发明领域：

本发明涉及医学领域，更特别地涉及抗体生产领域，更特别地涉 及抗体混合物的生产。

背景技术：

免疫系统的基本功能是抵御感染。体液免疫系统用免疫球蛋白与 被识别为非自身的分子，例如病原体进行斗争。这些也被称作抗体的 免疫球蛋白在与被用作抗原的感染性制剂第一次接触时被特异性地 引起(Roitt，Essential Immunology，Blackwell Scientific Publications，第 5版，1984；在此所引用的所有参考文献均全文并入参考)。抗体是 包含以链间二硫键连接的重(H)链和轻(L)链的多价分子。已知 几种同种型抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE 和IgM。IgG包含两条重链和两条轻链。每一条链含有恒定区(C) 和可变区(V)，可被分解成称为CH1、CH2、CH3、VH和CL、VL的结 构域(图1)。抗体通过包含在Fab部分中的可变区结构域与抗原结 合，结合后可通过恒定结构域，主要通过Fc部分与免疫系统的分子 和细胞相互作用。

B淋巴细胞在暴露给例如细菌、病毒和它们的毒性产物等生物物 质后会作出反应产生抗体。抗体通常是表位特异性的，并与携带这些 表位的物质强烈结合。杂交瘤技术(Kohler和Milstein 1975)利用B细 胞生产针对特异抗原的单克隆抗体的能力，以及随后通过将来自暴露 给感兴趣的抗原的小鼠的B细胞与无限增殖化的鼠浆细胞进行融合 生产这些单克隆抗体。这一技术使得人们认识到，杂交瘤产生的单克 隆抗体可以用于研究、诊断和治疗，用于治疗不同种类的疾病，例如 癌症和自身免疫相关疾病。

由于小鼠杂交瘤所产生的抗体在人体内诱发强烈的免疫反应，本 领域期望在人体内成功治疗所需要的抗体具有较小免疫原性，优选非 免疫原性。为此，首先通过将鼠恒定区用人恒定区替代对鼠抗体进行 工程化(称为嵌合抗体)。随后，将可变结构域中互补性决定区(CDR) 之间的结构域，所谓构架区，用人的相应部分进行替代(称为人源化 抗体)。人源化过程的最终阶段是生产完全的人抗体。

本领域也描述过对两种不同抗原具有结合特异性的双特异性抗 体。这些通常被用于将被抗体的一个可变区识别的治疗性或诊断性部 分，例如T细胞，细胞毒性引发分子或与放射性核素结合的螯和剂靶 向被抗体的其它可变区所识别的细胞，例如肿瘤细胞(双特异性抗体 参见Segal et al，2001)。

本领域已知获得具有所需结合特性的完全人单克隆抗体的一个 非常有用的方法是使用噬菌体展示文库。这是一种体外的、以重组 DNA为基础的方法，模仿体液免疫反应的关键特征(噬菌体展示方 法参见，例如CF Barbas III et al，Phage Display，A laboratory manual， 冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，2001)。为了构建噬菌体展示 文库，在细菌噬菌体颗粒表面通常以单链Fv(scFv)或以Fab模式表达 人单克隆抗体重链和轻链可变区基因的集合(collections)。表达抗体 片段的噬菌体的大文库典型地含有超过109抗体特异性，可以用免疫 或非免疫的个体的B淋巴细胞中表达的免疫球蛋白V区进行装配。

或者，噬菌体展示文库可以用体外部分装配或重排的免疫球蛋白 可变区进行构建，以在文库中导入额外的抗体多样性(半合成文库) (De Kruif et al，1995b)。例如，体外装配的可变区在对抗体特异性来 说重要的分子区域内含有成段的合成生产的、随机化或部分随机化的 DNA。编码噬菌体展示所鉴定的抗体的遗传信息可以被用来以所需 模形式，例如IgG、IgA或IgM克隆抗体，以用重组DNA方法生产 抗体(Boel et al，2000)。

提供完全人抗体的另外一种方法使用包含编码人免疫球蛋白所 有组成成分(repertoire)的遗传物质的转基因小鼠(Fishwild et al， 1996；Mendez et al，1997)。这样的小鼠可以用靶抗原进行免疫，所导 致的免疫反应将产生完全人抗体。这些抗体的序列可被用于重组生产 方法中。

单克隆抗体的生产常规通过使用编码宿主细胞抗体的H和L链 的核酸序列的重组表达来进行(参见例如，EP0120694；EP0314161； EP0481790；US patent 4,816,567；WO 00/63403)。

到目前为止，许多不同疾病正在用人源化的或完全人单克隆抗体 进行治疗。以目前被许可用于人体的单克隆抗体为基础的产品包括 HerceptinTM(抗-Her2/Neu)、ReoproTM(抗糖蛋白IIB/IIIA受体)、 MylotargTM(抗CD33)、RituxanTM(Rituximab，抗CD20)、SimulectTM (抗CD25)、RemicadeTM(抗TNF)、SynagisTM(抗RSV)、ZenapaxTM (IL2受体)、CAMPATHTM(抗CD52)。除了这些成就之外，仍然有 新抗体产品和对现有抗体产品进行相当程度的改进的空间。将单克隆 抗体用于癌症治疗已经显示，可以发生所谓“抗原丧失的肿瘤变种 (antigen-loss tumor variants)”，使得用单克隆抗体进行治疗的有效性 降低。例如，用非常成功的单克隆抗体Rituximab(抗CD20)进行治 疗显示可以发生抗原丧失的逃逸变种(escape variants)，导致淋巴瘤 复发(Massengale et al，2002)。在本领域，通过将单克隆抗体与毒性化 合物，例如放射性核素、毒素、细胞因子等融合提高了单克隆抗体的 效价。然而这些方法中的每一种均有其局限性，包括技术和生产问题 和/或高毒性。

此外，单克隆抗体与传统未明确定义的多克隆抗体相比在特异性 上的增长所带来的成本是功效的丧失。在体内，抗体反应在本性上是 多克隆的，即产生抗体的混合物，因为多种B细胞对抗原作出反应， 导致在多克隆抗体混合物中存在多种特异性。多克隆抗体也可被用于 治疗应用，例如用于被动接种或用于主动免疫治疗，而且目前通常源 自来自免疫动物或来自疾病康复的人的混合血清(pooled serum)。混 合血清被纯化成蛋白质样的或γ球蛋白级分，这样命名是因为它主要 包含IgG分子。目前用于治疗的多克隆抗体包括抗猕猴多克隆抗体、 用于被动免疫的γ球蛋白，抗蛇毒多克隆(CroFab)，用于同种异体移 植排斥的ThymoglobulinTM，抗地高辛用来中和心脏药物地高辛，和 抗狂犬病多克隆。在目前市场化的治疗用抗体中，与单克隆抗体相比 具有较高功效的多克隆抗体的一个例子是用抗T细胞抗体治疗急性 移植排斥。市场上的单克隆抗体(抗CD25 basiliximab)的有效性不 如针对胸腺细胞的兔多克隆抗体(ThymoglobulinTM)(2002年3月 12日、4月29日和8月26日的新闻发布，www.sangstat.com)。然而， 使用混合人血清潜在的危险是感染病毒例如HIV或肝炎、毒素例如 脂多糖、蛋白质样感染性物质例如朊病毒、以及未知的感染性物质。 此外，可利用的供给量有限，不足以用于普遍的人类治疗。在临床上 与当前源自动物血清的多克隆抗体的应用相关的问题包括人类免疫 系统针对这样的外来抗体的强免疫反应。因此，这样的多克隆抗体不 适于重复治疗，或治疗前曾用来自同一动物种属的其它血清制剂进行 过注射的个体。

现有技术描述了产生具有人类免疫球蛋白的所有组成成分的动 物的想法，这一动物继而可被用于用抗原免疫以获得来自转基因动物 的针对这一抗原的多克隆抗体(WO 01/19394)。然而，仍需要克服许 多技术障碍才能使这样的系统在比小鼠更大的动物上得以实际实现， 而且还需要许多年的研发才能使这种系统以足够的量、并以安全和一 致的方式提供多克隆抗体。此外，不管是人类还是动物来源的混合血 清所产生的抗体总是包含高含量的不相关和不需要的特异性，因为特 定血清中存在的抗体只有很小的百分比是针对用于免疫的抗原的。例 如已知在正常，即非转基因动物中大约1-10％的循环免疫球蛋白级分 是针对用来超免疫的抗原的，因此大多数循环免疫球蛋白不是特异性 的。

曾描述过一种表达多克隆抗体文库的方法(WO 95/20401，美国 专利5,789,208和6,335,163)。用噬菌体展示载体表达Fab抗体片段 的多克隆文库，然后选择对抗原的反应性。所选择的重链和轻链可变 区基因组合被以连接对(linked pairs)的方式大量转移至提供恒定区 基因的真核表达载体，以获得完整多克隆抗体的子文库。这一子文库 转染入骨髓瘤细胞后，稳定克隆便产生能被混合以获得多克隆抗体混 合物的单克隆抗体。尽管使用这一方法通过培养转染细胞的混合群 (mixed population)在理论上有可能直接从一个重组生产过程中获得 多克隆抗体，在混合细胞群的稳定性以及因此带来的所产生的多克隆 抗体混合物的一致性方面可能存在潜在的问题。在药学上可接受的大 (即工业)规模的方法中对整群不同细胞进行控制是一项艰巨的任 务。例如细胞生长速率和抗体产生速率等特性似乎对非克隆群中所有 单个克隆来说应保持稳定，才能使多克隆抗体混合物中的抗体比率多 少保持恒定。因此，尽管在本领域可能已认识到对混合抗体的需求， 还不存在可接受的解决方案以用药学可接受的方式经济地制造抗体 混合物。本发明的目的是提供在重组宿主中生产抗体混合物的新的手 段。

附图说明

图1：抗体的示意图。重链和轻链通过键间二硫键(虚线)配成 对。重链可为α、γ、μ、δ或ε同种型。轻链为λ或κ。显示的是IgG1 同种型抗体。

图2：双特异单克隆抗体的示意图。双特异抗体含有两个不同的 功能性F(Ab)结构域，用VH～VL区的不同图案表示。

图3：K53、UBS-54和02-237的VL和VH的序列对比。UBS54 和K53的共同VL的DNA序列为SEQ.ID.NO.1，而氨基酸序列以 SEQ.ID.NO.2给出。02-237的VL和UBS54、K53和02-237的VH 的DNA序列分别为SEQ.ID.NO.3、5、7和9，而氨基酸序列分别 以SEQ.ID.NO.4、6、8和10给出。

图4：质粒pUBS3000Neo和pCD46_3000(Neo)的总体图。

图5：A.瞬时表达的pUBS3000Neo、pCD46_3000(Neo)和两者 组合的IEF。B.上半部分显示当单一轻链和单一重链在细胞中表达 导致单克隆抗体UBS-54或K53时预期分子的示意图。箭头下方的下 半部分显示当重链和共同轻链一起在宿主细胞中共表达时所产生的 组合的示意图，并显示当两条重链以均等水平表达和以均等效率彼此 配对时的理论量。共同轻链用垂直的条纹杠显示。

图6：本发明的方法的一个可能的实施方案的示意图(见例如实 施例9)。(1)将编码一条轻链和能够与共同轻链配对的三条不同的 重链以生成功能性抗体的核酸序列导入宿主细胞；(2)选择稳定克 隆；(3)按例如表达水平、结合筛选克隆；(4)扩增克隆；(5)抗体 功能性混合物的产生。步骤2-5中的一些或全部可同时或按不同次 序进行。

图7：针对CD22(克隆B28)、CD72(克隆II-2)和HLA-DR(II 类；克隆I-2)的噬菌体的VH和VL序列。克隆B28、II-2和I-2的 VL的DNA序列分别是SEQ.ID.NO.11、13和15，而氨基酸序列分 别是SEQ.ID.NO.12、14和16。这些克隆的共同轻链的DNA序列 为SEQ.ID.NO.17，而氨基酸序列是SEQ.ID.NO.18。

图8：pUBS54-IgA(编码针对EPCAM的人IgA1的pCRU-L01) 的图谱。

图9：带有单一轻链(用水平条纹杠显示)的二聚体双特异性IgA。 本发明的方法将产生混合形式，其中不同重链可以配对，而这一示意 图中只表示了最简单的形式。显示J链连接两个单体。

图10：带有单一轻链(用水平条纹杠显示)的五聚体多特异性 IgM。本发明的方法将产生许多不同形式的混合，其中不同重链可以 配对，而这一示意图中只表示了当5种不同重链与单一轻链表达、而 且所有5种不同重链被掺入五聚体并与相同重链配对的最简单的形 式。通过掺入少于5种不同重链也可形成特异性较少的五聚体。特别 是当J链不表达时，也可以得到六聚体。

图11：在单一细胞中表达由一条共同轻链组成、但具有不同结合 特异性的人IgG同种型的混合物以防止双特异性抗体的形成。不同的 结合特异性用VH序列的不同颜色表示。共同轻链用垂直的条纹杠表 示。IgG1同种型用灰色Fc表示，IgG3同种型用黑色Fc部分表示。

图12：K53、UBS54和02-237 IgG的重链和轻链可变结构域的 DNA和蛋白质序列。

图13：K53、02-237和UBS54的重链可变序列的对比。用粗体 显示CDR1、CDR2和CDR3区域。

图14：K53和02-237的BIACORE分析。来自LS174T细胞的亲 和纯化的人CD46偶联(640RU)至CM5芯片(BIACORE BR-1000-14)。 在37℃使用BIACORE 3000系统监测纯化自稳定PER.C6TM来源的 细胞系的1000(A)、500(B)、250(C)、125(D)、63(E)、31(F)、16(G)、 8(H)或0(I)nM 02-237或k53与CD46的结合。使用这一实验发现 K53和02-237的Kd分别为9.1×10-7和2.2×10-8。

图15：K53和02-237与LS174T细胞的结合。与生物素缀合的 系列稀释的纯化02-237(■)、K53(*)和负对照GBSIII(◇)与和正常 人血清预孵育的LS147T细胞孵育以阻断Fcγ受体相互作用。在用链 霉抗生物素缀和的藻红蛋白孵育后用FACS确定结合(MFI，纵坐标)。

图16：纯化的IgG级分的SDS-PAGE分析。按照厂商的建议在 非还原(A)和还原(B)4-20％Nupage胶(Novex)上对3μg纯化IgG 进行分析。按照厂商的建议用胶状蓝(colloidal blue)(Novex目录号 LC6025)染色以显示蛋白质。在SDS-PAGE顶部指示克隆身份。每一 胶含有对照，为纯化02-237或K53。NR，非还原的；R，还原的。

图17：纯化的IgG组分的IEF分析。按照厂商的建议在Isogel 3-10 胶(BMA)上对10μg纯化IgG进行分析。按照厂商的建议用胶状蓝 (Novex目录号LC6025)染色以显示蛋白质。在IEF顶部指示克隆身 份。每一胶包含对照，由02-237、K53和UBS54按1∶1∶1混合而组 成。

图18：多克隆混合物241、280、282、361和402的IEF分析， 与单一K53、02-237和UBS54进行比较。按照厂商的建议在Isogel 3-10 胶(BMA)上对10μg纯化IgG进行分析。按照厂商的建议用胶状蓝 (Novex目录号LC6025)染色以显示蛋白质。在IEF顶部指示IgG身 份。

图19：K53、02-237、UBS54的CDR3肽以及IgG组分Poly1-280 中的两个独特轻链肽L1-K53/UBS54和L1-237的质量色谱。在每一 质量色谱的右手侧，显示肽的同种型模式。在m/z 1058.98的双重带 电离子(Mw 2115.96 Da)源自肽H11-K53。在m/z 1029.96的双重带电 离子(Mw 2057.92 Da)源自肽H11-02-237。在m/z 770.03的三重带电 离子(Mw 2307.09 Da)源自肽H9-UBS54。在m/z 1291.08的双重带电 离子(Mw 2580.16 Da)源自肽L1-K53/UBS54。在m/z 1278.11的双重 带电离子(Mw 2554.22 Da)源自肽L1-02-237。

纯化的IgG溶解于溶于50mM NH4HCO3中的0.1％RapiGestTM (Waters)。二硫化物用1M DTT(1，4-二硫-DL-苏糖醇)进行还原，随后 在65℃孵育30分钟。然后，为了烷基化所有硫氢基，加入1M碘乙 酰胺，随后在室温于黑暗中孵育45分钟。加入1M DTT以终止烷基 化。缓冲液换成25mM NH4HCO3，pH7.5。最后，通过加入新制备的 溶于25mM NH4HCO3的胰蛋白酶溶液以使抗体在37℃消化过夜。肽 混合物用LC-MS进行分析。LC-系统由Vydac反相C18柱组成，Vydac 反相C18柱通过使用溶剂A(5/95/1乙腈，水，冰乙酸v/v/v)和溶剂B (90/10/1乙腈，水，冰乙酸v/v/v)梯度进行洗脱。LC即时与装备有在 3kV下工作的电喷射源的Q-TOF2质谱仪(Micromass)偶联。在正离子 模式从m/z 50至1500、锥电压(cone voltage)35 V下记录质谱。＞ 10,000的仪器分辨率能够明白无误地确定电荷值，并因此确定高达至 少+7的大多数离子的质量。这样，所有肽均按照它们的分子量加以 鉴定。肽的氨基酸序列用MS/MS-实验加以证实。用正离子模式从 m/z 50-2000、碰撞能量在20-35电子伏特(eVolts)之间记录MS/MS 光谱。

图20：多克隆280的BIACORE分析。来自LS174T细胞的亲和 纯化的人CD46偶联(640 RU)至CM5芯片(BIACORE BR-1000-14)。 在37℃使用BIACORE 3000系统监测1000(A)、500(B)、250(C)、 125(D)、63(E)、31(F)、16(G)、8(H)或0(I)nM Poly1-280对CD46 的结合。

图21：生产抗体混合物的克隆poly1-241、poly1-280和poly1-402 的亚克隆的IEF分析。

A.克隆poly1-241和poly1-280。泳道1含有pI标记(Amersham， 目录号17-0471-01)。泳道2含有来自亲本克隆poly1-241(如图18 中)的分离的IgG。泳道3、4、5分别含有来自通过有限稀释源自 poly1-241的3个独立亚克隆的分离的IgG。泳道6含有来自亲本克 隆poly1-280(如图18中)的分离的IgG。泳道7、8、9分别含有来 自通过有限稀释源自poly1-280的三个独立亚克隆的分离的IgG。

B.克隆poly1-402。泳道1和7含有pI标记。泳道2含有来自 亲本克隆poly1-402(如图18中)的分离的IgG。泳道3、4、5分别 含有来自通过有限稀释源自poly1-402的3个独立亚克隆的分离的 IgG。泳道6含有对照(02-237、K53和UBS54的1∶1∶1混合物)。

图22：poly1-241(A)、poly1-280(B)和poly1-402(C)的亚克隆产 生的抗体混合物的FACS分析。用FACS分析测定抗体混合物与用 CD46、EpCAM或负对照(CD38)的cDNA转染的细胞的结合，显示 了各个亲本克隆和每个亲本克隆的三个独立亚克隆的平均荧光强度 (MFI)。也包括对照抗体GBS-III(负对照)、抗-CD72(02-004；负对 照)和单一抗体UBS54、02-237和K53。

发明简述

一方面，本发明提供了在重组宿主中生产抗体混合物的方法，所 述方法包含如下步骤：在重组宿主细胞中表达编码至少一个轻链和能 与所述至少一个轻链配对的至少三个不同重链的一或多个核酸序列。 本发明的另一方面是通过使用预先选择的重链和轻链组合消除潜在 的非功能性的轻链重链配对的产生。已经认识到，单一轻链和许多不 同重链所构建成的噬菌体展示文库可以编码具有非常独特的结合特 性的抗体片段。可以利用这一特征发现针对相同靶或不同靶的、具有 相同轻链但不同重链的不同抗体，其中靶可以为整个抗原或其表位。 这样的不同靶例如可以位于相同表面(例如细胞或组织)。噬菌体展 示所获得的这样的抗体片段可以按所需要的模形式，例如IgG、IgA 或IgM被克隆入载体，编码这些形式的核酸序列可以被用来转染宿 主细胞。在一个方法中，H和L链可以由不同构建体编码，在转染入 它们得以表达的细胞后生成完整Ig分子。当不同的H链构建体转染 入带有单一L链构建体的细胞时，H和L链可被组装形成所有可能 的组合。然而，与例如生产双特异性抗体这样表达不同轻链的方法形 成对照的是，这一方法将只产生功能性结合区域。当宿主，例如单一 细胞系，能够表达可接受水平的重组抗体，而无需在所述细胞中首先 扩增编码抗体的核酸序列时这一方法将会特别有用。好处在于，只具 有有限拷贝数目的所述核酸的细胞系被认为在遗传上更稳定，因为与 存在多个这样的拷贝的细胞系相比，在编码重链的序列间将会有较少 的重组。适合用于本发明的方法的细胞系为人细胞系PER.C6TM。使 用这一方法，能以安全、可控和一致的方式从单一细胞克隆中生产具 有确定特异性的抗体的混合物。

本发明提供了在重组宿主中生产抗体混合物的方法，所述方法包 含如下步骤：在重组宿主细胞中表达编码至少一个轻链和能与所述至 少一个轻链配对的至少三个不同重链的一或多个核酸序列。在一个优 选方面，所述重组宿主细胞包含编码能与所述至少三个不同重链配对 的共同轻链的核酸序列，使得所产生的抗体包含共同轻链。显然，本 领域技术人员将认识到，“共同”也指氨基酸序列不一样的轻链功能 等价物。存在所述轻链的许多变体，其中存在不在本质上影响功能性 结合区域形成的突变(缺失、替代、添加)。

本发明进一步提供了包含重组生产的抗体的混合物的组合物，其 中在所述混合物中呈现了至少三种不同重链序列。在一个具体实施方 式中，这样的混合物的轻链具有共同序列。抗体的混合物可以用本发 明的方法生产。优选地，抗体混合物与它所包含的单个抗体相比更有 效，更优选所述混合物在功能性测定中协同作用。

本发明进一步提供了用来生产抗体混合物的重组宿主细胞，以及 制备这样的宿主细胞的方法。

编码轻链和不只一条重链的核酸序列转染所获得的独立克隆可 以不同水平在混合物中表达不同抗体。本发明的另一方面是用功能性 测定选择克隆以得到最强有力的抗体混合物。本发明因此进一步提供 了用来鉴定生产抗体混合物的至少一个宿主细胞克隆的方法，其中所 述抗体混合物根据功能性测定具有所需效果，方法包含如下步骤：

i)将编码至少一个轻链的核酸序列和编码至少两个不同重链的核 酸序列提供给宿主细胞，其中所述重链和轻链能够彼此配对；(ii)在 有益于表达所述核酸序列的条件下培养所述宿主细胞的至少一个克 隆；(iii)筛选所述宿主细胞的至少一个克隆用于生产经由功能性测定 具有所需效果的抗体混合物；和(iv)鉴定至少一个生产具有所需效果 的抗体混合物的克隆。如果需要，本发明的这一方法可以用高通量程 序来进行。用这一方法所鉴定的克隆可以用来生产本发明的抗体混合 物。

本发明进一步提供了能够表达抗体混合物的转基因非人动物和 转基因植物或转基因植物细胞，以及由它们所生产的抗体混合物。

本发明进一步提供了包含重组生产的抗体的混合物和适当载体 的药物组合物。

本发明进一步提供了治疗或诊断所使用的、以及用于治疗或诊断 人或动物个体的疾病或紊乱所使用的药物的制备中的抗体混合物。

本发明进一步提供了生产包含来自单一宿主细胞克隆的不同同 种型的抗体混合物的方法。

本发明进一步提供了在功能性测定中鉴定具有所需效果的抗体 混合物的方法。

本发明进一步提供了生产能与靶结合的抗体混合物的方法，方法 包括如下步骤：i)将包含抗体的噬菌体文库与包含靶的物质接触，ii) 至少一个选择与所述靶结合的噬菌体的步骤，iii)鉴定至少两个包含 与所述靶结合的抗体的噬菌体，其中所述至少两个抗体包含共同轻 链，iv)将编码所述轻链的核酸序列和编码所述至少两个抗体的重链的 一或多条核酸序列导入宿主细胞，v)在有益于表达所述核酸序列的条 件下培养所述宿主细胞的克隆。

发明详述

本发明的一个目的是提供在重组宿主中生产抗体混合物的方法， 该方法包含如下步骤：在重组宿主细胞中表达编码至少一个轻链和能 与所述至少一个轻链配对的至少三个不同的重链的一或多条核酸序 列。根据本发明，轻链和重链配对后形成功能性抗原结合结构域。功 能性抗原结合结构域能特异性与抗原特异结合。

根据本发明的一个方面，生产本发明的抗体混合物的方法进一步 包含从细胞或宿主细胞培养物中回收抗体以获得适于进一步使用的 抗体混合物的步骤。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种生产抗体混合物的方 法，该方法包含如下步骤：在重组宿主细胞中表达编码共同轻链的核 酸序列和编码能与所述共同轻链配对的至少三个不同的重链的一或 多条核酸序列，使得所产生的抗体包含共同轻链。在一个方面，共同 轻链在每一轻链/重链对中是同样的。

本文所用术语“抗体”意味着含有一或多个与抗原上的表位结合 的结构域的多肽，其中这样的结构域源自抗体的可变区或与抗体的可 变区具有序列相同性。抗体结构在图1中用示意图表示。本发明的抗 体的例子包括全长抗体、抗体片段、双特异性抗体、免疫缀合物等等。 本发明的抗体可以是同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、 IgD、IgE、IgM等等，或这些的衍生物。抗体片段包括Fv、Fab、Fab′、 F(ab′)2片段等等。本发明的抗体可以是任何来源，包括鼠，不只一种 来源，即嵌合、人源化的或完全人抗体。免疫缀合物包含抗原结合结 构域和非抗体部分，例如毒素，放射性标记，酶等等。“抗原结合结 构域”优选包含重链和轻链的可变区，并负责与感兴趣的抗原特异性 结合。通过在宿主细胞中表达重链及轻链可以制备重组抗体。类似地， 通过表达带有它们的相应轻链(或共同轻链)的两条链，其中每一重 链/轻链具有自己的特异性，可以制备所谓“双特异性”抗体。“双 特异性抗体”包含两个不一样的重—轻链组合(图2)，双特异性抗 体的两个抗原结合区域都可以识别不同抗原或抗原上的不同表位。

本发明的“共同轻链(common light chain)”指相同或具有氨基 酸序列差异的轻链。所述轻链可以包含当与同一重链组合时不改变抗 体特异性的突变，而不偏离本发明的范围。例如有可能在本文所使用 的共同轻链的定义范围内制备或发现不一样但仍然功能等价的轻链， 例如通过导入和测试保守氨基酸改变，当与重链配对时不或只部分对 结合特异性作出贡献的区域的氨基酸改变等等。本发明的一个方面是 作为共同轻链使用一个同样的轻链来与不同重链组合以形成具有功 能性抗原结合结构域的抗体。一个共同轻链的使用避免了其中轻链和 重链的配对导致无功能的，换句话说不能与一或多个靶抗原结合的抗 原结合结构域的异二聚体的形成。曾为一不同目的提出使用共同轻链 和两条重链(Merchant et al，1998；WO 98/50431)，即以抗体混合物复 杂性为代价增加功能性双特异性抗体的形成。这些出版物教导了用来 优先生产明确的和所需要的双特异性抗体、从而使所产生的混合物的 复杂性最小化的方法。因此，Merchant明确教导了防止单特异性抗体 的产生，因为这些在那些出版物所描述的双特异性抗体生产过程中是 不想要的副产品。无疑地，在现有技术中没有从重组宿主细胞制备复 杂的抗体混合物以避免非功能性结合结构域形成、或这样做的好处的 教导，更不用说怎么做了。在本发明的方法中，表达了至少三种不同 的能与共同轻链配对的重链。在其它实施方案中，本发明的宿主细胞 拥有编码4、5、6、7、8、9、10个或更多个能与共同轻链配对的重 链的核酸序列，以增加所产生的抗体混合物的复杂性。

本发明的“不同重链”可以在可变区不同，并具有相同的恒定区。 在其它实施方案中，从上下文看清楚的是它们可以具有相同的可变 区，在恒定区不同，例如属于不同的同种型。如果在人或动物体的治 疗中需要动员免疫系统的不同兵种，使用具有不同恒定区，例如Fc- 部分的抗体混合物可能是有利的。而在其它实施方案中，也同样从上 下文看是清楚的，可变区和恒定区都可以不同。

本发明的“抗体混合物”包含至少两个不一样的抗体，但可以包 含3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同抗体，在复杂性和功能性 抗原结合分子的数目上可能类似多克隆或至少寡克隆(oligoclonal) 抗体混合物。本发明产生的混合物通常包含双特异性抗体。如果需要， 混合物中单特异性抗体的形成可能比双特异性抗体的形成有利。当n 条重链和1条共同轻链根据本发明在宿主细胞中以均等水平表达时， 本发明的方法产生的双特异性抗体的理论百分比是(1-1/n)*100％。本 发明的方法所产生的混合物中不同抗体的总数目在理论上是n+ {(n2-n)/2}，其中(n2-n/2)是双特异性抗体。不同重链表达水平比率的扭 曲可能导致数值偏离理论值。如果重链不都以均等效率配对，双特异 性抗体的量与这些理论值相比也可以降低。与前面Merchant所提议 的相反，例如有可能工程化重链，例如通过在所选择的重链间引入特 异的和互补的相互作用表面以促进同种型二聚体相对于异二聚体的 配对。重链也可以被选择以将混合物中异二聚体的形成减到最少。这 一实施方案的特殊形式涉及两个或更多个不同同种型(例如IgG1、 IgG3、IgA)的重链。当不同同种型的重链与能与这些重链配对的一 条轻链在本发明同一宿主细胞中表达时，双特异性抗体的量将降低， 有可能到非常低或甚至到检测不到的水平。因此，当不太想要双特异 性抗体时，有可能生产本发明的抗体混合物，其中编码一共同轻链的 核酸序列和编码至少两种不同的能够与所述共同轻链配对的带有不 同可变区的重链的核酸序列在一重组宿主中表达，其中所述重链进一 步在它们的恒定区有足够的不同，以降低或防止在不同重链间的配 对。本发明的抗体混合物可以产生自起源于单一宿主细胞的克隆，即 产生自含有相同重组核酸序列的细胞群。

人们将了解到，本发明的不同重链可以编码在分离的核酸分子 上，但也可以存在于包含不同区域的编码所述至少三个重链的一个核 酸分子上。核酸分子通常编码表达后从宿主细胞分泌、从而被加工以 生成成熟形式的轻链和/或重链的前体。在宿主细胞中表达抗体的这 些和其它方面对本领域普通技术人员来说是熟知的。

本文所使用的“重组宿主细胞”是包含一个或多个所谓转基因， 即在所述细胞中不是天然存在的重组核酸序列的细胞。当这些细胞在 有益于所述核酸序列表达的条件下培养时，这些转基因在所述宿主细 胞中表达以产生由这些核酸序列所编码的重组抗体。本发明的宿主细 胞可以以来自源于转基因已经被导入其中的单一宿主细胞的克隆的 培养物形式存在。为了获得编码抗体的核酸序列的表达，本领域技术 人员熟知能够驱动这种表达的序列能被功能性地与编码抗体的核酸 序列连接。功能性连接意谓着编码抗体片段或其前体的核酸序列被连 接到能驱动表达的序列上，使得这些序列能驱动抗体或其前体的表 达。有用的表达载体在现有技术中是可获得的，例如Invitrogen的 pcDNA载体系列。当编码感兴趣的多肽的序列被适当地插入到有关 控制所编码多肽的转录和翻译的序列时，所得到的表达盒对感兴趣的 多肽的产生，称为表达，有益。驱动表达的序列可以包括启动子、增 强子等，及其组合。这些应该能在宿主细胞中发挥功能，从而驱动与 它们功能性连接的核酸序列的表达。启动子可以为组成型的或受调节 的，可以从多种来源得到，包括病毒、原核或真核来源，或人工设计 的。感兴趣的核酸的表达可以来自天然启动子或其衍生物，或来自完 全异源的启动子。有些众所周知和用得很多的在真核细胞中用于表达 的启动子包含源于病毒，例如腺病毒的启动子，例如E1A启动子， 源于巨细胞病毒(CMV)的启动子，例如CMV立即早期(IE)启动子， 源于猿猴病毒40(SV40)的启动子，等等。适当的启动子也可以源自 真核细胞，例如金属硫蛋白(MT)启动子，延伸因子1α(EF-1α)启动 子，肌动蛋白启动子，免疫球蛋白启动子，热休克启动子，等等。任 何能在宿主细胞中驱动感兴趣的序列表达的启动子或增强子/启动 子在本发明中都是合适的。在一个实施方案中，能够驱动表达的序列 包含来自CMV启动子的一个区域，优选包含CMV立即早期基因增 强子/启动子核苷酸-735至+95的区域。本领域技术人员会意识到， 本发明中所使用的表达序列可以与能稳定或增强表达的元件，例如绝 缘体、基质附着区域、STAR元件(WO 03/004704)等等适当地组合， 这可以增强表达的稳定性和/或水平。重组宿主细胞中的蛋白质生产 已经广泛地被描述，例如Current Protocols in Protein Science，1995， Coligan JE，Dunn BM，Ploegh HL，Speicher DW，Wingfield PT，ISBN 0-471-11184-8；Bendig，1988。细胞被培养以使其能代谢，和/或生 长和/或分裂和/或产生感兴趣的重组蛋白。这可以通过本领域技术 人员熟知的方法来完成，包括但不限于为细胞提供营养。该方法包含 粘附于表面的生长、悬浮生长，或其组合。几种培养条件可以通过本 领域熟知的方法加以最优化，以优化蛋白质生产的产量。培养可以在 例如平皿、滚瓶或在生物反应器中，使用分批、补料分批、连续系统、 中空纤维，等等完成。为了达到通过细胞培养大规模(连续)生产重 组蛋白，在本领域中优选拥有能悬浮生长的细胞，优选拥有能在缺乏 动物或人来源的血清或动物或人来源的血清成分下被培养的细胞。由 于缺乏源于培养基的额外动物或人蛋白质，因而纯化更容易，安全性 增强，而系统也非常可靠，因为合成培养基在再现性上是最好的。

本发明的“宿主细胞”可以是能够表达重组DNA分子的任何宿 主细胞，包括细菌，例如埃希氏菌(Eschericia)(例如大肠杆菌 (E.coli))、肠杆菌(Enterobocter)、沙门氏菌(Salmonalla)、芽孢杆 菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、链霉菌(Streptomyces)， 酵母，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、毕 赤酵母(P.pastoris)、假丝酵母(Candida)或yarrowia，丝状真菌， 例如脉孢菌属(Neurospora)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲 霉(Aspergillus nidulans)和黑曲霉(Aspergillus niger)，昆虫细胞， 例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)SF-9或SF-21细胞，哺乳动物 细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、BHK细胞，小鼠细胞，包括 SP2/0细胞和NS-0骨髓瘤细胞，灵长类细胞，例如COS和Vero细胞、 MDCK细胞、BRL 3A细胞、杂交瘤、肿瘤细胞、无限增殖化的原代 细胞，人细胞，例如W138、HepG2、HeLa、HEK293、HT1080或胚 胎视网膜细胞，例如PER.C6TM等等。可选的表达系统常常涉及哺乳 动物细胞表达载体和宿主使得抗体被适当地糖基化。人细胞系，优选 PER.C6TM，可以被方便地使用以获得具有完全的人糖基化模式的抗 体。生长或繁殖细胞的条件(见例如，Tissue Culture，Academic Press， 编辑：Kruse和Paterson(1973))和重组产物表达的条件可以稍有不 同，根据本领域技术人员通常已知的方法，通常进行方法的最优化以 增加产物产量和/或细胞相对于彼此的生长。一般，使哺乳动物细胞 培养物的生产力最大化的原理、方案和实用技术可以在Mammalian Cell Biotechnology：a Practical Approach (M.Butler编辑，IRL出版 社，1991)中找到。在重组宿主细胞中表达抗体在本领域中已被广泛描 述(见例如EP0120694；EP0314161；EP0481790；EP0523949；美国 专利4816567；WO 00/63403)。编码轻链和重链的核酸分子可以作为 染色体外拷贝存在，和/或稳定整合进宿主细胞的染色体。在产品的 稳定性方面，优选后者。

抗体在细胞中根据本发明加以表达，并通过本领域技术人员通常 已知的方法从细胞中回收或优选从细胞培养基中回收。这样的方法可 以包括沉淀、离心、过滤、大小排阻层析、亲和层析、阳离子和/或 阴离子交换层析、疏水相互作用层析等等。对包含IgG分子的抗体混 合物来说，蛋白A或蛋白G亲和层析可以被适当地使用(见，例如， 美国专利4,801,687和5,151,504)。

在一个实施方案中，至少两个来自根据本发明所产生的混合物的 抗体包含具有不同特异性和/或亲和力的重链—轻链二聚体。特异性 决定哪个抗原或其表位被抗体结合。亲和力是对一特殊抗原或表位的 结合强度的量度。特异性结合被定义为以亲和力(Ka)至少5*10E4升 /摩尔结合，更优选5*10E5，更优选超过5*10E6，还更优选5*10E7， 或更多。典型地，单克隆抗体可以具有高达10E10升/摩尔，甚至更 高的亲和力。本发明所产生的抗体混合物可以包含至少两个与相同抗 原分子的不同表位结合的抗体，和/或可以包含至少两个与一个包含 抗原的混合物中存在的不同抗原分子结合的抗体。这样的包含抗原的 混合物可以为部分或全部纯化的抗原，例如毒素，膜组分和蛋白质， 病毒包膜蛋白的混合物，或它可以是健康细胞，患病细胞，细胞混合 物，组织或组织混合物，肿瘤，器官，完整的人或动物个体，真菌或 酵母，细菌或细菌培养物，病毒或病毒原种，这些的组合等等。与仅 能与单一抗原或表位结合的单克隆抗体不同，本发明的抗体混合物可 以因此具有多克隆或寡克隆抗体混合物的许多优势。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法的宿主细胞能够高 水平表达人免疫球蛋白，即至少1pg/细胞/天，优选至少10pg/细胞 /天，甚至更优选至少20pg/细胞/天或更多，而无需在所述宿主细 胞中扩增编码重链和轻链的核酸分子。优选地，本发明的宿主细胞在 它们的基因组中包含1-10个拷贝的要被表达的每一重组核酸。在本 领域，在例如CHO细胞中编码感兴趣的蛋白的核酸序列拷贝数的扩 增可以被用来增加细胞重组蛋白的表达水平(见例如，Bendig，1988； Cockett et al，1990；美国专利4,399,216)。这是目前广泛使用的方法。 然而，建立具有所需的高拷贝数和高表达水平的克隆需要付出很大 的、同时又耗时的努力，此外携带非常高拷贝数(高达数百)的表达 盒的克隆常常不稳定(例如，Kim et al.，1998)。因此本发明的一个优 选实施方案是使用不需要这类针对感兴趣的抗体的高水平表达的扩 增策略的宿主细胞。这样使得以一致的方式快速产生表达本发明的抗 体混合物的宿主细胞的稳定克隆。我们提供了本发明的宿主细胞可以 被获得、亚克隆和进一步繁殖至少大约30个细胞分裂(群体倍增)， 同时在没有选择压力下，以稳定方式表达本发明的抗体混合物的证 据。因此，在某些方面，本发明的方法包括培养细胞至少20、优选 25、更优选30个群体倍增，在其它方面，本发明的宿主细胞已经进 行了至少20、优选25、更优选30个群体倍增，而仍能表达本发明的 抗体混合物。本发明还提供从单一细胞生产免疫球蛋白混合物的细胞 培养物，所述混合物包含至少三个不同重链。本发明还提供了产生来 自单一细胞的至少三个不同单特异性免疫球蛋白的细胞培养物。在某 些优选方面，所述培养物在单一细胞中以超过20，优选超过25、更 优选超过30个群体倍增生产所述混合物或所述至少三个不同单特异 性免疫球蛋白。

根据本发明的方法的宿主细胞优选源自己被无限增殖化或用腺 病毒E1序列转化的人视网膜细胞。根据本发明的方法的特别优选的 宿主细胞是以ECACC no.96022940保藏的PER.C6TM或其衍生物。 PER.C6来源的克隆可快速产生，通常包含有限数目拷贝(大约1- 10)的转基因，能高水平表达重组抗体(Jones et al，2003)。因此，这 样的克隆预期在许多代后保持稳定的拷贝数，这在生物药物的生产上 是一个优势。PER.C6TM细胞的特点已经被广泛描述和证明，证实了 好的扩增过程、悬浮生长和生长因子非依赖性。此外，PER.C6TM可 以以高度可繁殖的方式被掺入悬浮液，使得它特别适于大规模生产。 在这一点上，PER.C6TM细胞系已被描述为生物反应器生长的特性， 即它能生长至非常高的密度。将PER.C6TM用于抗体的重组生产已在 出版物WO 00/63403和Jones et al.，2003中进行了详细描述。

本发明的另一方面是提供能通过本发明的方法得到的抗体的混 合物。这样的抗体混合物预期比它所包含的单独成分更有效，类似于 针对相同靶的多克隆抗体通常比单克隆抗体更有效。这样的混合物可 以针对多种多样的靶抗原或表位来制备。

本发明的另一方面是提供包含编码轻链的核酸序列和编码至少 三个不同的抗体重链的一或多个核酸序列的重组宿主细胞，其中所述 轻链和重链能配对，优选形成功能性结合结构域。配对的重链和轻链 形成针对一或多个靶抗原的功能性抗原结合区域。本发明的宿主细胞 在本发明的方法中是有用的。它们可被用于生产本发明的抗体的混合 物。

本发明的另一方面是提供包含重组生产的抗体的混合物的组合 物，其中在重组抗体的混合物中呈现有至少三种不同的重链序列。单 克隆抗体用重组方法常规生产。本发明揭示了用于多个领域中的诊断 或治疗的抗体混合物。本发明的组合物包含以抗体形式与轻链配对的 至少三种不同的重链的混合物。优选地，在所述混合物中的抗体的轻 链具有共同轻链。混合物可以包含双特异性抗体。混合物可以由来源 于单一宿主细胞的克隆，即来自包含相同重组核酸序列的细胞群产 生。混合物可以通过本发明的方法得到，或由本发明的宿主细胞产生。 在其它实施方案中，所述混合物中所呈现的重链数目为4、5、6、7、 8、9、10或更多。为某一特定用途的最佳混合物可以通过本领域技 术人员已知的方法或通过本发明所提供的方法依经验加以决定。本发 明的这样的组合物可以具有多克隆抗体混合物的若干好处，而不具有 多克隆抗体混合物通常与生俱来的缺点，其原因在于它们的产生方 式。人们进一步期望抗体混合物比分离的单克隆抗体更有效。因此本 发明的抗体混合物的剂量、以及因此所需要的生产能力可能比单克隆 抗体少。

例如已有描述，虽然没有针对肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)的单一 单克隆抗体能显著中和毒素，三种这种单克隆抗体的组合(寡克隆抗 体)中和450,000 50％致死剂量的BoNT/A，效价比人超免疫球蛋白 高90倍(Nowakowski et al，2002)。这一结果证明，仅包含2至3种不 同特异性的抗体的寡克隆混合物可以具有非常高的效价。

此外与单一单克隆抗体相比，由于靶或表位丧失导致本发明的混 合物丧失其活性的机会减少。在特别的实施方案中，本发明的混合物 中的2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个抗体具有不同特异性。 所述不同特异性可以针对相同抗原上的不同表位和/或针对一包含 抗原的混合物中的不同抗原。本发明的组合物进一步也可包含2、3、 4、5、6、7、8、9、10个或更多具有针对相同表位的不同亲和力的 抗体。具有针对相同表位的不同亲和力的抗体可以例如通过本领域技 术人员已知的亲和力成熟的方法产生。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的组合物具有的效果高于 在所述组合物中的每一个单独的单特异性抗体的效果。所述效果可以 在功能性测定中加以测量。本发明的“功能性测定”为能被用来在测 定条件下测定抗体或抗体混合物的一种或多种所需参数的测定。合适 的功能性测定可以为结合测定，凋亡测定，抗体依赖的细胞毒性 (ADCC)测定，补体依赖的细胞毒性(CDC)测定，细胞生长或增殖抑 制(抑制细胞的效应)测定，细胞杀死(细胞毒性)测定，细胞信号 传递测定，用于测量对病原体与靶细胞的结合的抑制的测定，用来测 量血管内皮生长因子(VEGF)或其它分泌的分子的分泌的测定，抑菌、 杀菌活性、病毒中和测定，测量抗体结合位点对免疫系统成分的吸引的测定，包括原位杂交 方法、标记方法等等。明显地，体内测定，例如动物模型，包括小鼠肿瘤 模型、自身免疫疾病模型、病毒感染或细菌感染的啮齿动物或灵长类 动物模型等等，也可以被用于这一目的。本发明的抗体混合物的功效 可以通过本领域技术人员通常已知的方法在这样的模型中与单个抗 体进行比较。

本发明的另一方面是提供鉴定至少一个生产抗体混合物的宿主 细胞克隆的方法，其中所述抗体混合物具有根据功能性测定的所需效 果，该方法包含下述步骤：(i)将编码至少一个轻链的核酸序列和编码 至少两个不同重链的一或多个核酸序列提供给宿主细胞，其中所述重 链和轻链能够彼此配对；(ii)在有益于所述核酸序列表达的条件下培 养所述宿主细胞的至少一个克隆；(iii)筛选宿主细胞的所述至少一个 克隆以生产通过功能性测定具有所需效果的抗体混合物；和(iv)鉴定 至少一个生产具有所需效果的抗体的混合物的克隆。优选地，如上述， 所述宿主细胞包含编码能够与所述至少两个不同重链配对的共同轻 链的核酸序列，使得所产生的抗体包含共同轻链。在特殊的实施方案 中，方法中步骤(ii)的所述培养和步骤(iii)的所述筛选用至少两个克隆 来完成。方法可任意包括测量所产生的抗体的表达水平的测定，测定 可在根据所述方法的步骤(ii)期间或其后、或随后在程序中。这样的 测定对本领域技术人员来说是熟知的，包括蛋白质浓度测定、免疫球 蛋白特异测定，例如ELISA、RIA、DELFIA等。在本发明的方法的 一个特别的实施方案中，宿主细胞包含编码至少3、4、5、6、7、8、 9、10个或更多能够与所述至少一个轻链配对的重链的一或多个核酸 序列。对用于本发明的方法的功能性测定可以为对凋亡、ADCC、 CDC、细胞杀死、增殖抑制、病毒中和、细菌调理、受体介导的信号 传递、细胞信号传递、杀菌活性的测定等等。对抗癌抗体的有用的筛 选测定例如已在美国专利6,180,357中进行了描述。这样的测定也可 以被用来鉴定根据本发明的方法的克隆。例如有可能用酶联免疫吸附 测定(ELISA)测试抗体对它们的靶的结合。使用这样的测定，有可 能筛选与靶抗原(或要被测试的抗体的混合物所针对的靶抗原的混合 物)最强烈结合的抗体混合物。另一种可被探究的可能性是直接筛选 细胞毒性或抑制细胞效应。有可能在这样的不同的筛选之后，而不是 上面所提到的ELISA，生产抗体混合物的其它或相同克隆会被选中。 可以根据本发明适宜地使用细胞杀死或癌细胞的生长停止的筛选。可 以通过多种终点对细胞死亡进行测量，包括代谢缺乏或酶的变性。在 本发明的一个可能的实施方案中，通过关注针对癌细胞的细胞毒性活 性作为终点来进行测定。为了这一测定，活/死测定试剂盒，例如 Molecular Probes生产的LIVE/DEADViability/Cytotoxicity测定试 剂盒(L-3224)可以被适当地使用。其它评估细胞生存力的方法，例如 台盼蓝排除、51Cr释放、Calcein-AM、Alamar blueTM、LDH活性和类 似方法也可被使用。测定也可以包括筛选抗体混合物对包含所需抗原 的组织的特异性。本发明的抗体可以具有有限的组织分布。有可能将 测试针对多种细胞、细胞类型或组织的抗体的混合物包括进来以筛选 优选与感兴趣的细胞、细胞类型或组织结合的抗体的混合物。

不考虑前面所述的功能性测定，本发明还教导了使用例如等电聚 焦(IEF)、质量光谱(MS)等等方法测定克隆所表达的抗体特性的途径。 本发明的一个方面因而是提供MS和/或IEF在选择表达本发明的抗 体混合物的克隆中的用途。

当单克隆抗体用重组宿主细胞生产时，通常进行筛选步骤以评估 所产生的各个克隆的表达水平。添加更多重链以生产混合物增加了抗 体生产的复杂性水平。当宿主细胞用编码能形成所需抗体混合物的轻 链和重链的核酸分子转染时，包含相同遗传信息、然而表达水平不同 的独立克隆可能出现，因此产生所编码抗体的不同比率，生成来自同 一所有遗传组成成分的抗体的不同混合物。本发明的方法对鉴定生产 用于某一目的的最佳混合物的克隆是有益的。

根据步骤(ii)和(iii)的培养和/或筛选可以使用分别高通量程序、 任意地以自动化方式来适当地进行。克隆可以，例如培养在96孔或 其它多孔板上，例如以阵列格式，并筛选所需混合物的产生。机器人 技术可以为这一目的被适当地使用。实现高通量培养和测定的方法通 常是可获得的，对本领域技术人员是已知的。人们将会清楚，也是为 了本发明的方法，使用能高水平表达蛋白质的宿主细胞是有益的，而 无需在所述细胞中扩增编码所述蛋白质的核酸。在一个实施方案中， 所述宿主细胞来源于已被无限增殖化或用腺病毒E1序列转化的人胚 胎成视网膜细胞。在一个优选实施方案中，所述细胞源自PER.C6TM。 这一细胞系已显示易于进行包括培养在内的高通量操作(WO 99/64582)。

在本发明的特殊的实施方案中，根据鉴定本发明的至少一种宿主 细胞的方法，所述抗体混合物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、 10或更多具有不同特异性和/或亲和力的抗体。

这一方法的潜在好处在于允许同时探索许多可能的组合，这些组 合固有地包括在所产生的混合物中存在双特异性抗体。因此，可以测 试更多组合，而不仅仅是通过在这些组合中以组合数目或不同抗体存 在的比率将纯化的已知单克隆抗体进行混合。

通过本发明的方法鉴定的克隆可用于生产所需的抗体混合物。因 此本发明的另一方面是提供生产抗体混合物的方法，该方法包含如下 步骤：培养通过鉴定至少一个生产本发明的抗体混合物的宿主细胞克 隆的方法所鉴定的宿主细胞，所述培养在有益于编码至少一个轻链和 至少两个不同重链的核酸分子表达的条件下进行。所生产的抗体可以 从宿主细胞和/或从宿主细胞培养物，例如从培养基中回收。抗体混 合物可以根据本领域技术人员已知的多种技术回收。本发明的还有一 个方面是提供用前述本发明的方法得到的抗体的混合物。所述混合物 可以用于多种目的，例如治疗或诊断疾病，还可以替代单克隆或多克 隆抗体或除了使用单克隆或多克隆抗体之外被使用。

本发明的方法可以适宜地使用编码抗体的核酸分子，这样的核酸 分子已经通过任何适宜的方法得到，包括体内，例如免疫方法或体外， 例如抗体展示方法(A.Plückthun et al，In Vitro selection and evolution of proteins.In：Adv.Prot.Chem.，F.M.Richards et al编辑，Academic Press，San Diego，2001，vol 55：367-403)，例如噬菌体展示，核糖体 展示或mRNA展示(C.Schaffitzel et al.，In Vitro selection and evolution of protein-ligand interaction by ribosome display.In：Protein-Protein Interactions.A Molecular Cloning Manual，E.Golemis编辑，冷泉港实 验室出版社，纽约，2001，535-567页》和酵母展示(例如WO 99/36569)。用噬菌体展示鉴定针对一定靶的抗体的方法是本领域技 术人员已知的，其中靶可以为已知抗原或存在于抗原混合物中的未知 抗原。一般地，在它们的表面表达抗原结合结构域或其衍生物的噬菌 体的文库与感兴趣的抗原或抗原混合物一起孵育，其中所述抗原结合 结构域由所述噬菌体中存在的遗传物质编码，然后得到展示与所需抗 原结合的抗原结合位点的噬菌体亚群的结合，而非结合噬菌体则被丢 弃。这样的选择步骤可以重复一次、两次或更多次以获得对感兴趣的 抗原多少具有特异性的噬菌体群。为了得到抗体、其部分或衍生物的 噬菌体展示方法已被广泛描述，在例如(CF Barbas III et al，Phage Display.A laboratory manual.冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约， 2001)。用于这样的筛选的文库可以通过使用一或多个轻链的遗传信 息组合编码多个重链的遗传信息产生。De Kruif et al.(1995b)所描述 的文库包含7个轻链。因此，在一组(a panel)可例如用De Kruif et al (见上)、美国专利6,265,150所描述的方法得到的、与靶结合的噬菌 体中，呈现的不同轻链不超过7个，而且如果组足够大，可以发现具 有与不相关的重链偶联的相同轻链的几个噬菌体。这样的噬菌体可以 用来获得在本发明的方法中有用的核酸分子。

本发明的另一方面是提供生产针对靶的抗体的混合物的方法，该 方法包括如下步骤：i)将包含抗体或抗体片段的抗体展示文库与包含 靶的材料接触，ii)至少一个选择与所述靶结合的抗体或抗体片段的步 骤，iii)鉴定与所述靶结合的至少两个抗体或抗体片段，其中所述至 少两个抗体或抗体片段包含共同轻链，iv)将编码所述轻链的核酸序列 和编码所述至少两个抗体的重链的一或多个核酸序列导入宿主细胞， v)在有益于所述核酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞的克隆。抗 体展示文库可以为噬菌体展示文库、核糖体展示文库、mRNA展示文 库或酵母展示文库。步骤i)和ii)可以任选地重复一次或更多次。

编码用噬菌体展示、核糖体展示或酵母展示方法获得的抗体的核 酸序列可以在将它们被导入到宿主细胞之前用本领域技术人员已知 的标准分子克隆方法和手段加以转变以编码任何所需的抗体形式，例 如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD、IgE(例如Boel et al， 2000中所描述的)。

本领域技术人员将会清楚，其中只有一条轻链被呈现的文库按照 本发明是特别有用的，因为从这样的文库所能得到的所有抗体将具有 在用每条重链与靶抗原结合时具有功能的共同轻链。换句话说，与本 发明的方法相一致，避免了非功能性轻链—重链二聚体的形成。具有 广泛的H链所有组成成分和唯一或非常少的L链序列的噬菌体抗体 展示文库在本领域已经被揭示(Nissim et al，1994；Vaughan et al， 1996)。一般地，抗体特异性在很大程度上似乎由它的重链决定。甚 至有可能筛选和鉴定不对抗体的结合作出显著贡献的轻链，这样的轻 链也可以根据本发明被适宜地使用。也有可能遵循本发明的教导，但 使用一条重链、使轻链不同。然而，使用一条共同轻链和不同重链看 来是优选的，下面的观察支持抗体特异性似乎受它的重链序列控制的 观点。在受体编辑过程中，B细胞具有监测它们的免疫球蛋白受体是 否编码潜在有害的自身抗体的机制，表达自身抗体的B细胞用另一 重链替换所表达的重链而保留所表达的轻链。因此，产生了不编码自 身抗体的新抗体特异性。这表明，单一轻链可以成功地与多个重链二 聚化以形成不同抗体特异性(Nemazee，2000；Casellas et al，2001)。 已经报道了一系列用带有不同轻链基因的单一重链基因转染的细胞 系，所产生的抗体不管轻链是什么在很大程度上保持它们的特异性 (Radic et al，1991)。不同抗体已经从用单一轻链构建的文库中得到 (Nissim et al，1994)。我们已经从De Kruif et al(1995)所描述的文库中 得到几个抗体，文库用7条轻链构建，抗体具有相同轻链但不同特异 性(见例如分别在WO 01/48485和WO 02/18948中描述的实施例1： antibodies binding to EpCAM and CD46)。除了针对靶筛选噬菌体文库 外，也可能从已被证实它的价值的抗体入手，根据本领域技术人员已 知的方法，例如噬菌体展示，在制备只与这一特殊轻链组合的重链文 库中使用这一抗体的轻链。利用这一策略，单克隆抗体可被用来获得 本发明的、功能上类似于针对相同靶的多克隆或寡克隆抗体的抗体混 合物。或者，可以使用与Jespers et al(1994)所描述的用来获得以功能 性啮齿类动物抗体为基础的人抗体的方法有相似之处的方法。非人来 源的已知抗体的重链首先被克隆，作为模板链与人轻链的所有组成成 分配对以用于噬菌体展示，随后筛选与抗原或抗原混合物结合的噬菌 体。所选中的轻链随后与噬菌体上所展示的人重链的所有组成成分配 对，再次选择噬菌体以发现几个当与轻链配对时能和感兴趣的抗原或 抗原混合物结合的重链。这能够生成针对靶的人抗体的混合物，对此 迄今为止只有非人单克隆抗体被描述过。有可能当单个抗体不具有对 靶的高亲和力、而高亲和力对单克隆抗体的有效性通常是必需的时 候，本发明的混合物已经具有有益的功能效果。这样的优势在于，对 于本发明的方法和混合物来说，与涉及单克隆抗体的方法相比，较少 的情况下需要亲和力成熟。

重链和轻链编码序列可以同时或相继被导入宿主细胞。本发明的 另一方面也制备了包含编码抗体轻链的重组核酸的宿主细胞。这样的 细胞可以例如通过所述核酸的转染得到，任选可以鉴定具有轻链高表 达的克隆。已建立的克隆可以随后被用来加入编码本发明的2、3、4、 5、6、7、8、9、10或更多重链遗传信息，通过将编码这些的核酸分 子导入已经含有轻链的克隆的细胞进行。编码重链的核酸分子可以一 同被导入所述宿主细胞。当然也可能将它们相继导入，例如通过使用 不同选择标记，如果因为细胞不接纳足够拷贝的重组核酸分子而不是 所有重链都能被同时导入时这会有好处。将重组核酸分子导入宿主细 胞的方法是本领域技术人员熟知的，包括转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、 病毒感染等等。本领域技术人员有数种可能性将具有感兴趣的核酸序 列的更多载体导入相同的宿主细胞，见例如Sambrook，Fritsch and Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，1989； Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel FM，et al编辑，1987； the series Methods in Emzymology，(Academic Press，Inc.)。用来将核 酸导入本发明的真核宿主细胞的适当的显性选择标记可以为G418或 新霉素(遗传霉素)、潮霉素或霉酚酸、嘌呤霉素等等，对这些标记 来说编码抗性的基因存在于表达载体上。更多的可能性包括例如使用 含有DHFR基因或谷氨酸合酶的载体分别在DHFR-细胞中存在氨甲 蝶呤或在谷氨酰胺营养缺陷体中缺乏谷氨酰胺的条件下进行选择。使 用带有不同选择标记的表达载体使得继而将感兴趣的重链序列转染 入已经稳定含有先前通过使用其它选择标记而被导入的其它重链的 宿主细胞成为可能。也可能使用能被不止一次使用的选择标记，例如 当含有突变、内含子、或致使它们浓度依赖的被弱化的启动子(例如 EP0724639；WO01/32901；美国专利5,733,779)。或者，选择标记通 过在使用后将它从宿主细胞删除，例如通过位点特异的重组，可以被 再次使用。位于被位点特异的重组酶所识别的序列，例如lox位点或 FRT位点之间的可选择标记被用来生成第一个稳定的转染子(Cre-lox 位点特异的重组见Wilson and Kola，2001)。随后，用匹配位点特异性 重组酶，例如Cre或Flp将可选择标记从宿主细胞DNA上切割下来。 随后的转染可以适宜地使用相同的选择标记物。可以制备每个包含编 码不同轻链的遗传信息的不同宿主细胞克隆。如果抗体用抗体展示方 法鉴定，则有可能制备几个宿主细胞，每个包含出现在抗体展示文库 中的一个轻链。在用抗体展示鉴定与靶结合的抗体之后，编码重链的 核酸分子可以被导入包含能与重链配对的共同轻链的宿主细胞。本发 明的一个方面因而是提供制备用来生产抗体混合物的宿主细胞的方 法，该方法包括如下步骤：将编码轻链的核酸分子和编码3、4、5、 6、7、8、9、10或更多能与所述轻链配对的不同重链的一或多个核 酸序列导入所述宿主细胞，其中所述核酸分子被相继或同时导入。当 然也可能同时导入至少两条所述核酸分子，并继而导入至少另外一条 所述核酸分子。在本发明的还有另一方面，提供用来制备用来生产抗 体混合物的重组宿主细胞的方法，该方法包含如下步骤：将编码2、 3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同重链的一或多个核酸分子导 入包含编码能与至少两条所述重链配对的轻链的核酸序列的重组宿 主细胞中。

为以防万一本发明的重组宿主细胞不表达足够的轻链与所有所 表达的至少两个重链二聚化，编码轻链的核酸分子的额外拷贝可转染 入细胞中。

除了转染后的随机整合，将转基因整合入基因组预先确定的位置 而导致良好表达水平的方法也可以根据本发明被使用。这样的方法可 以例如使用通过同源重组进行的位点特异性整合(见例如WO 98/41645)，或使用位点特异性重组酶(Gorman and Bullock，2000)。

本发明的还有一个方面是提供包含编码轻链的核酸序列和编码 至少两条能与所述轻链配对的不同重链的一或多个核酸序列的转基 因非人哺乳动物或转基因植物，其中所述编码所述轻链和重链的核酸 序列在组织特异性启动子的控制之下。植物中的启动子也可以是非组 织特异性的，并且也可以使用普通的基因表达元件，例如CaMV 35S 启动子和胭脂氨酸合酶polyA添加位点。所述轻链根据本发明是共同 轻链。在特殊的实施方案中，本发明的转基因动物或植物包含3、4、 5、6、7、8、9、10个或更多重链序列。除了以细胞培养物作为重组 蛋白质的生产系统外，本领域也揭示了使用转基因动物、转基因植物， 和例如用转基因鸡在鸡蛋中生产蛋白质等等，来生产感兴趣的重组蛋 白质(Pollock et al，1999；Larrick and Thomas，2001；WO 91/08216)。 这些通常包含与组织特异性启动子可操作地联合的编码一或多个感 兴趣的蛋白质的一或多个重组基因。例如已经表明重组抗体可以以高 水平在含有位于哺乳动物乳腺特异启动子之后的编码重链和轻链的 核酸的转基因动物的乳汁中产生(例如Pollock et al，1999；WO 95/17085)。在这方面特别有用的是能够被挤奶以获得抗体的母牛、 绵羊、山羊、猪、兔、小鼠等等。有用的启动子是酪蛋白启动子，例 如β-酪蛋白启动子、αS1-酪蛋白启动子、乳清酸性蛋白(WAP)启动子、 β-乳球蛋白启动子、α-乳清蛋白启动子等等。在转基因哺乳动物乳汁 中生产生物制药蛋白质已经被广泛描述(例如Pollock et al，1999)。 除了哺乳动物乳腺特异启动子，也可以使用其它组织特异性启动子， 以指导向血液、尿液、唾液等等的表达。包含重组核酸分子的转基因 动物的生成已经被广泛证明，并可包括卵母细胞的显微注射(见例如 Wilmut and Clark，1991)、转染后的核转移(例如Schnieke et al，1997)、 重组病毒感染(例如美国专利6291740)等等。针对哺乳动物细胞的核 转移和克隆方法对本领域技术人员来说是已知的，在例如(Campbell et al，1996；Wilmut et al，1997；Dinnyes et al，2002；WO 95/17500； WO 98/39416)中描述。现在有可能克隆大多数这些动物，以生成遗传 上同一的动物系，使本领域技术人员有可能在生产所需抗体混合物的 个体动物被鉴定后创造这样的品系。或者，可以使用经典育种方法来 产生转基因后代。产生转基因动物用来在乳汁中生产重组蛋白质的策 略在Brink et al，2000中描述。

生产抗体的转基因植物或植物细胞也已被描述(Hiatt et al，1989； Peeters et al，2001)，针对这一目的的有用的植物包括谷物、玉米、烟 草、大豆、苜蓿、水稻等等。能例如被用于植物细胞的组成型启动子 为CaMV 35S和19S启动子，农杆菌启动子nos和ocs。其它有用的 启动子为光可诱导启动子，例如rbcS。组织特异启动子可以例如是种 子特异的，例如来自玉米醇溶蛋白、napin、β-菜豆碱、泛素的启 动子，或块茎特异的、叶子特异的(例如在烟草中有用的)、根特异 的等等。也可能通过同源重组转化质体细胞器，以在植物中表达蛋白 质。在重组植物或其部分，或重组植物细胞培养物中表达蛋白质的方 法和手段是本领域技术人员已知的，已经例如在(Giddings et al，2000； WO 01/64929；WO 97/42313；美国专利5888789，6080560；实用指 南见Method In Molecular Biology vol.49，“Plant Gene Transfer And Expression Protocols”，Jones H，1995)中加以描述。其它用来生产重 组蛋白质的转基因系统也已被描述，包括使用转基因鸟类在卵中生产 重组蛋白质(例如WO 97/47739)，使用转基因鱼(例如WO 98/15627)， 并可以与本发明的教导组合使用以获得抗体混合物。也有可能使用体 外转录/翻译或体外翻译系统来表达本发明的抗体混合物。本领域技 术人员将会明了，本发明的教导将允许在编码轻链和重链的重组核酸 能被导入和表达的系统中生产抗体混合物。优选这样的系统能够生产 由所述核酸序列编码的抗体，而无需在所述系统中对所述核酸序列进 行扩增。在本发明的另一方面中，提供了来自本发明的转基因非人动 物或转基因植物的细胞。这样的细胞可被用于使用本领域技术人员已 知的技术，例如核转移或其它已知的从单个细胞克隆整个生物体的方 法，产生本发明的动物或植物。本发明的细胞也可以通过将轻链和至 少两个重链序列导入能够成为转基因动物或植物的一部分的非人动 物或植物的分离细胞而得到。对这样的目的特别有用的是胚胎干细 胞。这些能够加入种系，因此导入这样细胞的遗传信息可以被传递给 将来的后代。此外，当用编码轻链和重链的核酸分子转化时，例如通 过使用植物转化细菌根瘤土壤杆菌或通过粒子轰击、或用重组植物病 毒感染后，棉花、谷物、番茄、大豆、土豆、矮牵牛和烟草的植物细 胞培养物可以被用作宿主。

本发明的另一方面是提供包含重组生产的抗体混合物和适当的 载体的药物组合物，其中在所述重组生产的抗体混合物中呈现至少两 条不同重链。本文所用的药学上可接受的载体例如但不限于佐剂、固 体载体(solid carrier)、水、缓冲液或在本领域中用来支持治疗成分 的其它载体，或其组合。在特殊的实施方案中，3、4、5、6、7、8、 9、10个或更多不同重链在所述混合物中呈现。所述混合物可以通过 混合重组生产的单克隆抗体得到，也可以通过本发明的方法获得。所 述混合物可以因而包含对所述抗体来说的共同轻链。所述混合物可以 包含双特异性抗体。所述混合物可以从源自单一宿主细胞的克隆，即 从包含相同重组核酸分子的细胞群中生产。本文所用术语“重组生产” 指通过生产由导入这样的宿主细胞或其组现先的重组核酸所编码的 抗体的宿主细胞来生产。它因此不包括生产多克隆抗体的经典方法， 其中个体用抗原或包含抗原的混合物免疫，然后这一个体所生产的抗 体从个体中，例如从血液中回收。

本发明的另一方面是提供抗体混合物，其中呈现至少两条重链， 用于人类或动物个体的治疗或诊断。在另一方面，本发明提供了呈现 至少两个不同重链的抗体混合物在制备用于人或动物个体的疾病或 紊乱的治疗或诊断的药物中的应用。在特殊的实施方案中，在所述混 合物中呈现2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的重链。所述抗 体混合物可以为本发明的抗体混合物，或通过本发明的方法来得到。 在所述混合物中的抗体可以优选包含共同轻链。混合物可以包含双特 异性抗体，并可以从源自单一宿主细胞的克隆，即含有相同重组核酸 分子的细胞群中重组生产。靶可以被用来筛选如前面所描述的抗体展 示文库，以获得2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多包含与靶结 合的共同轻链的抗体，生产本发明教导的这些混合物。事实上可应用 单克隆抗体的任何医学领域都适于应用本发明的混合物。这可以例如 包括治疗自身免疫疾病和癌症，包括脑、头颈、乳腺、前列腺、结肠、 肺等等的实体肿瘤，以及血液肿瘤例如B细胞瘤。能用本发明的混 合物治疗的瘤性紊乱包括白血病、淋巴瘤、肉瘤、癌、神经细胞肿瘤、 鳞状上皮细胞癌、生殖细胞肿瘤、转移瘤、未分化肿瘤、精原细胞瘤、 黑素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、混合细胞肿瘤、感染剂所引起的瘤 形成，以及其它恶性肿瘤。抗体混合物的靶可以包括，但不限于 HER-2/Neu受体，其它生长因子受体，例如VEGFR1和VEGFR2受 体，B细胞标记，例如CD19、CD20、CD22、CD37、CD72等，T 细胞标记，例如CD3、CD25等，其它白血球细胞表面标记，例如 CD33或HLA-DR等，细胞因子，例如TNF、白细胞介素，这些细胞 因子的受体，例如TNF受体家族成员，等等。预期这样的抗体混合 物在癌组织或其它包含复杂多抗原的细胞，例如微生物或病毒的治疗 中的应用与应用单一单克隆抗体相比将较少发生表位丧失逃逸变体。 现今的几种治疗使用源自被免疫的人或动物的抗体的多克隆混合物。 这些治疗可以用本发明的混合物替代。这些混合物的用途也可以包括 用在移植领域已知的移植物对宿主的排斥中，例如通过使用抗胸腺细 胞抗体。预期抗体的混合物在治疗复杂抗原或包含抗原的混合物例如 细菌或病毒上优于单克隆抗体。因此，本发明的用途也可以包括抗细 菌和真菌菌株的用途，例如在病原细菌例如多种药物耐受的金黄色葡 萄球菌(S.aureus)等等，真菌例如白色假丝酵母(Candida albicans) 和曲霉种，酵母等等所引起的感染性疾病的治疗中。本发明的混合物 也可被用于针对病毒，例如狂犬病毒属成员，例如狂犬病病毒的暴露 后预防，或用于针对病毒例如水痘—带状疱疹病毒、腺病毒、呼吸道 合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、人Metapneumo病毒、流感病毒、西 尼罗河病毒、引起严重急性呼吸综合症(SARS)的病毒，等等的治疗 或预防。本发明的混合物也可以被用于针对细菌和病毒制剂，以及针 对生物战的潜在威胁的毒性物质的保护。因此，本发明的用途也可以 包括针对细菌株，例如炭疽芽孢杆菌(bacillus anthracis)、肉毒梭状 芽孢杆菌(Clostridium botulinum)毒素、产气荚膜梭状芽孢杆菌 (Clostridium perfringens)ε毒素、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia Pestis)、 土拉热弗郎西斯氏菌(Francisella tulariensis)、伯氏考克斯氏体 (Coxiella burnetii)、布鲁氏菌(Brucella)属的种，葡萄球菌 (Staphylococcus)肠毒素B、或针对病毒例如大天花、引起脑膜脑 炎综合症(EEEV、VEEV和WEEV)的甲病毒属、已知引起出血热的 病毒例如Ebola、马尔堡和Junin病毒、或针对病毒，例如Nipah病 毒、汉坦病毒、森林脑炎病毒和黄热病病毒、或针对毒素，例如来自 蓖麻(Ricinus communis)的蓖麻毒蛋白等等的用途。本发明的混合 物的用途也可以包括针对单细胞或多细胞寄生虫的用途。本发明的抗 体的重组混合物可以成为获自用于被动免疫的人血清库、或获自超免 疫动物的血清的多克隆抗体的安全替代物。混合物可以在多种治疗应 用，包括癌症、变态反应、病毒性疾病、慢性炎症等等中比重组单克 隆抗体更有效。    

已有描述，肿瘤反应性单克隆抗体的同种型二聚体化显著增加它 们诱导生长停滞或肿瘤细胞凋亡的能力(Ghetie et al，1997)。有可能， 当针对靶细胞，例如肿瘤细胞或感染性微生物上的受体或其它表面抗 原的抗体根据本发明被生产时，本发明的混合物中存在的双特异性抗 体也可以交联靶细胞表面的不同受体或其它抗原，因此这样的混合物 也可以非常适于杀死这样的细胞。或者，当不太需要双特异性抗体时， 本发明也提供了重组生产主要包含单特异性抗体的抗体混合物的方 法。已经有描述，用RituximabTM(抗-CD20单克隆抗体)治疗的功 效在加入抗CD59抗体后增加(Herjunpaa et al，2000)。因此，预期在包 含以B细胞受体识别抗体形式的抗肿瘤抗体的本发明的混合物中加 入抗CD59抗体增加肿瘤细胞对补体攻击的敏感性。也已经显示，抗 -CD19、抗-CD22和抗-CD38-皂草素免疫毒素的三重组合鸡尾酒在免 疫缺陷小鼠模型中的人B细胞淋巴瘤的治疗中比单个成分有效得多 (Flavell et al，1997)。许多其它的组合也是可行的，可由本领域技术人 员设计。一般地，能识别多重B细胞表位的抗体混合物的使用很可 能将减少逃逸变体的发生。

另一可能的靶是由Her-2/Neu(ErbB2)原癌基因编码的跨膜酪氨酸 激酶受体(抗-Her2抗体见美国专利5,772,997和5,783,186)。Her-2 在30％的高度恶性乳腺癌中过表达，针对这一靶的成功抗体，以 HerceptinTM(Trastuzumab)为名市场化，已被开发。已经显示，用单克 隆抗体混合物靶向多重Her-2表位导致人乳腺癌细胞系体外和体内抗 生长活性的改善(Spiridon et al，2002)。Her-2可以因此是本发明的抗体 混合物的良好靶。对这一目的有益的抗体可以通过本发明描述的方 法，包括抗体展示方法得到。

人类抗体能够通过与免疫效应细胞上的免疫球蛋白受体结合引 起效应子功能。人IgG，尤其是IgG1和IgG3，固定补体以诱导CDC， 并与Fcγ受体相互作用以诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性 (ADCC)、吞噬、胞吞、呼吸爆发的诱导和炎性介质和细胞因子的释 放。人IgA与FcαR相互作用，也导致ADCC的有效激活和靶细胞的 吞噬。因此，由于FcγR和FcαR在外周血细胞上的差异分布(Huls et al.， 1999)，使用针对靶和既由IgG也由IgA组成的抗体混合物将潜在地 使不同免疫效应细胞的补充和激活最大化。这样的既有IgG也有IgA 的混合物可以通过使用两种不同的生产细胞系在分开的生产过程中 生产IgG和IgA单克隆抗体来得到，但也可以从既生产IgG也生产 IgA单克隆抗体的单一细胞系中得到。这样的优势在于只需要开发一 个生产程序。因此，当提到不同重链时，在恒定区有所不同的重链也 包含在本发明中。使用共同轻链的原则也可以被用来生产来自宿主细 胞的同种型的混合物。因而本发明的另一方面是提供生产包含来自宿 主细胞的不同同种型的抗体混合物的方法，该方法包含如下步骤：在 对所述核酸序列的表达有益的条件下，培养包含编码轻链的核酸序列 和编码能与所述轻链配对的不同同种型的至少两条重链的核酸序列 的宿主细胞。根据本发明的这一方面，不同重链可以具有同样的可变 区，而只在它们的恒定区有所不同(即不同种型，具有相同特异性)。 在一个特殊的实施方案中，所述同种型包含至少IgG和IgA和/或 IgM，优选IgG1或IgG3和IgA。也可使用IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 的其它组合。在这些实施方案中，由于可变区是相同的，双特异性抗 体将不会被生产。

在根据本发明这一方面的其它实施方案中，不仅重链的恒定区可 以不同，可变区也可以不同，因而产生与相同轻链配对的不同的特异 性。当为一特定目的不需要双特异性抗体时，例如因为由于双特异性 抗体的存在使得抗体混合物不那么有效，有可能使用本发明的与共同 轻链组合的至少两条重链，其中所述重链在恒定区有足够的不同以减 少或防止在不同重链之间配对，例如通过使用不同同种型，例如一个 IgG1和一个IgG3的重链(示意图见图11)。如果还能配对的话，预 期不同同种型的重链与相同重链相比会以较低的效率进行配对。或 者，也有可能在它们的恒定区对不同重链进行工程化使得同种型二聚 体化胜过异二聚体化，例如通过导入自身互补(self-complementary) 相互作用(可能性见例如WO 98/50431，例如 “protuberance-into-cavity”策略(见WO 96/27011))。因此本发明的 另一方面是提供在重组宿主中生产抗体混合物的方法，该方法包括如 下步骤：在重组宿主细胞中表达编码共同轻链的核酸序列和编码在可 变区不同的并能与所述共同轻链配对的至少两条不同重链的核酸序 列，其中所述重链进一步在它们的恒定区有足够的不同以减少或防止 不同重链之间的配对。在一个实施方案中，所述重链为不同的同种型。 在特殊的实施方案中，3、4、5、6、7、8、9、10个或更多不同重链 被表达。用这一方法获得的抗体混合物也在本发明中实施。这样的混 合物将主要包含单特异性抗体。

本发明的教导也可用于获得新的多特异性抗体或其混合物。因 此，在另一方面，本发明提供在重组宿主中生产包含二聚体IgA同种 型{(IgA)2}抗体的抗体混合物的方法，其中至少部分所述二聚体IgA 抗体在每一IgA亚单位具有不同结合区域，该方法包含如下步骤：在 重组宿主细胞中表达编码共同轻链的核酸序列和编码能够与所述共 同轻链配对的IgA同种型的至少两个不同重链的核酸序列，其中所述 不同重链在它们的可变区有所不同。IgA分子的二聚体化可以通过共 表达J链加以提高(Yoo et al，1999)。所述二聚体化的IgA抗体具有两 种特异性(所生产的和混合物中存在的一种可能形式的示意图见图 9)。还在另一方面，本发明提供生产包含具有至少两种不同特异性的 IgM抗体的抗体混合物的方法，该方法包含在重组宿主细胞中表达编 码共同轻链的核酸序列和编码IgM同种型的至少两条不同重链的核 酸序列的步骤，其中所述重链能与所述共同轻链配对，并形成功能性 抗原结合区域。在有J链存在下，在IgM五聚体中可以包含高达5 种特异性，在缺乏J链时，在IgM六聚体中高达6种(Yoo et al，1999)。 因此，在特殊的实施方案中，3、4、5或6个IgM重链根据本发明的 这一方面与共同轻链共表达。根据本发明的这一方面，可被生产和在 混合物中存在、当五个不同重链与一个共同轻链表达的一个可能形式 的示意图见图10。本发明也提供具有至少两种不同特异性的IgA二 聚体、IgM五聚体或六聚体。这些分子可以从本发明的单一宿主细胞 的克隆中生产。携带具有不同特异性的抗原结合区域的这样的分子可 以结合相同抗原上的不同表位、一个细胞上的不同抗原、或不同细胞 上的不同抗原，从而将抗原或细胞交联。

本发明的还有一个方面是提供在功能性测定中鉴定具有所需效 果的抗体混合物的方法，该方法包含如下步骤：i)在功能性测定中加 入抗体混合物；和ii)在所述测定中测定所述混合物的效果，其中所述 抗体混合物包含具有共同轻链的抗体。在一优选的实施方案中，所述 混合物包含在本发明的组合物中。

本发明还提供在单一宿主细胞中重组表达一或多种蛋白质的方 法，其中在所述单一宿主细胞中至少4种不同多肽被表达。每一多肽 被独立表达，并可以在异源启动子的控制之下。一或多种蛋白可以单 独或作为混合物从所述宿主细胞的培养物中分离。优选地，这一实施 方案的宿主细胞是人类细胞，和/或可以源于视网膜细胞，更优选在 其基因组中包含腺病毒E1序列的细胞，最优选PER.C6细胞。

实施例

以下实施例被提供用于举例说明本发明，且不以任何形式解释为 限制本发明的范围。除非另外指出，本发明的实施将使用免疫学、分 子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技 术在现有技术范围内。参见例如Sambrook，Fritsch和Maniatis， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，1989；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel FM等，1987；the series Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；PCR2：A Practical Approach，MacPherson MJ，Hams BD，Taylor GR，1995；Antibodies： A Laboratory Manual，Harlow and Lane，1988。

实施例1在单细胞中用一条共同轻链和两个不同的重链可变区 生产单克隆抗体混合物

通过用半合成文库(de Kruif等，1995b)分别对结直肠(colorectal) 细胞系SW40(Huls等，1999)和多发性骨髓瘤患者单核细胞的非均匀 混合物(WO 02/18948)进行选择，预先分离克隆UBS-54和克隆K53。 进一步的研究显示克隆UBS-54和K53分别结合到EP-CAM同种型 粘附分子(homotypic adhesion molecule)(Huls等，1999)与膜辅因子 蛋白CD46(WO 02/18948)上。对这些克隆的DNA测序揭示它们在重 链CDRs中是独特的，但它们含有相同的轻链序列(图3)。通过基 本如(Boel et al，2000)所述方法，克隆UBS-54和K53的VH与VL被 插入到含HAVT20前导序列和含κ型轻链的人IgG1恒定区的全部编 码序列的表达载体中，这产生质粒pUBS3000Neo和pCD46_3000(Neo) (图4)。这些质粒单独地或组合地在PER.C6TM细胞中瞬间表达。简要 地说，通过在无血清DMEM培养基中，于37℃用140μl lipofectamine+10μg DNA(pUBS3000Neo或pCD46_3000(Neo)或 10μg两者的混合物)孵育4小时，转染80cm2烧瓶。4小时后，用 DMEM+10％FBS取代，细胞在37℃生长过夜。然后细胞用FBS 洗涤，且培养基被Excell 525培养基(JRH Bioscience)取代。细胞被允 许在37℃下生长6天，然后收集细胞培养上清。人IgG特异性ELISA 分析(WO 00/63403中所述)揭示对所有含有表达质粒的烧瓶来说， 大约存在10μg/ml的IgG。在没有被表达质粒转染的对照烧瓶中，没 有IgG1存在。随后，来自于各上清的人IgG根据厂商(Amersham Biosciences)所推荐的标准程序，采用蛋白A亲合层析纯化(Hightrap Protein A HP，目录号1-040203)。洗脱后，样品在一Microcon YM30 浓缩器(Amicon)中浓缩，且缓冲液换作10mM磷酸钠，pH6.7。随后 在等电聚焦凝胶上分析12μg纯化的IgG(Serva Pre-cast IEF gels，pH 范围3-10，目录号42866)。样品上样于低pH端，聚焦后用胶状蓝染 色(图5)。泳道1表示瞬间表达的K53，泳道2表示瞬间表达的 UBS-54，泳道3表示其中两种抗体共转染的细胞IgG样品。明显地， K53和UBS-54各自有一独特的pI图谱，且样品形成的共转染显示出 其它独特的同种型，其中主要的同种型的pI在K53和UBS-54的之 间。基于用Expasy主页(http：//www.expasy.ch；Appel等，1994)所提 供的ProtParam工具计算到的理论pI，这也被预测到了。K53和 UBS-54的理论pI分别为8.24和7.65，然而代表一种由一条UBS-54 重链和一条K53重链组成的异二聚体的同种型的理论pI为8.01。这 样的异二聚体的装配只会发生在当单细胞不但翻译K53的重链还翻 译UBS-54的重链，并将它们与共同轻链一起装配成全长IgG分子的 时候。因此，本试验说明有可能在单细胞中表达两条独特的人IgG分 子，且由这两种独特结合特异性组成的异二聚体也被有效地形成。

实施例2  在PER.C6TM细胞系来源的克隆中生产抗人B细胞标 记的抗体混合物。

本文举例说明了一种生产本发明的抗体混合物的方法，利用在重 组宿主细胞中表达单条轻链和能与上述单条轻链配对的三条不同的 重链以形成功能性抗体，如图6所示。编码可结合存在于人B细胞 上的蛋白质，也就是CD22、CD72和II类主要组织相容性复合物 (MHC)(进一步指HLA-DR)的抗体的噬菌体被预先从半合成噬菌 体文库中分离出来(de Kruif等，1995；van der Vuurst de Vries& Logtenberg，1999)。噬菌体克隆B28(抗CD22)、克隆I-2(抗HLA-DR) 和克隆II-2(抗CD72)的VH和VL序列的DNA测序揭示除含相同 CDR区的共有轻链序列(Vλ3)外，它们都包含一独特的VH序列(图 7)。

克隆B28、I-1和II-2的VH和VL序列被克隆到含有重链的表达 质粒的HAVT20前导序列之后。这种质粒的一个例子是pCRU-K01 (含有κ重链序列，如果想要，可以被本领域技术人员很容易地用λ 重链序列交换)，保藏于ECACC，保藏号为03041601。这种克隆产 生对CD22、CD72和HLA-DR具有结合特异性的、编码全长人IgG1 的质粒。这些质粒进一步分别是pCRU-CD22、pCRU-CD72和 pCRU-HLA-DR。

稳定的PER.C6TM来源的细胞系通过本领域技术人员已知的方法 生产(见例如WO 00/63403)，例如，表达pCRU-CD22、pCRU-CD72 或pCRU-HLA-DR上的遗传信息所编码的抗体的细胞系和表达所有 三种质粒编码的抗体的细胞系。因此，PER.C6TM细胞在组织培养皿 (直径10cm)或T80瓶中，以每皿大约2.5×106个细胞接种到添加了 10％FBS的DMEM中，在其标准培养条件下(10％CO2浓度和37℃) 保持过夜。次日，用Lipofectamine(Invitrogen Life Technologies)并依 照厂商所提供的标准流程，在37℃于另外的培养皿中进行转染，用 1-2μg pCRU-CD22、1-2μg pCRU-D72、1-2μg pCRU-HLA-DR或1μg 的pCRU-CD22、pCRU-CD72和pCRU-HLA-DR的混合物。作为转 染效率的对照，一些培养皿用LacZ对照载体转染，而一些培养皿不 转染以用做阴性对照。

4到5小时后，用DMEM将细胞洗涤两遍，不经挑选用新鲜培 养基重饲(refed)。第二天，培养基被含有500μg/ml G418的新鲜培 养基替换。每2天或每3天，细胞用含有相同浓度G418的培养基更 新。大约接种后20-22天，可见大量的菌落，且从每一转染中挑选至 少300个并通过96孔和/或24孔、通过6孔平板到T25瓶中生长。 在这一阶段，细胞被冷冻(每传代培养菌落至少1小管但通常4小管)， 且重组人IgG抗体的生产水平通过人IgG1特异性的ELISA方法在上 清中测定(如WO 00/63403中所述)。同样，在这一阶段，G418从培 养基中移除不再使用。对具有代表性的菌落，将被大量培养以根据标 准程序用蛋白A亲合层析法从条件上清中纯化重组人IgG1片段。来 自不同克隆的纯化的人IgG1用SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和用在 它们的细胞表面表达这些人抗原的细胞转染子结合靶CD22、CD72 和HLA-DR来分析(表达CD72和HLA-DR的转染子已经被van der Vuurst-de Vries和Logtenberg所描述，1999；CD22转染子已根据 PER.C6TM中相似的标准程序制得)。pCRU-CD22、pCRU-CD72和 pCRU-HLA-DR共转染所得菌落通过对基因组DNA的PCR来筛选这 三种构建体的每一种的存在与否。PCR产物的相同性进一步通过 DNA测序证实。

接下来，我们证明了克隆细胞系导致了三种结合特异性的每一种 的产生，即证明单细胞能够产生多于两种功能性人IgG’s的混合物。 因此，对筛选产生这三种结合特异性的每一种为阳性的少数菌落(即 通过DNA水平的PCR以及针对CD22、CD72和HLA-DR的特异性 结合实验)，通过荧光激活细胞分选仪(FACS)(Becton&Dickinson FACS VANTAGE SE)进行单细胞分选。或者，菌落以0.3个细胞/孔接 种以保证克隆生长。克隆细胞群，此后被称作亚克隆，用新鲜培养基 每周更新一次。亚克隆生长并通过24孔和6孔平板从96孔转移到 T25瓶中。在这一阶段，亚克隆被冷冻(每个亚克隆至少1小管，但 通常为4小管)，且在上清中用人IgG1特异性ELISA测定重组人IgG1 抗体的生产水平。对具有代表性的亚克隆，大量培养以根据标准程序 用蛋白A亲合层析法从条件上清中纯化重组人IgG1级分。

来自不同亚克隆的纯化的人IgG1随后如上所述分析从亲本克隆 中获得的人IgG1那样分析，即通过SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和 结合靶CD22、CD72和HLA-DR。亚克隆也通过基因组DNA的PCR 来筛选pCRU-CD22、pCRU-CD72和pCRU-HLA-DR三种构建体中 的每一种的存在与否。PCR产物的相同性进一步通过DNA测序证实。

其它方法，如Southern印迹和/或FISH也能被用以确定在克隆细 胞系中这三种构建体中的每一种是否存在。

对这三种构建体中每一种来说，被证明为转基因的亚克隆被培养 一段相当长时期来测定这种转基因的存在是否稳定以及抗体混合物 的表达是否达保持一致，不仅仅是在表达水平方面，还在细胞分泌的 不同抗体同种型之间的比例上。因此，该亚克隆培养物被保留至少 25倍群体倍增时间，或作为贴壁培养物或作为悬浮培养物。在每4-6 个群体倍增，用人IgG特异性ELISA进行特定的产物检测，且大量 被培养以获得细胞沉淀和上清。该细胞沉淀被用以评估在基因组 DNA中这三种构建体的存在，通过PCR或Southern印迹和/或FISH。 上清被用以如上所述来纯化重组人IgG1级分。在不同群体倍增获得 的纯化的人IgG1如前述被分析，即通过SDS-PAGE、等电聚焦(IEF) 和用表达这些抗原的细胞转染子结合靶CD22、CD72和HLA-DR。

实施例3在表达多种人IgG的克隆中筛选最有效的功能性人 IgG混合物

抗体混合物的功能性在基于细胞的测定中来分析，以确定是否人 IgG1混合物抑制例如Ramos这样的B细胞系的增殖和/或诱导凋亡。 也能应用其它的细胞系。此外，分析了该抗体混合物诱导例如Ramos 细胞的抗体依赖的细胞毒性和补体依赖的细胞毒性的潜力。

在以下的各个实验中，分析了抗体混合物识别靶CD22、CD72 和HLA-DR的功能性，且与每一单独IgG1抗体和三种单独IgG1特 异性的等摩尔组合对比。

为评估抗体混合物抑制Ramos细胞增殖的能力，这些细胞在96 孔板中(0.1-1.0×105个/ml)在抗CD22、CD72和HLA-DR的抗体混 合物的几个浓度下(5-20μg/ml)孵育24小时。细胞的增殖通过在另外 16小时的培养期间的3H-胸苷掺入测量。对生长的抑制通过相对于未 经处理细胞(作为100％参考值)3H-胸苷掺入的百分比作图测定。

为分析Ramos细胞的凋亡的介导，这些细胞在48孔板中(0.2-1.0 ×106个/ml)在抗靶CD22、CD72和HLA-DR的抗体混合物的几个 浓度下(5-20μg/ml)被刺激24或48小时。孵育期后，分析在凋亡细胞 上暴露的磷脂酰丝氨酸(Koopman G等，1994)。因此，收获细胞， 用PBS洗两遍并用100μl在膜联蛋白V结合缓冲液(Caltag)中以1∶ 25稀释后的FITC标记的膜联蛋白V(Caltag)在室温下孵育10分钟。 在用流式细胞计量术(FACSCalibur，Becton Dickinson，San Jose，CA)分 析样品之前，添加终浓度5μg/ml的碘化丙锭(PI)(Sigma)从凋亡 细胞(膜联蛋白V+/PI-，早期凋亡细胞；膜联蛋白V+/PI+，晚期凋亡 细胞)中区分坏死细胞(膜联蛋白V-/PI+)。

在一种替代测定中，凋亡是通过在孵育期交联抗Ramos细胞的 细胞表面上的CD22、CD72和HLA-DR的抗体混合物与25μg/ml的 羊抗人(Fc-特异性)F(ab)2多克隆抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories，West Grove，PA)所诱导的。

在另一种替代测定中，凋亡是通过在抗CD22、CD72和HLA-DR 的抗体混合物的几种浓度下(5-20μg/ml)孵育Ramos细胞，同时将它 们与化学敏感试剂阿霉素(Calbiochem)或地塞米松(UMCU，Utrecht， 荷兰)共孵育所诱导的。

抗体混合物的抗体依赖的细胞毒性是将外周血单核细胞作为效 应细胞在标准的51Cr释放测定中被分析的(Huls等，1999)。为了这 个目的，1-3×106个Ramos细胞用100μCi(Amersham， Buckinghamshire，UK)在37℃标记1小时。在用培养基洗涤3遍之 后，Ramos靶细胞以5×103个细胞/孔铺板在U形底96孔板中。通过 Ficoll-Hypaque密度梯度获自健康捐赠者的外周血单核细胞被随后添 加到每孔中，效应细胞∶靶细胞的比例范围从80∶1到10∶1，一式三 份。这些细胞在37℃在抗体混合物的不同浓度下(5-20μg/ml)孵育， 终体积200μl。孵育4小时后，收获部分上清并测量51Cr释放。特异 性裂解的百分比用以下公式计算：特异性裂解％＝([实验cpm-自发 cpm]/[最大cpm-自发cpm]×100％)。最大51Cr释放通过向靶细胞添 加triton X-100至终浓度为1％来测定，自发释放用培养液单独孵育靶 细胞后测定。

补体依赖的细胞毒性在类似的测定中被确定。替代效应细胞，现 将50μl人血清添加到靶细胞中。随后，以同样的方式进行测定。

或者，抗体混合物的ADCC和CDC用铕释放测定(Patel和Boyd， 1995)或用LDH释放测定(Shields等，2001)来确定。

实施例4应用噬菌体展示分离具有抗预定义的靶(Her-2)的相 同的VL序列的多种噬菌体，及在重组宿主细胞中生产能够结合该靶 的抗体混合物

能够结合存在相同蛋白质，例如表皮生长因子受体Her-2上的多 表位的噬菌体展示scFv片段能从半合成噬菌体文库中分离(de Kruif 等，1995a，b)。有可能鉴定几个这样的噬菌体并选择包含相同轻链序 列的那些进一步用于本发明的用途。半合成噬菌体文库是通过混合7 个亚文库而形成的，其中每一个文库含有一种不同的轻链(de Kruif 等，1995a，b)。因此，应用这样的含有仅一种轻链和多种重链的亚 文库筛选获得有相同VL序列的多种抗体是尤其实用的，且被进一步 用于表达本发明的抗体混合物。

为选择抗Her-2的噬菌体，几种融合蛋白被产生，包含被融合到 人IgG1的CH2和CH3结构域的Her-2胞外结构域的不同部分。为此 目的，已经构建了pCDNA3.1zeo表达载体(In Vitrogen)，其多克隆区 含有一XhoI限制位点，位于人IgG1的CH2和CH3结构域前读框内 的铰链区。采用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术，用Her-2 cDNA克隆为模板产生PCR片段。这些片段由独特5′限制位点，起 始密码子和随其后的在读框内被连接到Her-2的全部胞外(EC)结构域 或Her-2的部分EC结构域的真核前导序列，及随后的读框内的XhoI 限制位点组成。这些PCR片段随后在读框内用CH2-CH3 IgG1区域 克隆到pCDNA3.1zeo表达载体。除含有Her-2的全部EC结构域的融 合蛋白外，也产生了几种含有Her-2 EC结构域的非重叠片段的较小 的融合蛋白。这些编码Her-2-Ig融合蛋白的构建体被用于用 Lipofectamine试剂(Gibco)进行的293T细胞的瞬时转染。转染5天后， 收获293T细胞的上清，且Her-2-Ig融合蛋白根据标准程序用蛋白A 亲合层析法纯化。

含有Her-2 EC结构域非重叠片段的Her-2-Ig融合蛋白在饱和浓度下 (0.5-5μg/ml)，于37℃经2小时被包被到MaxisorpTM塑料试管(Nunc) 表面上。试管在2％的溶解于PBS的无脂奶粉(MPBS)中封闭1小时。 同时，500μl(大约1013cfu)半合成噬菌体展示文库(根据前面所用 术语的亚文库)被添加到2倍体积的4％MPBS中，其中该文库只有 一条如De Kruif等(1995a，b)和其中的参考文献中所述的那样所制备 的Vκ1轻链存在。此外，人血清被添加至终浓度15％，且封闭30-60 分钟。Her-2-Ig包被的试管被倒空，加入封闭的噬菌体文库。该试管 被封口并慢慢地被旋转1小时，随后无旋转孵育2小时。这些试管被 倒空并在含0.1％Tween-20的PBS中洗涤10次，随后在PBS中洗涤 5次。加入1ml的0.05M，pH2.2的甘氨酸-HCL，且试管被慢慢地旋 转10分钟。洗脱的噬菌体被添加到500μl pH为7.4的1M Tris-HCl中。对该混合物，加入3.5ml指数生长的XL1-blue细菌培养物。试 管在37℃不摇动地孵育30分钟。随后，细菌被铺板于含氨苄青霉素， 四环素和葡萄糖的2TY琼脂平板上。平板在37℃孵育过夜后，菌落 被从平板上刮落用于准备富集的噬菌体文库，基本上如De Kruif等 (1995a)所述。简单地说，刮落的细菌被用于接种含氨苄青霉素，四环 素和葡萄糖的2TY培养基，并在37℃下生长至OD600为～0.3。辅助 噬菌体被添加并被允许感染细菌，之后培养基被改为含氨苄青霉素， 四环素和卡那霉素的2TY。继续在30℃孵育过夜。第二天，细菌通 过离心从2TY培养基移除，之后噬菌体用聚乙二醇6000/NaCl沉淀。 最后，噬菌体在少量的PBS-1％BSA中溶解，过滤灭菌并用于下一轮 选择。选择/再感染程序进行两次。第2轮的选择后，单个的大肠杆 菌(E.coli)菌落被用于制备单克隆噬菌体抗体。基本上，单菌落生 长至对数期并被辅助噬菌体感染，之后噬菌体抗体生产过夜。含有噬 菌体抗体的上清在ELISA中检测其结合Her-2-全部EC-Ig包被的96 孔板的能力。

被选择的获自上述筛选的噬菌体抗体，通过ELISA确认其特异 性。为此目的，含有Her-2 EC结构域非重叠片段的Her-2-Ig融合蛋 白被包被到Maxisorp ELISA平板上。包被后，平板在2％MPBS中 封闭。被选择的噬菌体抗体在等容积的4％MPBS中孵育。平板被倒 空，在PBS中洗涤一次，之后加入被封闭的噬菌体。孵育进行1小 时，平板在PBS 0.1％Tween-20中洗涤，结合的噬菌体用缀合到过氧 化物酶的抗-M13抗体检测。这一程序进行的同时，将直接抗甲状腺 球蛋白的对照噬菌体抗体(De Kruif等，1995a，b)用做阴性对照。

在另一测定中，分析了选择的噬菌体抗体结合表达Her-2的 BT474人乳癌细胞的能力。为用于流式细胞计量术分析，在BT474细 胞染色前，噬菌体抗体首先于4℃在等容积的4％MPBS中封闭15分 钟。噬菌体抗体与细胞的结合用生物素酰化的抗-M13抗体(SantaCruz Biotechnology)继之以链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(Caltag)来显色。

或者，识别Her-2上多表位的噬菌体抗体用基于噬菌体与Her-2 的结合和与充分特性化的鼠抗Her-2抗体HER50、HER66和HER70 (Spiridon等，2002)结合之间的竞争的方法来选择。为此目的，2×106 个BT474细胞在4℃与半合成噬菌体展示文库的大约1013cfu(0.5ml) 孵育，该文库中仅提供一种如在前描述的那样所制备Vκ1轻链，且 被2倍体积的含有10％FBS的培养基封闭。该混合物在一密闭的试管 中于4℃被慢慢地旋转2小时。随后，非结合噬菌体通过用50ml含 10％PBS的冷培养基洗涤两遍移除。此后，识别Her-2上多表位的噬 菌体通过在含饱和浓度(5-20μg/ml)的HER50、HER66和HER70鼠抗 Her-2抗体的1ml冷培养基中重悬BT474细胞洗脱。细胞置冰上10 分钟，旋沉，含抗Her-2噬菌体抗体的上清如前所述的那样用于再感 染XL1-Blue细胞。

从通过前述筛选产生的Her-2特异性噬菌体抗体的组中，选择3 种噬菌体抗体，它们识别3种不同的Her-2蛋白上的非重叠表位。这 些克隆的VH序列和独特的Vκ1轻链序列被暂时称为VK1HER2-1， VK1HER2-2和VK1HER2-3，被克隆到表达质粒pCRU-K01(ECACC 保藏号03041601)或类似的表达质粒的HAVT20前导序列之后，以获 得编码具有Her-2结合特异性的全长人IgG1-κ的质粒。这些质粒被分 别暂时称为pCRU-VK1HER2-1，pCRU-VK1HER2-2和 pCRU-VK1HER2-3。根据本领域技术人员已知的方法，生产稳定的 PER.C6TM来源的细胞系，表达pCRU-VK1HER2-1或 pCRU-VK1HER2-2或pCRU-VK1HER2-3上的遗传信息编码抗体的 细胞系和表达被全部3种质粒编码抗体的细胞系。因此，在组织培养 皿(直径10cm)或T80瓶中，PER.C6TM细胞被接种到添加了10％FBS 的DMEM中，大约每皿2.5×106个细胞并在其标准培养条件下 (10％CO2浓度，37℃)保持过夜。第二天，用Lipofectamine(Invitrogen Life Technologies)，根据制造商提供的标准程序，于37℃在另外的培 养皿中用或1-2μg pCRU-VK1HER2-1、1-2μg pCRU-VK1HER2-2、 1-2μg pCRU-VK1HER2-3或1μg的pCRU-VK1HER2-1、 pCRU-VK1HER2-2和pCRU-VK1HER2-3的混合物进行转染。作为 转染效率的对照，几个培养皿被LacZ对照载体转染，同时几个培养 皿不被转染以用做阴性对照。

5小时后，细胞用DMEM洗涤两次，不加选择用新鲜的培养基 重饲。第2天，培养基用含500μg/ml G418的新鲜培养基替换。每2 天或每3天，细胞用含相同浓度G418的培养基更新。大约接种后 20-22天，可见大量菌落，从每个转染中至少挑选300个经96孔和/ 或24孔经6孔平板生长到T25瓶中。在这阶段，细胞被冷冻(每一 亚培养菌落至少1小管，但通常为4小管)，重组人IgG抗体产生水 平在上清中用人IgG1特异性ELISA测定。同样，在这一阶段，G418 从培养基移除且不再重新应用。对具有代表性的菌落，大量培养用以 根据标准程序用蛋白A亲合层析法于条件上清中纯化重组人IgG1级 分。来自不同克隆的纯化的人IgG1在SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)中 分析，用ELISA鉴定其与Her-2-Ig融合蛋白的结合，用流式细胞计 量术来分析其与BT474细胞表面的Her-2的结合。

获自pCRU-VK1HER2-1，pCRU-VK1HER2-2和 pCRU-VK1HER2-3共转染的克隆通过基因组DNA的PCR来筛选这 三种构建体中每种存在与否。PCR产物的相同性进一步通过DNA测 序确认。

接下来，我们证明了克隆细胞系是产生三种结合特异性的每一种 的原因。因此，少数被筛选为对产生三种结合特异性的每一种呈阳性 的菌落(既通过DNA水平的PCR也通过抗Her-2的特异结合测定)用 荧光激活细胞分选仪(FACS)(Becton&Dickinson FACS VANTAGE SE)进行单细胞分选。或者，菌落以0.3个细胞/孔接种以保证克隆生 长。克隆细胞群，以下称为亚克隆，用新鲜培养基每周更新一次。亚 克隆从96孔经24孔和6孔平板转移到T25瓶生长。在这一阶段，亚 克隆被冷冻(每亚克隆至少1小管，但通常是4小管)，重组人IgG1 抗体的生产水平在上清中用人IgG1特异性ELISA测定。对具有代表 性的菌落，大量培养用以根据标准程序用蛋白A亲合层析法从条件 上清中纯化重组人IgG1级分。

来自不同亚克隆的纯化的人IgG1随后如同前面所述对获自亲本 克隆的人IgG1分析那样进行分析，即通过SDS-PAGE、等电聚焦(IEF) 和结合Her-2。亚克隆也将通过基因组DNA的PCR来筛选 pCRU-VK1HER2-1、pCRU-VK1HER2-2和pCRU-VK1HER2-3这3 种构建体中的每一种是否存在。PCR产物的相同性进一步通过DNA 测序确认。

其它方法，例如Souther印迹和/或FISH也能用以测定这3种构 建体中的每一种在克隆细胞系中是否存在。

被证明对这3种构建体的每一种是转基因的亚克隆培养一段时 期来测定转基因的存在是否稳定以及抗体混合物的表达是否保持一 致，不仅在表达水平方面，而且在细胞分泌的不同抗体的比例上。因 此，亚克隆培养物被保持至少25个群体倍增时间，或作为贴壁培养 物或作为悬浮培养物。在每4-6个群体倍增，用人IgG特异性ELISA 进行特定的产物检测，且大量培养以获得细胞沉淀和上清。该细胞沉 淀被用以评估在基因组DNA中这三种构建体的存在，通过PCR、 Southern印迹和/或FISH。上清被用以如上面所描述的那样来纯化重 组人IgG1级分。在不同群体倍增获得的纯化的人IgG1被如上述分析， 即通过SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和通过ELISA与HER-2的结合和 应用BT474细胞的流式细胞计量术。

抗Her-2抗体的抗体混合物的功能性在基于细胞的测定中来分 析，以确定是否人IgG1混合物抑制BT474细胞的增殖和/或诱导凋亡。 此外，该抗体混合物被分析了其诱导BT474细胞的抗体依赖的细胞 毒性和补体依赖的细胞毒性的潜力。

在以下所描述的每个实验中，识别Her-2的抗体混合物的功能性 能够被分析，且与每一个IgG1抗体及3种单特异性IgG1分子的等摩 尔组合相比较。

为评估抗体混合物抑制BT474细胞增殖的能力，这些细胞在96 孔板中(1.5×105个/孔)贴壁过夜，并随后在抗Her-2抗体混合物的 几个浓度(5-20μg/ml)下孵育72小时。细胞的增殖通过在最后6小时 的培养期间的3H-胸苷掺入测量。生长的抑制通过相对于未经处理的 细胞(作为100％参考值)3H-胸苷掺入百分比作图测定。

为分析BT474细胞的凋亡诱导，这些细胞在48孔板中(2.5×105 个/孔，1ml)贴壁过夜，并随后在抗Her-2抗体混合物的几个浓度下 (5-20μg/ml)孵育4小时。此后细胞通过胰蛋白酶消化收获，用PBS 洗涤两遍并用100μl在膜联蛋白V结合缓冲液(Caltag)中以1∶25稀 释的FITC标记的膜联蛋白V(Caltag)于室温下孵育10分钟。在用流 式细胞计量术(FACSCalibur，Becton Dickinson，San Jose，CA)分析样品 之前，添加终浓度5μg/ml的碘化丙锭(PI)(Sigma)来从凋亡细胞(膜 联蛋白V+/PI-，早期凋亡细胞；膜联蛋白V+/PI+，晚期凋亡细胞)中 区分坏死细胞(膜联蛋白V-/PI+)。

抗体混合物的抗体依赖的细胞毒性是在如前面所述的标准的 51Cr释放测定(Huls等，1999)中，将外周血单核细胞作为效应细 胞，BT474细胞作为靶细胞进行分析的。补体依赖的细胞毒性在类似 的测定中被确定。用于替代效应细胞，现将50μl人血清添加到靶细 胞中。随后，测定如前所述进行。

或者，抗体混合物的ADCC和CDC用铕释放测定(Patel和Boyd， 1995)或用LDH释放测定来确定(Shields等，2001)。

抗Her-2的抗体混合物的功能性也用体内动物模型检验，例如 Spiridon等，2002所述。

实施例5在转基因动物乳汁中表达不同功能性人IgGs

根据厂商说明书，抗存在于人B细胞上的蛋白质，即CD22(克 隆B28)、CD72(克隆II-2)和HLA-DR(克隆I-2)的噬菌体的VH 和VL序列(图7)被克隆到表达质粒pBC1(如在pBC1小鼠乳汁表 达系统所提供的，Invitrogen Life Technologies)中以在转基因动物中 获得这些人IgG分子的乳腺和哺乳特异性表达。这些编码抗-CD22、 抗-CD72和抗-HLA-DR的抗体序列的乳腺特异性表达载体根据厂商 说明书导入鼠种系。通过对尾巴分离出的DNA的PCR，筛选获得的 幼畜是否存在着三种构建体中的每一种。被确认为对这3种抗体的每 一种为转基因的雌性或雄性幼畜被断乳和成熟。雌性转基因鼠在6-8 周龄受精，乳汁样品在孕后的几个时间点获得。雄性转基因鼠用非转 基因雌鼠交配，雌性转基因后代(按照上述PCR来确定)如对上述 雌性转基因建立者(transgenic founders)那样交配和挤乳。任何需要 的时候，雌性或雄性转基因建立者被交配以产生下一代，以能够获得 每一起始系(founder line)足够量的转基因乳汁。转基因乳汁用人IgG 特异性ELISA分析是否存在人IgG，其不与鼠IgG或其它小鼠乳汁 成分交叉反应。根据标准程序应用蛋白A亲合层析法，从转基因鼠 的乳汁中纯化人IgG。纯化的人IgG用SDS-PAGE、等电聚焦和结合 靶CD22、CD72和HLA-DR进行分析。抗体混合物的功能性如前所 述那样被分析。

实施例6抗PER.C6TM来源的克隆中预定靶的IgA/IgG混合物 的生产

抗同种型粘附分子EP-CAM(Huls等，1999)的噬菌体UBS-54 的VH-VL序列不仅被克隆到编码含κ轻链的人IgG1的恒定结构域的 载体中(表达载体pUBS3000Neo)，而且被克隆到编码含κ轻链的人 IgA1的恒定结构域的表达载体中(表达载体pUBS54-IgA，图8)。因 此，pUBS3000Neo和pUBS54-IgA来源的抗体结合EPCAM的相同表 位。pUBS3000Neo和pUBS54-IgA来源抗体的唯一区别在编码重链 恒定结构域的序列，由此导致或IgG1或IgA1同种型。这两个载体的 κ轻链序列是相同的。

表达被pUBS3000Neo和pUBS54-IgA上的遗传信息所编码的抗 体的稳定的PER.C6TM来源的细胞系，根据本领域技术人员熟知的程 序来制备。因此，在组织培养皿(直径10cm)或T80瓶中，PER.C6TM 细胞被接种到添加了10％F BS的DMEM中，大约每皿2.5×106个细 胞，并在其标准培养条件下(10％CO2浓度，37℃)保持过夜。第二天， 用Lipofectamine(Invitrogen Life Technologies)根据制造商提供的标准 程序，于37℃在另外的培养皿中用1-2μg pUBS3000Neo和 pUBS54-IgA进行转染。作为转染效率的对照，几个培养皿用LacZ 对照载体转染，同时几个培养皿不被转染以用做阴性对照。

4-5小时后，细胞用DMEM洗涤两次，不加选择用新鲜的培养 基重饲。第2天，培养基用含500μg/ml G418的新鲜培养基替换。每 2天或每3天，细胞用含相同浓度G418的培养基更新。大约接种后 20-22天，可见大量菌落，从每个转染中挑选至少300个经96孔和/ 或24孔经6孔平板生长到T25瓶中。在这阶段，细胞被冷冻(每一 亚培养菌落至少1小管但通常为4小管)，重组人IgG和人IgA抗体 的产生水平在上清中用人IgG1特异性ELISA以及人IgA特异性 ELISA测定。同样，在这一阶段G418从培养基移除且不再重新应用。 选择有代表性的菌落，大量培养以从条件上清中纯化重组人IgG1和 人IgA级分，应用例如蛋白L或LA亲合层析、阳离子交换层析、疏 水相互作用层析和凝胶过滤(或其组合)。来自不同克隆的纯化的人免 疫球蛋白用SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和用有该分子高表达的细胞系 结合靶EPCAM来分析。克隆也将通过基因组DNA的PCR来筛选 pUBS3000Neo和pUBS54-IgA的存在与否。PCR产物的相同性进一 步通过DNA测序确认。

少数被筛选为对生产EPCAM IgG1和EPCAM IgA都呈阳性的克 隆用荧光激活细胞分选仪(FACS)(Becton Dickinson FACS VANTAGE SE)进行单细胞分选。或者，菌落以0.3个细胞/孔接种以保证克隆生 长。克隆细胞群，以下称为亚克隆，用新鲜培养基每周更新一次。亚 克隆被从96孔经24孔和6孔平板转移到T25瓶生长。在这一阶段， 亚克隆被冷冻(每亚克隆至少1小管，但通常是4小管)，重组人IgG1 和IgA抗体的生产水平在上清中用人IgG1特异性ELISA和人IgA特 异性ELISA来测定。对于有代表性的菌落，大量培养以从条件上清 中纯化重组人IgG1和人IgA级分，应用例如蛋白L或LA亲合层析、 阳离子交换层析、疏水相互作用层析和凝胶过滤(或其组合)。来自不 同克隆的纯化的人免疫球蛋白用SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和用有该 分子高表达的细胞系结合靶EPCAM来分析。亚克隆也将通过基因组 DNA的PCR来筛选pUBS3000Neo和pUBS54-IgA是否存在。PCR 产物的相同性进一步通过DNA测序确认。

其它方法，例如Southern印迹和/或FISH也能够被用于测定是否 两种构建体在克隆细胞系中都存在。

实施例7抗克隆PER.C6TM细胞系的多个靶位的人IgG1/IgG3混 合物的生产

噬菌体克隆UBS-54和克隆K53(图3)如实施例1所述的那样获 得。克隆UBS-54的VH和VL通过已描述的方法(Boel et al，2000)被插 入到含HAVT20前导序列和含κ轻链的人IgG1恒定结构域的全部编 码序列的表达载体中。得到的质粒被称为pUBS3000Neo(图4)。将 很明显，含有任何所需的同种型的重链恒定结构域的表达载体能够用 现有技术中都能得到的这些区域的序列，通过分子生物学的常规方法 构建。噬菌体克隆K53的VH和VL序列基本上如同已描述的方法那 样(Boel等，2000)被克隆到表达载体中，该载体含HAVT20前导序列 和含κ轻链的人IgG3重链的恒定结构域的全部编码序列。该表达载 体被称做pK53IgG3。

这些质粒在PER.C6TM细胞中被瞬时表达，或单独或组合。简要 地说，每80cm2瓶通过用140μl Lipofectamine+10μg DNA(任选 pUBS3000Neo、pK53IgG3或10μg两者的混合物)在无血清DMEM 培养基中于37℃孵育4小时被转染。4小时后，这被DMEM+10％FBS 所取代，细胞在37℃下生长过夜。然后细胞被用FBS洗涤，且培养 基被Excell 525培养基(JRH Bioscience)取代。细胞在37℃下生长6 天，然后收集细胞培养上清。进行人IgG特异性ELISA分析，即测 量所有IgG亚型，来确定在转染的和非转染的PER.C6TM细胞中的IgG 浓度。获自各上清的人IgG随后根据标准程序按照(Amersham Biosciences)厂商的建议用蛋白A亲和层析法(Hightrap Protein A HP， 目录号1-040203)纯化。洗脱后，样品在Microcon YM30浓缩器 (Amicon)中浓缩，缓冲液被换为pH6.7的10mM磷酸钠。用有这些分 子高表达的细胞系，例如LS174T细胞，分析了样本与靶EPCAM和 CD46的结合。12μg纯化的IgG，来自其中两种抗体被共转染的细胞 的、瞬时表达的UBS-54 IgG1、K53 IgG3或IgG随后在等电聚焦凝 胶(Serva Pre-cast IEF凝胶，pH范围3-10，目录号42866)上分析。样 本被上样在低pH的一边，且在聚焦后被用胶状蓝染色。确定每一样 品的主要同种型的pI值用以例证是否有UBS-54 IgG1、K53 IgG3或 双特异性异二聚体的表达，这依赖于怎样转染细胞。异二聚体的鉴定 将表明单细胞已翻译了K53的IgG3重链和UBS-54的IgG1重链，并 将他们与共同轻链一起组装为全长IgG分子。没有双特异性异二聚体 存在表明有可能在单细胞中翻译K53的IgG3重链和UBS-54的IgG1 重链两者，但是这些不与共同轻链一起被组装为全长IgG分子，即 IgG1和IgG3重链存在优先结合。这仍然能够通过缺乏UBS-54 IgG1 和K53 IgG3的共表达来解释。因此，表达pUBS3000Neo与pK53IgG3 两者的稳定的克隆细胞系通过本领域技术人员所熟知的程序产生。在 组织培养皿(直径10cm)或T80瓶中，PER.C6TM细胞被接种到添加了 10％FBS的DMEM中，大约每皿2.5×106个细胞，并在其标准培养 条件下(10％CO2浓度，37℃)保持过夜。第二天，用Lipofectamine (Invitrogen Life Technologies)根据制造商提供的标准程序，于37℃在 另外的培养皿中用1-2μg pUBS3000Neo、pK53IgG3或两者转染。作 为转染效率的对照，几个培养皿被LacZ对照载体转染，同时几个培 养皿不被转染以用做阴性对照。

4-5小时后，细胞用DMEM洗涤两次，不加选择用新鲜的培养 基重饲。第2天，培养基用含500μg/ml G418的新鲜培养基替换。每 2天或3天，细胞用含相同浓度G418的培养基更新。大约接种后20-22 天，可见大量菌落，从每个转染中挑选至少300个经96孔和/或24 孔经6孔平板生长到T25瓶中。在这一阶段，细胞被冷冻(每一亚培 养菌落至少1小管但通常为4小管)，且重组人IgG抗体的产生水平 在上清中用所有亚型人IgG特异性ELISA测定。同样，在这一阶段 G418从培养基移除并不再重新使用。选择有代表性的菌落，大量培 养以根据标准程序遵循厂商(Amersham Biosciences)的建议用蛋白 A亲合层析法(Hightrap蛋白A HP，目录号1-040203)从条件上清中 纯化重组人IgG。来自不同克隆的纯化的人免疫球蛋白用SDS-PAGE、 等电聚焦(IEF)和具有这些分子高表达的细胞系，如LS174T细胞结合 靶EPCAM与CD46来分析。克隆也通过基因组DNA的PCR来筛选 pUBS3000Neo和pK53IgG3存在与否。PCR产物的相同性进一步通 过DNA测序确认。少数被筛选为对产生EPCAM IgG1和K53 IgG3 都是阳性的克隆，用荧光激活细胞分选仪(FACS)(Becton Dickinson FACS VANTAGE SE)进行单细胞分选。或者，菌落以0.3个细胞/孔接 种以保证克隆生长。克隆细胞群，以下称为亚克隆，用新鲜培养基每 周更新一次。亚克隆被从96孔经24孔和6孔平板转移到T25瓶生长。 在这一阶段，亚克隆被冷冻(每一亚克隆至少1小管但通常为4小管)， 且重组人IgG抗体产生水平在上清中用人IgG特异性ELISA测定。 对于有代表性的亚克隆，大量培养以根据标准程序遵循厂商 (Amersham Biosciences)的建议用蛋白A亲合层析法(Hightrap蛋 白A HP，目录号1-040203)从条件上清中纯化重组人IgG级分。来 自不同克隆的纯化的人免疫球蛋白通过SDS-PAGE、等电聚焦(IEF) 和用具有这些分子高表达的细胞系，例如LS174T细胞结合靶EPCAM 与CD46或表达这些分子的转染子来分析。亚克隆也通过基因组DNA 的PCR来筛选pUBS3000Neo和pK53IgG3存在与否。PCR产物的相 同性进一步通过DNA测序确认。

其它方法，例如Souther印迹和/或FISH也可以用于测定是否两 种构建体都存在于克隆细胞系中。

一旦克隆的亚克隆可得到且被确认为对表达UBS-54 IgG1和 K53 IgG3两者为阳性，功能性K53和UBS-54的存在表明有可能可 以在单细胞中用不同的同种型和共有轻链产生功能性IgG′s的混合 物。分析结合EpCAM与CD46两者的双特异性抗体的表达将揭示具 有不同亚型的不同重链将在多大程度上配对，这将影响产生的双特异 性抗体的量。预期在这种情况下，将发现没有或很低水平的双特异性 抗体。

实施例8  用RVGP-Ig融合蛋白选择携带单一链Fv片段、特异 识别狂犬病病毒糖蛋白(RVGP)的噬菌体和针对狂犬病病毒的抗体混 合物的表达。

这一实施例描述了针对作为另一潜在靶的狂犬病病毒的抗体混 合物的生产。作为抗原，狂犬病病毒糖蛋白(RVGP)被选用，但其它 狂犬病抗原也可以为这一目的被选择或包括。识别RVGP的几种单克 隆抗体在本领域已经被描述，多克隆抗体也已被公认为在治疗狂犬病 感染中有用(例如EP0402029；EP0445625)。

基本上如美国专利6,265,150和WO 98/15833中所描述的，用抗 体噬菌体展示文库和MAbstractTM技术选择抗体片段。除另外声明， 所有程序均在室温下进行。用于克隆目的的RVGP序列对本领域技术 人员来说是已获得的(例如Yelverton et al，1983)。用PER.C6TM中 表达的载体pcDNA3.1 Zeo-CH2-CH3生产由用遗传融合至人IgG1的 CH2和CH3结构域的完整RVGP组成的RVGP-Ig融合蛋白，并以浓 度1.25μg/ml、37℃在MaxisorpTM塑料管(Nunc)表面包被2小时。管 子用溶解于PBS中的2％无脂奶粉(MPBS)封闭1小时。同时，500μl (大约1013cfu)基本上按De Kruif et al(1995a，b)和文中的参考文献 所述加以制备的表达单链Fv片段的噬菌体展示文库被加入到两体积 的4％MPBS中。在这一实验中，仅用一种单一可变轻链基因种类所 构建的最初文库(例如VK1-文库)的部分进行选择。此外，加入人 血清至终浓度15％，封闭30-60分钟。将RVGP-Ig-包被的管子倒空， 加入经封闭的噬菌体文库。将管子密封，缓慢旋转1小时，随后不旋 转孵育2小时。将管子倒空，在含0.1％Tween-20的PBS中洗10次， 随后在PBS中洗5次。加入0.05M，pH2.2的甘氨酸-HCL 1ml，管子 缓慢旋转10分钟。将洗脱的噬菌体加入到500μl 1M Tris-HCl pH7.4 中。向这一混合物中加入3.5ml指数生长的XL-1 blue细菌培养物。 管子在37℃、不摇动的条件下孵育30分钟。然后，将细菌铺在含氨 苄青霉素、四环素和葡萄糖的2TY琼脂平板上。板子在37℃孵育过 夜后，将菌落从板上刮下来，用于制备富集的噬菌体文库，基本上按 De Kruif et al.(1995a，b)所述。简要地说，刮下来的细菌用于接种含氨 苄青霉素、四环素和葡萄糖的2TY培养基，在37℃的温度下生长至 OD600nm为～0.3。加入辅助噬菌体感染细菌，随后培养基换成含氨苄 青霉素、四环素和卡那霉素的2TY。在30℃继续孵育过夜。第二天， 通过离心将细菌从2TY培养基中去除，随后噬菌体用聚乙二醇 6000/NaCl沉淀。最后，将噬菌体溶解在小体积的PBS-1％BSA中， 过滤灭菌，用于下一轮选择。选择/再感染程序进行两次。第二轮选 择后，单个的大肠杆菌菌落用于制备单克隆噬菌体抗体。基本上，单 个菌落生长至对数期，用辅助噬菌体感染，随后让噬菌体抗体生产过 夜。用ELISA检测含噬菌体抗体的上清对人RVGP-Ig包被的96孔板 的结合活性。

上面所描述的筛选中所获得的选中的噬菌体抗体用ELISA验证 其特异性。为此目的，用人RVGP-Ig包被Maxisorp ELISA板。包被 后，板子在2％MPBS中封闭。选中的噬菌体抗体在等体积的4％ MPBS中孵育。倒空板子，用PBS洗一次，随后加入封闭的噬菌体。 孵育1小时，用PBS 0.1％Tween-20洗板子，结合的噬菌体用与过氧 化物酶缀合的抗-M13抗体检测。作为对照，程序同时用针对甲状腺 球蛋白的对照噬菌体抗体进行(De Kruifet al.1995a，b)，用作负对照。

继而检测与人RVGP-Ig结合的噬菌体抗体对人血清IgG的结合， 以排除它们识别融合蛋白Fc部分的可能性。

在另一测定中，分析噬菌体抗体与表达RVGP的PER.C6TM细胞 结合的能力。为此目的，PER.C6TM细胞用携带编码RVGP的cDNA 序列的质粒或用空载体转染，用本领域技术人员已知的标准技术选择 稳定转染子(例如Coligan，J.E.et al.(2001)，Current protocols in protein science，volume I，John Wiley&Sons，Inc.New York)。为进 行流式细胞计量术分析，噬菌体抗体在对RVGP和对照转染的 PER.C6TM细胞染色之前先用等体积的4％MPBS在4℃封闭15分钟。 将已经封闭的噬菌体加入到非标记的对照转染的PER.C6TM细胞和用 亲脂染料(lipophylic dye)(PKH67，Sigma)标记为绿色的用RGVP转 染的PER.C6TM细胞的混合物中。噬菌体抗体与细胞的结合用生物素 酰化的抗-M13抗体(Santa Cruz Biotechnology)、随后用链霉抗生物素 -藻红蛋白(Caltag)显现。抗RVGP scFv选择性地对PER.C6TM RVGP 转染子染色，而它们不与对照转染子结合。

筛选携带特异性识别人RVGP的单链Fv片段的噬菌体的另一种 方法是通过使用RVGP转染的PER.C6TM细胞。表达膜结合的RVGP 的PER.C6TM细胞如前所述生产。用这些细胞做靶，如前所述进行噬 菌体选择实验。使用仅一种单一scFv种类的包含scFv-噬菌体颗粒的 噬菌体文库的小部分(500μl，大约1013cfu)用2ml RPMI/10％FCS/1％ NHS在室温下封闭15分钟。非转染的PER.C6TM细胞(～10*106细胞) 被加入到PER.C6-RVGP细胞中(～1.0*106细胞)。这一混合物被加入到 经封闭的轻链受限的噬菌体文库中，在4℃缓慢搅拌下孵育2.5小时。 随后，将细胞洗两次，重悬于500μl RPMI/10％FCS，用鼠抗-RVGP 抗体(Becton Dickinson)、随后用藻红蛋白(PE)缀合的抗小鼠-IgG抗体 (Calltag)在冰上孵育15分钟。将细胞洗一次，转移至4ml管中。用 FACSvantage荧光激活细胞分选仪(Becton Dickinson)进行细胞分选， RVGP(PE阳性)细胞被分选。将分选的细胞离心，保留上清，通过将 细胞重悬于500μl 50mM甘氨酸pH2.2、随后在室温下孵育5分钟将 结合的噬菌体从细胞上洗脱。混合物用250μl 1M Tris-HCl pH7.4中 和，加入到拯救(rescued)的上清中。这些噬菌体共同用于制备如上 所述的富集的噬菌体文库。选择/再感染程序进行两次。第二轮选择 之后，单克隆噬菌体抗体如前所述加以制备和检测对 RVGP-PER.C6TM细胞和非转染PER.C6TM细胞的结合。对RVGP转染 的细胞呈阳性的噬菌体继而如前所述用ELISA检测与RVGP-IgG融 合蛋白的结合。

所选中的scFv片段以人IgG1形式根据本领域已知的方法(例如 Boel et al，2000)加以克隆。为此目的，所选中的scFv所共有的VL 片段用加入适当限制性位点的寡核苷酸进行PCR扩增。类似程序被 用于VH基因。这样修饰的基因被克隆入表达pCRU-K01(ECACC保 藏号03041601)中，生成编码完整huIgG1重链和具有与原始噬菌体 克隆相同特异性的完整人轻链基因的表达载体。通过这一方法，三种 不同重链被克隆入各自的表达载体，而仅一种载体需要包含共同轻链 序列。这些表达载体暂时被指定为pCRU-RVGP-1、pCU-RVGP-2和 pCRU-RVGP-3。或者，这三种载体可以缺少编码VL区域的DNA， 其可以然后被编码在不编码重链的第四个、单独的表达载体中。也可 能使VL序列存在于包含不同VH序列的所有三种载体、或三种载体中 的两种中。

稳定的PER.C6TM来源的细胞系按照本领域技术人员已知的方法 (见例如WO 00/63403)生成，例如，表达由pCRU-RVGP-1、 pCRU-RVGP-2或pCRU-RVGP-3上的遗传信息所编码的抗体的细胞 系和表达由所有三种质粒所编码的抗体的细胞系。因此，将PER.C6TM 细胞以大约2.5×106细胞/皿接种在加10％FBS的DMEM的组织培养 皿(10cm直径)或T80瓶中，在它们的正常培养条件下(10％CO2浓度 和37℃)保持过夜。第二天，用1-2μg pCRU-RVGP-1、1-2μg pCRU-RVGP-2、1-2μg pCRU-RVGP-3或1μg pCRU-RVGP-1、 pCRU-RVGP-2和pCRU-RVGP-3的混合物，根据厂商提供的标准方 案用Lipofectamine(Invitrogen Life Technologies)于37℃在单独的皿中 进行转染。作为转染效率的对照，几个皿用LacZ对照载体转染，而 几个皿将不转染，用作负对照。

4至5小时后，细胞用DMEM洗两次，在不进行选择下再饲给 新鲜培养基。第二天，培养基用含500μg/ml G418的新鲜培养基替代。 细胞每2或3天用含相同浓度的G418的培养基更新。接种后大约20 -22天，可见大量菌落，从每次转化中挑出至少300个，经由96孔 板和/或24孔板、经6孔板、至T25瓶中生长。在此阶段，将细胞冷 冻(每亚培养的克隆至少1小管，但通常4小管)，重组人IgG抗体 的生产水平在上清中用特异于人IgG1的ELISA(在WO 00/63403中 加以描述)进行测定。此外，在此阶段，G418从培养基中除去并不 再应用。选择有代表性的克隆，较大体积培养以根据标准程序用蛋白 A亲和层析从条件上清中纯化重组人IgG1级分。来自不同克隆的纯 化的人IgG1在SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和使用上面所述的RVGP PER.C6转染子进行与靶RVGP的结合进行分析。

用pCRU-RVGP-1、pCRU-RVGP-2和pCRU-RVGP-3共转染所得 到的菌落用基因组DNA PCR筛选三种构建体中的每一种是否存在。 PCR产物的相同性进一步用DNA测序证实。

对三种结合特异性中的每一种的生产(既通过在DNA水平PCR 也在针对RVGP的特异性结合测定中)筛选呈阳性的有限数量的菌落 用荧光激活细胞分选仪(FACS)(Becton&Dickinson FACS VANTAGE SE)进行单细胞分选。

或者，菌落以0.3细胞/孔进行接种以保证菌落长出。此后指定为 亚克隆的克隆细胞群每周一次用新鲜培养基更新。生长亚克隆，并从 96孔板经24孔和6孔板转移至T25瓶。在此阶段，将亚克隆冷冻(每 亚克隆至少1小管，但通常是4小管)，重组人IgG1抗体的生产水平 在上清中用人IgG1特异的ELISA进行测定。对于有代表性数量的亚 克隆，培养较大体积以根据标准程序用蛋白A亲和层析从条件上清 中纯化重组人IgG1级分。来自不同亚克隆的纯化人IgG1随后如上所 述对获自亲本克隆的人IgG1一样进行分析，即通过SDS-PAGE、等 电聚焦(IEF)和与靶RVGP的结合。亚克隆也用基因组DNA的PCR 筛选三种构建体pCRU-RVGP-1、pCRU-RVGP-2和pCRU-RVGP-3中 的每一种存在与否。PCR产物的相同性进一步用DNA测序证实。

也可以使用其他方法，例如Southern印迹和/或FISH来测定三种 构建体中的每一种是否在克隆的细胞系中存在。

被证实对三种构建体中的每一种是转基因的亚克隆进行长时间 培养，以测定转基因的存在是否稳定，抗体混合物的表达是否保持一 样，不仅在表达水平上一样，而且在细胞分泌的各种抗体同种型的比 率上也一样。因此，无论贴壁培养还是悬浮培养，都将亚克隆培养物 维持至少25个群体倍增时间。在每4-6个群体倍增，用人IgG特异 的ELISA进行特殊的产品测试，培养更大体积以获得细胞沉淀和上 清。细胞沉淀用于通过PCR、Southern印迹和/或FISH评估三种构建 体在基因组DNA中的存在。上清如上所述用于纯化重组人IgG1级分。 在不同群体倍增所获得的纯化人IgG1如所描述的进行分析，即通过 SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)和与靶RVGP结合。

针对狂犬病的抗体混合物的功效在体外细胞培养测定中以及在 被狂犬病感染的体内动物模型中进行检验，其中测量到狂犬病病毒扩 散减少。这样的模型对本领域技术人员是已知的，在例如EP0402029 中进行了描述。

实施例9用共同轻链和三种不同重链可变区在单一细胞中生产 抗体混合物

在此例证了用在重组宿主细胞中表达单一轻链和能与单一轻链 配对以形成功能性抗体的三种不同重链生产本发明的抗体混合物的 方法，并在图6中用示意图说明。

在实施例1中描述了分别抗EP-CAM同种型粘附分子(Huls et al.， 1999)和膜辅因子蛋白CD46(WO 02/18948)的人IgG UBS54和K53。 被鉴别与辅因子蛋白CD46结合的另一克隆为克隆02-237(VH的序 列列于图12中)。这一克隆的DNA序列显示，它包含与UBS54和 K53相同的轻链，但具有独特的重链可变序列(见图3中的对比)。 结果是，02-237的重链的CDR3在4个位置上与K53有所不同(见 图13的对比)。噬菌体02-237的重链和轻链可变序列被克隆入含有 IgG1抗体的重链和轻链恒定结构域的表达质粒pCRU-K01 (pCRU-K01以保藏号03041601保藏在欧洲动物细胞保藏中心 (European Collection ofCell Cultures，ECACC))中。所得到的质粒 被指定为pgG102-237。由于随后所采用的克隆策略，所得到的由 pgG102-237所编码的02-237轻链的N端与分别出现在pUBS3000Neo 和pCD46 3000(Neo)中的UBS54和K53的N端略有不同(图3)。 质粒pgG102-237在人293(T)细胞中短暂生产，或在PER.C6细胞中 稳定生产。似乎纯化的02-237 IgG与K53 IgG相比对纯化的CD46 具有高得多的亲和力(图14)，即亲和力从K53的9.1×10-7M增加至 02-237的2.2×10-8M。而且，02-237在人结肠癌LS174T细胞上与CD46 的结合比K53要好很多(图15)。

表达编码人IgG 02-237的质粒pUBS3000Neo、pCD46_3000(Neo) 和pgG102-237的组合的稳定的PER.C6TM来源的细胞系根据本领域 技术人员已知的方法生成(见例如WO 00/63403)。因此，将PER.C6TM 细胞以大约2.5×106细胞/皿接种在含加10％FBS的DMEM的组织培 养皿(直径10cm)中，在它们的正常培养条件下(10％CO2浓度和37 ℃)保持过夜。第二天，在分开的皿中用Lipofectamine(Invitrogen Life Technologies)在37℃根据厂商提供的标准方案用2μg pUBS3000Neo、 pCD46_3000(Neo)和pgG102-237的等摩尔混合物进行转染。作为选 择的负对照，几皿没有转染。4-5小时后，细胞用DMEM洗两次， 不选择再饲新鲜培养基。第二天，培养基用含500μg/ml G418的新鲜 培养基替换。细胞每2或3天用含相同浓度G418的培养基更新。接 种后大约20-22天，可见大量菌落，挑出大约300个，经96孔板和/ 或24孔板经6孔板至T25瓶中生长。在亚培养过程中，重组人IgG 抗体的生产水平在上清中用特异于人IgG1的ELISA进行测定(在 WO 00/63403中描述)。所有克隆中的大约25％在这一高度特异性的 测定中呈现阳性。在这一阶段测得的生产水平相当于单个IgG在 PER.C6TM细胞中表达时的水平(单个IgG的表达在Jones et al.，2003 中描述)。重要的一点是要强调，这些高表达水平的获得不借助任何 转基因扩增的方法，它们发生在低拷贝数转基因的条件下。

将30个最佳生产克隆冻存在小管中，选择19个最高生产克隆用 于纯化IgG(表1)。将它们在T80瓶中亚培养，每一克隆的人IgG 随后用蛋白A亲和层析进行纯化。因此，将15-25ml条件培养基加样 至5ml蛋白A FF Sepharose柱(Amersham Biosciences)上。柱子在用 0.1M柠檬酸pH3.0洗脱之前用4mM磷酸缓冲盐pH7.4(PBS)洗。 洗脱的级分随后在Sephadex G25 Fine HiPrep脱盐柱(Amersham Biotech)脱盐，溶于PBS。纯化的IgG级分的浓度用吸光度测量法在 280nm用系数1.4对0.1％(w/v)溶液进行测定(表1)。

纯化的IgG样品在非还原和还原的SDS-PAGE和IEF上进行分 析。非还原的SDS-PAGE(图16A)显示，所有IgG样品以大约150kDa 的装配的、完整IgG分子迁移，与对照K53或02-237相当。在还原 的SDS-PAGE(图16B)上，IgG样品以大约50kDa的重链和25kDa的 轻链迁移，与对照K53或02-237的重链和轻链相当。

在IEF上，首先将纯化的IgG级分与K53、UBS54和02-237的 等量的混合物进行对比(图17)。明显地，有些样品与含有纯化的 K53、UBS54和02-237的混合物相比，含有具有独特pI分布型的同 种型。有些主要独特同种型一方面具有在K53和02-237的pI之间的 pI，另一方面具有UBS54的pI。当用Expasy主页上 (http：//www.expasy.ch；Appel et al.，1994)提供的ProtParam工具进行 计算时基于理论pI，这也是可预期的。K53、02-237和UBS54分别 具有的理论pI为8.24、8.36和7.65，而呈现一条UBS54重链和一条 K53重链的异二聚体的同种型具有的理论pI为8.01。只有当单个细 胞既翻译K53的重链、也翻译UBS54的重链，并将这些与共同轻链 一起装配成全长IgG分子时这样的异二聚体的装配才会发生。因此， 这些结果暗示，某些克隆至少表达两种功能性抗体。为了证实有些同 种型的独特特性，将最令人感兴趣的克隆的样品或者单独、或者在混 合物中与K53、UBS54和02-237平行进行电泳(图18)。这进而显 示有些克隆表达至少两种抗体(241，282，361)。而且，这提供了有 些克隆表达所有三种功能性抗体的证据(280和402)。

为了证实克隆表达包含所有三种重链的IgG混合物，用肽谱 (peptide mapping)(Garnick，1992；Gelp，1995)来分析多克隆IgG级 分。我们先前用肽谱来回收99％的K53的蛋白质序列。基于图12中 提供的蛋白序列，计算出理论上K53、UBS54和02-237的胰蛋白酶 肽的质量(表II和III)。针对每一IgG可以鉴定出几个独特的肽，即 例如具有分子量2116.05、2057.99和2307.15Da的分别针对K53、 02-237和UBS54的CDR3肽。其次，制备Poly1-280的胰蛋白酶消 化物，这用LC-MS进行分析(图19)。检测到具有分子量2116、2057 和2308Da、分别代表K53、02-237和UBS54的独特CDR3肽的肽。 这些肽的精确氨基酸序列(如表III中所列)用MS-MS分析证实(表 IV、V和VI)。我们还证实分别具有分子量2580和2554Da的两种独 特N端轻链肽的存在。肽谱数据清楚明白地显示包含共同轻链和三 种不同重链的抗体的混合物被PER.C6TM克隆Poly1-280表达。克隆 055、241和402也用肽谱筛选。克隆241和402被证实对所有三种 重链序列呈阳性，而克隆055仅表现出表达K53和02-237重链，而 不表达UBS54重链。这证实了IEF筛选(图18)，其中在样品055 中没有见到UBS54相关条带。

用BIACORE分析Poly1-280与CD46的结合(图20)。Poly1-280 对CD46的亲和力为2.1×10-8M，显示IgG混合物含有与单独的02-237 IgG相同亲和力的CD46结合分子。

综合起来，这一实验显示，有可能在单一细胞中表达包含三种独 特重链的功能性IgG分子的混合物，并且除了同种型二聚体之外，也 可以形成由两种结合特异性组成的异二聚体。此外，表达三种不同重 链的克隆的频率暗示也有可能使用相同程序获得表达至少4、5或更 多重链的克隆。万一难以获得表达更高数量重链的克隆，表达本发明 的至少3种重链的克隆也可被用来，例如通过使用不同的选择标记， 在单独一轮转染中导入更多重链。

其次，这证明单个细胞能够生产两种以上功能性人IgG的混合 物。因此，将既通过IEF也通过MS对三种IgG中的每一种的生产筛 选呈阳性的克隆241、280和402进行有限稀释，即以0.3个细胞/孔 接种在96孔板上以保证克隆长出。

此后指定为亚克隆的克隆细胞群每周一次用新鲜培养基更新。生 长亚克隆，并从96孔板、经24和6孔板转移至T25、T80和T175 瓶。在T80阶段，将亚克隆冷冻。重组人IgG1抗体的生产水平在上 清中用人IgG1特异的ELISA进行测定。对每一亲本克隆，选择3个 亚克隆，培养在几个T175瓶中，以获得足够的条件培养基用来如上 所述用蛋白A亲和层析进行纯化。

来自亚克隆的纯化的人IgG1随后如上所述用等电聚焦(IEF)对获 自亲本克隆的人IgG1进行分析。结果示于图21。来自克隆poly1-241 的亚克隆每一个具有相同的模式，但与亲本克隆的区别在于它们看起 来缺少某些条带。来自克隆poly1-280的亚克隆全部看起来彼此不同， 并与亲本克隆不同。针对来自亲本克隆poly1-402的亚克隆用IEF得 到的模式对所有三种亚克隆和亲本克隆都是同样的。从这些数据可以 得出结论，克隆402稳定生产抗体混合物。这证明，从单一细胞克隆 中生产本发明的抗体混合物是可行的。克隆在选择压力下从转染程序 一直到第一次分析(示于图18)经历了大约25个群体倍增(细胞分 裂)，从那一点起在缺乏选择压力的条件下在亚克隆程序中进一步经 历大约30个群体倍增，直到收获图21中所分析的物质。因此，来自 单一细胞的一个克隆的抗体混合物的生产经过至少30代仍是稳定 的。

也分析来自亲本241、280和402克隆、以及亚克隆的纯化IgG1 对CD46-和EpCAM抗原的结合反应性。为此，将EpCAM、CD46 和对照抗原CD38的cDNA克隆入表达载体pcDNA(Invitrogen)。根 据厂商提供的方案用Fugene(Roche)将这些载体转染入CHO(dhfr-)细 胞。将细胞培养在含10％FBS和补加HT(Gibco)的Iscove′s培养基中。 培养2天后，用胰蛋白酶消化以收获细胞，并悬浮于PBS-1％BSA (PBSB)中用于FACS分析。

将生产抗体混合物的克隆的纯化IgG1和抗-GBSIII，即一种抗 -CD72抗体(02-004)的对照IgG1样品，以及来自抗-EpCAM克隆 UBS54和抗-CD46克隆K53和02-237的抗体稀释在PBSB中至浓度 20μg IgG1/ml。将每种20μl加入200.000个转染的细胞中，在冰上孵 育1小时。其后，细胞用冰冷的PBSB洗一次。结合的IgG然后用与 山羊抗人IgG-生物素孵育、随后用链霉抗生物素-PE进行检测。最后 一步冲洗步骤后，将细胞悬浮于含1μg/ml碘化丙锭的PBSB中。样 品在FACS(FACSvantage，Becton Dickinson)上进行分析。将活细胞门 化(gated)，从FACS图计算平均荧光强度(MFI)。结果示于图22。 如所预期，UBS54选择性地与EpCAM转染的细胞结合，02-237和 K53选择性地与CD46转染子结合，而不相关的抗体不与这些转染子 结合。

结果证明，针对EpCAM和CD46的结合活性在表达本发明的抗 体混合物的大多数克隆的纯化IgG1制剂中存在，证明功能性抗体的 混合物由已经历超过30个细胞分裂的亚克隆生产，并是由单一细胞 产生的。对CD46和EpCAM的结合模式在亚克隆280-015中与在亲 本克隆poly1-280中相似，这与其他克隆形成对照。应该声明的是， 这一测定的定量方面并不完全清楚。常规筛选，例如通过功能性测定， 可以用来发现具有所需表达分布型的克隆。在这样的筛选中也可以包 括定量方面。这样的筛选使得鉴定以定量上稳定的方式表达具有特定 功能性的抗体混合物的所需克隆成为可能。

          表I  用于IgG纯化的克隆的概观     克隆           Poly1-     筛选       ELISA   (μg/ml)          纯化   Conc.in    feed  (μg/ml)    纯化的     (mg)     209     6.1     98     1.37     233     10.0     53     0.75     234     8.0     51     0.71     241     6.6     91     1.42     250     12.5     117     2.10     280     6.3     36     0.80     282     8.5     67     1.48     289     8.2     33     0.64     304     7.2     161     3.91     320     6.3     43     0.83     322     15.2     168     3.27     340     6.0     109     2.64     361     10.4     71     1.73     379     9.5     78     1.75     402     39.9     135     3.14     022     16.2     83     1.69     040     7.8     67     1.43     048     6.5     43     0.94     055     11     55     1.04

       表II.K53/UBS54和02-237轻链可变结构域的胰蛋白酶肽     肽   第一个    AA1) 最后一个     AA   单同位素   Mw   (Da)   K53/UBS54 单同位素   Mw   (Da)   02-237     L1     1     24   2580.31(2)   2554.28(2)     L2     25     59   4039.02   4039.02     L3     60     66   700.35   700.35     L4     67     79   1302.61   1302.61     L5     80     82   374.23   374.23     L6     83     107   2810.29(2)   2810.29(2)     L7     108     111   487.30   487.30     L8     112     112   174.11   174.11

1)AA，氨基酸

2)一个半胱氨酸残基被烷化

            表III.  K53、02-237和UBS54重链可变结构域的胰蛋白酶肽     K53     02-237     UBS54   A  B  C   D   A   B   C   D   A   B  C   D   H1  1  12   1267.68   H1   1   12   1267.68   H1   1  12   1267.68   H2  13  19   685.41   H2   13   19   685.41   H2   13  19   729.41   H3  20  23   492.24   H3   20   23   492.24   H3   20  23   492.24   H4  24  38   1693.81   H4   24   38   1693.81   H4   24  38   1587.77   H5  39  63   2783.28   H5   39   63   2783.28   H5   39  63   2646.33   H6  64  67   472.28   H6   64   67   472.28   H6   64  67   506.26   H7  68  84   1906.87   H7   68   84   1906.87   H7   68  87   2174.04   H8  85  87   374.23   H8   85   87   374.23   -   -  -   -   H9  88  98   1319.55   H9   88   98   1319.55   H8   88  98   1333.56   H10  99  102   493.21   H10   99   102   475.25   H9   99  119   2307.15   H11  103  122   2116.05.   H11   103   122   2057.99   -   -  -   -

注解：

A：肽

B：第一个氨基酸

C：最后一个氨基酸

D：单同位素(monoisotopic)Mw(Da)

备注：

1)对H1，氨基酸残基1是焦谷氨酸

2)来自K53和02-237的肽H3和H9，以及UBS54的肽H3和 H8含有一个烷基化的半胱氨酸残基

3)能够被用来证实相应IgG的存在的独特的肽用粗斜体显示

 表IV K53的CDR3肽(H11)的MS/MS-数据，通过双重带电的m/z1059.06

 的碰撞诱导的解离而得到。  离子     m/z 离子     m/z  Y″1     147.12  B1     n.d.  Y″2     248.18  B2     157.10  Y″3     335.21(1)  B3     304.18  Y″4     406.25  B4     419.22  Y″5     507.30  B5     582.31  Y″6     594.33  B6     768.38  Y″7     693.40  B7     825.39  Y″8     794.46  B8     953.43  Y″9     893.54  B9     n.d.  Y″10     1006.63  B10     n.d.  Y″11     1107.67  B11     1224.65  Y″12     1164.68  B12     1323.68  Y″13     1292.81  B13     1424.79  Y″14     1349.77  B14     1523.86  Y″15     1535.85  B15     n.d.  Y″16     1698.95  B16     n.d.  Y″17     1813.95  B17     1782.96  Y″18     1960.97  B18     n.d.  Y″19     n.d.(2)  B19     n.d.

1加下划线的m/z-值是MS/MS谱中的主要峰。

2 n.d.是未检测。

表V.02-237的CDR3肽(H11)的MS/MS数据，通过双重带电的m/z 1030.02

的碰撞诱导的解离而得到。 离子     m/z  离子     m/z Y″1     147.12  B1     n.d. Y″2     248.18  B2     189.09 Y″3     335.20  B3     n.d. Y″4     406.24  B4     451.22 Y″5     493.30  B5     n.d. Y″6     580.32  B6     n.d. Y″7     679.40  B7     n.d. Y″8     780.44  B8     n.d. Y″9     879.53  B9     n.d. Y″10     992.60  B10     n.d. Y″11     1093.65  B11     n.d. Y″12     1150.67  B12     n.d. Y″13     1278.80  B13     n.d. Y″14     1335.80  B14     n.d. Y″15     1521.83  B15     n.d. Y″16     1608.90  B16     n.d. Y″17     1724.00  B17     n.d. Y″18     n.d.  B18     n.d. Y″19     n.d.  B19     n.d.

1加下划线的m/z-值是MS/MS谱中的主要峰。

2 n.d.是未检测。

表VI.UBS54的CDR3肽(H9)的MS/MS数据，通过三重带电的m/z 770.09

的碰撞诱导的解离而得到。 离子     m/z  离子     m/z  Y″1     n.d.  B1     n.d.  Y″2     248.17  B2     213.17  Y″3     335.20  B3     360.16  Y″4     406.25  B4     473.27  Y″5     507.30  B5     6l0.32  Y″6     594.33  B6     773.41  Y″7     693.42  B7     959.48  Y″8     794.45  B8     1016.50  Y″9     893.53  B9     1144.57  Y″10     1006.64  B10     1201.59  Y″11     1107.67  B11     1302.68  Y″12     1164.68  B12     1415.72  Y″13     n.d.  B13     1514.78  Y″14     n.d.  B14     n.d.  Y″15     n.d.  B15     n.d.  Y″16     n.d.  B16     n.d.  Y″17     n.d.  B17     n.d.  Y″18     n.d.  B18     n.d.  Y″19     n.d.  B19     n.d.  Y″20     n.d.  B20     n.d.

1加下划线的m/z-值是MS/MS谱中的主要峰。

2 n.d.是未检测。

参考文献

Appel RD，Bairoch A，Hochstrasser DF.1994.A new generation of information retrieval tools for biologists：the example of the ExPASy WWW server.Trends Biochem.Sci.19：258-260.

Bendig MM.1988.The production of foreign proteins in mammalian cells.Genet Eng 7：91-127.

Boel E，Verlaan S，Poppelier MJ，Westerdaal NA，Van Strijp JA， Logtenberg T. 2000.Functional human monoclonal antibodies of all isotypes constructed from phage display library-derived single-chain Fv antibody fragments.J Immunol Methods 239：153-166.

Brink MF，Bishop MD，Pieper FR.2000.Developing efficient strategies for the generation of transgenic cattle which produce biopharmaceuticals in milk.Theriogenology 53：139-148.

Campbell KH，McWhir J，Ritchie WA，Wilmut I.1996.Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 380：64-66.

Casellas R，Shih TA，Kleinewietfelt M，Rakoniac J，Nemazee D， Rajewski K，Nussenzweig MC.2001.Contribution of receptor editing to an antibody receptoire.Science 291：1541-1544.

Cockett MI，Bebbington CR，Yarranton GT.1990.High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese hamster ovary cells using glutamate synthetase gene amplification. Bio/technology 8：662-667.

De Kruif J，Terstappen L，Boel E and Logtenberg T(1995a) Rapid selection of cell subpopulation-specific human monoclonal antibodies from a synthetic phage antibody library.Proc Natl Acad Sci USA 92：3938

De Kruif J，Boel E and Logtenberg T(1995b) Selection and application of human single chain Fv antibody fragments from a semi-synthetic phage antibody display library with designed CDR3 regions.J Mol Biol 248：97

Dinnyes A，De Sousa P.King T.Wilmut I.2002.Somatic cell nuclear transfer：recent progress and challenges.Cloning Stem Cells 4： 81-90.

Flavell DJ，Noss A，Pulford KA，Ling N，Flavell SU.1997. Systemic therapy with 3 BIT，a triple combination cocktail of anti-Cd19， -CD22，and-CD38-saporin immunotoxins，is curative of human B-cell lymphoma in severe combined immunodeficient mice.Cancer Res 57： 4824-4829.

Fishwild DM，O′Donnell SL，Bengoechea T，Hudson DV，Harding F， Bernhard SL，Jones D，Kay RM，Higgins KM，Schramm SR，Lonberg N. 1996.High-avidity human IgG kappa monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice.Nat Biotechnol.14：845-51.

Garnick RL.1992.Peptide mapping for detecting variants in protein products.Develop.Biol.Standard 76：117-130.

Gelpí E.1995.Biomedical and biochemical applications of liquid chromatography-mass spectrometry.J.Chromatography A 703：59-80.

Ghetie M-A，Podar EM，Ilgen A，Gordon BE，Uhr JW，Vitetta，ES. 1997.Homodimerization of tumor-recative monoclonal antibodies markedly increases their ability to induce growth arrest or apoptosis of tumor cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：7509-7514.

Giddings G，Allison G，Brooks D，Carter A.2000.Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals.Nat.Biotechnol.18： 1151-1155.

Gorman C，Bullock C.2000.Site-specific gene targeting for gene expression in eukaryotes.Curr Opin Biotechnol 11：455-460.

Hiatt A，Cafferkey R，Bowdish K(1989)Production of antibodies in transgenic plants.Nature.342：76-78.

Huls，G.A.，Heijnen，I.A.，Cuomo，M.E.，Koningsberger，J.C.， Wiegman，L.，Boel，E.，van der Vuurst de Vries，A.R.，Loyson，S.A.， Helfrich，W.，van Berge Henegouwen，G.P.，van MeiDer，M.，de Kruif，J. &Logtenberg，T.1999.A recombinant，fully human monoclonal antibody with antitumor activity constructed from phage-displayed antibody fragments.Nat Biotechnol 17：276-281.

Jespers LS，Roberts A，Mahler SM，Winter G，Hoogenboom HR. 1994.Guiding the selection of human antibodies from phage display repertoires to a sìngle epitope of an antigen.Biotechnology(N Y)12： 899-903.

Jones，D.，Kroos，N.，Anema，R.，Van Montfort，B.，Vooys，A.，Van Der Kraats，S.，Van Der Helm，E.，Smits，S.，Schouten，J.，Brouwer，K.， Lagerwerf，F.，Van Berkel，P.，Opstelten，DJ.，Logtenberg，T.，Bout，A. (2003).High-level expression of recombinant IgG in the human cell line PER.C6TM.Biotechnol Prog.19，163-168.

Kim SJ，Kim Ns，Ryu CJ，Hong HJ，Lee GM.1998. Characterization of chimerìc antibody producing CHO cells in the course of dihydrofolate reductase-mediated gene amplification and their stability in the absence of selective pressure.Biotechnol Bioeng 58：73-84.

Kohler G and Millstein C.1975.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature 256：495-497.

Koopman G，Reutelingsperger CP，Kuijten GA，Keehnen RM，Pals ST，van Oers MH.1994.Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.Blood 84： 1415-1420.

Larrick JW，Thomas DW.2001.Producing proteins in transgenic plants and animals.Curr.Opin.Biotechnol.12：411-418.

Massengale WT，McBurney E，Gurtler J.2002.CD20-negative relapse of cutaneous B-cell lymphoma after anti-CD20 monoclonal antibody therapy.J.Am.Acad.Dermatol.46：441-443.

Mendez MJ，Green LL，Corvalan JR，Jia XC，Maynard-Currie CE， Yang XD，Gallo ML，Louie DM，Lee DV，Erickson KL，Luna J，Roy CM， Abderrahim H，Kirschenbaum F，Noguchi M，Smith DH，Fukushima A， Hales JF，Klapholz S，Finer MH，Davis CG，Z sebo KM，Jakobovits A. 1997.Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in míce.Nat Genet.15：146-56.

Merchant AM，Zhu Z，Yuan JQ，Goddard A，Adams CW，Presta LG， Carter P.1998.An efficient route to human bispecific IgG.Nat.Biotech. 16：677-681.

Nemazee D.2000.Receptor editing in B cells.Adv.Immunol.74： 89-126.

Nissim A，Hoogenboom HR，Tomlinson IM，Flynn G，Midgley C， Lane D，Winter G.1994.Antibody fragments from a″single pot″phage display library as immunological reagents.EMBO J.13：692-698.

Nowakowski A，Wang C，Powers DB，Amersdorfer P，Smith TJ， Montgomery VA，Sheridan R，Blake R，Smith LA，Marks JD.2002. Potent neutralization of botulinum neurotoxin by recombinant oligoclonal antibody.Proc.Natl.Acac.Sci.USA 99：11346-11350.

Patel AK，Boyd PN.1995.An improved assay for antibody dependent cellular cytotoxicity based on time resolved fluorometry. Journal of Immunological Methods 184：29-38.

Peeters K，De Wilde C，De Jaeger G，Angenon G，Depicker A.2001. Production of antibodies and antibody fragments in plants.Vaccine 19： 2756-2761.

Pollock D P，K utzko JP，Birck-Wilson E，Williams J L，E chelard Y， Meade HM.1999.Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies.J Immunol Methods.231：147-157.

Radic MC，Mascelli MA，Shan H，Weigert M.1991.Ig H and L chain contributions to autoimmune specificities.J.Immunol.146： 176-182.

Schnieke AE，Kind AJ，Ritchie WA，Mycock K，Scott AR，Ritchie M， Wilmut I，Colman A，Campbell KH.1997.Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science.278：2130-2133.

Segal DM，Weiner GJ，Weiner LM.2001.Introduction：bispecific antibodies.J Immunol Methods.248：1-6.

Shields，RL，Namenuk AK，Hong K，Gloria Meng Y，Rae J，Biggs J， Xie D，Lai J，Stadlen A/Li B，Fox JA and Presta LG.2001.High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for FcgRI，FcgRII， FcgRIII and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the FcgR.J Biol Chem 276：6591-6604.

Spiridon CI，Ghetie MA，Uhr J，Marches R，Li JL，Shen GL，Vitetta ES.2002.Tartgeting multiple her-2 epitopes with monoclonal antibodies results in improved antigrowth activity of a human breast cancer cell line in vitro and in vivo.Clin.Cancer Res.8：1720-1730.

Van der Vuurst de Vries A，Logtenberg T.1999.Dissecting the human peripheral B-cell compartment with phage display-derived antibodies.Immunology 98：55-62.

Vaughan TJ，Williams AJ，Pritchard K，Osbourn JK，Pope AR， Earnshaw JC，McCafferty J，Hodits RA，Wilton J，Johnson KS.1996. Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library.Nat.Biotech.14：309-314.

Wilmut I.Clark AJ.1991.Basic techniques for transgenesis.J Reprod Fertil Suppl 43：265-275.

Wilmut I，Schnieke AE，McWhir J，Kind AJ，Campbell KH.1997. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.Nature 385：810-813.

Wilson TJ，Kola I.2001.The LoxP/CRE system and genome modification.Methods Mol Biol.158：83-94.

Yelverton E，Norton S，Obijeski JF，Goeddel DV.1983.Rabies virus glycoprotein analogs：biosynthesis in Escherichia coli.Science 219：614-620.

Yoo EM，Coloma MJ，Trinh KR，Nguyen TQ，Vuong LU，Morrison SL，Chintalacharuvu KR.1999.Structural requirements for polymeric immunoglobulin assembly and association with J chain.J Biol Chem. 274：33771-33777.

                           序列表

<110>克鲁塞尔荷兰公司

<120>抗体混合物的重组生产

<130>0079 WO 00 ORD

<160>18

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>333

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>VL sequence of UBS54(anti-EpCAM) and K53(anti-CD46)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(333)

<400>1

gaa att gag ctc act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga        48

Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc ctg cat agt        96

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

            20                  25                  30

aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct       144

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

        35                  40                  45

cca cag ctc ctg atc tat ttg ggt tct aat cgg gcc tcc ggg gtc cct       192

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60

gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa atc       240

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65                  70                  75                  80

agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa gct       288

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

                85                  90                  95

cta caa act ttc act ttc ggc cct ggg acc aag gtg gag atc aaa           333

Leu Gln Thr Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105                 110

<210>2

<211>111

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>VL sequence of UBS54 (anti-EpCAM) and K53(anti-CD46)

<400>2

Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

            20                  25                  30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

        35                  40                  45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65                  70                  75                  80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

                85                  90                  95

Leu Gln Thr Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105                 110

<210>3

<211>333

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>VL sequence of 02-237(anti-CD46)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(333)

<400>3

gac atc gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga        48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc ctg cat agt        96

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

            20                  25                  30

aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct       144

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

        35                  40                  45

cca cag ctc ctg atc tat ttg ggt tct aat cgg gcc tcc ggg gtc cct       192

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60

gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa atc       240

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65                  70                  75                  80

agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa gct       288

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

                85                  90                  95

cta caa act ttc act ttc ggc cct ggg acc aag gtg gag atc aaa           333

Leu Gln Thr Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105                 110

<210>4

<211>111

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>VL sequence of 02-237(anti-CD46)

<400>4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

            20                  25                  30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

        35                  40                  45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65                  70                  75                  80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

                85                  90                  95

Leu Gln Thr Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105                 110

<210>5

<211>345

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>VH sequence of UBS54(anti-EpCAM)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(345)

<400>5

cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc        48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

tcg gtg agg gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agc agc tat        96

Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg       144

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc       192

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

    50                  55                  60

cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac gaa tcc acg agc aca gcc tac       240

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gct gtg tat tac tgt       288

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

gca aga gac ccg ttt ctt cac tat tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc       336

Ala Arg Asp Pro Phe Leu His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

            100                 105                 110

gtc tcg aca                                                           345

Val Ser Thr

        115

<210>6

<211>115

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>VH sequence of UBS54(anti-EpCAM)

<400>6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

    50                  55                  60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Asp Pro Phe Leu His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

            100                 105                 110

Val Ser Thr

        115

<210>7

<211>354

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>VH sequence of K53(anti-CD46)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(354)

<400>7

cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc        48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct ggt tac acc ttt acc agc tat        96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

ggt atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg       144

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

gga tgg atc agc gct tac aat ggt aac aca aac tat gca cag aag ctc       192

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

    50                  55                  60

cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg agc aca gcc tac       240

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

atg gag ctg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt       288

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

gca agg ggc atg atg agg ggt gtg ttt gac tac tgg ggc caa ggt acc       336

Ala Arg Gly Met Met Arg Gly Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

                100             105                 110

ctg gtc acc gtc tcg aca                                               354

Leu Val Thr Val Ser Thr

            115

<210>8

<211>118

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>VH sequence of K53(anti-CD46)

<400>8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

    50                  55                  60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Gly Met Met Arg Gly Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

            100                 105                 110

Leu Val Thr Val Ser Thr

        115

<210>9

<211>354

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>VH sequence of 02-237(anti-CD46)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(354)

<400>9

cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc        48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct ggt tac acc ttt acc agc tat        96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

ggt atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg       144

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

gga tgg atc agc gct tac aat ggt aac aca aac tat gca cag aag ctc       192

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

    50                  55                  60

cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg agc aca gcc tac       240

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

atg gag ctg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt       288

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

gca agg ggc ttt ccg cgt acg tcg ttt gac tcc tgg ggc cag ggc acc       336

Ala Arg Gly Phe Pro Arg Thr Ser Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

            100                 105                 110

ctg gtg acc gtc tcc tca                                               354

Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>10

<211>118

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>VH sequence of 02-237(anti-CD46)

<400>10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

    50                  55                  60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Gly Phe Pro Arg Thr Ser Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr

            100                 105                 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

        115

<210>11

<211>369

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>VH sequence of clone B28(anti-CD22 phage)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(369)

<400>11

atg gcc gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggt gtg gta cgg cct        48

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro

1               5                   10                  15

gga ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt gat        96

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp

            20                  25                  30

gat tat ggc atg agc tgg gtc cgc caa gct cca ggg aag ggg ctg gag       144

Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

tgg gtc tct ggt att aat tgg aat ggt ggt agc aca ggt tat gca gac       192

Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp

    50                  55                  60

tct gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc       240

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65                  70                  75                  80

ctg tat ctg caa atg aac agt ctg aga gcc gag gac acg gcc gtg tat       288

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

                85                  90                  95

tac tgt gca aga ggc ttt ctt cgt ttt gct tcc tcc tgg ttt gac tat       336

Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Leu Arg Phe Ala Ser Ser Trp Phe Asp Tyr

            100                 105                 110

tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcg aga                           369

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg

        115                 120

<210>12

<211>123

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>VH sequence of clone B28(anti-CD22 phage)

<400>12

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro

1               5                   10                  15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp

            20                  25                  30

Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp

    50                  55                  60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Leu Arg Phe Ala Ser Ser Trp Phe Asp Tyr

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg

        115                 120

<210>13

<211>369

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>VH sequence of clone II-2(anti-CD72 phage)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(369)

<400>13

atg gcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct        48

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

1               5                   10                  15

ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc acc        96

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

            20                  25                  30

agc tac tat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag       144

Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

        35                  40                  45

tgg atg gga ata atc aac cct agt ggt ggt ggc aca agc tac gca cag       192

Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Gln

    50                  55                  60

aag ttc cag ggc aga gtc acc atg acc agg gac acg tcc acg agc aca       240

Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr

65                  70                  75                  80

gtc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat       288

Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

                85                  90                  95

tac tgt gca aga gac tac tat gtt acg tat gat tcc tgg ttt gac tcc       336

Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Val Thr Tyr Asp Ser Trp Phe Asp Ser

            100                 105                 110

tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcg aga                           369

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg

        115                 120

<210>14

<211>123

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>VH sequence of clone II-2(anti-CD72 phage)

<400>14

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

1               5                   10                  15

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

            20                  25                  30

Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Gln

    50                  55                  60

Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr

65                  70                  75                  80

Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Val Thr Tyr Asp Ser Trp Phe Asp Ser

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg

        115                 120

<210>15

<211>360

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>VH sequence of clone I-2(anti-class II phage)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(360)

<400>15

atg gcc gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct        48

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1               5                   10                  15

ggc agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt gat        96

Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp

            20                  25                  30

gat tat gcc atg cac tgg gtc cgg caa gct cca ggg aag ggc ctg gag       144

Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

tgg gtc tca ggt att agt tgg aat agt ggt agc ata ggc tat gcg gac       192

Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp

    50                  55                  60

tct gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc       240

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65                  70                  75                  80

ctg tat ctg caa atg aac agt ctg aga gct gag gac acg gcc gtg tat       288

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

                85                  90                  95

tac tgt gca agg gac ctt tat ctt gcg cat ttt gac tac tgg ggc caa       336

Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

            100                 105                 110

ggt acc ctg gtc acc gtc tcg aga                                       360

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg

        115                 120

<210>16

<211>120

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>VH sequence of clone I-2(anti-class II phage)

<400>16

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1               5                   10                  15

Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp

            20                  25                  30

Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp

    50                  55                  60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg

        115                 120

<210>17

<211>336

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>common VL sequence of clones B28(anti-CD22 phage)，II-2

     (anti-CD72 phage)and I-2(anti-class II phage)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(336)

<400>17

tcg tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag        48

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1               5                   10                  15

aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca        96

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

            20                  25                  30

agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat       144

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

        35                  40                  45

ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc       192

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa       240

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65                  70                  75                  80

gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac agc agt ggt aac cat       288

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His

                85                  90                  95

gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt gcg gcc gca       336

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala

            100                 105                 110

<210>18

<211>112

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>common VL sequence of clones B28(anti-CD22 phage)，II-2

     (anti-CD72 phage) and I-2(anti-class II phage)

<400>18

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1               5                   10                  15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

            20                  25                  30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

        35                  40                  45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65                      70              75                  80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His

                    85              90                  95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala

                100             105                 110

                      PCT/RO/134表

                 关于微生物保藏的说明

                  (PCT细则13之二)

PCT/RO/134表(1992年7月)

                   关于微生物保藏的说明

                      (PCT细则13之二)

PCT/RO/134表(1992年7月)