技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物防治技术领域，具体的说，涉及一种运用RNAi有效防治鳞翅目害虫的方法。
背景技术
[0002] 鳞翅目昆虫，主要包括蛾、蝶两类昆虫。全世界已知约20万种，中国已知约8000余种。其中蛾类6000种，蝶类2000种。同时也是农、林害虫最多的一个目。绝大多数种类的幼虫为害各类栽培
植物，体形较大者常食尽植物
叶片或钻蛀枝干。体形较小者往往卷叶、缀叶、结鞘、吐丝结网或钻入植物组织取食为害。鳞翅目幼虫绝大多数为陆生，多为植食性，是一种广泛分布于全球的害虫。目前主要通过物理诱杀和化学
杀虫剂进行防治，效果均有限，且杀虫剂的施用很可能带来生物安全性问题和抗性的产生，亟需发现新方法。
[0003] RNA干扰技术近年来发展迅速，利用dsRNA对基因表达
水平进行下调很可能成为害虫防治的新手段。RNA干扰的成功与否主要取决于靶基因的选择，目前对昆虫的研究主要集中在神经、代谢以及生殖发育相关酶类，对于保幼
激素合成的研究还较少。保幼激素作为调节昆虫生长发育的重要激素，其生物合成中涉及的酶类具有作为RNAi靶标的潜
力。
发明内容
[0004] 本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种运用RNAi有效防治鳞翅目害虫的方法，其以保幼激素生物合成相关酶基因作为RNAi靶标，抑制害虫保幼激素的合成，调控鳞翅目害虫生长发育。
[0005] 本发明的实现方式为，用RNAi有效防治鳞翅目害虫的方法，利用饲喂的方式将针对法尼醇脱氢酶FOLD、保幼激素甲基转移酶JHAMT、保幼激素环
氧酶CYP15C1相关基因的双链RNA导入到鳞翅目害虫体内，抑制其相关酶的表达，抑制保幼激素合成，导致幼虫的死亡，达到防治鳞翅目害虫的目的。本发明的技术方案具体介绍如下。
[0006] 一种运用RNAi有效防治鳞翅目害虫的方法，通过饲喂的方式将针对法尼醇脱氢酶FOLD、保幼激素甲基转移酶JHAMT、保幼激素环氧酶CYP15C1相关基因的双链RNA导入到幼虫体内，实现防治鳞翅目害虫的目的；其中：针对法尼醇脱氢酶FOLD、保幼激素甲基转移酶JHAMT、保幼激素环氧酶CYP15C1相关基因的双链RNA的合成步骤如下：
[0007] (1)提取总RNA，反转录全部mRNA为cDNA，根据已知的鳞翅目害虫的FOLD、JHAMT和CYP15C1基因设计特异性引物，引物均添加T7启动子，PCR扩增特异
片段，利用琼脂糖凝胶
电泳对引物进行验证；
[0008] (2)以咽侧体cDNA作为扩增的模板，这些碎片再一次进行克隆放大，dsRNA(法尼醇脱氢酶FOLD、保幼激素甲基转移酶JHAMT、保幼激素环氧酶CYP15C1基因的双链RNA)的合成与纯化采用MEGA script RNAi
试剂盒，扩增产物进行消化反应以去除混有的模板DNA和单链RNA；
[0009] (3)解剖鳞翅目害虫的幼虫，取出咽侧体，进行RNA提取，完成后续反转录步骤，采用q-RT-PCR检测表达水平，实现dsRNA的体外培养。
[0010] 本发明中，步骤(1)中，扩增FOLD基因片段的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；扩增JHAMT基因片段的上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；扩增CYP15C1基因片段的上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示。
[0011] 本发明中，饲喂时，法尼醇脱氢酶FOLD、保幼激素甲基转移酶JHAMT、保幼激素环氧酶CYP15C1基因的双链RNA和食物总重量的投料比分别在2.5～3.5mg/g之间。
[0012] 本发明中，鳞翅目害虫包括
烟草天蛾和
棉铃虫。
[0013] 本发明中，针对法尼醇脱氢酶FOLD、保幼激素甲基转移酶JHAMT、保幼激素环氧酶CYP15C1相关基因的双链RNA，即dsFOLD、dsJHAMT、dsCYP15C1和dsGFP的序列分别如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12所示。
[0014] 和
现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0015] (1)因采用RNAi这种针对基因序列的技术，故防治特异性很强；
[0016] (2)双链RNA在体内可以持久存在，对于烟草天蛾等鳞翅目害虫的防治效果持久；
[0017] (3)保幼激素是昆虫体内的一类重要激素，广泛影响其生长发育，其合成途径普遍存在于昆虫中，而在
哺乳动物中不存在。以该生物合成途径中的酶作为靶标，既可以影响鳞翅目害虫的生长发育，也可以使其死亡；而且对哺乳动物等无害。
附图说明
[0018] 图1是离体培养RNAi对相关基因表达影响图示。
[0019] 图2是离体培养RNAi对保幼激素合成影响图示。
具体实施方式
[0020] 下面通过具体
实施例对本发明作进一步阐述，其目的仅在于更好理解本发明的内容。因此，本发明的保护范围不受所举之例的限制。
[0021] 实施例1、防治烟草天蛾
[0022] (1)虫源及饲养方法，
[0023] 烟草天蛾(Manduca sexta)的卵于Carolina Biological Supply Company(Burlington，NC)公司购买，在光照
培养箱中进行人工饲养，光周期为L16：D8，饲养
温度为26±1℃，
相对湿度70％～90％。幼虫使用烟草天蛾专用
饲料饲养，成蛾使用
蔗糖液体饲料饲养(经121℃高温灭菌20min、
质量分数为8％的蔗糖水溶液)。幼虫达到五龄后期出现蜕裂线时，单独转移至遮光的小管内，幼虫停止摄取食物，并在接下来的一日内
蜕皮成蛹。将蛹转移至
羽化箱内，羽化箱具有长时间光照以及放置烟草或其他茄科植物，不久蛹羽化为成虫，进行交配及产卵。
[0024] (2)实验方法
[0025] ①RNA提取和引物设计
[0026] 总RNA提取，用天根生化科技公司(TIANGEN)的RNA preppure动物组织总RNA提取试剂盒提取烟草天蛾总RNA。
[0027] 反转录，用上海生工
生物工程公司(Sangon Biotech)的M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit反转录烟草天蛾的mRNA为cDNA。
[0028] 引物设计，根据已报道的烟草天蛾FOLD、JHAMT和CYP15C1基因，dsGFP基因，设计特异性引物，进行PCR扩增后用琼脂糖凝胶电泳进行验证。引物序列见表1。
[0029] 表1三种酶的引物
[0030]
[0031] 引物序列均在5’端添加T7启动子序列
[0032] ②dsRNA的合成
[0033] 合成FOLD、JHAMT、CYP15C1的特异性dsRNA片段为dsFOLD、dsJHAMT和dsCYP15C1，EGFP基因特异性dsRNA片段为dsGFP。
[0034] dsRNA合成和纯化采用Ambion公司的MEGA script RNAi kit。最后获得针对烟草天蛾FOLD、JHAMT、CYP15C1基因的dsRNA片段和针对EGFP的dsRNA片段，其序列分别如SEQ ID NO:9～12所示。
[0035] ③dsRNA的离体培养
[0036] A.dsRNA导入，解剖五龄第一天的幼虫，取出咽侧体，转移到分别添加了1μL dsRNA的100μL Medium 199中进行培养，每一个培养管内放置10个CA，遮光置于摇床培养4h，
环境温度为30℃。6h后将CA转移出培养管并进行总RNA提取。对照组添加dsGFP，其余条件相同。
[0037] B.RNA干扰后烟草天蛾相关基因表达检测，上述咽侧体经培养后用接种环挑出，进行RNA提取，完成后续反转录步骤，采用q-RT-PCR检测表达水平。设置三个生物学重复，三个技术重复，内参基因采用beta-actin。
[0038] C.RNA干扰后烟草天蛾保幼激素合成水平的检测，培养结束后，利用200μl正己烷对上述培养液进行萃取，涡旋混合2min，离心分离(3200rpm)。取出150μl正己烷层萃取液，利用GC-MS/MS对保幼激素进行测定。检测方法参考文献J.Chromatogr.A,2018,1538,67–74。
[0039] ④dsRNA的饲喂
[0040] A.dsRNA导入，将孵化出的烟草天蛾幼虫置于添加了FOLD、JHAMT和CYP15C1 dsRNA的人工食物上，根据食物的重量称取相应的dsRNA，使其终浓度为3mg/g。每天更换一次食物。对照组添加相应重量的dsGFP，其余条件与实验组一致，每个实验组包含10个重复，每组内放置1只幼虫。
[0041] B.RNA干扰后烟草天蛾幼虫死亡率统计，记录三龄起每一龄的死亡率直至幼虫停止进食
化蛹为止。
[0042] C.RNA干扰后烟草天蛾幼虫表型的观察，观察幼虫体型大小与对照组差异，死亡幼虫的表型特点。
[0043] (3)结果
[0044] 离体培养RNAi对相关基因表达影响结果见图1。
[0045] 由图1可见，以FOLD、JHAMT、CYP15C1为靶标的RNAi抑制了相关基因的表达。FOLD、JHAMT和CYP15C1 dsRNA的导入，使编码基因的表达水平下降了45.5％、94.8％和64.5％。
[0046] 离体培养RNAi对保幼激素合成影响结果见图2。
[0047] 由图2可见，RNAi抑制了保幼激素的合成。添加了FOLD、JHAMT和CYP15C1 dsRNA的实验组保幼激素合成量下降了64.4％、75.4％和70.6％。
[0048] 表2提供了FOLD、JHAMT、CYP15C1为靶标的RNAi烟草天蛾死亡率。由表2可见，饲喂dsRNA的烟草天蛾幼虫的生长相比于对照组不同程度地有所抑制，尤其是CYP15C1。添加了CYP15C1 dsRNA的实验组幼虫在五龄化蛹之前全部死亡，尤其是四龄蜕皮至五龄阶段，蜕皮受阻。使用添加了JHAMT和FOLD dsRNA的人工食物饲喂后，幼虫在四龄时出现大量死亡，少数进入五龄阶段的幼虫体型明显小于正常生长的五龄幼虫，且出现停止进食，表皮发黑变红等现象。
[0049] 实验结果表明，通过RNAi的方法，干扰保幼激素相关酶的表达，利用离体培养和饲喂的方法，即可抑制保幼激素合成，影响烟草天蛾幼虫生长。证明FOLD、JHAMT和CYP15C1作为RNAi靶标防治鳞翅目害虫具有开发潜力。
[0050] 表2 FOLD、JHAMT、CYP15C1为靶标的RNAi烟草天蛾死亡率
[0051]
[0052] 实施例2、防治棉铃虫
[0053] (1)虫源及饲养方法，
[0054] 本发明所用的棉铃虫于科
云生物购买，后经实验室饲养繁殖。
[0055] 饲料为人工饲料，由本实验室配置。水源为
自来水。饲养条件为28±1℃，相对湿度为50％-70％，光周期为L14：D10。
[0056] (2)试验方法
[0057] ①dsRNA的合成参考实施例1。FOLD、JHAMT和CYP15C1的dsRNA的序列分别如SEQ ID NO:9～11所示。
[0058] ②dsRNA的饲喂
[0059] A.dsRNA导入，将孵化出的棉铃虫幼虫置于添加了FOLD、JHAMT和CYP15C1 dsRNA的人工食物上，根据食物的重量称取相应的dsRNA，使其终浓度为3mg/g。每天更换一次食物。对照组添加相应重量的dsGFP(序列如SEQ ID NO:12所示)，其余条件与实验组一致，每个实验组包含10个重复，每组内放置1只幼虫。
[0060] B.RNA干扰后棉铃虫幼虫死亡率统计，记录三龄起每一龄的死亡率直至幼虫停止进食化蛹为止。
[0061] C.RNA干扰后棉铃虫幼虫表型的观察，观察幼虫体型大小与对照组差异，死亡幼虫的表型特点。
[0062] (3)结果与分析
[0063] dsRNA饲喂后棉铃虫死亡结果见表3。
[0064] 实验结果表明，根据棉铃虫FOLD、JHAMT和CYP15C1序列保守区设计的dsRNA，能有效干扰棉铃虫幼虫相应酶的表达，可以造成棉铃虫幼虫的大量死亡。证明以这三种酶作为RNAi靶标用于鳞翅目害虫的控制具有极大潜力。
[0065] 表3 FOLD、JHAMT、CYP15C1为靶标的RNAi棉铃虫死亡率
[0066]
