一种包含弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶表达元件的真核表达载体及其构建方法专利检索-PER基因遗传学专利检索查询-专利查询网

一种包含弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶表达元件的真核表达载体及其构建方法

阅读：80发布：2020-05-15

专利汇可以提供一种包含弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶表达元件的真核表达载体及其构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明目的是提供一种能够方便、高效筛选高表达克隆的真核表达载体。本发明的载体以pBudCE4.1载体为基础改构获得，其中基础载体上肽链延长因子基因启动子(PER-1α)及其下游的多克隆位点被弱化的SV40启动子及其下游的二氢叶酸还原酶基因构成的表达元件替换；基础载体上巨细胞病毒早期启动子(PCMV)下游的多克隆位点被新的多克隆位点替换。，下面是一种包含弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶表达元件的真核表达载体及其构建方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种真核表达载体，该载体是以pBudCE4.1载体为基础载体改构获得，其特征在于：
(1)基础载体上肽链延长因子基因启动子(PEF-1α)及其下游的多克隆位点被弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶基因表达元件替换；(2)基础载体上巨细胞病毒早期启动子(PCMV)下游的多克隆位点被新的多克隆位点替换。
2.根据权利要求1所属的载体，其特征在于，所述的基础载体上肽链延长因子基因启动子(PEF-1α)及其下游的多克隆位点指基础载体上Nhe I和BstB I之间1246bp的片段。
3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述的弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶基因表达元件指SEQ.No.1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，基础载体上巨细胞病毒早期启动子(PCMV)下游的多克隆位点Hind III、Pst I、Sal I、Acc I、Sca I、Xba I、BamH I被新的多克隆位点Hind III(*)、Pst I、EcoR V、Not I、Xho I、Sal I、BamH I替换；其中，Hind III(*)位点为无效位点。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，基础载体上巨细胞病毒早期启动子(PCMV)下游的多克隆位点序列5’-CTGCAG…GGATCC-3’被新的多克隆位点序列5’-CTGCAGATATCGCGGCCGCTCGAGGTCGACGGATCC-3’所替换。
6.一种真核表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)合成如核苷酸序列SEQ.No.1所示的弱化的SV40启动子及其下游的二氢叶酸还原酶基因构成的表达元件；
(2)合成如核苷酸序列SEQ.No.3所示的多克隆位点/工作DNA序列片段；
(3)基础载体pBudCE4.1、弱化的SV40启动子及其下游的二氢叶酸还原酶基因构成的表达元件用Nhe I和BstB I双酶切，回收，连接，得到中间载体1；
(4)中间载体1与多克隆位点/工作DNA序列片段用Pst I和Xba I双酶切，回收，连接，得到中间载体2；
(5)中间载体2用BamH I单酶切，回收，连接，得到本发明的真核表达载体pCMV-WD。
7.根据权利要求5的方法，其特征在于，所述的多克隆位点/工作DNA序列片段通过PCR方法制备，PCR扩增的模板序列如SEQ.No.2所示，PCR扩增的引物为：
上游引物：5’-CTGCAGATATCGCGGCCGCTCGAGGTCGACGGATCCTCCCTGTCTGCCTCT CTGGGAG-3’；
下游序列：5’-TCTAGAACGTTTGATTTCCAG-3’。

说明书全文

一种包含弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶表达元件的

真核表达载体及其构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基因工程载体，具体涉及一种真核表达载体，尤其涉及可高效筛选高表达克隆的真核表达载体。

背景技术

[0002] CHO细胞表达系统是目前广泛应用的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，其优点是具有良好的蛋白质翻译后修饰功能，表达的目标蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子，缺点是获得高表达细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等。因此，快速筛选、获得高水平表达外源基因的CHO细胞株是基因工程和生物制药领域内的研究热点。

[0003] 在哺乳动物细胞中外源基因的高效表达依赖于许多因素，包括转录、翻译控制元件、RNA代谢、基因拷贝数、mRNA稳定性、基因在宿主细胞染色体上的定位等。通常认为，外-源基因的整合位点和/或拷贝数可极大地影响目的基因的表达强度。目前，在CHO(DHFR)细胞中采用包含DHFR共扩增基因的表达载体，是获得高表达细胞株的常用策略之一。

[0004] DHFR(二氢叶酸还原酶)基因是常用的筛选标记基因，具有扩增目的基因的功能，又称共扩增基因。DHFR基因编码的二氢叶酸还原酶是细胞代谢途径中的一个重要的酶，氨甲喋呤(MTX)是二氢叶酸还原酶的竞争抑制性底物，当环境存在高浓度的MTX 时，为了维持细胞的正常代谢，二氢叶酸还原酶基因的拷贝数不断增加，同时，其侧翼的目的基因拷贝得以扩增，从而实现外源基因的高表达。

[0005] DHFR标记基因/CHO(DHFR-)细胞/MTX加压筛选系统的筛选作用，可以通过弱化DHFR标记基因的基础表达进一步加强。已有多份文献报道通过加速DHFR mRNA的降解，或者利用DHFR的氨基酸序列突变来降低酶活性以及弱化DHFR基因的启动子，部能有效提高外源基因的表达。例如，白银等将采用弱化的SV40启动子与DHFR基因结合，用于提高抗人膀胱癌人鼠嵌合抗体的表达，获得了肯定得结果，参见《细胞与分子免疫学杂志》，2003，19(1)：62-64。

[0006] 尽管如此，大多数的研究者只是利用包含DHFR基因的表达元件针对不同的载体、不同的目的基因进行个性化改造，研究结果缺乏普适性。本领域迫切需要一种在-CHO(DHFR)细胞中高水平表达目的基因的通用载体，适用于快速构建共表达DHFR基因的多种外源基因，便于后期快速筛选高表达克隆，以克服以往筛选克隆时费时费力的缺点。

发明内容

[0007] 本发明需要解决的技术问题之一是提供一种适合CHO(DHFR-)细胞高水平表达目的基因的通用载体；本发明需要解决的另一技术问题是提供上述载体的构建方法。

[0008] 本发明的第一方面，提供了一种真核表达载体pCMV-WD。该载体是以pBudCE4.1载体为基础改构获得，基础载体上肽链延长因子基因启动子(PEF-1α)及其下游的多克隆位点被弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶基因表达元件替换，基础载体上巨细胞病毒早期启动子(PCMV)下游的多克隆位点被新的多克隆位点替换。

[0009] 所述的弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶基因表达元件见SEQ.No.1，该表达原件长度为973bp。其中“弱化的SV40启动子”为5’端11-356位核苷酸序列，“二氢叶酸还原酶基因”为位于3’端400-963位核苷酸序列，两者之间为43个核苷酸的连接序列。5’端5-10位核苷酸为Nhe I识别序列(GCTAGC)，最末端为4个保护性核苷酸GCGC；3’端
964-969位核苷酸为BstB I识别序列(TTCGAA)，最末端为4个保护性核苷酸GCGC。

[0010] 所述的弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶基因表达元件被插入到pBudCE4.1载体的Nhe I和BstB I内切酶位点之间，基础载体Nhe I和BstB I之间的肽链延长因子基因启动子(PEF-1α)及其下游的多克隆位点，总长度为1246bp的片段被SEQ.No.1的弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶基因表达元件替换。

[0011] 所述的新的多克隆位点长度为36bp，序列为：5’-CTGCAGATATCGCGGCC GCTCGAGGTCGACGGATCC-3’；从5’到3’端对应的内切酶位点为：Pst I-EcoR V-Not I-Xho I-Sal I-BamH I。基础载体位于巨细胞病毒早期启动子(PCMV)下游的多克隆位点Pst I-Sal I-Acc I-Sca I-Xba I-BamH I被新的多克隆位点替换。

[0012] 进一步，所述的基础载体上巨细胞病毒早期启动子(PCMV)下游的多克隆位点序列5’-CTGCAG…GGATCC-3’被新的多克隆位点序列5’-CTGCAGATATCGCGGCCGCTCGAGGTCGACGGATCC-3’所替换。

[0013] 本发明的第二方面，提供了一种真核表达载体pCMV-WD的构建方法，包括如下步骤：

[0014] (1)合成如核苷酸序列SEQ.No.1所示的弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶基因表达元件；

[0015] (2)合成如核苷酸序列SEQ.No.3所示的多克隆位点/工作DNA序列片段；

[0016] (3)基础载体pBudCE4.1、弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶基因表达元件用Nhe I和BstB I双酶切，回收，连接，得到中间载体1；

[0017] (4)中间载体1与多克隆位点/工作DNA序列片段用Pst I和Xba I双酶切，回收，连接，得到中间载体2；

[0018] (5)中间载体2用BamH I单酶切，回收，连接，得到本发明的真核表达载体pCMV-WD。

[0019] 所述的SEQ.No.3所示的多克隆位点/工作DNA序列片段长度为338bp，5’端36个核苷酸为新的多克隆位点，序列为：5’-CTGCAGATATCGCGGCCGC TCGAGGTCGACGGATCC-3’，对应的内切酶位点为：Pst I-EcoR V-Not I-Xho I-Sal I-BamH I；3’最末端是Xba I内切酶识别序列(TCTAGA)，多克隆位点与Xba I内切酶识别序列之间是296个核苷酸组成的“工作DNA序列”。

[0020] 在一个优选的方案中，所述的多克隆位点/工作DNA序列通过PCR方法制备，PCR扩增参数按常规方法操作。PCR扩增的模版为本实验室中保存的一段的330bp的核苷酸片段，序列见SEQ.No.2。

[0021] PCR扩增引物为：

[0022] 上游引物：5 ’TCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAG-3’。其中5’端斜体字标示的36个核苷酸为多克隆位点，3’端下划线部分的22个核苷酸为与“工作DNA序列”的模版的匹配区。

[0023] 下游序列：5’-TCTAGAACGTTTGATTTCCAG-3’。其中5’端6个核苷酸为Xba I内切酶识别位点，3’端下划线部分15个核苷酸为与“工作DNA序列”的模版的匹配区。

[0024] 本发明的真核表达载体pCMV-WD用恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25验证表达，pfs25/pCMV-WD重组质粒转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-DHFR-)，共获得7株阳性细胞株。表达产物能与Pfs25标准单抗4B7特异性反应，与美国MR4实验室提供的Pfs25标准蛋白有相同的抗原反应性。

[0025] 本发明的真核表达载体pCMV-WD用pCMV-WD表达人神经生长因子β亚基(β-hNGF)验证表达，β-hNGF/pCMV-WD重组质粒转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-DHFR-)，共获得5株阳性细胞株。表达产物能与鼠抗人NGF单抗发生特异性反应，说明具有神经生长因子的抗原反应性。表达产物能够诱导鸡背根神经节生长出神经纤维，说明具有神经生长因子的生物活性。

[0026] 本发明的优异效果：

[0027] 本发明的真核表达载体pCMV-WD，包含“PCMV-MCS-myc epitope-6xHis tag-SV40 pA”表达盒，可用于目的基因插入PCMV下游的多克隆位点实现表达；pCMV-WD包含“PSV40(弱-化)-DHFR-V5 epitope-6xHis tag-BGH pA”表达盒，可用于pCMV-WD载体转染CHO(DHFR)-
细胞后用MTX加压筛选，获得高表达细胞株。因此，pCMV-WD载体是一种适用于CHO(DHFR)细胞的通用载体，适用于多种目的基因的表达。

[0028] 本发明的真核表达载体pCMV-WD，由于插入了弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶基因表达元件，其共扩增目的基因，提高目的基因表达水平的效果优异，可以快速构建共表达DHFR基因的多种外源目的基因，从而大为加快了获得高表达细胞株的过程。在本发明一个优选的实例中，采用pCMV-WD表达恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25，Pfs25/-pCMV-WD转染CHO(DHFR)细胞后，经两轮MTX加压筛选，即得到7株高表达细胞株。表达量达到0.1ug/ul水平，表达产物具有正确的免疫原性。在另一个优选的实例中，采用pCMV-WD表达人神经生长因子β亚基β-hNGF，经两轮MTX加压筛选，即得到5株高表达细胞株，最高表达量达到0.1ug/ul水平。

[0029] 本发明的构建真核表达载体pCMV-WD的方法，选择以pBudCE4.1载体作为基础载体，其中肽链延长因子基因启动子表达盒为改造对象，pBudCE4.1载体总长度为4595bp，其中PEF-1α(肽链延长因子基因启动子)大小为1166bp，约占总载体的25％，使得对基础载体的改造有足够的改造“空间”。用SEQ.No.1所示的973bp的弱化的SV40启动子/二氢叶酸还原酶基因表达元件，替换基础载体Nhe I和BstB I之间1246bp的肽链延长因子基因启动子(PEF-1α)及其下游的多克隆位点片段，改造得到的新载体总长度约为4400bp左右，大小适中，适于外源基因的重组操作易于实现，保证了pCMV-WD的普适性。

[0030] 本发明的构建真核表达载体pCMV-WD的方法，采用引入“工作DNA序列”的方法改造基础载体上的多克隆位点，解决了多克隆位点短序列重组操作方面的困难。该方法还适用于其他30-80bp大小的DNA序列的重组操作。

[0031] 本发明的真核表达载体pCMV-WD，克服了以在筛选克隆时的费时费力的缺点，大大节省了时间、人力、物力和财力。将本发明的载体转染CHO细胞，可快速获得稳定高表达外源蛋白的细胞克隆，对提高表达重组蛋白克隆的筛选效率和抗体表达产量具有较好的应用价值。附图说明

[0032] 图1：pBudCE4.1质粒图谱

[0033] 图2：：pCMV-WD质粒图谱

[0034] 图3：：pCMV-WD质粒构流程图

[0035] 3A：DHFR/pUC57质粒用Nhe I和BstB I双酶切，回收小片段；pBudCE4.1质粒用Nhe I和BstB I双酶切，回收大片段；连接，得到中间载体1。

[0036] 3B：“MCS+工作序列”PCR产物用Pst I和Xba I双酶切；中间载体1用Pst I和Xba I双酶切；连接，得到中间载体2(含工作序列)。

[0037] 中间载体2用BamH I酶切；连接，得到pCMV-WD。

[0038] 图4：“MCS/工作DNA序列”PCR结果

[0039] 泳道1：100bp ladder marker

[0040] 泳道2：约330bp MCS/工作DNA序列

[0041] 泳道3：DL2000 DNA marker：2000，1000，750，500，250，100

[0042] 图5：BstB I和Nhe I双酶切

[0043] 泳道1：DHFR/pUC57

[0044] 泳道2：pBudCE4.1

[0045] 泳道 3：1kb DNA marker：1000，2000，3000，4000，5000，6000，7000，8000，9000，10000

[0046] 图6：表达元件阳性克隆酶切鉴定

[0047] 泳道1：1号克隆泳道2：7号克隆

[0048] 泳道3：5号克隆

[0049] 泳道 4：1kb DNA marker：1000，2000，3000，4000，5000，6000，7000，8000，9000，10000

[0050] 图7：pCMV-WD载体酶切鉴定

[0051] 泳道1，2，3，4，5：分别是EcoR V，Not I，Xho I，Sal I，BamH I单切pCMV-WD载体[0052] 泳道6：DL 15000 DNA marker：15000，10000，7500，5000，2500，1000，250[0053] 图8：pfs25基因PCR结果

[0054] 泳道1：pfs25基因

[0055] 泳道2：DL2000 DNA marker：2000，1000，750，500，250，100

[0056] 图9：EcoR V和Xho I酶切鉴定pfs25/pCMV-WD重组质粒

[0057] 泳道1：DL2000 DNA marker：2000，1000，750，500，250，100

[0058] 泳道2：Pfs25基因PCR

[0059] 泳道3：EcoRV和Xho I双酶切pfs25/pCMV-WD重组质粒

[0060] 泳道4：Xho I单酶切pfs25/pCMV-WD重组质粒

[0061] 泳道5：D507A DNA marker：11849，10085，8023，6133，5026，3997，3049，2087[0062] 图10：Western Blot检测pfs25蛋白阳性的CHO细胞株表达上清

[0063] 1：标准pfs25蛋白 2：阳性CHO细胞株表达上清

[0064] 图11：ELISA分析pfs25蛋白表达阳性的CHO细胞株表达上清

[0065] 1：1B32：4H11 3：5A4 4：5D4 5：5G11 6：6E8 7：6F3

[0066] 8：阳性对照 9：阴性对照

[0067] 图12：重组β-hNGF/pCMV-WD表达质粒的酶切分析

[0068] 泳道1是PCR扩增的β-hNGF目的基因片段

[0069] 泳道2是基础质粒pBudCE4.1用BstB I、Nhe I双酶切的对照

[0070] 泳道3是pCMV-WD用BstB I、Nhe I双酶切的对照

[0071] 泳道4是DNA分子量标准

[0072] 泳道5是BamH I单酶切得到线化的重组质粒β-hNGF/pCMV-WD

[0073] 泳道6是重组质粒β-hNGF/pCMV-WD用BamH I、EcoR V双酶切得到的片段(显示β-hNGF目的基因)

[0074] 泳道7是重组质粒β-hNGF/pCMV-WD用BstB I、Nhe I双酶切得到的片段[0075] 图13：ELISA方法检测β-hNGF表达阳性的CHO细胞株表达上清

[0076] 1：阴性对照 2：Ab3 3：Ac2 4：Ba2

[0077] 5：Bc3 6：Bh7 7：阳性对照

[0078] 图14：重组β-hNGF的生物活性分析：鸡背根神经节用5只8天的鸡胚制备，用β-hNGF表达阳性的CHO细胞培养上清处理。

[0079] A：阴性对照B：阳性对照(10ng/ml NGF)

[0080] C：稀释150倍的β-hNGF表达阳性CHO细胞培养上清处理

具体实施方式

[0081] 母本质粒pBudCE4.1

[0082] 本发明选择pBudCE4.1载体作为构建pCMV-WD载体的母本质粒。pBudCE4.1载体为双顺反子的表达载体，包含“PCMV-MCS 1-myc epitope-6xHis tag-SV40pA”和“PEF-1α-MCS2-V5epitope-6xHis tag-BGH pA”两组外源基因表达盒，以及复制起点、抗性基因等必须的元件。按照本发明的目的，保留其中一个顺反子表达盒，用于表达目的基因，另一个顺反子表达盒，可以改造为二氢叶酸还原酶(DHFR)等共扩增基因表达元件，以克服真核表达中高表达克隆筛选的难题。pBudCE4.1载体总长度为4595bp，其中PEF-1α(肽链延长因子基因启动子)大小为1166bp，占总载体的25％，因此，选择PEF-1α表达盒作为改造的对象，使得该载体具有较大的改造空间，增加新的元件后，新构建的载体大小也不会很大。

[0083] 弱化的SV40启动子/DHFR表达元件

[0084] SV40病毒早期启动子是在真核表达中广泛使用的启动子，对该启动子转录活性的调控机理已有较为充分的研究。例如，Zenke M，et al报道了调整SV40启动子转录活性的方法，天然的SV40启动子包含两个72bp的重复序列，通过删除SV40启动子中1个72bp的重复序列、将2个72bp的重复序列全部删除或在删除第一个72bp的重复序列后，同时在第二个72bp的重复序列的第57位引入TGG到GTT的点突变，可使SV40启动子转录活性分别降低为野生型的1/3、1/1000和1/36，参见EMBO J.1986 February；5(2)：387-397。

[0085] 在CHO细胞中表达目的基因时，利用二氢叶酸还原酶(DHFR)基因作为“共扩增基-因”与目的基因共转染CHO/DHFR 细胞，可以提高外源基因的表达量，这早已成为一种行之有效的表达策略，在这种策略中，降低二氢叶酸还原酶的本底表达量，是实现外源基因高表达的关键性因素。弱化DHFR基因表达的方式有多种，其中，弱化DHFR基因的启动子的方法，简单实用、可靠性、应用面较广成为本发明所选。

[0086] 本发明把弱化的SV40启动子、连接序列、DHFR基因整合为一个完整的表达元件，克隆到pCMV-WD载体中，使得该载体成为一种专一应用于CHO细胞基因工程的通用载体。同时，本发明设计合成的弱化的SV40启动子/DHFR基因表达元件，也可以单独作为一个整体，供其他研究人员灵活地应用于各种真核载体的构建中，从而规避了大量烦琐的DNA操作，快速开展预期的工作。

[0087] 多克隆位点克隆和工作序列

[0088] 本发明提供了一种在母本载体中引入多克隆位点(MCS)的方法。MCS通常由30-80bp的DNA序列组成，由于序列过于短小，常规的DNA重组技术遇到了困难。本发明引入了“工作DNA序列”的概念，通过PCR方法将MCS序列和一段300-500bp的“工作DNA序列”加以整合，进行各过程步骤的操作，最后，利用“工作DNA序列”上下游的相同DNA限制性内切酶作用，去除“工作DNA序列”，即可实现MCS在母本载体中的克隆。

[0089] 本发明对母本质粒pBudCE4.1进行改造，插入了新的弱化的SV40启动子/DHFR基因表达元件，因此，pBudCE4.1质粒中原有的多克隆位点(MCS)需要重新设计和替换。本发明设计了一段36个核苷酸的新的多克隆位点，随机选择的一段330bp的核苷酸片段作为“工作DNA序列”，通过PCR方法将多克隆位点与“工作DNA序列”连接，对连接片段和目标质粒进行DNA重组操作，将多克隆位点连同“工作DNA序列”插入到目标质粒中，最后通过适当的内切酶操作，去除“工作DNA序列”，实现了对母本质粒pBudCE4.1中原多克隆位点的改造。

[0090] 目前，对于单一或若干个(10bp以内)的DNA碱基突变，已经有成熟的方法或商业化的试剂盒完成。对于大片段的DNA序列增减，也可以通过常规的分子生物学技术实现。本发明引入“工作DNA序列”的方法，则可以实现片段大小介于其中的短的、功能性的DNA序列(30-80bp)在质粒、粘粒或其他任意DNA片段中任意部位的插入的目的，例如，应用于研究基因表达调控过程中某些调控元件、顺式因子等DNA序列的插入。选择工作序列的条件是：在插入部位邻近下游找到一个DNA限制性内切酶，且该酶不在待插入的短序列中存在识别位点。

[0091] 测试基因Rfs25

[0092] 恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25作为疟疾疫苗的研究已经开展了多年。采用痘病毒(Vaccinia virus)载体系统表达的Pfs25在哺乳动物宿主中诱导产生了良好的传播阻断活性。用酵母表达的Pfs25免疫小鼠和猴子获得的抗体在体外实验中具有明显的传播阻断活性，现已证实：子孢子囊表面膜蛋白Pfs25是传播阻断型疟疾疫苗的侯选靶抗原。美国NIH已经以Pfs25蛋白质作为抗原制备的疫苗完成I临床试验。用于疫苗研制的pfs25基因是171个氨基酸组成的20Kd的蛋白质，其中含有九个二硫键，结构很复杂。截止目前，该蛋白多是采用酵母系统进行重组表达，尚无看到CHO细胞表达pfs25蛋白质的文献。本发明选择该蛋白用CHO细胞进行表达，也试图以此验证我们新构建的载体的可靠性。

[0093] 测试基因β-hNGF

[0094] 神经生长因子(nerve growth factor，NGF)属于神经营养因子家族，在神经细胞的增殖，发育，分化和损伤修复过程中均发挥着重要作用。1954年Levi-Montalcini首先在小鼠神经系统中存在一种大分子复合物，能够增殖鸡交感神经细胞(Levi-Montalcini R，et al.Cancer Res，1954，14(1)：49-57)。1969年Bocchini在小鼠体内纯化到了神经生长因子，并证明其由α，β和γ三个亚基组成(Bocchini V，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1969，64(2)：787-794)。Lee R等人2001年在《科学》发表文章认为NGF能够通过诱导神经细胞产生低亲和力的p75NTR受体造成少突神经胶质细胞核神经元的凋亡(Lee R，et al.Science.2001，294(5548)：1945-1948)，进一步丰富了人们对NGF的认识，在人类的神经生长因子中，β亚基二聚体是hNGF的主要活性成分。

[0095] 神经生长因子具备巨大的药用价值，2002年我国第一个神经生长因子产品“恩经复”开发成功，该产品是采用原核表达系统表达的鼠神经生长因子。本研究采用新构建的真核表达质粒pCMV-WD在CHO细胞中表达人神经生长因子β亚基(β-hNGF)，也试图以此验证我们新构建的载体的可靠性。

[0096] 二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-DHFR-)购自ATCC(编号：CRL-9096)，真核表达质粒pBudCE4.1、Zeocin抗生素均购自Invitrogen公司，DMEM培养基购自Gibco公司；大肠杆菌Top10’由本室保存，pMD18-T SimpleVector、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA marker均购自TaKaRa公司，氨苄青霉素(Amp)购自Sigma公司；Taqplus DNA聚合酶购自上海“生工”公司，质粒小量提取试剂盒购自北京“道普”生物公司，PCR产物纯化试剂盒和胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；标准蛋白质分子量购自GE公司；抗Pfs25单克隆抗体4B7和标准蛋白由美国MR4惠赠，HRP标记兔抗鼠IgG(二抗)购自Sigma公司；
辣根过氧化物酶标记兔抗鼠NGF抗体由兰州生物制品研究所有限责任公司诊断室提供，鼠抗人NGF单克隆抗体购自Sigma公司，NGF标准品购自中国生物制品检定所。

[0097] 实施例1、真核表达载体pCMV-WD的构建

[0098] (1)设计弱化的SV40启动子/DHFR表达元件

[0099] 根据Zenke M，et al在EMBO J.1986 February；5(2)：387-397.中报道的方法对SV40启动子进行了弱化处理：天然SV40启动子中包含有两个重复的72bp的增强子序列，即：GGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAG AAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCA，作者删除了第一个增强子序列，同时把第二个增强子序列中第5-7位的序列TGG突变为GTT，得到346个核苷酸的弱化的SV40启动子序列。

[0100] 根据ATCC购买的pSV2-dhfr载体(编号：67110)确定了564核苷酸的DHFR编码基因序列。

[0101] 发明人根据以往的工作经验，设计了一段位于SV40启动子和DHFR基因之间的43个核苷酸的连接序列，将弱化的SV40启动子、连接序列、DHFR基因依次连接，并且在5’端设计BstB I内切酶位点，3’端设计Nhe I内切酶识别位点，得到弱化的SV40启动子/DHFR表达元件，该表达元件大小为973bp，具体见SEQ.No.1。

[0102] 弱化的SV40启动子/DHFR表达元件委托上海生工生物工程有限公司合成，该元件被克隆到pUC57载体上，命名为DHFR/pUC57。

[0103] (2)设计多克隆位点和工作DNA序列

[0104] 根据pBudCE4.1的序列、弱化的SV40启动子/DHFR表达元件序列特征，设计新的多克隆位点(multiple cloning site，MCS)，包括36个核苷酸，

[0105] 序列为：CTGCAGATATCGCGGCCGCTCGAGGTCGACGGATCC；

[0106] 对应的DNA限制性内切酶位点依次是：Pst I，EcoR V，Not I，Xho I，Sal I，BamH I。

[0107] 根据pBudCE4.1的序列、弱化的SV40启动子/DHFR表达元件、新的多克隆位点序列特征，发明人随机选择一段330bp的核苷酸片段(不包含以上新设计的多克隆位点)作为PCR方法制备“工作DNA序列”的模版，具体见SEQ.No.2，该序列的引物设计区如下所示：

[0108] GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGAC AGAGTCACCTCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACT GGTATCAGCAGAAATCAGATGGAACTGTTAAACTTCTGATCTATTACACATC AAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAA CAGATTATTCTCTCACCATTAGCACCCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTA CTTTTGCCAACAGGGTAATGCGCTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAA GCTGGAAATCAAACGTGCGGCCG

[0109] 其中下划线部分为PCR引物的匹配区。

[0110] PCR引物设计：

[0111] 上游引物：5’ TCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAG 3’。上游引物长58个核苷酸，其中，5’端斜体字标示的36个核苷酸为新设计的多克隆位点，3’端下划线部分的22个核苷酸为与“工作DNA序列”的模版的匹配区。

[0112] 下游序列：5’TCTAGAACGTTTGATTTCCAG 3’，其中，5’端6个核苷酸为Xba I内切酶识别位点，3’端下划线部分15个核苷酸为与“工作DNA序列”的模版的匹配区。

[0113] 以上述330bp核苷酸片段的质粒为模板，采用上下游引物进行PCR扩增，扩增条件：95℃、4min；95℃、45s，55℃、45s，72℃、60s，30个循环；72℃、7min。结果见图4。

[0114] 得到的PCR产物经测序为338个核苷酸，从5’到3’端依次为：新设计的MCS(36bp)、工作DNA序列(296bp)、Xba I位点(6bp)，具体见SEQ.No.3。

[0115] (2)pCMV-WD通用表达载体的构建

[0116] 用核酸限制性内切酶Nhe I和BstB I双酶切DHFR/pUC57质粒，回收约973bp的小片段；同样用Nhe I和BstB I双酶切pBudCE4.1质粒，回收约3350bp的大片段，结果见图5。将回收的973bp的小片段和3350bp的大片段用T4DNA连接酶连接，得到中间载体1。用连接得到的中间载体1转化大肠杆菌Top10’菌株，挑选到3个阳性克隆：1号、5号和7号，3个阳性克隆分别用BstB I和Nhe I限制酶双酶切，均能得到973bp的“弱化的SV40启动子/DHFR表达元件”，结果见图6。选择7号克隆测序，结果与合成的目的序列一致。

[0117] 母本质粒pBudCE4.1到中间载体1的构建流程见图3A。通过酶切、连接操作，母本质粒pBudCE4.1上位于Nhe I和BstB I位点之间的1246bp的“肽链延长因子基因启动子(EF-1αpromoter，PEF-1α)及其下游的多克隆位点”片段被973bp的“弱化的SV40启动子/DHFR表达元件”所替换，得到中间载体1。

[0118] 中间载体1到中间载体2的构建流程见图3B。用核酸限制性内切酶Pst I和Xba I双酶切包含“新多克隆位点和工作DNA序列”的PCR产物；用同一组内切酶双酶切中间载体1；回收酶切产物，用T4 DNA连接酶连接，得到中间载体2。经此步骤，中间载体1中源自母本质粒的位于PCMV(巨细胞病毒早期启动子)下游的多克隆位点被“新多克隆位点和工作DNA序列”替换，即在中间载体1PCMV下游的Pst I位点和Xba I位点之间插入了“新多克隆位点和工作DNA序列”。

[0119] 中间载体2到通用载体pCMV-WD的构建流程见图3B。用核酸限制性内切酶BamH I单酶切中间载体2，回收大片断；再用T4 DNA连接酶连接连接回收得到的大片段，得到新的通用载体，命名为pCMV-WD。经此步骤，中间载体2中位于PCMV下游的多克隆位点中的“工作DNA序列”被去除，在新载体pCMV-WD的PCMV下游的多克隆位点变为Hind III(*)Pst I、EcoRV、Not I、Xho I、Sal I、BamH I，其中，因为Hind III(*)位点也存在于“弱化的SV40启动子/DHFR表达元件”之中，为不可用位点。

[0120] 对新构建的真核载体pCMV-WD用所有组成多克隆位点(MCS)的DNA限制性内切酶进行酶切分析，结果图7所示，所有的单酶切都能有效地使环形载体线形化而不产生杂带。这说明，设计的多克隆位点正确有效。

[0121] 实施例2、采用pCMV-WD质粒表达恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25Pfs25目的基因和引物合成

[0122] 在先前的工作中，作者根据GenBank中公布的Pfs25基因信息(GenBank locus：X07802)，选取完整pfs25蛋白第23位至第193位氨基酸对应的DNA序列作为目的基因。本研究中，利用引物合成软件Primer premier5.0设计引物。

[0123] Pfs25上游引物：

[0124] GCAAgatatcACACCATG AAAG TAACAGTCGATACTGTGTGTAAGAGAGGCTTCCT

[0125] 下划线为EcoR V酶切位点，斜体字序列对应信号肽：GVKVLFALICIAVAEA；

[0126] Pfs25下游引物：

[0127] TGATctcgagTTAAGTACATATTGATGA

[0128] 下划线为Xho I酶切位点。

[0129] 目的基因及引物均委托上海生工生物工程有限公司合成。PCR条件：95℃、4min；95℃、45s，55℃、45s，72℃、60s，30个循环；72℃、7min。

[0130] 图8中可以看到，513bp的pfs25基因得到了有效的PCR扩增，通过DNA序列分析，与预期一致，具体见SEQ.No.4。推测的氨基酸序列见SEQ.No.5，其中18-188位氨基酸为成熟肽。

[0131] 重组pfs25/pCMV-WD表达质粒的构建及鉴定

[0132] Pfs25基因的PCR产物直接克隆到pMD18-T Simple Vector中，经酶切和测序，对阳性克隆pfs25/pMD18-T用EcoRV、Xho I双酶切纯化后，与经同样酶切的质粒pCMV-WD连接，所构建质粒为pfs25/pCMV-WD，转化E.coli Top10’，PCR、酶切鉴定阳性克隆。

[0133] 从图9可以看到，用EcoRV和Xho I双酶切pfs25/pCMV-WD重组质粒后，pfs25基因可以被有效的释放，说明pfs25基因已经被成功地克隆到了pCMV-WD载体中。同时，以pfs25/pCMV-WD为模板进行pfs25基因的PCR检测，也可以得到阳性结果。

[0134] 重组pfs25/pCMV-WD表达质粒转染CHO细胞

[0135] 接种CHO-DHFR-细胞于40cm2培养瓶中，使用DMEM培养液，补加10％新生牛血清，0.1mmol/L次黄嘌呤(H)，0.016mmol/L胸腺嘧啶脱氧核苷(T)，5％CO2、37℃培养。采用电转染法将重组质粒pfs25/pCMV-WD转染CHO-DHFR-细胞，电转染条件：电容-75μF，电压-210V。之后，二次电击，一分钟间隔，电击前后及间隔时间内细胞处于冰浴环境中。电转后，细胞加入DMEM培养液(10％FCS)培养于96孔板中。3天后换液，并添加Zeocin至终浓度500μg/ml。克隆形成后Zeocin降低至250μg/ml，双抗体夹心ELISA检测所有克隆。
挑选阳性细胞继续培养于混合培养液(10％FCS和200nmol/L MTX)。克隆形成后ELISA检测，挑出分泌pfs25蛋白的高表达阳性株。

[0136] 表达产物的Western Blot鉴定

[0137] 表达上清液经SDS-PAGE、电转移于PVDF膜上，用20％牛血清4℃过夜封闭，用洗液清洗5min，加入Pfs25单克隆抗体4B7(1∶1000)室温孵育2小时，用洗液清洗1小时，中间换液三次，加入HRP标记兔抗鼠IgG二抗(1∶8000)，室温孵育2小时，用洗液清洗1小时，中间换液三次，最后加入Western-blot化学发光底物(ECL)A和B显色。

[0138] 转染重组质粒pfs25/pCMV-WD的CHO细胞，经过抗性筛选后，用Western Blot检测进行目的表达产物的定性分析。图10显示，阳性CHO细胞株表达上清中有针对pfs25单抗4B7的阳性反应，且条带与pfs25标准蛋白的位置一致，说明作者筛选的CHO阳性克隆细胞株能够有效分泌重组pfs25蛋白。

[0139] 表达产物的ELISA鉴定

[0140] 用双抗体夹心ELISA检测阳性CHO细胞克隆培养上清中的pfs25蛋白。以Pfs25单克隆抗体4B7作为包被一抗，包被浓度为2μg/ml，4℃包被过夜。次日用20％牛血清白蛋白进行封闭。以辣根过氧化物酶标记的Pfs25单克隆抗体1B4作为酶标二抗，8000倍稀释37℃孵育1h。TMB显色后终止反应，用酶标仪测其450nm/630nm 双波长A值。

[0141] 在本发明中，利用检测pfs25蛋白的双抗体夹心ELISA方法对抗性CHO细胞株进行了定性检测，作者共得到了7株pfs25基因的CHO重组细胞株，命名为1B3、4H11、5A4、5D4、5G11、6E8和6F3株，结果如图11所示。

[0142] 实施例3、采用pCMV-WD质粒表达人神经生长因子β亚基(β-hNGF)

[0143] β-hNGF基因和引物的合成

[0144] 根据GenBank 中发表的β-hNGF 基因序列(Accession No.：NM_002506)设计引物，上、下游引物由上海生工有限公司合成，其序列如下：hNGF引物：P(s)：5’AGGGATATCACACCATGTCCATGTTAT 3’( 划线为 EcoR V 酶切位点 )、P(a)：
5’TGGGATCCGGTCAGGCTCTTCTC 3’(划线为BamH I酶切位点)

[0145] pUC18-β-NGF由中国药品生物制品检定所提供，包含根据相当于GenBank Accession No.：NM_002506第170-895位核苷酸序列，编码241个氨基酸的β-hNGF全长片断(包含N端18个氨基酸的信号肽)。以pUC18-β-NGF作为模板，引物P(s)、P(a)扩增人神经生长因子β亚基(β-hNGF)基因。PCR条件：95℃、4min；95℃、60秒，55℃、60秒，72℃、70秒，30个循环；72℃、7min。

[0146] 人神经生长因子β亚基(β-hNGF)基因PCR产物直接克隆到质粒pMD 18-T中，经测序与预期一致，具体见SEQ.No.6。推测的氨基酸序列见SEQ.No.7，其中N端18个氨基酸为信号肽。

[0147] 重组β-hNGF/pCMV-WD表达质粒的构建及鉴定

[0148] 对序列正确的阳性克隆β-hNGF/pMD 18-T用BamH I、EcoR V双酶切纯化后，与经同样酶切的质粒pCMV-WD连接，所构建质粒为β-hNGF/pCMV-WD，转化E.coli Top10’，PCR、酶切鉴定阳性克隆。

[0149] 如图12所示，泳道1是PCR扩增的β-hNGF目的基因片段；泳道2是基础质粒pBudCE4.1用BstB I、Nhe I双酶切的对照；泳道3是pCMV-WD用BstB I、Nhe I双酶切的对照；泳道4是DNA分子量标准；泳道5是BamH I单酶切得到线化的重组质粒β-hNGF/pCMV-WD；泳道6是重组质粒β-hNGF/pCMV-WD用BamH I、EcoR V双酶切得到的片段(显示β-hNGF目的基因)泳道7是重组质粒β-hNGF/pCMV-WD用BstB I、Nhe I双酶切得到的片段；图谱与预期结果相同。

[0150] 重组β-hNGF/pCMV-WD表达质粒转染CHO细胞

[0151] 方法同实施例2。经Zeocin筛选和MTX加压，共获得了5株表达hNGF的CHO细胞株，命名为Ab3、Ac2、Ba2、Bc3和Bh7株。

[0152] 表达上清的ELISA鉴定

[0153] 双抗体夹心ELISA检测：以1ug/ml鼠抗人NGF单克隆抗体作为一抗4℃包被过夜，用1％(v/v)BSA在37℃封闭2h后。之后，用含0.1％(v/v)Tween 20的PBS洗涤多次，加入辣根过氧化物酶标兔抗鼠NGF抗体，37℃封闭1h。TMB显色后终止反应，用酶标仪测其450nm/630nm双波长A值。

[0154] 在本发明中，利用检测β-hNGF蛋白的双抗体夹心ELISA方法对抗性CHO细胞株进行了定性检测，5株表达β-hNGF基因的CHO重组细胞株的检测结果如图13所示。

[0155] 表达上清的活性测定

[0156] 利用鸡背根神经节增殖分析模型评价β-hNGF表达上清的刺激神经细胞生长活性，具体方法参照翟雷等，神经生长因子生物活性检定方法的建立，《微生物学免疫学进展》，1999，2：43～46.。简单来说，以10ng/ml的小鼠NGF作为阳性对照，以未转染重组表达质粒的CHO-dhfr-细胞培养上清作为阴性对照。结果如图14所示，可以看到，添加了表达hNGF的阳性细胞克隆培养上清的神经节，出现了明显的神经纤维(图14C)。这说明在CHO细胞中重组表达的hNGF具有生物学活性，比对NGF标准品，表达量为0.1ug/ul。

标题	发布/更新时间	阅读量
一种时钟基因表达量的调整剂及其制备方法	2020-05-15	844
生产蛋白质的方法	2020-05-24	895
将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法	2020-05-17	99
使用多重细胞信号传导途径活性的治疗应答的医学预后和预测	2020-05-25	888
一种用于工业生产的哺乳动物细胞表达载体	2020-05-21	915
动物源食品致病菌鉴定及其耐药和毒力基因检测复合芯片	2020-05-20	634
一种细菌耐药性筛查PCR芯片	2020-05-18	167
病原体高通量检测基因芯片及其应用	2020-05-22	701
细菌耐药基因检测芯片及其应用	2020-05-19	320
细菌耐药基因检测芯片及其应用	2020-05-19	98