一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用专利检索-PER基因遗传学专利检索查询-专利查询网

一种用于微 生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用

阅读：990发布：2020-05-23

专利汇可以提供一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用。本发明构建的CRISPR/Cas9基因载体，包括复制起始位点、筛选标记基因、Cas9蛋白基因、gRNA的编码DNA、同源重组元件和操纵子。本发明构建的CRISPR/Cas9基因载体能够对大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌基因组进行编辑(包括基因或者DNA序列的敲除、置换、插入等操作)，具有试验周期短、节省时间和成本、效率高等优点。，下面是一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.载体，包括复制起始位点、筛选标记基因、Cas9蛋白基因和gRNA的编码DNA，所述gRNA识别受体菌的目的DNA，所述受体菌的目的DNA具有5’-(N)X-NGG-3’结构，(N)X表示X个N，N为A、G、C或T，X为大于5的一个自然数；其特征在于：所述载体包括同源重组元件和操纵子；
所述同源重组元件含有用于进行同源重组的DNA片段，所述同源重组元件通过与所述受体菌的基因组DNA靶位点附近发生同源重组从而实现所述靶位点的基因组编辑；
所述操纵子调控所述Cas9蛋白基因的转录，或调控所述Cas9蛋白基因和所述gRNA的编码DNA的转录。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述载体含有终止所述Cas9蛋白基因转录的终止子和启动所述gRNA的编码DNA转录的启动子。
3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：所述操纵子为阿拉伯糖操纵子，所述阿拉伯糖操纵子由操纵区域和调控蛋白基因组成。
4.根据权利要求1-3中任一所述的载体，其特征在于：所述载体为1)-3)中任一种载体：
1)所述载体由权利要求3所述操纵区域、与所述操纵区域连接的权利要求1所述Cas9蛋白基因、与所述Cas9蛋白基因连接的权利要求2所述的终止子、与所述终止子连接的权利要求2所述的启动子、与所述启动子连接的权利要求1所述gRNA的编码DNA、与所述gRNA的编码DNA连接的权利要求1所述复制起始位点、与所述复制起始位点连接的权利要求3所述阿拉伯糖操纵子、与所述阿拉伯糖操纵子连接的同源重组系统、与所述同源重组系统连接的orf60a基因，与所述orf60a基因连接的权利要求1所述同源重组元件、与所述同源重组元件连接的权利要求1所述筛选标记基因组成；
2)所述载体包括Red同源重组系统；
3)所述载体的核苷酸序列为SEQ ID No.1。
5.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述载体含有终止所述Cas9蛋白基因转录的终止子、启动所述gRNA的编码DNA转录的启动子和终止所述gRNA的编码DNA转录的终止子。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于：所述操纵子为乳糖操纵子，所述乳糖操纵子由laclq基因和Ptrc启动子组成。
7.根据权利要求5或6所述的载体，其特征在于：所述载体为1)或2)的载体：
1)所述载体由权利要求6所述乳糖操纵子、与所述乳糖操纵子连接的权利要求1所述Cas9蛋白基因、与所述Cas9蛋白基因连接的权利要求5所述终止所述Cas9蛋白基因转录的终止子、与所述终止所述Cas9蛋白基因转录的终止子连接的权利要求5所述的启动子、与所述启动子连接的权利要求1所述gRNA的编码DNA、与所述gRNA的编码DNA连接的权利要求5所述终止所述gRNA的编码DNA转录的终止子、与所述终止所述gRNA的编码DNA转录的终止子连接的per基因，与所述per基因连接的所述权利要求1所述复制起始位点、与所述复制起始位点连接的权利要求1所述筛选标记基因、与所述筛选标记基因连接的权利要求1所述同源重组元件组成；
2)所述载体的核苷酸序列为SEQ ID No.2。
8.用于构建权利要求1-7中任一所述载体的成套DNA分子，为下述a1-a4中任一成套DNA分子：
a1、包括模块A、模块B、模块C和模块D，所述模块A含有权利要求1所述筛选标记基因、权利要求3所述操纵区域和权利要求1所述Cas9蛋白基因；所述模块B含有gRNA的骨架DNA、权利要求1所述复制起始位点和权利要求3所述操纵子；所述模块C含有权利要求
1所述5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X；所述模块D含有权利要求1所述同源重组元件；所述gRNA的骨架DNA为将权利要求1所述gRNA的编码DNA中的所述(N)X去除得到的DNA；
a2、包括所述模块A、所述模块B、所述模块C和所述模块D，所述模块A还含有权利要求
2所述的终止子和权利要求2所述的启动子；所述模块B还含有权利要求4所述的Red同源重组系统和权利要求4所述的orf60a基因；
a3、包括模块E、模块F、模块G和模块H，所述模块E含有权利要求6所述操纵子和权利要求1所述Cas9蛋白基因；所述模块F含有所述gRNA的骨架DNA、权利要求1所述复制起始位点和权利要求1所述筛选标记基因；所述模块G含有权利要求1所述5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X；所述模块H含有权利要求1所述同源重组元件；所述gRNA的骨架DNA为将权利要求1所述gRNA的编码DNA中的所述(N)X去除得到的DNA；
a4、包括所述模块E、所述模块F、所述模块G和所述模块H，所述模块E还含有权利要求
5所述终止Cas9蛋白基因转录的终止子和权利要求5所述的启动子；所述模块F还含有权利要求5所述终止gRNA的编码DNA转录的终止子和权利要求7所述per基因；
所述a1或所述a2的成套DNA分子为构建权利要求1-4中任一所述载体的DNA分子；
所述a3或所述a4的成套DNA分子为构建权利要求1、或权利要求5-7中任一所述载体的DNA分子。
9.权利要求1所述载体的构建方法，为将权利要求8所述的成套DNA分子中的各模块连接得到所述载体。

说明书全文

一种用于微 生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因编辑领域中一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用。

背景技术

[0002] 对基因进行定点编辑，是生物研究领域重要的方法之一。随着科学的发展，出现了越来越多的基因编辑技术，从经典的EMS随机诱变、T-DNA插入诱变或转座子插入失活到锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)技术和转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)技术，这些技术都大大地促进了基因功能研究的进程。但由于ZFN技术与TALEN技术需要针对每一个目的基因设计特定的内切酶，且构建过程繁琐，大大限制了其应用范围。与其它沉默体系相比，规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats),CRISPR)技术有其无法比拟的优点，逐渐被广泛地应用于基因定点修饰研究中。

[0003] CRISPR/Cas系统最早是在细菌的天然免疫系统内发现的，其主要功能是对抗入侵的病毒及外源DNA，该系统主要依赖于CRISPRRNA(crRNA)与Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的原间隔物模块(protospacer-adjacent motif,PAM)对入侵噬菌体或质粒进行特异性切割。CRISPR系统主要有三种类型，其中II型体系仅需要一个Cas9蛋白、crRNA与反式激活的crRNA(tracrRNA)就能行使其功能。有研究表明将crRNA与tracrRNA整合成向导RNA(guide RNA,gRNA)并不影响CRISPR/Cas9体系的作用。2013年8月，自然生物技术期刊上首次同时发表了三篇有关CRISPR/Cas9体系成功应用于植物基因修饰的研究。之后，CRISPR/Cas9体系被广泛地应用于动植物的研究上，而在微生物中的研究较少。近期有研究报道将CRISPR/Cas系统应用于大肠杆菌的多基因编辑，但是其采用的是多质粒系统，操作复杂，所需时间较长。因此构建出操作方便、适用于微生物的CRISPR/Cas9系统具有重要的意义。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何构建出利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对大肠杆菌进行编辑的单一载体或谷氨酸棒状杆菌基因组进行编辑的单一载体。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了两种载体，一种是大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体，一种是谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体。

[0006] 本发明所提供的大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体和谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体，均包括复制起始位点(origin)、筛选标记基因、Cas9蛋白基因和gRNA的编码DNA，所述gRNA识别受体菌的目的DNA，所述受体菌的目的DNA具有5’-(N)X-NGG-3’结构，(N)X表示X个N，N为A、G、C或T，X可为大于5的一个自然数；其特征在于：所述载体包括同源重组元件和操纵子；

[0007] 所述同源重组元件含有用于进行同源重组的DNA片段，所述同源重组元件通过与所述受体菌的基因组DNA靶位点附近发生同源重组从而实现所述靶位点的基因组编辑(包括删除、插入、替换等)；

[0008] 所述操纵子调控所述Cas9蛋白基因的转录，或调控所述Cas9蛋白基因和所述gRNA的编码DNA的转录。

[0009] 上述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体和上述谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体中，所述X具体可为20。

[0010] 上述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体中，含有终止所述Cas9蛋白基因转录的终止子和启动所述gRNA的编码DNA转录的启动子。

[0011] 上述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体中，所述操纵子为阿拉伯糖操纵子，所述阿拉伯糖操纵子由操纵区域和调控蛋白基因组成，所述调控蛋白基因具体可为AraC蛋白基因，所述阿拉伯糖操纵子调控所述Cas9蛋白基因的转录和Red同源重组系统的转录。

[0012] 上述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体为1)-3)中任一种载体：

[0013] 1)所述载体由所述阿拉伯糖操纵子的操纵区域、与所述操纵区域连接的所述Cas9蛋白基因、与所述Cas9蛋白基因连接的所述终止所述Cas9蛋白基因转录的终止子、与所述终止所述Cas9蛋白基因转录的终止子连接的所述启动所述gRNA的编码DNA转录的启动子、与所述启动所述gRNA的编码DNA转录的启动子连接的所述gRNA的编码DNA、与所述gRNA的编码DNA连接的所述复制起始位点、与所述复制起始位点连接的所述阿拉伯糖操纵子、与所述阿拉伯糖操纵子连接的同源重组系统、与所述同源重组系统连接的orf60a基因，与所述orf60a基因连接的所述同源重组元件、与所述同源重组元件连接的所述筛选标记基因组成；

[0014] 2)所述载体包括Red同源重组系统；

[0015] 3)所述载体的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

[0016] 上述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体中，1)所述载体的所述复制起始位点可包括oriR101基因和repA101基因；所述同源重组元件含有与所述受体菌的基因组DNA靶位点附近发生同源重组的上游同源臂和下游同源臂，或含有与所述受体菌的基因组DNA靶位点附近发生同源重组的上游同源臂、敲入基因和与所述受体菌的基因组DNA靶位点附近发生同源重组的下游同源臂；所述阿拉伯糖操纵子的操纵区域具体可为SEQ ID No.1的第7333-7684位的核苷酸序列或SEQ ID No.1的第11516-11867位的核苷酸序列；所述orf60a基因具体可为SEQ ID No.1的第9566-9748位所示的核苷酸序列。

[0017] 上述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体中，2)所述载体的所述Red同源重组系统由λ噬菌体exo、bet、gam三个基因组成，它们分别编码Exo、Beta、Gam三种蛋白质。

[0018] 上述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体中，3)所述载体的SEQ ID No.1的第10577-11371位的核苷酸序列为卡那霉素抗性基因；SEQ ID No.1的第11868-4059位的核苷酸序列为所述Cas9蛋白基因；SEQ ID No.1的第4060-4114位的核苷酸序列为所述终止Cas9蛋白基因转录的终止子；SEQ ID No.1的第4115-4158位的核苷酸序列为所述启动gRNA的编码DNA转录的启动子；SEQ ID No.1的第4183-4260位的核苷酸序列为所述gRNA的编码DNA；SEQ ID No.1的第4494-6188位的核苷酸序列为所述复制起始位点(origin)，所述复制起始位点(origin)包括所述oriR101基因和所述repA101基因，SEQ ID No.1的第4494-5444位的核苷酸序列为所述repA101基因，SEQ ID No.1的第5448-6188位的核苷酸序列为所述oriR101基因；SEQ ID No.1的第6452-7684位的核苷酸序列为所述阿拉伯糖操纵子，SEQ ID No.1的第6452-7330位所示的核苷酸序列为所述AraC蛋白基因，SEQ ID No.1的第7333-7684位的核苷酸序列和SEQ ID No.1的第11516-11867位的核苷酸序列均为所述操纵区域；SEQ ID No.1的第7658-9569位的核苷酸序列为所述Red同源重组系统；SEQ ID No.1的第9566-9748位的核苷酸序列为orf60a基因；SEQ ID No.1的第
9842-10436位的核苷酸序列为所述同源重组元件的上游同源臂和下游同源臂。

[0019] 上述谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体中，含有终止所述Cas9蛋白基因转录的终止子、启动所述gRNA的编码DNA转录的启动子和终止所述gRNA的编码DNA转录的终止子。

[0020] 上述谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体中，所述操纵子为乳糖操纵子，所述乳糖操纵子由lacIq基因和Ptrc启动子组成，调控所述Cas9蛋白基因的转录。

[0021] 上述谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体为1)或2)的载体：

[0022] 1)所述载体由所述乳糖操纵子、与所述乳糖操纵子连接的所述Cas9蛋白基因、与所述Cas9蛋白基因连接的所述终止所述Cas9蛋白基因转录的终止子、与所述终止所述Cas9蛋白基因转录的终止子连接的所述启动所述gRNA的编码DNA转录的启动子、与所述启动所述gRNA的编码DNA转录的启动子连接的所述gRNA的编码DNA、与所述gRNA的编码DNA连接的所述终止所述gRNA的编码DNA转录的终止子、与所述终止所述gRNA的编码DNA转录的终止子连接的per基因，与所述per基因连接的所述复制起始位点、与所述复制起始位点连接的所述筛选标记基因、与所述筛选标记基因连接的所述同源重组元件组成；

[0023] 2)所述载体的核苷酸序列为SEQ ID No.2。

[0024] 上述谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体中，1)所述的载体的所述复制起始位点可为repA101基因；所述同源重组元件含有与所述受体菌的基因组DNA靶位点附近发生同源重组的上游同源臂和下游同源臂；所述per基因具体可为SEQ ID No.2的第5422-5367位所示的核苷酸序列。

[0025] 上述谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体中，2)所述的载体的SEQ ID No.2的第11351-12735位的核苷酸序列为所述乳糖操纵子，SEQ ID No.2的第11351-12433位的核苷酸序列为乳糖操纵子中的lacIq基因，SEQ ID No.2的第12490-12735位的核苷酸序列为乳糖操纵子中的Ptrc启动子；SEQ ID No.2的第12755-4069位的核苷酸序列为所述Cas9蛋白基因；SEQ ID No.2的第4070-4124位的核苷酸序列为所述终止Cas9蛋白基因转录的终止子；SEQ ID No.2的第4125-4168位的核苷酸序列为所述启动gRNA的编码DNA转录的启动子；SEQ ID No.2的第4193-4270位的核苷酸序列为所述gRNA的编码DNA；SEQ ID No.2的第4271-4701位的核苷酸序列为所述终止gRNA的编码DNA转录的终止子；
SEQ ID No.2的第5422-5367位的核苷酸序列为per基因；SEQ ID No.2的第6280-7743位的核苷酸序列为所述复制起始位点(origin)，所述复制起始位点(origin)为repA101基因；SEQ ID No.2的第8273-9067位的核苷酸序列为卡那霉素抗性基因；SEQ ID No.2的第
9168-10173的核苷酸序列为所述同源重组元件的上游同源臂和下游同源臂。

[0026] 为解决上述技术问题，本发明还提供了用于构建所述载体的成套DNA分子。

[0027] 本发明所提供的用于构建所述载体的成套DNA分子，为下述a1-a4中任一成套DNA分子：

[0028] a1、具体可由模块A、模块B、模块C和模块D组成，所述模块A含有所述筛选标记基因、所述阿拉伯糖操纵子的操纵区域和所述Cas9蛋白基因；所述模块B含有gRNA的骨架DNA、所述复制起始位点和所述阿拉伯糖操纵子；所述模块C含有所述5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X；所述模块D含有所述同源重组元件；所述gRNA的骨架DNA为将所述gRNA的编码DNA中的所述(N)X去除得到的DNA；

[0029] a2、具体可由包括所述模块A、所述模块B、所述模块C和所述模块D，所述模块A还含有所述终止Cas9蛋白基因转录的终止子和所述启动gRNA的编码DNA转录的启动子；所述模块B还含有所述Red同源重组系统和所述orf60a基因；

[0030] a3、具体可由模块E、模块F、模块G和模块H组成，所述模块E含有所述乳糖操纵子和所述Cas9蛋白基因；所述模块F含有所述gRNA的骨架DNA、所述复制起始位点和所述筛选标记基因；所述模块G含有所述5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X；所述模块H含有所述同源重组元件；所述gRNA的骨架DNA为将所述gRNA的编码DNA中的所述(N)X去除得到的DNA；

[0031] a4、包括所述模块E、所述模块F、所述模块G和所述模块H，所述模块E还含有所述终止Cas9蛋白基因转录的终止子和所述启动gRNA的编码DNA转录的启动子；所述模块F还含有所述终止gRNA的编码DNA转录的终止子和所述per基因；

[0032] 所述a1或所述a2的成套DNA分子为构建所述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体的DNA分子；

[0033] 所述a3或所述a4的成套DNA分子为构建所述谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体的DNA分子。

[0034] 上述a1或上述a2所述的成套DNA分子中，所述筛选标记基因可为SEQ ID No.1的第10577-11371位的核苷酸所示的卡那霉素抗性基因；所述Cas9蛋白基因可为SEQ ID No.1的第11868-4059位的核苷酸序列；所述终止Cas9蛋白基因转录的终止子可为SEQ ID No.1的第4060-4114位所示的核苷酸序列；所述启动gRNA的编码DNA转录的启动子可为SEQ ID No.1的第4115-4158位所示的核苷酸序列；所述gRNA的骨架DNA可为SEQ ID No.1的第4183-4260位所示的核苷酸序列；所述复制起始位点(origin)可为SEQ ID No.1的第4494-6188位所示的核苷酸序列，所述repA101蛋白基因可为SEQ ID No.1的第4494-5444位所示的核苷酸，所述oriR101基因可为SEQ ID No.1的第5448-6188位所示的核苷酸；
所述阿拉伯糖操纵子可为SEQ ID No.1的第6452-7684位所示的核苷酸序列，所述AraC蛋白基因可为SEQ ID No.1的第6452-7330位所示的核苷酸序列，所述操纵区域可为SEQ ID No.1的第7333-7684位所示的核苷酸序列或SEQ ID No.1的第11516-11867位所示的核苷酸序列；所述Red同源重组系统可为SEQ ID No.1的第7658-9569位所示的核苷酸序列；所述调控Cas9蛋白基因转录的阿拉伯糖操纵子操纵区域可为SEQ ID No.1的第11516-11867位所示的核苷酸序列；所述受体菌的目的DNA[含有5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X，X为
20]可为SEQ ID No.1的第4163-4182位所示的核苷酸序列；所述同源重组元件的上游同源臂和下游同源臂可为SEQ ID No.1的第9842-10436位所示的核苷酸序列。

[0035] 上述a3或上述a4所述的成套DNA分子中，所述乳糖操纵子可为SEQ ID No.2的第11351-12735位所示的核苷酸序列，所述乳糖操纵子中的lacIq基因可为SEQ ID No.2的第11351-12433位所示的核苷酸序列，所述乳糖操纵子中的Ptrc启动子可为SEQ ID No.2的第12490-12735位所示的核苷酸序列；所述Cas9蛋白基因可为SEQ ID No.2的第12755-4069位的核苷酸序列；所述终止Cas9蛋白基因转录的终止子可为SEQ ID No.2的第4070-4124位所示的核苷酸序列；所述启动gRNA的编码DNA转录的启动子可为SEQ ID No.2的第4125-4168位所示的核苷酸序列；所述gRNA的骨架DNA可为SEQ ID No.2的第
4193-4270位所示的核苷酸序列；所述终止gRNA的编码DNA转录的终止子可为SEQ ID No.2的第4271-4701位所示的核苷酸序列；所述per基因可为SEQ ID No.2的第5422-5367位所示的核苷酸序列；所述复制起始位点(origin)可为repA101基因，可为SEQ ID No.21的第6280-7743位所示的核苷酸序列；所述筛选标记基因可为SEQ ID No.2的第8273-9067位的核苷酸所示的卡那霉素抗性基因；所述受体菌的目的DNA[含有5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X，X为20]可为SEQ ID No.2的第4173-4192位所示的核苷酸序列；所述同源重组元件的上游同源臂和下游同源臂可为SEQ ID No.2的第9168-10173所示的核苷酸序列。

[0036] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体和所述谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法。

[0037] 本发明所提供的所述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体的快速构建方法，为将上述a1或上述a2所述的成套DNA分子中的各模块连接得到所述载体；具体可为将所述模块A、所述模块B和所述模块D的两端加上限制性核酸内切酶BsaI位点，分别得到含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块A、含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块B和含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块D；将所述模块C的两端分别加上与所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块A和所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块B的粘性末端互补的粘性末端，得到含有互补粘性末端的模块C；将所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块A、所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块B、所述含有互补粘性末端的模块C和所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块D进行反应连接，得到所述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体。

[0038] 上述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法中，所述限制性核酸内切酶BsaI为IIs型限制性内切酶；所述限制性核酸内切酶BsaI位点包括所述限制性核酸内切酶BsaI的识别位点和切割位点，如下图所示：

[0039]

[0040] 上述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法中，所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块A、所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块B、所述含有互补粘性末端的模块C和所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块D的摩尔比可为(0.1-10):(0.1-10):(1-100):(0.1-10)，具体可为1:1:10:1。

[0041] 上述大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法中，所述反应条件可为：37℃反应3min；16℃反应4min，共进行25个循环；50℃反应5min，然后80反应5min。

[0042] 本发明所提供的所述谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体的快速构建方法，为将上述a3或上述a4所述的成套DNA分子中的各模块连接得到所述载体；具体可为将所述模块E、所述模块F和所述模块H的两端加上限制性核酸内切酶BsaI位点，分别得到含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块E、含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块F和含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块H；将所述模块G的两端分别加上与所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块E和所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块F的粘性末端互补的粘性末端，得到含有互补粘性末端的模块G；将所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块E、所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块F、所述含有互补粘性末端的模块G和所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块H进行反应链接，得到所述谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体。

[0043] 上述谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法中，所述限制性核酸内切酶BsaI为IIs型限制性内切酶；所述限制性核酸内切酶BsaI位点包括所述限制性核酸内切酶BsaI的识别位点和切割位点，如下图所示：

[0044]

[0045] 上述谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法中，所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块E、所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块F、所述含有互补粘性末端的模块G和所述含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块H的摩尔比摩尔比可为(0.1-10):(0.1-10):(1-100):(0.1-10)，具体可为1:1:10:1。

[0046] 上述谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法中，所述反应条件可为：37℃反应3min；16℃反应4min，共进行25个循环；最后80反应5min。

[0047] 实验证明，利用本发明构建的CRISPR/Cas9基因编辑单一载体对大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌基因组进行编辑(包括基因或者DNA序列的敲除、置换、插入等操作)，具有试验周期短、节省时间和成本、效率高等优点。该方法仅使用一个大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体即可以完成对大肠杆菌的快速编辑，大肠杆菌编辑效率能达到100％。该方法仅使用一个谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体即可以完成对谷氨酸棒状杆菌基因组的快速编辑，谷氨酸棒状杆菌编辑效率达到5％。附图说明

[0048] 图1为大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体的结构示意图。

[0049] 图2为模块A的结构示意图。

[0050] 图3为模块B的结构示意图。

[0051] 图4为利用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体进行基因敲除实验的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1,2和8为对照组的大肠杆菌；3、4、5、6、7、9、10、11、12、13和14为实验组的大肠杆菌；M为DNA分子量Marker。

[0052] 图5为利用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体进行基因敲入实验的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1和10为对照组的大肠杆菌；2、3、4、5、6、7、8和9为实验组的大肠杆菌；M为DNA分子量Marker。

[0053] 图6为谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体的结构示意图。

[0054] 图7为模块E的结构示意图。

[0055] 图8为模块F的结构示意图。

[0056] 图9为利用谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体进行基因敲入实验的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1为对照组的大肠杆菌；2-21均为实验组的大肠杆菌；M为DNA分子量Marker。

具体实施方式

[0057] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

[0058] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0059] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0060] 下述实施例中的大肠杆菌 K-12 MG1655(E.coli K-12 MG1655)(Blattner et al.The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.Science,1997,277:1453-1462.)公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

[0061] 下述实施例中的谷氨酸棒状杆菌(谷氨酸棒杆菌)为中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)的产品，产品编号为：20888。

[0062] 下述实施例中的LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，去离子水1L。

[0063] 下述实施例中的LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂15g，去离子水1L。

[0064] 实施例一、利用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体对大肠杆菌K-12 MG1655进行基因编辑

[0065] 大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体由阿拉伯糖操纵子的操纵区域、与操纵区域连接的Cas9蛋白基因、与Cas9蛋白基因连接的终止Cas9蛋白基因转录的终止子、与终止Cas9蛋白基因转录的终止子连接的启动gRNA的编码DNA转录的启动子、与启动gRNA的编码DNA转录的启动子连接的gRNA的编码DNA、与gRNA的编码DNA连接的复制起始位点(包括repA101基因和oriR101基因)、与复制起始位点连接的阿拉伯糖操纵子(包括AraC蛋白基因和操纵区域)、与阿拉伯糖操纵子连接的Red同源重组系统、与Red同源重组系统连接的orf60a基因，与orf60a基因连接的同源重组元件、与同源重组元件连接的卡那霉素抗性基因组成。

[0066] SEQ ID No.1所示的大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体(又为载体pj5 0033)中(图1)，SEQ ID No.1的第10577-11371位的核苷酸序列为卡那霉素抗性基因；SEQ ID No.1的第11868-4059位的核苷酸序列为Cas9蛋白基因；SEQ ID No.1的第4060-4114位的核苷酸序列为终止Cas9蛋白基因转录的终止子；SEQ ID No.1的第4115-4158位的核苷酸序列为启动gRNA的编码DNA转录的启动子；SEQ ID No.1的第4183-4260位的核苷酸序列为gRNA的骨架DNA；SEQ ID No.1的第4494-5444位的核苷酸序列为repA101蛋白基因；SEQ ID No.1的第5448-6188位的核苷酸序列为oriR101基因；SEQ ID No.1的第6452-7684位的核苷酸序列为阿拉伯糖操纵子，SEQ ID No.1的第6452-7330位的核苷酸序列为阿拉伯糖操纵子中的AraC蛋白基因；SEQ ID No.1的第7333-7684位的核苷酸序列和SEQ ID No.1的第11516-11867位的核苷酸序列均为阿拉伯糖操纵子中的操纵区域；SEQ ID No.1的第7658-9569位的核苷酸序列为Red同源重组系统；SEQ ID No.1的第9566-9748位的核苷酸序列为orf60a基因；SEQ ID No.1的第4163-4182位所示的核苷酸序列为受体菌的目的DNA[含有5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X，X为20]；SEQ ID No.1的第9842-10436位所示的核苷酸序列为同源重组元件的上游同源臂和下游同源臂。

[0067] 大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体采用模块的方式构建，各个模块的接头以Goldengate的思路进行设计：在各个模块的两端加上限制性核酸内切酶BsaI的位点或互补的粘性末端，酶切位点通过PCR引物的方式添加。

[0068] 大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体包括模块A、模块B、模块C和模块D，模块A含有筛选标记基因、Cas9蛋白基因、阿拉伯糖操纵子中的操纵区域、终止Cas9蛋白基因转录的终止子和启动gRNA的编码DNA转录的启动子(图2)；模块B含有gRNA的骨架DNA、复制起始位点的repA101基因和oriR101基因、阿拉伯糖操纵子中的AraC蛋白基因和操纵区域、Red同源重组系统和orf60a基因(图3)；模块C含有5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X，X为20；模块D含有同源重组元件，同源重组元件含有与受体菌的基因组DNA靶位点附近发生同源重组的上游同源臂和下游同源臂，或含有与受体菌的基因组DNA靶位点附近发生同源重组的上游同源臂、敲入基因和与受体菌的基因组DNA靶位点附近发生同源重组的下游同源臂；gRNA的骨架DNA为将gRNA的编码DNA中的(N)X去除得到的DNA。

[0069] 大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体中，筛选标记基因为SEQ ID No.1的第10577-11371位的核苷酸所示的卡那霉素抗性基因；Cas9蛋白基因为SEQ ID No.1的第
11868-4059位所示的核苷酸序列；终止Cas9蛋白基因转录的终止子为SEQ ID No.1的第
4060-4114位所示的核苷酸序列；启动gRNA的编码DNA转录的启动子为SEQ ID No.1的第
4115-4158位所示的核苷酸序列；gRNA的骨架DNA为SEQ ID No.1的第4183-4260位所示的核苷酸序列；repA101蛋白基因为SEQ ID No.1的第4494-5444位的核苷酸；oriR101基因为SEQ ID No.1的第5448-6188位的所示的核苷酸序列；阿拉伯糖操纵子为SEQ ID No.1的第6452-7684位所示的核苷酸序列，阿拉伯糖操纵子中的AraC蛋白基因为SEQ ID No.1的第6452-7330位所示的核苷酸序列，操纵区域为SEQ ID No.1的第7333-7684位所示的核苷酸序列或SEQ ID No.1的第11516-11867位所示的核苷酸序列；Red同源重组系统为SEQ ID No.1的第7658-9569位所示的核苷酸序列；受体菌的目的DNA[含有5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X，X为20]为SEQ ID No.1的第4163-4182位所示的核苷酸序列；同源重组元件的上游同源臂和下游同源臂为SEQ ID No.1的第9842-10436位所示的核苷酸序列。

[0070] 一、利用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体对大肠杆菌K-12 MG1655进行基因敲除实验

[0071] 模块A和模块B通过PCR反应获得限制性核酸内切酶BsaI位点，得到两端带有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块A和两端带有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块B；模块A的PCR反应所用的引物对为Part1-F(5’-CCAGGTCTCAGCTCTGCTGAATGGAAGCTTGGATTCTCACC-3’)和Part1-R(5’-CCAGGTCTCACGCTTAAGATCTGACTCCATAACAGAGTACTCGCC-3’)，模块B的PCR反应所用的引物对为Part2-F(5’-CCAGGTCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’)和Part2-R(5’-CCAGGTCTCAGCACCACAGGCCCATGGATTCTTCG-3’)。

[0072] 大肠杆菌K-12 MG1655中目的DNA的5’-(N)20-NGG-3’结构中N20片段直接通过合成两条互补的引物通过退火方式获得，其中引物的5’进行磷酸化处理，引物的两端分别加上与两端带有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块A和两端带有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块B连接的四个碱基的粘性末端，具体的序列为(5’→3’)：AGCGGCCGACACGTTAGTGCTACT和AAACAGTAGCACTAACGTGTCGGC，带下划线的即为添加的粘性末端，N20的两条片段通过退火并在两端进行配对成双链DNA，获得含有互补粘性末端的模块C。

[0073] 对于基因敲除，同源重组元件中的左右同源臂，以大肠杆菌K-12 MG1655的基因组为模板，通过PCR反应的方式获得，其中左同源臂(即为上游同源臂)两端的引物分别添加(5’→3’)CCAGGTCTCAGTGC和CCAGGTCTCACGCT序列，右同源臂(即为下游同源臂)两端分别添加(5’→3’)CCAGGTCTCAAGCG和CCAGGTCTCAGAGC序列，获得含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块D，含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块D包括左同源臂和右同源臂。

[0074] 含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块A、含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块B、含有互补粘性末端的模块C和含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块D通过如下体系连接成编辑载体(图1)：20μL反应体系中含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块A2.7E-8mol(约为50ng)，含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块B2.7E-8mol，含有互补粘性末端的模块C 2.7E-7mol；含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块D的左同源臂和右同源臂以等摩尔量加入，均为2.7E-8mol；BsaI酶1μL，T4 DNA Ligase 1μL，10×T4 buffer
2μL，10xBSA蛋白溶液2μL，用水补齐至20μL，并通过如下反应条件进行连接：37℃反应
3min；16℃反应4min，共进行25个循环；50℃反应5min，然后80反应5min。反应结束后，获得大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体溶液。取5μL大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体溶液电转入大肠杆菌K-12 MG1655感受态细胞中，并在含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的5mL LB液体培养基中筛选培养，获得大肠杆菌K-12 MG1655阳性转化子，将大肠杆菌K-12 MG1655阳性转化子转入含有浓度为50μg/mL的卡那霉素和浓度为1mg/mL的阿拉伯糖的LB液体培养基中诱导并过夜培养，获得诱导培养的大肠杆菌K-12 MG1655，将诱导培养的大肠杆菌K-12 MG1655在含有浓度为50μg/mL的卡那霉素和浓度为1mg/mL的阿拉伯糖的LB固体培养基中划线培养，获得poxb基因(Genbank登录号ALI50137.1)被敲除的大肠杆菌K-12 MG1655，记为实验组；对照组为将大肠杆菌K-12 MG1655阳性转化子直接转入含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，获得大肠杆菌K-12 MG1655菌液，将大肠杆菌K-12 MG1655菌液于含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB固体培养基中划线培养，获得poxb基因未被敲除的大肠杆菌K-12 MG1655。

[0075] 分别挑选11株实验组poxb基因被敲除的大肠杆菌K-12 MG1655的单菌落和3株对照组poxb基因未被敲除的大肠杆菌K-12 MG1655的单菌落，分别进行菌落PCR验证，验证引物为pkd_poxb-F：CGCCTTATGCCCGATGATATTC和pkd_poxb-R：CCAGCACGCTGTTGTTAAAGAC，对于获得的PCR扩增引物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图4所示，实验组的11株菌株均完成poxb基因敲除，PCR片段大小为1008bp；对照组的3株菌株poxb基因均未被敲除，PCR片段大小为1521bp。

[0076] 编辑效率＝编辑成功的菌落数/实验组总菌落数×100％。

[0077] 采用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体对大肠杆菌K-12 MG1655进行基因编辑(poxb基因敲除)的编辑效率为100％。

[0078] 二、利用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体对大肠杆菌K-12 MG1655进行基因敲入实验

[0079] 含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块A、含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块B和含有互补粘性末端的模块C的制备方法同步骤一。

[0080] 对于基因敲入，同源重组元件中的左右同源臂，以大肠杆菌K-12 MG1655的基因组为模板，通过PCR反应的方式获得，其中左同源臂(即为上游同源臂)两端的引物分别添加(5’→3’)CCAGGTCTCAGTGC和CCAGGTCTCACGCT序列，右同源臂(即为下游同源臂)两端分别添加(5’→3’)CCAGGTCTCATCCG和CCAGGTCTCAGAGC序列；敲入基因以rfp基因(核苷酸序列为SEQ ID No.3)为模板，通过PCR方式获得，其中引物两端分别添加(5’→3’)CCAGGTCTCAAGCG和CCAGGTCTCACGGA序列；含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块D包括左同源臂、敲入基因和右同源臂。

[0081] 含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块A、含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块B、含有互补粘性末端的模块C和含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块D通过如下体系连接成编辑质粒：20μL反应体系中含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块A2.7E-8mol(约为50ng)含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块B 2.7E-8mol，含有互补粘性末端的模块C 2.7E-7mol；含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块D的左同源臂和右同源臂以等摩尔量加入，均为2.7E-8mol；BsaI酶1μL，T4 DNA Ligase 1μL，10×T4 buffer
2μL，10xBSA蛋白溶液2μL，用水补齐至20μL，并通过如下反应条件进行链接：37℃反应
3min；16℃反应4min，共进行25个循环；50℃反应5min，然后80反应5min。反应结束后，获得大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体溶液。取5μL大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体溶液电转入大肠杆菌K-12 MG1655感受态细胞中，并在含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的5mL LB液体培养基中筛选培养，获得大肠杆菌K-12 MG1655阳性转化子，将大肠杆菌K-12 MG1655阳性转化子转入含有浓度为50μg/mL的卡那霉素和浓度为1mg/mL的阿拉伯糖的LB液体培养基中诱导过夜培养，获得诱导培养的大肠杆菌K-12 MG1655，将诱导培养的大肠杆菌K-12 MG1655在含有浓度为50μg/mL的卡那霉素和浓度为1mg/mL的阿拉伯糖的LB固体培养基中划线培养，获得含有敲入基因的大肠杆菌K-12 MG1655，记为实验组；对照组为将大肠杆菌K-12 MG1655阳性转化子直接转入含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，获得大肠杆菌K-12 MG1655菌液，将大肠杆菌K-12 MG1655菌液于含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB固体培养基中划线培养，获得未被编辑的大肠杆菌K-12 MG1655。

[0082] 分别挑选8株实验组含有敲入基因的的大肠杆菌K-12 MG1655的单菌落和2株对照组未被编辑的大肠杆菌K-12 MG1655的单菌落，分别进行菌落PCR验证，验证引物为pkd_poxb_F：CGCCTTATGCCC GATGATATTC和pkd_poxb_R：CCAGCACGCTGTTGTTAAAGAC，对于获得的PCR扩增引物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图5所示，实验组的8株菌株均含有敲入基因，PCR片段大小为1823bp；对照组的2株菌株均为未被编辑的大肠杆菌K-12 MG1655，PCR片段大小为1521bp。

[0083] 编辑效率＝编辑成功的菌落数/实验组总菌落数×100％。

[0084] 采用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体对大肠杆菌K-12 MG1655进行基因编辑(rfp基因敲入)的编辑效率为100％。

[0085] 实施例二、利用谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体对谷氨酸棒状杆菌进行基因编辑

[0086] 谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体由乳糖操纵子、与乳糖操纵子连接的Cas9蛋白基因、与Cas9蛋白基因连接的终止Cas9蛋白基因转录的终止子、与终止Cas9蛋白基因转录的终止子连接的启动gRNA的编码DNA转录的启动子、与启动gRNA的编码DNA转录的启动子连接的gRNA的编码DNA、与gRNA的编码DNA连接的终止gRNA的编码DNA转录的终止子、与终止gRNA的编码DNA转录的终止子连接的per基因，与per基因连接的复制起始位点(repA101蛋白基因)、与复制起始位点连接的卡那霉素抗性基因、与卡那霉素抗性基因连接的同源重组元件组成。

[0087] SEQ ID No.2所示的谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体(又为载体pj5 00131)中(图6)，SEQ ID No.2的第11351-12735位的核苷酸序列为乳糖操纵子，SEQ ID No.2的第11351-12433位的核苷酸序列为乳糖操纵子中的lacIq基因，SEQ ID No.2的第12490-12735位的核苷酸序列为乳糖操纵子中的Ptrc启动子；SEQ ID No.2的第12755-4069位的核苷酸序列为Cas9蛋白基因；SEQ ID No.2的第4070-4124位的核苷酸序列为终止Cas9蛋白基因转录的终止子；SEQ ID No.2的第4125-4168位的核苷酸序列为启动gRNA的编码DNA转录的启动子；SEQ ID No.2的第4173-4192位所示的核苷酸序列为受体菌的目的DNA[含有5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X，X为20]；SEQ ID No.2的第4193-4270位的核苷酸序列为gRNA的编码DNA；SEQ ID No.2的第4271-4701位的核苷酸序列为终止gRNA的编码DNA转录的终止子；SEQ ID No.2的第5422-5367位的核苷酸序列为per基因；SEQ ID No.2的第6280-7743位的核苷酸序列为repA101蛋白基因；SEQ ID No.2的第8273-9067位的核苷酸序列为卡那霉素抗性基因；SEQ ID No.2的第9168-10173所示的核苷酸序列为同源重组元件的上游同源臂和下游同源臂。

[0088] 谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体采用模块的方式构建，各个模块的接头以Goldengate的思路进行设计：在各个模块的两端加上限制性核酸内切酶BsaI的位点或互补的粘性末端，酶切位点通过PCR引物的方式添加。

[0089] 谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体包括模块E、模块F、模块G和模块H，模块E含有乳糖操纵子中的lacIq基因和Ptrc启动子、Cas9蛋白基因、终止Cas9蛋白基因转录的终止子和启动gRNA的编码DNA转录的启动子(图7)；模块F含有gRNA的骨架DNA、终止gRNA的编码DNA转录的终止子、per基因、复制起始位点(repA101蛋白基因)和筛选标记基因(图8)；模块G含有5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X，X为20；模块H含有同源重组元件，同源重组元件含有与受体菌的基因组DNA靶位点附近发生同源重组的上游同源臂和下游同源臂；gRNA的骨架DNA为将gRNA的编码DNA中的(N)X去除得到的DNA。

[0090] 谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体中，乳糖操纵子为SEQ ID No.2的第11351-12735位所示的核苷酸序列，乳糖操纵子中lacIq基因为SEQ ID No.2的第11351-12433位所示的核苷酸序列，乳糖操纵子中Ptrc启动子为SEQ ID No.2的第12490-12735位所示的核苷酸序列；Cas9蛋白基因为SEQ ID No.2的第12755-4069位所示的核苷酸序列编码；终止Cas9蛋白基因转录的终止子为SEQ ID No.2的第4070-4124位所示的核苷酸序列；启动gRNA的编码DNA转录的启动子为SEQ ID No.2的第4125-4168位所示的核苷酸序列；受体菌的目的DNA[含有5’-(N)X-NGG-3’结构中的(N)X，X为20]为SEQ ID No.2的第4173-4192位所示的核苷酸序列；gRNA的骨架DNA为SEQ ID No.2的第
4193-4270位所示的核苷酸序列；终止gRNA的编码DNA转录的终止子为SEQ ID No.2的第
4271-4701位所示的核苷酸序列；per基因为SEQ ID No.2的第5422-5367位所示的核苷酸序列；复制起始位点(repA101蛋白基因)为SEQ ID No.1的第6280-7743位的核苷酸序列；
筛选标记基因为SEQ ID No.2的第8273-9067位的核苷酸所示的卡那霉素抗性基因；同源重组元件的上游同源臂和下游同源臂为SEQ ID No.2的第9168-10173所示的核苷酸序列。

[0091] 模块E和模块F通过PCR反应获得限制性核酸内切酶BsaI位点，得到两端带有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块E和两端带有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块F；模块E的PCR反应所用的引物对为PartE-F(5’-CCAGGTCTCAGCTCAGATCCTTTTTTTCTGCGCG-3’)和PartE-R(5’-CCAGGTCTCACGCTAGATCTGACTCCATAACAGAGTACTCGCC-3’)，模块F的PCR反应所用的引物对为PartF_F(5’-CCAGGTCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’)和PartF_R(5’-CCAGGTCTCAGCACAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGT-3’)。

[0092] 受体谷氨酸棒状杆菌中目的DNA的5’-(N)20-NGG-3’结构中N20片段直接通过合成两条互补的引物通过退火方式获得，其中引物的5’进行磷酸化处理，引物的两端分别加上与两端带有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块E和两端带有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块F连接的四个碱基的粘性末端，具体的序列为(5’→3’)：AGCGGGCTCTTAAGGAACCGAAGC和AAACGCTTCGGTTCCTTAAGAGCC，带下划线的即为添加的粘性末端，N20的两条片段通过退火并在两端进行配对成双链DNA,获得含有互补粘性末端的模块G。

[0093] 对于基因敲除，同源重组元件中的左右同源臂，以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板，通过PCR反应的方式获得，其中左同源臂(即为上游同源臂)两端的引物分别添加(5’→3’)CCAGGTCTCAGTGC和CCAGGTCTCACGCT序列，右同源臂(即为下游同源臂)两端分别添加(5’→3’)CCAGGTCTCAAGCG和CCAGGTCTCAGAGC序列，获得含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块H，含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块H包括左同源臂和右同源臂。

[0094] 含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块E、含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块F、含有互补粘性末端的模块G和含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块H通过如下体系连接成编辑载体(图6)：20μL反应体系中含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块E 2.3E-8(约为50ng)含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块F 2.3E-8mol，含有互补粘性末端的模块G 2.3E-7mol；含有限制性核酸内切酶BsaI位点的模块H的左同源臂和右同源臂以等摩尔量加入，均为2.7E-8mol；BsaI酶1μL；T4 DNA Ligase 1μL；10x T4buffer2μL；10xBSA蛋白溶液2μL，用水补齐至20μL，并通过如下反应条件进行连接：37℃反应
3min；16℃反应4min，共进行25个循环；最后80反应5min。反应结束后，获得谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体溶液。取5μL谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体溶液电转入大肠杆菌K-12 MG1655感受态细胞中并在含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB固体培养基中进行筛选培养，将筛选获得的阳性转化子扩增培养并提取谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体。将谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体电转入谷氨酸棒状杆菌中，在含有浓度为10μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中进行筛选培养，获得谷氨酸棒状杆菌阳性转化子，将谷氨酸棒状杆菌阳性转化子在含有浓度为10μg/mL的卡那霉素和浓度为1mg/mL的IPTG的LB液体培养基中进行过夜诱导培养，获得诱导培养的谷氨酸棒状杆菌，将诱导培养的谷氨酸棒状杆菌在含有浓度为1mg/mL的IPTG的LB固体培养基中划线培养，获得Ncgl 1221基因(Genbank登录号BAB98663.1)被敲除的谷氨酸棒状杆菌，记为实验组；对照组为将谷氨酸棒状杆菌阳性转化子加入到含有浓度为10μg/mL的卡那霉素LB液体培养基中培养，获得谷氨酸棒状杆菌菌液，并将谷氨酸棒状杆菌菌液于无IPTG的LB固体培养基中划线培养，获得NCgl 1221基因未被敲除的谷氨酸棒状杆菌。

[0095] 分别挑选20株实验组Ncgl 1221基因被敲除谷氨酸棒状杆菌的单菌落和1株对照组Ncgl1221基因未被敲除的谷氨酸棒状杆菌的单菌落，分别进行菌落PCR验证，验证引物为Ncg_genome_F：ATGTGGTAGTCGGAGTTTGG和Ncg_genome_R：ACTTCCTTGGACAGGGTTTC，对于获得的PCR扩增引物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图9所示，实验组的20株菌株只有一株菌株完成Ncgl 1221基因敲除，PCR片段大小为3672bp，1株菌株无条带，其余均未完成Ncgl 1221基因敲除；对照组的1株菌株NCgl 1221基因未被敲除，PCR片段大小为5032bp。

[0096] 编辑效率＝编辑成功的菌落数/实验组总菌落数*100％。

[0097] 采用谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体对谷氨酸棒状杆菌进行基因编辑(Ncgl 1221基因敲除)的编辑效率为5％，该结果通过三次重复试验获得同样的结果。

标题	发布/更新时间	阅读量
布鲁氏菌104M疫苗株敲除Per基因的重组菌及应用	2020-05-11	741
具有改进的基因表达能力的表达载体	2020-05-20	202
促进Bmal1的诱导表达的RORα	2020-05-16	597
动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片	2020-05-18	704
动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片	2020-05-20	634
生产冠状病毒的细胞系	2020-05-27	164
蛋白质的生产方法	2020-05-23	728
一种在杆状病毒-昆虫表达系统中生产美洲大蠊过敏原蛋白Pera9的方法	2020-05-12	492
重组美洲大蠊过敏原蛋白的表达方法	2020-05-14	812
甲型流感病毒疫苗哺乳动物细胞适应株的获得方法和适应位点	2020-05-25	420

一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用

一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：