcR可变区。优选地筛 选所述文库以获得具有想要的特异性的亚文库(目的文库)。
蛋白质的多样性也可能通过人工方式获得，例如合成或通过突变。 突变可以是随机的或编码单一蛋白质的核酸序列的定点突变，由此产 生所述单一蛋白的多克隆群体。产生人工抗体文库的另一个例子描述 于EP 0 859 841，该方法基于产生能与另外的CDRs文库组合的可变 区架构文库的方法。
在本发明优选的实施方案中，所述重组多克隆蛋白质是重组多克 隆抗体或抗体片段。
在本发明另一个优选的实施方案中，所述重组多克隆蛋白质是重 组多克隆TcR或TcR片段。
除了通过在所谓的可变区内的遗传和体细胞重组获得的多样性 外，还有根据重链定义的不同同种型的免疫球蛋白。主要的同种型是 IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。
本发明的重组多克隆蛋白质因此也能由不同同种型或更优选的不 同亚类组成。免疫球蛋白的多克隆性可发生在所述免疫球蛋白分子的 恒定部分或可变结构域，或同时发生在恒定部分和可变结构域。
对于抗体的治疗性应用，所谓的恒定区(特别是抗体的重链)中 的多克隆性是令人感兴趣的。各种免疫球蛋白的同种型具有不同的生 物学功能(总结于表1)，当使用抗体用于治疗时所述各种免疫球蛋 白的同种型可能进行合适的组合，因为免疫球蛋白的不同同种型会涉 及到天然免疫应答(Canfield和Morrison 1991.J.Exp.Med.173， 1483-91；Kumpel等人，2002.Transfus.Clin.Biol.9，45.-53； Stirnadel等人，2000.Epidemiol.Infect.124，153-162)的不同 方面。
表1：人免疫球蛋白同种型的生物学功能 人免疫球蛋白 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgA1 IgA2 IgM IgD IgE 经典补体活化 +++ ++ ++++ + - - ++++ - - 替代性补体活化 + + + +++ + - - + - 胎盘转移 + ++ + ++ - - - - - 细菌裂解 + + + + +++ +++ + ？ ？ 巨噬细胞/其它 吞噬细胞结合 + - + + + + - - - 肥大细胞/嗜碱 性粒细胞结合性 - - - - - - - - - 葡萄球菌蛋白质 A反应性 + + - + - - - - -
本发明的进一步实施方案是重组的多克隆生产型细胞系，所述细 胞系包含用不同核酸序列构成的文库转染的细胞集合，其中所述集合 中各细胞用所述文库中的一个成员转染并能表达该成员，该成员编码 与特定抗原结合的多克隆蛋白质的不同成员并且位于所述集合中细胞 个体基因组中的相同单一位点，其中所述核酸序列不是天然地与所述 集合中的细胞相关。
在上述实施方案的附加实施方案中，所述编码多克隆蛋白质(优 选地来自免疫球蛋白超家族)的不同核酸序列全都来自天然存在的序 列，例如从供体中分离。
WO 02/44361已描述了含有不同核酸的细胞组合物，所述核酸位 于各细胞内基因组的单一特异性位点。这篇文献公开了使用细胞鉴定 具有想要特性的分子的方法，但该文献没有涉及提供生产体系或提供 以特异性结合抗原为特征的多克隆蛋白质。
克隆多样性
多克隆蛋白质的特征之一是它由许多单一蛋白质分子组成，其中 各蛋白分子与所述多克隆蛋白质的其它分子同源但仍具有可变性，所 述可变性是以所述多克隆蛋白质的单一成员之间氨基酸序列的差异为 特征的。优选地，所述差异限于所述多克隆蛋白质总体结构的独特区 域。这类区域是例如抗体或TcR的可变区，并且可能进一步地限于这 些区域的CDR区。这种可变性也可以描述为多样性，可在核酸和蛋白 质功能两个水平上(例如对靶标的特异性和亲和力差异上)对所述多 样性进行鉴定。
通过对来自表达重组多克隆蛋白质的细胞集合的分离克隆使用 RFLP(或(RT)-PCR产物测序)可以对所述细胞系的克隆多样性进行 分析。也可通过对由所述细胞系产生的重组多克隆蛋白质进行功能检 测(例如ELISA)来分析所述多样性。
克隆差异性(即组成多克隆抗体的单一抗体含量的逐渐变化)， 如果存在，可通过比较用于转染的起始文库的克隆多样性与表达所述 多克隆蛋白质的细胞(细胞系)集合中发现的多样性而进行估计。
由细胞系表达的多克隆蛋白质的克隆多样性可估算为所述多克隆 蛋白质的靶标覆盖。在这种情况下，当接近25-100％的想要的目的分 子被所述的多克隆蛋白质结合，则可认为获得了足够的多样性。例如 在多克隆抗体的例子中，抗体与至少25％的目的抗原表面上的非一致 抗原表位结合，则在组合物中提供了足够的多样性。优选地，由靶标 覆盖确定的克隆多样性至少是50％，而且甚至更优选的是至少75％。对 于抗体，这种靶标覆盖能例如通过表位作图进行估计。
做为选择地，克隆多样性可估计为所述多克隆组合物的单一成员 的分布。这种分布可以被估计为：与转染期间最初导入到所述细胞系 的不同编码序列的数目相比，在所述最终多克隆蛋白质组合物中不同 的单一成员的总数。在这种情况下，当至少50％并且优选地至少75％ 的应用于转染的编码序列被鉴定为所述最终多克隆蛋白质的不同单一 成员时，可认为获得足够的多样性。
所述多克隆组合物的单一成员的分布也可以被估计为所述单一成 员间的相互分布。在这种情况下，如果没有所述组合物的单一成员组 成超过最终多克隆组合物中单一成员总数的75％，就认为获得了足够 的克隆多样性。优选地，没有单一成员超过50％、甚至更优选的25％ 和最优选的10％的最终多克隆组合物的单一成员总数。通过RFLP分析、 序列分析和蛋白分析(例如后面描述的用于确定多克隆组合物特征的 方法)进行基于多克隆组合物中单一成员分布的克隆多样性估计。
克隆差异可能导致克隆多样性的减少，所述克隆差异会产生于a) 克隆过程中，b)作为细胞增殖变化的结果，或c)通过多个整合子的混 杂。如果这种差异产生，通过对此处描述的方法进行较小的改变就可 轻易地挽回每个这种来源的克隆多样性丢失。
为了限制由于将可变结构域克隆到合适的载体上引起的差异，可 设计从一个载体到另一个载体的目的基因转移以限制克隆的差异。整 体转移技术和精心选择用于扩增的大肠杆菌可减少所述克隆差异。另 一个可能性是在本发明的载体间进行各多聚核苷酸的单一转移，所述 多聚核苷酸编码所述多克隆蛋白质的单一成员。
有可能在较长的一段时间内，细胞系内单一细胞的细胞增殖速率 的变化能将差异引入到所述重组多克隆蛋白质的表达中，增加或减少 由细胞系表达的重组蛋白质的某些成员的存在。这种增殖速率变化的 一个原因是构成用于初始转染的起始细胞系的细胞群体是异质性的。 已知细胞系中单一细胞经较长的时间后会差异生长。为了确保更同质 的起始材料，通过使用限制性稀释所述细胞系到单一细胞水平并将各 单一细胞培养成新的细胞群体(所谓的由限制性稀释进行的细胞亚克 隆)以在用目的文库转染前对细胞系进行亚克隆。然后基于其繁殖和 表达特性选出一个或多个这样的细胞体作为起始材料。
更进一步，用于确保只有那些接受位点特异性整合的细胞才能存 活的选择压力可能会影响多克隆细胞系内单一细胞的繁殖速率。这可 能是由于为了适应所述选择压力经受某种遗传改变的细胞的偏好导致 的。于是，选择标记的选择也会影响繁殖速率引起的差异。如果这种 情况发生，应该对不同的选择标记进行测试。在一些情况下，如果选 择是基于对细胞有毒害的物质，应当细致地测试最优浓度以及选择是 否在整个生产时期中都是必需的还是仅在开始阶段需要。
另一个确保良好限定的细胞群体的方法是在转染和选择过程后使 用荧光激活细胞分选(FACS)。荧光标记抗体能用来富集高产的细胞， 所述细胞来自用IgG构建体转染的细胞集合(Brezinsky等人，J.2003. Immunol Methods 277，141-155)。这个方法也可以用于分选表达相 似水平的免疫球蛋白的细胞，由此产生在生产率上均一的细胞群体。 同样，通过使用用荧光染料5，6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯 (CFSE)标记，通过FACS方法可选择出显示有相似繁殖速率的细胞。
甚至当繁殖速率引起的差异确定发生了，单一成员的损失或过度 呈现可能不一定是重要的，这取决于所述最终重组多克隆蛋白质产物 的多样性要求和一段时间内多样性的稳定性。
在位点特异性单一整合体中，所述细胞只在要表达的抗体的可变 区序列上有差异。因此，由整合位点和基因调节元件不同施以的不同 细胞影响被消除并且对细胞繁殖速率只有最小程度的影响。混杂和多 位点整合都不可能在所述生产型细胞系的繁殖速率上产生问题，因为 这些是稀有事件。随机整合通常以接近10-5的效率发生，而位点特异 性整合则以接近10-3的效率发生。如果多位点整合意外地产生了问题， 可选择的方法是重复用目的载体文库转染，因为所述事件再发生的可 能性非常小，如上面所描述的。另一个替换方法在下面的实施例3中 进行描述。
另一个控制不合需要的克隆差异的方法是将整个目的载体文库分 成几个亚群进行转染或在转染较早的时间点上将所述细胞群分成几个 亚群。在这点上，差异应当还不明显并且在统计学上应当有可能获得 缺少具有不合需要的繁殖优势的亚群。作为结果的不合需要的克隆的 排除必需满足最终重组多克隆蛋白质产物多样性的要求。从统计学上 考虑，大量细胞的整体转染也组成了克服不想要的克隆差异的方法。 在这个方法中，用不同核酸序列构成的文库整体转染宿主细胞系。这 样的文库构建了所述文库的各不同成员的众多拷贝。这些拷贝应该优 选地整合到大量的宿主细胞中。优选地用不同核酸序列构成的文库的 多拷贝不同成员对至少100、1000、10000或100000个单独的细胞进 行转染。于是，如果不同核酸序列构成的文库由1000个各自被整合到 1000个单独的细胞中的独特成员构成，那么从转染中应当产生106个 含有位点特异性整合的GOI的克隆。通过这种方法，单一细胞倍增速 率的高斯浅型将只以非常小的程度影响整个群体。这将增加随着时间 流逝保持克隆组合物恒定的概率，即使低百分比的所述生产型细胞展 现异常的生长和/或表达特性。
做为选择地，目的载体文库可以被分成含有大约5到50个所述文 库的单一载体的部分。优选地，所述文库的一部分构成10到15个单 一载体。接着将各部分转染到等份细胞中。接着让所述各等份细胞经 过一段时间以观察它们中任何一个是否发生克隆差异。如果发生，在 将剩下的等份细胞汇集起来重建细胞集合前将这种等份细胞除去。任 选地，在整个生产过程中所述等份细胞保持分离，并且所述多克隆抗 体组合物是通过组合每个等份物的产物形成的，而不是通过在生产前 将等份细胞组合起来。可以操作的汇集体的数目预期在5到10个之间 (参见之前对单克隆抗体的描述)。
做为选择，可以实施高通量方法，在所述高能量方法中用载体分 别转染细胞，细胞基于来自所述目的载体最初文库的单一克隆而选择。 这将在转染和整合期间消除任何可能的序列差异。任意地，可以确定 单一转染子的基因型并且如果合适可以刚好在生产前或更早时候组合 出充分多样性的细胞集合。作为选择，当在生产多克隆蛋白质前将单 独转染的细胞汇集时，大量细胞的单独转染(产生具有不同核酸序列 构成的文库的独特成员的许多克隆)会产生与整体转染相同的统计学 上的有利方面。
宿主细胞
合适的宿主细胞在其基因组区域包含一个或多个适合的重组位 点，即被一个或多个重组酶识别的核酸序列。为能选择整合子，(即 在整合位点上整合了目的核酸序列拷贝的细胞)，将重组位点有效地 连接到位于所述整合位点3’的第一个选择基因(例如抗生素抗性基 因)。此外，弱启动子(例如截短的SV40早期启动子)和转录起始密 码子可以位于组成抗性标记-编码区域的整合部位的重组位点的5’。 于是，在用编码所述多克隆蛋白质的表达载体的文库转染之前，所述 转录起始密码子在宿主细胞内启动所述选择基因的转录。
如上面描述的用于位点特异性整合的宿主细胞可从能将DNA整合 到其染色体或保留染色体外组分例如微型染色体、YACs(酵母人工染 色体)、MACs(小鼠人工染色体)或HAC(人类人工染色体)的任何 细胞中产生。在WO97/40183中详细描述了MACs和HACs，此处引用作 为参考。优选地使用哺乳动物细胞例如CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、 骨髓瘤细胞(例如Sp2/0或NS0细胞)、成纤维细胞例如NIH 3T3和 永生化的人类细胞例如HeLa细胞、HEK293细胞或PER.C6。然而也可 以使用非哺乳动物真核细胞或原核细胞，例如植物细胞、昆虫细胞、 酵母细胞、真菌、大肠杆菌等。
在本发明的一个实施方案中，通过进行所谓的限制性稀释将细胞 系稀释到单个细胞水平，接着在用目的表达载体文库转染前将单个细 胞培养成新的细胞群体，来对用作起始材料的细胞系进行亚克隆。如 果需要，这种亚克隆也可在以后选择适合的细胞系过程中进行。
通过用随机整合的质粒转染可获得用于位点特异性整合的宿主细 胞，所述质粒包含弱启动子(例如截短的SV40早期启动子)、转录起 始密码子、位于所述起始密码子3’的重组位点。优选地，所述整合 质粒也包含与第一个选择基因连接的标记基因。这种整合质粒的一个 例子是来自Invitrogen(Carlsbad，CA)的pFRT/LacZeo2。所述标记 基因可用来估计用于插入目的核酸的基因组位点的相对表达强度。可 将标记基因(例如β-半乳糖苷酶(LacZ)、绿色荧光蛋白(GFP)或 细胞表面标记)以融合基因的形式或通过IRES(内部核糖体进入位点) 转录性地连接到第一个选择基因上，以使第一个选择基因和标记基因 共表达。选择基因与标记的组合使用是确保在基因组内保持所述整合 质粒的高产型细胞的有效方法，所述选择基因对细胞建立起生存压力 (例如药物抗性或营养损耗)，所述标记允许估计从细胞系到细胞系 的相对表达水平。具有重组序列的细胞将导致所述标记基因例如GFP 或LacZ的高度表达，其中所述重组序列插入到具有显著转录活性的位 点上。通过荧光激活的细胞分选(FACS)选择高表达者并进行克隆。 这时也应该分析所述整合子是否是单一整合子。这可以通过实时PCR 和Southern印迹法进行分析。
另一个用于估计来自用整合质粒转染的细胞的相对表达水 平的方法是对如上面描述所产生的细胞进行额外的整合-切除步骤。再 用编码对应于所述整合质粒重组位点的重组酶的质粒和第二质粒转染 这一所选的细胞集合，所述第二质粒含有不具有起始密码子的第二选 择标记，在第二选择标记的编码区之前是同样对应于第一整合质粒的 重组序列。这个第二质粒也含有编码荧光标记蛋白质(例如哺乳动物 启动子驱动的GFP(或同等荧光蛋白))的序列。重组酶介导这种质 粒整合到宿主细胞基因组上，在此之前已通过整合质粒将类似的重组 序列插入到所述宿主细胞基因组中。具有插入在具有显著转录活性位 点上的重组序列的细胞将导致所述荧光蛋白的高度表达。通过荧光激 活细胞分选(FACS)选择高表达者并进行克隆。用重组酶转染并且通 过第一选择标记选择具有一致高表达和含有一个拷贝所述插入质粒的 克隆，鉴定其中第二质粒序列已经被重组酶除去的细胞，使所述第一 选择标记重新工作。这些细胞仍然含有插入到转录热点上的第一重组 序列并且现在能用于表达目的基因。
在单拷贝质粒整合后获得所述标记基因高度表达的细胞系用来进 行目的基因的转染。宿主细胞中的重组位点优选地位于具有显著表达 活性的基因或区域，即位于所谓的热点。
用于位点特异性整合的载体
合适的载体含有连接到合适的选择基因上的合适的重组位点，所 述选择基因不同于用于构建宿主细胞的选择基因。用于哺乳动物细胞 表达的合适选择基因包括但不局限于允许营养选择的基因，例如胸腺 嘧啶脱氧核苷激酶基因(TK)、谷氨酰胺合成酶基因(GS)、色氨酸 合酶基因(trpB)或组氨醇脱氢酶基因(hisD)。进一步，选择标记 是赋予药物抗性的抗新陈代谢物抗性基因，例如可用次黄嘌呤和胸腺 嘧啶脱氧核苷缺乏培养基选择并且进一步用甲氨蝶呤选择的二氢叶酸 还原酶基因(dhfr)、可用霉酚酸选择的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转 移酶基因、在真核细胞中用G418而在原核细胞中可用新霉素或卡那霉 素选择的新霉素磷酸转移酶基因(neo)、可用潮霉素选择的潮霉素B 磷酸转移酶(hyg、hph、hpt)基因、可用嘌呤霉素选择的嘌呤霉素 N-乙酰转移酶基因(pac)或可用杀稻瘟菌素选择的杀稻瘟菌素S脱 氨酶基因(Bsd)。最后，编码能由例如流式细胞仪分选的蛋白的基因 也可以用作选择标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)、神经生长因子受体 (NGFR)或其它膜蛋白或β-半乳糖苷酶(LacZ)。
本发明的一个方面，所述选择基因之前即没有启动子也没配有翻 译起始密码子。在所选的位点特异性重组位点提供启动子和ATG密码 子。如果这个载体整合的位置不是宿主基因组中选择的重组位点，那 么由于缺少启动子和起始密码子使得这第二个选择基因不能表达。如 果整合发生在宿主细胞基因组中选择的重组位点，第二选择基因表达 而第一选择基因不表达。 例如通过使用基因组中和用于位点特异性整合的载体上的所谓 FRT 位 点 (5’-gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3’ (SEQ ID NO 1)和其变体)与来自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Flp重组酶或其突变体一起进行整合。然而，其它重 组酶体系也同样好使，包括那些Cre重组酶和各种lox位点，例如来 自噬菌体P1或其变体或突变体(例如lox66、lox71、lox76、lox75、 lox43、lox44和lox511(C.Gorman和C.Bullock，Curr.Opinion in Biotechnology 2000，11：455-460))的loxP或通过使用噬菌体整合 酶ФC31或λ整合酶，所述λ整合酶在attP和attB位点间进行重组 (A.C，Groth等人，PNAS 2000，97：5995-6000)。进一步可用于本 发明的重组酶体系是但不限于来自细菌质粒pSM19035的β-重组酶-6 体系、来自噬菌体Mu的Gln-gix体系或来自zygosaccharomyces rouxii的R-RS体系。
位点特异性重组的进一步改变是使用非同源性重组位点。在这种 体系中，将二个不一致的重组位点导入到宿主基因组中以产生特异性 目的位点。对应于目的位点两侧序列的重组位点也位于含有目的基因 的构建体两侧。在WO 99/25854中已经描述过这种体系，其全文在此 引用作为参考。非同源性重组位点的使用能抑制GOI从染色体中切除。 所述非一致重组位点可由任何上面描述的重组位点组成，只要提供对 应的重组酶。例如，非一致性重组位点可由利用Flp重组酶整合的FRT 位点和突变体FRT位点组成或利用Flp和Cre重组酶整合的FRT位点 和loxP位点组成。
进一步，在Verhoeyen等人的Hum.Gene Ther.2001 12，933-44 中已描述使用二种不同FRT位点的体系。在这个方法中，通过逆转录 病毒感染将所述整合质粒转入宿主细胞。所述质粒由报告基因和第一 选择标记基因以及感染所需要的逆转录病毒元件的组合构成。所述逆 转录病毒3’LTR含有2个不同的FRT位点。缺少启动子和翻译起始密 码子的无功能的第二选择标记基因位于这些位点的3’。在逆转录病 毒感染过程中3’LTR序列拷贝至5’LTR。这导致报告基因和第一选 择标记基因两侧各为一个不同的FRT位点。在外侧FRT位点之间的序 列可以与在强启动子控制下的GOI进行交换。含有GOI的盒的两侧被 同一套FRT位点侧接。所述反应由Flp重组酶催化。在转染的交换质 粒中IRES元件和翻译起始密码子进一步位于所述GOI的下游。在取代 所述整合盒后，由GOI构建盒提供的翻译起始密码子激活所述无功能 选择标记基因，所述基因位于处于所述FRT位点外侧的3’LTR序列。 如果负选择标记(例如胸腺嘧啶脱氧核苷激酶)存在于所述整合载 体上，交换状况会进一步强化。
也可通过标准转染将整合载体转入所述宿主细胞。在这种情况下 所述整合盒在其5’末端由FRT侧接而在其3’末端由不同的FRT’位 点侧接。缺少ATG的第二抗性标记基因位于3’FRT’位点的更下游。 如对逆转录病毒体系所描述的方法对GOI进行交换。
另一个阻止GOI在其位点特异性整合到染色体后被切除的体系是 所述ФC31整合酶，也在上面提到过。在专利申请WO01/07572和 WO02/08409中已经详尽地描述这个体系，其全文在此引用作为参考。
在本发明的进一步方面，用于目的基因位点特异性整合的载体进 一步包含编码重组目的多克隆蛋白质的一个成员的DNA，任选地在所 述DNA之前加上其自身的哺乳动物启动子指导所述蛋白质表达。如果 目的多克隆蛋白质的成员含有超过一个蛋白链，例如如果成员是抗体 或T细胞受体，在编码所述蛋白质链的DNA之前加上其自身的哺乳动 物启动子指导各链高水平表达(双向的或单向的，分别参见图1和2)。 在双向表达中可以在表达载体中使用头对头启动子构型，而对于单向 表达可使用两个启动子或一个结合例如IRES序列的启动子进行表达。 合适的头对头启动子构型例如为但不限于两个方向的AdMLP启动子与 小鼠金属硫蛋白-1启动子、两个方向的AdMLP启动子与延伸因子-1 启动子或两个方向的CMV启动子与MPSV启动子。
表达载体可以包含编码功能前导序列的核酸序列以指导所述基因 产物到内质网或细胞内特定位置例如细胞器。强多聚腺苷酸化信号可 位于编码蛋白质的DNA序列的3’。多聚腺苷酸化信号确保新生RNA 转录物的终止和多聚腺苷酸化并且与信使稳定性相关。例如，编码重 组多克隆目的蛋白的成员的DNA可同时编码抗体或抗体片段的重链和 轻链，各基因序列任选地在其前面加上其自身的哺乳动物启动子元件 和/或在其后接上强Poly A信号指导两条链中各链的高水平表达。
用于位点特异性整合的表达载体可携带用于增强整合位点表达的 另外的转录调控元件，例如增强子或UCOE(遍在染色质开放元件)。 增强子是特异性地与细胞内参与转录的蛋白质相互作用的核酸序列。 UCOE打开染色质或保持染色质开放状态从而促进有效连接的基因(WO 00/05393中有更详细描述，其全文此处引用作为参考)重复地表达。 当一个或更多的上面描述的调控元件整合到宿主细胞染色体时就称它 们为异源调控元件。
构建用于蛋白质高水平表达的表达体系
用于将核酸序列导入细胞的方法在本领域是熟知的。这些方法通 常包括使用DNA载体将目的序列导入细胞、基因组或染色体外元件。 通过本领域技术人员所熟知的许多方法可实现对细胞的转染，包括磷 酸钙沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体融合、RBC血影融合、原生质 体融合等。
为转染宿主细胞系，使用目的载体文库，其中各载体只包含一个 拷贝的编码重组目的多克隆蛋白质的一个成员的核酸序列。这个目的 表达载体文库共同编码所述重组目的多克隆蛋白质。在前面部分描述 了用于位点特异性整合的合适载体。构成不同目的核酸序列文库的单 一载体可以混合起来形成单一组合物，或者编码各文库成员的单一载 体也可保持为单独的组合物或形成由大约5到50个单一文库载体混合 物的组合物。
可通过几种不同的转染和生产策略获得重组多克隆生产型细胞系 和来自这种细胞系的重组多克隆蛋白质的生产。图3概述了这些策略。
一个方法是利用混合起来形成单一组合物的表达载体文库转染宿 主细胞系。这个方法称为整体转染。通常前面描述的载体和宿主细胞 设计将确保通过合适的选择可获得多克隆细胞系。在这种细胞系中大 部分细胞个体已将一个拷贝来自目的核酸序列文库的核酸分子整合到 基因组中，所述核酸分子编码重组多克隆蛋白质的不同成员。所述单 拷贝的核酸序列整合到细胞集合中各细胞基因组的单一特异性位点， 由此产生了由表达所述目的多克隆蛋白质单一成员的细胞个体构成的 多克隆细胞系。在开始重组多克隆蛋白质生产前制备所述多克隆细胞 系的冷冻贮存物。
另一个方法是利用分成小部分的载体文库进行转染，所述小部分 的载体文库在组合物中含有大约5到50个所述文库的单一载体。优选 地，所述小部分的文库由10到20个单一载体构成。然后将各组合物 转染到等份宿主细胞中。这个方法称为半整体转染。转染的等份细胞 的数量将取决于文库的大小和各小部分中单一载体的数目。例如如果 文库包含100个不同成员，所述文库分成在组合物中含有20个不同成 员的小部分，将需要对5个等份宿主细胞用构成原文库的不同部分的 文库组合物进行转染。选择所述等份宿主细胞以进行位点特异性整合。 优选地，不同等份是分开选择的。然而，它们也可以在选择前汇集。 可对所述等份的克隆多样性进行分析并且只有那些具有充分多样性的 才可用于生产多克隆GOI文库贮存物。为了获得想要的用于生产的多 克隆细胞系，可将所述等份在产生冷冻贮存物前在它们从贮存物中取 出之后或在短暂的增殖和适应时间之后进行混合。任选地，将所述等 份细胞在整个生产中保持分离，并且通过将各等份的产物(而不是生 产前等份细胞)混合以组成所述多克隆蛋白质组合物。
第三种方法是高通量方法，在所述方法中宿主细胞分别用构成目 的文库的单一载体进行转染。这个方法称为个体转染。所述个体转染 的宿主细胞优选地分别根据位点特异性整合而进行选择。然而，在选 择前也可将它们进行汇集。对根据选择产生的单一细胞克隆的繁殖时 间和整合方式进行分析，并且优选地，那些具有相似的生长速率和单 一位点特异性整合的细胞克隆被用来产生多克隆GOI文库贮存物。在 产生贮存物前、在刚从贮存物中取出之后或经过短暂繁殖和适应时间 之后可将所述单一细胞克隆混合起来以获得想要的多克隆细胞系。
这个方法可以在转染、整合和选择期间消除任何可能的残留序列 差异。或者，在进行选择前将所述单独转染的宿主细胞混合，这将确 保对由转染造成的序列差异的控制。
上面概述的生产策略的共同特性是可以在一个或有限数目(最大 大约10个)的生物反应器中生产所有构成重组多克隆蛋白质的单一成 员。仅有的不同是人们选择产生构成重组多克隆生产型细胞系的细胞 集合的阶段。
用于表达和生产重组目的多克隆蛋白质的宿主细胞系具有一个或 更多个被重组酶(例如，如US5,677,177中描述的具有位于基因组 中预先确定座位上的FRT位点的预先制备的细胞)识别的核酸分子。
用于位点特异性整合的载体优选地整合到预先确定的介导高水平 表达的基因组座位(所谓的热点)上。
如果需要增加表达水平，可利用对DHFR基因或谷氨酰胺合成酶 (GS)基因的选择进行基因扩增。这要求使用含有这种选择标记的载 体。
为了生产多克隆蛋白质(其中各蛋白质成员由超过二个多肽链构 成)，所述链的组合对其形成的蛋白质的亲和力、特异性和活性可能 有重要作用。这个可从例如抗体和TcRs中看出来。例如，已知抗体可 变重链和可变轻链的组合影响由所述链形成的抗体的亲和力和特异 性。于是，当选择能产生与某种目的物具有亲和力的抗体的抗体编码 序列文库时，需要确保对应这个的最终产物中可变重链和轻链的组合。 因此将构成多克隆蛋白质的单一成员的多肽链放入用于整合的相同载 体中，由此确保在整个过程中它们始终在一起。
下面的描述是怎样获得重组多克隆抗体表达细胞系的一个例子， 其中所述链的混杂如果存在的话是最小的。
构建具有两个置于相反转录方向的启动子的组成型表达的通用启 动子盒，例如由可变重链和整个kappa轻链包围的头对头结构，以允 许将整个构建体转入用于位点特异性整合的载体中，所述载体包含 FRT位点和潮霉素抗性基因和重链恒定区。可以预期也可以使用诱导 表达的启动子盒。此外，可以尾对尾地放置启动子以造成相反方向的 转录或以尾对头的单方向转录方式放置。本实验中使用能稳定表达 lacZ-Zeocin融合基因的CHO-Flp-In细胞(Invitrogen，Carlsbad， CA)，使得所述细胞抵抗抗生素Zeocin。所述细胞维持在含有Zeocin 的培养基上。所述细胞用编码多克隆抗体和不同选择标记(潮霉素磷 酸转移酶)的用于位点特异性整合的载体文库连同表达Flp重组酶的 质粒进行整体转染。可诱导的启动子也可用来控制表达。转染后，将 所述细胞在有潮霉素存在的情况下进行培养。对潮霉素有抗性的细胞 随后生长在不同的培养体系中，例如传统的小量培养细颈瓶、核酸多 层细胞工厂、小的高产量生物反应器(MiniPerm，INTEGRA-CELLine) 和旋转烧瓶到中空纤维生物反应器。用ELISA检测所述细胞的抗体产 量。将多克隆细胞系长期悬浮培养在无选择压力的无血清培养基上以 选择其生存能力。细胞系贮存物在有潮霉素存在的情况下进行培养。
估计表达体系中多克隆性的保持
根据本发明，通常确保在生产中表达体系的多克隆性不发生严重 改变是重要的，这样当多克隆性确实改变了时就可能要停止生产。根 据本发明通过监控各种核酸序列的相对表达水平来确保这一点。例如 所述表达水平可通过例如使用RLFP分析、阵列或实时PCR在mRNA水 平上或使用例如双相聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱或各种层析技术在蛋 白质水平上进行监控。通过这些技术就可能对许多所有个体表达水平 确立基本值，然后在生产期间从培养物中取样以测量表达水平是否已 经改变(在总体和相对两个方面)。在本发明的正常实践中，可确立 围绕基本值的数值范围，并且如果发现相对表达水平超出范围就终止 生产。
为了能估计表达体系的稳定性和生产力，制备编码具有抗鸡卵清 蛋白、牛碱性磷酸酶(AP)、人β2-微球蛋白(β2m)、人触珠蛋白 (HAP)、人因子VIII(FVIII)和鸡蛋白溶菌酶活性的六个不同Fab 片段的载体(mini six library)。所述不同Fab片段编码序列是不 一致的因此展现出不同的RFLP图谱，因此可用RFLP分析基因型组成。
通过用具有头对头启动子盒的表达载体转染将所述mini six library导入CHO-Flp-In细胞。既可以用编码六个不同抗体的目的表 达载体的混合物整体转染CHO-Flp-In细胞，以产生按已知组合表达所 述六个抗体的多克隆细胞系，也可以用目的表达文库的一个成员单一 地转染细胞，接着混合转染的细胞，产生按已知组合表达所述六个抗 体的重组多克隆抗体表达细胞系。通过这种方式就可能检测出哺乳动 物细胞是否发生转染，并且不会对一个或几个所述重组多克隆抗体表 达细胞系的克隆的产生差异。此外，可能用于检查繁殖差异或由多克 隆抗体组合物的纯化引起的差异。
构建抗卵清蛋白重组多克隆抗体生产型细胞系
通过使用噬菌体展示和ELISA鉴定相关克隆以选择卵清蛋白结合 噬菌体克隆。两种装置用来鉴定来自卵清蛋白结合克隆的抗体，即基 于用卵清蛋白覆盖的ELISA板或基于将卵清蛋白固定在PVDF膜上的高 密度筛选方法(HDS)。通过这种方式获得抗体组，其中的一些识别固 定在ELISA板上的卵清蛋白，而其它则识别固定在PVDF膜上的卵清蛋 白。
选择的卵清蛋白结合噬菌体克隆可能具有其连接到哺乳动物启动 子上的可变重链和kappa链DNA序列，并且转到用于抗体表达的 pSymvc20类型(图4D)载体中以产生pSymvc21类型(图4E)的克隆 集合。所述CHO-Flp-In细胞既可以用pSymvc21克隆混合物进行整体 转染，又可以用单个pSymvc21抗体表达质粒进行个体转染，然后混 合表达其它卵清蛋白结合抗体的转染细胞。可通过对单一抗体表达细 胞进行DNA测序、TaqMan PCR和RFLP分析以及对产生的抗体混合物 进行ELISA、双相(2D)液相层析(LC)和质谱(MS)分析来监控制 造抗卵清蛋白多克隆抗体生产型细胞系的过程。
培养细胞和生产重组多克隆抗体
将如上面描述产生的多克隆细胞系在适合于表达所述目的多克隆 蛋白质的条件下培养在合适的培养基中，所述目的多克隆蛋白质由插 入到细胞基因组中的不同核酸序列编码。可通过几个步骤进行细胞培 养。在第一个步骤中对多克隆细胞系选择位点特异性整合子。当使用 哺乳动物细胞时，优选地使所选择的细胞适应悬浮培养以及无血清条 件。这可以通过一个或两个步骤并且在有或没有选择压力的情况下进 行。当所述多克隆细胞系适应合适条件后可以开始放大实验。这时工 作细胞贮存物可以进行解冻。优选地使用30和100升之间的生物反应 器，但也可使用更小的或更大的生物反应器。适合的生产时间和生物 反应器大小的选择取决于来自该批想要的蛋白质产量和来自所述细胞 系的表达水平。反应时间的变化可以从几天到三个月。将表达的重组 多克隆蛋白质从细胞或上清液中分离出来。根据本领域技术人员所熟 知的方法对所述重组蛋白质进行纯化和鉴定。下面列出纯化和鉴定方 法的例子。
从培养上清液中纯化重组多克隆蛋白质
使用各种层析技术将特定蛋白从培养物上清液中分离是可能的， 所述层析技术是利用蛋白质物理化学特性的不同，例如分子量、静电 荷、疏水性或对特定配体或蛋白质的亲和力的不同。于是可根据分子 量使用凝胶过滤层析或根据静电荷使用离子交换(阳离子/阴离子)层 析或使用层析聚焦分离蛋白质。类似地，根据疏水性使用疏水相互作 用层析或亲和层析可分离蛋白质，所述亲和层析是利用对特定固定配 体或蛋白质的亲和力的差异。于是通过一系列各种层析原理的组合可 以获得对蛋白质复杂混合物的分离。于是根据例如静电荷使用离子交 换层析首先对蛋白质混合物进行分离，而具有相似静电荷的蛋白质接 着根据分子量使用凝胶过滤层析进行分离或根据疏水性在高浓度选择 盐存在的情况下使用相互作用层析进行分离。
亲和层析结合后续纯化步骤例如离子交换层析、疏水相互作用和 凝胶过滤已经常用于从不同材料来源例如腹水液体、细胞培养上清液 和血清中纯化IgG(多克隆的及单克隆的)和TcR。亲合纯化是种快速易 行的方法，其中分离是基于所述蛋白质和连接到层析基质的特定配体 之间的可逆相互作用，其可提供高选择性、高产量并浓缩到较小的体 积中。蛋白质A和蛋白质G是两种细菌细胞表面蛋白，对Fc区域有很 高的亲和力，并且其固定化形式已用于许多常规的应用，包括纯化来 自各物种的多克隆IgG及其亚类和吸收及纯化免疫复合物。
在亲和层析之后，可进行下游层析步骤例如离子交换和/或疏水相 互作用层析以除去宿主细胞蛋白、渗漏的蛋白A和DNA。
作为最后纯化步骤的凝胶过滤可用来除去污染分子例如二聚体和 其它聚集体，并且将样品转入贮存缓冲液中。根据来源和表达条件有 必要包括额外的纯化步骤以获得所要求水平的抗体纯度。于是经常使 用疏水相互作用层析或离子交换层析与蛋白质A和凝胶过滤层析相结 合以纯化用于治疗的抗体。
为了纯化其它种类的抗体，必须使用其它的亲和层析介质，因为 蛋白质A和G不与IgA和IgM结合。可使用免疫亲和纯化(将抗IgA 或抗IgM单克隆抗体连接到固体相)或应用包括离子交换和疏水相互 作用层析的多步骤纯化策略。
结构表征
由于所述混合物的复杂性(多克隆多样性和糖基化)，多克隆蛋 白质例如抗体和TcRs的结构表征要求高分辨率。传统的方法例如凝胶 过滤、离子交换层析或电泳可能没有足够的分辨率区分单个抗体。已 经使用双相聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)及随后的质谱(MS)或液 相色谱(LC)-MS对复杂的蛋白质混合物(例如蛋白质组)进行表征。 已经证明基于蛋白质电荷和质量的分离方法的2D-PAGE在区分血清样 品中的多克隆、寡克隆和单克隆免疫球蛋白上非常有用。然而，这个 方法有一些局限性。层析技术，特别是与电喷射离子化MS偶联的毛细 管和LC赿来赿多地被用来分析复杂的肽混合物。LC-MS已用来鉴定单 克隆抗体的特征并且近年来也用于对多克隆抗体轻链的表征。对非常 复杂样品的分析要求更强的层析系统分辨能力，所述分辨力可通过用 两相(或更多相)分离获得。这种方法可基于在第一相中进行离子交 换和在第二相进行反向相层析(或疏水相互作用)，可选地与MS结合。
功能表征
多克隆蛋白质通过例如与具有对相同目的物特异性结合或相似活 力的多克隆蛋白进行比较研究来鉴定功能上的特征。这种研究可在体 外和体内进行。
多克隆抗体的体外功能表征可以是例如免疫沉淀，所述免疫沉淀 是用于对来自细胞粗提裂解物中的靶抗体分析分离的高度特异性技 术。通过免疫沉淀与其它技术的结合，例如SDS-PAGE之后接着进行蛋 白质染色(考马斯亮兰、银染或生物素标记)和/或免疫印迹，就可能 例如检测和定量抗原，于是估计所述抗体的某些功能特性。尽管该方 法既没有估计抗体分子的数目又没有估计其结合亲和力，但它提供了 目的蛋白质的可视化以及其特异性。这个方法可能用于在表达过程期 间监控抗体对抗原(克隆多样性的完整性)结合的潜在差异。
多克隆抗体的体内功能表征可以通过例如感染研究。实验动物例 如小鼠可用例如特定的病毒感染，针地所述病毒的多克隆抗体已经开 发出来了。感染被抑制的程度可表明所述多克隆抗体的功能。
治疗组合物
在本发明的实施方案中，含有选自免疫球蛋白超家族的重组多克 隆蛋白质作为活性成分的药物组合物可用来治疗或预防动物疾病，例 如选自癌症、感染、炎症疾病、过敏、哮喘和其它呼吸疾病、自体免 疫疾病、免疫障碍、心血管病症、中枢神经系统疾病、代谢和内分泌 疾病、移植排斥和不期望的怀孕等的疾病。所述哺乳动物优选地是人、 驯养的动物或宠物。
在本发明优选的实施方案中，所述药物组合物包括重组多克隆抗 体或抗体片段作为活性成分和药物学可接受的赋形剂。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述药物组合物包含重组多 克隆T细胞受体或T细胞受体片段作为活性成份和药物学可接受的赋 形剂。
为了治疗或预防感染，根据本发明的药物组合物含有能与感染性 微生物例如选自细菌、分枝杆菌、病毒、支原体、立克次氏体、螺旋 体、原生动物、真菌、蠕虫和外寄生物的微生物反应或结合的目的重 组多克隆蛋白质。
重组人多克隆蛋白质可以在药物学可接受的稀释剂、载体或赋形 剂中以单位剂量形式施药。传统的药物学实践可用于提供合适的制剂 或组合物，以将所述混合物施用给遭受例如由于过度细胞增殖造成的 疾病的病人。施药可能在病人有症状之前开始进行。可使用任何合适 的给药途径，例如给药可以是肠胃外的、静脉内的、动脉内的、皮下 的、肌肉的、头颅内的、眶内的、眼的、心室内的、英膜内的、脊柱 内的、池内的、腹膜内的、鼻内的、气雾剂、栓剂、或口服施药。例 如，治疗制剂可以是以液体溶液或悬浮液形式；对于口服施药，制剂 可以是片剂或胶囊咀嚼胶、糊剂的形式，适合应用于皮肤的组合物可 以是霜剂、软膏、洗液、凝胶、垫子或其它形式，适合应用于阴道或 泌尿生殖道粘膜的组合物可以是阴道栓剂(vagitories)、凝胶或其 它形式，而对于鼻内制剂则是粉末、鼻滴或气雾剂形式。
本发明的药物组合物通过已知的方式制备，例如，通过传统的溶 解、冻干、混合、研磨或糖膏(confectioning)加工。根据传统药物 学实践(例如参见，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.)，ed.A.R.Gennaro，2000，Lippincott Willianms & Wilkins，Philadelphia，PA和Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，eds.J.Swarbrick和J.C.Boylan，1988-1999，Marcel Dekker，New York，NY)配制药物组合物。
优选地使用活性成分溶液，还有悬浮液，特别是等渗水溶液或悬 浮液，例如在只含有活性成分或连同载体例如甘露糖的情况下，很可 在使用前制备这类溶液或悬浮液。所述药物组合物可能会灭菌和/或可 能包含赋形剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、用以 调节渗透压的盐和/或缓冲液，并且通过已知的方式进行制备，例如通 过传统的溶解或冻干加工的方法。所述溶液或悬浮液可含有增加粘性 的物质，例如羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯吡 咯烷酮或明胶。
注射组合物在无菌条件按通常方式进行制备；也用同样方式将所 述组合物装入安瓿或小瓶中并且密封容器。
用于口服施药的药物组合物可通过将活性成分与固体载体结合 (如果想要将所得混合物制粒)获得，如果想要或必要，在加入合适 的赋形剂后，将混合物加工成为片剂、糖衣丸(drage core)或胶囊。 也可将其整合到允许活性成分缓慢地扩散或以定量方式释放的塑料载 体中。
所述药物组合物包含从大约1％到大约95％，优选地从大约20％到 90％的活性成分。根据本发明的药物组合物可以是例如单位剂量的形 式，例如以安瓿、小瓶、栓剂、糖衣丸、片剂或胶囊的形式。
所述制剂可以按治疗有效剂量(例如，预防、消除或减轻病理状 况的剂量)给病人施药以对疾病或病理状况提供治疗。用于施药的治 疗药物的优选剂量可能取决于这类参数，如病的种类和程度、具体病 人总的健康状况、化合物赋形剂的制剂和其施药途径。
如果需要，使用重组人多克隆抗体的治疗可以同更多传统治疗方 法结合。例如在癌症的治疗中，这种组合治疗可采取手术或施用化学 治疗剂或其它抗癌药物的形式。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的所述药物组合物包 含与感染性微生物例如选自细菌、分枝杆菌、病毒、支原体、立克次 氏体、螺旋体、原生动物、真菌、蠕虫和外寄生物的微生物反应或结 合的目的重组多克隆蛋白质。
根据本发明的所述组合物的治疗应用
根据本发明的所述药物组合物可以用于治疗、改善或预防哺乳动 物疾病。能用本药物组合物治疗的疾病包括癌症、感染性疾病、炎症 疾病、过敏、哮喘和其它呼吸疾病、自体免疫疾病、免疫障碍、心血 管病症、中枢神经系统疾病、代谢和内分泌疾病、移植排斥和不期望 的怀孕。
本发明的一个方面是用于治疗、改善或预防动物中疾病的方法， 其中施用有效剂量的所述重组多克隆抗体或抗体片段。在进一步的方 面中施用有效剂量的所述重组多克隆T细胞受体或T细胞受体片段。
本发明另外的方面是利用重组多克隆抗体或重组多克隆T细胞受 体、或抗体或T细胞受体的片段制备用于治疗疾病的组合物，所述疾 病选自癌症、感染、炎症疾病、过敏、哮喘或其它呼吸疾病、自体免 疫疾病、免疫障碍、心血管病症、中枢神经系统疾病、代谢疾病、内 分泌疾病、移植排斥和不期望的怀孕。
诊断应用和环境检测应用
本发明的另一个实施方案涉及诊断试剂盒和用于环境检测应用的 试剂盒以及使用这些试剂盒的方法。根据本发明的试剂盒包含根据本 发明制备的重组多克隆蛋白质，其中该蛋白质可以用可检测的标记进 行标记或可以不标记进行非标记检测。如果标记，所述本重组多克隆 蛋白质可加入到怀疑含有靶分子的样品中，并且所述标记的存在或缺 少表明所述靶分子的存在或缺少。被检测的样品可以是体液样品，例 如血液、血清、血浆、脊髓液、淋巴液或尿或非哺乳动物样品，例如 怀疑含有污染物的来自环境来源的样品。非哺乳动物样品可以是水、 空气或污染的土壤。非标记检测包括测量结合后BIAcore的折射的改 变，其中所述重组多克隆蛋白质用于捕获靶分子。
实施例
下列的实施例描述了怎样在高产者细胞系中表达和生产重组多克 隆抗体，其中目的基因/载体通过位点特异性整合已被插入预先鉴定的 染色体“热点”位置。
在所述实施例中，将CHO细胞用作宿主细胞。其有利方面包括容 易获得合适生长培养基、在培养中其有效地长成高密度的能力和其以 生物学活性的形式表达哺乳动物蛋白质例如抗体的能力。
通常，根据传统方法进行根据本发明的大肠杆菌的转化和哺乳动 物细胞的转染。为增进对本发明的理解，在下面的实施例中描述了作 为例子的载体的构建和其在生产用于表达重组多克隆蛋白质的重组多 克隆生产型细胞系中的应用。
下列实施例阐述本发明，但不应该被认为是对本发明的范围的限 制。
实施例1
位点特异性整合对比随机整合
为进行下列转染实验，使用CHO-Flp-In细胞(Invitrogen， Carlsbad，CA)。用人分泌型碱性磷酸酶(SEAP)作为报告基因检测 所述系统的效率。制备两个质粒构建体：
1.将SEAP插入pcDNA3.1 hygro+(Invitrogen，Carlsbad，CA) (用于随机整合)
2.将SEAP插入pcDNA5/FRT(Invitrogen，Carlsbad，CA)(用 于位点特异性整合)
在调控元件(即启动子、多聚腺苷酸化等)方面两个质粒构建体 非常相似，这使得使用所述质粒进行随机整合与位点特异性整合的比 较成为可能。
单独使用质粒构建体1或按照Invitrogen描述的方法使用质粒构 建体2结合重组酶编码质粒pOG44转染CHO Flp-In细胞。使用潮霉素 选择转染体，并且测量来自转染体集合的SEAP的产量。
通过位点特异性整合转染的细胞产生大约比随机整合感染的细胞 多6倍的SEAP，证明了所述系统和所述细胞系的有效性。
实施例2
设计和制备用于在宿主细胞中位点特异性整合的表达载体
适合于位点特异性整合到宿主细胞热点染色体区域的表达载体可 由下列DNA元件组装而成：
a)连接潮霉素抗性基因的FRT重组位点，
b)pUC复制超始位点，
c)氨苄青霉素抗性基因(bla)，
d)允许氨苄青霉素(bla)抗性基因表达的bla启动子，
e)基因，编码目的蛋白质(GOIs)，
f)允许所述GOI表达的启动子，和
g)任选地，附加的转录或翻译调控元件，例如增强子或 UCOE’s，以增加在整合位点或IRES的表达。
为了更好理解表达载体的构建，给予各元件更详细的描述：
a)使用了连接潮霉素抗性基因的FRT重组位点以用于Flp重组 酶介导的整合以及选择具有大多数单一整合子的细胞系。所述潮霉素 基因前没有启动子也没有装配转录起始密码子，只在基因的3’加上 多聚腺苷酸化信号。所使用的FRT位点是 5’-gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3’ (SEQ ID NO 1)。
b)包含了允许在大肠杆菌宿主细胞中高拷贝数量复制的pUC复 制起始位点。
c)包含了允许选择大肠杆菌转化子的氨苄青霉素(bla)抗性基 因(β-内酰胺酶)。
d)允许氨苄青霉素(bla)抗性基因在大肠杆菌中表达的bla- 启动子。
e)包含了编码目的蛋白质例如重组多克隆蛋白质、抗体、抗体 的重链和轻链的GOI以及编码所有或部分抗体分子恒定区或可变区的 核酸序列和任选地所有或部分控制抗体分子表达的调控核酸序列。
重链的免疫球蛋白座位包括但不限于V、D、J和转换区(包括间 插序列，也称作内含子)以及与特定重链恒定区基因相关或相邻的侧 翼序列，它也可以包括位于恒定区内或下游的区域(包括内含子)。
轻链免疫球蛋白座位可包括但不限于V和J区、其上游的侧翼序 列、和与所述轻链恒定区基因相关或相邻的间插序列(内含子)，并 且其可以包括位于所述恒定区内或下游的区域(包括内含子)。
对于所有或部分抗体的恒定区的修饰，本发明的修饰序列可以包 括但不限于具有特定效应物功能、种类和/或来源(例如，人或任何其 它种类的免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD或IgE恒定区)的抗体恒定 区或修饰了抗体恒定区活性或性质的部分恒定区；以及编码赋予修饰 了的抗体以某些新功能的其它分子的基因，例如酶、毒素等。
编码目的蛋白质的基因可以有效地连接到编码指导基因产物到分 泌途径中的有功能的前导序列的核酸序列。
此外，在编码目的蛋白质例如含有重链和轻链的多克隆抗体的 GOI的3’可以具有强多聚腺苷酸化信号。在下面的例子中小鼠同种型 IgG1的应用是用作说明目的的，并不意味要限本发明的范围。
f)提供了允许GOI表达的启动子。因此，描述了含有用于表达 的启动子和增强子元件的盒。在所述表达载体中，各抗体基因前有其 自己的指导两条链中各链高水平表达的哺乳动物启动子元件，无论单 向、双向或尾对尾方向的转录盒都可使用。
在双向表达中，可使用头对头启动子构型(在US Patent No.5, 789,208中详细描述这种系统的结构，其全文引用作为参考)。在单 向表达系统中，两个启动子或一个启动子结合例如IRES序列也可用于 表达。
为了构建头对头启动子，分别对启动子进行Pfu PCR扩增。5’- 引物将从所述启动子的最5’的碱基开始，3’端引物将包括单一限制 性位点，例如XbaI位点。在PCR扩增之后，将所述片段用琼脂糖凝胶 分离并用QiaQuick柱(Qiagen)将其从胶中分离。此后用XbaI限制 性消化、于65℃下进行20分钟热失活，并用QiaQuick对片段进行柱 纯化。然后将所述片段混合并用大肠杆菌连接酶(New England Biolabs(NEB))连接，所述酶优选地连接粘性末端。连接混合物用各 启动子的5’引物进行PCR扩增以产生完整的头对头启动子(启动子 A/启动子B)片段。这个片段用T4多聚核苷酸激酶(PNK)(NEB)进 行磷酸化，所述酶于65℃下进行20分钟热失活，并且用T4连接酶 (NEB)将所述片段连接(平末端)到目的载体上(PCR扩增的 pSymvc10(图4)片段，其中用于扩增的引物与启动子区域的各端退火， 扩增除启动子外的所有区域)。
图1和2显示分别包含用于双向和单向表达的启动子的表达载体。 这些启动子是用于说明的，但不限制本发明中启动子的选择。
g)为了增加整合位点和/或IRES的表达，所述表达载体可以携 带另外的转录和/或翻译调控元件，例如增强子和/或UCOE’s。
实施例3
对开发的生产系统中的多克隆性保存的估量
为了能估计生产系统的稳定性和重复性，制备以已知组合表达不 同抗体的多克隆组合物的细胞系。所述多克隆抗体组合物称为mini six组合物。编码所述mini six组合物的核酸序列文库称为mini six library。
(a)克隆起点
在这个实施例中使用下列编码与抗原1-6反应的Fab片段(目的 基因)的序列：
1.卵清蛋白(OVA)。所述Fab编码片段选自鼠抗OVA噬菌体展 示文库。
2.碱性磷酸酶(AP)。所述Fab编码片段选自鼠抗AP噬菌体展 示文库。
3.β2-微球蛋白(β2m)。所述Fab编码片段克隆自杂交瘤BBM.1 (由Dr.L.Ф.Pedersen赠送，Denmark)，其针对β2m而产生。
4.人触珠蛋白(HAP)。Fab编码片段选自鼠抗人触珠蛋白噬菌 体展示文库。
5.因子VIII(FVIII)。这个Fab片段的亲本单克隆抗体是FVIII F25单克隆抗体(由Novo Nordisk赠送，Denmark)。将编码这个Fab 片段的VH和完整Kappa链的DNA亚克隆到噬菌体中，接着将原核启动 子盒插入构建体中。
6.鸡蛋溶菌酶(LYS)。这个构建体产自D1.3scFv克隆(Boulot， G.等人，J.Mol.Biol.，213(4)(1990)617-619)，通过对VH和Vκ 片段的PCR扩增并克隆到噬菌体中。
所述噬菌体克隆存在于转化的大肠杆菌株系TG1的甘油贮存物中 (保存在-80℃)或作为噬菌体DNA制备物存在。
(b)mini six library的RFLP分析和DNA测序。
如下通过RFLP分析编码所述Fab片段重链的核酸序列：检测通过 用NlaIII和Hinf I酶消化PCR产生的片段获得的条带图谱。不同的 Fab片段编码序列展现非常不同和易区别的图谱。对编码VH和VL片段 的核酸序列测序并且找出对应于RFLP图谱的序列。此外，所述核酸序 列编码开放阅读框并且可翻译成已明确定义的多肽。
(c)mini six组合物的ELISA分析
用ELISA分析由克隆表达的所述Fab片段，其中分析所有Fab片 段对所有抗原的反应性。用抗kappa ELISA监控Fab的表达。所有Fab 片段用ELISA进行二次重复测试。所有克隆都表达Fab片段，并且所 述Fab片段特异性与其相关的抗原发生反应。在ELISA分析中没有发 现背景问题。
所述6个噬菌体克隆分别存在于转化的大肠杆菌株系TG1甘油贮 存物中，在用于如下描述的接种的模式系统中使用所述克隆。
(d)设计具有已知组合的6个不同抗体的多克隆模式系统。
通过检测表达的Fab片段对相关抗原的反应性确定所述6个选择 的Fab表达克隆(表达抗OVA、抗AP、抗β2m、抗HAP、抗FVIII和 抗LYS的Fab片段的克隆)的特性。这些克隆形成了多克隆模式系统 的一部分，所述模式系统用于测试已知组合(所述mini six组合物) 的6个不同抗体的表达和产量。将所有Fab编码核苷酸序列(所述mini six library)转移到噬菌体载体(由pSymvc10所示，图4A)。
(d.1)GOI从噬菌体载体向用于哺乳动物表达的载体的个体转 移。
在这个实施例中，目的基因(所述mini six library)从噬菌体 载体到用于哺乳动物表达的载体的转移是通过2步法进行的。第一步 是用头对头方向的哺乳动物启动子盒取代原核启动子。这个步骤之后 是将GOI’s的可变区、启动子盒和恒定kappa转移到如下详细描述的 表达载体中，并且于图4中说明。
通过使用SacI/XhoI消化，接着通过连接导致来自细菌的启动子 换成来自哺乳动物的启动子，于是将头对头启动子盒(启动子A/启动 子B)插入到各克隆的噬菌体载体上。然后用EcoRI和NotI消化将可 变重链、头对头启动子盒(启动子A/启动子B)和完整kappa链 (EcoRI/NotI片段)从噬菌体载体移到表达载体上。
在图4的流程图给出了各克隆个体转移的例子。该图显示质粒 pSymvc10，其中目的重链和kappa编码序列(例如，gc032 OVA)位于 噬菌体载体上，通过使用SacI/XhoI片段转移将头对头哺乳动物启动 子盒构建体连接到所述噬菌体载体上以取代细菌启动子，产生 pSymvc12。
从这个构建体中，通过使用NotI/EcoRI转移将包括启动子盒和完 整kappa链编码序列的可变重链编码序列转到哺乳动物同种型编码载 体(pSymvc20)上。最终获得的载体(pSymvc21)表达目的小鼠抗体 (例如抗OVA IgG1抗体)。
通过NotI/EcoRI转移分别将来自六个克隆中每个克隆的可变重 链编码序列、哺乳动物启动子盒和完整的kappa链编码序列进行转移， 产生哺乳动物表达载体pSymvc21，其表达每个GOI编码的抗体序列作 为小鼠IgG1抗体。
含有所述6个GOIs的6个单个pSymvc21克隆保存为TG1甘油贮 存物。
为了转染入CHO Flp-In细胞，所述TG1贮存物分别繁殖，并且在 OD600校正大肠杆菌数目后，将所述6个培养物混合并用于质粒制备。 将包含所述6个GOIs的这个质粒制备物(mini six library)用于对 哺乳动物细胞的整体转染，所述哺乳动物细胞用于重组多克隆抗体表 达。
(d.2)将所述GOI’s从噬菌体载体整体转移到用于哺乳动物表 达的载体中。
将位于噬菌体载体中并编码6个不同Fab片段(抗OVA、抗AP、 抗β2m、抗HAP、抗FVIII和抗LYS)的GOIs(所述mini six library) (此处为EcoRI/NotI片段)以所述6个载体构建体的混合物整体转移 到用于哺乳动物表达的载体上，以产生6个不同表达载体的混合物。
涉及整体转移的实验方法和(d.1)中所描述的方法一样，除了其 以整体方式进行，即将所有6个GOIs(编码可变重链，包括头对头启 动子盒和完整kappa链)以6个噬菌体载体混合物的形式同时转移。
mini six library质粒的制备
质粒制备物1是指所述6种噬菌体载体(具有含于载体pSymvc10 上的抗体编码序列)混合的质粒制备物。
质粒制备物2是指在整体转移步骤1(参见图4C)之后具有含于 载体pSymvc12上的编码序列的6种噬菌体载体的质粒制备物，所述步 骤1导致原核启动子与哺乳动物启动子盒构建体的交换。
质粒制备物3是指在整体转移步骤2(参见图4D)后的质粒制备 物，所述步骤2导致可变重链、头对头启动子盒和完整kappa链从 pSymvc12交换到哺乳动物表达载体(pSymvc21)，于是允许6个选择 的抗体作为全长小鼠IgG1抗体而表达。
确定整体转移中使用的质粒制备物转化的TG1细胞的基因型
用电穿孔将mini six library整体转化TG1细胞并且在2xYT (Sigma Y 2627)板上过夜培养之后，将单个克隆挑出。在各实验中 挑出180个克隆并在96孔培养板中于2xYT液体培养基中孵育4小时。 用水稀释等份培养物、变性并用作PCR模板。在所有的实验中，可变 重链得以扩增。用于噬菌体载体(pSymvc10-类型)的引物是：
5’-GCATTGACAGGAGGTTGAGGC-3’(SEQ ID NO 2)和
5’-GCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTC-3’(SEQ ID NO 3)
用于具有哺乳动物启动子盒的载体的引物是(pSymvc12-型)：
5’-GCATTGACAGGAGGTTGAGGC-3’(SEQ ID NO 4)和
5’-GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3’(SEQ ID NO 5)
用于pSymvc21构建体的引物是：
5’-CAAATAGCCCTTGACCAGGC-3’(SEQ ID NO 6)和
5’-GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3’(SEQ ID NO 7)
同时用NlaIII和HinfI消化所有PCR产物以确保明确的基因分 型。用琼脂糖凝胶电泳分析所述消化片段并用溴化乙锭染色显示条带。 RFLP确定的片段图谱鉴定出个体基因型的数目，其对应于在所有挑选 的克隆总数目中代表所述6个抗体中各抗体的单个克隆的数目。
(d.2a)DNA在大肠杆菌中扩增后整体地将其从噬菌体载体转到 哺乳动物载体中(二步扩增法)。
从所述6个大肠杆菌TG1甘油贮存物中的每一个制备所述质粒制 备物1，所述每个贮存物包含构成mini six library的6种噬菌体载 体中的一个。贮存物分别繁殖，并且在OD600校正大肠杆菌数目后，将 所述6种培养物等量混合并用于质粒制备，形成质粒制备物1。通过 将其转化入电感受态的TG1细胞和进行随后的RFLP分析以检测在质粒 制备物1中6种噬菌体载体的基因型分布。图5显示TG1细胞中不同 基因型的分布。
用SacI/XhoI消化含有多克隆噬菌体载体的质粒制备物1，所述 噬菌体载体表达6个选择的Fab片段基因型的等量混合物。然后将头 对头启动子盒(CMV启动子/MPSV启动子)通过连接插入。在用来自连 接步骤(图6)的DNA转化后在TG1细胞中检测载体启动子交换后载 体的基因型分布。
将所述细胞涂到板上并生长在大的(245mmx245mm)2xYT琼脂糖 板上，并且制备质粒制备物2以产生包含头对头启动子盒(pSymvc12) 的噬菌体载体。
从质粒制备物2中，用NotI/EcoRI消化将包含启动子盒和完整 kappa链的可变重链编码序列从噬菌体载体中切下并转到已含有小鼠 IgG1恒定区结构域的载体(pSymvc20)中。这形成了pSymvc21载体 集合，所述载体集合表达作为全长小鼠IgG1抗体的6个所选抗体克隆 的可变区。
或者所述启动子转移可在编码同种型的哺乳动物载体中进行，限 制性酶切的顺序颠倒，开始用NotI/EcoRI消化以将目的DNA转移到 哺乳动物载体中，然后用SacI/XhoI限制性消化片段插入到启动子区 域。
在将可变重链编码序列、启动子盒和整个kappa链编码序列转入 表达载体后，通过用来自第二连接步骤(图7)的DNA转化TG1细胞 以检测基因型的分布。将细胞涂在大的(245mmx245mm)2xYT琼脂糖 板上并且制备(pSymvc21)质粒制备物3，其中于小鼠IgG1抗体构架 区中表达所述6个克隆的可变区。
所述质粒制备物3可用于对哺乳动物细胞进行整体转染以产生用 于重组多克隆抗体表达的重组多克隆生产型细胞系。
DNA在大肠杆菌细胞中扩增后，从噬菌体载体到同种型编码哺乳 动物载体的整体转移的结果显示：在6种载体构建体分别繁殖并混合 (质粒制备物1，图5)后，有可能获得其均衡分布。在启动子盒(质 粒制备物2，图6)交换之后以及在插入小鼠IgG1同种型编码载体(质 粒制备物3，图7)后，以可比的水平可检测到所述6种构建体。
(d.2b)在质粒制备物1步骤之后无需进行大肠杆菌中的DNA扩 增即从噬菌体载体整体转移到用于哺乳动物表达的载体(一步扩增方 法)。
为了交换启动子，用SacI/XhoI消化来自质粒制备物1(此处使 用25μg)的DNA，所述DNA包含表达6种选出的Fab片段基因型的等 量混合物的多克隆噬菌体载体(pSymvc10)。纯化所述SacI/XhoI载 体片段并与头对头启动子盒(CMV启动子/MPSV启动子)连接。交换启 动子后不进行任何扩增，用NotI/EcoRI消化具有CMV/MPSV启动子盒 的载体以从噬菌体载体中切出具有可变重链编码序列的整个区域，所 述可变重链编码序列包括启动子盒和完整kappa链编码序列，再将其 整体转移到用于哺乳动物表达的载体中。在将编码可变重链，所述启 动子盒和kappa链的NotI/EcoRI片段转入小鼠IgG1编码载体 (pSymvc20)中后，获得了在小鼠IgG1全长抗体环境下表达6个选择 克隆的可变区的表达载体。图1说明这种表达载体的组成。
在造成启动子交换的整体转移和转移编码可变重链区、启动子盒 和完整kappa链的核苷酸序列到用于哺乳动物细胞表达的载体中后， 通过用来自第二连接步骤的质粒转化TG1细胞来检测基因型的分布。 将所述细胞涂在大的(245mmx245mm)2xYT琼脂糖板上并且制备这种 双酶切/连接形成的质粒制备物(载体pSymvc21，其中在小鼠IgG1抗 体背景下表达6种克隆的可变区，对应于来自d.2a的质粒制备物3)。 图8显示在用来自一步扩增法的质粒制备物转化的TG1细胞的基因型 分布。
由于所述一步扩增法会由于产生不想要的连接产物，因而可能在 来自所述6种Fab编码序列的重链和轻链中引入一些混杂，正常情况 下在大肠杆菌中扩增期间会避免产生所述混杂。然而，如果发生这种 混杂，可引入筛选步骤以确保维持足够的克隆多样性。
(d.2c)启动子交换后直接转染哺乳动物细胞
为了表达重组多克隆抗体，来自所述mini six library的质粒制 备物的产物可用来直接整体转染哺乳动物细胞，所述mini six library的质粒制备物既可以来自二步扩增法又可来自一步扩增法。
(d.3)检测转染的哺乳动物细胞
所述mini six多克隆模式系统的已知抗体组合可用来检测并确保 对哺乳动物细胞的转移和转染以这样的方式发生：在转染和随后培养 过程中，维持了克隆多样性并不会在所述抗体可变序列基因型组成中 引入差异。整体转移、整体转染和哺乳动物表达整个过程中用于监控 基因型组成的方法包括如下：
-分离克隆的DNA测序
-单个克隆的RFLP分析
-所述产生的抗体混合物的ELISA分析
-所述产生的抗体混合物的质谱分析
-基因组序列和表达不同重链和轻链的mRNA的相对组成的Taqman PCR
在转染过程中引入的基因型组成上的偏差(如果发生)是由于随 机整合或多整合子造成的。如在详细描述中所述的，当使用预先设计 的用于位点特异性整合的宿主细胞时不太可能引起这个问题。然而， 可用多种方法控制这种偏差。使用非常少量的DNA例如当用 Lipofectamine进行转染时DNA为1μg/107细胞或当用电穿孔转染时 DNA为0.2μg/107细胞，可选择除去在随机基因组座位(除了位点特 异性座位的座位)上的整合。还有，还可提供不利于随机整合的超螺 旋形式的DNA进行整合；
通过负选择将位于预先设计的靶位点之外的单个或多个整合消 除，因为可选择的标记将位于基因组中，没有启动子或起始密码子。 于是，这些随机整合事件接受者不能在选择过程中存活。
具有多处整合(其中有一个重组事件发生在所述靶位点)的转化 子能在选择过程中存活下来；然而，这种多处整合类型的概率是极其 低的。于是这种事件导致最小化的多克隆蛋白质混杂。此外，由于存 在100到1000个编码相同重组多克隆蛋白质的其它克隆，即使异位表 达很高，如果多处整合发生则所述混杂将小于大约1％。如前面提到的， 异位整合的概率可通过减少方法中所使用的DNA量予以降低。
最不可能的事件是在靶位点的多个串联整合。通过使用此处描述 的Flp重组酶系统这种事件将很少发生，因为其在染色体上切割活性 明显高于整合活性。然而，如果串联整合以不可接受的高频率发生， 要用其中只能插入单个拷贝的系统(参见，例如，WO99/25854；引用 作为参考)更换所述Flp系统。
(e)在哺乳动物细胞中表达已知组合的6种不同抗体
通常为了最小化繁殖速率的差异，优选地将各特异GOI(在这个 例子中是所述mini six library的各单个成员)整合到至少100个， 优选地1000个和最优选的10000个细胞中。含有大量表达相同GOI(对 所有的GOI’s)的单个细胞的多克隆细胞系预期较少受到单个细胞不 同繁殖速率的影响，并且在最终多克隆蛋白质组合物中能减少差异的 概率。
进一步，确保用于表达的宿主细胞系同源是有利的。这可以通过 在转染前亚克隆所述宿主细胞系实现。在关于克隆多样性的段落中对 这个过程进行了描述。
对于希望对其中差异进一步控制的多克隆文库，通过向所述表达 载体平台引入可诱导的转录控制元件可控制所述多克隆蛋白质产物的 最终组成。合适的可诱导控制元件包括，例如BD Tet on/off(BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ)和GeneSwitch(Invitrogen， Carlsbad，CA)。这些转录开关可在合适的时间点(例如，当细胞集 合充分扩增时)诱导以最小化由于基因表达或蛋白质产物的差异造成 的任何繁殖差异。没有使用这样的控制元件进行本实验。
无论是如(d.1)中所描述的单个地或如(d.2)中所描述的整体地 将所述6种选择的GOI从噬菌体载体转移到哺乳动物表达载体上后， 通过使用位点特异性整合将所述哺乳动物表达载体转染到 CHO-Flp-In细胞系的热点中以如下所述表达6种不同的抗体。
对于个体转移的GOI(d.1)，将质粒DNA’s进行分别繁殖并且 单个地转染到CHO-Flp-In细胞中或将所述TG1贮存物分别繁殖，并在 OD600校准大肠杆菌数目后，将所述6种培养物混合并用于质粒制备。 将这种含有所述6种目的基因的质粒制备物整体转染哺乳动物细胞， 以用于表达重组多克隆抗体。
对于整体转移的GOI(d.2a或d.2b)，将质粒DNA’s转染入 CHO-Flp-In细胞或根据(d.2a或d2.b)描述的方法扩增和纯化(质 粒制备物3)然后用于整体转染。
(e.1)细胞培养
将所述CHO Flp-In宿主细胞(Invitrogen，carlsbad，CA)培养 在Ham’s F-12培养基上，所述培养基添加有谷氨酰胺(2mM)和FCS (10％)和100μg/ml Zeocin(Invitrogen，Carlsbad，CA)。为了亚 培养，根据厂商说明书用胰蛋白酶将所述细胞脱壁并分离出来。将细 胞生长于5％二氧化碳、37℃。培养基和培养基添加物来自Gibco。
这种细胞系稳定地表达lacZ-Zeocin融合基因，使得所述细胞能 抵抗抗生素Zeocin，在外源基因位点特异性整合后该抗性将会丢失。 所述细胞含有单一拷贝的Flp重组靶(FRT)位点，于是适合用作进行 定点整合的宿主细胞系，所述定点整合使用了Flp-In系统 (Invitrogen，Carlsbad，CA)。
(e.2)转染CHO细胞
6孔组织培养板的每个孔中接种4.0x105个CHO-Flp-In细胞，并 且在O/N 37℃/5％二氧化碳条件下进行孵育。根据厂商说明书进行这 些细胞的转染以测试使用FuGENETM6(Roche)、LipofectineTM、 LipofectAmineTM或LipofectAMINE 2000TM(Gibco)的不同转染方法。 在这个实验中，LipofectAMINE 2000TM用作转染试剂。简短地，在转 染前一天，如上面描述的将呈指数生长的CHO-Flp-In细胞进行接种并 且在O/N 37℃/5％二氧化碳条件下进行孵育。具有85-95％细胞汇合的 孔用于共转染。
制备含有下列内含物的二个管子：
管1：将0.5μg具有(d.1)所描述的GOI的单个表达载体(例如 具有OVA的pSymvc21)+4.5μg mp040(pOG44的最大制备物)(表达 重组酶Flp的质粒)加入到250μl的Optimem(1.5ml的Eppendorf 管)。
管2：将7.5μl LipofectAMINE 2000TM加入到250μl的Optimem (1.5ml的Eppendorf管)并在室温下(RT)孵育5分钟。
将管2中的物质转移到管1中，接着在RT下卵育20分钟。
根据厂商说明书将所述DNA-Lipofectamine复合物转移到具有细 胞的孔中。
24小时后，用胰蛋白酶脱落所述细胞，分离(1∶3)并且分配到 T-25烧瓶和100mm培养皿中，并培养在含有900μg潮霉素B/ml作 为选择压力的新鲜营养混合物F-12 Ham+10％FCS+2mM L-谷氨酰胺培养 基中。
(e.3)选择位点特异性整合子并亚培养转染细胞
将细胞在潮霉素B选择压力下培养2到3周，在这个时期每2到 4天更换含有相同浓度的选择剂的新培养基。用胰蛋白酶将在T-25烧 瓶和培养皿中的存活细胞集合脱离下来，分离(1∶6)并且分配到T- 烧瓶中，在上面提到的选择压力下进一步繁殖。从含有转染子的培养 皿中挑取(使用所谓的克隆柱(cloning cylinder))一些单个克隆， 并将其转到新的孔中繁殖和用于表达水平研究，所述转染子根据(d.1) 中描述的方法产生。
能抵抗潮霉素B浓度阈值的各细胞集合或单个克隆在6孔板上长 成汇合，重新将其涂于具有相应烧基外加潮霉素B的培养皿、T-25、 T-80和T-175培养瓶中。当指数生长细胞在T8-组织培养瓶中生长到 80％的汇合时，将各细胞系的小瓶冰冻并贮存于液氮N2(L)冰箱中。
为了用含有6种目的基因的质粒混合物(mini six library)转 染，在OD600处校准所述6种单个培养物的大肠杆菌的数目，将其混合 并用于制备含有所述6种目的基因的多克隆质粒制备物。使用7.5倍 上述的试剂和细胞进行转染，产生表达所述6种不同抗体的混合物的 重组多克隆细胞系。
在培养和繁殖期间，通过使用抗原特异性ELISA对表达单个所选 抗体成员的所述6个细胞系和表达所述6个不同抗体的混合物的细胞 系的抗体产量进行检测。
(f)监控多克隆细胞系的组成，所述细胞系表达已知组合的6 种不同抗体。
通过产生6种所选目的基因的混合物然后将其通过整体转染和 位点特异性整合到CHO-Flp-In细胞中，产生表达6种不同抗体的多克 隆细胞系，所述目的基因位于表达载体上。
在接下来的34天里对所述细胞系的基因型分布、抗体表达和繁殖 速率进行鉴定。结果描述如下：
(f.1)在CHO-Flp-In细胞中所述6种选择的目的基因的基因型 分布，其中所述CHO-Flp-In细胞用来自OD600校准的细胞混合物的质 粒制备物转染。
所述多克隆CHO-Flp-In细胞系用胰蛋白酶处理并将细胞悬浮液 稀释到10个细胞/ml。此后，将200μl转到总共10个96孔板的每个 孔中。大约10天后，通过显微镜鉴定具有单个克隆的孔。用PBS冲洗 具有单个克隆的孔一次并且加入50μl的水。平板在80℃孵育10分 钟将溶解产物转移到另外的96孔板中。将10μl溶解产物和下列引物 用于25μl OneStep RT-PCR(Qiagen)。
5’-CAAATAGCCCTTGACCAGGC-3’(SEQ ID NO 6)和
5’-GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3’(SEQ ID NO 7)
在15μl反应系统中用HinfI和NlaIII对10μl的RT-PCR混合 物进行RFLP，所述反应系统于37℃孵育2小时。将所述消化片段用琼 脂糖凝胶电泳接着用溴化乙锭将凝胶染色显示。一段时间(转染后第 16天和34天)后确定产生抗OVA、抗AP、抗β2m、抗HAP、抗FVIII 和抗LYS的细胞的基因型分布，参见图9。
(f.2)来源于CHO-Flp-In细胞的样品的ELISA，所述CHO-Flp-In 细胞是用来自OD600校准的大肠杆菌(d.1)混合物的质粒制备物转染 的。
用胰蛋白酶处理所述多克隆CHO-Flp-In细胞系(e.3)并将3x106 个细胞涂于装有F-12 HAM+10％FCS+2mM L-谷氨酰胺和900μg潮霉素 的T-75培养瓶中。每隔一天换一次培养基并且在第3天收集上清液进 行ELISA。将抗原(β2-微球蛋白(由Copenhagen大学赠送)、碱性 磷酸酶(Sigma)、卵清蛋白(Sigma)、因子VIII(Novo Nordisk 赠送，Denmark)、鸡蛋清溶菌酶(Sigma)和触珠蛋白(Sigma))在 50mM碳酸盐缓冲液中稀释成10μg/ml。用抗原(每个孔50μl)覆盖 ELISA板并在4℃下孵育O/N。用冲洗缓冲液(1xPBS/0.05％Tween 20) 冲洗孔4次并用冲洗缓冲液配制的2％脱脂奶粉(每个孔100μl)封闭 1小时。将50μl样品加入到孔中并将板在RT下孵育1小时。将板冲 洗4次并加入第二抗体(羊抗小鼠IgG/HRP缀合物(Sigma))进行1 小时接着冲洗4次。ELISA用TMB底物(每个孔50μl，DAKO S1600) 显色5分钟并通过加入50μl 1M硫酸停止反应。立即将板于450nm 处读数。图10显示表明裂解物中所有6个目的抗体都表达的数据，用 编码所述6个目的基因的表达载体混合物转染后第34天获得所述数 据。应当指出的是：因为图10展示的数据来自6个不同的抗原特异性 ELISA分析，所以不能在抗体的量方面对OD450读数进行直接比较。
通过在CHO-Flp-In细胞集合中用抗kappa覆盖的ELISA对抗体表 达水平进行进一步分析，其中用各单个GOI或所述6个GOI的混合物 对所述CHO-Flp-In细胞进行了转染。图11显示结果。这显示在单个 转染的细胞系(例如，与用编码抗AP抗体的载体转染的细胞系相比， 用编码抗β2m载体转染的细胞系表达了可比量的抗体)之间抗体表达 水平是可比的。此处使用术语“用单个GOI转染的CHO-Flp-In细胞集 合”，因为所述单个细胞系不是来自单个克隆而是来自如e.3中所描 述的克隆集合。
(g)实验结论
首先，这些对生产系统中多克隆性保存的估计(测试)表明在不 引入选择或繁殖差异(图7)的情况下，将来自所述mini six library (编码抗OVA、抗AP、抗β2m、抗HAP、抗FVIII和抗LYS)的6个选 择的目的基因从噬菌体载体转移到哺乳动物表达载体中是可能的，于 是最终所述6个选择的目的基因的频率是相当的。
第二，用含有所述6个选择的目的基因的构建体混合物整体转染 CHO-Flp-In细胞也导致在分离的哺乳动物细胞中可比的构建体的分 布。一段时间(转染后第16天和34天)内，所述6个选择的目的基 因的基因型分布也是相似的(图9)，表明到第34天所述表达系统仍 维持所述六个基因型的原始的、相同的分布，而不引入繁殖差异。
第三，用所述6个目的基因的混合物整体转染的细胞显示所有6 个抗体都表达，如对来自转染后第34天的细胞的上清液进行抗原抗异 性ELISA检查所显示的(图10)。由于不同的结合亲和力，不能在抗 体的量方面对不同抗原的ELISA结果进行直接比较。然而，对来自a) 所述6个个体转染的CHO-Flp-In细胞系(如用(d.1)所描述的载体 制备物产生的)的上清液和b)对表达所述6个选择的目的基因的多克 隆细胞系的上清液进行的基于覆盖有羊抗小鼠kappa链抗体的捕获 ELISA表明在所述6个基因型中具有可比的抗体表达水平。
总的说来，已经表明将多克隆GOI整体地从噬菌体载体转移到哺 乳动物表达载体是可行的。这在之前已经由Sharon(US 5,789,208)描 述。此外，可用哺乳动物表达构建体的混合物整体地转染到哺乳动物 细胞中并且至少在转染后34天仍保持可比的频率。
实施例3A
估量细胞培养物中的多克隆性保存，所述细胞培养物由用mini six library整体转染的来自CHO-Flp-In细胞系的亚克隆产生。
(a)“起始”CHO-Flp-In细胞系的亚克隆
如(实施例3的e.1部分)所描述的培养起始CHO-Flp-In细胞系 (Invitrogen)。在胰蛋白酶化后，细胞计数并在96孔培养板上每个 孔中放入1个细胞。大约14天后鉴定具有单个克隆的20个孔，并且 将细胞用胰蛋白酶处理并转移到24孔板中。在鉴定生长行为特征以及 表达水平后，选择其中一个亚克隆CHO-Flp-In克隆019用于进一步研 究。
(b)CHO-Flp-In克隆019细胞的整体转染和选择
进行三次重复的转染，并且基本上如(实施例3，e.2和e.3部分) 所描述的对CHO-Flp-In克隆019细胞进行选择，除了在pSymvc21(图 4.e)中用新霉素选择标记取代潮霉素标记。从而，在细胞选择和培养 期间，用Geniticin(450μg/ml)取代潮霉素B。
(c)从CHO-Flp-In克隆019细胞中获得的样品的ELISA，所述 细胞已用mini six library进行整体转染。
所述细胞在转染后培养73天并且在第17天、31天、45天、59 天和73天对用于ELISA的样品取样。如(实施例3，f.2部分)所描 述的进行定量ELISA(使用分别纯化的mini six抗体作为标准)。图 12显示来自3个独立转染的结果。在不同的转染中观察到不同表达特 性。然而，到第59天在所有的实验中均检测到所有6种抗体。
(d)实验结论
针对CHO-Flp-In克隆019细胞使用新霉素选择系统的实验显示整 体转染两个月后仍较好地保持了单个批次的表达特征(图12)。这样 的稳定期间足以满足生产目的。通过在生产前产生和贮存单批次的大 量冰冻贮存物可解决所观察到的批与批之间的变化。
实施例3B
估量在细胞培养物中多克隆性的保存，所述细胞培养物是在选择 后混合个体转染的CHO-Flp-In细胞而产生的。
(a)CHO-Flp-In细胞的个体转染和选择
之前在(实施例3，e.3部分)中已经描述了产生所述表达mini six library中单个成员的6个细胞系的实验方法。在选择后立刻等量(每 个细胞系5x105)混合表达所述mini six library中单个成员的6个 细胞系并将混合的细胞群体培养85天。从所述单个细胞系分别制备三 个混合物。
(b)从产生于(a)的多克隆细胞培养物中获得的样品的ELISA
每两星期取样并且通过如(实施例3，f.2部分)所描述的ELISA 确定表达自所述mini six library的抗体组成。混合后在第8天、17 天、30天、45天、57天、72天和85天进行ELISA。图13显示所述 结果(三次重复实验的平均值±SD)。所有抗体在混合后第85天可检 测到。如前面提到的(实施例3，f.2部分)，所述不同抗体的读数不 能直接进行比较，但图13中展示的数据显示至少在混合后第45天仍 有相对稳定的表达特性，之后观察到产量总体下降。此外，从3个独 立混合物获得的结果比较显示：一段时间内所述mini six抗体有相似 的表达特性，表明结果是可重复的。
(c)实验结论
由细胞混合物组成的多克隆细胞培养物显示其组成能保持至混合 后至少45天，其中所述细胞用所述mini six library的不同成员单 个地转染。45天的组成保持期在大多数情况下足以满足生产目的。此 外，三次重复的实验给出了相似的结果，因此表明将用不同构建体单 个转染的细胞混合起来导致混合的细胞培养物具有较低的批与批之间 的变化。
实施例4
建立抗卵清蛋白重组多克隆抗体生产型细胞系
(a)表达抗卵清蛋白多克隆抗体组合物
如下鉴定已完全表征的卵清蛋白结合噬菌体克隆集合。用50μg 完全弗氏佐剂中的OVA通过腹腔注射和皮下注射免疫四只8周大小的 雌性BALA/C小鼠，并在免疫(第0天)后第21天和42天用不完全弗 氏佐剂中的OVA加强免疫，并确定所有动物具有血清转换为抗OVA， 这通过抗原特异性ELISA进行测量。在第31天和52天从具有最佳反 应的小鼠获取脾。如前面描述的使用噬菌体载体(Symvc10)从脾RNA 产生Fab展示噬菌体文库。最终产生的文库含有约106个独立克隆。 通过使5x1011个Fab展示噬菌体与覆盖在NUNC免疫管上的OVA反应对 这些文库进行选择，接着冲洗并用酸洗脱结合噬菌体。由于来自第一 轮筛选的洗脱物含有很大比例的OVA结合者，因此从来自第一和第二 轮筛选的洗脱物中筛选OVA结合噬菌体克隆。
最初，通过ELISA鉴定OVA反应性噬菌体克隆。简短地，用OVA 涂布ELISA板并用噬菌体展示Fabs与之反应，接着与HRP连接的第二 抗体反应。作为阴性对照，使用了无关的抗原(BSA)或无关的噬菌体 展示Fabs(抗AP)。
此外，建立基于将OVA固定在PVDF膜上的HDS方法。这两种方法 导致鉴定了不同的克隆亚类，一些克隆识别一个实验(set-up)中的 OVA而不识别另一实验中的OVA，反之亦然。对于通过ELISA或HDS 与OVA起反应的Fab展示噬菌体克隆，通过DNA测序对编码VH可变结 构域的核酸序列进行确定，并且使用Vector NTI软件包通过系统发生 分析对遗传多样性进行估算。最终获得的组包含127个OVA结合克隆， 所有这些克隆的VH可变部分的核酸序列都得以确定。
所有由所述127个OVA-结合克隆表达的Fab片段都具有与天然或 变性形式的卵清蛋白结合的能力。根据这个技术我们已经鉴定了大约 30个含于噬菌体载体例如pSymvc10中的不同克隆，用于整体转移和 哺乳动物表达。这些抗体以小鼠IgA、IgG2A或IgG2B抗体的形式表 达。因为我们已经完全鉴定了这些抗体产生克隆的DNA序列的特征， 所以我们能够在整体转移和哺乳动物表达过程中监控基因型的分布， 所用方法与用于如实施例3描述的具有所述6个不同抗体的模式系统 的方法相同。
(b)将OVA特异性抗体序列整体转移至用于哺乳动物表达的载体
从噬菌体载体将目的基因转移到表达载体有2个步骤(图4中说 明)，其中第一步是用具有头对头朝向的选择的哺乳动物启动子的启 动子盒进行启动子交换，这之后将目的基因的可变区和启动子盒转移 到表达载体上。使用SacI/XhoI消化接着连接，可将头对头启动子盒 (启动子A/启动子B)插入到各克隆中的噬菌体载体中，导致了从细 菌启动子与哺乳动物启动子(pSymvc12)的交换。
接着EcoRI和NotI的消化将把编码可变重链、头对头启动子盒(启 动子A/启动子B)和完整的kappa链的序列从噬菌体载体(pSymvc12) 移到同种型编码载体pSymvc20中。所述pSymvc20载体可接受任何来 自噬菌体载体的NotI/EcoRI片段。这个片段将把编码可变重链的序列 转移连接到pSymvc20上的恒定重链序列以及将整个编码kappa链的序 列与bGH PolyA序列连接。这个整体转移将产生如图1显示的表达载 体，所述载体在整体转移后表达作为小鼠IgG2B抗体的可变重链区和 整个kappa链。
所述载体pSymvc20含有IgA、IgG2A、IgG2B、IgE或IgG1基因 的小鼠重链恒定区，于是能够表达任何相关的目的小鼠免疫球蛋白同 种型。
(c)表达抗卵清蛋白重组多克隆抗体
通过整体转移，将编码重链可变区、启动子和完整kappa链的序 列从噬菌体载体文库移到同种型编码载体上，形成了多克隆哺乳动物 表达载体组合物。这之后通过转染和位点特异性整合整合到 CHO-Flp-In细胞系中，产生了重组多克隆抗体生产型细胞系。后者通 过将编码所述重组多克隆蛋白质的各成员的目的基因靶向整合到各转 染细胞基因组的相同特异性座位而产生，其中在同一时间只有一个拷 贝的含有所述核酸序列的表达构建体整合到各转染的细胞中。
所述细胞培养和转染和选择的方法与实施例3(e.1-e.3)描述的 相同。
(d)监控组合物的稳定性
为了确保整体转移和转染入哺乳动物细胞时不会在单个克隆之间 的克隆、表达和多样性方面引入差异，因此可以用下列方法监控整体 转移和哺乳动物表达的过程：
1)分析来自各转染构建体的细胞集合的传代时间，
2)分析来自各转染构建体的细胞集合的表达水平，
3)对单个细胞进行RFLP分析，
4)对产生的抗体混合物进行ELISA，
5)对产生的抗体混合物进行质谱分析，
6)使用V区特异性引物通过Taqman PCR(实时PCR)对确定的 批次大小进行分析以确定各不同克隆的比例，或
7)使用下列参数对一段时间内用和不用选择压力(潮霉素)培 养的批次进行分析：
a)克隆分布
b)蛋白质表达水平(数量和分布)
c)基因组稳定性
d)对无血清培养基适应性的影响
e)抗卵清蛋白重组多克隆抗体组合物的生产
重组多克隆抗体产生型CHO-Flp-In细胞系培养在不同的培养系 统中，包括传统的小培养瓶、Nunc多层细胞工厂和小型高产量生物反 应器(MiniPerm，INTEGRA-CELLine)。此外，使所述细胞系适应无血 清悬浮培养以随后在旋转瓶、中空纤维和生物反应器中培养。
用于生长选择的细胞系的培养基是如厂商(Invitrogen，B&D， Hyclone)推荐的无血清、无蛋白或化学成分确知的培养基。
收集培养在无选择(潮霉素)压力下的粘附的或悬浮的细胞的上 清液。如(3f)所描述的分析和鉴定收集的上清液的特性。细胞在补 料分批或灌流条件下生长期间或之后对其产生的抗体的产量、功能和 质量进行检测。悬浮生长的细胞用于更大旋转瓶或生物反应器接种。
纯化来自收集的上清液的多克隆抗体为以后在动物实验中使用。
从此处公开的本发明的说明书和实践来考虑，本发明的其它实施 方案和应用对本领域技术人员来说是显而易见的。也就是说所述说明 书和实施例仅被认为是作为例子的，下列权利要求表明本发明的真实 范围和精神。
序列表
<110>Symphogen A/S
<120>用于生产重组多克隆蛋白质的方法
<130>15685PCT00
<160>7
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>48
<212>DNA
<213>啤酒糖酵母
<400>1
gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttc 48
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>2
gcattgacag gaggttgagg c 21
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>3
gctgccgacc gctgctgctg gtc 23
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>4
gcattgacag gaggttgagg c 21
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>5
gtgtccactc tgaggttcag 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>6
caaatagccc ttgaccaggc 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的PCR引物
<400>7
gtgtccactc tgaggttcag 20
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