使tau表达沉默的微RNA
阅读：725发布：2020-06-20
专利汇可以提供使tau表达沉默的微RNA专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及使用tau信使RNA(mRNA)的3'非翻译区(UTR)作为靶标，特别是使用调控tau表达的微RNA来 治疗 和 预防 阿尔茨海默氏病(AD)、缠结主导型痴呆(TPD)和其他与异常tau表达相关的 疾病 例如tau蛋白病。本发明也属于筛查、鉴定和诊断这些疾病的领域。特别是，本发明提供呈微RNA形式的关于这些疾病的 生物 标志物。，下面是使tau表达沉默的微RNA专利的具体信息内容。
1.一种治疗或预防tau蛋白病的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含结合于源自微管相关蛋白tau基因的tau mRNA的3'UTR的微RNA。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人类。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含配体、结合物、载体、脂质、运载体、佐剂或稀释剂。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述微RNA选自miR-34c-5p、miR-132-3p、miR-27a-5p、miR-204-5p、miR-485-5p、miR-181b-5p、miR-181d-5p和miR-219-5p。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述微RNA是miR-219-5p。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述微RNA包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述tau蛋白病选自阿尔茨海默氏病、缠结主导型痴呆、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTLD-tau)、额颞叶痴呆、神经节胶质细胞瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、皮克病和皮质基底节变性。
8.一种治疗或预防tau蛋白病的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的DNA，所述DNA编码结合于源自微管相关蛋白tau基因的tau mRNA的3'UTR的微RNA。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述受试者是人类。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述组合物还包含配体、结合物、载体、脂质、运载体、佐剂或稀释剂。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述微RNA选自miR-34c-5p、miR-132-3p、miR-27a-5p、miR-204-5p、miR-485-5p、miR-181b-5p、miR-181d-5p和miR-219-5p。
12.如权利要求8所述的方法，其中所述微RNA是miR-219-5p。
13.如权利要求8所述的方法，其中所述微RNA包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
14.如权利要求8所述的方法，其中所述tau蛋白病选自阿尔茨海默氏病、缠结主导型痴呆、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTLD-tau)、额颞叶痴呆、神经节胶质细胞瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、皮克病和皮质基底节变性。
15.一种用于筛选或鉴定用于预防或治疗tau蛋白病的治疗剂的方法，其包括如下步骤：
a.使测试剂与包含源自微管相关蛋白tau基因的tau mRNA的3'UTR的核苷酸接触或温育；和
b.测定所述测试剂是否结合于所述包含源自微管相关蛋白tau基因的tau mRNA的
3'UTR的核苷酸，
其中如果所述测试剂结合于所述包含源自微管相关蛋白tau基因的tau mRNA的3'UTR的核苷酸，则所述测试剂被鉴定为tau蛋白病的预防或治疗剂。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述tau蛋白病选自阿尔茨海默氏病、缠结主导型痴呆、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTLD-tau)、额颞叶痴呆、神经节胶质细胞瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、皮克病和皮质基底节变性。
17.一种用于筛选或鉴定用于预防或治疗tau蛋白病的治疗剂的方法，其包括如下步骤：
a.测量由与包含源自微管相关蛋白tau基因的tau mRNA的3'UTR的核苷酸连接或结合的核苷酸所表达的表型；
b.使测试剂与所述连接或结合至表达可测量表型的核苷酸的包含源自微管相关蛋白tau基因的tau mRNA的3'UTR的核苷酸接触或温育；和
c.在与所述测试剂接触或温育后测量所述表型，
其中如果在与所述测试剂接触或温育后所述表型的表达改变，则将鉴定所述测试剂为tau蛋白病的治疗或预防剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述tau蛋白病选自阿尔茨海默氏病、缠结主导型痴呆、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTLD-tau)、额颞叶痴呆、神经节胶质细胞瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、皮克病和皮质基底节变性。
19.一种用于筛选或鉴定用于预防或治疗tau蛋白病的治疗剂的方法，其包括如下步骤：
a.测量具有与包含源自微管相关蛋白tau基因的tau mRNA的3'UTR的核苷酸连接或结合的核苷酸的宿主细胞或动物的表型；
b.使测试剂与所述具有与核苷酸连接或结合的包含源自微管相关蛋白tau基因的tau mRNA的3'UTR的核苷酸的宿主细胞或动物接触或温育；和
c.在与所述测试剂接触或温育后测量所述表型，
其中如果在与所述测试剂接触或温育后所述表型的表达改变，则所述测试剂被鉴定为tau蛋白病的治疗或预防剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述tau蛋白病选自阿尔茨海默氏病、缠结主导型痴呆、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTLD-tau)、额颞叶痴呆、神经节胶质细胞瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、皮克病和皮质基底节变性。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述动物是黑腹果蝇。
22.一种用于筛选或鉴定用于预防或治疗tau蛋白病的治疗剂的方法，其包括如下步骤：
a.测量表达与结合于源自微管相关蛋白tau基因的tau mRNA的3'UTR的微RNA的表达相关的可测量表型的宿主细胞或动物的表型，
b.使测试剂与宿主细胞或动物接触或温育；和
c.在与所述测试剂接触或温育后测量所述表型，
其中如果在与所述测试剂接触或温育后所述可测量表型的表达改变，则所述测试剂被鉴定为tau蛋白病的治疗剂。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述tau蛋白病选自阿尔茨海默氏病、缠结主导型痴呆、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTLD-tau)、额颞叶痴呆、神经节胶质细胞瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、皮克病和皮质基底节变性。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述动物是黑腹果蝇。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述微RNA是miR-219。
26.一种筛查、诊断、预测或鉴定受试者中的tau蛋白病的方法，其包括：
a.从所述受试者获得生物组织或体液；
b.从所述生物组织或体液分离和纯化核酸样品；
c.测量所述核酸样品中的微RNA量；和
d.比较所述核酸样品中的所述微RNA量与微RNA量的参考值，所述参考值代表正常认知功能，并且找出在(c)中测量的所述微RNA量与所述参考值的偏差；
其中较小或较低或降低的微RNA量确定、诊断、预测或鉴定所述受试者具有tau蛋白病。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述受试者是人类。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述受试者罹患范围从轻度到重度的认知障碍或罹患前驱期的前期痴呆。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述生物组织是大脑、表皮、血液或血浆。
30.如权利要求26所述的方法，其中所述体液是脑脊髓液、唾液、血浆、汗液或尿液。
31.如权利要求26所述的方法，其中所述核酸是RNA、cDNA或基因组DNA。
32.如权利要求26所述的方法，其中所述tau蛋白病选自阿尔茨海默氏病、缠结主导型痴呆、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTLD-tau)、额颞叶痴呆、神经节胶质细胞瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、皮克病和皮质基底节变性。
33.如权利要求26所述的方法，其中所述微RNA是miR-219-5p。
34.如权利要求26所述的方法，其中所述微RNA选自miR-185-5p和miR-151-5p。
35.如权利要求26所述的方法，其中所述微RNA选自表11和表13中列出的那些微RNA。
36.如权利要求26所述的方法，其中所述核酸样品中的所述微RNA是通过选自Northern印迹法、原位杂交、实时PCR、核酸酶保护测定法、多聚A尾逆转录、微RNA扩增分析、基因表达的微RNA系列分析、微阵列、酶扩增测定法、测序、RNA测序和纳米粒子方法的测定法来检测的。
37.一种筛查、诊断、预测或鉴定受试者中的tau蛋白病的方法，其包括：
a.从所述受试者获得生物组织或体液；
b.从所述生物组织或体液分离和纯化核酸样品；
c.测量所述核酸样品中的微RNA量；和
d.比较所述核酸样品中的所述微RNA量与微RNA量的参考值，所述参考值代表正常认知功能，并且找出在(c)中测量的所述微RNA量与所述参考值的偏差；
其中较高或增加的微RNA量确定、诊断、预测或鉴定所述受试者具有tau蛋白病。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述受试者是人类。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述受试者罹患范围从轻度到重度的认知障碍或罹患前驱期的前期痴呆。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述生物组织是大脑、表皮、血液或血浆。
41.如权利要求37所述的方法，其中所述体液是脑脊髓液、唾液、血浆、汗液或尿液。
42.如权利要求37所述的方法，其中所述核酸是RNA、cDNA或基因组DNA。
43.如权利要求37所述的方法，其中所述tau蛋白病选自阿尔茨海默氏病、缠结主导型痴呆、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTLD-tau)、额颞叶痴呆、神经节胶质细胞瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、皮克病和皮质基底节变性。
44.如权利要求37所述的方法，其中所述微RNA是miR-181。
45.如权利要求37所述的方法，其中所述微RNA是miR-149。
46.如权利要求37所述的方法，其中所述微RNA选自表12和表14中列出的那些微RNA。
47.如权利要求37所述的方法，其中所述核酸样品中的所述微RNA是通过选自Northern印迹法、原位杂交、实时PCR、核酸酶保护测定法、多聚A尾逆转录、微RNA扩增分析、基因表达的微RNA系列分析、微阵列、酶扩增测定法、测序、RNA测序和纳米粒子方法的测定法来检测的。
使tau表达沉默的微RNA
[0001] 相关申请的交叉引用
技术领域
[0003] 本发明涉及使用tau信使RNA(mRNA)的3'非翻译区(UTR)作为靶标，特别是使用调控tau表达的微RNA来治疗和预防阿尔茨海默氏病(AD)、缠结主导型痴呆(TPD)和其他与异常tau表达相关的疾病例如tau蛋白病以及神经变性。本发明也属于筛查、鉴定和诊断这些疾病的领域。特别是，本发明提供呈微RNA形式的关于这些疾病的生物标志物。
背景技术
[0004] 由微管相关蛋白tau组成的异常神经元和神经胶质丝状包裹体的存在限定一组不同种类的神经变性病症，称为tau蛋白病(Dickson(2009))。阿尔茨海默氏病(AD)目前被归类为继发性tau蛋白病，其中由于淀粉样蛋白-β肽(Aβ)的毒性物质的水平增加而出现缠结(Hardy(2006))。导致额颞叶变性(FTLD)的微管相关蛋白tau基因(MAPT)突变的发现显示，tau功能障碍自身足以诱导神经变性(Hutton等(1998)；Gasparini等(2007))，但大多数具有缠结的患者缺乏这类突变。散发性非突变原发性tau蛋白病的一个实例是缠结主导型痴呆(TPD)(Ulrich等(1992)；Bancher和Jellinger(1994))。这些特殊的患者产生神经原纤维缠结，其在区域上、形态上、超结构上和生物化学上与中期AD相同，但缺乏显著的Aβ斑块沉积(Santa-Maria等(2012)(1))。目前对于AD或TPD尚无有效的治疗。
[0005] 在成人大脑中，17号染色体上的单一基因(MAPT)产生主要6种同工异构体(Wade-Martins(2012))。外显子10的可选剪接导致含有介导与微管蛋白结合的三个或四个串联的微管结合结构域重复序列的tau(Weingarten等(1975))。也发生外显子2和3的可选剪接。Tau表达不限于神经元，因为还观测到其在少突神经胶质细胞和星形胶质细胞中的存在(Binder等(1985)；Chin和Goldman(1996))。Tau存在于体树突区室中，其中它与各种蛋白质和质膜相互作用以调控多种过程和信号通路(Tashiro等(1997)；
Maas等(2000)；Avila等(2004)；Morris等(2011))。Tau在轴突中非常丰富(Mandell和Banker(1995)；Dotti等(1987)；Trojanski等(1989)；Litman等(1993))，其中它通过成核、捆束和稳定化微管而促进微管蛋白组装。Tau还结合于肌动蛋白，从而影响聚合，并且可能调和微管和肌动蛋白聚合物在细胞骨架网络组织中的相互作用(Kotani等(1985)；
Fulga等(2007)；He等(2009)；Farias等(2002))。通过结合于微管蛋白上与其他蛋白如分子马达驱动蛋白位点重叠的位点，tau还可以影响轴突运输(Ebneth等(1998)；Terwel等(2002))。最后，tau也可能在神经发生中起作用(Bullmann等(2007)；Hong等(2010))。
Maas等(2000)；Avila等(2004)；Morris等(2011))。Tau在轴突中非常丰富(Mandell和Banker(1995)；Dotti等(1987)；Trojanski等(1989)；Litman等(1993))，其中它通过成核、捆束和稳定化微管而促进微管蛋白组装。Tau还结合于肌动蛋白，从而影响聚合，并且可能调和微管和肌动蛋白聚合物在细胞骨架网络组织中的相互作用(Kotani等(1985)；
Fulga等(2007)；He等(2009)；Farias等(2002))。通过结合于微管蛋白上与其他蛋白如分子马达驱动蛋白位点重叠的位点，tau还可以影响轴突运输(Ebneth等(1998)；Terwel等(2002))。最后，tau也可能在神经发生中起作用(Bullmann等(2007)；Hong等(2010))。
[0006] 由于tau具有众多功能，因此它可能以多种方式促进神经变性，包括功能获得和功能缺失作用。在病理条件下，tau变得高度磷酸化(Lippens等(2012))，聚集(Mandelkow和Mandelkow(2012)；Hernandez和Avila(2008))并散布至邻近神经元(Le等(2012)；Santa-Maria等(2012)(2))。这在不存在编码区突变或不平衡的情况下在可选剪接中如何发生是不明确的，但次要翻译后修饰起作用(Lippens等(2012)；Mandelkow和Mandelkow(2012))。可选地，异常tau蛋白积累可通过蛋白质降解系统失效而促进(Wang和Mandelkow(2012))。尚未直接解决的一种额外机制是源自微RNA导致的tau翻译失调的tau合成增加是否在tau蛋白病中起作用。
[0007] 微RNA是调控其靶mRNA转录物表达的平均具有22个核苷酸的小非编码RNA(Ambros(2004)；Bartel(2009))，并且可能在大脑衰老、神经变性和神经保护中起作用(Kosik(2006)；Saugstad(2010)；Abe 和 Bonini(2013)；Gascon 和 Gao(2012)；Schonrock和Gotz(2012))。成熟微RNA源自70-100bp前体，其在细胞核和细胞质中分别通过III型RNA酶Drosha和Dicer连续处理(Perron和Provost(2009))。然后将RNA链并入RNA诱导的沉默复合物中。微RNA与其靶标的结合通过微RNA的2-8位与靶标3'非翻译区(3'UTR)(Bartel(2009)(影响翻译、稳定性和定位的mRNA组分)之间的互补碱基配对指定(Mazumder等(2003)；Kuersten和Goodwin(2003)；Matoulkova等(2012))。微RNA使其靶标沉默的确切机制尚在讨论中(Eulalio等(2008)；Flynt和Lai(2008))。
[0008] 虽然tau是在转录后调控，但不知道微RNA是否发挥直接作用。
发明内容
[0009] 本发明是基于如下令人惊讶的发现：微RNA的失调有助于tau蛋白病的发展。特别是，这些微RNA结合于源自tau基因MAPT的tau mRNA的3'UTR，从而调控tau的表达。在具有tau蛋白病如阿尔茨海默氏病和缠结主导型痴呆的患者中，存在一些微RNA(包括称为miR-219-5p者)的水平降低，这导致病理性tau的过度表达。这种发现可用于许多应用，包括筛查、诊断、预防和治疗tau蛋白病，特别是阿尔茨海默氏病和缠结主导型痴呆。它还可以用于由过多tau造成的疾病和病症的潜在疗法的药物筛选以及用于关于tau蛋白病的研究模型的基础。
[0010] 本发明的一个实施方案是在受试者中治疗或预防tau蛋白病、特别是阿尔茨海默氏病和缠结主导型痴呆的方法，其通过在有需要的受试者中增加结合于tau mRNA基因的3'UTR的微RNA水平来实现。所述增加可通过施用治疗有效量的可增加结合于MAPT基因的
3'UTR的微RNA产生的药剂或者可增加微RNA与MAPT基因的3'UTR的结合或促进微RNA与MAPT基因的3'UTR的结合的药剂来实现。
3'UTR的微RNA产生的药剂或者可增加微RNA与MAPT基因的3'UTR的结合或促进微RNA与MAPT基因的3'UTR的结合的药剂来实现。
[0011] 这种增加还可通过施用治疗有效量的包含结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的微RNA的组合物来实现。所述组合物还可包含配体、结合物、载体、脂质、脂质体、运载体、佐剂或稀释剂。可用于所述方法中的微RNA包括表4和表5中列 出 的那 些以 及来 自miRNA家族 miR-181abcd/4262、miR-27ABC/27a-3p、miR-34ac/34bc-5p/449abc/449c-5p、miR-132/212/21/-3p、miR-146ac/146b-5p、miR-204/204b/211和miR-219-5p/508/508-3p/4782-3p的那些。可用于所述方法中的其他微RNA包括miR-185、miR-151-5p、miR-149和miR-409-3p。用于所述方法中的优选微RNA是miR-34c-5p、miR-132-3p、miR-27a-5p、miR-204-5p、miR-485-5p、miR-181b-5p、181d-5p和miR-219-5p。
[0012] 用于所述方法中的最优选微RNA是来自家族miR219-5p/508/508-3p/4782-3p并且更具体地称为miR-219-5p，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列；或具有与SEQ ID NO:1的序列类似或同源的核苷酸序列的微RNA，其足以维持与MAPT基因的3'UTR的结合。可用于所述方法中的其他优选的微RNA包括(但不限于)包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列的微RNA(称为miR-485-5p)、包含核苷酸序列SEQ ID NO:3的微RNA 181d-5p，和miR-34c-5p、miR-132-3p、miR-27a-5p、miR181b-5p和miR-204-5p。
[0013] 另外，可通过使用序列信息来设计结合于源自tau MAPT 3'UTR的tau mRNA的微RNA或微RNA模拟物。MAPT 3'UTR的H1单倍型存在于17号染色体上的碱基对44,101295与44,105,727之间并且以SEQ ID NO:4示出。MAPT 3'UTR的H2单倍型存在于17号染色体上的碱基对76,2196-76,6698之间并且以SEQ ID NO:5示出。
[0014] 更具体地，可使用如下序列来设计结合于miR-219-5p所结合的MAPT3'UTR mRNA的保守区的微RNA或微RNA模拟物，所述序列为：
[0015] 5'–gugaucuuaaaugaggacaaucc–3' SEQ ID NO:6
[0016] 此外可使用如下序列来设计结合于miR-485-5p所结合的MAPT 3'UTR mRNA的保守区的微RNA，所述序列为：
[0017] 5'–aaugucccgaauucccagccuca–3' SEQ ID NO:7
[0018] 此外可使用如下序列来设计结合于miR-181-5p所结合的MAPT 3'UTR mRNA的保守区的微RNA，所述序列为：
[0019] 5'-uuagcuuucugucugugaauguc-3' SEQ ID NO:8
[0020] 这种增加还可通过施用治疗有效量的组合物来实现，所述组合物包含编码结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的微RNA的DNA，所述微RNA包括表4和表5中列出的那些以及来自miRNA家族miR-181abcd/4262、miR-27ABC/27a-3p、miR-34ac/34bc-5p/449abc/449c-5p、miR-132/212/21/-3p、miR-146ac/146b-5p、miR-204/204b/211和miR-219-5p/508/508-3p/4782-3p的那些。编码微RNA miR-185、miR-151-5p、miR-149和miR-409-3p的DNA也可用于所述方法中。用于所述方法中的优选的微RNA是miR-34c-5p、miR-132-3p、miR-27a-5p、miR-204-5p、miR-485-5p、miR-181b-5p、miR-181d-5p和miR-219-5p。
[0021] 所述组合物还可包含配体、结合物、载体、脂质、脂质体、运载体、佐剂或稀释剂。用于所述方法中的优选DNA是编码包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的微RNA(称为miR-219-5p)或者具有与SEQ ID NO:1的序列类似或同源的核苷酸序列并足以维持与MAPT基因的3'UTR的结合的微RNA的DNA。可用于所述方法的其他DNA包括(但不限于)编码包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列的微RNA(称为miR-485-5p)或者具有与SEQ ID NO:2的序列类似或同源的核苷酸序列并足以维持与MAPT基因的3'UTR的结合的微RNA的DNA，编码包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的微RNA(称为miR-181d-5p)或者具有与SEQ ID NO:3的序列类似或同源的核苷酸序列并足以维持与MAPT基因的3'UTR的结合的微RNA的DNA，和编码被设计以结合于包含SEQ ID NO:4-8的核苷酸的微RNA或者miR-34c-5p、miR-132-3p、miR-27a-5p或miR-204-5p的DNA。
[0022] 本发明的另一个实施方案是用于筛查、诊断、预测和/或鉴定tau蛋白病、特别是阿尔茨海默氏病或缠结主导型痴呆的方法，其包括从受试者获得生物组织和/或体液，从所述组织或液体纯化和/或分离RNA，和检测特定微RNA的存在或不存在。
[0023] 具体来说，一些微RNA(包括(但不限于)具有以SEQ ID NO:1示出的核苷酸序列的miRNA(称为miR-219-5p))的低水平或不存在和/或一些微RNA(包括(但不限于)具有以SEQ ID NO:3示出的核苷酸序列的miRNA(称为miR181d-5p))的高水平确定、诊断、预测或鉴定患者具有tau蛋白病(包括AD或TPD)。
[0024] 本发明的另一个实施方案是用于筛选、诊断、预测和/或鉴定tau蛋白病、特别是阿尔茨海默氏病和/或缠结主导型痴呆的方法，其包括从受试者获得生物组织和/或体液，从所述生物组织纯化和分离RNA，并检测所述纯化和分离的RNA样品中的微RNA(包括(但不限于)称为miR-219-5p的那些)的水平。将miRNA(例如miR-219-5p)的水平与来自健康对照的RNA样品中的水平进行比较。如果miR-219-5p的水平例如定性地(例如通过目测)或定量地(例如与健康对照中蛋白质的已知量进行比较)不同，则所述患者可被诊断或鉴定为具有tau蛋白病。
[0025] 本发明的另一个实施方案是用于筛选、诊断、预测和/或鉴定tau蛋白病、特别是阿尔茨海默氏病和/或缠结主导型痴呆的方法，其包括从受试者获得生物组织和/或体液，从所述生物组织纯化和分离RNA，并检测所述纯化和分离的RNA样品中的微RNA(包括(但不限于)称为miR-181d-5p的那些)的水平。将miRNA(例如miR-181d-5p)的水平与来自健康对照的RNA样品中的水平进行比较。如果miRNA(例如miR-181d-5p)的水平定性地(例如通过目测)或定量地(例如与健康对照中蛋白质的已知量进行比较)不同，则所述患者可被诊断或鉴定为具有tau蛋白病。
[0026] 在一个优选实施方案中，所测试的患者具有可被诊断为阿尔茨海默氏病和/或缠结主导型痴呆的认知障碍。
[0028] 纯化和/或分离的RNA可获自任何体液。优选的体液包括(但不限于)脑脊髓液、血浆、唾液、汗液和尿液。
[0029] 所述微RNA可使用本领域中已知的任何方法纯化和分离。
[0030] 用于检测微RNA的方法包括(但不限于)Northern印迹法、原位杂交、实时PCR、核酸酶保护测定法、多聚A尾逆转录、微RNA扩增分析、基因表达的微RNA系列分析、微阵列、酶扩增测定法、测序、RNA测序和纳米粒子方法。
[0031] 在一个优选的实施方案中，测量来自受试者的RNA样品中的miRNA量并与健康对照中的miRNA量的参考值进行比较，其中所述参考值代表正常认知功能的已知诊断或预测，并且找出来自受试者的RNA样品的miRNA量与参考值的偏差，其中如果来自受试者的RNA样品的miRNA量不同于参考值，则所述受试者可被确定、诊断、预测或鉴定为具有AD或TPD。
[0032] 其他miRNA可用于筛查、诊断、预测和/或鉴定tau蛋白病、特别是阿尔茨海默氏病或缠结主导型痴呆的方法中。可使用在阿尔茨海默氏病或缠结主导型痴呆中差异表达的任何miRNA。在具有阿尔茨海默氏病的患者中下调或以较低水平存在的miRNA包括(但不限于)表11中列出的那些。在阿尔茨海默氏病中上调或以较高水平存在的miRNA包括(但不限于)表12中列出的那些。在缠结主导型痴呆患者中下调或以较低水平存在的miRNA包括(但不限于)表13中列出的那些。在缠结主导型痴呆患者中上调或以较高水平存在的miRNA包括(但不限于)表14中列出的那些。在缠结主导型痴呆患者相比于阿尔茨海默氏病患者中下调或以较低水平存在的miRNA包括(但不限于)表15中列出的那些。在缠结主导型痴呆患者相比于阿尔茨海默氏病患者中上调或以较高水平存在的miRNA包括(但不限于)表16中列出的那些。
[0034] 本发明还提供用于药物设计、药剂测试的方法和工具，和用于tau蛋白病(包括阿尔茨海默氏病和缠结主导型痴呆)的病因和病原学的基础研究的工具。本发明还提供测定用于关于这些疾病的药物开发和基础研究的靶基因或蛋白的方法。
[0035] 本发明的另一个实施方案是用于筛选和/或鉴定用于预防和/或治疗tau蛋白病(包括但不限于AD和TPD)的测试剂的方法和/或测定法，其包括使测试剂与包含MAPT或其部分(包括但不限于SEQ ID NO:4-8)的3'UTR的核苷酸接触或温育，并且确定所述测试剂是否结合于所述核苷酸(即DNA或RNA)，其中如果所述测试剂结合于所述核苷酸，则所述测试剂被鉴定为tau蛋白病(包括但不限于AD和TPD)的治疗和/或预防剂。
[0036] 本发明的另一个实施方案是用于筛选和/或鉴定用于预防和/或治疗tau蛋白病(包括但不限于AD和TPD)的测试剂的方法和/或测定法，其包括使测试剂与包含MAPT或其部分(包括但不限于SEQ ID NO:4-8)的3'UTR的核苷酸接触或温育，并且在与所述测试剂接触或温育之前和之后检测所述核苷酸的表达，其中如果所述核苷酸的表达在与所述测试剂接触或温育之后降低，则所述测试剂被鉴定为tau蛋白病(包括但不限于AD和TPD)的治疗和/或预防剂。
[0037] 本发明的另一个实施方案是用于筛选和/或鉴定用于预防和/或治疗tau蛋白病(包括但不限于AD和TPD)的测试剂的方法和/或测定法，其包括使测试剂与包含MAPT或其部分(包括但不限于SEQ ID NO:4-8)的3'UTR的核苷酸的基因构建体接触或温育，并且在所述测试剂与所述基因构建体接触或温育之前和之后检测所述基因构建体中的核苷酸表达，其中如果在与所述测试剂接触之后所述基因的表达降低或减少，则所述测试剂被鉴定为tau蛋白病(包括但不限于AD和TPD)的治疗和/或预防剂。
[0038] 本发明的另一个实施方案是用于筛选和/或鉴定用于预防和/或治疗tau蛋白病(包括但不限于AD和TPD)的测试剂的方法和/或测定法，其包括用包含包括MAPT或其部分(包括但不限于SEQ ID NO:4-8)的3'UTR的核苷酸的基因构建体转化宿主细胞，检测所述宿主细胞中的核苷酸表达，使所述测试剂与所述宿主细胞接触，并且在与所述测试剂或化合物接触后检测所述宿主细胞中的核苷酸表达，其中如果在与所述测试剂或化合物接触后的核苷酸表达降低或减少，则所述测试剂被鉴定为tau蛋白病(包括但不限于AD和TPD)的治疗和/或预防剂。
[0039] 可使用可测量表型(基因的天然表型或人工连接表型，例如报道基因)来测定核苷酸或基因的表达。
[0040] 本发明的另一个实施方案是用于筛选和/或鉴定用于预防和/或治疗tau蛋白病(包括但不限于AD和TPD)的测试剂的方法和/或测定法，其包括使测试剂与包含与MAPT基因或其部分(包括但不限于SEQ ID NO:4-8)的3'UTR相关的表型和/或与微RNA表达相关的表型和/或与过度tau表达相关的表型的动物接触或温育，检测或观测所述动物中的所述表型，使所述测试剂与所述动物接触或温育，并且在与所述测试剂接触或温育后检测或观测所述表型，其中如果在与所述测试剂接触或温育后所述表型改变或变化，则所述测试剂被鉴定为tau蛋白病(包括但不限于AD和TPD)的治疗和/或预防剂。
[0041] 所述表型可能是动物的天然表型或已经人工产生的表型，例如，转基因果蝇(Drosophila)。
[0043] 为说明本发明，以附图形式描绘了本发明的某些实施方案。然而，本发明不限于附图中描绘的实施方案的精确布置和手段。
[0044] 图1A是来自RNA测序实验的平均读取频率相对于阿尔茨海默氏病(AD)、缠结主导型痴呆(TPD)和对照受试者的读取频率的图。图1B是示出定位至非编码RNA子组的读取比例的柱状图和饼状图。
[0045] 图2A是在AD(n＝6)、TPD(n＝3)和对照(n＝7)中具有微RNA变化的无监督层次聚类的小RNA测序的热图。数据以伪彩色热图(标准化读取频率的log2转化的相对表达值)示出。图2B是来自在AD(n＝6)、TPD(n＝3)和对照(n＝7)中鉴定的最显著25种微RNA的具有微RNA平均水平变化的无监督层次聚类的小RNA测序的热图(单因素ANOVA，p<0.05，未调整)。
[0046] 图3示出使用Taqman测定法的QPCR的结果，其证实在TPD(n＝19)和AD(n＝7)相比于对照(n＝20)中的miR-219-5p水平降低。*p<0.05。
[0047] 图4A示出含有整个tau 3'UTR的萤光素酶报道基因构建体(用各种微RNA共转染者)和空载体对照的萤光素酶活性的图。图4B是具有和不具有miR-219-5p识别元件的定点诱变的构建体的萤光素酶活性的图。*p<0.05，**p<0.01。
[0048] 图5A-C描绘在已经用含有miR-219前体和GFP的慢病毒载体转导的原代海马神经元中使用靶向神经元标志物MAP2的抗血清进行的免疫组织化学的图像。比例尺＝25μm。图5D是描绘关于从用mir-219慢病毒转导的培养物分离的总RNA的QPCR结果的图。*p<0.05。
[0049] 图6A是用在整个人类tau 3'UTR上游含有萤火虫萤光素酶的慢病毒载体与含有miR-219的载体一起共转导、用含有加扰miR的阴性对照慢病毒载体、和空载体对照转导的海马培养物中的萤光素酶活性结果的图。图6B是使用靶向总tau的抗血清(TauC)对原代海马培养物进行的代表性免疫印迹分析的图像和量化结果。图6C是用在整个人类tau3'UTR上游含有萤火虫萤光素酶的慢病毒载体与含有miR-219的载体一起、含有加扰miR的阴性对照慢病毒载体、和空载体对照转导的原代海马培养物的QPCR分析结果的图(tau mRNA水平)。*p<0.05。
[0050] 图7A是使用靶向总tau的抗血清进行的代表性免疫印迹分析的图像和量化结果，其揭示出在NGF处理后PC-12细胞中的tau蛋白表达相比于对照有所增加。图7B是对照和用NGF处理3天和7天的PC-12细胞中的tau mRNA水平的图。图7C是对照和用NGF处理3天和7天的PC-12细胞中的miR-219-5p水平的图。图7D是在慢病毒转导后miR-219-5p水平的QPCR分析结果的图，并且图7E是在用慢病毒miR-219-5p和加扰miR转导的细胞中的tau mRNA水平的QPCR分析的图。图7F是使用针对总tau的抗血清，用miR-219-5p、加扰RNA或空载体转导的PC12细胞的代表性免疫印迹分析的图像和量化结果。图7G和图7H是在无NGF暴露和暴露于NGF七天的PC12细胞中使用识别总tau的抗血清的免疫组织化学的图像。图7I-K是通过免疫荧光共焦显微镜对用慢病毒miR-219-5p和GFP报道基因转导的PC-12细胞所观测到的图像。图7K是图8I和图8J的合并。比例尺＝25μm。*p<0.05。
[0051] 图8A-D描绘用黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)进行的体内实验的结果。图8A示出具有miR-219过度表达的苍蝇。这些苍蝇相比于图8B中所示的对照具有举翅表型。
图8C示出在负趋地性或攀爬测定法中的苍蝇，其中对照在左侧管中，过度表达miR-219的苍蝇在中间管中，和过度表达miR-134的苍蝇在右侧管中。图8D是量化负趋地性测定法的结果的图。图8E-G是在对照苍蝇、过度表达miR-219的苍蝇和过度表达miR-34的苍蝇的整个苍蝇(图8E)、头部(图8F)和身体(图8G)中使用靶向果蝇tau的抗血清的代表性免疫印迹法的图像和量化结果的图。
图8C示出在负趋地性或攀爬测定法中的苍蝇，其中对照在左侧管中，过度表达miR-219的苍蝇在中间管中，和过度表达miR-134的苍蝇在右侧管中。图8D是量化负趋地性测定法的结果的图。图8E-G是在对照苍蝇、过度表达miR-219的苍蝇和过度表达miR-34的苍蝇的整个苍蝇(图8E)、头部(图8F)和身体(图8G)中使用靶向果蝇tau的抗血清的代表性免疫印迹法的图像和量化结果的图。
[0052] 图9A是来自使用elav-GAL4神经驱动子的过度表达miR-219的果蝇、加扰miRNA对照果蝇、过度表达miRNA海绵抑制剂(含有多种miR-219识别元件的转基因)的果蝇和加扰对照海绵果蝇的提取物的免疫印迹图像。图9B是量化这些免疫印迹结果的图。图9C是来自使用elav-GAL4过度表达miR-219或miR-219海绵的苍蝇相比于对照的总RNA结果的图。图9D是来自共同表达与人类tau 3'UTR融合的萤火虫萤光素酶与miR-219、加扰对照、miR-219海绵抑制剂和加扰对照海绵的苍蝇的溶胞物的萤光素酶报道基因测定法结果的图。使用具有与萤光素酶融合的人类GAPDH 3'UTR的对照系进行标准化。图9E是示出在过度表达miR-219、对照和加扰的苍蝇中的miR-219水平定量的图。使用2sRNA水平进行标准化。图9F是示出表达miR-219海绵、对照和加扰海绵的苍蝇中的定量的图。数据是平均值±SEM并且代表≥3次实验。使用Student t检验(双尾分布，*P≤0.05，**P≤0.01)进行统计分析。
[0053] 图10A-E是果蝇眼睛的图像。
[0054] 图11A-C是果蝇眼睛的图像。
[0055] 图12示出含有用各种微RNA共转染的整个tau 3'UTR相比于对照(仅htau3'UTR)的萤光素酶报道基因构建体的萤光素酶活性的图。(***p<0.0001)。
具体实施方式
[0056] 定义
[0057] 在本说明书中使用的术语通常具有其在本领域中、在本发明上下文中和使用每个术语的特定上下文中的普通含义。某些术语在下文或在本说明书中其他地方讨论，以向专业人员提供额外的指导以描述本发明的方法和如何使用它们。此外，应理解，同样的事情可以一种以上的方式讲述。因此，替代语言和同义词可用于本文讨论的任何一个或多个术语，而术语在本文中是否阐述或讨论不具有任何特殊意义。提供某些术语的同义词。一个或多个同义词的叙述不排除其他同义词的使用。在本说明书中其他地方使用实施例(包括本文讨论的任何术语的实施例)仅具说明性，而不以任何方式限制本发明或任何示例术语的范围和含义。同样，本发明不限于其优选实施方案。
[0058] 如本申请中使用的术语“受试者”是指具有免疫系统的动物，例如禽类和哺乳动物。哺乳动物包括犬科动物、猫科动物、啮齿动物、牛、马、猪、羊和灵长类动物。禽类包括(但不限于)家禽、鸣禽和猛禽。因此，本发明可用于兽药中，例如以治疗伴侣动物、农场动物、动物园中的实验动物和野生动物。本发明特别希望用于人类医学应用。
[0059] 如本申请中使用的术语“患者”是指人类受试者。在本发明的一些实施方案中，“患者”是罹患范围从轻度到重度的认知障碍或罹患前驱期的前期痴呆者。
[0060] 术语“健康对照”或“对照”将是未罹患痴呆疾病并具有正常的认知功能的人类受试者。此外，优选的是健康对照与受试者在合理范围内年龄匹配。
[0061] 如本申请中使用的术语“轻度认知障碍”或“MCI”是指正常衰老的预期认知能力下降与痴呆的更严重衰退之间的中间阶段。它是一种脑功能综合征，涉及认知障碍的起始和进展超过基于个体的年龄和教育所预期的那些，但这些不显著地足以干扰其日常活动。它经常被发现是正常衰老与痴呆之间的过渡阶段。虽然MCI可呈现多种症状，但是当记忆丧失是主要症状时，它被称为“遗忘型MCI”并且通常视为阿尔茨海默氏病的前驱期。
[0062] 术语“阿尔茨海默氏病”和“AD”将可互换使用并且是其中存在轻度认知障碍和存在包含Aβ的淀粉样蛋白斑块的疾病。
[0063] 术语“缠结主导型痴呆”、“仅缠结型痴呆”、“TOD”和“TPD”、“缠结主导型老年性痴呆”、“缠结型老年性痴呆”、“具有缠结的老年性痴呆”和“边缘神经原纤维缠结型痴呆”将在本申请中可互换使用并且被定义为产生在区域上、形态上、超结构上和生物化学上与中期AD中类似但缺乏显著的Aβ斑块沉积的神经原纤维缠结的患者(Santa-Maria等(2012)(1))。
[0064] 如本文使用的术语“tau蛋白病”是指特征在于tau蛋白在大脑中积累的神经变性疾病。这些tau蛋白病包括(但不限于)进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTLD-tau)、额颞叶痴呆、神经节胶质细胞瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、皮克病(Pick's disease)和皮质基底节变性。
[0065] 术语“治疗”等是指减慢、缓解、改善或减轻疾病的至少一种症状或在疾病发作后逆转疾病的手段。
[0066] 术语“预防”等是指在明显疾病发作之前作用，以预防疾病发展或最小化疾病程度或减缓其发展过程。
[0067] 术语“有需要的”将是已知或疑似具有阿尔茨海默氏病、缠结主导型痴呆或另一种tau蛋白病或造成神经变性的疾病或病状或处于阿尔茨海默氏病、缠结主导型痴呆或另一种tau蛋白病或造成神经变性的疾病或病状风险中的受试者。在AD或TPD的情况下，受试者可能罹患范围从轻度到重度的认知障碍或罹患前驱期的前期痴呆者。
[0068] 如本文所用的术语“药剂”是指产生或能够产生作用的物质并且将包括(但不限于)化学物质、药物、生物制剂、有机小分子、抗体、核酸、肽和蛋白质。
[0069] 短语“治疗有效量”在本文中用于是指足以造成受试者中的临床显著病状改善、或延迟或最小化或缓解与疾病相关的一种或多种症状、或导致受试者中的所需有利的生理学变化的量。
[0070] 如本文所用的术语“筛查”等是指测试受试者或患者以确定他们是否具有特定病症或疾病，在这种情况下是AD、TPD或另一种tau蛋白病。术语也是指测试药剂以确定它是否具有特定作用或功效。
[0071] 如本文所用的术语“诊断”等是指确定受试者或患者具有什么身体疾病或病症，在这种情况下是AD、TPD或另一种tau蛋白病。
[0072] 如本文所用的术语“鉴定”等是指识别受试者或患者中的疾病，在这种情况下是AD、TPD或另一种tau蛋白病。术语也是指识别可有效用于特定用途的药剂。
[0073] 如本文所用的术语“预测”等是指基于专业知识提前告知。
[0074] 如本文所用的术语“参考值”是指来自健康对照的样品中的特定蛋白质或核酸的数量。
[0075] 术语“MAPT”、“MAPT基因”和“MAPT基因座”在本申请中可互换使用并且是指微管相关蛋白tau基因。
[0076] 术语“3'UTR”或“MAPT基因的3'UTR”在本申请中可互换使用并且是指通过影响mRNA稳定性和定位以及其他功能而能够在转录后水平上调控基因表达的关键顺式作用调控元件(Aronov等(2001)；Aronov等(1999))。
[0077] 术语“微RNA”或“miRNA”将可互换使用并且被定义为平均具有22个调控其靶mRNA转录物表达的核苷酸的小非编码RNA(Ambros(2004)；Bartel(2009))。
[0078] 术语“微RNA模拟物”被定义为含有非天然或人工双链微RNA样RNA片段，其被构建以在其5'端上含有与3'UTR中的靶序列部分互补的序列基序。
[0079] 术语“微RNA家族”或“miRNA家族”将在整个本申请中可互换使用并且将是指具有相同种子的微RNA，其被定义为成熟微RNA的5'端的2至8位核苷酸。例如，miR-181b-5p和miR-181d-5p是来自微RNA家族miR-181abcd/4262并且具有相同的种子序列。因此，如果来自家族的一个或两个微RNA显示或预测结合至MAPT的3'UTR，则将假定所述家族中的其他微RNA也将结合于MAPT的3'UTR。
[0080] 术语“miR-219-5p”或“miR-219”在整个本申请中可互换使用并且是指鉴定为可用于诊断、预防和治疗tau蛋白病和神经变性的一种微RNA。当两种成熟微RNA源自同一pre-miRNA的相对臂时，它们被标注以-3p或-5p后缀。本领域技术人员将认识到，一种成熟miRNA比另一种更丰富并且关于在本申请中所述的其他微RNA，有时具有“5p”或“3p”名称，并且有时不描述相同的微RNA，例如，miR-181d和mir-181d-5p。
[0081] 术语“反义DNA”是与双链DNA中的编码链互补的非编码链。
[0082] 如本文所用，术语“分离的”等是指参考材料不含在所述材料通常存在的天然环境中存在的组分。特别是，分离的生物材料不含细胞组分。在核酸分子的情况下，分离的核酸包括PCR产物、分离的mRNA、cDNA、分离的基因组DNA或限制片段。在另一个实施方案中，分离的核酸优选是从其可能存在的染色体中切除的。分离的核酸分子可插入质粒、粘粒、人工染色体等中。因此，在一个具体的实施方案中，重组核酸是分离的核酸。分离的蛋白质可与其他蛋白质或核酸或两者缔合，与其在细胞中缔合者缔合，或与细胞膜缔合(如果它是膜相关蛋白的话)。分离的材料可能但无需纯化。
[0083] 如本文所用的术语“纯化的”等是指已经在减少或消除无关材料即污染物的条件下分离的材料。例如，纯化蛋白优选基本上不含其在细胞中缔合的其他蛋白质或核酸；纯化核酸分子优选基本上不含其可以在细胞内存在的蛋白质或其他无关核酸分子。如本文所用，术语“基本上不含”在材料的分析测试情况下可操作地使用。优选地，基本上不含污染物的纯化材料的纯度为至少50％；更优选地纯度为至少90％，并且更优选地纯度为至少99％。可通过色谱法、凝胶电泳、免疫测定法、组成分析、生物测定法和本领域中已知的其他方法来评估纯度。
[0084] 术语“核酸杂交”是指两个单链核酸之间的反平行氢键，其中A与T(或U，如果RNA核酸的话)配对并且C与G配对。当一个核酸分子的至少一条链可以与另一个核酸分子的互补碱基在限定严格度条件下形成氢键时，核酸分子可彼此“杂交”。例如通过如下测定杂交严格度：(i)进行杂交和/或洗涤的温度，和(ii)离子强度和(iii)杂交和洗涤溶液的变性剂如甲酰胺的浓度以及其他参数。杂交需要两条链含有基本上互补序列。然而，取决于杂交严格度，可容忍某种程度的错配。在“低严格度”条件下，可容忍更大百分比的错配(即，不会防止形成反平行杂交体)。
[0085] 术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指可将DNA或RNA序列(例如外来基因)引入宿主细胞中以转化宿主并促进所引入序列的表达(例如转录和翻译)的媒介物。载体包括(但不限于)质粒、噬菌体和病毒。
[0086] 载体通常包含已插入外来DNA的传播病原体的DNA。将一个DNA区段插入另一个DNA区段中的常用方式涉及使用被称为限制酶的酶，其在被称为限制位点的特定位点(特定核苷酸群)裂解DNA。“盒”是指可在指定限制位点插入载体中的编码表达产物的DNA编码序列或DNA区段。盒限制位点被设计来确保盒插入适当阅读框中。通常，外来DNA在载体DNA的一个或多个限制位点插入，然后与可传递的载体DNA一起被载体运载至宿主细胞中。具有插入或外加DNA的DNA区段或序列如表达载体也可被称为“DNA构建体”。常见类型的载体是“质粒”，其通常是双链DNA的自包含分子，通常具有细菌来源，其可以容易地接受额外的(外来)DNA并且其可以容易地引入合适的宿主细胞中。质粒载体通常含有编码DNA和启动子DNA并且具有适于插入外来DNA的一个或多个限制位点。编码DNA是编码特定蛋白质或酶的特定氨基酸序列的DNA序列。启动子DNA是起始、调控或以其他方式介导或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可能来自相同基因或来自不同基因，并且可能来自相同或不同的生物体。大量的载体(包括质粒和真菌载体)已经描述在多种真核和原核宿主中复制和/或表达，并且许多适当的宿主细胞是相关领域中的技术人员已知的。重组克隆载体通常将包括一个或多个用于克隆或表达的复制系统、一个或多个用于在宿主中选择(例如抗生素抗性)的标志物和一个或多个表达盒。
[0087] 术语“宿主细胞”是指以任何方式选择、修饰、转化、生长、使用或操纵以由细胞产生物质，例如由细胞表达基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶的任何生物体的任何细胞。宿主细胞还可用于如本文所述的筛选或其他测定法。
[0088] “多聚核苷酸”或“核苷酸序列”是核酸如DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)，并且是指两个或更多个核苷酸的任何链。核苷酸序列通常带有遗传信息，包括通过细胞机制用于制造蛋白质和酶的信息。这些术语包括双链或单链基因组和cDNA、RNA、任何合成和遗传操纵的多聚核苷酸，和有义和反义多聚核苷酸。这包括单链和双链分子，即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂交体，以及通过将碱基与氨基酸骨架结合形成的“蛋白质核酸”(PNA)。这还包括含有修饰碱基例如硫代尿嘧啶、硫代鸟嘌呤和氟尿嘧啶的核酸。
[0089] 本文的核酸可侧接天然调控(表达控制)序列，或者可与异源序列缔合，所述异源序列包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他核糖体结合位点序列、增强子、应答元件、抑制剂、阻遏子、信号序列、多聚腺苷酸化序列、内含子、5'非编码区和3'非编码区等。所述核酸也可通过本领域中已知的许多手段修饰。这类修饰的非限制性实例包括甲基化、“帽”、一个或多个天然存在的核苷酸被类似物取代，和核苷酸间修饰例如具有不带电荷的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些。多聚核苷酸可含有一个或多个额外的共价连接部分，例如，蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如，金属、放射性金属、铁、氧化性金属等)和烷化剂。所述多聚核苷酸可通过形成甲基或乙基磷酸三酯或氨基磷酸烷基酯键而衍生化。此外，本文的多聚核苷酸也可用能够直接或间接地提供可检测信号的标记来修饰。示例性标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素等。
[0090] 术语“序列相似性百分比(％)”、“序列同一性百分比(％)”等通常是指可能会或可能不会共有共同进化起源的核酸分子的不同核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列之间的同一性程度或对应关系。序列同一性可使用多种可公开获得的序列比较算法如BLAST、FASTA、DNA Strider或GCG(Genetics Computer Group，GCG软件包程序手册，第7版，Madison,Wisconsin)中的任一种测定。
[0091] 术语“基本上同源”或“基本上相似”是如通过序列比较算法如BLAST、FASTA和DNA Strider测定时，至少约80％并且最优选至少约90％或95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸在限定长度的DNA序列上匹配。这种序列的实例是本发明的特定基因的等位基因或物种变体。可以通过使用在序列数据库中可用的标准软件或在Southern杂交实验中在例如关于所述特定系统限定的严格条件下比较序列来鉴定基本上同源的序列。
[0092] 术语“约”或“大约”是指在如通过本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受的误差范围内，其将部分取决于如何测量或测定所述值，即测量系统的限制，即特定目的例如药物制剂所需的精度。例如，“约”可能是指依据本领域中的惯例在1个或大于1个标准差内。可选地，“约”可能是指给定值的高达20％、优选高达10％、更优选高达5％并且更优选高达1％的范围。可选地，特别是关于生物系统或过程，所述术语可能是指在值的一个数量级内，优选地在5倍内，并且更优选地在2倍内。在本申请和权利要求书中描述特定值时，除非另外说明，否则应假定术语“约”是指在特定值的可接受的误差范围内。
[0093] 作为Tau的调控因子的微RNA
[0094] 在至少23种脑部疾病中在体细胞和神经元过程和神经胶质中出现tau蛋白以神经原纤维缠结形式的细胞内聚集和积累，所述疾病中最常见的是阿尔茨海默氏病(AD)。据推测，使tau沉默的微RNA失调通过独立于tau mRNA水平或剪接不平衡以引起tau蛋白水平增加而在神经原纤维缠结形成的发病机理中起作用。这种假设建立在描述AD和其他神经变性疾病中的微RNA改变的以前研究上(Wang等(2008)；Hebert等(2008)；
Nunez-Iglesias等(2010)；Smith等(2011)；Kim等(2007)；Packer等(2008)；Rademakers等(2008)；Wang等(2010))。这种假设也是基于如下事实：大多数人类基因受微RNA调控(Friedman等(2009))，并且MAPT具有拥有多个保守预测微RNA识别元件的相对大(4.2Kb)3'UTR。
Nunez-Iglesias等(2010)；Smith等(2011)；Kim等(2007)；Packer等(2008)；Rademakers等(2008)；Wang等(2010))。这种假设也是基于如下事实：大多数人类基因受微RNA调控(Friedman等(2009))，并且MAPT具有拥有多个保守预测微RNA识别元件的相对大(4.2Kb)3'UTR。
[0095] 这项研究利用小RNA序列，因为它是定量的和杂交独立的，从而避免杂交探针的交叉反应性。使用严格的神经病理学纳入标准并着重于AD和TPD患者，该研究能够查明与颞叶tau积累(AD的标志特征)相关的微RNA。此外，对照的纳入是严格的，基于由Rowe和Khan(1987)提出的模型将病理分层。虽然在衰老中通常观察到缠结，但被称为成功的“大脑”衰老的老年个体的子集基本上没有年龄相关的颞叶缠结(Santa-Maria等(2012)(2))。这些对照从根本上不同于不具有病变的较年轻对照，因为它们已经避免了神经原纤维变性并且富集保护因子。总之，这种方法允许产生可用于区分AD和TPD与年龄相关认知障碍的一组独特微RNA特征，以及用于治疗AD和TPD和其他神经变性病状。
[0096] 本文阐述的研究结果支持如下假设：微RNA是神经原纤维变性的调控因子，在转录后水平下降低tau表达。因为tau表达降低保护免于Aβ诱导的认知障碍(Santacruz等(2005)；Roberson等(2007)；Roberson等(2011))，并且tau减少在转基因小鼠模型中通常充分耐受(Dawson等(2010))，所以降低tau表达是用于治疗AD和TPD的有吸引力的策略并且增加微RNA可实现这种降低。
[0097] 本文呈现的结果强烈地支持如下断言：微RNA，特别是具有包含SEQ ID NO:1的序列的被称为miR-219-5p者，是tau的调控因子。这种研究结果受到如下支持：miR-219-5p识别元件在tau 3'UTR中的广泛保守(实施例2和3)和使用萤光素酶报道基因测定法的体外实验证实直接结合和miR-219-5p使tau 3'UTR活性沉默(实施例4和15)。当用miR-219-5p转导海马培养物时，观测到tau蛋白水平显著降低，同时tau mRNA水平保持不变，这说明miR-219-5p使tau表达沉默的机制包括诱导翻译抑制(实施例5)。
[0098] 已证实miR-219可以与tau 3'UTR相互作用，接着必须询问这在另一种生理学情形下是否发生。预测靶标的功能趋势分析表明，miR-219在神经元分化、轴突发育和基因表达中起作用(实施例12；表9)。以前的研究已证实，tau是重要的发育蛋白质，在神经突起生长中发挥功能作用(Drubin等(1988)；Drubin等(1985))。使用暴露于神经生长因子(NGF)的PC12细胞(公认的神经突起生长模型)，证实应用NGF诱导分化成具有神经突起生长的神经元样细胞，其中伴随着tau mRNA和蛋白水平增加。此外发现，NGF诱导短暂但显著的miR-219下调，一旦细胞已完全分化，其返回到基线，展示出活性tau蛋白合成与miR-219水平之间的逆相关。最后，在施用神经元生长因子(NGF)后，发现miR-219-5p的过度表达阻断tau水平增加和PC12细胞中的废止的神经突起生长(实施例6)。总之，这些结果表明，NGF诱导的tau蛋白合成在转录后受到miR-219调控。
[0099] 使用果蝇在体内重现本文所有研究结果。在果蝇中，许多蛋白质调控机制是人类保守的，包括miRNA调控(Dai等(2012))。生物信息学分析揭示，成熟的果蝇miR-219序列与人类miR-219具有100％序列同一性。果蝇具有编码与人类tau具有66％氨基酸相似性的蛋白质的单一tau基因。果蝇和人类tau共有许多关键特征，包括微管结合结构域(Hedari和Fortinin(2001))。对果蝇基因组的研究揭示，苍蝇tau基因具有扩展为1439bp的以前不完全注释的3'UTR区并含有单一miR-219识别元件(实施例7；表8)。实际上，在预测靶向人类tau的所有miRNA中，在果蝇中仅miR-219识别元件是保守的，指示惊人的进化上保守的关系。
[0100] 为了询问果蝇tau是否也受到miR-219调控，这种miRNA在神经元中过度表达(Bejarano等(2012))。当miR-219在苍蝇大脑中过度表达时，苍蝇具有不同表型，包括举翅表型并且不能像对照一样攀爬得那么高(实施例8)。此外相比于加扰miRNA对照存在非常显著的tau蛋白水平降低(实施例9)。然而，当海绵抑制剂(含有多个串联miR-219结合位点的重组转录物)在果蝇中表达时，在果蝇神经元中表达的miR-219水平降低并且相比于对照存在内源tau蛋白水平的显著增加(实施例9)。miR-219海绵的过度表达也导致果蝇tau mRNA显著增加(实施例9)。然而，在miR-219过度表达后的果蝇tau mRNA水平不变，表明对mRNA水平和翻译的作用(实施例9)。另外，使用表达与人类tau 3'UTR融合的萤光素酶报道基因的果蝇，证实miR-219也能够在体内调控人类tau 3'UTR活性。相比之下，miR-219海绵抑制剂显著增加萤光素酶活性，从而证实tau调控的进化上保守的双向机制(实施例9)。
[0101] 研究已证实，tau的过度表达在转基因果蝇中产生显著的粗糙眼表型(Jackson等(2002)；Wittman等(2001)；Williams等(2000))，这是在本文中重现的研究结果(实施例10)。本文的结果也表明miR-219和人类3'UTR拯救表型，这表明miR-219调控tau毒性并且在3'UTR中存在保护性顺式作用调控元件(实施例10和11)。
[0102] 在可能促进tau毒性的致病机制中包括tau高度磷酸化、聚集、清除率降低和扩展至相邻神经元(Morris等(2011))。一种治疗策略是通过减少高度磷酸化tau(p-tau)的产生或增加高度磷酸化tau(p-tau)的清除率来降低神经元中毒性tau物质的负担(Jinwal等(2013))。如本文所示，miR-219也预测使GSK3β表达沉默，所述GSK3β是在tau高度磷酸化中所涉及的脯氨酸定向丝氨酸/苏氨酸激酶(实施例14)。另外，本文示出miR-219和其他miRNA靶向tau中所牵涉的其他激酶，例如人类tau-微管蛋白激酶1(TTBK1)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIγ和蛋白激酶A(PKA)(实施例14)。这些研究结果开启了如下可能性：迄今为止未确定的涉及miRNA的转录后机制调控tau和GSK3β以及或许tau中所涉及的其他激酶的表达。
[0103] 因为微RNA靶向MAPT的3'UTR，所以也可以使用微RNA来治疗其他tau蛋白病。tau蛋白病是特征在于tau蛋白在大脑中积累的神经变性疾病。这些tau蛋白病包括(但不限于)进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTLD-tau)、额颞叶痴呆、神经节胶质细胞瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、皮克病和皮质基底节变性。
[0104] 此外，虽然tau蛋白病的潜在机制可能涉及tau功能的获得或缺失，但许多研究人员现在认为，毒性tau的水平增加驱动神经原纤维变性(Morris等(2011)；Mandelkow和Mandlekow(2012))。其中微RNA成熟所需的内切核糖核酸酶Dicer在遗传上失活的以前研究支持所提出的微RNA在黑腹果蝇和啮齿动物模型中作为tau毒性调节因子的作用(Hebert等(2010)；Bilen等(2006))，这增加了微RNA改变可在许多神经变性病症中起到致病作用的可能性(Schaefer等(2007))。本文中神经元生长因子或NGF介导的miR-219-5p降低可影响tau介导的神经突起生长的研究结果是有趣的，因为已提出NGF信号传导改变可促进AD的发病机制，并且NGF目前被评估为神经变性的治疗剂(Borlongon(2012))。其他研究已显示，NMDA受体信号传导的破坏降低miR-219-5p水平(Kocerha等(2009)；Beveridge和Cairns(2012))，因此，微RNA，特别是miR-219-5p，可通过调节由NMDA、非NMDA和代谢型谷氨酸受体激动剂诱导的tau表达而在谷氨酸诱导毒性中起作用(Sindou等(1992)；Couratier等(1995)；Esclaire等(1997))。另外，苏铁源毒素(称为苏铁素)以及内源谷氨酸可增加tau表达，从而通过微RNA网络改变来促进在肌萎缩侧索硬化/关岛型帕金森病痴呆复合症中的tau蛋白积累和神经变性(Spencer等(2012))。
[0105] 另外，微RNA、特别是miR-219-5p在缠结形成中的作用可能不限于神经元，因为miR-219-5p也存在于神经胶质中，在其中它调控少突胶质细胞分化和髓鞘化(Zhao等(2010))。
[0106] 因此，可通过增加微RNA来治疗其他神经变性疾病，以及与神经胶质相关的疾病。
[0107] 总之，本文的结果证实，tau表达受到miRNA和更具体地至少miR-219调控。这种结论是基于如下事实：miR-219在体内特异性结合tau 3'UTR并且受到miR-219过度表达和体内抑制的双向调控。在miRNA中不可能仅miR-219能够调控人类tau，因为在tau 3'UTR中存在丰富的miRNA识别元件，并且本文阐述的体外研究已提出其他候选的调控tau的miRNA。这些包括被称为miR-34c-5p、miR-132-3p、miR-27a-5p、miR-204-5p、miR-485-5p、miR-181b-5p、mir-181d-5p和miR-219-5p的微RNA。此外，本文的结果也表明，这些miRNA家族靶向tau蛋白病中所牵涉的其他激酶(实施例14)。
[0108] 本文还表明，微RNA可以在体内经由MAPT基因的3'UTR来调控人类tau并且减少由tau过度表达所产生的负表型。这些体内结果表明，miRNA作为用于由tau过度表达和tau毒性造成的tau蛋白病的预防和治疗的巨大潜力。
[0109] 微RNA
[0110] 本文阐述的结果表明，微RNA牵涉于tau蛋白病中，所述tau蛋白病包括(但不限于)AD和TPD以及其他神经变性疾病和病状。
[0111] 为了起始本文的结果，显示存在76种在阿尔茨海默氏病相对于对照中差异表达的miRNA、152种在缠结主导型痴呆相对于对照中差异表达的miRNA，和54种在缠结主导型痴呆和阿尔茨海默氏病中差异表达的miRNA。参见实施例13，表11-16。
[0112] 另外，已显示某些miRNA在AD和TPD和靶标MAPT中差异表达。这些miRNA包括(但不限于)miR-185、miR151-5p、miR-219-5p、miR-149、miR-181d-5p和miR-409-3p。参见实施例2，表3。
[0113] 其他miRNA家族已显示靶向tau的3'UTR。这些miRNA家族是miR-181abcd/4262、miR-27ABC/27a-3p、mi-R34ac/34bc-5p/449abc/449c-5p、miR-132/212/21/-3p、miR-146ac/146b-5p、miR-204/204b/211和miR-219-5p/508/508-3p/4782-3p(实施例2，表6；实施例15)。这些miRNA也预测靶向在tau蛋白病中所牵涉的激酶，包括GSK3β(实施例14，表17)。
[0114] 另外，使用Targetscan已预测若干微RNA靶向tau并且在脊椎动物(表4)和哺乳动物(表5)中广泛保守。
[0115] 这些微RNA中的任一种可用于本发明用于治疗和预防tau蛋白病的方法中以及用于筛查、鉴定和诊断这类疾病的方法。用于所述方法中的优选微RNA是miR-34c-5p、miR-132-3p、miR-27a-5p、miR-204-5p、miR-485-5p、miR-181b-5p、miR-181d-5p 和miR-219-5p。
[0116] 使用来自TPD、AD和对照大脑的RNA的表达谱分析，发现两种微RNA，特别是miR-219-5p和miR-181d-5p，都具有在脊椎动物中在tau 3'UTR内广泛保守的预测识别元件(实施例1和2)。miR-181在AD和TPD相比于对照中增加。相比之下，miR-219-5p在AD和TPD相比于对照中降低。
[0117] 虽然调控tau表达的miRNA降低将增加tau产生的原因是显而易见的，但调控tau表达的miRNA增加将造成tau表达增加并且是tau蛋白病的标志物的原因不太明显。不受任何理论束缚，一些靶向tau的miRNA(包括miR-181d)的增加是响应性变化。大脑响应于tau增加使miRNA产生加强以致力于降低tau过度表达，但是它不够也太迟并且miRNA水平增加而实际上不降低tau表达。因此，增加这种miRNA也将有利地预防和/或治疗tau蛋白病，包括AD和TPD。
[0118] 分别由6号和9号染色体上的不同基因产生的两种前体(称为mir-219-1和mir-219-2)可以产生相同的成熟miR-219-5p。在所得概况中，获得可忽略水平的miR-219-1-3p，这表明mir-219-2前体的差异造成所观测到的miR-219-5p变化(表7)。
[0119] 成熟的miR-219-5p序列是高度保守的并且不同于miR-219-2-3p，其并未预测靶向tau。相比之下，虽然miR-219-5p家族(miR-219-5/508/508-3p/4782-3p)识别元件不包含在其他代表性微管相关蛋白的3'UTR中，但高度保守的miR-181识别元件存在于MAP1a、MAP1b和MAP23'UTR中，这表明miR-219-5p对于MAPT源转录物的相对选择性(表6)。因此，miR-219-5p是预测靶向tau的高度保守的微RNA，其据观测在AD和TPD大脑中下调。
[0120] 因此，本发明的一个实施方案是分离的微RNA和所述分离的微RNA(称为微RNA-219-5p)的用途，所述分离的微RNA包含如下序列：
[0121] 5'–ugauuguccaaacgcaauucuug-3' (SEQ ID NO:1)
[0122] 可用于本发明方法中的另一种微RNA是包含SEQ ID NO:2的序列的微RNA(称为miR-485-5p)。因此，本发明的另一个实施方案是分离的微RNA(称为微RNA-485-5p)和所述分离的微RNA(称为微RNA-485-5p)的用途，所述分离的微RNA包含如下序列：
[0123] 5'-agaggcuggccgugaugaauuc-3' (SEQ ID NO:2)
[0124] 可用于本发明方法中的另一种微RNA是包含SEQ ID NO:3的序列的微RNA(称为miR-181d)。因此，本发明的另一个实施方案是包含如下序列的分离的微RNA(称为微RNA-181d-5p)和所述分离的微RNA(称为微RNA-181d-5p)的用途，所述分离的微RNA包含如下序列：
[0125] 5'-aacauucauuguugucggugggu-3' (SEQ ID NO:3)
[0126] 本发明的其他实施方案是与SEQ ID NO:1、2或3具有序列同源性或相似性并足以维持结合于MAPT基因的3'UTR的功能的分离的微RNA，和与SEQ ID NO:1、2或3具有序列同源性或相似性并足以维持结合于MAPT基因的3'UTR的功能的分离的微RNA的用途。
[0127] 本发明的另一个实施方案是编码包含SEQ ID NO:1、2或3的微RNA的分离DNA，和编码包含SEQ ID NO:1、2或3的微RNA的分离DNA的用途。
[0128] 本发明的另一个实施方案是编码与SEQ ID NO:1、2或3具有序列同源性或相似性并足以维持结合于MAPT基因的3'UTR的功能的RNA的分离DNA和编码与SEQ ID NO:1、2或3具有序列同源性或相似性并足以维持结合于MAPT基因的3'UTR的功能的RNA的分离DNA的用途。
[0129] 本发明还包括重组构建体，其包含具有SEQ ID NO:1、2或3的核苷酸序列的RNA或编码所述微RNA的DNA，和可以在转化宿主细胞中表达的载体。本发明还包括用重组构建体转化的宿主细胞，所述重组构建体包含具有SEQ ID NO:1、2或3的核苷酸序列的微RNA或编码所述微RNA的DNA，和载体。
[0130] 本发明还包括重组构建体，其包含与SEQ ID NO:1、2或3具有序列同源性并足以维持结合于MAPT基因的3'UTR的功能的RNA或编码与SEQ ID NO:1、2或3具有序列同源性并足以维持结合于MAPT基因的3'UTR的功能的微RNA的DNA，和可以在转化宿主细胞中表达的载体。本发明还包括用包含这种微RNA或DNA和载体的重组构建体转化的宿主细胞。
[0131] 本发明还包括包含SEQ ID NO:1、2或3的核苷酸序列的反义微RNA或DNA的用途。
[0132] 本发明还包括重组构建体，其包含具有SEQ ID NO:1、2或3的核苷酸序列的反义微RNA或编码所述反义微RNA的DNA，和可以在转化宿主细胞中表达的载体。本发明还包括用包含具有SEQ ID NO:1、2或3的核苷酸序列的反义微RNA或编码所述反义微RNA的DNA和载体的重组构建体转化的宿主细胞。
[0133] 本发明的另一个实施方案是结合于从包含SEQ ID NO:4-8的序列设计的3'UTR的微RNA和结合于从包含SEQ ID NO:4-8的序列设计的3'UTR的微RNA的用途。
[0134] 本发明的另一个实施方案是编码结合于从包含SEQ ID NO:4-8的序列设计的3'UTR的微RNA的分离DNA和编码结合于从包含SEQ ID NO:4-8的序列设计的3'UTR的微RNA的分离DNA的用途。
[0135] 本发明还包括重组构建体，其包含结合于从包含SEQ ID NO:4-8的序列设计的3'UTR的微RNA或编码所述微RNA的DNA和可以在转化宿主细胞中表达的载体。本发明还包括用包含结合于从包含SEQ ID NO:4-8的序列设计的3'UTR的微RNA或编码所述微RNA的DNA和载体的重组构建体转化的宿主细胞。
[0136] 本发明还包括结合于从包含SEQ ID NO:4-8的序列设计的3'UTR的核苷酸序列的反义微RNA或DNA的用途。
[0137] 本发明还包括重组构建体，其包含结合于从包含SEQ ID NO:4-8的序列设计的3'UTR的反义微RNA或编码所述反义微RNA的DNA，和可以在转化宿主细胞中表达的载体。
本发明还包括用包含结合于从包含SEQ ID NO:4-8的序列设计的3'UTR的反义微RNA或编码所述反义微RNA的DNA和载体的重组构建体转化的宿主细胞。
本发明还包括用包含结合于从包含SEQ ID NO:4-8的序列设计的3'UTR的反义微RNA或编码所述反义微RNA的DNA和载体的重组构建体转化的宿主细胞。
[0138] 应理解，利用微RNA的本发明的治疗、预防、诊断或筛查方法中的任一种也可以利用微RNA模拟物。微RNA模拟物是设计用于基因沉默方法的分子并且含有非天然或人工双链微RNA样RNA片段，其可以结合至MAPT基因的3'UTR。
[0139] 增加微RNA作为AD和TPD和其他tau蛋白病的治疗
[0140] 如本文所示，罹患AD和TPD的患者具有低水平的结合于MAPT基因的3'UTR的微RNA，允许tau表达增加，从而导致病理性tau积累。因此，结合于MAPT基因的3'UTR的微RNA增加将降低tau的这种过度表达。
[0141] 因此，本发明的一个实施方案是治疗或预防tau蛋白病，所述tau蛋白病包括(但不限于)阿尔茨海默氏病和缠结主导型痴呆，以及进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(FTLD-tau)、额颞叶痴呆、神经节胶质细胞瘤、神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、皮克病和皮质基底节变性，其通过在有需要的受试者中增加结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的微RNA来实现。本领域技术人员应理解，在tau蛋白病中差异表达的任何微RNA(包括表11-16中列出的那些)可能增加并用于预防和治疗tau蛋白病。另外，靶向tau MAPT基因的3'UTR的微RNA(例如表3-6中列出的那些)也可增加并用于预防和治疗tau蛋白病。
[0142] 可能增加并用于所述方法中的优选微RNA是miR-34c-5p、miR-132-3p、miR-27a-5p、miR-204-5p、miR-485-5p、miR-181b-5p、miR-181d-5p和miR-219-5p。
[0143] 在一个优选的实施方案中，所用的微RNA是包含SEQ ID NO:1的序列的被称为miR-219-5p者。在另一个优选的实施方案中，所述微RNA包含与SEQ ID NO:1具有相似性或同源性的核苷酸序列并足以维持结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的功能。在另一个优选的实施方案中，所用的微RNA是包含SEQ ID NO:2的序列的被称为miR485-5p者。在另一个优选的实施方案中，所述微RNA包含与SEQ ID NO:2具有相似性或同源性的核苷酸序列并足以维持结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的功能。在另一个优选的实施方案中，所用的微RNA是包含SEQ ID NO:3的序列的被称为miR181d者。在另一个优选的实施方案中，所述微RNA包含与SEQ ID NO:3具有相似性或同源性的核苷酸序列并足以维持结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的功能。
[0144] 虽然这种微RNA和其他以较高水平存在于具有tau蛋白病(包括如上文所讨论的AD和TPD)的患者中，但这是因为所述患者响应于tau的过度产生并且靶向MAPT基因的3'UTR的任何微RNA可用于预防和/或治疗tau蛋白病。
[0145] 在另一种实施方案中，所述微RNA可包含将结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR并调控tau表达的核苷酸序列。这种微RNA可使用MAPT基因的3'UTR的已知序列并且特别是具有包含SEQ ID NO 4-8的核苷酸序列的序列来设计的。
[0146] 微RNA的增加可以不同方式实现。
[0147] 在有需要的受试者中增加微RNA的一种方法将是向所述受试者施用治疗有效量的药剂，其中所述药剂增加微RNA产生。
[0148] 增加结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的微RNA的另一种方法是通过施用增加或最大化所述微RNA结合其靶标的能力的药剂来实现的。
[0149] 在有需要的受试者中增加微RNA的另一种方法将是向所述受试者施用结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的微RNA或微RNA模拟物，或在AD或TPD中差异表达的微RNA或微RNA模拟物。
[0150] 这可以使用被设计以维持微RNA功能的所述微RNA来实现，原因在于它可以结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR。这种微RNA可通过本领域中已知的重组方法制造。所述微RNA也可以被修饰以增加其他所希望的特性，例如增加的稳定性、降低的体内降解和增加的细胞摄取。
[0151] 用于递送RNA的一种此类方法是受体介导的内吞作用，其中所述RNA与靶向分子偶联，所述靶向分子可以结合于特异性细胞表面受体，诱导内吞作用和将RNA转移至细胞中。通常通过将聚赖氨酸共价连接至受体分子并且然后布置以将带负电荷的RNA(可逆)结合于带正电荷的聚赖氨酸组分来实现偶联。另一种方法利用在许多细胞类型中表达的转铁蛋白受体或叶酸受体。当产生用于这种施用方法的微RNA时，所述微RNA可被制造以具有与所关注微RNA相同的引导链和被修饰和连接至分子以增加细胞摄取的信使链。特别是，神经元特定的配体-受体对将可用于本发明中。
[0152] 因此，本发明的一个优选实施方案是微RNA或微RNA模拟物，其包括包含SEQ ID NO:1、2或3的核苷酸序列的那些，或具有足以维持结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的功能的核苷酸序列，或使用MAPT基因的3'UTR的已知序列、特别是具有包含SEQ ID NO 4-8的核苷酸序列的序列设计，连接至增加RNA的细胞摄取的配体或结合物。这种结合可发生在末端位置5'/3'-OH，但所述配体也可发生在糖和/或碱基。可以连接至微RNA分子的结合物/配体的实例包括(但不限于)转铁蛋白、叶酸、胆固醇部分、双链体嵌入剂如吖啶、聚L-赖氨酸和单硫代磷酸。
[0153] 向适当组织施用RNA的另一种方法是直接注射/粒子轰击，其中所述RNA是利用针筒和针头直接注射至特定组织如肌肉中。
[0154] 一种可选的直接注射方法使用粒子轰击(‘基因枪’)技术：将RNA涂在金属球粒上并从特殊的枪射击到细胞中。使用这种方法已获得成功的基因转移至多种不同组织中。这类直接注射技术是简单和相对安全的。
[0155] 另一种用于递送微RNA至适当组织或细胞的方法是通过使用腺相关病毒(AAV)。在这些病毒载体中递送的微RNA被连续表达，取代未在受试者中表达的微RNA的表达。此外，AAV具有不同血清型，由于针对每种单独的AAV血清型的不同器官的天然趋向性以及与每种AAV血清型相互作用的不同细胞受体，其允许组织特异性递送。使用组织特异性启动子进行表达允许除AAV血清型之外的其他特异性。
[0156] 可用于递送RNA的其他哺乳动物病毒载体包括致癌逆转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体和慢病毒。
[0157] 特别是，HSV载体对于中枢神经系统(CNS)具趋向性并且可以在神经元中建立终身潜伏感染，并且因此是用于本发明中的优选载体。
[0158] 因此，本发明的另一个优选的实施方案是微RNA或微RNA模拟物，其包括包含SEQ ID NO:1、2或3的核苷酸序列的那些，或具有足以维持结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的功能的核苷酸序列，或使用MAPT基因的3'UTR的已知序列、特别是具有包含SEQ ID NO 4-8的核苷酸序列的序列设计，包裹在病毒载体中。
[0159] 脂质体是由模拟生物膜结构的合成脂质双层构成的球形囊泡。有待转移的RNA与脂质体一起在体外包裹并且直接用于在体内将RNA转移至合适的靶组织。脂质涂层允许RNA在体内存活，结合于细胞并且被内吞到细胞中。阳离子脂质体(其中脂质体上的正电荷使带负电荷DNA的结合稳定化)具有一种类型的脂质体。
[0160] 所述微RNA也可以与脂质一起施用以增加细胞摄取。所述微RNA可与阳离子脂质组合施用，所述阳离子脂质包括(但不限于)lipofectin、DOTMA、DOPE和DOTAP。
[0161] 其他脂质或脂质体制剂(包括纳米粒子)和施用方法已经描述于例如美国专利公开2003/0203865、2002/0150626、2003/0032615和2004/0048787在。用于形成粒子的方法也公开于美国专利No.5,844,107、5,877,302、6,008,336、6,077,835、5,972,901、6,200,801和5,972,900中。
[0162] 因此，本发明的另一个实施方案是微RNA或微RNA模拟物，其包括包含SEQ ID NO:1、2或3的核苷酸序列的那些，或具有足以维持结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的功能的核苷酸序列，或使用MAPT基因的3'UTR的已知序列、特别是具有包含SEQ ID NO 4-8的核苷酸序列的序列设计，包裹在脂质体中。本发明的另一个实施方案是微RNA或微RNA模拟物，其包含SEQ ID NO:1、2或3的核苷酸序列，或具有足以维持结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的功能，或使用MAPT基因的3'UTR的已知序列、特别是具有包含SEQ ID NO 4-8的核苷酸序列的序列设计，与脂质组合。
[0163] 本发明的另一个实施方案是包含微RNA或微RNA模拟物的药物组合物，所述微RNA或微RNA模拟物包括包含SEQ ID NO:1、2或3的核苷酸序列的miRNA，或具有足以维持结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的功能的核苷酸序列，或使用MAPT基因的3'UTR的已知序列、特别是具有包含SEQ ID NO 4-8的核苷酸序列的序列设计，和药学上可接受的稀释剂、载体或佐剂。也可向微RNA添加佐剂以保护其免于降解。
[0164] 对于某些实施方案，所述微RNA将靶向特定组织或细胞。在一个优选的实施方案中，所述组织是大脑或神经系统，并且所述细胞是神经元。
[0165] 用于增加有需要的受试者中的微RNA的另一种方法将是向所述受试者施用将编码结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的微RNA的DNA。
[0166] 这可通过上文关于在体内递送DNA所概述的方法来实现，其中所述DNA表达微RNA，包括包含SEQ ID No:1、2或3的那些miRNA和/或结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的那些。
[0167] 经典基因疗法通常需要将克隆基因有效转移至疾病细胞中以使得所引入的基因在适当高水平下表达。在基因转移后，所插入的基因可整合至细胞染色体中，或保持为染色体外基因元件(游离基因)。
[0168] 对于前者的情形，DNA与产生细胞中存在的微RNA的内源基因重组。这种重组需要双重组事件，其导致产生微RNA的基因中的突变的校正。
[0169] 更优选的情形是基因将由来自染色体外位置的细胞表达。
[0170] 用于在重组或染色体外复制中引入DNA的载体是本领域中已知的并且已经在本文中讨论。本领域中已知用于将基因引入细胞中的方法，包括电穿孔、磷酸钙共沉淀和病毒转导。
[0171] 微RNA作为用于tau蛋白病、特别是AD和/或TPD的筛查或诊断的用途
[0172] 如上文所述，并且在实施例3中所示，低水平的具有包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的微RNA(称为miR-219-5p)与较高水平的tau相结合，其又传导tau蛋白病信号。因此，本发明的一个实施方案是筛查、诊断或鉴定受试者中的tau蛋白病，其通过在来自受试者的样品中检测降低水平的具有包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的微RNA(称为miR-219-5p)。特别是，因为认知障碍可由除AD和TPD之外的许多其他疾病和病症造成，所以这种方法特别可用于在具有认知障碍的受试者中筛查、鉴定和诊断AD和/或TPD。
[0173] 此外如所示，增加水平的具有包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的微RNA(称为miR-181d-5p)与AD和TPD相关。因此，本发明的一个实施方案是筛查、诊断或鉴定受试者中的tau蛋白病，其通过在来自受试者的样品中检测增加水平的具有包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的微RNA(称为miR-181d-5p)。特别是，因为认知障碍可由除AD和TPD之外的许多其他疾病和病症造成，所以这种方法特别可用于在具有认知障碍的受试者中筛查、鉴定和诊断AD和/或TPD。
[0174] 为了检测与阿尔茨海默氏病和缠结主导型痴呆相关的微RNA中的一种，获得并制备来自具有范围从轻度到重度的认知障碍或具有前驱期的前期痴呆的受试者的生物样品并且分析微RNA的存在。这可以由诊断实验室和/或健康护理提供者以众多方式实现。
[0175] 将样品中存在的微RNA(称为miR-219-5p和/或miR-181d-5p)的水平与健康对照中的这些微RNA的水平进行比较。这种比较可以许多方式进行。可以在来自健康对照的纯化和分离的RNA样品上同时或连续地进行相同测定法，并且定性地(例如目测)比较结果，即，来自健康对照的RNA样品相比于相同测定法中来自受试者的RNA样品产生相同强度的信号，或者可以定量地比较结果，例如，获得来自受试者的RNA样品的信号值并且与健康对照中的RNA的已知值进行比较。
[0176] 相比于健康对照，来自受试者的样品中的微RNA(称为miR-219-5p)的较低水平将指示所述受试者具有tau蛋白病。如果受试者具有MCI，则其将指示所述受试者具有AD或TPD。如图3中所示，在对照受试者相比于AD或TPD中的miR-219水平存在显著差异(约5倍)。此外如表3中所示，在TPD相对于对照中，这种miRNA的倍数变化为-1.4，并且在AD相对于对照中，这种miRNA的倍数变化为-1.9。
[0177] 相比于健康对照，来自受试者的样品中的微RNA(称为miR-181d)的较高水平将指示所述受试者具有tau蛋白病。如果受试者具有MCI，则其将指示所述受试者具有AD或TPD。如表3中所示，在TPD相对于对照中，这种miRNA的倍数变化为+0.8，并且在AD相对于对照中，这种miRNA的倍数变化为+0.6。
[0178] 此外，表3中列出的miRNA(包括miR-185、miR-151-5p)和表11和表13中列出的miRNA可用于与miR219-5p的一种方法类似的方法中，因为这些miRNA以较低水平存在于AD和TPD中(相对于对照)。表3中列出的微RNA(包括miR-149)和表12和表14中列出的那些可用于与miR-181的一种方法类似的方法中，因为这些miRNA以较高水平存在于AD和TPD患者中(相对于对照)。最后，表15和表16中列出的miRNA可用于诊断或鉴定AD与TPD，原因在于这些miRNA在这些患者中差异表达。
[0179] 任何检测微RNA的方法可用于在具有认知障碍的受试者中筛查、诊断、预测和鉴定AD或TPD，其利用微RNA与AD和TPD相关的惊人发现。
[0180] 用于在具有范围从轻度到重度的认知障碍或具有前驱期的前期痴呆的患者中筛查和诊断AD或TPD的方法通过从所述患者获得生物组织或体液的样品并且从所述组织或液体中提取、分离和/或纯化核酸(例如，基因组DNA、cDNA、RNA)开始。
[0181] 所述核酸可获自任何生物组织。优选的生物组织包括(但不限于)大脑、表皮、全血和血浆。
[0182] 所述核酸可获自任何任何体液。优选的体液包括(但不限于)脑脊髓液、血浆、唾液、汗液和尿液。
[0183] 通过本领域中已知的方法从组织或液体的细胞提取、分离和纯化核酸。已经开发了许多方案以使用各种试剂盒和试剂来提取高质量RNA。虽然有可能使用总RNA用于微阵列分析，但是因为小RNA仅构成所有RNA的约0.01％，所以微RNA富集增加灵敏性。
[0184] 用于检测微RNA的方法包括(但不限于)Northern印迹法、原位杂交、实时PCR、核酸酶保护测定法、多聚A尾逆转录、微RNA扩增分析、基因表达的微RNA系列分析、微阵列、酶扩增测定法、测序和纳米粒子方法。
[0186] 下一代测序平台如基因组分析仪(Illumina Inc)或基因组测序仪FLX(454 Life Science和Roche Applied Science)也可用于通过测序来检测微RNA。深度测序使用大规模平行测序，从给定样品产生数百万的小RNA序列读数。
[0187] 当探针有待用于检测微RNA的存在时，必须治疗有待分析的生物样品以提取核酸。有待靶向的核酸通常需要至少部分单链的以与探针序列形成杂交体。如果所述核酸是单链的，则无需变性。然而，如果有待探测的核酸是双链的，则必须通过本领域中已知的任何方法进行变性。
[0188] 在促进探针中的靶序列和核酸中的靶序列的稳定杂交体形成的条件下温育有待分析的核酸和探针。所希望的杂交严格度将取决于诸如所靶向的基因组部分中的探针的独特性等因素，并且可通过洗涤程序、温度、探针长度和本领域中已知的其他条件改变，如Maniatis等(1982)和Sambrook等(1989)中所述。
[0189] 使用标记探针来检测杂交体，或者可选地，将探针与直接或间接标记的配体结合。合适的标记的和标记方法是本领域中已知的，并且包括生物素、荧光、化学发光、酶和放射性。
[0190] 使用这类探针的测定法包括Northern印迹分析。在将这些小RNA从凝胶转移在膜上之后，通过UV交联和/或烘烤所述膜而将RNA固定在所述膜上。由于微RNA分子的小尺寸和低丰度，为检测微RNA必需使用具有增加的灵敏性的寡核苷酸探针。Northern印迹探针区分相关微RNA的能力取决于序列同源性水平和碱基错配位置。如果碱基错配分布在微RNA序列长度上，则3-bp错配足以赋予探针特异性。
[0191] 也可使用斑点杂交来筛选微RNA。核酸(包括RNA)获自具有疑似AD或TPD的受试者，变性和点样到硝基纤维素或尼龙膜上并使其干燥。使膜暴露于标记单链探针序列的溶液并且在允许探针-靶标异源双链形成足够时间后，除去探针溶液并且将膜洗涤、干燥并暴露于放射自显影胶片。阳性斑点是受试者的RNA中的靶序列的指示并且没有斑点指示在受试者的RNA中缺乏靶序列。
[0192] 也可使用原位杂交(ISH)以使用探针来检测微RNA。ISH无需RNA的分离或电泳分离。探针的杂交发生在细胞或组织内。由于细胞结构在整个程序内得以维持，因此ISH提供关于mRNA在组织样品内的位置的信息。
[0193] 通过将样品固定在中性缓冲福尔马林中并将组织包埋在石蜡中来进行ISH。然后将样品切成薄切片并安装到显微镜载片上。(可选地，可将组织切片冷冻并后固定在多聚甲醛中。)经过一系列洗涤以将切片脱蜡和再水合后，进行蛋白酶K消化以增加探针可接近性，并且然后将标记探针与样品切片杂交。利用在载片上干燥的液体膜使放射性标记的探针可视化，同时利用比色或荧光试剂方便地检测非同位素标记的探针。
[0194] 也可使用核酸酶保护测定法来检测微RNA。这种测定法(包括核糖核酸酶保护测定法和S1核酸酶测定法)是用于检测和定量特定微RNA的极其灵敏的方法。所述核酸酶保护测定法的基础是反义探针(放射性标记或非同位素的)与RNA样品的溶液杂交。在杂交后，单链非杂交探针和RNA通过核酸酶降解。在丙烯酰胺凝胶上分离其余保护片段。溶液杂交通常比基于膜的杂交更有效，并且相比于印迹杂交的最大值20-30μg，它可以容纳高达100μg的样品RNA。
[0195] 也可使用RNA微阵列来筛选微RNA。所涉及的表面是玻璃而非多孔膜并且与反向斑点印迹法类似，RNA微阵列技术使用反向核酸杂交方法：所述探针由固定至固体支撑物(DNA或寡核苷酸的阵列)的未标记的DNA组成并且靶标是被标记的并且在溶液中。
[0196] 微阵列分析允许大量微RNA的平行分析并且可用于检测广泛多种限定微RNA的存在和/或调控。在提取RNA后，通常可通过使用T4RNA连接酶直接标记成熟微RNA以将1或2个荧光团标记的核苷酸连接至微RNA的3'端。
[0197] 微阵列技术也允许RNA测序的替代方法，其通过使靶RNA与一系列具有已知序列的寡核苷酸(通常长度为约7-8个核苷酸)杂交而允许。如果杂交条件是特定的，则有可能检查哪些寡核苷酸通过杂交呈阳性，将结果输入计算机中并使用程序寻找序列重叠以建立所需的DNA序列。RNA微阵列已通过与寡核苷酸大规模杂交来允许测序。
[0198] 另一种用于测定微RNA是否存在于样品中的优选和常用的技术是使用实时PCR。这在实施例13中示例。
[0199] 微RNA实时反应起始于RNA逆转录成cDNA。成熟微RNA的有限长度(约22nt)、缺乏共同序列特征如多聚(A)尾、和成熟微RNA序列也存在于初级微RNA和微RNA前体转录物中的事实，对于适当逆转录施加若干挑战。然而，迄今为止，主要两种不同方法被用于逆转录：微RNA特异性或普遍性逆转录。在第一种方法中，通过使用茎-环特异性逆转录引物单独地逆转录微RNA。茎-环引物被设计以具有在微RNA的3'端与已知序列互补的短的单链区域、双链部分(茎)和含有普遍性引物结合序列的环。然后将所得cDNA用作定量(q)PCR的模板，其具有1个微RNA特异性引物和第二普遍性引物(TaqMan PCR,Applied Biosystems)。茎-环引物更难于设计，但其结构降低引物至微RNA前体和初级微RNA的退火，从而增加测定法的特异性。这种技术示例于实施例3中。
[0200] 第二种方法首先限定所有具有共同序列的微RNA并且然后通过使用普遍性引物来逆转录所述微RNA。这种方法被广泛使用并且如果需要从少量原料分析若干不同的微RNA，则它是特别有用的。使用大肠杆菌多聚(A)聚合酶(miRCURY,Exiqon)用多聚(A)尾延长所有微RNA的3'端。然后使用由在5'端具有普遍性引物结合序列的寡(dT)序列组成的引物来引起逆转录并且在qPCR反应中扩增靶序列。通过使用在引物的5'端锚定引物至微RNA的3'端的模板结合序列来限定微RNA与普遍性寡(dT)引物序列之间的“dTs”伸长。
[0201] 另一种可用于检测微RNA的新技术(称为“光学液体冲压”)通过将微粒结构压印在感光流体上而起作用。用独特的“条形码”编码的所得三维水凝胶粒子可用于在大量样品上检测微RNA。这些粒子被定制设计用于在几乎任何流式细胞仪中读出。商业产品FirePlex miRSelect，使用这种技术是可用的。
[0202] 试剂盒
[0203] 可预期的是，本文公开的所有诊断和筛选测定法可以试剂盒形式被健康护理提供者和/或诊断实验室使用。
[0204] 基于miRNA的诊断和筛选测定法将包括例如用于miRNA的探针，例如称为miR-219和miR-181-d的那些；用于从生物组织或体液分离和纯化核酸的试剂；用于在所述分离和纯化的核酸上进行测定法的试剂；使用说明书，并且比较序列可包括在用于检测miRNA的试剂盒中。这些试剂盒也可包括对MAPT 3'UTR具特异性的引物。
[0205] 药物筛选和研究工具
[0206] 本发明的另一个实施方案是微RNA和其在源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR上的结合位点和本文阐述的方法作为用于筛选tau蛋白病、特别是阿尔茨海默氏病和缠结主导型痴呆的潜在疗法的方法的用途。
[0207] 在一个实施方案中，使用包含源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的DNA或mRNA，并且更具体地是与微RNA结合以调控tau合成的保守区，并且更具体地是与miR-219-5p结合的区域。
[0208] 在筛选tau蛋白病(包括AD和/或TPD)的潜在治疗剂的这种测定法中，使药剂与如上所述的DNA或RNA接触，并且通过本领域中已知的方法检测所述DNA或RNA与所述药剂之间的复合。一种此类方法是标记DNA或RNA并且然后使游离DNA或RNA与和所述药剂结合者分离。如果所述药剂结合于DNA或RNA，则所述药剂将被视为AD和/或TPD或其他tau蛋白病的潜在治疗剂。
[0209] 另外，源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR可使用例如包含SEQ ID NOs:9、10、13和14的核苷酸序列的那些的引物扩增，并且通过本文所述的方法克隆到本文所述的任何载体中。3'UTR和载体的重组构建体也可具有测量3'UTR如报道基因构建体的表达的手段。这类构建体包括(但不限于)在实施例4中示例的那些、双重萤光素酶报道基因psiCHECK-2载体。如实施例5中所示例，3'UTR也可连接至具有可测量表型的另一种基因如tau。
[0210] 这些重组构建体可通过本文所述的方法转染至本文所述的任何宿主细胞中。宿主细胞包括(但不限于)神经母细胞瘤细胞和海马细胞。
[0211] 然后可将具有重组构建体的宿主细胞用于筛选AD和/或TPD的治疗剂。在这个实施方案中，在与药剂接触之前通过连接基因的表达来测量3'UTR的表达。然后使转化的宿主细胞与药剂接触，并且如果连接至3'UTR的基因的表达降低，则所述药剂结合于3'UTR阻断表达并且可被视为AD和/或TPD的潜在疗法。
[0212] 在这种方法中，重组构建体中的3'UTR DNA或RNA也可以突变以缺失miR-219-5p或已知靶向tau的3'UTR的另一种miRNA的保守结合位点，并且用于药物筛选测定法中。如果在与降低在具有整个3'UTR的重组构建体中的表达的药剂接触后，连接基团的表达未降低，则所述药剂可被视为在miR-219-5p结合的保守位点处结合于3'UTR。因为本文中已显示这种结合降低tau的表达，所以结合于MAPT基因的3'UTR的这个区域的任何药剂可被视为由tau过度表达产生的疾病和病症的治疗剂。
[0213] 任何构建体和转化宿主细胞也可用于与AD、TPD和其他tau蛋白病有关的基础研究。例如，这些构建体和细胞可用于测量天然存在的物质对源自tau MAPT基因如Aβ肽或神经元生长因子的tau mRNA的3'UTR的影响。
[0214] 这些基因构建体以及用这些基因构建体转化的宿主细胞也可以是用于测试二者作为研究工具和用于治疗剂的转基因动物的基础。这类动物将包括(但不限于)裸小鼠和果蝇。表型与基因相关并且在施用潜在治疗剂或与潜在治疗剂接触后考虑确定基因对动物以及表型变化的影响。
[0215] 另外，本发明也涵盖过度表达或不足表达结合于源自tau MAPT基因的tau mRNA的3'UTR的微RNA的宿主细胞和动物并且其可用于筛选治疗剂以及用于基础研究。这在实施例7中用过度表达miR-219的黑腹果蝇示例。如通过负趋地性测定法所示，这些苍蝇相比于其对照对应物具有不同的翅表型并且飞行肌较弱。测试剂可施用至这些苍蝇或与这些苍蝇接触并且测定所述表型。另外，测试剂可施用至对照苍蝇并且如果其表型变得与过度表达miR-219的苍蝇更相似，即，攀爬得没那么高和/或举翅表型，则所述测试剂可视为增加结合于源自tau基因的tau mRNA的3'UTR的微RNA，并且是tau蛋白病(包括AD和TPD)的潜在治疗剂。
[0216] 具有可鉴定表型的具有tau过度表达的动物，例如实施例10中示例的具有粗糙眼表型的转基因苍蝇，也可用于筛选治疗和预防剂，以及用于基础研究。如实施例中所示，miR-219拯救这种与tau毒性相关的表型。
[0217] 实施例
[0218] 通过参考以下非限制性实施例可更好地理解本发明，呈现所述实施例以更充分地说明本发明的优选实施方案。它们决不应被理解为限制本发明的宽泛范围。
[0219] 实施例1-在死后阿尔茨海默氏病、缠结主导型痴呆和对照大脑中的微RNA表达[0220] 材料和方法
[0221] 患者样品是来自额叶皮层(布罗德曼区9)的去识别化的新鲜冷冻的人类尸检脑组织(表1)，其获自哥伦比亚大学的纽约脑库、肯塔基大学(Lexington,KY,USA)、加州大学圣地亚哥分校(San Diego,CA,USA)、Banner Sun健康研究所(Sun City,AZ,USA)和华盛顿大学(Seattle,WA,USA)。
[0222] 通过将新鲜冷冻的脑组织在液氮中粉碎，在QIAzol中裂解和使用QIAshredder柱匀浆化 来获得RNA分离。 使用miRNeasy试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)提 取总RNA。使用TRIzol纯化总RNA样品的子集并且获得类似结果(Invitrogen/Life Technologies,Carlsbad,CA)。在Agilent 2100生物分析仪系统上使用Agilent RNA 6000纳米测定法试剂盒和Nanodrop分光光度计(Thermoscientific,Waltham,MA)评估RNA。
[0223] 如先前在Hafner等(2011)中所述，通过使用条形码编码的小RNA cDNA文库进行小RNA测序和注释并且从新鲜冷冻提取的RNA准备后续汇集文库制备步骤。在两个条形码测序操作中对于所有样品产生微RNA表达谱。使用计算机管线来提取条形码，与基因组(hg19)比对并向读数指定小RNA注释。微RNA丰度被确定为具有至多两个注释错配的所有读数的总和并且以标准化读取频率呈现。将主导定义用于微RNA注释。在R/Bioconductor统计框架内进行热图产生和数据分析(Gentleman等(2004)；Anders和Huber(2010))。
[0224] 结果
[0225] 使用如Hafner等(2011)中所阐述的确定的小RNA测序方案分析在阿尔茨海默氏病(AD，n＝6)、缠结主导型痴呆(TPD，n＝3)和对照(n＝7)中的微RNA表达(示于表1中)。对于每个样品获得平均约1290万个序列读数(范围＝380-4720万)(表2)。回归分析揭示标准化读数计数之间的高度相关性(平均r2＝0.88，范围＝0.76-0.96)并且所有小RNA类别显示类似的读数分布(图1A和图1B)。对于所有受试者，微RNA读数高度富集，其中约86％的读数定位至已知微RNA并且其余定位至其他非编码小RNA，包括tRNA、snoRNA、snRNA、rRNA和piRNA(表2)。
[0226] 为了产生微RNA特征，比较来自AD、TPD和对照的标准化读取频率(图2A)。当通过特征分级时，观测到AD、TPD和对照中25种微RNA不同(p<0.05；单因素ANOVA，未调整，图2B)。鉴定在TPD与对照之间不同的11种微RNA，在AD与对照之间为20种，和在TPD与AD之间为6种。在所鉴定的微RNA中，仅源自mir-219-1和mir-219-2前体的那些已知具大脑特异性(Sempere等(2004))。值得注意的是，在神经元mir-124中未见到差异，这表明所观测到的差异并不是神经元损失继发性的。
[0227] 表1-患者数据的汇总
[0228]
[0229] SEM-平均值的标准误差；AD-阿尔茨海默氏病；TPD-缠结主导型痴呆：MCI-轻度认知障碍；CERAD斑块评分：0＝无；A＝稀少；B＝中等；C＝频繁
[0230]
[0231]
[0232] AD＝阿尔茨海默氏病；TPD＝缠结主导型痴呆；其他RNA＝piRNA、snRNA和snoRNA[0233] 实施例2-MAPT靶向的预测
[0234] 材料和方法
[0235] 目前，各种计算方法的整合是一种提高预测精度并产生用于破译微RNA的生物功能的最佳框架的常见方法(Zhang和Verbeck(2010))。在可用程序中，选择TargetScan(Friedman 等 (2009)；Lewis 等 (2005)；Grimson 等 (2007)；Garcia 等(2011)) 和 miRBase(Kozomara 和 Griffith-Jones(2011)；Griffith-Jones 等 (2008)；Griffith-Jones等(2006)；Griffith-Jones(2004))。TargetScan(公认的在多个物种之间具有结合位点保守的种子和序列互补性的算法)已显示在靶标验证后产生最精确的预测(Baek等(2008)；Selbach等(2008))。
[0236] 使用TargetScan来鉴定预测结合tau mRNA 3'UTR的候选微RNA(表3)。TargetScan也用于鉴定在脊椎动物(表4)和哺乳动物(表5)中广泛保守的微RNA家族以及能够结合其他微管相关蛋白子集的微RNA家族(表6)。
[0237] 结果
[0238] 使用用于可靶向tau mRNA的候选微RNA的生物信息学方法来分析在实施例1中获得的表达谱。在所有所检测微RNA中，9.61％被认为具大脑特异性(Sempere等(2004))并且14.13％被预测为靶向tau。在AD、TPD和对照中具显著差异的微RNA中，预测六种靶向tau(表3)。这些中的两种，miR-219-5p和miR-181d，都具有在脊椎动物中在tau 3'UTR内广泛保守的预测识别元件。在AD和TPD相比于对照中，miR-181d增加。相比之下，在AD和TPD相比于对照中，miR-219-5p降低。
[0239] 分别由6号和9号染色体上的不同基因产生的两种前体(称为mir-219-1和mir-219-2)可以产生相同的成熟miR-219-5p。在所得概况中，获得可忽略水平的miR-219-1-3p，这表明mir-219-2前体中的差异造成所观测的miR-219-5p变化(表7)。
[0240] 成熟miR-219-5p序列是高度保守的并且不同于miR-219-2-3p，其预测不靶向tau。相比之下，虽然miR-219-5p家族(miR-219-5/508/508-3p/4782-3p)识别元件不包含在其他代表性微管相关蛋白的3'UTR中，但是高度保守的miR-181识别元件存在于MAP1a、MAP1b和MAP23'UTR中，这表明miR-219-5p对MAPT源转录物的相对选择性(表6)。因此，miR-219-5p是被预测靶向tau的唯一高度保守的微RNA，其被观测为在AD和TPD大脑中下调。
[0241] 表3-被预测为靶向MAPT的在TPD、AD和对照中不同的人脑微RNA
[0242]
[0243] 显著值呈粗体。
[0244]
[0245]
[0246]
[0247]
[0248]
[0249]
[0250] MAP＝微管相关蛋白；粗体微RNA家族在脊椎动物中广泛保守的
[0251]
[0252]
[0253] 实施例3-微RNA-219-5p在死后AD、TPD和对照大脑中的差异表达的验证[0254] 材料和方法
[0255] 使用TaqMan微RNA测定法来测量AD(n＝7)、TPD(n＝19)和对照(n＝20)中的miR-219-5p水平(Applied Biosystems/Life Technologies,Carlsbad,CA)，并且验证实施例2的研究结果。
[0256] 使用特异性茎-环逆转录引物(Applied Biosystems)逆转录100ng总RNA并且在Mastercycler ep realplex(Eppendorf,Hamburg,Germany)上利用TaqMan微RNA测定法测量miR-219-5p水平。将U24/SNORD24和Z30/SNORD7的水平用作内源对照以使用比较CT方法进行标准化。
[0257] 结果
[0258] 使用TaqMan微RNA测定法来验证实施例2中阐述的研究结果，当与非痴呆对照进行比较时，发现AD和TPD样品中的miR-219-5p显著下调(p<0.05，Student t检验)(图3)。总之，这些结果证实，在AD和TPD相比于对照中，miR-219-5p表达降低。
[0259] 实施例4-通过微RNA调控Tau表达
[0260] 材料和方法
[0261] 使用以下引物从来自对照受试者(纯合MAPT H1)的基因组DNA扩增全长人类MAPT 3'UTR：
[0262] F：5'-AATTCTAGGC GATCGCTCGA GAAGCAGGGT TTGTGATCAGG-3'(SEQ ID NO:9)，和[0263] R：5'-ATTTTATTGC GGCCAGCGGC CGCGGTGCGT GGGAAAGAACTTA-3'(SEQ ID NO:10)[0264] 并且使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech/Takara Bio Inc.,Mountain View,CA)在双重萤光素酶报道基因psiCHECK-2载体(Promega,Madison,WI)的XhoI与NotI位点之间克隆。这种定量系统利用初级海肾萤光素酶报道基因和二级萤火虫萤光素酶报道基因表达盒进行标准化，其控制转染效率和细胞死亡。
[0265] 使用利用QuickChange引物设计产生的引物，通过使用QuickChange II XL定点诱变试剂盒(Agilent/Stratagene,Santa Clara,CA)来产生miR-219-5p识别元件的定点诱变。
[0266] miR-219位点_F：
[0267] 5'-CACGCTGGCTTGTGATCTTAAATGAGGGTCGATCCCCCAGGGCTGGGCACTC-3'；和miR-219位点_R:(SEQ ID NO:11)
[0268] 5'-GAGTGCCCAGCCCTGGGGGATCGACCCTCATTTAAGATCACAAGCCAG CGTG-3'。(SEQ ID NO:12)
[0269] 通过Sanger测序(Genewiz,South Plainfield,NJ)验证所有序列。
[0270] 在转染前24小时以每孔(在24孔板中)8×104个细胞的密度涂以SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。遵循制造商的方案，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)将含有MAPT 3'UTR的萤光素酶报道基因构建体与微RNA mirVana模拟物(Ambion)共转染。在指示实验中包括突变的miR-219-5p结合位点MAPT 3'UTR载体作为对照。在使用双重萤光素酶报道基因测定系统(Promega,Madison,WI)转染后48小时测量萤火虫和海肾萤光素酶活性。进行至少六次转染测定法以获得每种单独的条件的统计学显著数据。
[0271] 结果
[0272] 为了测定miR-219-5p是否可以在体外使tau表达沉默，将全长人类tau3'UTR插入海肾萤光素酶下游的双重萤光素酶报道基因构建体中并且将这种构建体与预测靶向tau的三种微RNA模拟物(即miR-219-5p、miR-181d、miR-485-5p)和并非(miR-217)者一起短暂共转染至人类神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)中。
[0273] 虽然miR-219-5p和miR-181d都在tau 3'UTR中具有高度保守的结合位点，但是miR-485-5p具有不良保守的六种。已发现，miR-219-5p(p＝0.0362)、miR-485-5p(p＝0.0115)和miR-181d(p＝0.0009)相比于模拟转染都能够显著降低萤光素酶活性，但miR-217不是如此(图4A)。
[0274] 此外，人类tau 3'UTR萤光素酶报道基因载体中的miR-219-5p识别元件的突变废止沉默(图4B)。这些研究结果表明，miR-219-5p使tau表达沉默是通过与tau 3'UTR中的预测和高度保守的识别元件的直接相互作用。
[0275] 实施例5-miR-219-5p调控原代海马神经元培养物中的Tau表达
[0276] 材料和方法
[0277] 也将人类 MAPT的全长 3'UTR克隆到慢病毒萤光素酶转移载体pLenti-Luc-UTR(Applied Biological Materials,Vancouver,British Columbia,Canada)中。
[0278] 使用以下引物扩增来自上述相同对照个体的基因组DNA：
[0279] Lenti-MAPT3'UTR-EcoRI_F：
[0280] 5'-TGGTGGCCTGCAGGTGAATTCAAGCAGGGTTTGTGATCAGG-3'(SEQ ID NO:13)；和LentiMAPT3'UTR-BamHI_R：
[0281] 5'-GAGCTGCAGTCTAGAGGATCCGGTGCGTGGGAAAGAA CTTA-3'(SEQ ID NO:14)[0282] 并且克隆到pLenti-UTR-Luc载体的EcoRI-BamHI位点中。使用慢病毒载体pEZX-MR03(Genecopoeia,Rockville,MD)制造人类mir-219前体序列和加扰微RNA对照。如Follenzi和Naldini(2002)所述进行含有miR-219前体或加扰对照和lenti-LucMAPT
3'UTR的慢病毒转移载体的慢病毒包裹和原料产生。
3'UTR的慢病毒转移载体的慢病毒包裹和原料产生。
[0283] 使用稳定地和组成型地表达SV40大T抗原并促进最佳慢病毒产生的人类HEK293T细胞系。在37℃下在5％CO2和95％空气的加湿气氛中使HEK 293T细胞(ATCC)在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素和100μg/ml链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)或DMEM/F12培养基(Cellgro)中生长。使用Global UltraRapid慢病毒滴定试剂盒(System Biosciences)进行慢病毒原料滴定。
[0284] 如Brewer等(1993)所述产生来自雄性和雌性新生大鼠的原代大鼠海马培养物。将海马培养物在37℃与5％CO2下保持在具有B27补充和Glutamax(Invitrogen)的5
Neurobasal培养基(Invitrogen)中并且以2.5×10个细胞/毫升的密度涂在涂有聚L-赖氨酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的盘上。在体外约14至21天后使用培养物。
Neurobasal培养基(Invitrogen)中并且以2.5×10个细胞/毫升的密度涂在涂有聚L-赖氨酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的盘上。在体外约14至21天后使用培养物。
[0285] 将原代海马培养物与含有miR-219前体或加扰对照和lenti-LucMAPT3'UTR的载体共转导。
[0286] 在72或96小时后，测定萤光素酶活性。
[0287] 结果
[0288] 由于还不清楚在神经母细胞瘤细胞中的观测结果在非肿瘤性神经元中是否有效，因此在大鼠原代海马神经元培养物中重现研究结果。miR-219-5p识别元件与人类tau3'UTR之间的相互作用是高度保守的，证明了这种细胞模型的用途。
[0289] 将这些培养物与含有整个tau 3'UTR和miR-219-5p或加扰对照的慢病毒构建体共转染。在72小时后，观测到miR-219-5p表达增加六倍(图5D)。当将miR-219-5p和tau3'UTR慢病毒构建体共转导至海马培养物中时，观测到3'UTR活性显著降低。与加扰对照微RNA慢病毒没有差异(图6A)。用慢病毒miR-219-5p而非加扰对照转导也显著降低内源tau蛋白的表达(图6B)。实时QPCR表达分析未显示用慢病毒miR-219-5p或加扰对照转导的这些培养物中的tau mRNA水平的显著差异，表明miR-219-5p的机制是阻遏蛋白质翻译(图6C)。
[0290] 实施例6-通过miR-219降低NGF诱导的Tau表达和神经突起生长
[0291] 材料和方法
[0292] 将PC12细胞或原代海马神经元用4.0％多聚甲醛(Thermo Fisher Scientific/Pierce,Rockford,IL)固定并用0.4％Triton X-100(Sigma-Aldrich)的PBS溶液渗透，用于TBS中的SuperBlock缓冲液(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)阻断，并在MAP2(Cell Signaling,Danvers,MA)或TauC抗血清(DAKO,Glostrup,Den-mark)中温育过夜。使用与Alexa Fluor染料(Invitrogen)结合的抗小鼠二级抗血清。
[0293] 使用配备有40×1.3NA和100×1.4NA油浸物镜的LSM 510Meta共焦显微镜和Zeiss observer Z1或AxioObserver Z1显微镜(Carl Zeiss,Oberkochen,DE)对标记的PC12细胞或神经元成像。扫描使用氩激光器的两种激发线(对于Alexa Fluor-488为488nm，对于Alexa Fluor-568为568nm)。对于共焦图像，在1.0μm间隔下收集Z堆叠并且然后压缩成单一图像以使用Volocity成像软件(速度采集和速度可视化，PerkinElmer)进行分析。对于AxioOb-server荧光成像，使用Axiovision Rel 4.8.2。
[0294] 如Greene和Tischler(1976)以及Grau和Greene(2012)先前所述，在具有补充有10％热灭活马血清和5％胎牛血清的RPMI 1640培养基的涂有胶原蛋白的盘中培养PC12细胞。用于PC12的神经元分化培养基含有NGF(每毫升100ng人类重组蛋白)和补充有1％热灭活供体马血清的RPMI1640培养基。
[0295] 通过利用SDS-PAGE解析总蛋白来进行免疫印迹法并使用标准程序进行反式印迹。将硝基纤维素膜(BioRad,Hercules,CA)与TauC(DAKO,Glostrup,Denmark)、β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和二级抗体(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)温育，并且使用ECL试剂盒(Millipore,Billerica,MA)和Biomax光膜(Sigma-Aldrich)通过化学发光揭示。
[0296] 结果
[0297] 已证实微RNA能够调控tau表达，询问它们是否可在生理情形下调控tau。以前的研究已证实，在暴露于神经生长因子(NGF)后，tau蛋白在PC12细胞中的神经突起生长中发挥功能作用(Drubin等(1985)；Drubin等(1988))。
[0298] 向PC12细胞施用NGF可诱导分化成具有神经突起生长的神经元样细胞，其中伴随着tau mRNA和蛋白质水平的增加(图7A和图7B)。
[0299] 有趣的是，已发现，NGF在三天时也诱导短暂的miR-219-5p降低，但是一旦细胞在七天时已完全分化，其就返回到基线(图7C)。
[0300] 为了确定miR-219-5p中的这些变化是否在tau介导的神经突起生长中起到直接作用，miR-219-5p在暴露于NGF的PC12细胞中过度表达。QPCR证实miR-219-5p的过度表达(图7D)。在NGF处理的PC12细胞中的免疫印迹法和QPCR分析证实，miR-219-5p的慢病毒过度表达削弱tau mRNA和蛋白质表达(图7E和图7F)。虽然观测到在miR-219-5p处理后tau mRNA水平降低约35％，但是也观测到tau蛋白水平降低约75％。
[0301] 在NGF处理的PC12细胞中利用识别tau的抗血清进行的免疫荧光显微镜证实，NGF处理导致神经突起生长(图7G和图7H)。已经用慢病毒miR-219-5p和GFP报道基因转导的细胞显示，所述细胞相比于未感染细胞不能扩展tau阳性过程(图7I-K)。这些结果表明，通过在转录后水平上直接影响tau表达，可利用miR-219-5p来调控NGF对tau介导的神经突起生长的影响。如使用针对tau的抗血清通过免疫荧光共焦显微镜所观测的miR-219-5p和GFP报道基因的过度表达证实如通过合并图像所证实的神经突起生长废止。注意到，未用miR-219-5p构建体转导的细胞维持其精心设计神经突的能力。
[0302] 实施例7-果蝇Tau 3'UTR中的miRNA识别元件
[0303] 材料和方法
[0304] 对果蝇基因组使用实施例2中所述的TargetScan。
[0305] 结果
[0306] 果蝇基因组的研究揭示出具有延伸1439个碱基对的先前不完全注释的3'UTR区并含有如表8中所示的miR-219识别元件的tau基因。
[0307]
[0308]
[0309] TargetScan预测以下位点类型：8mer：与成熟miRNA的2-8位精确匹配(种子+8位)，接着是'A'。m8：与成熟miRNA的2-8位精确匹配(种子+8位)。1a：与成熟miRNA的2-8位精确匹配(种子)，接着是'A'(6)。
[0310] 实施例8-miR-219在黑腹果蝇中的过度表达导致神经功能障碍和降低的Tau表达[0311] 材料和方法
[0312] 过度表达全长miR-219微RNA的黑腹果蝇获自布鲁明顿库存中心(Bloomington stock center)。这些苍蝇在泛神经元ELAV驱动子中过度表达miR-219。
[0313] 相对于对照苍蝇和过度表达微RNA miR-34的苍蝇，目测研究所述苍蝇的表型。它们也进行负趋地性或攀爬测定法。
[0314] 果蝇免疫印迹法
[0315] 在补充有Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液(Thermo Scientific)的神经元蛋白质提取试剂(N-PER)中将成年果蝇匀浆化。溶胞产物在冰上温育10分钟并且在4℃下在13,000x g下离心15分钟。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific)测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE解析样品并通过Western印迹法进行分析。将硝基纤维素膜(BioRad,Hercules,CA)与抗果蝇tau抗体(来自Dr.Nick Lowe,UK的慷慨礼物)、β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和二级抗体(Thermo Fisher Scientific)温育，并且使用ECL试剂盒(Millipore,Billerica,MA)和Biomax光膜(Sigma-Aldrich)通过化学发光揭示。
[0316] 也使用靶向果蝇tau(dTau)的来自Dr.Nick Lowe的抗血清对每组代表性苍蝇的整个苍蝇、仅头部和仅身体的蛋白质提取物进行免疫印迹法。
[0317] 结果
[0318] 如图8A中所示，相比于图8B中的对照，过度表达miR-219的苍蝇具有举翅表型。
[0319] 当进行负趋地性或攀爬测定法时，过度表达miR-219的苍蝇(中间圆柱体)不能像对照(左侧圆柱体)和过度表达miR-34的苍蝇一样攀爬得那么高，其在苍蝇tau3'UTR(右侧圆柱体)中不含保守识别元件。也参见图8D。
[0320] 这种测定法以及举翅表型显示飞行肌弱。
[0321] 相比于对照和过度表达miR-34的苍蝇，过度表达miR-219的苍蝇也降低tau表达(图8E-G)。
[0322] 实施例9-mir-219在黑腹果蝇中过度表达导致Tau表达降低的其他证据
[0323] 材料和方法
[0324] 果蝇品系
[0325] 果 蝇miR-219 或 加 扰 对 照 系(来 自 Eric C.Lai的 慷 慨 礼 物)源 自UAS-DsRed-miRNA质粒集合(Bejarano等(2012)；Silver等(2007))。miRNA插入物包括在每侧侧接miRNA前体发夹的约200-250个核苷酸并且是从w1118或Canton S基因组DNA扩增的。
[0326] 为了产生果蝇miRNA海绵(miR-219海绵)或加扰对照，将与为增强稳定性在9-12位具有错配的miRNA互补的十种重复序列引入pUAST表达载体中的EGFP或mCherry的3′UTR中(Loya等(2009)；Ebert和Sharp(2010))。
[0327] 使用一系列果蝇phiC31相容性GAL4-UAS载体(称为pBID(attB、孤立、果蝇))产生转基因萤光素酶报道基因果蝇系，其表达与对照GAPDH3'UTR(200bp；缺乏miR-219结合位点)或人类tau 3'UTR(4162bp)融合的萤光素酶编码区(Wang等(2012))。使用泛神经元elav-GAL4驱动子来驱动转基因表达。所有果蝇杂交都维持在25℃。
[0328] 根据Bejarano等(2012)，miRNA-219在果蝇的神经元中过度表达。
[0329] 如实施例7中所述进行免疫印迹法。
[0330] 果蝇萤光素酶报道基因测定法
[0331] 使果蝇萤光素酶报道基因系与miR-219或miR-219海绵系杂交。使用泛神经元elav-GAL4驱动子来驱动转基因表达。使用萤光素酶报道基因测定系统
(Promega,Madison,WI)从汇集成年果蝇头部的溶胞产物测量萤光素酶活性。将具有GAPDH
3'UTR的对照系用于标准化。
(Promega,Madison,WI)从汇集成年果蝇头部的溶胞产物测量萤光素酶活性。将具有GAPDH
3'UTR的对照系用于标准化。
[0332] 果蝇定量PCR
[0333] 从完整果蝇分离总RNA。简言之，将苍蝇溶解在QIAzol中并使用QIAshredder柱匀浆化。使用miRNeasy试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)提取总RNA。利用Nanodrop ND-1000分光光度计测量RNA浓度。使用First Strand cDNA合成试剂盒(Origene,Rockville,MD)根据制造商的说明来逆转录等量的RNA。使用TaqMan基因表达测定法(AppliedBiosystems,Foster,CA)进行果蝇tau和内源对照RpL32的QPCR。使用Mastercycler ep realplex(Eppendorf,Hauppauge,NY)在以下条件下利用MicroAmp光学96孔板一式三份地进行实时PCR反应：初始步骤为在95℃下10分钟，接着进行40次在96℃下15秒、在60℃下
1分钟的循环。使用TaqMan微RNA测定法来测量miR-219-5p水平(Applied Biosystems)。
使用特异性茎-环逆转录引物(TaqMan微RNA测定法，Applied Biosystems)逆转录总RNA并且在Mastercycler ep realplex(Eppendorf)上用TaqMan微RNA测定法测量miR-219-5p水平。将2srRNA水平用作内源对照以使用比较CT方法进行标准化。每个数据点是各自由三个技术重复组成的至少三个生物学重复的结果。
1分钟的循环。使用TaqMan微RNA测定法来测量miR-219-5p水平(Applied Biosystems)。
使用特异性茎-环逆转录引物(TaqMan微RNA测定法，Applied Biosystems)逆转录总RNA并且在Mastercycler ep realplex(Eppendorf)上用TaqMan微RNA测定法测量miR-219-5p水平。将2srRNA水平用作内源对照以使用比较CT方法进行标准化。每个数据点是各自由三个技术重复组成的至少三个生物学重复的结果。
[0334] 结果
[0335] 当miR-219在苍蝇大脑中过度表达时，如通过免疫印迹法所示，相比于加扰miRNA对照，发现tau蛋白水平的非常显著的降低(63.8％；P<0.00)(图9A、图9B和图9E)。
[0336] 使用海绵抑制剂，即当在果蝇神经元中表达时显著降低miR-219水平的含有多个串联miR-219结合位点的重组转录物，降低miR-219水平(图9F)。如通过免疫印迹法所示，相比于对照，miR-219海绵的表达导致内源tau蛋白水平显著增加(23.1％；P<0.05)(图9A和图9B)。如通过定量PCR所测量，miR-219海绵的过度表达导致果蝇tau mRNA显著增加(22％；P<0.05)(图9C)。然而，在miR-219过度表达后的果蝇tau mRNA水平不变，这表明对mRNA水平和翻译的影响。
[0337] 扩展分析并证实miR-219也能够在体内调控人类tau 3'UTR活性。产生转基因果蝇，其表达与人类tau 3'UTR融合的萤光素酶报道基因。已发现，相比于加扰对照，miR-219的过度表达显著降低人类tau 3'UTR构建体的萤光素酶活性。相比之下，miR-219海绵抑制剂显著增加萤光素酶活性，证实tau调控在进化上保守的双向机制(图9D)。
[0338] 实施例10-通过miR-219废止人类Tau在果蝇眼睛中的毒性
[0339] 材料和方法
[0340] 研究已证实，tau的过度表达导致果蝇中显著的粗糙眼表型(Jackson等(2002)；Wittman等(2001)；Williams等(2000))。为了测定miR-219是否影响tau毒性，使miR-219和htau(不具有3'UTR)在果蝇眼睛中共表达。使用在实施例9中所述的一系列pBID载体产生仅表达htau蛋白编码区(不具有其3'UTR)的转基因果蝇。用转基因miR-219苍蝇(Bloomington stocks)、miR-219海绵抑制剂(如实施例9中所述)或加扰miR(Dr.Van Vactor的慷慨礼物)进行杂交。使用GMR-GAL4驱动子在眼睛中特异性表达转基因。在羽化后2天记录眼睛表型(n＝3)。
[0341] 结果
[0342] 仅表达GMR驱动子的对照苍蝇显示正常的眼睛表型(图10A)。如所预测，相比于对照，仅htau的过度表达导致粗糙眼表型(眼睛大小降低和不规则形态)(图10B)。htau和miR-219的共同过度表达导致粗糙眼表型的部分逆转，与保护性作用一致(图10C)。相比之下，htau和miR-219海绵的共同过度表达导致表型恶化，从而证实双向性(图10D)。htau和加扰miRNA对照的共同过度表达不拯救粗糙眼表型(图10E)。
[0343] 这些结果证实，miR-219影响tau毒性。这种研究结果促使如下假设：miRNA直接地(可能是通过降低内源苍蝇tau)、通过GSK3β间接地(因为这种htau转基因缺乏功能性miR-219位点)或两者来调控tau毒性。
[0344] 实施例11-人类Tau 3'UTR含有改善果蝇眼睛中的Tau毒性的顺式作用元件[0345] 材料和方法
[0346] 通过在不具有合成SV40多聚腺苷酸化位点的Gateway盒上游插入htau蛋白编码区序列以修饰实施例10中所述的pBID载体骨架来产生过度表达与htau 3'UTR融合的htau编码序列的苍蝇。然后插入人类GAPDH和tau 3'UTR。在商业上生成苍蝇。利用实施例10中所述的GMR驱动子获得在眼睛中的表达。
[0347] 结果
[0348] 仅表达GMR驱动子的对照苍蝇显示正常的眼睛表型(图11A)。如所预测，相比于对照，与GADPH 3'UTR融合的htau的过度表达导致粗糙眼表型(眼睛大小降低和不规则形态)(图11B)。相比之下，与tau 3'UTR融合的tau的过度表达降低粗糙眼的严重程度，从而指示在tau 3'UTR中存在保护性顺式作用调控元件(图11C)。
[0349] 实施例12-MiR-219被预测具有除Tau之外的其他靶标
[0350] 材料和方法
[0351] 使用如实施例2中所述的TargetScan，使用miR-219的预测靶标的FuncAssociate2.0(Berriz等(2009))进行功能趋势分析。
[0352] 结果
[0353] 如表9中所示，miR-219被预测在神经元分化、轴突发育和基因表达中起作用。
[0354] 表9-预测miR219靶标的功能趋势分析过度表现的属性
[0355]基因本体论ID 名称 p(调整)
GO:0010628 基因表达的阳性调控 <0.001
GO:0022008 神经发生 <0.001
GO:0030182 神经元分化 <0.001
GO:0031175 神经元投射发育 <0.001
GO:0048666 神经元发育 <0.001
GO:0061564 轴突发育 0.042
GO:0007399 神经系统发育 0.004
GO:0010628 基因表达的阳性调控 <0.001
GO:0022008 神经发生 <0.001
GO:0030182 神经元分化 <0.001
GO:0031175 神经元投射发育 <0.001
GO:0048666 神经元发育 <0.001
GO:0061564 轴突发育 0.042
GO:0007399 神经系统发育 0.004
[0356] 实施例13-在AD和TPD患者中差异表达的其他miRNA的证据
[0357] 材料和方法
[0358] 使用来自五名对照、五名仅缠结型痴呆患者和三名阿尔茨海默氏病患者的如实施例1中所述的患者样品。通过如实施例1中所述的Trizol或Qiagen分离RNA。将约0.5μg总RNA装载在具有总共约250,000个细胞并且每个反应约5个细胞的SmartChip(Wafergen Biosystems)上。将样品装载在3.0版SmartChip miRNA面板上，进行1,036次miRNA测定，各自具有四个技术重复。另外，使用七次内源芯片上对照测定法和四次内源酵母cDNA片段工艺控制。参见表10。
[0359] 统计学利用在来自biogazelle的qbaseplus中的Mann-Whitney检验。
[0360] 表10-样品信息和芯片统计
[0361]
[0362]
[0363] *-省略NTC
[0364] RIN-RNA完整数目
[0365] 结果
[0366] 在阿尔茨海默氏病(AD)组与对照组之间，78种miRNA显示显著差异(p≤0.05)。在这78种中，有33种下调并且列于表11中并且有45种上调并列于表12中。
[0367] 表11-在阿尔茨海默氏病相对于对照组中下调的miRNA(p≤0.05)
[0368]
[0369]
[0370] 表12-在阿尔茨海默氏病相对于对照组中上调的miRNA(p≤0.05)*
[0371]
[0372]
[0373] 152种miRNA在仅缠结(TOD)组与对照组之间显示显著差异。36种miRNA在TOD与对照组之间显示显著差异(p≤0.01)，48种miRNA在TOD与对照组之间显示显著差异(0.01≤p<0.02)，并且68种miRNA在TOD与对照组之间显示显著差异(0.02≤p<0.05)。
[0374] 在152种中，有76种下调并列于表13中，并且有76种上调并列于表14中。
[0375] 表13-在TOD相对于对照组中下调的miRNA(p≤0.05)
[0376]
[0377]
[0378]
[0379] 表14-在TOD相对于对照组中上调的miRNA(p≤0.05)
[0380]
[0381]
[0382]
[0383] 54种miRNA在TOD与AD组之间显示显著差异(p≤0.05)。有20种从TOD开始相比于AD下调并列于表15中，并且有34种从TOD开始相比于AD上调并列于表16中。
[0384] 表15-在TOD与AD组之间下调的miRNA(p≤0.05)
[0385]
[0386] 表16-在TOD与AD组之间上调的miRNA(p≤0.05*)
[0387]
[0388]
[0389] 实施例14-miR-219、miR181和其他miRNA被预测为靶向GSK3β和其他Tau磷酸酶
[0390] 材料和方法
[0391] 使用如实施例2中所述的TargetScan算法，对于由于3'UTR上的识别位点而预测靶向tau的miRNA家族(表6)测试其与牵涉于tau蛋白病中的其他蛋白的mRNA的3'UTR的潜在结合。
[0392] 结果
[0393] 如表17中所示，miRNA家族miR-219-5p/508/508-3p/4782被预测不仅靶向GSK3β，而且靶向tau蛋白病中所牵涉的其他激酶(包括PKC1、TTBK1、CAMK2G和PKA)。此外从表17可见，miR181abcd/4262miRNA家族也靶向GSK3β和其他磷酸酶。此外被预测靶向tau的其他miRNA(包括来自miRNA家族miR-204/204b/211、miR146ac/146b-5p、miR132/212/212-3p和miR34ac/34bc-5p/449abc/449c-5p的那些)也被预测靶向这些其他蛋白。
[0394] 表17-被预测靶向Tau蛋白病中所牵涉的激酶的miRNA家族
[0395]
[0396] 实施例15-其他微RNA对Tau表达的调控
[0397] 材料和方法
[0398] 使用与实施例4中一样的萤光素酶报道基因系统和细胞。
[0399] 将全长人类tau 3'UTR插入海肾萤光素酶下游的双重萤光素酶报道基因构建体中并且使用FuGene(Promega)将这种构建体与预测靶向人类tau 3'UTR的作为保守微RNA的六种微RNA mirVana模拟物(Ambion)(即miR-219-5p、miR-181-5p、miR-34c-5p、miR-132-3p、miR-27a-5p和miR-204-5p)一起短暂共转染至人类神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)中。
[0400] 使用控制转染效率的双重萤光素酶报道基因(Promega)在48小时后测定萤光素酶活性(n＝8)。
[0401] 结果
[0402] 已发现，相比于对照(仅htau 3'UTR)，miR-219-5p与miR-181、mir-34、miR-132、miR-27和miR-204都能够显著降低萤光素酶活性(图12)。这些研究结果表明，这些微RNA使tau表达沉默是通过与tau 3'UTR中预测和高度保守的识别元件的直接相互作用。
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