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色杆菌的配方、成分、代谢物和使用方法

阅读：26发布：2020-07-11

专利汇可以提供色杆菌的配方、成分、代谢物和使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了具有稳定性的生物杀虫剂，其含有色杆菌的滤液、上清液、提取物或杀虫活性成份，可通过日光曝晒后，提供其抗降解的能力而维持物理均匀性来改善产品的保质期。，下面是色杆菌的配方、成分、代谢物和使用方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于调节至少一种蜱螨害虫和/或至少一种蝇科、果蝇科、花蝇科、常蚜科、木虱科、拟步行虫科和圣甲虫科的害虫于单一区域进行防治的方法，包括：(a)可采用一个数量的上清液、滤液和/或提取物和/或一种或一种以上来自上述色杆菌种的上清液、滤液和/或提取物，和(b)另一种杀虫物质，其中的此杀虫物质为某种杀螨剂和/或杀虫剂，可有效防治一种或一种以上的蝇科、果蝇科、花蝇科、常蚜科、木虱科、拟步行虫科和圣甲虫科的害虫，而在某个区域中，用于防治蛛形纲动物和/或一种或一种以上的蝇科、果蝇科、花蝇科、常蚜科、木虱科、拟步行虫科和圣甲虫科的害虫。
2.根据权利要求1所述的方法，其中的所述区域为植株、植株种子或土壤中的一个区域。
3.根据权利要求1所述的方法，其中的蜱螨害虫为螨虫。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述螨虫为叶螨种的害虫。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述害虫为家蝇属、蚜属、洋葱线角个木虱、鞘翅类或面包虫属、果蝇属、地种蝇属、图棕色金龟子、豆金龟属、金龟子属或蛀象鼻虫种的害虫。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述色杆菌菌种为色杆菌苏比丝加新菌种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述害虫为舍蝇、樱桃果蝇、甘蓝地种蝇、烟蚜、马铃薯/番茄木虱、大黄粉虫、圆头犀金龟属、欧洲切根鳃金龟、日本丽金龟、黑蛀象鼻虫和东方异丽金龟的害虫。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述代谢物选自具有下列特征的群组：
1
(a)为一化合物，液相色谱/质谱LC/MS测定的分子量约840到890；(ii)H NMRδ值约
为8.89、8.44、8.24、8.23、7.96、7.63、6.66、5.42、5.36、5.31、5.10、4.13、4.07、4.05、3.96、
3.95、3.88、3.77、3.73、3.51、3.44、3.17、2.40、2.27、2.11、2.08、2.03、2.01、1.97、1.95、
1.90、1.81、1.68、1.63、1.57、1.53、1.48、1.43、1.35、1.24、1.07、1.02、0.96、0.89、0.88、
13
0.87、0.80，且(iii) C NMRδ 值约为 173.62、172.92、172.25、172.17、171.66、171.28、
170.45、132.13、130.04、129.98、129.69、129.69、125.48、98.05、70.11、69.75、68.30、
68.25、64.34、60.94、54.54、52.82、49.72、48.57、45.68、40.38、39.90、38.18、36.60、
31.98、31.62、31.58、29.53、28.83、27.78、24.41、23.06、22.09、20.56、19.31、18.78、
17.66、15.80；
(b)一化合物而具有下列特征：(i)可取自色杆菌的菌种；(ii)对害虫具有毒性；
(iii)液相色谱/质谱LC/MS测定的分子量约850到900；(iv)在反相C-18HPLC色谱仪
(菲罗门，鲁那，5μC18(2)100A，100×4.60mm)，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0到
20分钟90％到0％CH3CN水溶液、20到24分钟100％CH3CN、24到27分钟0到90％CH3CN
水溶液、27到30分钟90％CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分钟流速和UV检测器波长210nm下，高压液相色谱仪HPLC的保留时间约7到12分钟；
(c)一具有##STR001##结构的化合物
或含有可接受的杀虫活性盐类或立体异构物，其中的R是-H，低链烷基含有1、2、3、4、
5、6、7、8或9个烷基团和取代低链烷基团，X是O、NH、NR或S，n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11是各别独立的H，可为相同或不同而各别独立的氨基酸侧链基团或氨基酸侧链衍生物、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的烷硫基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧基酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子；
(d)一具有##STR001a##结构的化合物
其中的R是-H，低链烷基含有1、2、3、4、5、6、7、8或9个烷基团、芳基或芳基烷基团和取代低链烷基，X是O、NH、NR或S，R2a和R2b是选自下列的独立官能团，而含有-H、烷基、低链烷基、取代烷基和取代低链烷基；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11是各别独立的H，属相同或不同而各别独立的氨基酸侧链基团或氨基酸侧链衍生物、烷基、取代烷基、链烯基、取代的链烯基和炔基链烯基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧基酰基、氨基甲酸叔丁酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子；
(e)一具有##STR001b##结构的化合物
其中的R是-H，低链烷基含有1、2、3、4、5、6、7、8或9个烷基团、芳基或芳基烷基团、取代低链烷基和取代低链烷基团，X是O、NH、NR或S，n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，R2a和R2b是各别独立选自下列的官能团，含有-H、烷基、低链烷基、取代烷基和取代低链烷基，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11是各别独立的H，属相同或不同而各别独立的氨基酸侧链基团或氨基酸侧链衍生物、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基链烯基、取代的炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧基酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子；
(f)一具有##STR001c##结构的化合物
其中的R是-H，低链烷基、芳基或芳基烷基团、取代低链烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9个烷基团，X是O、NH、NR或S，n是1、2、3、4、5、6、7、8或9，R2a和R2b是各别独立选自下列的官能团，含有-H、烷基、低链烷基、取代烷基和取代低链烷基，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11是各别独立的H，属相同或不同而各别独立的氨基酸侧链基团或氨基酸侧链衍生物、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基链烯基、取代的炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧基酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子；
(g)一化合物具有下列特性：(i)可取自色杆菌的菌种；(ii)对害虫具有毒性；(iii)液相色谱/质谱LC/MS测定的分子量约325到360)；(iv)在反相C-18HPLC色谱仪(菲罗
门，鲁那，5μC18(2)100A，100×4.60mm)，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0到20分钟
90％到0％CH3CN水溶液、20至24分钟100％CH3CN、24到27分钟0到90％CH3CN水溶
液、27到30分钟90％CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分钟流速和UV检测器波长210nm下，高压液相色谱仪HPLC的保留时间约8到14分钟；
(h)一化合物具有下列的特性：(i)可取自色杆菌的菌种；(ii)对害虫具有毒性；
(iii)液相色谱/质谱LC/MS测定的分子量约315到350；(iv)在反相C-18HPLC色谱仪(菲罗门，鲁那，5μC18(2)100A，100×4.60mm)，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0到20分钟90％到0％CH3CN水溶液、20至24分钟100％CH3CN、24到27分钟0到90％CH3CN水溶
液、27到30分钟90％CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分钟流速和UV检测器波长210nm下，高压液相色谱仪HPLC的保留时间约10到15分钟。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述代谢物是紫色杆菌素的衍生物，具有下列的结构：
其中R是-H，低链烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9个烷基团、芳基或芳基烷基团、取代低链烷基和卤素，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11是各别独立的H，属相同或不同而各别独立的烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基链烯基、取代的炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧基酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述代谢物选自含有紫色杆菌素、脱氧紫色杆菌素和克罗玛德A的官能团。
11.一种杀虫组合物，其活性成份包括：(a)某种上清液、滤液和/或提取物和/或一种或一种以上取自色杆菌菌种其代谢物的上清液、滤液和/或提取物成份，和(b)另一种杀虫物质，另一种杀虫物质，其中的此杀虫物质为某种杀螨剂和/或杀虫剂，可有效防治一种或一种以上的蝇科、果蝇科、花蝇科、常蚜科、木虱科、拟步行虫科和圣甲虫科的害虫，而在某个区域中，用于防治蛛形纲动物和/或一种或一种以上的蝇科、果蝇科、花蝇科、常蚜科、木虱科、拟步行虫科和圣甲虫科的害虫。
12.一种应用于植株、植株种子和/或植株生长物的害虫防治方法，所述方法包括：
(I)一化合物，所述化合物具有下列特性
(a)具有杀虫毒性；
(b)LTQ轨道阱XL混合型傅立叶变换质谱仪测得的分子量约950到1450；
1
(c)H NMRδ值为5.22(sext，1H)、2.62(dd，1H)、2.53(dd，1H)和1.31(d，3H)；
13
(d) C NMRδ值为169.2、67.6、40.9和19.8；
(e)具有-(-O-CHCH3-CH2-CO-)n-的结构，其中n＝6到50；
(f)可取自色杆菌的菌种；和
(II)也可另选其它的杀虫物质，其用量足以防治本文所述的虫害。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述化合物(I)具有下列的结构：
其中X是各别独立的-O、-NR或-S，其中的R是H或C1-C10烷基，Y是各别独立的-O
和-S，n＝6到50，R1、R2是各别独立的H、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基链烯基、取代的炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基、取代的杂环基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、硫代烷基、取代的硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧基酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述化合物(I)具有下列的结构：
其中n＝10到25。
15.根据权利要求12所述的方法，其中的害虫为线虫或生长于土壤中的细菌。
16.一种组合物，包括：
(I)一化合物，所述化合物具有下列特性：
(a)具有杀虫活性；
(b)LTQ轨道阱XL混合型傅立叶变换质谱仪测得的分子量约950到1450；
1
(c)H NMRδ值为5.22(sext，1H)、2.62(dd，1H)、2.53(dd，1H)和1.31(d，3H)；
13
(d) C NMRδ值为169.2、67.6、40.9和19.8；
(e)具有-(-O-CHCH3-CH2-CO-)n-的结构，其中n＝6到50；
(f)可取自色杆菌的菌种；和
(II)也可另选其它的杀菌和杀虫物质。
17.一种方法，所述方法所含的化合物(i)具有杀虫毒性；(ii)LTQ轨道阱XL混合
1
型傅立叶变换质谱仪测得的分子量约950到1450；(iii)H NMRδ值为5.22(sext，1H)、
13
2.62(dd，1H)、2.53(dd，1H)和1.31(d，3H)(iv) C NMRδ值为169.2、67.6、40.9和19.8；
(iv)具有-(-O-CHCH3-CH2-CO-)n-的结构，其中n＝6到50，和(v)可取自色杆菌的菌种，而含有：
(A)将色杆菌的菌株于全细胞培养液中，在足以生成下列化合物的条件下加以培养；
(B)于(A)中从上述的全细胞培养液析离出此化合物。
18.一种具有稳定性的生物杀虫剂成份，包括有：
(a)色杆菌菌种的滤液、上清液、提取物或来自前述物具有杀虫活性的物质；和
(b)日晒保护剂，其中所述日晒保护剂为木质素和/或苯甲酸的盐类物质。
19.根据权利要求1所述的成份，其中苯甲酸的盐类物质是选自含有下列成份的物质
群组，即钠、钾、钙、镁和其组合物和/或本文提及选自含钠、钾、钙、镁和其组合物中和离子等木质素磺酸盐的木质素盐类物质。
20.根据权利要求18所述的成份，其中所述色杆菌为色杆菌苏比丝加。
21.根据权利要求18所述的成份，其中所述色杆菌含量至少约5％，和/或日晒保护剂的含量至少约5％。
22.一种具有成份稳定功能的方法，是含有生物杀虫剂可避免物理解离和活性损失，其中所述生物杀虫剂为色杆菌，此生物杀虫剂成份具有稳定功能的剂量，可用于避免因为日晒引发的物理解离和活性损失。
23.一种选自含有苯甲酸盐类和木质素磺酸盐的稳定剂成份，是用于生物杀虫剂成份的制造，其中所述成份具有稳定性可避免因为日晒而引发物理解离和活性损失。

说明书全文

色杆菌的配方、成分、代谢物和使用方法

技术领域

[0001] 本发明所述为色杆菌(Chromobacterium)滤液、上清液和提取物的用途、成份或配方，原本作为杀螨剂和杀虫剂使用，具有杀虫活性的化合物或其代谢物，特别是用于防治下列一种或一种以上的害虫，如蜱螨目、金龟子科、果蝇科、叉木虱科、蜜蜂科、蝇科、花蝇科和拟步甲科等。本发明所述再包括有生物性杀虫剂(也简称为生物杀虫剂)的配方，尤其是含色杆菌滤液、上清液、提取物、代谢物或其衍生物中，具有杀虫活性的化合物和其制造方法和防治害生物入侵的方法。更具体来说，本发明提供具有高稳定性的生物杀虫剂特性，因为其均匀的物理特性具有更长的保存期限，因为对日光曝晒的高抗降解特性，具有更耐久的使用后杀虫活性。

背景技术

[0002] 使用微生物、植物和其它生物体所制成的天然产品，此微生物天然产物具有丰富多样性的化学成份来源，并此天然产品在医药用途已有长久的历史。虽然天然产品主要用于人体治疗，其中超过50％的产品来自天然产品，只有11％的杀虫剂是使用天然原料。然而，天然原料制成的杀虫剂，在传统和有机农场的虫害控制上举足轻重。微生物(细菌、放线菌和真菌)的次级代谢物提供新的化学成份，可将已知的成份进行单方或复方使用，以有效控制虫害并降低耐药性增强的可能风险。关于微生物天然产品在农业杀虫剂上的成功应用，有几个著名的例子(汤普森(Thompson)等人，2000；阿瑞娜(Arena)等人，1995；克力克(Krieg)等人，1983)。

[0003] 微生物杀虫剂的开发始于尾随纯培养物的析离，然后通过体外、体内、温室或农地的实验，进行其疗效和应用范围的筛选，同时进行微生物制造成份的析离和鉴定，关于微生物杀虫剂的商品化，可通过工业发酵的方法大量而经济地制造微生物，进行生物相容性的配方处理，添加经核可的添加物来增加药效，将应用便利性和农地条件下的储存稳定性最大化。

[0004] 色杆菌

[0005] 在2000年，马丁(Martin)博士和其同事在USDA从马里兰州的农地上壤中，析离出某种紫色的细菌(马丁等人，2007a)，在最初的筛选中，他们发现这种细菌对科罗拉多州的马铃薯甲虫等害虫具有毒性(马丁等人，2007b)，此种运动型细菌属革兰氏染色阴性，被界定为新种的色杆菌，即色杆菌苏比丝加(Chromobacterium substsugae sp.nov)(马丁等人，2007c)，它兼有嗜氧和运动性，属革兰阴性的β-变形菌(beta-proteobacterium)而具有极生鞭毛，使用L-琼脂与5℃下持续培养2-3天的菌落最初呈现奶油色，在接下来的24小时逐渐被称为暗紫色。PRAA4-1的菌落在蛋白胨培养基中，于25℃、pH值6.5～8.0和0-1.5％(w/v)氯化钠的条件下生长情况良好(马丁等人，2007a)。

[0006] 因为马丁和其同事所发现的色杆菌苏比丝加中，至少析离出3个色杆菌新种，杨(Young)等人(2008)也从台湾的泉水样本析离出新的色杆菌种水生色杆菌(C.aquaticum)，肯普法(Kampfer)等人(2009)也从马来西亚的环境中析离出两个新菌种，即色杆菌皮丝西纳(C.piscinae)和假紫色色杆菌(C.pseudoviolaceum)。

[0007] 在所有来自土壤和水源的已知色杆菌种中，紫色色杆菌(C.violaceum)属革兰氏阴性。关于色杆菌生成次级代谢物已发布的研究论文中，仅限于紫色色杆菌的菌种(参见实例如度伦(Durán)和门克(Menck)(2001)关于紫色色杆菌菌种在药理和工业应用上的全面性探讨)。此菌种通常被认为对人类不具有致病性，但属可能致病的病原体，在人体和动物体中，偶尔变成为败血症的病原体，而导致败血症和致命的感染。紫色色杆菌已知可生成某种紫色成份即紫色杆菌素，出现氧气的情况下，可融合两个L-色氨酸分子而形成1个双吲哚分子(星野(Hoshino)等人，1987；瑞安(Ryan)和德雷南(Drennan)；2009)。紫色杆菌素生物合成可通过群体感应来调节，为革兰氏阳性菌中1个调节各种次生代谢物途径的共同机制(麦克林(McClean)等人，1997)。

[0008] 度伦和门克(2001)所摘要列举的紫色色杆菌代谢物包括氰化氢、铁草氨菌素E(FERRIOXAMINE E)、B-内酰胺糖肽SQ28504和SQ28546、抗生素如气花青素、阿罗卡因(aerocavin)、3,6-二羟基-苯并异恶唑、单酰胺菌素(monobactam)SB-26.180和抗肿瘤的缩酚酸肽FR901228。根据度伦和门克(2001)的研究，紫色色杆菌也制造不寻常的糖化合物如胞外多醣和脂多醣的成份。

[0009] 美国专利申请案US20120100236也揭露可得白色杆菌种的化合物成份，更具体来说为色杆菌苏比丝加的色杆菌种。

[0010] 螨虫和杀螨剂

[0011] 二斑叶螨属叶螨科，红蜘蛛也许是观赏植物中最重要的害虫，在温室和农地作物中，有180余个品种造成相当大的损害，这些螨虫也就是最难以防治的节肢动物害虫，可快速养成抗药性(斯塔普斯(Stamps)和奥士邦(Osborne)2009；奥士邦、爱乐(Ehler)和尼科尔斯(Nech01s)，1999)。

[0012] 杀螨剂属具有杀灭螨虫(杀螨剂)和蜱虫(杀蜱剂)的毒性，此类的杀虫剂种类繁多，包括有抗生素、氨基甲酸酯类、甲脒杀螨剂、拟除虫菊酯类、螨虫生长调节剂和有机磷杀螨剂。除了化学杀虫剂外，硅藻土和脂肪酸也可用于防治螨虫，通常可破坏螨虫的角质层让其干死。此外，某些精油如薄荷油也可用于防治螨虫，尽管已有种类繁多的杀螨剂化合物，因为对作物造成的损害，在农业上，螨虫危害仍属严重的问题。在-个季节中螨虫可繁衍数代，快速养成对杀螨剂产品的抗药性，因此，急需具有新用途和新方法的杀虫剂产品。

[0013] 家蝇

[0014] 舍蝇(家蝇)是蝇科成员，此科被视为国内和国外在全球各地经济上的问题，其它蝇科的成员包括面蝇，厩螫蝇和角蝇，被认为害虫是人类和动物的病媒虫。此虫习惯以垃圾、粪便和人类的食物为食，成为致病微生物的最佳传染病媒虫，此病媒虫通过开放性的伤口成为动物传染性疾病的害虫。

[0015] 以植物为食的果蝇—斑翼果蝇

[0016] 斑翼果蝇是美国地区果蔬种植区的新入侵者，其破坏性较众所周知的黑腹果蝇和其它的果蝇危害更甚，因为樱桃果蝇(D.suzukii)以破坏完整的果蔬为食，而其它的果蝇只以腐烂的植物为食。

[0017] 根蛆

[0018] 根蛆属花蝇科，以不同植物的根为食，大白菜的根蛆危害卷心菜、菜花、西兰花和抱子甘蓝等(此类的蔬菜也称为“油菜作物”)，不同种类的根蛆也危害胡萝卜、洋葱、蔬菜和其它作物，因为油菜作物属冷季型蔬菜，白菜根蛆在美国北方危害更甚，而难以防治，因为其孵化和喂食行为都发生在土壤下，所以当你发现到叶子发育不良或枯萎时，才知道他们的存在。

[0019] 桃蚜

[0020] 烟蚜(桃蚜)属常蚜科(见US20110054022)，由其俗名得知，桃蚜是各种果蔬和观赏植物的害虫并遍布全球，这些害虫危害更甚，因为不只通过取食韧皮部而造成直接的损害，也是李痘病毒的潜在宿主，这是李树痘病的病媒而导致果实变形和变色。因此，感染株需连根拔起，目前正通过各种杀虫剂来防治这些害虫，但这些害虫常养成抗药性。

[0021] 马铃薯木虱

[0022] 马铃薯/番茄木虱(马铃薯木虱)属叉木虱科，是斑马纹病的病原体，通过革兰氏阴性菌来感染。虽然原产于北美洲，已在纽西兰发现到此物种(WWW.biosecurity.govt.nz/ﬁles/pests/potato-tomato-psyllid/psyillid-factsheet.pdf)，马铃薯木虱通常生长于茄科宿主(如番茄和马铃薯)中，但也可在其它植物如辣椒、茄子、红薯、波罗蜜、树番茄和曼陀罗中发现到。

[0023] 枯叶甲虫

[0024] 大黄粉虫是危害家禽业极为严重的害虫属拟步甲科，据报Bt菌株PS8681对拟步行虫具有防治活性(海客里(Hickle)的美国专利5,100,665等)，拟步行虫亚种(Bt tenebrionis)对此甲虫的幼虫可能也有防治活性(美国专利5,244,660)，枯叶甲虫和其它某些鞘翅目为原生动物、细菌和病毒性传染病的宿主，对鸡和火鸡饲养业造成重大的经济损失。枯叶甲虫属致病性沙门氏菌的重要病猫，包括许多的病媒种如肠道沙门菌(S.enterica)血清型肠炎。此问题就是感染有病原微生物如沙门氏菌的家禽，危害人体健康，这些甲虫栖息于垃圾、木材、发泡塑料、玻璃纤维和鸡舍的聚苯乙烯保温板中，其幼虫和成虫也会在鸟粪和鸡饲料的谷物中滋生，这些大甲虫的群组和其不同的栖息地均在鸡舍内，而难以根除其身上携带的沙门氏菌。在落叶甲虫为患甚剧时，或在新鸡群建立前，不频繁翻动垃圾也不沾染化学杀虫剂，即可提供完全有效的虫害防治。

[0025] 蛴螬和甲虫

[0026] 蛴螬如白色蛴螬(圆头犀金龟属)、南方隐金龟子(欧洲切根鳃金龟)、日本甲虫的幼虫(日本丽金龟(Popillia japonica))、黑色蛀象鼻虫的幼虫(黑蛀象鼻虫(Otiorhynchussulcatus))、东方甲虫的幼虫(东方异丽金龟)、金龟科成员，已发现到会侵扰草地和牧场。也已发现圣甲虫的成虫会侵扰世界各地的观赏植物和众多的作物，目前已尝试使用过各种的杀虫剂，包括化学杀虫剂、杀线虫剂(如参加美国专利7641573)、苏云金芽孢杆菌(参见美国专利5185158)、费洛蒙和天然驱虫剂如薄荷和韭菜等。

[0027] 聚羟基脂肪酸酯(PHA)

[0028] 生物塑料即定义为从再生资源所合成的塑料，如植物淀粉和微生物等。生物塑料由一种叫做聚羟基脂肪酸酯(PHA)的成份所制成，PHA家族包括几种聚合酯，如聚羟基丁酸盐、聚羟基丁酸酯、聚羟基丁酸盐、共羟基戊酸乙酯(PHBV)、聚羟基丁酸酯共羟基己酸酯(PHBHx)和聚羟基丁酸酯-共-羟基辛酸酯(PHBO)等，聚3-羟基丁酸(PHB)是最常见的天然微生物PHA成份，聚羟基脂肪酸酯是100％可生物降解的聚合物，含各种羟基烷酸酯(HAS)，由无数微生物所合成，作为基质失恒条件下的能量储备物质，各种合成的热塑性塑料具有类似的特性，如聚丙烯等，也可在有氧条件下，全部降解为水和二氧化碳，并在厌氧条件下，通过土壤、湖水、污水和海水中的微生物降解为甲烷。目前开发中的可生物降解塑料，包括有聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚乳酸、脂肪族聚酯、多醣和这些物质的共聚物和/或共混物。

[0029] 根据链中的碳原子数，PHA可分为两类：短链(SCL)含3-5个碳原子以及中链(MCL)含6-14个碳原子(康纳S(Khanna S)，丝丽他瓦(Srivastava)，AK.2005)，这些差异主要是因为PHA合成酶的基质特性，一定范围内可容纳3HAS的碳链长度。其它众所周知的PHASCL属共聚物和聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)聚(3HB-共-3HV)的物质，含4和5个活性碳原子的单体单元。这些单体单元的比例各有变化，而影响到聚合物的物理特性，如增加3HV的单位可降低脆度。

[0030] 在某些微生物的物种中，在碳存量过多而氮来源有限的情况下，即会导致PHA的累积。PHA的成份用于因应压力下的环境，作为储存能量的分子以备不时之需(苏莱曼(Solaiman)和阿什比(Ashby)，2005)。塑料聚合物塑料在这些生物体的细胞内聚积成为光折射的非晶体储存物(姆克赫帕德杨(Mukhopadhyay)等人，2005)，PHB通过3个酶促步骤从乙酰-CoA进行合成步(克浪斯(Krans)等人，1997)，从生物技术的角度来看，可生物降解的生物塑料特征可让其成为污染环境石化塑料的替代品(李(Lee)，1996)，大量增加生物塑料的生产可大幅降低二氧化碳的排放量，削减塑料废物的产生，并减低化石燃料的消耗量。

[0031] PHA可通过下列3种方法取得：微生物的生物合成、转基因植物的光合作用和使用适当的酶进行体外的生物合成(如参见美国专利7455999、W09914313)。在大多数的细菌中，细胞可在伸展有限的基质，如氮、磷或氧中来合成PHA。

[0032] 累积的PHA在生物饥饿时，可作为碳源和能源使用，PHA也作为降低功耗的装置，因此而被视为细胞内的氧化还原调节器。PHA也可作为立体调节的化合物，可作为光活性合成化合物的前驱物，此类的化合物特别作为可长期使用的药剂、激素、杀虫剂和除草剂(雷迪(Reddy)2003)的可生物降解载剂成份，也可在骨板、手术缝合线和更换血管中，因为具有压电特性而作为刺激骨骼生长的骨质合成物(舍费尔(Schaefer)等人，2000)，此外，已有许多公开的共聚物生成方法指出，可使用不同的菌种如碱杆菌NCIMB40124(EP.0431883A2)和美国专利7455999成份物，进行生物成份的制造。EP第2236089A1号中揭露这些聚合物用于植入物的整形和软组织固定的装置，WO9I/00917A1揭露的方法，可在特别是植物的原核和真核细胞中，通过聚羟基丁酸酯(PHB)和聚羟基链烷酸酯(PHA)的遗传学和酶学原理，来控制和修改新的聚酯生物聚合物。WO2005/030482A1揭露的方法和用途，可用于堆肥的包装材料上，W02008/110541揭露的聚羟丁酸具有抗热降解的稳定特性。

[0033] 木质素

[0034] 木质素是高等植物木质结构的主要成份，加工取得的木质素为木材制浆的副产物，例如，木质素的产品包括有木质素磺酸盐、碱质素和氧木质素，这些成份可从亚硫酸盐、硫酸盐和碱废液中取得(斯努克(Snook)，1982，制浆造纸技术手册(Handbook for Pulp&Paper Technologists)，TAPPI，亚特兰大(Atlanta))。

[0035] 目前已发现到木质素有多种商业用途，如碱可溶性的木质素可作为分散剂来使用。美国专利3726850中揭露碱溶性臭氧处理过的木质素产品，其相关的用途，此物质基本上不含有机结合键结的硫，作为粘土、染料、杀虫剂、石墨和其它材料的分散剂来使用。美国专利4666522中揭露木质素磺酸产品可用于制备蜡、油、脂肪、沥青和其混合物的乳液产品。据报导木质素乙酸的相关应用，如作为水基油墨组合物的粘合剂(如参见美国专利4612051)，美国专利5668183中揭露木质素磺酸盐产品可分散脂溶性物质，此外，已揭露有含木质素的杀虫剂复合物(如参见美国专利3813236、美国专利3929453重新发布为美国专利29,238、美国专利4381194、美国专利20110015237、美国专利申请案2010136132、美国专利申请案20100278890、美国专利申请案20080113920、美国专利申请案2006247130、美国专利申请案7867507、W02003/005816、美国专利5994266)。

[0036] 苯甲酸钠苯甲酸钠可用于不同的配方中，作为食物制品的抗菌成份，例如，美国专利6,599,514中揭露抗真菌的成份含有抗菌剂和食品添加物，对抗菌成份的活性具有协同效应。在美国专利6599514中揭露的食品添加剂包括山梨酸、山梨酸盐、苯甲酸、苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、二氧化硫和亚硫酸盐、联苯基和其衍生物、亚硝酸盐、硝酸盐、乳酸、乳酸盐、柠檬酸和柠檬酸盐、酒石酸和酒石酸盐、正磷酸和正磷酸盐、苹果酸盐、己二酸、琥珀酸、1,4-庚糖内酯、烟酸、柠檬酸三铵、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠钙、甘油、2-、3-和多磷酸盐、脂肪酸(E470)、单-和二甘油酯脂肪酸(E471)酯、单-和二甘油酯脂肪酸、碳酸盐、葡糖酸盐、氯(E92S)、六偏磷酸钠、叔丁基、羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)(E321)、叔丁基对苯二酚(THBQ)、丙基没食子儿茶素没食子酸酯、葡庚糖酸钙、植酸钙、乙醚、乙二胺四乙酸二氢二钠EDTA、乙酸乙酯、甘油单-、二-和三乙酸、甘氨酸、羟基硬脂精、丙-1,2-二醇和丙烷-2-01和葡庚糖酸钠。

[0037] 苯甲酸钠也用于杀虫剂配方中，例如，SC约翰逊(SC Johnson)的美国专利4668507中，将含有苯甲酸钠的杀虫剂放于钢质加压系统中，此系统主要用于抑制腐蚀。美国专利5620678中揭露某种的杀虫剂配方，其中的苯甲酸钠作为缓蚀剂使用。美国专利4731379中揭露的杀虫剂成份中，含有苯甲酸钠作为动物杀蚤洗发精。在所述专利中，苯甲酸钠的使用不是用于促进杀虫剂的效果或稳定产品的化学性质，而是用于动物伤口的愈合治疗。美国专利5017620中的杀虫剂成份含苯甲酸钠和其它已知的防腐剂成份，作为抗菌剂用于稳定储存产品的化学性质。美国专利6841572中揭露某种水溶液，用于治疗活的植物、作物、树木和收获前的水果、蔬菜、叶、茎、根和花，其pH值为4.0到6.5之间，基本上含有效浓度以上的杀真菌和/或杀菌，其一种或一种以上的防腐剂成份，而选自山梨酸、苯甲酸、乳酸、含苯甲酸的钠、钾、钙和铵盐成份，山梨酸、羟甲基氨基乙酸、乳酸和丙酸、甲基、乙基、丙基和丁基化合物，至少一种的阴离子表面活性剂和任选的酸化剂。

发明内容

[0038] 本发明提供的成份和方法，即用于控制和/或防治一种或一种以上的蜱螨科(节肢动物)、蝇科、果蝇科、花蝇科、蚜科、叉木虱科和拟步行虫科(Tenebrionidae)的害虫，含有或使用某种上清液、滤液和/或提取物，和/或一种或一种以上来自上述色杆菌种的上清液、滤液和/或提取物的成份，特别是含紫色杆菌素的菌株，包括但不限于色杆菌种中的色杆菌皮丝西纳、假紫色色杆菌和色杆菌苏比丝加，而更具体来说，为色杆菌苏比丝加新种，而更具体来说，此新种的色杆菌苏比丝加跟美国专利7,244,607中的NRRLB-30655具有相同的特性。

[0039] 具体来说，本发明提供的成份和方法，即用于控制和/或防治一种或一种以上的蜱螨科(节肢动物)、蝇科、果蝇科、花蝇科、蚜科、叉木虱科和拟步行虫科(Tenebrionidae)的害虫，于特定部位(a)含有特定数量的上清液、滤液和/或提取物，和/或一种或一种以上来自上述色杆菌种的上清液、滤液和/或提取物的成份，和(b)另一种杀虫剂物质，特别是杀螨剂和/或杀虫剂，可在特定位置中，有效防治螨虫和/或一种或一种以上属于蝇科、果蝇科、花蝇科、蚜科、叉木虱科、拟步行虫科或金龟子科的害虫。

[0040] 在具体实例中，此种蜱螨为叶螨科的螨虫，在更为具体的实例中，此种蜱螨为二斑叶螨(Tetranychus urticae)。

[0041] 在另一个具体实施例中，此害虫是家蝇属.、蚜属.、洋葱线角个木虱、鞘翅类或面包虫属、果蝇属、地种蝇属、图棕色金龟子、豆金龟属、金龟子属或蛀象鼻虫。在更具体的实例中，此侵扰到虫害为舍蝇(家蝇)、樱桃果蝇(斑翼果蝇)、甘蓝地种蝇(大白菜根蛆)、桃蚜、马铃薯/番茄木虱(马铃薯木虱)、大黄粉虫(甲虫)、圆头犀金龟属(白色蛴螬)、欧洲切根鳃金龟(南方淫金龟子)、日本丽金龟(日本甲虫)、蛀象鼻虫(黑色蛀象鼻虫)、东方异丽金龟(东方甲虫)。

[0042] 本发明提供的杀虫剂活性成份，可防治至少一种的节肢动物和/或一种或一种以上属于蜱螨科、花蝇科、果蝇科、蝇科、蚜科、叉木虱科、拟步行虫科或金龟子科的害虫：(a)一种色杆菌种的上清液、滤液和/或提取物，和/或来自上述色杆菌种代谢物的上清液、滤液或提取物，和(b)另一种杀虫物质，特别是杀螨剂和/或杀虫剂，可有效防治一种或一种以上属于蜱螨科、花蝇科、果蝇科、蝇科、蚜科、叉木虱科、拟步行虫科或金龟子科的害虫，其中(a)和(b)可任选用于复合剂方中。此杀虫物质可(a)取自微生物，(b)天然产物和/或(c)化学杀虫剂和特定的化学杀虫剂中。

[0043] 在具体实例中，此代谢产物的化合物：(a)具有杀虫活性；(b)液相色谱/质谱(LC/MS)测定的分子量约840-900，和(c)在反相C-18HPLC色谱仪，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0到20分钟90％到0％CH3CN水溶液、20至24分钟100％CH3CN、24到27分钟0到90％CH3CN水溶液、27到30分钟CH3CN水溶液)在0.5毫升/分钟流速和UV检测器波长210nm下，高压液相色谱仪(HPLC)的保留时间约7-12分钟，和(d)任选的色杆菌种，此具体实例中的成份可以是肽。

[0044] 在特定的具体实例中，此化合物通过13C NMR质谱测定下，含43个碳原子、7个甲基、10个亚甲基碳、12个甲烯、6个烯烃类甲烯和8个季碳。在更具体的实例中，此化合物分别为A、B、C和D，分别说明如图##STR001##、##STR001a##、##STR001b##和##STR001c##。

[0045] 在具体实例中，成份A：(a)取白色杆菌种色杆菌(Chromobacterium)，(b)对害虫具有毒性，(c)液相色谱/质谱(LC/MS)测定的分子量约840-890，更具体来说是860，(d)1H NMRδ值为为8.89、8.44、8.24、8.23、7.96、7.63、6.66、5.42、5.36、5.31、5.10、4.13、4.07、4.05、3.96、3.95、3.88、3.77、3.73、3.51、3.44、3.17、2.40、2.27、2.11、2.08、2.03、
2.01、1.97、1.95、1.90、1.81、1.68、1.63、1.57、1.53、1.48、1.43、1.35、1.24、1.07、1.02、
13
0.96、0.89、0.88、0.87、0.80 且 C NMR 值为 6173.62、172.92、172.25、172.17、171.66、
171.28、170.45、132.13、130.04、129.98、129.69、129.69、125.48、98.05、70.11、69.75、
68.30、68.25、64.34、60.94、54.54、52.82、49.72、48.57、45.68、40.38、39.90、38.18、
36.60、31.98、31.62、31.58、29.53、28.83、27.78、24.41、23.06、22.09、20.56、19.31、
18.78、17.66和15.80，(e)在反相C-18HPLC色谱仪(菲罗门(Phenomenex)，鲁那(Luna)，
5μC18(2)100A，100×4.60mm)，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0到20分钟90％到
0％CH3CN水溶液、20至24分钟100％CH3CN、24到27分钟0到90％CH3CN水溶液、27到30分钟90％CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分钟流速和UV检测器波长210nm下，高压液相色谱仪(HPLC)的保留时间约7-12分钟，更具体来说约9分钟，更明确则是9.08分钟。

[0046] 在具体实例中，成份B具有下列特性：(a)取白色杆菌种色杆菌(Chromobacterium)，(b)对害虫具有毒性，(c)液相色谱/质谱(LC/MS)测定的分子量约850-900，更明确的是874，(d)在反相C-18HPLC色谱仪(菲罗门，鲁那，5μC18(2)100A，
100×4.60mm)，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0到20分钟90％到0％CH3CN水溶液、
20至24分钟100％CH3CN、24到27分钟0到90％CH3CN水溶液、27到30分钟90％CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分钟流速和UV检测器波长210nm下，高压液相色谱仪(HPLC)的保留时间约7-12分钟，更具体来说约9分钟，更明确则是9.54分钟。

[0047] 代谢物的成份包括但不限于：

[0048] (A)含##STR001##结构的成份

[0049]

[0050] 或可接受的杀虫盐类，其中的R是-H，低链烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9个烷基团、芳基或芳基烷基团、低链取代烷基，X是O、NH、NR或S，n是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10和R11分别是独立而相同或不同的H原子和氨基酸侧链基团或侧链的氨基酸衍生物、烷基、取代烷基、链烯基、取代链烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷基、取代环烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧基酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子；

[0051] (B)含##STR001a##结构的成份

[0052]

[0053] 其中的R是-H，低链烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9个烷基团、芳基或芳基烷基团、低链取代烷基，X是O、NH、NR或S，R2a和R2b是含-H、烷基、低链烷基、取代烷基和低链取代烷基，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11分别是独立而相同或不同的H原子和氨基酸侧链基团或侧链的氨基酸衍生物、烷基、取代烷基、链烯基、取代链烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷基、取代环烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧基酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子；

[0054] (C)含##STR001b##结构的成份

[0055]

[0056]

[0057] 其中的R是-H，低链烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9个烷基团、芳基或芳基烷基团、低链取代烷基，X是O、NH、NR或S，R2a和R2b是含-H、烷基、低链烷基、取代烷基和低链取代烷基，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R1o、R11分别是独立而相同或不同的H原子和氨基酸侧链基团或侧链的氨基酸衍生物、烷基、取代烷基、链烯基、取代链烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷基、取代环烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧基酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子；

[0058] (D)含##STR001C##结构的成份

[0059]

[0060] 其中的R是-H，低链烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9个烷基团、芳基或芳基烷基团、低链取代烷基，X是O、NH、NR或S，R2a和R2b是含-H、烷基、低链烷基、取代烷基和低链取代烷基，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11分别是独立而相同或不同的H原子和氨基酸侧链基团或侧链的氨基酸衍生物、烷基、取代烷基、链烯基、取代链烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷基、取代环烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧基酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子；

[0061] 在更为具体的实例中，此代谢物是克罗玛德A(Chromamide A)(1)。

[0062]

[0063] 在明确的具体实例中，此代谢物是成份C，具有下列特性：(a)取白色杆菌种色杆菌(Chromobacterium)，(b)对一种或一种以上的害虫具有毒性，(c)测量测定的分子量是325-360，更明确则约343，(d)在反相C-18HPLC色谱仪(菲罗门，鲁那，5μC18(2)100A，
100×4.60mm)，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0到20分钟90％到0％CH3CN水溶液、
20至24分钟100％CH3CN、24到27分钟0到90％CH3CN水溶液、27到30分钟90％CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分钟流速和UV检测器波长210nm下，高压液相色谱仪(HPLC)的保留时间约8到14分钟，更具体来说约10分钟，更明确则是10.88分钟。在具体实例中，此成份C可为紫色杆菌素(2)为先前从色杆菌种紫色色杆菌析出的已知成份。

[0064] 在另一个具体实例中，上述的成份和制作方法中使用有另一种代谢物D，具有下列特性：(a)取白色杆菌种色杆菌(Chromobacterium)，(b)对害虫具有毒性，(c)液相色谱/质谱(LC/MS)测定的分子量约315到350，更具体来说约327，(d)在反相C-18HPLC色谱仪(菲罗门，鲁那，5μC18(2)100A，100×4.60mm)，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0到20分钟90％到0％CH3CN水溶液、20至24分钟100％CH3CN、24到27分钟0到90％CH3CN水溶液、27到30分钟90％CH3CN水溶液)，在0.5毫升/分钟流速和UV检测器波长210nm下，高压液相色谱仪(HPLC)的保留时间约10到15分钟，更具体来说约12分钟，更明确则是12.69分钟。在具体实例中，此成份D可为脱氧紫色杆菌素(3)，其为先前从色杆菌种紫色色杆菌析出的已知成份。

[0065] 在另一个具体实例中，此成份可具有下列的结构：

[0066]

[0067] 其中的R是-H，低链烷基含1、2、3、4、5、6、7、8或9个烷基团、芳基或芳基烷基团、低链取代烷基，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9分别是独立的H原子和相同或不同的烷基、取代烷基、链烯基、取代链烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷基、取代环烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代烷硫基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧基酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子。

[0068] 本发明再提供的方法，可用于(1)防治侵害植物害虫(如土壤传播的线虫、昆虫和细菌)，适用于植物、种子和/或用于植物栽培基质土壤，或用于防治土壤细菌的方法，适用于植物、种子和栽培用的基质土壤，

[0069] (I)其某种成份

[0070] (a)具有杀虫和/或抗菌活性；

[0071] (b)LTQ轨道阱(Orbitrap)XL混合型傅立叶变换质谱仪测定的分子量约950到1450；

[0072] (c)1H NMR6 值为 5.22(sext，1H)、2.62(dd，1H)、2.53(dd，1H) 和 1.31(d，3H)，(d)13CNMR6值为169.2、67.6、40.9和19.8。

[0073] (d)具有-(-O-CHCH3-CH2-CO-)n-的结构，其中n＝6到50

[0074] (e)取白色杆菌种色杆菌属，和

[0075] (II)可任选其它对植物虫害防治有效的杀虫物质：

[0076]

[0077] 成份(I)可具有的结构：

[0078] 其中：

[0079] X是独立的-O、-NR或-S基团，R是H或C1-C10烷基，Y是独立的-O和-S基团，n＝6到50，R1和R2是各别独立的H、烷基、取代烷基、链烯基、取代链烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基、环烷基、取代环烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羟基、卤素、氨基、酰氨基、羧基、-C(O)H、酰基、氧基酰基、氨基甲酸酯、磺酰基、磺酰胺或硫原子。

[0080] 尤其是成份(I)具有此类的结构：

[0081]

[0082] 其中n＝10-25。

[0083] 在最为具体的实例中，(I)为a-丁酸。

[0084] 本发明再提供的方法，可用于取得上述的化合物，此方法含色杆菌种色杆菌(Chromobacterium sp.)的培养物放于全细胞液中，其条件足以生成化合物并可析离全细胞液中的化合物成份。

[0085] 在本发明揭露的相关方法中，通过可有效稳定日光曝晒物理解离和药剂流失的成份，来控制稳定药效成份的流失和物理解离，本发明也提供有此类的成份。在明确的具体实例中，此杀虫剂成份含色杆菌种色杆菌(Chromobacterium sp.)的滤液、培养上清液、提取物或取自上述物质而具有杀虫活性的成份，其含量约0.5％，按照约30wt％的干细胞重量约0.5wt％的重量，在具体实例中，此稳定剂可为苯甲酸盐和/或木质素盐类，特别是木素磺酸的盐类，包括但不限于钠、钾、钙、镁、铵和其相关的成份，至少约2.5wt％(重量)，可优选约5％-15wt％的重量。附图说明

[0086] 图1是取自克罗玛德A(1)、紫色杆菌素(2)和脱氧紫色杆菌素(3)纯化物的示意图。

[0087] 图2说明克罗玛德A(1)、紫色杆菌素(2)和脱氧紫色杆菌素(3)的学结构。

[0088] 图3显示MBI-203TSSM叶片的检测结果，CFD表示将细胞冷冻干燥处理，然后重新溶解于水中，即1/2倍、1倍和2.5倍的全细胞液中。

[0089] 图4显示曝露于MBI-203处理过的辣椒叶，木虱的平均产卵数。

[0090] 图5显示出曝露于经MB-203处理过和未处理过辣椒叶片的木虱产卵数平均值。

[0091] 图6显示桃蚜(GPA)幼虫和成虫曝露于处理过的辣椒叶片24小时后(P＜0.0001，LSD，a＝0.05)的平均数，相同字母的统计平均数并无差异，蒸馏水-阴性对照组，20310％V/V-阳性对照组。

[0092] 图7显示在曝露于MBI-203处理过辣椒叶片3天后，桃蚜后代(幼虫)的平均数(P＜0.0001、LSD、a＝0.05)。相同字母的统计平均数并无差异，蒸馏水-阴性对照组，10％V/V-阳性对照组。

[0093] 图8显示桃蚜成虫曝露于经处理过MBI-203和DF2(MBI-203配方产品)的辣椒叶3天后的桃蚜后代(幼虫)平均数(P＜0.0001、LSD、a＝0.05)，相同字母的统计平均数并无差异，蒸馏水-阴性对照组，10％v/v-阳性对照组。

[0094] 图9是将培养液中的紫色杆菌素(2)和寡核苷酸(β-羟基丁酸)(4)纯化的示意图。

[0095] 图10显示桃蚜成虫曝露于经处理过辣椒叶片3天后的后代(幼虫)平均数(P＜0.0001、LSD、a＝0.05)，相同字母的统计平均数并无差异，VL1-紫色杆菌素于0.5μg/mL、VL2-紫色杆菌素于1.0μg/mL、丙酮-无添加物处理、蒸馏水-阴性对照组、阿维地10％v/v-阳性对照组。

[0096] 图11A和11B显示烟蚜(幼虫和成虫)曝露于处理过辣椒叶片24小时后，桃蚜的平均数。相同字母的统计平均数并无显著的差异(P＜0.0001、LSD、a＝0.05)。
203Me-MBI-203属甲醇溶剂的粗提取物(无添加物处理)、203，Ace-MBI-203丙酮溶剂粗提取物、Ace-丙酮(无添加物处理)、蒸馏水-阴性对照组、阿维地(Avid)10％-阳性对照组。

[0097] 图12A和12B显示烟蚜(幼虫和成虫)曝露于处理过辣椒叶片24小时后，桃蚜的平均数。相同字母的统计平均数并无显著的差异。Ace-只含有丙酮(无添加物处理，DCM-EA-清洗-甲醇-蒸馏水-阴性对照组，20310％-MBI-203STD(阳性对照组)。

[0098] 图13显示桃蚜曝露于处理过辣椒叶片3天后的平均数(P＜0.0018、LSD、ct＝0.05)。相同字母的统计平均数并无显著的差异。VL1-于0.5μg/mL的紫色杆菌素中，VL2-于1.0μg/mL的紫色杆菌素中，丙酮-无添加物处理、蒸馏水-阴性对照组、阿维地
10％(v/v)-阳性对照组。

[0099] 图14显示桃蚜(GPA)成虫曝露于处理过辣椒叶片24小时后，其幼虫和成虫的平均数(P＜0.0001、LSD、a＝0.05)。相同字母的统计平均数并无差异，蒸馏水203-阴性对照组、10％v/v-阳性对照组。

[0100] 图15显示桃蚜成虫曝露于处理过辣椒叶片24小时后，其幼虫和成虫的平均数(P＜0.0001、LSD、a＝0.05)。相同字母的统计平均数并无差异，蒸馏水203-阴性对照组、10％v/v-阳性对照组。

[0101] 图16显示MBI-203@3％日晒前与日晒后的死亡率，归零到不含添加物的清水。

[0102] 图17显示MBI-203：菜蚜植株喷雾EP/EP+NaBenz的处理状况。

[0103] 图18显示MBI-203EP+/-Na Benz、白菜蚜虫植株喷雾的修正状况。

[0104] 图19显示MBI-203：EP+CaC03/NaBenz日光曝晒前后标准化为阴性对照组的处理状况。

[0105] 图20显示MBI-203EP SDP日光曝晒后第3和6天的检测状况。

[0106] 图21显示MBI-203EP/Benz+木质素日光曝晒后第4天的修正状况。

[0107] 图22显示MBI-203EP添加Na Benz+木质素在日光曝晒后第4天的活性损失百分比。

[0108] 图23显示MBI-203：EP+木质素+日光曝晒，西兰花第3天的检测状况。

具体实施方式

[0109] 虽然以往的成份和方法容易出现有各种的修改和替代方式，本文中将详细说明实例内容，然而，应了解到本文所揭露并未打算限制任何应用形式，相反地，本文所指涵盖所有的修改、同等或替用方法，仍无违本发明权利请求书的精神和范围。

[0110] 应了解到本文提供的数值，除非另有特别说明者，否则所述数值位于上下单位十分之一的上下限值之间，任何其它的表示值或中间也在此范围内，而更小的范围也包括在内。这些更小范围的上下限也在所述范围内，和其它以外的特定范围内。

[0111] 除非另有说明者，本文所用的所有技术和科学术语均具有相同的含义，为所属领域技术人员所能理解者。虽然尚有其它任何类似或等同本文所描述的方法和材料，也可用于本发明的实践或测试中，本文所述为优选的方法和材料。

[0112] 需注意到除非另有特别说明者，否则本文和本专利申请书所使用的单数形式也意指复数。

[0113] 如本文所述，“取自”即意为直接从某个特定来源或从另一个具有相同特性的特定来源的物质或微生物所析离或取得。

[0114] 本无所述“载剂”为某一种惰性的有机或无机物，混合或调配其活性成份而方便应用于植物或其它处理对象或其储存、运输和/或处理中。

[0115] 本文所述“防治”为改变侵扰害虫的数量或扩散速率。

[0116] 本文所述“害虫侵扰”即害虫出现的数量会导致严重损害，包括宿主感染疾病后，出现害虫侵扰或生长系统中出现有不想要的杂草。

[0117] 本文所述“杀虫剂”为取自生物产物或化学物质的一种物质，看增加害虫的死亡率或抑制害虫的危害，包括但不限于杀线虫剂、杀虫剂、除草剂、植物杀真菌剂、植物杀菌剂和植物杀病毒剂。

[0118] 本文所述“生物杀虫剂”为一种具有杀虫毒性的微生物。

[0119] 制造方法

[0120] 如上所述，此生物杀虫剂可含有或取自跟色杆菌种色杆菌(Chromobacterium)具有相同特性的一种微生物，更具体地说，可取自一种具有跟色杆菌苏比丝加相同特性的微生物，更明确来说是取自一种色杆菌苏比丝加的菌株，此菌株具有跟NRRL B-30655或任何其它微生物相同的特性，本发明提供的方法包括通过对这些微生物培养液析离出的成份，而培养这些微生物并取得本发明中的成份。

[0121] 尤其是，此微生物可在含有养分的培养基中，使用已知的工艺进行培养。这些微生物可在实验室或使用工业用的发酵罐，放于适当的培养基在适合细胞生长的条件下，通过摇晃培养瓶进行小规模或大规模的发酵培养(包括但不限于连续、分批、分批喂养或整体一并发酵的培养方法)。此培养过程的在适当的培养基中发生，这些培养基含碳、氮和无机盐，通过本领域中已知的步骤进行培养。适用的培养基可依据本文公布的成份，市售或自行自备而取得。

[0122] 经过培养后，本发明中的化合物和/或成份即可从培养液中取得，其提取物可通过色谱法进行分馏。

[0123] 成份

[0124] 本文所揭露的成份和方法中，所使用的物质可通过任何方法进行调配。配方不限的实例包括但不限于：可乳化的浓缩物(EC)、可湿性粉剂(WP)、可溶性液体(SL)、气溶胶、超低体积的浓缩物溶液(ULV)、可溶性粉剂(SP)、微胶囊化、水分散颗粒剂(FL)、微乳剂(ME)和纳米乳液(NE)等。本文所述任何的配方中，活性成份的百分比介于0.01％到99.99％范围内。

[0125] 此成份可为液体、凝胶或固体。液体成份含取白色杆菌色杆菌(Chromobacterium)的菌株中，例如此菌株具有跟新种色杆菌色杆菌苏比丝加相同的特性，更明确来说，是具有跟NRRL B-30655(见美国专利7,244,607)相同的特性。

[0126] 此种固体成份可通过杀虫剂复合物溶液的固体载剂，于温和条件下来进行悬浮的制备，如在室温或65℃或更低的真空蒸发条件下。

[0127] 此成份含取白色杆菌种色杆菌(Chromobacterium)菌株中的凝胶封装化合物，例如此凝胶包封物可通过本发明的方法，于色杆菌的活性或非活性培养液，或色杆菌培养液或悬浮液的无细胞滤液或细胞分馏液，或喷雾或冷冻干燥培养液或杀虫剂化合物的细胞分馏液或滤液料的胶状剂来进行制备。

[0128] 此成份得再含有表面活性剂，用于乳化、分散、润湿、扩散、整合、崩解控制、稳定活性成份和改进流动性或防锈。在特定实例中，表面活性剂属无植物毒性的非离子型表面活性剂，优选自EPA惰性成份列表4B(EPA Inerts List4B)。在另一个具体实例中，非离子型表面活性剂是聚氧乙烯(20)单月桂酸酯，表面活性剂的浓度介于配方总量的0.1-35％之间，优选范围是5-25％。分散剂和乳化剂的选定，如非离子型、阴离子型、两性表面活性剂和阳离子型分散剂和乳化剂，其用量依据本发明的成份特性和药剂有助于扩散的能力而定。

[0129] 如上文所述的成份也含有一种稳定剂，可稳定生物杀虫剂的成份避免因为日光曝晒而动作物理解离和丧失活性，此稳定剂可以是苯甲酸盐或木质素磺酸盐。

[0130] 上述的成份也可混合有另一种微生物和/或杀虫剂(如杀线虫剂、杀真菌剂、杀虫剂、抗生素或抗菌剂)，此维生素包括但不限于取自芽孢杆菌、假单胞菌、短芽孢杆菌、蜡蚧轮枝菌.、非白粉寄生菌、二形性酵母菌、炼霉菌、伯克霍尔德氏菌、木霉.和粘帚菌的微生物。或者此活性剂可以是天然油或油制产物，具有杀真菌和/或杀虫活性(如石蜡油、茶树油、香茅油、丁香油、肉桂油、柑橘油和迭香油)。此外，此杀虫剂可为单点局部作用的抗真菌剂，包括但不限于苯并咪唑、脱甲基化抑制剂(DMI)(如咪唑、哌嗪、嘧啶和三唑)、吗啉、羟基嘧啶、苯胺基嘧啶、硫代磷酸酯、醌外抑制剂、喹啉、二羧酰亚胺、甲酰亚胺、苯基酰胺、苯胺基嘧啶、苯基吡咯、芳香族烃、肉桂酸、羟基苯胺、抗生素、多氧霉素、酰胺、邻苯二甲酰亚胺的苯环(xylylalanine)、咪唑、哌嗪、选自脱甲基化抑制剂和三唑的嘧啶(如双苯三唑醇、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、三唑酮、糠菌唑、环唑醇、烯唑醇、腈苯唑、己唑醇、戊唑醇、氟醚唑、腈菌唑和抑制剂以外的醌(如甲氧基丙烯酸酯类)。甲氧基丙烯酸酯类包括但不限于嘧菌酯、甲醚菌酯或肟菌酯。在另一个具体实例中，此抗真菌剂是醌，如喹氧灵(5，7-二氯-4-喹啉基4-氟苯基醚)，此抗真菌剂也可取自虎杖的提取物。

[0131] 杀真菌剂也可以是多点作用的非无机化学杀真菌剂成份，成份选自氯腈、喹恶啉、磺酰胺、膦酸酯、亚磷酸酯、二硫代氨基甲酸盐、氯化烷基硫代物(、苯基吡啶胺、氰基-乙酰胺肟。

[0132] 如上所述的此成份可再含有一种杀虫剂，此杀虫剂的成份包括但不限于阿维菌素、楝树油、多杀菌素和伯克霍尔德氏菌，内容悉如美国专利2011-0207604，昆虫病原真菌如球孢白礓菌和化学杀虫剂的成份包括但不限于有机氯化合物、有机磷化合物、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类和新烟碱类的杀虫剂。

[0133] 如上所述的此成份可再含有一种杀线虫剂，此杀线虫剂的成份包括但不限于阿维菌素和微生物产物如生物群落(坚强芽孢杆菌)、巴氏杆菌属和如皂甙的有机物。

[0134] 用途

[0135] 上述的成份、培养液、上清液和杀虫剂可作为杀虫剂使用，尤其是上述的成份或化合物可作为杀虫剂、杀菌剂(毒杀土壤中生长的细菌)和杀线虫剂。尤其是其中的杀线虫剂可通过上述的方法进行虫害防治，包括但不限于寄生线虫，如导致根结、胞囊和病变的线虫，包括但不限于根结线虫属。农田矮化线虫，冠(矛)状线虫，螺旋线虫，根腐菌，孢囊菌，黄金线虫，毛刺线虫属，钉线虫，剑线虫属和环线虫(Criconema SP)，尤其是根结线虫，以及马铃薯胞囊线虫、黄豆胞囊线虫、甜菜胞囊线虫和禾谷孢囊线虫。

[0136] 如上所述的活性成份也可应用于上述的蜱螨亚纲(蛛形纲动物)中，如螨虫，包括但不限于叶螨科如柑桔红蜘蛛和柑桔全爪螨、叶螨如神泽叶螨、二斑叶螨、太平洋红蜘蛛、草莓叶螨和朱砂叶螨、枇杷全爪螨如帕尼卡全爪螨(Panonychus panicae)(奶油果褐螨)、酪梨全爪螨(Panonychus perseae)(鳄梨螨虫)、普拉提斯全爪螨(Panonychus pratensis)(班克斯(Banks)草螨)和咖啡全爪螨、螨类如桃银螨、梅锈蜱和番茄赤褐色螨、始叶螨如瓦拉米特始叶螨、尤马红蜘蛛和六点始叶螨(Eotetranychus sexmaculatis)(斑螨)、褐螨、梨锈蜱、梨叶泡蜱、红色浆果螨、茶细蹒、柑橘芽螨、柑橘平螨、柑桔锈蜱、长腿蜘蛛、橄榄螨、根蹒、粉螨、胎膜梅螨和冬季谷物螨、牛油果红蜘蛛、平螨、黑色和红色的芒果叶螨，木瓜叶叶缘卷取螨，德州柑橘螨、欧洲红螨，葡萄的毯螨(泡蜱)、太平洋叶螨、瓦拉米特蜘蛛螨、粉红色的柑桔锈蜱，此类的防治位置点包括但不限于受到螨虫或其它蛛形纲动物(如蚜虫)侵扰的作物。

[0137]

[0138] 上述方法所防治的植物病原虫包括但不限于来自下列各纲的非蚊幼虫类，(a)鳞翅类如长翅卷蛾属、褐带卷蛾属.、透翅蛾属(Aegeria spp.)、切根虫、棉树叶虫、阿米洛斯属(Amylois spp.)、黎豆夜蛾、黄卷蛾、带巻蛾属(Argyrotaenia spp.)、丫纹夜蛾、玉米茎蛀褐夜蛾、粉斑螟蛾、桃蛀果蛾、禾草螟属(Chilo spp.)、棕色卷蛾属、葡萄果蠹蛾、水稻瘤野螟、云巻蛾属(Cnephasia spp.)、细卷娥属(Cochylis spp.)、鞘蛾属、大菜螟、苹果异形小卷蛾、小卷蛾属(Cydia spp.)、杆草螟属、苏丹棉铃虫、瘤蛾属、螟属、花小卷娥属(Eucosma spp.)、女贞细卷蛾、黄毒蛾属、切根虫属(Euxoa spp.)、果实蛾、芽广翅小卷蛾(Hedya nubiferana)、棉铃虫属、菜心野螟蛾、美国白蛾、蕃茄茎麦蛾、旋纹潜蛾、潜叶细蛾属(Lithocollethis spp.)、欧洲葡萄蛾、毒蛾属、莱氏蛾属、天幕毛虫属(Malacosomaspp.)、甘蓝夜蛾、天蛾、尺蛾、玉米螟、超小卷蛾属(Pammene spp.)、褐卷蛾属(Pandemisspp.)、冬夜蛾、棉红铃虫、马铃薯蠹蛾、纹白蝶、纹白蝶属、小菜蛾、伪巢蛾属(Prays spp.)、螟蛾属、蛀茎夜蛾属(Sesamia spp.)、长须卷蛾属、夜蛾属、兴透翅蛾、带蛾属(Thaumetopoeaspp.)、蛾属、金翅夜蛾和巢蛾属；(b)细胸属鞘翅目如叩头虫、面包虫.、青铜金龟如东方异丽金龟；棉铃象甲、谷类蚜虫、蚤凹胫跳甲、根颈象属(Cosmopolites spp.)、栗实象虫属、鞘翅类如圆头犀金龟属、鲣节虫属、玉米根虫、食植瓢虫属种、伊利莫斯属(Eremnusspp.)、马铃薯甲虫、稻属、金龟属、锯谷牙舀属(Orycaephilus spp.)、蛀象鼻虫(Otiorhynchussp.)、黑蛀象鼻虫、斑象属(Phlyctinus spp.)、豆金龟属如日本丽金龟、蚤属、谷囊属(Rhizopertha spp.)如欧洲切根鳃金龟、米象虫、麦蛾属(Sitotroga spp.)、黄粉虫属、拟谷盗.和小红鲣节虫属；(c)直翅目如比拉塔属(Blatta spp.)、蜚蠊属、蝼蛄属、马得拉蜚蠊、飞蝗属，大蠊属和沙漠虫皇属(Schistocerca spp.)；(d)等翅目如散白蚁；(e)啮虫目如书虱科；(f)虱亚目如吸血虱、毛凰属(Linognathus spp.)、虱属、瘿绵蚜属和根瘤虫牙属(Phylloxera spp.)；(g)食毛亚目如畜虱属和啮毛虱属；(h)缨翅目如花蓟马属、蓟马属(Hercinotnrips spp.)、带蓟马属(Taeniothrips spp.)、南黄蓟马、葱蓟马和非洲柑桔蓟马；(i)半翅目如臭虫属、可可瘤盲蝽、棉红蝽属、美洲蝽属(Euchistus spp.)、扁盾蝽属、稻缘椿属、蛛缘蝽属、皮蝽属(Piesma spp.)、红猎蝽属、可可褐盲蝽、稻黑蝽和锥鼻虫；(j)同翅目如卷毛粉虱、菜粉虱、肾圆盾介壳虫属、常蚜科、豆蚜、圆盾阶属(Aspidiotus spp.)、洋葱线角个木虱属(Bactericera spp.)、烟草粉虱、克螨(Ceroplaster spp.)、黑褐圆盾蝓(Chrysomphalus aonidium)、橙褐圆盾介壳虫、扁坚介壳虫、棉花小绿叶蝉、对苹果绵蚜、红斑叶蝉属(Erythroneura spp.)、家斯卡迪属(Gascardia spp.)、灰飞凰属(Laodelphax spp.)、水木坚阶(Lecanium corni)、榆蛎盾介壳虫、长管蚜属(Macrosiphus spp.)、蚜虫类、黑尾叶蝉、褐飞虱属(Nilaparvata spp.)、环翅卷蛾属(Paratoria spp.)、瘿绵蚜属(Pemphigus spp.)、动性球菌属(Planococcus spp.)、桑白盾虫介属(Pseudaulacaspis spp.)、粉蚧、木虱属、柑橘绵马蹄莲、笠圆盾蚧属(Quadraspidiotus spp.)、缢管蚜属、硬介壳虫、带叶蝉、麦二叉蚜属、谷网虫牙属(Sitobion spp.)、温室白粉虱、叉木蝨科(Triozidae spp.)、南非柑橘木虱和柑桔矢尖盾蚧；(k)膜翅目如顶切叶蚁属、切叶蚁、麦茎蜂、松叶蜂、膜翅目松叶蜂科、松叶蜂、实叶蜂属(Hoplocampa spp.)、蚁属、法老蚁、新锯角叶虫奪属(Neodiprion spp.)、火蚁(Solenopsis spp.)和膜翅目胡蜂属；(1)双翅目昆虫如伊蚊属、高梁芒蝇、毛蚋、红头丽蝇(Calliphora erythrocephala)、地中海实蝇属、丽蝇属、黄狂蝇属、寡毛实蝇属、地种蝇属、甘蓝地种蝇、果蝇属如樱桃实蝇；厕蝇属、马胃蝇蛆和成蝇、采采蝇、牛皮蝇属、虱蝇属、美洲斑潜蝇属、绿头苍蝇、潜蝇、家蝇属、狂也黾属(Oestrus spp.)、瘿蚊属(Orseoliaspp.)、黑麦秆蝇、菠菜潜叶蝇、草种蝇属(Phorbia spp.)、苹果实蝇、菇蚋、螫蝇属(Stomoxysspp.)、虻属、螗蜩属(Tannia spp.)和大蚊属(Tipula spp.)；(m)蚤目(Siphonaptera)如角叶蚤属(Ceratophyllus spp.)和雌印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis)；(n)来自蜉蝣纲如蠹鱼；(o)半翅目如木虱如马铃薯木虱。此活性成份可用于出现有金龟害虫的区域，包括但不限于土壤、草地和不同的观赏植物、树木和蔬菜。

[0139] 上述的活性成份也可应用于出现有蝇科害虫的区域，包括但不限于室内环境、垃圾、动物身上、围篱、畜栏、谷仓、挤奶棚和动物育种栏等(牛、猪、羊、马等)。

[0140] 上述的活性成份可再适用于出现有拟步行虫科的区域，包括但不限于谷物、家畜和家禽栏棚(围栏，围栏，谷仓，挤奶厅，产仔笔等)含有动物(牛，猪，羊，马等)(围篱、畜栏、谷仓、挤奶棚和动物育种栏等)和动物栏棚等(牛、猪、羊、马等)。

[0141] 实例

[0142] 上述的成份不受限于下列的应用实例中，这些实例仅提供不同的具体事例，但不仅限于本发明专利请求列举的相关物质、条件、重量比、工艺参数和类似的内容等。

[0143] 实例1：从色杆菌苏比丝加提取克罗玛德、脱氧紫色杆菌素和紫色杆菌素[0144] 下列步骤用于纯化取白色杆菌苏比丝加培养液的化合物：

[0145] 培养液取自10-L的色杆菌苏比丝加的发酵培养液中，通过安珀莱特(Amberlite)XAD-7树脂仅(阿索卡(Asolkar)等人，2006)以225rpm的转动速度于室温下持续摇晃悬浮液2小时而进行提取，树脂和细胞块使用棉布过滤，然后再使用蒸馏水洗去盐份。树脂、细胞块和棉布在浸入丙酮/甲醇(50/50)中持续2小时，然后将丙酮/甲醇溶液滤出，于真空中使用转动式的蒸发器干燥并析出粗提取物，此粗提取物再使用塞法戴克斯(Sephadex)LH20尺寸排阻色谱仪(CH2Cl2/CH30H；50/50)进行分馏，而析出7个分馏物(图1)，这些分馏物再使用转动式蒸发器干燥浓缩，干燥后的残留物使用甘蓝尺蠖夜蛾(Trichoplusia ni)或甜菜夜蛾的生物测定进行生物活性的筛检，活性分馏物即可使用反相HPLC(光谱系统P4000(赛默科技(Thermo Scientiﬁc))析出纯化合物，再通过上述的生物测定进行筛检而找出/辨识出活性化合物。要确认化合物时，可采用其它的质谱数据资料如LC/MS和NMR的纪录值。

[0146] 克罗玛德A(1)和化合物B即分别取自分馏物1和2，紫色杆菌素(2)和脱氧紫色杆菌素(3)通过塞法戴克斯.LH20色谱仪从分馏物5进行纯化。

[0147] 化合物的纯化

[0148] 克罗玛德A(1)的纯化可通过HPLC C-18色谱仪(菲罗门，鲁那，10u C18(2)100A，250×10)来进行，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-10分钟80-75％CH3CN溶液、10至45分钟75-60％CH3CN溶液、45-55分钟60-50％CH3CN溶液、55-65分钟50-100％CH3CN溶液、65-70分钟100％CH3CN溶液、55-70分钟0-80％CH3CN溶液)，在2.5毫升/分钟流速和UV检测器波长210nm下检测，活性成份化合物克罗玛德A(1)的保留时间为23.19分钟。

[0149] 本发明化合物B的纯化可通过HPLC C-18色谱仪(菲罗门，鲁那，10u C18(2)100A，250×10)，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-10分钟80-75％CH3CN溶液、10至45分钟75-60％CH3CN溶液、45-55分钟60-50％CH3CN溶液、55-65分钟50-100％CH3CN溶液、
65-70分钟100％CH3CN溶液、55-70分钟0-80％CH3CN溶液)，在2.5毫升/分钟流速和UV检测器波长210nm下检测，活性成份化合物B的保留时间为26.39分钟。

[0150] 紫色杆菌素(2)和脱氧紫色杆菌素(3)的纯化可通过HPLC C-18色谱仪(菲罗门，鲁那，10u C18(2)100A，250×10)，使用水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-10分钟70-60％CH3CN溶液、10-40分钟60-20％CH3CN溶液、40-60分钟20-0％CH3CN溶液、60-65分钟100％CH3CN、65-75分钟0-70％CH3CN溶液)，在2.5毫升/分钟流速和UV检测器波长210nm下检测，活性成份化合物紫色杆菌素(2)的保留时间为7.86分钟，而活性化合物脱氧紫色杆菌素(3)的保留时间为12.45分钟。

[0151] 化合物的质谱分析

[0152] 活性峰值的质谱分析通过赛默菲尼根(Thermo Finnigan)LCQ Deca XP Plus电喷plus洒仪器(ESI)，使用阳离子化和阴离子化模式，于LCQ DECA XP 质谱仪(赛默电子公司(Thermo Electron Corp.)，圣何塞(San Jose)，CA)进行权扫描(m/z100-1500Da)。高效液相色谱仪(HPLC)加装有费妮根苏威业(Finnigan Surveyor)PDA侦测器、自动采样器、MS 泵和一个4.6mm×100mm鲁那C185μ100A的色谱仪(菲罗门)，此溶剂系统使用水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)，流动相始于10％的溶剂B，经过20分钟溶剂B线性增加到100％，然后持续4分钟，最后经过3分钟后溶剂B回到10％，流速为0.5mL/min，注射量为1OuL，而自动采样器中的样本放于室温中。此化合物通过LC-MS使用LC和反相质谱仪进行分析，本化合物的质谱分析条件如下：氮气流速固定为30，而鞘气流速和辅助器流速固定为15arb。电喷洒离子化使用喷洒电压5000v和毛细管电压35.0v来进行，毛细管温度设定为400℃，数据资料通过石卡里布(Xcalibur)软件来分析。在阳离子化模式下的克罗玛德A(1)分子量为
860，另一个活性化合物B的LC-MS色谱显示在阳离子化模式下的分子量为874，紫色杆菌素(2)和脱氧紫色杆菌素(3)的分子量分则别为313和327。

[0153] 化合物的NMR核磁共振光谱分析

[0154] 于布鲁克(Bruker)600MHz梯度场光谱仪中，进行NMR核磁共振光谱分析，参考值设定为四甲基硅烷(TMS，0.00ppm)的内部标准值，使用日立(Hitachi)8800氨基酸分析仪进行氨基酸的分析。

[0155] 关于结构鉴定，分子量860的纯化克罗玛德的进一步分析，可使用600MHz NMR核1
磁共振光谱分析仪，其 H NMRδ值为8.89、8.44、8.24、8.23、7.96、7.63、6.66、5.42、5.36、
5.31、5.10、4.13、4.07、4.05、3.96、3.95、3.88、3.77、3.73、3.51、3.44、3.17、2.40、2.27、
2.11、2.08、2.03、2.01、1.97、1.95、1.90、1.81、1.68、1.63、1.57、1.53、1.48、1.43、1.35、
13
1.24、1.07、1.02、0.96、0.89、0.88、0.87、0.80(见图4)，C NMRδ 值为 73.62、172.92、
172.25、172.17、171.66、171.28、170.45、132.13、130.04、129.98、129.69、129.69、125.48、
98.05、70.11、69.75、68.30、68.25、64.34、60.94、54.54、52.82、49.72、48.57、45.68、
40.38、39.90、38.18、36.60、31.98、31.62、31.58、29.53、28.83、27.78、24.41、23.06、
22.09、20.56、19.31、18.78、17.66、15.80。克罗玛德A经析出为白色固体，通过ESI高分辨率质谱仪(M+m/z观察值为861.5376，M+m/z计算值为861.5343)分析得到的分子式
1
为C43H68N6O12(13个不饱和度)。克罗玛德A在DMSO-d6的 H NMR的光谱数据资料中，显示有68个质子信号[δH：8.89，8.44，8.23，8.22，7.96，7.64，6.65，5.10，4.13]，因为在异核
13
NMR(HMQC)分析中缺乏关联性，可识别为NH或OH。 C NMR光谱显示出现有7个羰基信号
1
[δc：173.62，172.92，172.25，1.72.17，171.66，171.28，170.45]，在 H NMR光谱中出现有6个氨基质子信号[δH：4.07，4.06，3.96，3.95，3.88，3.72]，经观察显示克罗玛德A是一种肽类物质。

[0156] 2D NMR数据解读显示在6个氨基酸单位中有3个是由1个亮氨酸(Leu)、1个缬氨酸(Va1)和1谷氨酰胺(G1n)所组成。可通过氨基酸分析确认这些氨基酸的存在，也显示出现有上述3个氨基酸。DEPT和2D NMR光谱数据(COSY、HSQC和HMBC)的进一步分析中，证明3种次结构I、II和III的存在。

[0157]

[0158] 在1中，3中次结构的关联性可使用a-氨基质子和/或仲酰胺质子和羰基碳的共振和化学位移进行一股的HMBC NMR分析，次结构I中C-9跟次结构C-10的连结，可通过HMBC从CH3-40[δH：1.00]和丙氨酸a-氨基质子[δH：3.42]对C-10碳[Hc：70.11]的关联性而得到证明，此结果可再通过羟基[δH：5.101跟C-9[δc：49.78]的三键HMBC关联性得证，次结构II中的亚甲基[Hm：3.50]显示对连结次结构I和II的C-19[Hc：68.31]具有3个HMBC键结的关联性。C-3[Hc：98.09]的季碳通过H-21[HH：3.95]和其化学位移的弱键结跟C-21[Sc：64.40]连接而形成一个环状系统。最后，此封闭环由H3-36[HH：1.431连结C-1[Hc：172.17]的3个HMBC键结来固定，即可识别为克罗玛德A(1)的平面结构。

[0159] 化合物B的分子量为874，具有类似的NMR和UV数据，即表示此化合物B属肽类物质。

[0160] 紫色杆菌素(2)和脱氧紫色杆菌素(3)的结构可比较文献的数据得出，克罗玛德A、紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素的结构如图2所示。

[0161] 实例2：克罗玛德A的氨基酸分析

[0162] 克罗玛德A(0.05mg)通过液相水解(6N HCL，1％苯酚，110℃，真空处理24小时)进行水解，冷却后，将反应混合物干燥，并将水解产物稀释于缓冲液中达1.0mL的体积，将50μ1的样本溶液放在离子交换柱上进行分析。

[0163] 为能够进行标准化的校准，将氨基酸标准液放在日立8800(西格玛(Sigma)，A-9906)的Na-基分析仪进行蛋白质水解物的分析，用于测定响应因子，借此进行日立8800分析仪对所有氨基酸的校准。各个注射物含有正亮氨酸作为内部标准物，可进行样本体积和色谱变量的结果校正。系统采用皮克林(Pickering)钠缓冲液、皮尔斯西奎那尔(PierceSequana1)级盐酸(水解)、一个郎吉米克(Transgenomic)离子交换柱和加州大学戴维斯分校分子结构基金会(MSF)开发的优化方法，并记录出现于样本中的各别氨基酸成份。发现样本中的氨基酸(克罗玛德A)是G1x(谷氨酰胺/谷氨酸)、leu(亮氨酸)和Val(缬氨酸)。

[0164] 实例3：色杆菌苏比丝加(MBI-203)对豆科植物二斑叶螨的防治效果

[0165] 冷冻干燥的MBI-203混合有蒸馏水，让全细胞培养液的当量达到不同的浓度，未侵染的豆科植物菜豆(Phaseolus vulgaris)使用MBI-203进行喷洒。然后从经过喷洒的植物取出叶片，放置在装有二斑叶螨的培养皿中作为其食物来源，将10只螨虫放在每个培养皿中，在75°F下保温12：12(L：D)。在第1、3、7天后记录螨虫的死活数量，将1个份量的CFD冻干物放入浓缩的全细胞培养液中(0.0103克冻干物/毫升蒸馏水)，其结果如图3。

[0166] 实例4：色杆菌苏比丝加(MBI-203)对金盏花二斑叶螨的防治效果

[0167] 金盏花和万寿菊受到二斑叶螨的侵扰，使用配方产品(MBI-203)或土荆芥(市售产品名称为瑞奎木 (REQUIEM )属加州戴维斯阿加斯特(AgraQuest)公司出品)用于害虫侵扰的植物中，温室温度的范围为约72-85°F，取样时，即采取6平方厘米的叶面，并算出存活和死亡的幼虫数，其结果如表l。

[0168] 表1：MBI-203和瑞奎木⑧的比较

[0169]

[0170] 实例5：色杆菌苏比丝加(MBI-203)筛检对四季豆(MBI-203)二斑叶螨(TSSM)的防治效果

[0171] 受到TSSM的四季豆或对阿维菌素具有抗药性的TSSM，喷洒0.5％、l％、2％和4％v/v的MBI-203稀释配方，喷洒面积约100加仑/英亩，使用9天后观察其死亡率，结果如表2。

[0172] 表2：MBI-203对四季豆TSSM的虫害防治效果

[0173]

[0174]TSSM易感性阿维菌素抗药性TSSM
减低％减低％
浓度卵蛹成虫卵蛹成虫
0.5％ 0 0 0 了匕了匕了匕
l％ 0 0 0 0 0 0
2％ 8 15 25 0 0 0
4％ 55 55 60 0 0 0

[0175] 实例6：筛检MBI-203对草莓二斑叶螨的防治效果

[0176] 有5种化合物和MBI-203的成份于佛罗里达州墨西哥湾研究教育中心进行草莓田TSSM的防治效果研究，将种苗移植到农田(第0天)中，各个12.5英尺的培养盆种有20株，培养盆从第55天到第77天中，各株受到10到20只螨虫的侵扰共4次，使用杀螨剂进行不同速率和排程的防治处理，某些混合有增效剂，并于RCB的设计中进行未经处理的检测4次，防治处理使用手提式喷洒器以4碟式的喷嘴进行45度的喷洒，喷洒器使用CO2加压到40psi，每英亩喷洒100加仑后进行校准。从第90天到最后的防治处理2周后第l天(第154天)前的期间中进行采样，进行每个培养盆叶片的10次随机采样，从植株中央1／3表层处进行采样，使用转动的粘碟从叶片刷下螨虫和TSSM卵并进行计数，未观察到植物毒性，结果如表3和表4。

[0177]

[0178]

[0179]

[0180]

[0181] 实例7：色杆菌苏比丝加(MBI-203)对家蝇的效果

[0182] 筛检测试物而用于测试对家蝇(成虫)直接接触的防治效果，各种化合物建立3个测试群组：1.5％、3％和6％的浓度添加未处理的对照组，各个群组含5个相同的样本约有10只家蝇，节肢动物使用手提式的喷洒器进行防治处理，直到所有区域喷洒完成为止，使用加盖的16盎司装饮料杯装填。在4小时的期间中，使用棉花球沾有10％的蔗糖溶液放入杯盖中提供家蝇食用，于第5、15、30、45和60分钟和第2、4和24小时或直到时间终了而记录相关数据，算出家蝇的死活数量，濒死的家蝇不列入计算中，结果如表5。

[0183] 实例8：色杆菌苏比丝加(MBI-203)对枯叶甲虫的防治效果

[0184] 有3个防治处理群组进行各个化合物的测试：1.5％、3％和6％的浓度添加未处理的对照组，各个群组含5个相同的样本约有10只家蝇。节肢动物使用手提式的喷洒器进行防治处理，直到所有区域喷洒完成为止，使用加盖的8或16盎司装饮料杯装填，杯子底部有滤纸用于吸收任何过量的物质。于防治处理后的第5、15、30、45和60分钟和第2、4、24、48和72小时，算出家蝇的死活数量，濒死的家蝇不列入计算中，结果如表6。

[0185]

[0186] 实例9：MBI-203对马铃薯木虱马铃薯/番茄木虱产卵能力的影响

[0187] 方法

[0188] 马铃薯木虱曝露于经过MBI-203处理掉辣椒叶用于测定其产卵能力，将辣椒叶的茎和叶切下，浸泡MBI-203持续约1分钟，处理方法如下：MBI-203放入10％v/v的蒸馏水中，蒸馏水作为阴性对照组，阿维地的10％v/v溶液作为阳性对照组，经处理过的叶子放入塑料培养皿中，将叶缘外露内部放有泡绵，将圆心部位切割让经处理过的叶子外露。

[0189] 1天龄的母虫放于培养皿中央曝露于经处理过的叶子中(泡绵经切割外露的部分)再盖上盖子，然后使用两个夹子固定，母成虫即可产卵，于曝露后的第3到10天计算产卵数。

[0190] 进行经MBI-203处理过和未处理过叶子的生物测定，以验证MBI-203对马铃薯木虱产卵能力的影响效果，将MBI-203处理液放入3％v/v的水中，而未处理过的对照组仅加入蒸馏水(阴性对照组)用于进行生物测定，辣椒叶的培养皿(3-4周龄的辣椒株)使用23mm的饼干切割器切成圆形，选定叶子扁平的部位确保培养皿可平放于处理过后的琼脂培养皿上，培养皿底部盖有30μL的1％琼脂溶液，其数量仅足以覆盖培养皿底部让培养皿突出维持适当的湿度。琼脂在室温下固化，将处理液倒入玻璃培养皿中，让其完成浸泡整个培养皿，持续处理1分钟，经处理过的叶片再使用通风柜干燥10到15分钟，或直到叶片表面的溶液完全干燥为止。在各个固化的琼脂培养皿中，将30μL蒸馏水滴于琼脂上，各个经处理过的叶片即可各别放于琼脂培养皿上，将叶片背面朝向湿琼脂上，将叶片轻轻压入琼脂中。在每个处理过的叶片(经处理过)放入4只木虱，将放有产卵母虫的培养皿盖子使用封口膜密封盖上，戳出一个小孔让其通气和防止结露。培养皿使用石蜡膜密封放于室温下，放入母虫后的第1天，即开始计算每天的产卵数，使用3组进行实验并各重复两次。

[0191] 结果

[0192] 曝露于MBI-203的母虫，其产卵数明显下降，经MBI-203处理过的叶片母虫的产卵时间受到些许的延迟，曝露于MBI-203叶片的木虱母虫于曝露后的第3天开始产卵(图4)，在第7天产卵数达到高峰，在第10天产卵数下降，因为母虫开始进行孵化，让第10天的产卵平均数下降，曝露于阳性对照组的母虫(阿维地10％v/v)于第3天死亡并未在经处理过的叶片中产卵。

[0193] 叶片的生物测定证实母虫经过MBI-20的33％v/v溶液处理，母虫产卵数明显下降的一致结果(图5)，相较于曝露在未经处理的叶片(仅放有蒸馏水)中，曝露于经过处理的叶片让母虫的产卵数减少65％，这些生物测定结果显示MBI-203会影响降低木虱母虫的产卵能力。

[0194] 实例10：MBI-203对蛴螬和甲虫的影响

[0195] 对草坪草白色蛴螬的防治效果

[0196] 杀虫剂用于评估在肯塔基蓝草(草地早熟禾(Poa pratensis L))和内布拉斯加州北本德(North Bend)高尔夫球场草地中，对白色蛴螬的防治效果(南方假面金龟子(SouthernMasked Chafer)，南方圆头犀金龟(Cyclocephala lurida Bland))，杀虫剂施用于随机的5×5英尺的培养盆农地(RCB)中，重复试验5次，液态产品采用40psi压力的C02喷洒器喷洒174gpa。使用后的24小时期间，使用经处理过的培养盆加水灌溉，于处理(DAT)后的第24天和第48天，将培养盆的植株移除，以8英寸直径的土壤(总面积1.05ft2)3英寸深的部位，算出存活和垂死的蛴螬数量，定期进行培养盆的药害检测，结果如表7和8。

[0197] 在用量和MBI-203DF1的防治效果上似乎有其相关性，在所有的处理样本中，MBI-203DF1(2fl oz/100ﬁ2)的效果优于拜耳作物科学(Bayer CropScience)制造即一股业界普遍使用的蛴螬杀虫剂产品6％三氯松(trich1orfon)(市售产品名称为迪洛斯2
(DYLOX )420SL(6.9fl.oz/1000ft)。有趣的是，所有垂死的蛴螬都出现于MBI-203AF1和MBI-203DF1的处理样本中，这些数字(括号中的数字)并未用于统计中但用于比较，未发现到药害，在色杆菌苏比丝加的配方中，AF1具有水溶性而DF1是可湿性的粉剂。

[0198] 表7：MBI-203处理后第24天(24DAT)对白色蛴螬的防治效果

[0199]

[0200]

[0201] 表8：MBI-203处理后第43天(43DAT)对白色蛴螬的防治效果

[0202]

[0203] 相同字母标示的平均数并无明显的统计显著性(P>0.05，LSD=4.4)

[0204] MBI-203对根饲养甲虫防治效果的喂养研究

[0205] 未经杀菌的格罗顿(Groton)土壤4.25pH有14％的有机物受到金龟子幼虫(东方异丽金龟)的侵扰，算出死亡的幼虫数，次土壤加有MBI-203的水溶性配方，并算出害虫的[0206] 死亡率：

[0207] 表9：MBI-203对东方甲虫幼虫的防治效果

[0208]

[0209] 圣甲虫欧洲切根鳃金龟(欧洲金龟子)蛴螬也使用1.5m1和l ml产品放入5g的土壤中，进行类似的实验，在处理后的第7天有100/100的幼虫死亡，对照组则无任何死亡的案例。

[0210] 次实验也同样用于黑色蛀象鼻虫的幼虫黑蛀象鼻虫(象虫科)，实验采用盆栽土壤(无

[0211] 食物来源)和胡萝卜和红豆杉根等培养媒介物，结果如表10、11、12和13。

[0212] 表10：盆栽土壤的MBI-203防治效果

[0213]死亡率％7DAT 死亡率％14DAT
.9ml产品/3g媒材(30％土壤水分) 0 0
.6ml产品/3g媒材(20％土壤水分) 0 0
对照(30％水分) 0 0
对照(20％水分) 0 0

[0214] 表11：MBI-203随同浸泡产品的防治效果

[0215]死亡率％3DAT
胡萝卜切片浸泡于产品中 100
胡萝卜切片浸泡于去离子水(对照组)中 0

[0216] 表12：MBI-203随同曼地亚红豆杉根的防治效果死亡率％3DAT
曼地亚红豆杉根浸泡于产品中进行干燥 90
曼地亚红豆杉根浸泡于去离子水中进行干燥 0

[0217] 表13：MBI-203随同胡萝卜切片(已干燥)的防治效果

[0218]死亡率％3DAT
胡萝卜切片浸泡于产品中进行干燥 60
胡萝卜切片浸泡于去离子水中进行干燥(对照组) 0

[0219] 显示MBI-203对于根饲养圣甲虫和象鼻虫具有非常好的防治效果，尤其是以根为食物的害虫。

[0220] 实例11：MBI-203对大白菜根蛆的防治效果

[0221] 本研究用于测定MBI-203配方对温室培养西兰花植物害虫的白菜蛆虫(甘蓝地2
种蝇)防治效果，MBI203DF-1(MBI-203的可湿性粉剂配方)的实验用量为2盎司/1000ft
2
和8盎司/1000ft ；MBI203DF-2(MBI-203的第2种可湿性粉剂配方)，其用量为2盎司
2 2
/1000ft 和8盎司/1000ft，实验处理结果用于跟市售产品拉点特 (Radiant )(陶氏益农(DowAgro Sciences)制造的市售产品含丝平拉姆(spineforam)作为活性成份)用量为
1磅/加仑来进行比较。

[0222] 第3次施用(14DA-C)14天后，每周记录成虫和幼虫的存活数量，直到21DA-C为止。结果显示相较于拉点特，MBI203DF-1于最后评估日明显减低成虫的存活数量。于最后评估日计算下，相较于拉点特对照组，MBI203DF-1可明显减低成虫的存活数量。

[0223] 表14：评估日登录每次处理后的甘蓝地种蝇蛆虫数和幼虫平均数

[0224]处理号次处理用材名称用量用量单位编码 7DA-C 14DA-C 21DA-C
1 未处理 ABC 5.75a 6.25a 6.50a
2 MBI203DF-l 2 oz/1000ft2 ABC 5.00ab 5.00ab 4.25b
3 MBI203DF-1 8 oz/1000ft2 ABC 4.75ab 3.00c 3..0bc
4 MBI203DF-2 2 oz/1000ft2 ABC 6.50a 5.50ab 4.25b
5 MBI203DF-2 8 oz/1000ft2 ABC 5.25ab 3.00c 1.50cd
8 拉点特 10 f1oz/a AC 1.50c 1.00d 1.00d

[0225] 表15：评估日登录每次处理后的甘蓝地种蝇防治效果百分比

[0226]处理号次处理用材名称用量用量单位编码 7DA-C 14DA-C 21DA-C
1 未处理 ABC 0.00c 0.00d 0.00d
2 MBI203DF-l 2 oz／1000ft2 ABC 13.04bc 20.00cd 34.62c
3 MBI203DF-l 8 oz／1000ft2 ABC 17.39bc 52.00b 46.15bc
4 MBI203DF-2 2 oz／1000ft2 ABC 0.00c 12.00cd 34.62c
5 MBI203DF-2 8 oz／1000ft2 ABC 8.70bc 52.00b 76.92ab
8 拉点特 10 f1oz/a AC 73.9l a 84.00a 84.62a

[0227] 实例12：MBI-203DFl和MBI-203DF2对温室培养草莓樱桃果蝇(斑翼果蝇(sWD))的防治效果

[0228] 本研究用于测定MBI-203DFl和MBI-203DF2对温室培养草莓斑翼果蝇(SWD)的防治效果，MBI-203DF1和MBI-203DF2的培养盆用量为l lb／a和4lb／a，本实验用于跟市售产品因鲁斯特 (Entrust )用量为1.5oz/a进行比较，所有的处
理样本加有表面活性剂喜威 (SILWET )L77(科聚亚阿罗替丝公司(Chemtura
AgroSolutions，Inc.))其用量为0.05％v/v，各个培养盆栽有草莓植株用于测定害虫的变化数量。

[0229] 实验室所培养第3代的SWD成虫放入各个草莓移植的植株中，施用前(实际计数前)先记录SWD成虫的数量，再于施用后的第4天、第7天和第ll天记录成虫数量，也分别于14DAA、2l DAA、28DAA和35DAA记录每个草莓的SWD幼虫数量，进行阿诺瓦的LSD统计分析而a＝0.05。

[0230] 在第 1次施用后，MBI-203 处理样本显示使用DFl和DF2产品后，斑翼果蝇的成虫数量逐渐减少。虽然相较于因鲁斯特⑧( 多维阿罗西斯 (DOW
AgroBioSciences)) 含多杀菌素(spinosad)的活性成份并无显著的效果，但
MBI-203DF2的用量为4lb/a时，于施用后(DAA)第7天，相较于UTC可明显减少成虫
数量达25％。到了11DAA，DFl和DF2的用量41b/a可降低成虫数量达44％，虽然跟
UTC并无显著的差异，但MBI-203产品显示可协助减少SwD幼虫的数量。在所有的评估中，DF2的用量为41b/a可明显减少各个草莓的幼虫数量达71％，而因鲁斯特 (多维阿罗西斯)含多杀菌素作为活性成份于21DAA达78％，相较于因鲁斯特 (多维阿
罗西斯)，所有的MBI一203对幼虫的防治数量可达72％，也对MBI一203DFl和DF2
用量对幼虫数量的防治效果进行观察。

[0231] 结果：

[0232] 表16：评估日登录对植株每次防治处理后，樱桃果蝇成虫的百分比和平均数[0233]处理号次处理用剂名称用量用量单位编码计数前 4DAA 7DAA ll DAA
1 未处理 ABC 25.00a 23.25a 16.00ab 4.00a
2 MBI-203DF l 1 lb/a ABC 25.00a 21.25a 14.75ab 2.75a
喜威L77 0.05 ％v/v ABC
3 MBI-203DF l 4 lb/a ABC 25.00a 19.75a 13.50ab 2.25a
喜威L77 0.05 ％v/v ABC
4 MBI-203DF2 1 lb/a ABC 25.00a 21.00a 18.00a 3.00a
喜威L77 0.05 ％v/v ABC
5 MBI-203DF2 4 lb/a ABC 25.00a 19.75a 12.00b 2.25a
喜威L77 0.05 ％v/v ABC
6 因鲁斯特 1.5 Oz/a ABC 25.00a 8.25b 0.00c 0.00b
喜威L77 0.05 ％v/v ABC

[0234] 表17：评估日登录对植株每次防治处理后，樱桃果蝇幼虫的百分比和平均数[0235]处理号次处理用剂名称用量用量单位编码 14DAA 21DAA 28DAA 35DAA
1 未处理 ABC 0.00d 0.00b O.00b 0.00c
2 MBI-203DF l 1 lb/a ABC 41.52c 54.22a 42.83ab 44.44b
喜威L77 O.05 ％v/v ABC
3 MBI-203DF l 4 lb/a ABC 54.78bc 67.85a 88.11a 100.00a
喜威L77 O.05 ％v/v ABC
4 MBI-203DF2 1 lb/a ABC 52.97bc 60.58a 64.33a 88.89a
喜威L77 O.05 ％v/v ABC
5 MBI-203DF2 4 lb/a ABC 71.36ab 72.16a 88.11a 100.00a
喜威L77 O.05 ％v/v ABC
6 因鲁斯特 1.5 Oz/a ABC 78.12a 69.19a 100.00a 100.00a
喜威L77 O.05 ％v/v ABC

[0236]

[0237] 发现结果摘要如下：

[0238] 观察到MBI-203DF1和DF2用量对SWD成虫和幼虫数量的影响。

[0239] MBI-203DF2用量为41b/a于7DAA可明显降低成虫的数量达25％。

[0240] 在整个实验进行中，相较于因鲁斯特，DF2用量为41b/a可明显降低各个草莓的幼虫数量。

[0241] 虽然两种产品的使用对成虫的数量并无明显的影响，但可显著降低下一代的幼虫数量。

[0242] 实例13：MBI-203对蚜虫的驱除效果

[0243] 本实验进行不同浓度的MBI-203对桃蚜的驱除效果，通过MBI-203水溶液(1％v/v，3％v/v和10％v/v)处理下进行相关的评估。MBI-20310％v/v的浓度作为阳性对照组和装有蒸馏水者作为阴性对照组，各种防治处理溶液添加有0.0l％吐温(TWEEN)20。

[0244] 辣椒叶片经过上述浓度的MBI-203处理后，再进行生物测定，辣椒叶片(3_4周龄的植株叶片)使用23mm的切割器进行切割，选定扁平的叶片部位确保经过药剂处理后可平放于琼脂培养皿上。加入融化l％的琼脂溶液，倒入145mm×20mm的培养皿，让数量足以覆盖培养皿底部表面可让叶片突出而保持其湿度，琼脂即可通过室温冷却来固化。

[0245] 将处理液放入玻璃培养皿中进行叶片的处理，叶片中放入溶液，轻轻转动并完全浸泡叶片，持续1分钟即可完成，经过处理的叶片使用夹子值溶液中取出，放于通风柜15分钟以进行干燥，或直到叶片表面完全干燥为止。叶片干燥后，加入40L的水于放有叶片的琼脂中，经过处理的叶片以相同之间距摆放于浸湿的琼脂上，将各个叶片背面朝下，轻压各个叶片浸入琼脂中，再使用刷子放入20只3-4天龄的GPA成虫于叶片中央，培养皿即盖上盖子加以密封，培养皿的盖子戳有小孔让其通气和防止结露。

[0246] 在各个植株进行测试，于成虫放于经处理过叶片的培养皿24小时后，测定成虫和蛹的驱除数量，各个叶片出现的蚜虫(成虫和蛹的数量)加以计算并记录相关的数据。

[0247] 结果

[0248] 不同浓度的MBI-203对GPA成虫和蛹有97-99％的驱除效果(表18)，图6显示不同处理浓度的统计差异性，MBI-203的浓度为3％和l％v/v时，其驱除效果的平均百分比达97％和99％。

[0249] 表18：辣椒叶片经过MBI-203不同浓度处理后对桃蚜(GPA)成虫和蛹驱除效果的百分比

[0250]处理驱除效果平均百分比％
MBI-203std3％v/v 97
MBI-203std l％v/v 99
MBI-203std10％v/v 97

[0251] 实例14：MBI-203施用会减少蚜虫后代

[0252] MBI-203的浓度为3％v/v可用于测定对桃蚜(GPA)成虫产卵的防治效果，生物测定则采用含MBI-203其浓度为3％v/v而经过处理的辣椒叶片，将辣椒叶片(取自3-4周龄的植株)使用23mm的切割器切割成圆形，选定叶片扁平的部位，确保叶片可平放于琼脂培养皿上，加热软化1％琼脂溶液，倒入30gL于培养皿(16mm×35mm通风的聚苯乙烯培养皿)上，其数量仅足以覆盖培养皿底部让培养皿突出维持适当的湿度。琼脂在室温下固化，将处理液倒入玻璃培养皿中，让其完成浸泡整个培养皿，持续处理1分钟，经处理过的叶片再使用通风柜干燥10到15分钟，或直到叶片表面的溶液完全干燥为止。在各个固化的琼脂培养皿中，将30gL蒸馏水滴于琼脂上，各个经处理过的叶片即可各别放于琼脂培养皿上，将叶片背面朝向湿琼脂上，将叶片轻轻压入琼脂中。在每个处理过的叶片(经处理过)放入6只GPA成虫(3_4天龄)，将放有产卵母虫的培养皿盖子使用封口膜密封盖上，戳出一个小孔让其曝气和防止结露。培养皿放于室温下保温，放入母虫后的第3天，即开始计算每天的产卵数，使用3组进行实验并各重复5次。

[0253] 图7显示接触过处理叶片后的第3天，MBI-203即明显影响到GPA成虫的产卵数，图5内容为5次实验中，相对于阴性对照组(仅含有蒸馏水)和阳性对照组(阿维地10％)，可观察到GPA成虫的产卵数减少可达50％，显示对产卵数具有相同的统计差异性。带产卵数比对配方产品DF2的防治效果时，MBI-203标准液和DF2浓度为3％v/v时，并无统计上的差异性(图8)。相较于阴性对照组，MBI-203和DF2的防治处理可降低产卵数(蛹)超过90％，显示相关较阿维地10％v/v的浓度(阴性对照组)更好。

[0254] 实例15：来自色杆菌苏比丝加的紫色杆菌素和寡-(p-羟基丁酸)提取物

[0255] 下列步骤用于色杆菌苏比丝加培养液提取物纯化：

[0256] 全细胞培养液(WCB)通过液一液提取法使用乙酸乙酯值L-培养液中提取20-L的发酵色杆菌苏比丝加成份，乙酸乙酯层于真空下使用旋转蒸发器干燥分离而取得粗提取物，此粗提取物再使用不同的溶剂如二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EA)和甲醇(MeOH)进行分馏，再使用WASH溶剂洗涤，这些馏分物使用旋转蒸发器进行浓缩干燥，其干燥的残留物使用不同的害虫(昆虫和线虫)进行生物活性的筛检，其活性馏分物再进行塞法戴克斯LH20色谱仪(CH2C12/CH30H；50/50)的分析而提供有10各馏分物(图9)，这些馏分物再使用旋转蒸发器浓缩干燥，其干燥残留物(馏分物)再使用桃蚜、桃蚜(GPA)和线虫(南方根结线虫(M.incognita)和/或北方根结线虫(M.hapla))的产卵数，进行其生物驱除效果相关的生物活性测定，次活性成份再使用反相HPLC(光谱系统P4000(赛默科技)析出纯化合物，再通过上述的生物测定进行筛检来找出/识别其活性化合物。为能够确认识别此化合物，应记录有其它的光谱数据如LC/MS和NMR。

[0257] 将可能具有驱虫效果的化合物从馏分物F8、F9和F10析出，经识别为紫色杆菌素(2)，此具有线虫驱除活性的化合物主要来自DCM的馏分物，次化合物也经识别为寡-(β-羟基丁酸)(4)。

[0258] 化合物的质谱分析

[0259] 活性峰值的质谱分析于赛默菲尼根LCQ Deca XP Plus电喷洒(ESI)测量仪，使用阳plus性和阴性离子化模式的全扫描模式(m/z100-1500Da)在LCQ DECA XP 质谱仪(赛默电子公司，圣何塞，CA)上进行测定，高效液相层析仪(HPLC)加装有费妮根苏威业PDA侦测器、自动采样器、MS泵和1个4.6mm×100mm鲁那C185μ100A的色谱仪(菲罗门)，溶剂相同含水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)，流动相始于10％的溶剂B，经过20分钟溶剂B线性增加到
100％，然后持续4分钟，最后经过3分钟后溶剂B回到10％，流速为0.5mL/min，注射量为
10uL，而自动采样器中的样本放于室温中。此化合物通过LC-MS使用LC和反相质谱仪进行分析，本化合物的质谱分析条件如下：氮气流速固定为30，而鞘气流速和辅助器流速固定为15arb。电喷洒离子化使用喷洒电压5000v和毛细管电压35.0v来进行，毛细管温度设定为400℃，数据资料通过石卡里布软件来分析。寡-(β-羟基丁酸)(1)的分析使用在阳离子化模式下的克罗玛德A(1)分子量为860，另一个活性化合物B的LC-MS色谱显示在阳离子化模式下的分子量为874，紫色杆菌素(2)和脱氧紫色杆菌素(3)的分子量分则别为313和327。

[0260] 寡-(β-羟基丁酸)(1)加州大学戴维斯分校的LTQ轨道阱XL混合型傅立叶变换质谱仪进行分析。

[0261] 化合物的NMR核磁共振质谱分析

[0262] NMR核磁共振质谱分析于布鲁克600MHz的梯度场光谱仪进行测量，参考值设定为四甲基硅烷(TMS，0.00ppm)的内部标准值。

[0263] 化合物的纯化

[0264] 二氯甲烷(DCM)的馏分物可使用甲醇馏分，而析出寡-(β-羟基丁酸)(1)的白色固体物。

[0265] 化合物的识别

[0266] 寡-(β-羟基丁酸)(1)

[0267] 成份4的1H NMR质谱信号显示的δ值为5.22(sext)、2.62(dd)和2.53(dd)各13
个相对强度为1个质子，除了这些甲基信号的δ值为1.31，也观察到其两倍值。 C NMR质谱显示只有4个碳信号，其δ值为169.2、67.6、40.9和19.8。详细的1D＆2D NMR分析结果显示-(-O-CHCH3-CH2-CO-)-的部分表面其片段质量为86。次化合物的MALDI-TOF-ESI MS(图2)显示典型的信号形态含低聚物的混合物，其分子量为[(n×86)+Na]，对应的产品为寡-(β-羟基丁酸)1的混合物n＝10-25，此化合物据报可从多种的细菌提取(辛格(Singh)等人，2011；马思肯(Maskey)等人，2002；哈恩(Hahn)等人，1995)，在体外化验中，可使用北方根结线虫值DCM馏分物提取次化合物，显示具有75％不动率(图10)。

[0268] 色杆菌苏比丝加馏分物和纯化物的体外测试

[0269] 馏分物和纯化物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，使用96孔的塑料培养皿进行体外化验，约有15-20只的线虫放入50μL的水溶液中，曝露于100μL的4mg/ml样本于24C下存续放置24小时，培育期结束后，按照目视的各孔经样本处理掉线虫幼虫(J2)不动率，记录其相关的结果，各孔经处理后各测试4次，结果如图5，即表示色杆菌苏比丝加馏分物和化合物在96孔培养皿生物测定下的结果，每个实验各有3个对照组，即1个阳性对照组(阿维地l％)和2个阴性对照组(DMSO和水)，两个实验(T1)和(T2)均采用北方根结线虫线虫进行测试。

[0270] 具有驱虫的化合物提取和识别

[0271] 主要的馏分物如DCM、EA、MeOH和WASH使用桃蚜(GPA)进行驱虫活性的测试，将详细说明如下，观察EA和MEOH馏分物的驱虫能力，这些馏分物的LCMS分析显示类似的化学特性，因为MeOH馏分物的产量高于EA馏分物，即采用MeOH馏分物进行详细的化学处理。MeOH馏分物可使用塞法戴克斯.LH20色谱仪(CH2C12/CH3OH；50/50)再馏分而取得10个馏分物(图9)，馏分物F9和F0观察到具有最高的驱虫活性，这些馏分物可通过HPLC和塞法戴克斯.LH20进行生物测定的纯化而生成具有驱虫活性的紫色杆菌素成份，紫色杆菌素也用于测试对蚜虫产卵的防治效果。

[0272] 实例16：MBI-203馏分物对桃蚜的驱虫效果

[0273] 方法

[0274] 桃蚜成虫(GPA)的生物测定使用MBI-203馏分物和取白色杆菌苏比丝加(MBI-203)细胞提取物的纯化物(紫色杆菌素)来进行，用于测定驱虫能力。辣椒叶的培养皿(3-4周龄的辣椒株)使用23mm的饼干切割器切成圆形，选定叶子扁平的部位确保培养皿可平放于处理过后的琼脂培养皿上，制备号所需的琼脂百分比(％)后，加热软化1％的琼脂溶液，倒入145mm×20mm的培养皿中，其数量仅足以覆盖培养皿底部让培养皿突出维持适当的湿度，琼脂再通过室温冷却固化。

[0275] 轻轻将100μL的MBI-203的提取物滴入叶片处理样本中，经处理过的叶片即可平放于标示有12孔的培养皿盖进行干燥，叶片干燥后，将40uL的水滴入放有叶片的琼脂上。经处理过的叶片即彼此等距摆放于琼脂的浸表面上，将各个叶片背面朝下而处理面朝上，轻压各个叶片而完全平放浸入琼脂中，摆放好处理过的叶片后，使用细毛刷放入203-4天龄的GPA成虫于叶片中央，然后使用封口膜密封，培养皿的盖子戳有小孔用于通气和防止结露。

[0276] 所有的测试进行3次，要选用粗提取物最粗测试的溶剂时，可采用甲醇和丙酮作为溶剂，此测试显示丙酮是优选的溶剂，后续的样本测试包括有馏分物和纯化物(紫色杆菌素)，使用丙酮为溶剂来进行测试。成虫和蛹的驱虫效果的相关数据，于成虫曝露于处理过的叶片24小时后进行测试，算出蚜虫数量(成虫和蛹)，记录并分析数据，驱除效果的百分比计算如下：

[0277] 驱虫效果百分比％＝100-{([N+A]“放于处理过的叶片上”)/[N+A]“放于培养皿上”×100}，

[0278] 其中A表示成虫数量，而N表示蛹的数量。

[0279] 结果

[0280] 先使用粗提取物开始进行MBI-203馏分物的驱虫效果测试，将粗提取物浸入甲醇和丙酮中，测试分析结果显示有显著的差异如图11，含MBI-203粗提取物的叶片浸入甲醇和丙酮中，相较于阴性对照组，对蚜虫的蛹和成虫数量的影响具有明显的差异。图11A和B显示MBI-203对蚜虫的驱虫效果，但甲醇溶剂显示对蚜虫具有驱虫效果(图11A)，但更MBI-203提取物和阳性对照组(阿维地10％)并无显著的统计差异性。丙酮上，良好的馏分物溶剂，对GPA的蛹和成虫并无驱虫效果，叶片中的蛹和成虫平均数相同于阴性对照组(图11B)。

[0281] MBI-203馏分物显示对GPA蛹和成虫具有驱虫效果，也观察到各平均数的统计差异性(图12A和B)，经馏分的物质EA和MeOH对蛹和成虫具有100％的驱虫效果，而WASH物质具有94％的驱虫效果，跟阳性对照组(MBI-20310％v/v)并无显著的统计差异性(表19)。

[0282] 表19.MBI-203馏分样本的驱虫效果平均百分比

[0283]

[0284] 此外，在10个取自MeOH的馏分物使用丙酮溶剂进行测试，含纯紫色杆菌素化合物(F9，F10)的样本，显示对桃蚜的成虫和蛹具有高驱虫效果(表20)，仅有2个非紫色杆菌素馏分物显示具有高驱虫效果(F2和F3)，馏分物F9和F10再进行纯化可得到具有100％驱虫效果的紫色杆菌素，数据资料显示紫色杆菌素对吸允觅食的昆虫具有驱虫效果，即表示馏分物F6-F10含紫色杆菌素，其中F9和F10含有纯紫色杆菌素化合物。

[0285] 表20：MeOH馏分物(F1-F10)的驱虫效果平均百分比。

[0286]

[0287] 实例17：紫色杆菌素降低蚜虫的产卵数

[0288] 将两种浓度的纯紫色杆菌素化合物放入的丙酮中，以0.5μtg/mL和1.0μtg/mL的用量测定化合物对桃蚜(GPA)产卵数的防治效果。使用经处理过的辣椒叶片以不同紫色杆菌素浓度的丙酮溶剂进行生物测定。将辣椒叶片(取自3-4周龄植株)切成23mm直径的叶片，选定扁平部位确保以化合物处理过的叶片可均匀平放，制备l％的琼脂溶液，加热融化后将30μL放入培养皿(16mm×35mm通风的聚苯乙烯培养皿)，其数量刚好足以覆盖培养皿底部，以支撑叶片并保持湿度。琼脂可在室温下冷却固化，将100μL的样本溶液使用2000μL的移液管轻轻涂布于处理过的紫色杆菌素样本上，处理样本分成3份，处理过的叶片可在通风柜中干燥5-10分钟，阳性对照组为阿维地10％v/v而阴性对照组是使用蒸馏水和丙酮作为空白对照组。在各个固化的琼脂培养皿中，将20-30μL的蒸馏水滴入琼脂以维持湿度，各个处理过的叶片各自摆放在琼脂培养皿中，让叶片背面朝向湿琼脂，轻轻完全压平于琼脂上。各个装有叶片(处理过)的培养皿中放入6只GPA成虫(3-4天
龄)，装有成虫的培养皿再使用封口膜密封，封口膜的盖子戳有小孔可通气和防止结露，放于室温下，成虫曝露于处理过叶片3天后，算出产卵数(初蛹寿龄)，实验分成3组各进行2次的实验。

[0289] 如图13，紫色杆菌素的浓度为1.0μg/mL时，可明显降低蚜虫的产卵数，相较于阴性对照组(仅经过水溶液的处理)约减少50％，阳性对照组(阿维地10％)的产卵数最少，成虫曝露3天后即使死亡，本实验进行2次的测试，各个实验重复3次，每个测试均跟紫色杆菌素有相同的结果，而明显降低产卵数。

[0290] 实例18：其它生成紫色杆菌素的药剂对蚜虫的驱虫效果

[0291] 也评估色杆菌对桃蚜的驱虫效果：色杆菌皮丝西纳DSM23278、假紫色色杆菌 DSM23279、溶血棒状杆菌 (C.haemolyticum)DSM19808 和水生色杆菌
DSM19852中，有两个菌种可生成紫色杆菌素(色杆菌皮丝西纳和假紫色色杆菌)，
另有两个菌种据报不会生成紫色杆菌素。微生物于LB培养液在26C和100rpm 的
要换转速下存续培养5天，在培养结束时，将培养液分装进行生物测定，水溶液的处理浓度为5％v/v对GPA成虫进行测试，MBI-20310％v/v浓度的溶液作为阳性
对照组，仅含蒸馏水的溶液作为阴性对照组，各个处理样本的溶液添加有0.01％
吐温20。

[0292] 如上所述，进行处理过辣椒叶片的生物测定，将各个叶片轻轻压平于琼脂上，摆放好处理过的叶片后，使用细毛刷放入20只3-4天龄的GPA成虫于叶片中央，再盖上叶片使用封口膜密封，培养皿戳有小孔可通风和防止结露。

[0293] 测试样本分成3组，让成虫曝露于处理过的叶片24小时后，测定对成虫和蛹的驱虫效果，算出叶片上的蚜虫(成虫和蛹)的数量，并就数据资料进行记录和分析，驱虫效果百分比计算如下：

[0294]

[0295] 其中，N是蛹的数量，A是成虫的数量。

[0296] 结果显示如表2l和22和图14和15，显示多种生成紫色杆菌素的色杆菌(色杆菌(Chromobacterium))菌种对GPA成虫和蛹具有驱虫效果，具有显著的统计差异性，可生成紫色杆菌素的色杆菌种(色杆菌(Chromobacterium))具有75％(色杆菌皮丝西纳)和86％(假紫色色杆菌)的驱虫效果，不生成紫色杆菌素的菌种(水生色杆菌和溶血棒状杆菌)跟未处理的对照组(水)并无统计差异性，不生成紫色杆菌素的菌种仅有些微的驱虫效果。

[0297] 表21：桃蚜(GPA)的成虫和蛹曝露于不同色杆菌种(色杆菌(Chromobacterium))处理过的辣椒叶片中，其驱虫效果的平均百分比(％)

[0298]处理驱虫效果平均百分比％

色杆菌皮丝西纳 75
假紫色色杆菌 86
MBI-203Std10％ 100

[0299] 表22：桃蚜(GPA)的成虫和蛹曝露于不同色杆菌种(色杆菌(Chromobacterium))处理过的辣椒叶片中，其驱虫效果的平均百分比(％)

[0300]处理驱虫效果平均百分比％
水生色杆菌 9l.4
溶血棒状杆菌 67.3
MBI-203Std10％ 99

[0301] 实例19：色杆菌配方有无苯甲酸钠的稳定性比较

[0302] 含色杆菌细胞配方l浓缩分为32份，色杆菌发酵上清液分为62.5份，正己醇分为 l份，海藻酸钠0.5份、脱水山梨糖醇酯聚氧乙烯醚 2份和d- 柠檬
烯2 份。这些配方依据其功能而选用，按照 US EPA列表 4的清单固定，确保配
方均匀提供最佳的含水量。根据 EPA 列表 4 列举的成份，有最低的环境毒性影
响。配方 2含有色杆菌细胞的浓缩液分成 32 份、色杆菌发酵培养上清液 54.5
份、正己醇 1份、海藻酸钠 0.5 份、脱水山梨糖醇酯乙氧基化物2份和苯甲酸钠
10 份。

[0303] 表23：配方l和2长期存放的影响效果

[0304] 表23：配方1和2的存放

[0305]

[0306]

[0307] 配方2较配方l更稳定，显示苯甲酸的水溶液盐类可稳定生物杀虫剂的成份，而避免因为日光曝晒的物理解离和活性丧失，苯甲酸离子提供可溶性和电解质平衡性，可让生物基质保持均匀，延长杀虫剂成份的产品保质期。在延长保质期的农药组合物。苯甲酸酯离子在产品应用于农地作物时，让产品具有吸收紫外线辐射的功能，对紫外线灯保护可延长杀虫剂活性至少数天之久。

[0308] 实例20：苯甲酸钠对害虫死亡率的影响

[0309] MBI-203产品含色杆菌苏比丝加、d-苎烯、己醇、丙二醇和对羟基苯甲酸酯配方(MBI-203EP)，再混合有碳酸钙、苯甲酸钠或钛的氧化物，放入塑料培养皿中，再使用封口膜密封，培养皿放于室温日光下存续7小时，经过日光曝晒后，将样本带入实验室中，使用蒸压微孔水稀释为1.5％和3％v／v的浓度，样本材料再放于添加食物上，进行干燥再喂养给甘蓝尺蠖(甘蓝尺蠖)和夜蛾(Trichoplusia ni)的新生幼虫，于喂养后的第3和4天测定器死亡率，结果显示如表24和图16。

[0310] 表24：苯甲酸钠对害虫死亡率的影响效果

[0311]成份死亡率(损失％)
EP+CaCO3 约30％损失
EP+TiO2 约60％损失
EP+普斯哈德(Purshade) 约25％损失
EP+苯甲酸钠约10％损失
仅含EP 约30％损失

[0312] 关于西兰花的研究

[0313] 4-5周龄的帕克曼(Packman)西兰花喷洒3％v/v浓度有或无苯甲酸钠的MBI-203产品稀释液(d一柠檬烯配方)(MBI-203EP)，各植株栽种于9平方英寸的培养盆，添加有500uL的处理液，所有的样本中，吐温/20的最终浓度为0.0l％，将5只甘蓝蚜虫的成虫甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)放于各植株上，植株和害虫于日光曝晒下培育(75-85°F，
16小时光／8小时暗)，于害虫侵扰后的第3、5、7天算出活蚜虫的数量，显示苯甲酸钠配方较单一成份的最终产品具有更好的防治效果(图17)。

[0314] 关于紫甘蓝的研究

[0315] 有或无苯甲酸钠浓度为10％v/v的MBI-203稀释液最终产品(d-柠檬烯配方)(MBI-203EP)，用于喷洒紫甘蓝其用量为30加仑/英亩，配方对照组(批号2403-83-3)浓度为10％v/v也放入化验样本中，进行植株的干燥后，放入10只甘蓝蚜虫侵扰，于第3、6、8天进行化验样本的计数，防治效果的百分比可使用亨德森-迪尔顿(Henderson-Tilton)校正来判定，其结果如图18，最终产品+苯甲酸钠配方，相较于单方的最终产品或仅含对照组配方的产品，对蚜虫有更好的防治效果。

[0316] 实例21：苯甲酸钠和碳酸钙的比较

[0317] 未稀释MBI-203最终产品(MBI-203EP)具有不同浓度的苯甲酸钠或碳酸钙，于密封垫培养皿中，进行日光曝晒存续1天的期间。经过日光曝晒或未曝晒的样本材料稀释成3％v/v的稀释液，作为日常的人为喂养食物，将甘蓝尺蠖的幼虫放于人为喂养食物上，于第4天计算死亡率，其结果如图19，苯甲酸钠的浓度为10％和15％时，具有最经济实惠的价格其活性降解程度最低。

[0318] 实例22：木质素磺酸盐的影响效果

[0319] 将未经处理不含添加物的干细胞倒入塑料瓶中，于40-65°F的晴天中存续培育4天。经过曝晒和未曝晒的样本稀释成6％v/v的浓度，喷洒于帕克曼西兰花植株上。经干燥的植株放入5只甘蓝蚜虫的幼虫，于第3和6天算出蚜虫的数量，再使用亨德森-迪尔顿校正法测定防治效果，干燥的细胞喷洒有苯甲酸钠，于第3天有最高点杀虫率，化验样本中此杀虫活性持续到第6天(见图20)。

[0320] MBI-203最终产品(d-柠檬烯配方)(MBI-203EP)混合有不同浓度的苯甲酸钠和木质素磺酸盐，处理样本稀释到10％v/v的浓度，滴入塑料培养皿中，进行日光曝晒存续4天。样本通过人工食物进行甘蓝尺蠖的测试，木质素磺酸盐的处理样本容易在形成人工食物上形成1道表层，仅含有苯甲酸钠的最终产品，于日光曝晒前后似乎具有最佳的杀虫效果(见图21和22)。

[0321] 在另一个研究中，10％v/v的MBI-203最终产品(d-柠檬烯配方)稀释液中含有10％的苯甲酸钠和不同浓度的木质素磺酸盐，于密封的塑料培养皿中持续日光曝晒4天。
于日光曝晒后，将4周龄的帕克曼西兰花喷洒有处理液，用量约为30加仑/英亩，将3只甘蓝尺蠖的晚龄幼虫放于各个经处理过的植株上，于第3和4天计算害虫数量。日光曝晒的植株中，仅含有苯甲酸钠的样本具有最佳的防治效果(见图图23)。

[0322] 虽然本发明已通过具体实例的参考内容加以说明，仍然未尽详细，任何人可借用不同的同等事项、变化和修改内容加以应用，但仍无违本发明的精神和其范围。

[0323] 本文引用不同的参考内容，即属本文完整内容的一部分。

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