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一种分泌表达屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌及其应用

阅读：287发布：2020-05-18

专利汇可以提供一种分泌表达屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及通过对屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）的主要过敏原Derp2的基因进行密码子优化得到优化后的基因mderp2，并以此为基础构建分泌表达过敏原Derp2的重组表达质粒pNZ8148-SD和重组乳酸乳球菌L.lactisSD（保藏号为CGMCC No.8223）。Western blot结果表明本发明的重组乳酸乳球菌L.lactis SD可实现过敏原Derp2的分泌表达；同时，动物实验结果显示口服重组乳酸乳球菌L.lactis SD可增加小鼠脾脏内调节性T细胞的水平，降低小鼠体内由尘螨过敏原Derp2引发的过敏反应，具有较好的预防作用。，下面是一种分泌表达屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基因优化的屋尘螨过敏原Derp2，该过敏原基因mderp2的序列为SEQ ID No.1。
2.如权利要求1所述的基因优化的屋尘螨过敏原Derp2，其特征在于所述过敏原基因是通过对来源于屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）的主要过敏原Derp2的天然基因序列SEQ ID No.2进行基因优化后获得的。
3.一种分泌表达基因优化的屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactisSD，于
2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.8223。
4.如权利要求3所述的分泌表达基因优化的屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactis SD，其特征在于所述菌株是通过将优化后的过敏原基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表达质粒pNZ8148上，构建分泌表达型质粒pNZ8148-SD，再将获得的分泌表达型质粒电转入宿主菌株L.lactis NZ9000而获得的。
5.将权利要求1或2中任意一项所述的过敏原用于预防屋尘螨过敏疾病的用途。
6.将权利要求3或4中任意一项所述的乳酸乳球菌用于预防屋尘螨过敏疾病的用途。

说明书全文

一种分泌表达屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌及其

应用

背景技术

[0001] 过敏性疾病是临床上的常见病、多发病，是当前世界性的重大卫生学问题。其中，在引发过敏性疾病的众多吸入性过敏原中，尘螨是导致呼吸道变态反应性疾病的重要因素之一。尘螨是一类结构和成分复杂的生物，目前人们已从尘螨的数百种蛋白中初步鉴定出几十种过敏原；过敏原Derp2是其中最为主要的过敏原之一，约80%-90%的尘螨过敏患者对Derp2产生过敏反应。特异性免疫治疗（SIT）被认为是最有效的治疗过敏的方法，但成功的免疫治疗取决于高质量的变应原。目前，临床上用于诊断和治疗的尘螨粗提液含有大量非特异性杂质，严重阻碍了尘螨过敏原试剂的临床应用。为获得高质量的变应原，从天然产物中分离纯化过敏原（专利申请号：200410022961.9），操作繁复且纯度不高，重复性较差；利用分子生物学技术，在大肠杆菌（专利申请号：201210139240.0）、酵母等表达系统中表达过敏原Derp2被认为是一种可行的策略，但其安全性及后续过敏原的纯化限制了这些表达系统的实际应用。

[0002] 近几年，随着对乳酸菌性质的不断研究，其益生特性逐渐被人们所认识并接受，特别是在治疗一些慢性疾病和自身免疫性疾病，如过敏，肠炎等，具有普通药物所不具备的优势。以乳酸菌作为表达系统，使抗原或其他功能性蛋白在粘膜表面进行表达释放，可以有效的避免传统表达系统（大肠杆菌）所带来的安全隐患及后续抗原的纯化问题，同时避免了在口服过程中蛋白的降解和口服耐受，更能促进抗原或功能性蛋白被免疫系统所吸收等。

[0003] 外源蛋白在乳酸菌中的表达方式有三种，其中在信号肽作用下将目的蛋白分泌到培养基中是最为主要的一种方式。多项实验结果表明乳酸菌以分泌表达的形式在肠道粘膜表面表达功能性蛋白分子（如IL-10,IL-12）可以起到非常明显的治疗效果。此外，抗原蛋白（如花粉、人乳头状瘤病毒等）在乳酸菌内的分泌表达可以起到明显的预防疾病发生的作用。本实验为使尘螨过敏原Derp2在乳酸乳球菌内高效表达并发挥较好的预防效果，我们对Derp2的天然基因进行了密码子优化，并构建了分泌表达过敏原Derp2重组乳酸乳球菌L.lactis SD；同时通过动物实验对其预防尘螨过敏疾病的效果进行了研究。发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种基因优化的屋尘螨过敏原Derp2，提供一种分泌表达基因优化后的尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactis SD（保藏号为CGMCC No.8223），提供将所述过敏原用于预防屋尘螨过敏疾病的用途，提供将所述重组乳酸乳球菌用于预防尘螨过敏疾病的用途。

[0005] 一方面，本发明提供了一种基因优化的屋尘螨过敏原Derp2，该过敏原基因mderp2的序列为SEQ ID No.1。

[0006] 所述的基因优化的屋尘螨过敏原Derp2基因是通过对来源于屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）的主要过敏原Derp2的天然基因序列SEQ ID No.2进行基因优化后获得的。

[0007] 另一方面，本发明提供了一种分泌表达基因优化的屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactis SD（保藏号为CGMCC No.8223），所述菌株是通过将优化后的基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表达质粒pNZ8148上，构建分泌表达型质粒pNZ8148-SD，再将获得的分泌表达型质粒电转入宿主菌株L.lactis NZ9000而获得的。

[0008] 另一方面，本发明提供了将所述过敏原用于预防屋尘螨过敏疾病的用途。

[0009] 再一方面，本发明提供了将上述菌株用于预防尘螨过敏疾病的用途。

[0010] 本发明涉及的一种分泌表达基因优化的屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactis SD，于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.8223。附图说明

[0011] 图1表示屋尘螨过敏原Derp2基因突变位点对照图。

[0012] 图2表示重组乳酸乳球菌中Derp2蛋白的Western blot检测。

[0013] 如图：最左侧为蛋白分子Marker；1号泳道：纯化的Derp2，用作阳性对照；2号泳道：重组菌株L.lactis SD培养液上清；3号泳道和4号泳道：分别是对照菌株L.lactis8148（不含Derp2的基因序列）培养基上清和细胞破碎液

[0014] 图3表示小鼠免疫的过程。

[0015] 首先进行小鼠尘螨过敏模型的构建，具体的构建过程分为三个阶段：首先在0-4天及7-11天进行灌胃预防处理（200μl菌体或生理盐水）；在第17、24、31天进行腹腔注射Derp2/Alum（Pierce，美国）（200μl）的混合物，使小鼠产生过敏反应；最后一个阶段为雾化阶段，通过雾化激发器将Derp2蛋白进行雾化，使小鼠通过自然呼吸的方式吸入体内。

[0016] 图4表示口服重组乳酸乳球菌对小鼠体内过敏原特异性抗体的影响。

[0017] Positive：阳性对照组小鼠；Negative：阴性对照组小鼠；8148：灌胃对照菌株L.lactis8148（不含Derp2基因）的小鼠；SD：灌胃重组菌株L.lactis SD的小鼠；ND：灌胃重组菌株L.lactis ND的小鼠

[0018] 图5-1表示肺部的组织形态观察(HE染色)；

[0019] 图5-2表示肺部的组织形态观察（甲苯胺蓝染色）；

[0020] A：阳性对照组；B：阴性对照组;C:灌胃L.lactis8148（空质粒）的小鼠；D：灌胃重组菌株L.lactis SD的小鼠；

[0021] 图6表示不同组别的小鼠脾脏内调节性T细胞的水平

[0022] A：阳性对照组小鼠；B：灌胃L.lactis ND菌株的小鼠；C：灌胃L.lactis SD菌株的小鼠；D：阴性对照组小鼠

[0023] 本发明具有以下优点：

[0024] 目前，临床使用的尘螨变应原制剂多为通过对人工饲养的尘螨进行灭活处理后分离纯化得到的混合物，其成分复杂，用于SIT治疗存在着无法避免的副作用。本发明所用的乳酸菌疫苗因为乳酸菌的可食用性，不用经过灭活及纯化处理即可用于临床使用。此外，乳酸菌作为一种常见的微生物，培养及后续操作过程简单，成本较低，可以通过制成粉状制剂、胶囊等形式的药品，携带方便，无需特殊条件即可自行服用。相比传统的皮下注射方式，乳酸菌疫苗的口服方式更易为病人所接受，同时通过口服方式更容易使机体产生免疫耐受，缩短治疗时间。实施例

[0025] 下面将结合具体实施例对本发明做更详细的说明。

[0026] 1、根据乳酸乳球菌基因组数据，分析乳酸乳球菌的密码子偏好性、GC含量等参数，将来源于屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）的主要过敏原Derp2的天然基因序列该修饰性过敏原的基因序列为SEQIDNo.2（genebank：AF276239.1）进行密码子优化，得到可以在乳酸乳球菌内高效表达的基因mderp2，该基因的序列为SEQ ID No.1；

[0027] 2、将优化后的基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表达质粒pNZ8148（中国科学院钟瑾研究员惠赠）上，获得分泌表达型质粒pNZ8148-SD，并将表达质粒电转入宿主菌株L.lactis NZ9000（中国科学院钟瑾研究员惠赠）中，得到重组菌株L.lactis SD，保藏号为SD CGMCC No.8223。

[0028] 3、用Western blot检测重组乳酸乳球菌L.lactis SD中重组蛋白Derp2的表达，发现在重组乳酸乳球菌L.lactis SD的上清液中可成功检测到Derp2的表达信号；

[0029] 4、动物实验结果说明，相比口服生理盐水和胞內表达过敏原的重组乳酸乳球菌的对照小鼠，口服重组乳酸乳球菌L.lactis SD可通过增加脾脏内调节性T细胞的水平，降低实验小鼠体内Derp2特异性的IgE的水平和肺部炎症反应，抑制过敏疾病的发生。技术细节

[0030] 1、尘螨过敏原Derp2天然基因的优化

[0031] 参照尘螨过敏原Derp2天然基因序列SEQ ID No.2（GeneBank：AF276239.1），基于乳酸乳球菌基因组的特点，根据GC含量、稀有密码子使用情况等对其进行基因优化，得到优化后的基因序列mderp2（SEQ ID No.1），人工合成后克隆到质粒pUC57（生工生物工程（上海）有限公司）上，得到pUC57-mderp2质粒。

[0032] 尘螨过敏原Derp2基因优化后的基因序列mderp2：SEQ ID No.1。

[0033] 尘螨过敏原Derp2的原始基因序列AF276239.1：SEQ ID No.2。

[0034] 尘螨过敏原Derp2的氨基酸序列：SEQ ID No.3。

[0035] 2、乳酸乳球菌表达质粒的构建

[0036] 以乳酸乳球菌NZ9000的基因组为模板，以SPusp45-F

[0037] （cgaattcCATGGTGAAAAAAAAGATTATCTCAGC）和SPusp45-R

[0038] （ggggtaccCAGCGTAAACACCTGACAAC）为引物，采用PCR的方法扩增信号肽基因SPusp45（GeneBank:EU382094.1）（PCR程序为：95℃30s，57℃30s,72℃30s,30个循环；PCR反应体系：5μl dNTPs(2mM),5μl 10×Buffer,1μl TaqE,上下游引物各1μl,模板
1μl），以PCR产物纯化试剂盒回收目的片段，然后以内切酶NcoI和KpnI在37℃条件下反应3小时，再经PCR产物纯化试剂盒回收得到目的片段-SPusp45；同时以人工合成的质粒pUC57-mderp2为模板，以8N-F’

[0039] （ggggtaccGATCAAGTTGATGTTAAAGATTGTGC）和8N-R

[0040] （gtctagaTTAATCACGAATTTTAGCATGAGTAG）为引物，以PCR的方法扩增目的基因mderp2，经PCR产物纯化试剂盒回收目的片段，以内切酶KpnI和XbaI在37℃条件下反应3小时后，纯化回收目的片段-mderp2；然后将-SPusp45、-mderp2片段与酶切处理的质粒片段pNZ8148进行连接后得到表达质粒pNZ8148-SD，电转入乳酸乳球菌NZ9000中，得到重组菌株L.lactis SD（保藏号为SD CGMCC No.8223）。该菌株已于2013年9月18日交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。

[0041] 3、重组菌株L.lactis SD上清中过敏原Derp2的检测

[0042] 重组乳酸乳球菌L.lactis SD活化后，按1:50接种于50ml GM17培养基（1000ml培养基：胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母粉2.5g，β-磷酸甘油二钠19g，维生素C0.5g，1M MgSO4 1ml，葡萄糖5g）中(含10μg/ml的氯霉素)，在30℃培养至OD600=0.5，加入nisin（Sigma-Aldrich）至终浓度10ng/ml，诱导培养6小时后；8000rpm离心5min，收集上清液。

[0043] 分泌蛋白样品的处理：取1.7ml上清液加入2mlEP管中，然后加入300μl 100%三氯乙酸（100%TCA）混合均匀后，放在冰上2h，然后13000rpm离心10min；加入1ml预冷的丙酮，将沉淀重悬并离心，重复两次；然后室温下晾干，加入100μl 50mMNaOH重悬，最后加入100μl 2x loading buffer（250mMTris-HCl，10%(w/v)SDS,50%(w/v)甘油,5%(w/v)β-巯基乙醇），在沸水中煮10min；

[0044] 所有样品取15μl上样，经5-12%SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜(Millipore公司，美国)上，分别用Derp2特异性多克隆抗体（一抗）（京天成生物技术(北京)有限公司）及HRP标记的羊抗兔IgG抗体（二抗）（Thermo，美国）杂交后，加入eECL显色液（北京康为世纪生物科技有限公司）避光显色，检测结果如图2所示。

[0045] 实验结果及结论：1号泳道可以检测蛋白信号（阳性对照），分子量大小为17KDa左右；2号泳道可检测到同1号泳道分子量大小相同的蛋白信号，同时在3,4号泳道检测不到信号；结果说明过敏原Derp2蛋白可以在重组菌株L.lactis SD内特异性表达。

[0046] 4、动物实验

[0047] 参见图3，进行小鼠尘螨过敏模型的构建，具体的构建过程分为三个阶段：首先在0-4天及7-11天进行灌胃预防处理（200μl菌体或生理盐水）；在第17、24、31天进行腹腔注射Derp2/Alum（Pierce，美国）（200μl）的混合物，使小鼠产生过敏反应；最后一个阶段为雾化阶段，通过雾化激发器将Derp2蛋白进行雾化，使小鼠通过自然呼吸的方式吸入体内。

[0048] 小鼠灌胃乳酸乳球菌的制备：乳酸乳球菌活化后，按照1:50的比例接入GM17培养基中（加入10μg/ml氯霉素）进行培养，至OD=0.5左右，然后加入nisin至终浓度10ng/ml,30℃培养6h后，8000rpm 5min离心收集菌体，用预冷的灭菌的生理盐水洗涤2遍后，加10
入一定体积的生理盐水，调整菌落数为1x10 CFU/ml，取200μl进行小鼠灌胃。

[0049] 实验组的设计：

[0050] 阳性模型组：灌胃生理盐水，然后进行腹腔注射；

[0051] SD、ND、8148模型组：分别用重组菌株L.lactis SD、L.lactis ND和L.lactis8148（空质粒）进行灌胃，并且进行腹腔注射处理；

[0052] 阴性模型组：灌胃生理盐水，腹腔注射生理盐水。

[0053] 5、过敏原Derp2特异性抗体的测定

[0054] 在实验结束处死小鼠时，取小鼠血液，然后室温静置2h，4000rpm离心10min，取上层血清，采用ELISA方法测定其中过敏原特异性抗体的浓度。

[0055] 实验结果：发现口服重组乳酸乳球菌L.lactis SD可明显降低小鼠体内Derp2特异性IgE的浓度（参见图4A），同时提高特异性IgG2a浓度（参见图4B）；

[0056] 实验结果说明口服重组乳酸乳球菌L.lactis SD可通过调整细胞内特异性抗体的浓度抑制过敏反应。

[0057] （1）包被：用包被缓冲液（1000ml含Na2CO3 1.59g；NaHCO3 2.93g，ph调至9.6）将提取的Derp2蛋白稀释到10μg/ml，每孔加入100μl后4℃包被过夜。次日弃去孔内液体，用PBST（1000ml 0.1M的PBS缓冲液中加入1ml Tween20）洗涤3次，每次3min。

[0058] （2）封闭：酶标板加样孔干燥后每孔加入100μl封闭液（1g牛血清蛋白溶解到100ml的0.1M PBS缓冲液中），37℃封闭2h，然后用同样方法洗涤3次。

[0059] （3）加样：加100μl适度稀释的小鼠血清于已包被的反应孔中，分别设置空白对照和阴性对照（PBS对照组血清），37℃保温1h后同样方法洗涤。

[0060] （4）加酶标二抗：每孔加入100μl新鲜稀释的酶标二抗（IgE和IgG2a）（SouthernBiotech，美国），37℃保温1h，用PBST洗涤2次，最后用不含Tween-20的PBS洗涤一次。

[0061] （5）加底物液显色：向每孔中加入新鲜配置的TMB底物溶液（北京康为世纪生物科技有限公司），每孔100μl，室温暗处静置反应15min。

[0062] （6）终止反应及检测：向各反应孔中加入2M H2SO4 50μl，轻敲酶标板使其均匀混合以终止反应，然后在15min内将酶标板置于酶标仪（Thermo，美国）上，于450nm处读取各孔的OD值。

[0063] 6、肺部的组织切片

[0064] 取新鲜的小鼠肺部，用生理盐水冲洗掉多余的血液，然后放入10%的多聚甲醛中保存过夜，然后用大量的清水冲洗，将多聚甲醛冲洗干净，然后用75%的乙醇保存，然后经脱水、包埋及切片染色后，用光学显微镜观察肺部的组织形态。

[0065] 实验结果：通过HE染色和甲苯胺蓝染色，我们发现服用重组乳酸乳球菌L.lactis SD的实验小鼠肺部内的炎症细胞和肥大细胞的数目要远远低于阳性对照组，参见图5-1和5-2;

[0066] 实验结果说明口服重组乳酸乳球菌L.lactis SD可通过抑制炎症细胞在炎症部位的聚集抑制过敏反应。

[0067] 7、脾脏内淋巴细胞种群的流式分析

[0068] 取新鲜的小鼠脾脏，采用机械破碎（研磨）的方法获得单细胞悬浮液，然后采用FITC标记的CD4抗体和PE标记的Foxp3抗体进行染色（两种抗体均来源于eBioscience公司），具体的实验操作方法为eBioscience推荐的最优方法；细胞染色后用流式细胞仪（BD Bioscience）进行细胞种群的分析，实验结果如图6所示。

[0069] 实验结果：通过对脾脏内淋巴细胞的染色分析，发现口服重组乳酸乳球菌+ +L.lactis SD可以明显提高脾脏内CD4Foxp3 细胞的水平；此外，相比胞內表达过敏原的重+ +
组乳酸乳球菌L.lactis ND,L.lactis SD可以刺激机体产生更多的CD4Foxp3 细胞。

[0070] 实验结果说明口服重组乳酸乳球菌L.lactis SD可以通过增加脾脏内CD4+Foxp3+细胞的数目，抑制过敏疾病的发生；此外，相比胞内表达过敏原的重组菌株L.lactis ND，分泌表达过敏原的重组菌株L.lactis SD具有更好的保护作用。

[0071] 结论：

[0072] 动物实验结果说明，口服本发明的重组乳酸乳球菌L.lactis SD可通过增加脾脏内调节性T细胞的水平、降低小鼠血清中Derp2特异性IgE的水平及炎症细胞在发炎部位的聚集的方式，降低实验小鼠体内的尘螨过敏反应；同时相比胞內表达过敏原的重组菌株，分泌表达过敏原的重组菌株L.lactis SD具有更好的效果。

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