β-井冈霉烯胺的生物制备方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及采用酶学、基因工程等生命科学技术手段，具体涉及一种β-井冈霉烯胺的生物制备方法。
背景技术
[0002] β-井冈霉烯胺(β-valienamine)是井冈霉烯胺的1-差向异构体，和井冈霉烯胺一起被认为是糖苷酶
抑制剂开发的先导化合物。由Ogawa和Suzuki研究团队开发的其衍生物对N-辛烷基-β-井冈霉烯胺(NOV)和N-辛烷基-4-epi-β-井冈霉烯胺(NOEV)β-类糖苷酶有抑制作用，有望作为药物分子伴侣应用于由β-类糖苷
水解酶功能异常引起的GM1-神经节苷脂贮积症、Morquio B症以及Gaucher症等溶酶体贮积症(lysosomal storage disease,LSD)。天然状态下井冈霉烯胺以α-状态存在于井冈霉素、阿卡波糖等结构中，可以通过井冈霉素
微生物裂解来获得，尚未见天然产物中β-井冈霉烯胺结构单元及其合成途径的报道，目前仅见于化学合成。
[0003] 目前，化学合成β-井冈霉烯胺的方法一般是以D-
葡萄糖和L-山梨糖为起始原料化学合成光学纯β-井冈霉烯胺，需要经过复杂的保护、取代、消除、异构、脱保护及消旋和
手性拆分过程，相对于生物方法反应条件严苛，需要使用昂贵的立体选择催化剂，且消旋体拆分困难。且这种总体合成方法因为合成反应需要至少10个反应步骤而过于复杂，因此不能被采用进行大量生产。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供β-井冈霉烯胺的生物制备方法，以解决
现有技术中所存在的上述问题。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0006] 一方面，本发明提供了一种制备β-井冈霉烯胺的方法，是以式II所示的井冈霉烯
酮为底物，使其在
氨基转移酶的作用下，与氨基供体发生反应，生成式I所示的β-井冈霉烯胺，其反应路线如下：
[0007]
[0008] 具体包括如下操作：
[0009] 将井冈霉烯酮、氨基供体、氨基转移酶和辅因子在pH为7.0～7.5的PBS缓冲液中，在25～37℃下进行反应，得到β-井冈霉烯胺。
[0010] 作为优选方案，所述氨基供体为L-谷氨酰胺、L-谷氨酸盐、L-丙氨酸或L-丝氨酸，所述辅因子为
磷酸吡哆
醛。
[0011] 作为优选方案，所述氨基转移酶包括天然氨基转移酶或在所述天然氨基转移酶
基础上经
蛋白质工程技术手段进行改造的氨基转移酶的突变体。
[0012] 作为进一步优选方案，所述天然氨基转移酶来源于天冬氨酸氨基转移酶I家族、Pfam
数据库DegT_DnrJ_EryC1_StrS氨基转移酶亚家族。
[0013] 作为更进一步优选方案，所述氨基转移酶包括来自于各种微生物的BtrR、ArnB，DesI、Per、PglE、PseC、DesV、MegCII、TylB、QdtB、WbpE、WecE、GtmB、RbmB、StsC、SpcS2、TbmB或其他来自于抗生素结构中负责催化该结构生成的氨基转移酶或在天然氨基转移酶基础上采用蛋白质工程手段获得的突变体。
[0014] 另一方面，本发明还提供了一种制备β-井冈霉烯胺的方法，是将氨基转移酶基因导入井冈霉素生产菌株，采用获得的基因工程菌通过
发酵产生β-井冈霉烯胺。
[0015] 作为优选方案，所述将氨基转移酶基因导入井冈霉素生产菌株的方法为采用整合型质粒通过链霉菌接合转移操作，将氨基转移酶基因整合入宿主
染色体上。所述氨基转移酶基因优选BtrR基因。
[0016] 作为优选方案，所述
生产井冈霉素的菌株包括在天然生产菌株的基础上采用
生物工程手段改造的突变菌株。
[0017] 作为优选方案，所述生产井冈霉素的菌株为吸链霉菌井冈变种5008或吸水链霉菌柠檬亚种，吸链霉菌井冈变种5008和吸水链霉菌柠檬亚种分别见《应用与环境生物学报》2000年03期“吸水链霉菌井冈变种JG5008转化系统的初建”以及《中国微生物菌种总目录》。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0019] 1、解决了制备β-井冈霉烯胺的常规方法所存在的工艺复杂、无法量产的
缺陷；
[0020] 2、基于由氨基转移酶催化的氨基转移反应，建立方便、高效、立体选择性强的β-井冈酶烯胺直接生物合成策略，为β型糖苷酶功能异常引起的相关
疾病的药物开发提供直接的先导化合物。
附图说明
[0021] 通过阅读参照以下附图对非限制性
实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0022] 图1为BtrR催化反应的TLC分析结果；
[0023] 图2为本发明实施例1的催化产物以邻苯二甲醛(OPA)衍生化HPLC结果；
[0024] 图3为本发明实施例1催化产物以邻苯二甲醛(OPA)衍生化HPLC-MS结果；
[0025] 图4为本发明实施例1反应产物经Dowex1×2阴离子交换
树脂纯化获得β-井冈霉烯的NMR氢谱和NOE图；
[0026] 图5为本发明实施例2催化产物以邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生化HPLC分析结果；
[0027] 图6为本发明实施例3的基因工程菌发酵液对OPA-HPLC的检测结果；
[0028] 图7为本发明实施例3基因工程菌发酵液中β-井冈霉烯胺OPA-HPLC-MS分析。
具体实施方式
[0029] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干
变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0030] 实施例1、以BtrR酶由井冈霉烯酮生物转化制备β-井冈霉烯胺
[0031] 以5mM井冈霉烯酮为底物，10mM谷氨酰胺为氨基供体，0.3mM磷酸吡哆醛(PLP)为辅因子，以1mg/ml BtrR酶为氨基转移酶，在pH7.4的20mM PBS缓冲液中，于37℃反应3小时，通过TLC检测反应进度，其中，TLC的条件是以正丙醇、乙酸、水按照4：1：1的体积比作为展开剂，用1wt％的茚三酮显色，TLC结果如图1所示。其中No.1-3为完全反应体系，No.4-5分别为不加酶和不加底物的对照组。茚三酮在加热条件下可以与伯胺发生反应，产生红色产物。通过对No.1-3和No.4-5显色点进行比对，可以确定由BtrR催化的井冈霉烯酮反应体系有氨基化合物产生。
[0032] 采用2wt％邻苯二甲醛(OPA)室温条件下对反应产物进行柱前衍生化，衍生化产物经Eclipse XDB-C185um 4.6×150mm色谱柱分离，0～8min乙腈-水(22:78体积比)；8～12min 100％乙腈；12～17min乙腈：水(22:78体积比)梯度洗脱；激发
波长240nm、发射波长
450nm时检测
荧光吸收。OPA衍生化HPLC结果如图2所示，邻苯二甲醛与BtrR催化产物反应生成具有荧光的化合物，其保留时间实验条件下β-valienamine保留时间分别为5.6～
5.7min，即为图2中保留时间5.724min的I峰。
[0033] 采用OPA衍生化HPLC方法与Aglient TOF MS 6230联用，以正离子模式检测OPA衍生化后的反应产物分子量，实验结果如图3所示，证明衍生化后的反应产物特征分子量为374.0919，与β-井冈霉烯胺OPA衍生化产物理论分子量(M+Na+)相符。
[0034] 将反应产物经阴离子交换树脂Dowex 1×2分离纯化后溶于D2O，经400MHz
核磁共振检测，获得1H NMR特征图谱。与底物井冈霉烯酮和产物的1H NMR对比分析，可以观测到由羰基向氨基转化引起屏蔽效应增加导致的整个H谱的化学位移向高场移动，其中最特征的是双键C6的δ由6.20移动到5.50，新增C1上δ3.35(s,1H)。实验图谱如图4所示，NOE图谱显示产物结构中C3的氢与C1氢之间有耦合作用，推测新生成氨基与其间位羟基在六元环的同侧，属于R构型，BtrR的催化产物是β-井冈霉烯胺。
[0035] 实施例2、以ArnB由井冈霉烯酮生物转化制备β-井冈霉烯胺
[0036] 以10mM井冈霉烯酮为底物，10mM谷氨酰胺为氨基供体，0.4mM磷酸吡哆醛(PLP)为辅因子，以1mg/ml ArnB酶为氨基转移酶，在pH7.4的20mM PBS缓冲液中，于37℃下反应3小时。
[0037] 采用2wt％邻苯二甲醛(OPA)室温条件下对反应产物进行柱前衍生化，衍生化产物经Eclipse XDB-C18 5um 4.6×150mm色谱柱分离，0～8min乙腈-水(22:78体积比)；8～12min 100％乙腈；12～17min乙腈：水(22:78体积比)梯度洗脱；激发波长240nm、发射波长
450nm时检测荧光吸收。反应产物OPA衍生化HPLC结果如图5所示，图5中保留时间5.709min的I峰即为β-valienamine特征峰。
[0038] 实施例3、由BtrR构建基因工程菌，发酵生产β-井冈霉烯胺
[0039] 将氨基转移酶基因BtrR克隆到井冈霉素生物合成基因valA的启动子PvalA的下游，并通过整合型载体pPM927按链霉菌接合转移操作方法将BtrR基因整合入吸水链霉菌井冈变种5008染色体上，实现氨基转移酶基因BtrR在井冈霉生产菌株中的表达。基因工程菌阳性克隆经发酵培养5天，按实施例1所述以OPA衍生化HPLC条件检测发酵液，通过和未转入氨基转移酶的空白菌株发酵液成分进行比对，在保留时间5.733min处检测到β-valienamine特征峰。发酵液OPA衍生化HPLC实验结果如图6所示。
[0040] 采用OPA衍生化HPLC方法与Aglient TOF MS 6230联用，以正离子模式检测工程菌发酵液OPA衍生化后的反应产物分子量，获得m/z为374.1038特征分子峰，与实施例1中BtrR体外催化井冈霉烯酮生成的β-valienamine特征峰值相符。OPA-HPLC-MS测试结果如图7所示。
[0041] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在
权利要求的范围内做出各种变形或
修改，这并不影响本发明的实质内容。
