对蚊子等双翅目昆虫有杀虫活性的Btcry40Dal基因及其应用
阅读：167发布：2020-05-13
专利汇可以提供对蚊子等双翅目昆虫有杀虫活性的Btcry40Dal基因及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种从苏 云 金杆芽胞杆菌野生菌株S2096-2中分离克隆的杀虫晶体蛋白基因cry40Da1，及其对蚊子等 双翅目 昆虫有 杀虫活性 和应用。本发明采用反向PCR克隆法从菌株S2096-2中克隆了cry40Da全长基因，该基因的开放阅读框(ORF)为1977bp，编码由659个 氨 基酸组成的 蛋白质 ，被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry40Da1，GenBank登录序号为EU596478。利用工程菌以及提取的表达蛋白，对致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)等双翅目昆虫表现出高效的杀虫活性。，下面是对蚊子等双翅目昆虫有杀虫活性的Btcry40Dal基因及其应用专利的具体信息内容。
1.一种苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry40Da1，具有如下所示序列：
a)如SQE NO：1所示的核苷酸序列；
b)与SQE NO：1所示的核苷酸序列具有兼并性的核苷酸序列；
c)与SQE NO：1所示的核苷酸序列有90％以上同源性的核苷酸序列。
2.一种含有权利要求1所述的基因cry40Da1的载体。
3.一种含有权利要求1所述的基因cry40Da1的宿主细胞。
4.一种含有权利要求3所述的宿主细胞，它是工程菌株HIC40。
5.一种由编码cry40Da1gSQE NO1所示的核苷酸序列的蛋白。
6.一种如权利要求5所述的蛋白其氨基酸序列如SQE NO：2所示。
7.一种制备权利要求1所述的基因cry40Da1的方法。
8.一种制备权利要求1所述的基因cry40Da1的宿主细胞的方法。
9.一种制备权利要求1所述的基因cry40Da1的工程菌株的方法。
10.一种如权利要求1所述的基因cry40Da1的用途，对双翅目昆虫有高效杀虫活性。
对蚊子等双翅目昆虫有杀虫活性的Bt cry40Da1基因及其
应用
技术领域
背景技术
[0002] 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis，简称Bt)能产生对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种害虫具有高毒杀作用的杀虫晶体蛋白(又称 -内毒素)。杀虫晶体蛋白在Bt菌株形成芽孢生成期间形成，并形成伴孢晶体，是由cry基因和cyt基因编码。自Schnepf等1981年首次从Bt中克隆cry基因，现在已有400余种杀虫蛋白基因(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html)。Hofte和whiteley1989年Hofte和Whiteley根据晶体蛋白的氨基酸序列和杀虫谱的不同，将已经发表的42种Cry蛋白分为4群13亚类。现在分类原则是根据杀虫晶体蛋白的氨基酸序列同源性，Neil Crickmore为首Bt内毒素命名委员会将它们分为为57大类。
[0003] 不同种类的Cry蛋白不仅杀虫范围不同，而且大小也不一样，大致有三个区域范围：129-138KD、65-67KD和25-28KD。它经特定蛋白酶的水解作用后，释放有活性的毒性肽核心片断(toxincore fragment)，然后与敏感昆虫消化道刷状缘膜囊(brush border memberance vesicles，BBMV)上的受体不可逆特异的高亲和结合，快速插入细胞质膜形成穿孔(pore)或病灶(lesion)。引起细胞膜非极化，离子梯度的破坏，扰乱了细胞内外正常的跨膜电势，及破坏细胞的酸碱平衡。另外Bt在敏感昆虫的血腔迅速增值会导致昆虫的败血症。一般认为内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入和孔洞或离子通道形成等五个环节。
[0004] 蚊虫、蝇等双翅目昆虫吸血叮人，不仅扰乱人们的工作和睡眠，而且传播疟疾，丝虫病，登革热，黄热病及乙型脑炎等多种疾病，其以疟疾和乙脑危害最为严重，目前世界上约有5亿多人口遭受疟疾的威胁，严重危害人类健康。以前一般利用化学农药控制蚊虫生长繁殖，但长期大量使用，不可避免地造成环境污染，并使害虫产生抗性。控制蚊虫现在人们把眼光都转向生物农药，在1976年，Goldberg等发现了Bt0NR260菌株对蚊虫具有很强的杀虫活性。这种菌株属于一种新的血清型并被命名为Bt以色列亚种(Btsubsp.israelensis)，在它的包涵体中发现了多种杀虫晶体蛋白成分(Goldberg L.J.，Margalit J.Mosq.News，1977，37(3)：355～358)。苏云金芽孢杆菌以色列亚种作为生物杀虫剂成功地用于蚊虫和蚋等多种双翅目昆虫的控制已有多年，在疟疾，登革热，黄热病和丝虫病等蚊媒疾病的控制上发挥了重要的作用(李洁，张应阔，钱万红.昆虫知识，1997，34(2)：109～111)。近年来，在巴西，印度，法国，尼日利亚，塞内加尔等地，Bti已广泛地用于蚊幼虫孽生地的控制，取得了良好的应用防和治效果。
[0005] 作者从中国广西百色大王岭自然保护区收集了大量微生物土壤样品，从中分离到一株高产椭圆形晶体蛋白的Bt菌株，命名为Bt S2096-2(见附图1)。本发明建立了PCR-RFLP方法鉴定该Bt菌株cry40基因的鉴定体系，然后利用PCR方法获得获取了Cry40Da基因全基因序列，该基因苏云金芽孢杆菌国际命名委员会确认为一个新的cry模式基因，命名为cry40Da1基因。Cry40Da1基因并在大肠杆菌中表达，其表达产物对三龄致倦库蚊具有相当毒力。本发明的意义在于从野生的Bt菌株S2096-2中分离克隆了杀虫晶体蛋白基因Cry40Da，转化到大肠杆菌表达，表明Cry1Ac22蛋白对库蚊双翅目昆虫有相当的杀虫活性，菌株Bt S2096-2的cry40Da1基因克隆为构建杀蚊工程菌提供一种候选基因。
发明内容
[0006] 本发明的主要内容是分离和克隆了一种对蚊子等双翅目昆虫有高效杀虫活性的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白模式基因cry40Da1，重组工程菌的构建，在宿主细胞(工程菌)中的诱导表达，目标蛋白的分离纯化及其在生物防治领域的应用。
[0007] 本发明提供了一种苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry40Da1，具有如下所示的核苷酸序列：a)如SQE NO：1所示的核苷酸序列；b)与SQE NO：1所示的核苷酸序列具有兼并性的核苷酸序列；c)与SQE NO：1所示的核苷酸序列有90％以上同源性的核苷酸序列。
[0008] 本发明还提供一种含有所述基因cry40Da1的载体。
[0009] 本发明还提供一种含有所述基因cry40Da1的宿主细胞。
[0010] 本发明还提供一种含有所述宿主细胞的工程菌株HIC40。
[0011] 进一步，本发明提供一种由SEQ NO：1所示的核苷酸序列编码的蛋白。
[0012] 本发明还提供一种如上所述的蛋白，其氨基酸序列如SQE NO：2所示。
[0013] 本发明还提供一种制备如上所述的基因cry40Da1的方法。
[0014] 本发明还提供一种制备如上所述的宿主细胞的方法。
[0015] 本发明还提供一种制备如上所述的工程菌株的方法。
[0016] 进一步，本发明提供一种如上所述的基因cry40Da1的用途，对蚊子(Culex quinquefasciatus等双翅目昆虫有高效杀虫活性用。
[0017] 本次发明所述cry40Da1所编码的杀虫活性蛋白对双翅目害虫有很强的毒杀活性，可以制成各种生物杀虫剂，用于防治可能传播人畜疾病的蚊子等昆虫，减少化学农药的使用和保护环境，对人畜无害，具有广阔的应用前景。附图说明：
[0018] 图1：菌株S2096-2杀虫晶体蛋白扫描电镜
[0019] 图2：菌株S2096-2的杀虫基因PCR鉴定扩增产物电泳
[0020] 其 中 M 为 DNA Loading Marker(250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，3200bp)，1为引物up40-5/up40-5扩增0.9kb的PCR产物。
[0021] 图3：PCR片段RFLP分析
[0022] M为DNA Loading Marker(300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，1000bp)，1为引物up40-5/up40-5在菌株S2096-2中扩增产物BglII和DraI酶切电泳带型。
[0023] 图4：cry40Da基因全序列PCR扩增
[0024] M为DNA Loading Marker(250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，3200bp)，1为引物EP40-5/EP40-3在菌株S2096-2中扩增产物BglII和DraI酶切电泳带型。
[0025] 图5：cry40Da基因全序列PCR扩增
[0026] M为DNA Loading Marker(250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，3200bp)，1为引物EP40-5/EP40-3在菌株S2096-2中扩增产物BglII和DraI酶切电泳带
[0027] 图6：菌株S2096-2分泌蛋白SDS-PAGE分析
[0028] M为蛋白质分子量标准(200kDa，120kDa，80kDa 60kDa，40kDa)
[0029] 2为菌株S2096-2表达75kDa的毒素蛋白，1毒素为在胰蛋白作用下酶解成50kDa毒素核心片段。3为菌株蛋白在Na2CO3(pH11)溶液溶解具体实施方式：
[0030] 本发明的技术方案是，首先通过PCR-RFLP鉴定菌株S2096-2含有cry40基因，通过反向PCR方法获得全基因序列。将cry1Ac22基因采用基因重组技术克隆到pQE30原核表达载体上，以构建重组质粒，获得一种工程菌HIC40，用IPTG诱导表达出融合蛋白，利用工程菌或纯化的表达蛋白，对双翅目昆虫致倦库蚊幼虫(Culex pipiens)具有高活力毒杀作用。具体技术方法如下：1，菌株S2096-2中cry基因PCR-RFLP分析
[0031] 从GenBank下载已经克隆的cry40基因进行多重序列比对，寻找基因保守区域，然后在保守区域设计鉴定通用引物up40-5/up40-3，根据扩增片段，选择BglII and DraI酶切，达到鉴定分析Bt菌株的基因型。总DNA提取参照(Bourgouin C.Transfer of the toxin protein genes of Bacillus sphaericus into Ba cillus thuringiensis subsp.Israelensis and their expressionEJ].Appl Environ Microbiol.1990，56：340～3)，以总DNA为模板，用cry40基因鉴定的通用引物up40-5/up40-3扩增约900bp左右片段，纯化PCR片段用现在内切酶消化PCR产物，酶切带型判断菌株S2096-2可能含有含有新型cry40类基因(如图2、3所示)。琼脂糖胶回收纯化后(胶回收试剂盒购自北京天根公司)，与克隆载体pMD 18T Vector(购自于大连Takara公司)连接，亚克隆测序。BLAST分析表明克隆片段为新型cry40基因部分序列。
[0032] up40-5引物序列：TGGAATCTTCATCGAATAACAC
[0033] up40-3引物序列：CGTGTTCCATTAGCTTCTAAC
[0034] 2，菌株S2096-2中cry40Da基因克隆
[0035] 克隆的PCR通过序列比发现他和cry40Aa和cry40Ba基因序列有较高同源性，而且cry40Aa和cry40Ba编码序列两侧序列有较高保守性，于是根据cry40Aa和cry40Ba保守序列设计对引物F40-5/F40-3用来扩增cry40Da完整编码框序列，获得了约2.0kb的目的片段(如图4所示)，用限制内切酶BglII和DraI消化PCR片段片段不同于cry40Aa和cry40Ba(如图5所示)。琼脂糖胶回收纯化后(胶回收试剂盒购自北京天根公司)，与克隆载体pMD 18T Vector(购自于大连Takara公司)连接，亚克隆测序，获得cry40Da基因完整编码蛋白序列，如SEQ NO1所示，编码659个氨基酸的毒蛋白质，如SEQ NO2所示。
[0036] F40-5引物序列：ATACGAGGAGTGAAATAGATG
[0037] F40-3引物序列：CACTTGTAAACATCGGACT
[0038] 3，基因cry40Da在大肠杆菌中表达
[0039] 根据编码序列设计表达引物EP40-5/EP40-3，并在分别在正向和反向引物N端加上BamHI和SalI酶切位点，质粒为模板扩增出1.977kb片段，纯化后与pMD 18T Vector载体连接，转入大肠杆菌JM110，Amp抗生素培养基选择，筛选正确克隆子，提取质粒，用BamHI和SalI完全消化，回收纯化1.977kp的基因目的带，同时用BamHI和SalI消化载体pQE30(购自QIAGEN公司)，基因目的产物和载体连接，转入大肠杆菌宿主M15，氨苄青霉素和卡那霉素抗生素选择正确的重组子HI40Da，然后用含有涂布于含100ug/ml氨苄青霉素和25ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中37度120rpm培养1-2个小时至OD值到0.4至0.6之间后加入IPTG至终浓度为0.5mM，37度120rpm诱导20小时。诱导培养的菌液超声波破碎3次，每次用0.5M的NaCl洗涤，获得cry40Da基因表达的粗蛋白，7.5％SDS聚丙烯酰胺变性胶检测到75kDa蛋白带。
[0040] EP40-5引物序列：CGGGATCC ATGAATTCATATCAAAATACAAATGG
[0041] BamHI
[0042] EP40-3引物序列：ACGCGTCGAC TGTTAAACAGCGATACCTCGAC
[0043] SalI
[0044] 4，Cry40Da蛋白活性测定
[0045] 诱导表达500mL工程菌株HI40Da，收集表达的蛋白，重新用30ml无菌水重新悬浮中，滴加1ml TritonX100，800W功率超声波破碎细胞5min。，弃上清，然后用40ml 0.5M的NaCl充分悬浮，相同功率超声波破碎1min，12 000r/min离心10min。反复用0.5M的NaCl洗涤3次。最后用悬浮于20ml冰冷的无菌水中，制备成生侧粗蛋白样品。利用标准的BSA蛋白标定蛋白浓度，然后将粗蛋白取菌液稀释成六个不同浓度梯度被测液200mL，测定Cry40Da蛋白对三龄致倦库蚊(Culex pipiens)幼虫杀虫活性。通过毒力回归分析得出Cry40Da蛋白对三龄致倦库蚊幼虫活性。
[0046] 实施例：
[0047] 实施例1
[0048] 菌株S2096-2的基因型分析
[0049] 1)总DNA提取：
[0050] Bt单菌落接种于7mL的LB液体培养基中，30℃，220rpm培养过夜，1％转接于盛有50mL的LB培养基的250mL体积的三角瓶中，30℃，220rpm继续培养4小时至OD600＝1.0～
2.0；离心收集10mL菌体，2mL J Buffer(0.1M Tris HCl(pH 8.0)、0.1M EDTA(pH 8.0)、
0.15M Nacl)洗涤沉淀；将沉淀轻悬于2mL J Buffer中加入80uL新鲜配制的溶菌酶(50mg/mL)，混匀，37℃温育45min；再加入15uLRNase(10mg/mL)，50℃作用15min；接着加入200μL SDS(20％)，70℃处理20min；缓慢冷却至37℃，用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)及氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，再加入等体积异戊醇混匀置-20℃沉淀上清20min，
12,000rmp离心10min。70％乙醇洗涤沉淀2次，风干后溶100uL TE Buffer(10mM Tris HCl(pH 8.0)、1mMEDTA(pH 8.0))中，取5uL DNA样品在0.8％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外分析仪检测。
2.0；离心收集10mL菌体，2mL J Buffer(0.1M Tris HCl(pH 8.0)、0.1M EDTA(pH 8.0)、
0.15M Nacl)洗涤沉淀；将沉淀轻悬于2mL J Buffer中加入80uL新鲜配制的溶菌酶(50mg/mL)，混匀，37℃温育45min；再加入15uLRNase(10mg/mL)，50℃作用15min；接着加入200μL SDS(20％)，70℃处理20min；缓慢冷却至37℃，用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)及氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，再加入等体积异戊醇混匀置-20℃沉淀上清20min，
12,000rmp离心10min。70％乙醇洗涤沉淀2次，风干后溶100uL TE Buffer(10mM Tris HCl(pH 8.0)、1mMEDTA(pH 8.0))中，取5uL DNA样品在0.8％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外分析仪检测。
[0051] 2)PCR-RFLP鉴定菌株Cry基因：
[0052] 50uLPCR反应体系，包括提取的总DNAluL为模板，各上下游引物分别为0.2uM，加入dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP混合物)至浓度250uM，5uL的10×PCR buffer(200mM Tris-HCl(pH 8.3)，500mM KCl，15or 20mM MgCl2，0.01％(w/v)gelatin)0.5UTaq酶，补双蒸水至50uL。反应按如下程序：进入循环前94℃预变性5min。然后进入30个循环反应，每个循环为：94℃变性1min；50℃退火1min；72℃延伸2min。最后在72℃延伸10min。扩增反应结束后，取PCR产物5μl，在1％琼脂糖凝胶上电泳检测扩增PCR片段约为900bp情况。然后利用Gel Extraction Mini Kit纯化PCR产物，分别用BglII and DraI双酶切消化引物up40-5/up40-3扩增产物，在2％的琼脂糖胶分析PCR产物酶切的带型。确定酶切带型和现已经克隆的cry40Aa和cry40Ba基因同样的酶切带型完全不同，初步确定为新型cry40基因。
[0053]
[0054] 实施例2
[0055] cry40Da1基因克隆
[0056] 1)菌株S2096-2质粒DNA提取：
[0057] 离心收集10mL菌体。每10mL菌液加150uL SI(10％蔗糖，50mM Tris·Cl(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)Lysozyme 20mg/ml，用时现配)，混匀，37℃水浴3h；加1350uL SII(10mM Tris·Cl，1mM EDTA，0.085M NaOH，1.I％SDS用时现配)，轻轻混匀，放置10min，然后加750uL SIII(5M KAc，用冰乙酸调至pH4.8)，上下倒置离心管轻轻混匀，冰浴4h以上；
12,000rpm离心10min，取上清，加入30RNase(10mg/mL)，45℃作用30min，加入1/10体积3M NaAC和2倍体积无水乙醇，-20℃沉30min。12,000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇漂洗。将沉淀在真空干燥器中干燥后用100uL超纯水溶解。取5uL质粒DNA样品在0.8％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外分析仪检测。
12,000rpm离心10min，取上清，加入30RNase(10mg/mL)，45℃作用30min，加入1/10体积3M NaAC和2倍体积无水乙醇，-20℃沉30min。12,000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇漂洗。将沉淀在真空干燥器中干燥后用100uL超纯水溶解。取5uL质粒DNA样品在0.8％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外分析仪检测。
[0058] 2)PCR扩增基因全序列：
[0059] 质粒为PCR反应模板，总的反应体系为50ul，10×PCR Buffer 5uL，dNTP为0.2mmol/L 1uL，引物Cry1rs5/Cry1rs3各0.2mmol/L，1单位/ul pfu酶。反应30个循环，
94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后延伸10min，PCR产物取5uL用
1.0％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外分析仪检测目的产物2.0kbPCR产物，用Ned I完全消化验证PCR产物是否正确。
94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后延伸10min，PCR产物取5uL用
1.0％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外分析仪检测目的产物2.0kbPCR产物，用Ned I完全消化验证PCR产物是否正确。
[0060]
[0061] 3)PCR扩增片段亚克隆与测序：
[0062] PCR产物用鼎国DNA Fragment QuickPurification/Recover Kit回收纯化，然后和载体pMD 18T Easy Vector连接，重组质粒导入到用0.1mol/LCaCl2诱导的大肠杆菌JM110感受态细胞中，转化子在含有Amp(100ug/ml)，5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside(X-Gal)(64ug/ml) 和 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)(0.2mM)的LB培养基平板，37℃培养过夜，任意挑取白色菌落于LB液体培养基中培养，提取重组菌株的质粒，选择相应的引物PCR扩增和选择多克隆位点的合适的限制性内切酶消化，确定含有目的片段的重组质粒，送往北京奥科生物科技有限公司测序。
[0063] 实施例3
[0064] cry40Da基因在大肠杆菌中表达：
[0065] 0.5ng质粒为模板，表达引物EP40-5/EP40-3各为0.2uM，加入dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP混合物)至浓度250uM，5uL的10×PCR buffer(200mMTris-HCl(pH 8.3)，500mMKCl，15or 20mM MgCl2，0.01％(w/v)gelatin)0.5U LA Taq酶(东洋纺)，补双蒸水至50uL。反应按如下程序：进入循环前94℃预变性5min。然后进入30个循环反应，每个循环为：94℃变性1min；50℃退火1min；72℃延伸3min。最后在72℃延伸10min。然后利用Gel Extraction Mini Kit纯化的PCR产物，用限制内切酶BamH I和Sal I 37℃分别消化纯化的PCR产物和表达载体pEQ30质粒3h，65℃水浴15min失活，然后将消化产物混合，加入T4DNA连接酶和Buffer过夜连接。转入大肠杆菌M15中，挑取重组菌落质粒DNA，BamH I和Sal
[0066] I酶切鉴定重组子HIC40为阳性重组子，在LB液体培养基中培养培养至OD＝0.5或0.6(600nm)加入IPTG继续培养4-6个小时至终浓度为1mmol/L诱导表达重组子上的目的基因。
[0067] 实施例4
[0068] Cry40Da蛋白对双翅目昆虫毒性测定
[0069] 粗蛋白取菌液六个不同浓度梯度被测液，将人工饲养的三龄致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)幼虫放到一定浓度待测液的500ml容积的水杯中，每个水杯放置25头，重复3次。恒温25℃，光照周期12：12，相对湿度65％环境，96h后，仔细观察剩下的活蚊数，就可以进行浓度-死蚊数/率的线性回归拟合了。利用spss软件进行毒力回归分析。得出Cry40Da1蛋白对三龄致倦库蚊毒力LC50为0.01ug/ml，较阳性对照Cry4Ba蛋白活性(LC50：134ug/ml)高达13400倍。
[0071] SEQUENCE LISTING
[0072] <110>海南海德热带农业资源研究所有限公司
[0073] <120>对蚊子等双翅目昆虫有杀虫活性的Bt cry40Da1基因及其应用[0074] <130>
[0075] <160>1
[0076] <170>PatentIn version 3.1
[0077] <210>1
[0078] <211>3534
[0079] <212>DNA
[0080] <213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
[0081] <220>
[0082] <221>gene
[0083] <222>(1)..(1977)
[0084] <223>
[0085] <400>1
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[0120] <120>对蚊子等双翅目昆虫有杀虫活性的Bt cry40Da1基因及其应用[0121] <130>
[0122] <160>1
[0123] <170>PatentIn version 3.1
[0124] <210>1
[0125] <211>1178
[0126] <212>氨基酸
[0127] <213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
[0128] <220>
[0129] <221>protein
[0130] <222>(1)..(426)
[0131] <223>
[0132] <400>1
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