作为昆虫防治剂的dsRNA
阅读：141发布：2020-07-21
专利汇可以提供作为昆虫防治剂的dsRNA专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及通过RNAi介导的基因沉默来防治 害虫 侵害的方法，其通过将完好的昆虫细胞与该昆虫细胞外部的双链RNA 接触 以及通过所述双链RNA被所述完好的昆虫细胞摄取来实现。在一个具体的实施方案中，本发明的方法用于减轻昆虫害虫对 植物 的侵害。作为替代地，所述方法用于向有此处理和/或防止需要的 基层 或对象进行处理和/或防止昆虫侵害。公开了适当的昆虫靶基因及其 片段 、dsRNA构建体、重组构建体和组合物。，下面是作为昆虫防治剂的dsRNA专利的具体信息内容。
1.分离的核苷酸序列，其包含选自以下的核酸序列：
(i)如下表示的任意序列：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23， 49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至 247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515， 517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773， 778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894， 896，908to1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081， 1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111， 1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627， 1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690， 1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065， 2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344， 2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或 2486，或其互补序列，
(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、 90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列：
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183， 188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472， 473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591， 596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，78B，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061， 1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097， 1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592， 1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667， 1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至 2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102， 2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372， 2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互补序列，以及
(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168， 173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257， 259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575， 576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795， 797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041， 1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089， 1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572， 1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647， 1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698， 1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085， 2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364， 2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互补序列，
或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续 核苷酸的基因的直系同源物：SEQ ID NO 49至158、275至472、533至 575、621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、 2120至2338、2384至2460，或其互补序列。
2.权利要求1的多核苷酸序列表达产生的双链核糖核苷酸序列，其 中植物昆虫害虫摄取所述核糖核苷酸序列抑制所述昆虫害虫的生长。
3.权利要求2的核糖核苷酸序列，其中摄取所述序列抑制与所述序 列基本上互补的核苷酸序列的表达。
4.包含根据权利要求2或3的核糖核苷酸序列的组合物，其还包 含至少一种佐剂以及任选地至少一种表面活性剂。
5.包含至少一种双链RNA的组合物，其中一条链包含与选自权利 要求1中所限定序列的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列，其 还任选地包含至少一种适当的载体、赋形剂或稀释剂。
6.用包含权利要求1中所限定核酸序列的多核苷酸转化的细胞， 所述核酸序列任选地与调节序列有效连接。
7.权利要求6的细胞，其中所述细胞是原核细胞，例如革兰氏阳 性细胞或革兰氏阴性细菌细胞；或者其中所述细胞是真核细胞，例如酵 母细胞或藻类细胞。
8.权利要求7的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
9.权利要求7的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。
10.包含至少一种细菌细胞或酵母细胞的组合物，所述细菌细胞或 酵母细胞包含权利要求1中所限定的至少一种多核苷酸。
11.权利要求10的组合物，其中所述细菌或酵母细胞被灭活或被 杀死，例如通过热处理或机械处理。
12.包含表达至少一种双链RNA的至少一种细菌或酵母细胞的组 合物，其中所述双链RNA的一条链包含与选自权利要求1中所限定序 列的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列，该组合物中还任选地 包含至少一种适当的载体、赋形剂或稀释剂。
13.权利要求5或10至12中任一项的组合物，所述组合物还包含 至少一种选自以下的杀虫剂：化学杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢 杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀 虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白，所述杀虫剂具有对抗与权利要求2中所 限定的同样的植物昆虫害虫的活性，或者其中所述杀虫剂具有对抗一种或 多种其它植物昆虫害虫的活性。
14.权利要求10至12中任一项的组合物，其中所述至少一种细菌或 酵母细胞还包含或还表达至少一种选自以下的杀虫剂：化学杀虫剂、马铃 薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫 蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白，所述杀虫剂具有 对抗与权利要求2中所限定的同样的植物昆虫害虫的活性，或者其中所述 杀虫剂具有对抗一种或多种其它植物昆虫害虫的活性。
15.权利要求5或10至12中任一项的组合物，其还包含至少一种 其它细菌或酵母细胞，所述细胞包含或表达至少一种选自以下的杀虫 剂：化学杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀 虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫 蛋白，所述杀虫剂具有对抗与权利要求2中所限定的同样的植物昆虫害虫 的活性，或者其中所述杀虫剂具有对抗一种或多种特定植物昆虫害虫的活 性。
16.权利要求13至15中任一项的组合物，其中所述苏云金芽孢杆菌 杀虫蛋白选自：Cry1、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二元杀虫蛋 白CryET33和CryET34、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫 蛋白TIC100和TIC101以及二元杀虫蛋白PS149B1。
17.权利要求13至16中任一项的组合物，其作为杀昆虫试剂。
18.权利要求13至16中任一项的组合物，其用作预防或治疗人或动 物机体免受昆虫侵害的药物。
19.包含权利要求10至18中任一项的至少一种组合物的喷雾剂，其 还任选地包含至少一种佐剂和至少一种表面活性剂。
20.包含权利要求10至18中任一项所限定组合物的用于害虫的外罩、 陷阱或诱饵。
21.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或者 权利要求20的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途，所 述昆虫选自：马铃薯叶甲属物种(Leptinotarsa spp.)(例如，马铃薯叶甲 (L.decemlineata)、伪马铃薯叶甲(L.juncta)或胡颓子叶茄叶甲(L. texana))，并且
-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或
-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，
所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(i)如下表示的任意序列：
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160至163，168，173，178， 183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至246，或2486，或其互补序列，
(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、 90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列：
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160至163，168，173，178， 183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至246，或2486，或其互补序列，以及
(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160至163，168，173，178， 183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至246，或2486，或其互补序列，
或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续 核苷酸的基因的直系同源物：SEQ ID NO 49至158，或其互补序列。
22.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或 者权利要求20的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途， 所述昆虫选自：猿叶甲属物种(Phaedon spp.)(例如，辣根猿叶甲(P. cochleariae))并且
-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或
-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，
所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(i)如下表示的任意序列：SEQ ID NO 247，249，251，253，255，257，259，275 至472，473，478，483，488，493，498，503，508至512，或其互补序列，
(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、 90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列：
SEQ ID NO 247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503， 508至512，或其互补序列，以及
(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：
SEQ ID NO 247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488， 493，498，503，508至512，或其互补序列，
或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续 核苷酸的基因的直系同源物：SEQ ID NO 275至472，或其互补序列。
23.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或 者权利要求20的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途， 所述昆虫选自：食植瓢虫属(Epilachna spp.)(例如，墨西哥豆瓢虫(E. varivetis))，并且
-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或
-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，
所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(i)如下表示的任意序列：
SEQ ID NO 513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591或596，或其互补序列，
(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、 90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列：
SEQ ID NO 513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591或596，或其互补序列， 以及
(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：
SEQ ID NO 513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591或596，或其互补序列，
或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续 核苷酸的基因的直系同源物：SEQ ID NO 533至575，或其互补序列。
24.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或 者权利要求20的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途， 所述昆虫选自：花象属物种(Anthonomus spp.)(例如，墨西哥棉铃象(A. grandis))，并且
-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或
-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，
所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(i)如下表示的任意序列：
SEQ ID NO 601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783或788，或其互补序列，
(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、 90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列：
SEQ ID NO 601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783或788，或其互补序列， 以及
(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：
SEQ ID NO 601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783或788，或其互补序列，
或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续 核苷酸的基因的直系同源物：SEQ ID NO 621至767，或其互补序列。
25.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或 者权利要求20的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途， 所述昆虫选自：拟谷盗属物种(Tribolium spp.)(例如，赤拟谷盗(T. castaneum))，并且
-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或
-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，
所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(i)如下表示的任意序列：
SEQ ID NO 793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878或883，或其互补序列，
(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、 90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列：
SEQ ID NO 793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878或883，或其互补序列， 以及
(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：
SEQ ID NO 793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878或883，或其互补序列，
或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续 核苷酸的基因的直系同源物：SEQ ID NO 813至862，或其互补序列。
26.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或 者权利要求20的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途， 所述昆虫选自：瘤蚜属物种(Myzus spp.)(例如，桃蚜(M.persicae))， 并且
-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或
-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，
所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(i)如下表示的任意序列：SEQ ID NO 888，890，892，894，896，908至1040， 1041，1046，1051，1056，1061，或1066至1070，或其互补序列，
(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、 90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列：
SEQ ID NO 888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，或1066至 1070，或其互补序列，以及
(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：
SEQ ID NO 888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，或1066至1070，或 其互补序列，
或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续 核苷酸的基因的直系同源物：SEQ ID NO 908至1040，或其互补序列。
27.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或 者权利要求20的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途， 所述昆虫选自：褐飞虱属物种(Nilaparvata spp.)(例如，褐飞虱(N. lugens))，并且
-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或
-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，
所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(i)如下表示的任意序列：
SEQ ID NO 1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091， 1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577， 1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652， 1657，1662，1667，1672或1677，或其互补序列，
(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、 90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列：
SEQ ID NO 1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095， 1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587， 1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662， 1667，1672或1677，或其互补序列，以及
(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：
SEQ ID NO 1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091， 1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577， 1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652， 1657，1662，1667，1672或1677，或其互补序列，
或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续 核苷酸的基因的直系同源物：SEQ ID NO 1161至1571，或其互补序列。
28.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或 者权利要求20的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途， 所述昆虫选自：禾草螟属物种(Chilo spp.)(例如，二化螟(C.suppressalis)、 台湾稻螟(C.auricilius)或稻多丽螟(C.polychrysus))，并且
-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或
-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，
所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(i)如下表示的任意序列：SEQ ID NO 1682，1684，1686，1688，1690，1692， 1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070， 2075，2080，2085，2090或2095，或其互补序列，
(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、 90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列：
SEQ ID NO 1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至 2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090或2095，或其 互补序列，以及
(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：
SEQ ID NO 1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702， 1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090或2095， 或其互补序列，
或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续 核苷酸的基因的直系同源物：SEQ ID NO 1730至2039，或其互补序列。
29.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或 者权利要求20的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途， 所述昆虫选自：Plutella属物种(例如，菜蛾)，并且
-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或
-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，
所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(i)如下表示的任意序列：SEQ ID NO 2100，2102，2104，2106，2108，2120至 2338，2339，2344，2349，2354或2359，或其互补序列，
(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、 90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列：
SEQ ID NO 2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354或2359，或其 互补序列，以及
(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：
SEQ ID NO 2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354 或2359，或其互补序列，
或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续 核苷酸的基因的直系同源物：SEQ ID NO 2120至2338，或其互补序列。
30.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂或 者权利要求20的外罩、陷阱或诱饵用于杀死昆虫或抑制昆虫生长的用途， 所述昆虫选自：Acheta属物种(例如，居屋艾蟋(A.domesticus))，并 且
-其中所述组合物中的所述核酸包含多核苷酸，或
-其中所述组合物中的细菌或酵母细胞包含或表达多核苷酸，
所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
(i)以下任意序列：
SEQ ID NO 2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，
(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、 90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列：
SEQ ID NO 2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其 互补序列，以及
(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：
SEQ ID NO 2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476 或2481，或其互补序列，
或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续 核苷酸的基因的直系同源物：SEQ ID NO 2384至2460，或其互补序列。
31.权利要求10至18中任一项的组合物、权利要求19的喷雾剂 或者权利要求20的外罩、陷阱或诱饵在药物或兽医应用中的用途。
32.用于防止昆虫在植物上生长或者防止昆虫侵害植物的方法，其包 括将权利要求10至18中任一项的组合物或者权利要求19的喷雾剂应 用到所述植物。
33.提高产量的方法，其包括将有效量的权利要求10至18中任一 项的组合物或权利要求19的喷雾剂应用到植物。
34.权利要求32或33的方法，其中所述植物选自：苜蓿、苹果、 杏、朝鲜蓟、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜、黑莓、蓝莓、嫩茎花 椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、蓖麻、胡萝卜、木薯、花椰菜、谷类、芹菜、 樱桃、柑桔、克莱门氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、茄子、菊苣、 桉树、无花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、猕猴桃、莴苣、韭、柠檬、 莱姆酸橙、松树、玉米、芒果、甜瓜、小米、蘑菇、燕麦、菜秋葵、洋葱、 橙、观赏性植物或花或树、番木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、豌豆、胡椒、 柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马铃薯、南瓜、菊苣、萝卜、油菜、 悬钩子、稻、黑麦、高粱、黄豆、大豆、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、 向日葵、红薯、橘子、茶树、烟草、番茄、藤本植物、西瓜、小麦、山药 以及西葫芦。
35.根据权利要求32至34中任一项的方法，其中所述昆虫选自：马 铃薯叶甲属(例如，马铃薯叶甲、伪马铃薯叶甲或胡颓子叶茄叶甲)、合 爪负泥虫属物种(Lema spp.)(例如，三条负泥虫(L.trilineata))、茄 跳甲属物种(Epitrix spp.)(例如，美国马铃薯跳甲(E.cucumeris)、烟 草跳甲(E.hirtipennis)或块茎跳甲(E.tuberis))、豆芫菁属物种(Epicauta spp.)(例如，北美豆芫菁(E.vittata))、食植瓢虫属物种(例如，墨西 哥豆瓢虫)、猿叶甲属物种(例如，辣根猿叶甲)、褐飞虱属物种(例如， 褐飞虱)、灰飞虱属物种(Laodelphax spp.)(例如，灰飞虱(L.striatellus))、 黑尾叶蝉属物种(Nephotettix spp.)(例如，二点黑尾叶蝉(N.virescens)， 或黑尾叶蝉(N.cincticeps)，或二条黑尾叶蝉(N.nigropictus))、白背 飞虱属物种(Sogatella spp.)(例如，白背飞虱(S.furcifera))、Acheta 属物种(例如，居屋艾蟋)、杆长蝽属物种(Blissus spp.)(例如，美洲 谷杆长蝽(B.leucopterus leucopterus))、黑蝽属物种(Scotinophora spp.) (例如，稻黑蝽(S.vermidulate))、绿蝽属物种(Acrosternum spp.)(例 如，拟绿蝽(A.hilare))、稻弄蝶属物种(Parnara spp.)(例如，直纹 稻弄蝶(P.guttata))、禾草螟属物种(例如，二化螟、台湾稻螟或稻多 丽螟(C.polychrysus))、禾草螟属物种(Chilotraea spp.)(例如，稻杆 螟(C.polychrysa))、蛀茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)(例如，稻蛀茎 夜蛾(S.inferens))、蛀禾螟属物种(Tryporyza spp.)(例如，白稻螟 (T.innotata)或三化螟(T.incertulas))、纵卷叶野螟属物种 (Cnaphalocrocis spp.)(例如，稻纵卷叶野螟(C.medinalis))、潜蝇 属物种(Agromyza spp.)(例如，日本稻潜蝇(A.oryzae)或玉米斑潜蝇 (A.parvicornis))、杆草螟属物种(Diatraea spp.)(例如，小蔗螟(D. saccharalis)或西南玉米杆草螟(D.gtandiosella))、Narnaga属物种(例 如，绿稻毛虫(N.aenescens))、黄夜蛾属物种(Xanthodes spp.)(例 如，犁纹黄夜蛾(X.transversa))、灰翅夜蛾属物种(Spodoptera spp.) (例如，草地贪夜蛾(S.frugiperda)、甜菜夜蛾(S.exigua)、海灰翅夜 蛾(S.littoralis)或西部黄条夜蛾(S.praefica))、秘夜蛾属物种(Mythimna spp.)(例如，粘虫(Mythmna(Pseudaletia)seperata))、铃夜蛾属物种 (Helicoverpa spp.)(例如，谷实夜蛾(H.zea))、Colaspis属物种(Colaspis spp.)(例如，葡萄肖叶甲(C.brunnea))、稻水象属物种(Lissorhoptrus spp.)(例如，稻水象甲(L.oryzophilus))、稻象属物种(Echinocnemus spp.)(例如，稻象(E.squamos))、稻铁甲属物种(Diclodispa spp.) (例如，水稻铁甲(D.armigera))、禾谷负泥虫属物种(Oulema spp.) (例如，水稻负泥虫(O.oryzae))、米象属物种(Sitophilus spp.)(例 如，米象(S.oryzae))、Pachydiplosis属物种(例如，稻瘿蚊(P.oryzae))、 毛眼水蝇属物种(Hydrellia spp.)(例如，麦叶毛眼水蝇(H.griseola)或 日稻毛眼水蝇(H.sasakii))、Chlorops属物种(例如，稻杆潜蝇(C.oryzae))、 根萤叶甲属物种(Diabrotica spp.)(例如，玉米根叶甲(D.virgifera virgifera)、北美玉米根叶甲(D.barberi)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(D. undecimpunctata howardi)、墨西哥玉米根叶甲(D.virgifera zeae)、条 纹黄瓜叶甲(D.balteata))、杆野螟属物种(Ostrinia spp.)(例如，玉 米螟(O.nubilalis))、地虎属物种(Agrotis spp.)(例如，小地老虎(A. ipsilon))、Elasmopalpus属物种(例如，南美玉米苗斑螟(E.lignosellus))、 梳爪叩头虫属(Melanotus spp.)(线虫)、圆头犀金龟属(Cyclocephala spp.) (例如，北部伪装金龟(C.borealis)或南部伪装金龟(C.immaculata))、 弧丽金龟属物种(Popillia spp.)(例如，日本弧丽金龟(P.japonica))、 跳甲属物种(Chaetocnema spp.)(例如，玉米铜色跳甲(C.pulicaria))、 龙颈象属物种(Sphenophorus spp.)(例如，玉米长喙象(S.maidis))、 缢管蚜属物种(Rhopalosiphum spp.)(例如，玉米蚜(R.maidis))、圆 尾蚜属(Anuraphis spp.)(例如，玉米根蚜(A.maidiradicis))、黑蝗 属物种(Melanoplus spp.)(例如，红足黑蝗(M.femurrubrum))、特 异黑蝗(M.differentialis)或迁飞黑蝗(M.sanguinipes))、种蝇属物种 (Hylemyaspp.)(例如，种蝇(H.platura))、呆蓟马属物种(Anophothrips spp.)(例如，黄呆蓟马(A.obscrurus))、火蚁属物种(Solenopsis spp.) (例如，盗蚁(S.milesta))、叶螨属物种(Tetranychus spp.)(例如， 二点叶螨(T.urticae)、朱砂叶螨(T.cinnabarinus)、铃夜蛾属物种(例 如，谷实夜蛾或棉铃虫(H.armigera))、Pectinophora属物种(例如， 红铃麦蛾(P.gossypiella))、金刚钻属物种(Earias spp.)(例如，翠纹 钻夜蛾(E.vittella))、实夜蛾属物种(Heliothis spp.)(例如，烟芽夜 蛾(H.virescens))、花象属物种(Anthonomus spp.)(例如，墨西哥棉 铃象(A.grandis))、Pseudatomoscelis属物种(例如，棉伪斑腿盲蝽(P. seriatus))、结翅粉虱属物种(Trialeurodes spp.)(例如，结翅粉虱(T. abutiloneus)、温室粉虱(T.vaporariorum))、小粉虱属物种(Bemisia spp.) (例如，银叶粉虱(B.argentifolii))、蚜属物种(Aphis spp.)(例如， 棉蚜(A.gossypii))、草盲蝽属物种(Lygus spp.)(例如，美国牧草盲 蝽(L.lineolaris)或美洲牧草盲蝽(L.hesperus))、美洲蝽属物种(Euschistus spp.)(例如，斑点美洲蝽(E.conspersus))、Chlorochroa属物种(例 如，赛氏蝽(C.sayi))、绿蝽属物种(Nezara spp.)(例如，稻绿蝽(N. viridula))、蓟马属物种(Thrips spp.)(例如，烟蓟马(T.tabaci))、 花蓟马属物种(Frankliniella spp.)(例如，烟褐蓟马(F.fusca)或西方 花蓟马(F.occidentalis))、绿小叶蝉属物种(Empoasca spp.)(例如， 蚕豆小绿叶蝉(E.fabae))、瘤蚜属物种(Myzus spp.)(例如，桃蚜(M. persicae))、薯个木虱属物种(Paratrioza spp.)(例如，马铃薯木虱(P. cockerelli))、宽胸金针虫属物种(Conoderus spp.)(例如，南部马铃薯 线虫(C.falli)或烟草线虫(C.vespertinus))、麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)(例如，马铃薯麦蛾(P.operculella))、长管蚜属物种(Macrosiphum spp.)(例如，大戟长管蚜(M.euphorbiae))、Thyanta属物种(例如， 红肩蝽象(T.pallidovirens))、麦蛾属物种(例如，马铃薯麦蛾)、铃夜 蛾属物种(例如，谷实夜蛾)、Keiferia属物种(例如，番茄蠹蛾)、金 针虫属物种(Limonius spp.)(线虫)、Manduca属物种(例如，烟草天 蛾(M.sexta)或番茄天蛾(M.quinquemaculata))、斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)(例如，蔬菜斑潜蝇(L.sativae)、三叶草斑潜蝇(L.trifolli)或南 美斑潜蝇(L.huidobrensis))、果蝇属物种(Drosophilla spp.)(例如， 黑腹果蝇(D.melanogaster)、D.yakuba、拟暗果蝇(D.pseudoobscura) 或拟果蝇(D.simulans))、步甲属物种(Carabus spp.)(例如，粒步甲 (C.granulatus))、摇蚊属物种(Chironomus spp.)(例如，摇蚊(C. tentanus))、栉首蚤属物种(Ctenocephalides spp.)(例如，猫栉首蚤(C. felis))、非耳喙象属物种(Diaprepes spp.)(例如，根象鼻虫(D. abbreviatus))、齿小蠹属物种(Ips spp.)(例如，美松齿小蠹(I.pini))、 拟谷盗属物种(Tribolium spp.)(例如，赤拟谷盗(T.castaneum))、 舌蝇属物种(Glossina spp.)(例如，刺舌蝇(G.morsitans))、按蚊属 物种(Anopheles spp.)(例如，甘比亚按蚊(A.gambiae))、铃夜蛾属 物种(例如，棉铃虫(H.armigera))、Acyrthosiphon属物种(例如，豌 豆蚜(A.pisum))、蜜蜂属物种(Apis spp.)(例如，意大利蜜蜂(A. melifera))、Homalodisca属物种(例如，琉璃叶蝉(H.coagulate))、 伊蚊属物种(Aedes spp.)(例如，埃及斑纹(Ae.aegypti))、蚕蛾属物 种(Bombyxspp.)(例如，家蚕(B.mori))、飞蝗属物种(Locusta spp.) (例如，飞蝗(L.migratoria))、牛蜱属物种(Boophilus spp.)(例如， 微小牛蜱(B.microplus))、Acanthoscurria属物种(例如，红毛巧克力 捕鸟蛛(A.gomesiana))、甲蠊属物种(Diploptera spp.)(例如，太平 洋折翅蠊(D.punctata))、袖蝶属物种(Heliconius spp.)(例如，瓦氏 袖蝶(H.erato)或诗神袖蝶(H.melpomene))、象虫属物种(Curculio spp.)(例如，欧洲栎象(C.glandium))、Plutella属物种(例如，菜蛾 (P.xylostella))、花蜱属物种(Amblyomma spp.)(例如，彩饰花蜱(A. variegatum))、柞蚕属物种(Anteraea spp.)(例如，天蚕(A.yamamai)) 和阿蚊属物种(Armigeres spp.)(例如，骚扰阿蚊(A.subalbatus))。
36.用于防止昆虫在基层上生长的方法，其包括将权利要求10至18 中任一项的组合物或权利要求19的喷雾剂应用到所述基层。
37.用于治疗和/或预防由靶生物导致的疾病或病症的方法，其包括将 权利要求10至18中任一项的组合物或权利要求19的喷雾剂施用于有此治 疗和/或预防需要的对象。
技术领域
本发明涉及在昆虫物种中双链RNA(dsRNA)介导基因沉默的领域。 更具体地，本发明涉及设计用于表达对应于新靶基因的dsRNA的遗传构 建体。这些构建体在RNAi介导的害虫防治中尤其有用。本发明还涉及用 于防治昆虫的方法、用于防止昆虫侵害的方法以及使用RNAi下调昆虫中 基因表达的方法。
背景技术
昆虫及其它害虫可通过其叮咬或螫刺而导致损伤甚至死亡。而且，许 多害虫传播导致疾病的细菌及其它病原体。例如，蚊子传播导致疟疾、黄 热病、脑炎和另一些疾病的病原体。腺鼠疫(或黑死病)由感染大鼠和另 一些啮齿动物的细菌所引起。用于防治微观害虫侵害的组合物已经以抗生 素、抗病毒和抗真菌的组合物的形式提供。用于防治害虫(如线虫和昆虫) 侵害的方法通常采用化学组合物的形式，将所述化学组合物应用于害虫停 留的表面上，或者以丸剂、粉剂、片剂、糊剂或胶囊剂的形式施用于被侵 扰动物。
重要农作物的昆虫害虫防治是非常重要的领域，例如破坏茄科植物的 昆虫害虫，尤其是鞘翅目害虫的防治，所述茄科植物尤指马铃薯(Solanum tuberosum)，以及番茄(Solanum lycopersicum)、茄子(Solanum melongena)、辣椒(Solanum capsicum)和茄属植物(例如，Solanum aculeastrum、S.bulbocastanum(一种野生马铃薯)、S.cardiophyllum、 S.douglasii、欧白英(S.dulcamara)、S.lanceolatum、S.robustum和S. triquetrum)。
在过去的几十年中，用于防治植物中昆虫侵害的更有效方法和组合物 的开发已取得显著进展。化学杀虫剂在根除害虫侵害中已非常有效。
使用印楝籽提取物进行生物防治已显示出对植物鞘翅目害虫有作用。 基于印楝的市售杀虫剂将印楝素作为主要的活性成分。这些杀虫剂适用于 广谱的昆虫。它们作为昆虫生长调节剂；印楝素通过抑制一种昆虫激素(蜕 皮素)的产生而阻止昆虫蜕皮。
使用来自苏云金芽孢杆菌粉虫变种(Bacillus thuringiensis varieties tenebrionis)和圣地亚哥变种(varieties san diego)的Cry3A蛋白以及衍 生的杀虫蛋白进行生物防治是化学防治的可替代方法。所述Bt(Bacillus thuringiensis)毒素蛋白对于防治马铃薯叶甲幼虫是有效的，该毒素蛋白或 者作为在植物上喷洒的制剂或者在马铃薯的叶中表达。
一种可替代的生物制剂是dsRNA。在过去的几年里，借助RNA干扰 或“RNAi”下调多细胞生物中的基因(也称为“基因沉默”)已成为成熟的技 术。
RNA干扰或“RNAi”是序列特异性下调基因表达的方法(也称为“基因 沉默”或“RNA介导的基因沉默”)，其由序列与待下调靶基因区域互补的 双链RNA(dsRNA)起始(Fire，A.Trends Genet.Vol.15，358-363，1999； Sharp，P.A.Genes Dev.Vol.15，485-490，2001)。
在过去的几年里，借助RNA干扰(RNAi)下调多细胞生物的靶基因 已成为成熟的技术。可参考国际申请WO 99/32619(卡内基学院)和WO 00/01846(本申请人)。
dsRNA基因沉默应用于许多不同的领域中，例如在临床应用 (WO2004/001013)和植物中dsRNA介导的基因沉默。在植物中，还已 将用于基因沉默的dsRNA构建体设计成可被切割及加工成小干扰RNA (siRNA)。
尽管本领域已普遍了解植物、秀丽隐杆线虫(C.elegans)和哺乳动物 细胞中的RNAi技术若干年，然而对于使用RNAi下调昆虫中基因表达迄 今几乎是未知的。自从WO 00/01846和WO 99/32619申请的提交和公布 以来，仅有少量涉及使用RNAi保护植物免受昆虫侵害的其它申请被公布。 这些包括国际申请WO 01/37654(DNA Plant Technologies)、WO 2005/019408(Bar Ilan大学)、WO 2005/049841(CSIRO，Bayer Cropscience)、WO 05/047300(犹他大学研究基金会)和美国申请 2003/00150017(Mesa等)。本发明提供了用于RNAi介导的昆虫害虫防治 的靶基因和构建体。相应地，本发明提供了通过抑制、延迟或降低特定害 虫中靶基因的表达来防治害虫侵害的方法和组合物。
重要农作物的昆虫害虫防治是非常重要的领域，例如破坏茄科植物的 昆虫害虫，尤其是鞘翅目害虫的防治，所述茄科植物尤指马铃薯(Solanum tuberosum)，以及番茄(Solanum lycopersicum)、茄子(Solanum melongena)、辣椒(Solanum capsicum)和茄属植物(例如，Solanum aculeastrum、S.bulbocastanum(一种野生马铃薯)、S.cardiophyllum、 S.douglasii、欧白英(S.dulcamara)、S.lanceolatum、S.robustum和S. triquetrum)。
在过去的几十年中，用于防治植物中昆虫侵害的更有效方法和组合物 的开发已取得显著进展。化学杀虫剂在根除害虫侵害中已非常有效。
使用印楝籽提取物进行生物防治已显示出对植物鞘翅目害虫有作用。 基于印楝的市售杀虫剂将印楝素作为主要的活性成分。这些杀虫剂适用于 广谱的昆虫。它们作为昆虫生长调节剂；印楝素通过抑制一种昆虫激素(蜕 皮素)的产生而阻止昆虫蜕皮。
使用来自苏云金芽孢杆菌粉虫变种(Bacillus thuringiensis varieties tenebrionis)和圣地亚哥变种(varieties san diego)的Cry3A蛋白以及衍 生的杀虫蛋白进行生物防治是化学防治的可替代方法。所述Bt(Bacillus thuringiensis)毒素蛋白对于防治马铃薯叶甲幼虫是有效的，该毒素蛋白或 者作为在植物上喷洒的制剂或者在马铃薯的叶中表达。
一种可替代的生物制剂是dsRNA。在过去的几年里，借助RNA干扰 或“RNAi”下调多细胞生物中的基因(也称为“基因沉默”)已成为成熟的技 术。
RNA干扰或“RNAi”是序列特异性下调基因表达的方法(也称为“基因 沉默”或“RNA介导的基因沉默”)，其由序列与待下调靶基因区域互补的 双链RNA(dsRNA)起始(Fire，A.Trends Genet.Vol.15，358-363，1999； Sharp，P.A.Genes Dev.Vol.15，485-490，2001)。
在过去的几年里，借助RNA干扰(RNAi)下调多细胞生物的靶基因 已成为成熟的技术。可参考国际申请WO 99/32619(卡内基学院)和WO 00/01846(本申请人)。
dsRNA基因沉默应用于许多不同的领域中，例如在临床应用 (WO2004/001013)和植物中dsRNA介导的基因沉默。在植物中，还已 将用于基因沉默的dsRNA构建体设计成可被切割及加工成小干扰RNA (siRNA)。
尽管本领域已普遍了解植物、秀丽隐杆线虫(C.elegans)和哺乳动物 细胞中的RNAi技术若干年，然而对于使用RNAi下调昆虫中基因表达迄 今几乎是未知的。自从WO 00/01846和WO 99/32619申请的提交和公布 以来，仅有少量涉及使用RNAi保护植物免受昆虫侵害的其它申请被公布。 这些包括国际申请WO 01/37654(DNA Plant Technologies)、WO 2005/019408(Bar Ilan大学)、WO 2005/049841(CSIRO，Bayer Cropscience)、WO 05/047300(犹他大学研究基金会)和美国申请 2003/00150017(Mesa等)。本发明提供了用于RNAi介导的昆虫害虫防治 的靶基因和构建体。相应地，本发明提供了通过抑制、延迟或降低特定害 虫中靶基因的表达来防治害虫侵害的方法和组合物。
发明内容
本发明描述了用于防治作物昆虫害虫的不基于化合物、不基于蛋白质 的新方法。其活性成分是核酸(双链RNA(dsRNA))，所述核酸可用 作杀虫制剂(例如，作为叶的喷雾剂)。所述dsRNA的序列对应于昆虫 必需基因的部分或全部，并通过RNA干扰(RNAi)导致昆虫靶标的下调。 由于mRNA的下调，所述dsRNA阻止昆虫靶蛋白的表达，并因此导致昆 虫死亡、生长停滞或不育。
本发明的方法可实际应用在需要抑制昆虫的生存、生长、发育或繁殖 或者降低昆虫的致病性或感染性的任何技术领域。本发明的方法还实际应 用于需要特异性下调昆虫中一种或多种靶基因表达的情形。特别有用的实 际应用包括但不限于：(1)保护植物免受昆虫害虫侵害；(2)在人和动物 中的药物或兽医用途(例如，控制、治疗或预防人和动物中的昆虫感染)； (3)保护物品免遭昆虫破坏；(4)保护易腐的物品(如食品、种子等) 免遭昆虫破坏；以及通常需要防治昆虫和/或需要防止昆虫引起破坏的任何 应用。
根据一个实施方案，本发明涉及控制细胞或生物上昆虫生长的方法， 或者防止昆虫侵害对昆虫感染敏感的细胞或生物的方法，其包括将昆虫与 双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条退火互 补链包含与昆虫靶基因核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列，该双 链RNA被昆虫摄取并因此控制生长或防止侵害。
因此，本发明提供了分离的新的昆虫靶基因核苷酸序列，所述分离的 核苷酸序列包含选自以下的至少一种核酸序列：
(i)如下表示的任意序列：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23， 49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至 247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515， 517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773， 778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894， 896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081， 1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111， 1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627， 1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690， 1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065， 2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344， 2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384或2460，2461，2466，2471，2476，2481或 2486，或其互补序列，
(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、 85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序 列： SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183， 188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472， 473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591， 596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061， 1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097， 1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592， 1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667， 1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至 2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102， 2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372， 2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互补序列，以及
(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列： SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168， 173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257， 259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575， 576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795， 797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041， 1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089， 1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572， 1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647， 1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698， 1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085， 2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364， 2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互补序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷 酸的基因的直系同源物：SEQ ID NO 49至158、275至472、533至575、 621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120 至2338、2384至2460，或其互补序列，所述核酸序列可用于制备本发明 的用于控制昆虫生长的双链RNA。
本发明使用的“防治害虫”意指杀死害虫，或阻止害虫发育或生长，或 防止害虫感染或侵害。本文使用的防治害虫还包括控制害虫的后代(卵的 发育)。本文使用的害虫防治还包括抑制昆虫的生存、生长、发育或繁殖， 或降低昆虫的致病性或感染性。本文所述的化合物和/或组合物可用于维持 生物健康，并可以治疗性、预防性或全身性地使用来防治害虫或者阻止昆 虫生长或发育或者感染或侵害。
本发明涉及的特定害虫是昆虫害虫。因此，本文使用的“防治昆虫”还 包括控制昆虫的后代(例如昆虫害虫的卵的发育)。本文使用的防治昆虫 还包括抑制昆虫的生存、生长、发育或繁殖，或者降低昆虫的致病性或感 染性。在本发明中，防治昆虫可以抑制昆虫中的生物活性，其导致一种或 多种以下特征：昆虫进食减少，昆虫生存力降低，昆虫死亡，抑制昆虫的 分化和发育，以下的缺失或能力下降：昆虫有性繁殖、肌肉形成、保幼激 素形成、保幼激素功能调节、离子调节和转运、细胞膜电势的维持、氨基 酸的生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合成、信息素的感知、触 角形成、翅的形成、足的形成、发育和分化、卵的形成、幼虫的成熟、消 化酶的形成、血淋巴的合成、血淋巴的维持、神经传递、细胞分裂、能量 代谢、呼吸、凋亡以及真核细胞的细胞骨架结构(如肌动蛋白和微管蛋白) 的任何组分。本文所述的化合物和/或组合物可用于维持生物健康，并可以 治疗性、预防性或全身性地使用来防治昆虫，或阻止害虫生长或发育或者 感染或侵害。因此，本发明可以使先前的敏感生物对昆虫侵害产生抗性。
本文使用的表述“与......的至少一部分互补”是指所述核苷酸序列与靶 标的核苷酸序列在超过两个核苷酸的长度上，例如超过至少15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24或更多个连续核苷酸的长度上完全互补。
根据又一实施方案，本发明涉及用于下调昆虫中靶基因表达的方法， 其包括将所述昆虫与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互补 链，其中一条退火互补链包含与待下调昆虫靶基因核苷酸序列之至少一部 分互补的核苷酸序列，其中所述双链RNA被昆虫摄取并因此下调昆虫靶 基因的表达。
在无数量词修饰时，“靶基因”是指“至少一种”靶基因。同样地，靶生 物是指“至少一种”靶生物，RNA分子或宿主细胞是指“至少一种”RNA分 子或宿主细胞。这在后面还有详述。
根据一个实施方案，本发明的方法依赖于昆虫摄取其外部的双链RNA (例如，通过进食)，而不需要在昆虫细胞中表达双链RNA。另外，本发 明还包括如上所述的方法，其中所述昆虫与包含该双链RNA的组合物接 触。
可通过原核的(例如但不限于细菌)或真核的(例如但不限于酵母) 宿主细胞或宿主生物来表达所述双链RNA。
所述昆虫可以是任何昆虫，意指属于动物界、特别是节肢动物门、尤 其是昆虫纲或蛛形纲的任何生物。本发明的方法适用于对利用RNA干扰 进行的基因沉默敏感的所有昆虫，以及能够从其邻近环境将双链RNA内 化的所有昆虫。本发明还适用于处于其任何发育阶段的昆虫。因为昆虫具 有无生命的外骨骼，所以它们不能以均一的速率生长，而是通过周期性蜕 落其外骨骼进行分阶段生长。该过程称作“蜕皮”。蜕皮之间的阶段称作 “龄”，而这些阶段可以作为本发明的靶标。同时，昆虫的卵或活的幼虫也 可作为本发明的靶标。发育周期中的所有阶段(包括有翅昆虫中的变态) 均可以作为本发明的靶标。因此，单个阶段(如幼虫、蛹、若虫等发育阶 段)均可以作为靶标。
在本发明的一个实施方案中，所述昆虫可以属于以下的目：蜱螨目、 蜘蛛目、虱目、鞘翅目、弹尾目、革翅目、网翅目、双尾目、双翅目、纺 足目、蜉蝣目、蛩蠊目、半翅目、同翅目、膜翅目、等翅目、鳞翅目、食 毛目、长翅目、脉翅目、蜻蜓目、直翅目、竹节虫目、翅目、原尾目、 啮虫目、蚤目、虱目、缨尾目、捻翅目、缨翅目、毛翅目和缺翅目。
在本发明优选的非限制性实施方案和方法中，所述昆虫选自：
(1)植物昆虫害虫，例如但不限于褐飞虱属物种(Nilaparvata spp.)) (例如，褐飞虱(N.lugens))、灰飞虱属物种(Laodelphax spp.)(例 如，灰飞虱(L.striatellus))、黑尾叶蝉属物种(Nephotettix spp.)(例 如，二点黑尾叶蝉(N.virescens)，或黑尾叶蝉(N.cincticeps)，或二条 黑尾叶蝉(N.nigropictus))、白背飞虱属物种(Sogatella spp.)(例如， 白背飞虱(S.furcifera))、杆长蝽属物种(Blissus spp.)(例如，美洲 谷杆长蝽(B.leucopterus leucopterus))、黑蝽属物种(Scotinophora spp.) (例如，稻黑蝽(S.vermidulate))、绿蝽属物种(Acrosternum spp.)(例 如，拟绿蝽(A.hilare))、稻弄蝶属物种(Parnara spp.)(例如，直纹 稻弄蝶(P.guttata))、禾草螟属物种(Chilo spp.)(例如，二化螟(C. suppressalis)、台湾稻螟(C.auricilius)或稻多丽螟(C.polychrysus))、 禾草螟属物种(Chilotraea spp.)(例如，稻杆螟(C.polychrysa))、蛀 茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)(例如，稻蛀茎夜蛾(S.inferens))、蛀 禾螟属物种(Tryporyza spp.)(例如，白稻螟(T.innotata)或三化螟(T. incertulas))、纵卷叶野螟属物种(Cnaphalocrocis spp.)(例如，稻纵 卷叶野螟(C.medinalis))、潜蝇属物种(Agromyza spp.)(例如，日本 稻潜蝇(A.oryzae)或玉米斑潜蝇(A.parvicornis))、杆草螟属物种(Diatraea spp.)(例如，小蔗螟(D.saccharalis)或西南玉米杆草螟(D.grandiosella))、 Narnaga属物种(例如，绿稻毛虫(N.aenescens))、黄夜蛾属物种 (Xanthodes spp.)(例如，犁纹黄夜蛾(X.transversa))、灰翅夜蛾属 物种(Spodoptera spp.)(例如，草地贪夜蛾(S.frugiperda)、甜菜夜蛾 (S.exigua)、海灰翅夜蛾(S.littoralis)或西部黄条夜蛾(S.praefica))、 秘夜蛾属物种(Mythimna spp.)(例如，粘虫(Mythmna(Pseudaletia) seperata))、铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)(例如，谷实夜蛾(H.zea))、 Colaspis属物种(Colaspis spp.)(例如，葡萄肖叶甲(C.brunnea)、稻 水象属物种(Lissorhoptrus spp.)(例如，稻水象甲(L.oryzophilus))、 稻象属物种(Echinocnemus spp.)(例如，稻象(E.squamos))、稻铁 甲属物种(Diclodispa spp.)(例如，水稻铁甲(D.armigera))、禾谷负 泥虫属物种(Oulema spp.)(例如，水稻负泥虫(O.oryzae))、米象属 物种(Sitophilus spp.)(例如，米象(S.oryzae))、Pachydiplosis属物 种(例如，稻瘿蚊(P.oryzae))、毛眼水蝇属物种(Hydrellia spp.)(例 如，麦叶毛眼水蝇(H.griseola)或日稻毛眼水蝇(H.sasakii))、Chlorops 属物种(例如，稻杆潜蝇(C.oryzae))、根萤叶甲属物种(Diabrotica spp.) (例如，玉米根叶甲(D.virgifera virgifera)、北美玉米根叶甲(D.barberi)、 黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi)、墨西哥玉米根 叶甲(D.virgifera zeae)、条纹黄瓜叶甲(D.balteata))、杆野螟属物种 (Ostrinia spp.)(例如，玉米螟(O.nubilalis))、地虎属物种(Agrotis spp.)(例如，小地老虎(A.ipsilon))、Elasmopalpus属物种(例如， 南美玉米苗斑螟(E.lignosellus))、梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.) (线虫)、圆头犀金龟属物种(Cyclocephala spp.)(例如，北部伪装金 龟(C.borealis)或南部伪装金龟(C.immaculata))、弧丽金龟属物种 (Popillia spp.)(例如，日本弧丽金龟(P.japonica))、跳甲属物种 (Chaetocnema spp.)(例如，玉米铜色跳甲(C.pulicaria))、龙颈象 属物种(Sphenophorus spp.)(例如，玉米长喙象(S.maidis))、缢管 蚜属物种(Rhopalosiphum spp.)(例如，玉米蚜(R.maidis))、圆尾蚜 属物种(Anuraphis spp.)(例如，玉米根蚜(A.maidiradicis))、黑蝗 属物种(Melanoplus spp.)(例如，红足黑蝗(M.femurrubrum))、特 异黑蝗(M.differentialis)或迁飞黑蝗(M.sanguinipes))、种蝇属物种 (Hylemya spp.)(例如，种蝇(H.platura))、呆蓟马属物种(Anaphothrips spp.)(例如，黄呆蓟马(A.obscrurus))、火蚁属物种(Solenopsis spp.) (例如，盗蚁(S.milesta))、叶螨属物种(Tetranychus spp.)(例如， 二点叶螨(T.urticae)、朱砂叶螨(T.cinnabarinus))、铃夜蛾属物种 (例如，谷实夜蛾或棉铃虫(H.armigera))、Pectinophora属物种(例 如，红铃麦蛾(P.gossypiella))、金刚钻属物种(Earias spp.)(例如， 翠纹钻夜蛾(E.vittella))、实夜蛾属物种(Heliothis spp.)(例如，烟 芽夜蛾(H.virescens))、花象属物种(Anthonomus spp.)(例如，墨西 哥棉铃象(A.grandis))、Pseudatomoscelis属物种(例如，棉伪斑腿盲 蝽(P.seriatus))、结翅粉虱属物种(Trialeurodes spp.)(例如，结翅 粉虱(T.abutiloneus)、温室粉虱(T.vaporariorum))、小粉虱属物种 (Bemisia spp.)(例如，银叶粉虱(B.argentifolii))、蚜属物种(Aphis spp.)(例如，棉蚜(A.gossypii))、草盲蝽属物种(Lygus spp.)(例 如，美国牧草盲蝽(L.lineolaris)或美洲牧草盲蝽(L.hesperus))、美 洲蝽属物种(Euschistus spp.)(例如，斑点美洲蝽(E.conspersus))、 Chlorochroa属物种(例如，赛氏蝽(C.sayi))、绿蝽属物种(Nezara spp.) (例如，稻绿蝽(N.viridula))、蓟马属物种(Thrips spp.)(例如，烟 蓟马(T.tabaci))、花蓟马属物种(Frankliniella spp.)(例如，烟褐蓟 马(F.fusca)或西方花蓟马(F.occidentalis))、马铃薯叶甲属物种 (Leptinotarsa spp.)(例如，马铃薯叶甲(L.decemlineata)、伪马铃薯 叶甲(L.juncta)或胡颓子叶茄叶甲(L.texana))、合爪负泥虫属物种 (Lema spp.)(例如，三条负泥虫(L.trilineata))、茄跳甲属物种(Epitrix spp.)(例如，美国马铃薯跳甲(E.cucumeris)、烟草跳甲(E.hirtipennis) 或块茎跳甲(E.tuberis))、豆芫菁属物种(Epicauta spp.)(例如，北 美豆芫菁(E.vittata))、猿叶甲属物种(Phaedon spp.)(例如，辣根猿 叶甲(P.cochleariae))、食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)(例如，墨 西哥豆瓢虫(E.varivetis))、Acheta属物种(例如，居屋艾蟋(A. domesticus))、绿小叶蝉属物种(Empoasca spp.)(例如，蚕豆小绿叶 蝉(E.fabae))、瘤蚜属(Myzus spp.)(例如，桃蚜(M.persicae))、 薯个木虱属物种(Paratrioza spp.)(例如，马铃薯木虱(P.cockerelli))、 宽胸金针虫属物种(Conoderus spp.)(例如，南部马铃薯线虫(C.falli) 或烟草线虫(C.vespertinus))、麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)(例如， 马铃薯麦蛾(P.operculella))、长管蚜属物种(Macrosiphum spp.)(例 如，大戟长管蚜(M.euphorbiae))、Thyanta属物种(例如，红肩蝽象 (T.pallidovirens))、麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)(例如，马铃薯 麦蛾(P.operculella))、铃夜蛾属物种(例如，谷实夜蛾)、Keiferia属 物种(例如，番茄蠹蛾(K.lycopersicella))、金针虫属物种(Limonius spp.) (线虫)、Manduca属物种(例如，烟草天蛾(M.sexta)或番茄天蛾(M. quinquemaculata))、斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)(例如，蔬菜斑潜 蝇(L.sativae)、三叶草斑潜蝇(L.trifolli)或南美斑潜蝇(L.huidobrensis))、 果蝇属物种(Drosophilla spp.)(例如，黑腹果蝇(D.melanogaster)、 D.yakuba、拟暗果蝇(D.pseudoobscura)或拟果蝇(D.simulans))、步 甲属物种(Carabus spp.)(例如，粒步甲(C.granulatus))、摇蚊属物 种(Chironomus spp.)(例如，摇蚊(C.tentanus))、栉首蚤属物种 (Ctenocephalides spp.)(例如，猫栉首蚤(C.felis))、非耳喙象属物 种(Diaprepes spp.)(例如，根象鼻虫(D.abbreviatus))、齿小蠹属物 种(Ips spp.)(例如，美松齿小蠹(I.pini))、拟谷盗属物种(Tribolium spp.)(例如，赤拟谷盗(T.castaneum))、舌蝇属物种(Glossina spp.) (例如，刺舌蝇(G.morsitans))、按蚊属物种(Anopheles spp.)(例 如，甘比亚按蚊(A.gambiae))、铃夜蛾属(例如，棉铃虫(H.armigera))、 Acyrthosiphon属物种(例如，豌豆蚜(A.pisum))、蜜蜂属物种(Apis spp.) (例如，意大利蜜蜂(A.melifera))、Homalodisca属物种(例如，琉璃 叶蝉(H.coagulate))、伊蚊属物种(Aedes spp.)(例如，埃及斑纹(Ae. aegypti))、蚕蛾属物种(Bombyx spp.)(例如，家蚕(B.mori))、 飞蝗属物种(Locusta spp.)(例如，飞蝗(L.migratoria))、牛蜱属物 种(Boophilus spp.)(例如，微小牛蜱(B.microplus))、Acanthoscurria 属物种(例如，红毛巧克力捕鸟蛛(A.gomesiana))、甲蠊属物种(Diploptera spp.)(例如，太平洋折翅蠊(D.punctata))、袖蝶属物种(Heliconius spp.)(例如，瓦氏袖蝶(H.erato)或诗神袖蝶(H.melpomene))、象 虫属物种(Curculio spp.)(例如，欧洲栎象(C.glandium))、Plutella 属物种(例如，菜蛾(P.xylostella))、钝眼蜱属物种(Amblyomma spp.) (例如，彩饰花蜱(A.variegatum))、柞蚕属物种(Anteraea spp.)(例 如，天蚕(A.yamamai))和阿蚊属物种(Armigeres spp.)(例如，骚扰 阿蚊(A.subalbatus))；
(2)能够侵扰或损伤人和/或动物的昆虫，例如但不限于具有可见于半翅 目和某些膜翅目以及双翅目(如蚊子、蜜蜂、黄蜂、虱、蚤和蚂蚁)的刺 吸式口器的昆虫以及蛛形纲动物(Arachnidae)(如蜱和螨)：蜱螨目(蜱 和螨)，例如代表性的科：软蜱科(Argasidae)、皮刺螨科(Dermanyssidae)、 硬蜱科(Ixodidae)、痒螨科(Psoroptidae)或疥螨科(Sarcoptidae)，以 及代表性的物种：花蜱属物种(Amblyomma spp.)、暗眼蜱属物种 (Anocentor spp.)、锐缘蜱属物种(Argas spp.)、牛蜱属物种(Boophilus spp.)、姬螯螨属物种(Cheyletiella spp.)、足螨属物种(Chorioptes spp.)、 蠕形螨属物种(Demodex spp.)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)、皮刺 螨属物种(Dermanyssus spp.)、血蜱属物种(Haemophysalis spp.)、璃 眼蜱属物种(Hyalomma spp.)、硬蜱属物种(Ixodes spp.)、Lynxacarus 属物种、中气门亚目物种(Mesostigmata spp.)、背肛螨属物种(Notoedres spp.)、钝缘蜱属物种(Ornithodoros spp.)、禽刺螨属物种(Ornithonyssus spp.)、残喙蜱属物种(Otobius spp.)、耳痒螨属物种(Otodectes spp.)、 肺刺螨属物种(Pneumonyssus spp.)、痒螨属物种(Psoroptes spp.)、扇 头蜱属物种(Rhipicephalus spp.)、疥螨属物种(Sarcoptes spp.)或恙螨 属物种(Trombicula spp.)；虱目(吸吮和叮咬的虱)，例如代表性物种： 牛毛虱属物种(Bovicola spp.)、血虱属物种(Haematopinus spp.)、颚 虱属物种(Linognathus spp.)、鸡虱属物种(Menopon spp.)、人虱属物 种(Pediculus spp.)、瘿绵蚜属物种(Pemphigus spp.)、根瘤蚜属物种 (Phylloxera spp.)或管虱属物种(Solenopotes spp.)；双翅目(蝇)，例 如代表性的物种：伊蚊属物种(Aedes spp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、 丽蝇属物种(Calliphora spp.)、金蝇属物种(Chrysomyia spp.)、斑虻属 物种(Chrysops spp.)、锥蝇属物种(Cochliomyia spp.)、库蚊属物种(Culex spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、黄蝇属物种(Cuterebra spp.)、 皮蝇属物种(Dermatobia spp.)、胃蝇属物种(Gastrophilus spp.)、舌蝇 属物种(Glossina spp.)、黑角蝇属物种(Haematobia spp.)、麻虻属物 种(Haematopota spp.)、虱蝇属物种(Hippobosca spp.)、皮蝇属物种 (Hypoderma spp.)、绿蝇属物种(Lucilia spp.)、角蝇属物种(Lyperosia spp.)、蜱蝇属物种(Melophagus spp.)、狂蝇属物种(Oestrus spp.)、 绿蝇属物种(Phaenicia spp.)、白蛉属物种(Phlebotomus spp.)、伏蝇 属物种(Phormia spp.)、麻蝇属物种(Sarcophaga spp.)、蚋属物种 (Simulium spp.)、螫蝇属物种(Stomoxys spp.)、虻属物种(Tabanus spp.)、 Tannia属物种或大蚊属(Tipula spp.)；食毛目(叮咬的虱)，例如代表 性的物种：Damalina属物种、猫毛虱属物种(Felicola spp.)、Heterodoxus 属物种或啮毛虱属物种(Trichodectes spp.)；蚤目(无翅昆虫)，例如角 叶蚤属物种(Ceratophyllus spp.)、蚤属物种(Pulex spp.)或客蚤属物种 (Xenopsylla spp.)；臭虫科(臭虫)，例如代表性的物种：臭虫属物种 (Cimex spp.)、Tritominae属物种、Rhodinius属物种或锥蝽属物种 (Triatoma spp.)以及
(3)导致对基层(substrate)或物品的不利破坏的昆虫，如攻击食品、 种子、木材、涂料、塑料、衣物等的昆虫。
(4)与公共健康和卫生相关的昆虫或蛛形纲动物，包括住屋昆虫和 体外寄生虫，例如但不限于蝇、叶螨、蓟马、蜱、红色家禽螨、蚂蚁、蟑 螂、白蚁、蟋蟀(包括住屋蟋蟀)、蠹虫、书虱、甲虫、蠼螋、蚊子和蚤。 更优选的靶标是蟑螂(蜚蠊目)，例如但不限于小蠊属物种(Blatella spp.) (例如，德国小蠊(Blatella germanica)、大蠊属物种(Periplaneta spp.) (例如，美洲大蠊(Periplaneta americana)和澳洲大蠊(Periplaneta australiasiae)、蜚蠊属物种(Blatta spp.)(例如，东方蜚蠊(Blatta orientalis)) 和皮蠊属物种(Supella spp.)(例如，长须蜚蠊(Supella longipalpa))， 蚂蚁(蚁总科)，如但不限于火蚁属(Solenopsis spp.)(例如，红火蚁 (Solenopsis invicta))、小家蚁属物种(Monomorium spp.)(例如，小 家蚁(Monomorium pharaonis))、弓背蚁属物种(Camponotus spp.)(例 如，弓背蚁属物种(木匠蚁))、毛蚁属物种(Lasius spp.)(例如，黑 毛蚁(lasius niger))、铺道蚁属物种(Tetramorium spp.)(例如，铺道 蚁(Tetramorium caespitum))、红蚁属物种(Myrmica spp.)(例如， 小红蚁(Myrmica rubra))、蚁属物种(Formica spp.)(木蚁)、举腹 蚁属物种(Crematogaster spp.)(例如，举腹蚁(Crematogaster lineolata))、 虹臭蚁属物种(Iridomyrmex spp.)(例如，阿根廷蚁(Iridomyrmex humilis))、大头蚁属物种(Pheidole spp.)(大头蚁)和Dasymutilla属 物种(例如，Dasymutilla occidentalis(蚁蜂))，白蚁(等翅目和/或白蚁 科)，例如但不限于丫白蚁属物种(Amitermes spp.)(例如佛罗里达黑翅 散白蚁(Amitermes floridensis))、散白蚁属物种(Reticulitermes spp.) (例如，黄肢散白蚁(Reticulitermes flavips)、西部散白蚁(Reticulitermes hesperus))、乳白蚁属物种(Coptotermes spp.)(例如，台湾乳白蚁 (Coptotermes formosanus))、楹白蚁属物种(Incisitermes spp.)(例如， 小楹白蚁(Incisitermes minor))、新白蚁属物种(Neotermes spp.)(例 如，森林树白蚁(Neotermes connexus))。
受益于本发明的“敏感生物”包括对害虫侵害敏感的任何生物。许多不 同生物的害虫，所述生物例如动物(如人、家畜(如宠物(如猫、犬等)) 和牲畜(包括绵羊、奶牛、猪、鸡等))。
由此，在本发明的优选但非限制的实施方案中，所述昆虫或蛛形纲动 物选自：
(1)蜱螨目：包括蜱亚目(蜱)的螨类
(2)蛛形纲：蜘蛛目(蜘蛛)和盲蛛目(盲蜘蛛)，实例包括黑寡 妇蜘蛛(Latrodectus mactans)和棕色隐遁蜘蛛(Loxosceles recluse)
(3)虱目：虱，如体虱(Pediculus humanus)
(4)蜚蠊目：蟑螂，包括德国小蠊、大蠊属的美洲大蠊和澳洲大蠊、 蜚蠊属的东方蜚蠊以及皮蠊属的长须蜚蠊。最优选的靶标是德国小蠊。
(5)鞘翅目：甲虫，实例包括长蠹总科；大小蠹属物种(Dendroctonus spp.)(Black Turpentine Beetle、南部松小蠹(Southern Pine Beetle)、 IPS雕刻小蠹(IPS Engraver Beetle))；地毯甲虫(Carpet Beetles)(圆 皮蠹属物种(Anthrenus spp.)、毛皮蠹属物种(Attagenus spp.))；Old House Borer(天牛科：家天牛(Hylotrupes bajulus))；家俱窃蠹(Anobium punctatum)；拟谷盗属物种(面象虫)；谷斑皮蠹(Trogoderma granarium)； Oryzaephilus sarinamensis(锯谷盗(Toothed Grain Beetle))等(书虫)
(6)革翅目：蠼螋类
(7)双翅目：蚊(蚊科)和蝇(短角亚目)，实例是Anophehnae(如 按蚊属物种)和库蚊亚科(如Aedes fulvus)；虻科如Tabanus punctifer (马蝇)、Glossina morsitans morsitans(舌蝇)、drain flies(毛蠓科)以 及有瓣蝇类(Calyptratae)如家蝇(Musca domestica)、肉蝇(麻蝇科) 等
(8)异翅亚目：臭虫，如温带臭虫(Cimex lectularius)(床虱)
(9)膜翅目：黄蜂(细腰亚目)，包括蚂蚁(蚁总科)、蜜蜂(蜜 蜂总科)：红火蚁、小家蚁、弓背蚁属物种(木匠蚁)、黑毛蚁、铺道蚁、 小红蚁、蚁属物种(木蚁)、举腹蚁、阿根廷蚁、大头蚁属物种(大头蚁) 和Dasymutilla occidentalis(蚁蜂)等
(10)等翅目：白蚁，实例包括佛罗里达黑翅散白蚁(Amitermes floridensis)、黄肢散白蚁、西部散白蚁(R.hesperus)、台湾乳白蚁、小 楹白蚁、森林树白蚁(Neotermes connexus))和白蚁科
(11)鳞翅目：蛾，实例包括谷蛾科和织蛾科(如衣蛾(Tineola bisselliella))以及螟蛾科(如紫斑谷螟(Pyralis farinalis))等
(12)啮虫目：书虱(啮虫目)
(13)蚤目：蚤，如致痒蚤(Pulex irritans)
(14)胸喙亚目：蚜虫(蚜科)
(15)衣鱼目：蠹虫，实例是：小灶衣鱼(Thermobia domestica)和 衣鱼(Lepisma saccharina)
本发明优选的植物病原性昆虫是植物害虫并选自：马铃薯叶甲属物种 (例如，马铃薯叶甲、伪马铃薯叶甲或胡颓子叶茄叶甲)、褐飞虱属物种 (例如，褐飞虱)、灰飞虱属物种(例如，灰飞虱)、黑尾叶蝉属物种(例 如，二点黑尾叶蝉，或黑尾叶蝉，或二条黑尾叶蝉)、白背飞虱属物种(例 如，白背飞虱)、禾草螟属物种(例如，二化螟、台湾稻螟或稻多丽螟)、 蛀茎夜蛾属物种(例如，稻蛀茎夜蛾)、蛀禾螟属物种(例如，白稻螟或 三化螟)、根萤叶甲属物种(例如，玉米根叶甲、北美玉米根叶甲、黄瓜 十一星叶甲食根亚种、墨西哥玉米根叶甲)、杆野螟属物种(例如，玉米 螟)、呆蓟马属物种(例如，黄呆蓟马)、Pectinophora属物种(例如， 红铃麦蛾)、实夜蛾属物种(例如，烟芽夜蛾)、结翅粉虱属物种(例如， 结翅粉虱、温室粉虱)、小粉虱属物种(例如，银叶粉虱)、蚜属物种(例 如，棉蚜)、草盲蝽属物种(例如，美国牧草盲蝽或美洲牧草盲蝽)、美 洲蝽属物种(例如，斑点美洲蝽)、Chlorochroa属物种(例如，赛氏蝽)、 绿蝽属物种(例如，稻绿蝽)、蓟马属物种(例如，烟蓟马)、花蓟马属 物种(例如，烟褐蓟马或西方花蓟马)、瘤蚜属物种(例如，桃蚜)、长 管蚜属物种(例如，大戟长管蚜)、杆长蝽属物种(例如，美洲谷杆长蝽)、 绿蝽属物种(例如，拟绿蝽)、禾草螟属物种(例如，稻杆螟(C.polychrysa))、 稻水象属物种(例如，稻水象甲)、缢管蚜属物种(例如，玉米蚜)和圆 尾蚜属物种(例如，玉米根蚜(A.maidiradicis))。
根据一个更具体的实施方案，本发明的方法适用于马铃薯叶甲属物种。 马铃薯叶甲属属于叶甲科或叶甲类。叶甲(如跳甲和玉米根虫)和象甲(如 苜蓿叶象甲)是特别重要的害虫。跳甲包括多种小型食叶甲虫，其以多种 草、谷类和草本植物的叶为食。跳甲包括多个属(例如，Attica、Apphthona、 Argopistes、Disonycha、茄跳甲属、长跗跳甲属、潜跳甲属 (Prodagricomela)、Systena和黄条跳甲属)。蔬菜黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae)(也叫作油菜跳甲(Rape Flea Beetle))是特别重要的害虫。 玉米根虫包括叶甲属的物种(例如，黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata undecimpunctata)、黄瓜十一星叶甲食根亚种、D.longicornis、玉米根叶 甲和条纹黄瓜叶甲)。玉米根虫对玉米和瓜类(curcubit)造成广泛破坏。 黄瓜十一星叶甲(Western Spotted Cucumber Beetle)是美国西部的瓜类 害虫。苜蓿叶象甲(亦称三叶草象甲)属于叶象属(紫苜蓿叶象(H.postica)、 埃及苜蓿叶象(H.brunneipennis)、H.nigrirostris、三叶草叶象(H. punctata)和H.meles)，并被认为是重要的豆类害虫。埃及苜蓿叶象是 美国西部的重要苜蓿害虫。
马铃薯叶甲属物种超过30种。因此，本发明包括用于防治马铃薯叶甲 属物种的方法，更特别地用于杀死昆虫、或阻止马铃薯叶甲属昆虫发育或 生长、或者防止昆虫感染或侵害的方法。本发明所防治的特定马铃薯叶甲 属物种包括马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata(Say))和伪马铃薯叶甲 (Leptinotarsa juncta(Say))。
CPB(Colorado Potato Beetle，马铃薯叶甲)对我们本国的马铃薯、 其它栽培和野生的有块茎和无块茎的马铃薯物种(例如，S.demissum(墨 西哥马铃薯野生种)、富利亚薯(S.phureja a.o.))以及另一些茄属植物 物种是(严重的)害虫，所述植物物种包括：
(a)作物物种番茄(若干番茄属物种)、茄子、胡椒(若干辣椒属物种)、 烟草(若干烟草属物种，其包括观赏性植物)和醋栗(酸浆属物种)；
(b)杂草/草本植物物种，北美刺龙葵(S.carolinense)、欧白英(S. dulcamara)、颠茄(颠茄属物种)、曼陀罗(曼陀罗属物种)、天仙子 (天仙子属物种)和黄花刺茄(S.rostratum)。
FPB(False Potato Beetle，伪马铃薯叶甲)主要发现于北美刺龙葵上， 也发生在欧白英、醋栗和酸浆(酸浆属物种)上。
术语“昆虫”包括所有类型以及所有发育阶段的昆虫，包括卵、幼虫或 若虫、蛹和成虫阶段。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是马铃薯叶甲，所述植 物是马铃薯、茄子、番茄、胡椒、烟草、醋栗或者稻、玉米或棉花。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是辣根猿叶甲，所述植 物是芥菜、大白菜、芜菁、羽衣甘蓝或小白菜。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是墨西哥豆瓢虫，所述 植物是豆类、菜豆、四季豆、食英菜豆、利马豆、绿豆、青豆、牛眼豆、 绒毛豆、大豆、豇豆、木豆、三叶草或苜蓿。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是墨西哥棉铃象，所述 植物是棉花。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是赤拟谷盗，所述植物 以贮藏谷物的形式，如面粉、谷类、粗粉、饼干、豆类、调味品、面食、 点心粉、干的宠物食品、干花、巧克力、坚果、种子甚至干的博物馆标本。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是桃蚜，所述植物是树 木如李属，特别是桃、杏和李子；茄科、藜科、菊科、十字花科和葫芦科 的蔬菜作物，其包括但不限于：朝鲜蓟、芦笋、豆类、甜菜、嫩茎花椰菜、 抱子甘蓝、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、哈蜜瓜、芹菜、玉米、黄瓜、茴香、 无头甘蓝、大头菜、芜菁、茄子、莴苣、芥菜、菜秋葵、欧芹、欧洲防风 草、豌豆、胡椒、马铃薯、萝卜、菠菜、南瓜、番茄、芜菁、豆瓣菜和西 瓜；农田作物例如但不限于：烟草、糖用甜菜和向日葵；花作物或其它观 赏性植物。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是褐飞虱，所述植物是 稻类植物。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是二化螟，所述植物是 稻类植物、大麦(bareley)、高粱、玉米、小麦或草。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是菜蛾，所述植物是芸 苔属物种，例如但不限于卷心菜、大白菜、抱子甘蓝、无头甘蓝、油菜籽、 嫩茎花椰菜、花椰菜、芜菁、芥菜或萝卜。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是居屋艾蟋，所述植物 是本文所述的任何植物或任何有机体。
在本文中，术语“植物”包括期望被处理从而阻止或降低昆虫生长和/ 或昆虫侵害的任何植物材料。这包括整株植物、幼苗、增殖或繁殖材料(如 种子、插条、接穗、外植体等)，以及植物细胞和组织培养物等。所述植 物材料应当表达RNA分子或者具有表达RNA分子的能力，所述RNA分 子包含至少一种核苷酸序列，该核苷酸序列是害虫至少一种靶基因的有义 链核苷酸序列之至少一部分的RNA互补序列或代表了其RNA等价物，从 而所述RNA分子通过植物与害虫的相互作用被害虫摄取，所述RNA分子 能够通过RNA干扰来抑制靶基因或者下调靶基因的表达。
所述靶基因可以是本文所述的任何靶基因，例如对于害虫的生存、生 长、发育或繁殖必需的靶基因。本发明涉及昆虫中可被下调的任何目的基 因(本文可称作“靶基因”)。
术语“下调基因表达”和“抑制基因表达”可互换使用，其指在靶基因的 蛋白质产物和/或mRNA产物水平上可测量的或可观察的基因表达减少或 者完全消除可检测的基因表达。优选地，所述下调不显著地直接抑制昆虫 其它基因的表达。当与正常的基因表达比较时，dsRNA对基因表达的下调 效果可计算为至少为30％、40％、50％、60％，优选70％、80％，或者更 优选90％或95％。取决于靶基因的性质，可通过对细胞或整只昆虫进行表 型分析或者使用分子技术测量mRNA或蛋白质的表达来验证昆虫细胞中 基因表达的下调或抑制，所述分子技术如RNA溶液杂交、PCR、核酸酶 保护实验、Northern杂交、逆转录、使用微列阵监测基因表达、抗体结合、 酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、放射免疫测定(RIA)、 其它免疫测定或荧光激活细胞分析(FACS)。
“靶基因”基本上可以是由于其干扰昆虫的生长或致病性或感染性而期 望被抑制的几乎任何基因。例如，如果本发明的方法用于阻止昆虫生长和 /或侵害，则优选地选择对昆虫的生存、生长、发育或繁殖必需的靶基因， 或者参与昆虫的致病性或感染性的任何基因，从而对靶基因的特异性抑制 导致致死性表型或者降低或阻止昆虫侵害。
根据一个非限制性的实施方案，所述靶基因是当使用本发明的方法下 调或抑制其表达时，昆虫被杀死或者昆虫的繁殖或生长被阻止或阻滞的那 些基因。认为这类靶基因是昆虫生存所必需的，并称作必需基因。因此， 本发明包括本文所述的方法，其中所述靶基因是必需基因。
根据另一非限制性的实施方案，所述靶基因是当使用本发明的方法将 其下调时，昆虫的侵害或感染、昆虫造成的破坏和/或昆虫侵害或感染宿主 生物和/或导致此类破坏的能力有所降低。一般地，术语“侵害”和“感染” 始终可互换使用。认为这类靶基因参与昆虫的致病性或感染性。因此，本 发明延伸至本文所述的方法，其中所述靶基因参与昆虫的致病性或感染 性。选择后一类型靶基因的优势在于阻断了昆虫进一步感染植物或植物部 分，并抑制其形成后代。
根据一个实施方案，靶基因是保守基因或昆虫特异性基因。
另外，在本发明的方法中可以使用能够指导RNAi或RNA介导的基 因沉默或者抑制昆虫靶基因的任何适当的双链RNA片段。
在另一实施方案中，选择实质性参与害虫(如昆虫)生长、发育和繁 殖的基因。示例性的基因包括但不限于核糖体蛋白的结构亚基和β-外被体 基因(如CHD3基因)。核糖体蛋白如S4(RpS4)和S9(RpS9)是参与 蛋白质生物合成的核糖体的结构组分，并且是胞质小核糖体亚基的组分， 核糖体蛋白如L9和L19是参与蛋白质生物合成的核糖体的结构组分，并 且定位于核糖体。秀丽隐杆线虫中的β-外被体基因编码蛋白质，所述蛋白 质形成膜泡外衣的多聚复合体的亚基。已在多种生物中发现类似的序列， 如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) 和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在多种生物中发现相关的序列， 如马铃薯叶甲、辣根猿叶甲、墨西哥豆瓢虫、墨西哥棉铃象、赤拟谷盗、 桃蚜、褐飞虱、二化螟、菜蛾和居屋艾蟋。
本发明使用的其它靶基因可包括例如在生存、生长、发育、繁殖和感 染性中扮演重要角色的基因。这些靶基因包括例如持家基因、转录因子和 害虫特异性基因或者线虫或果蝇中致死性敲除突变。本发明使用的靶基因 还可以是来自其它生物的基因，例如来自昆虫或蛛形纲动物(例如，马铃 薯叶甲属物种、猿叶甲属物种、食植瓢虫属物种、花象属物种、拟谷盗属 物种、瘤蚜属物种、褐飞虱属物种、禾草螟属物种、Plutella属物种或Acheta 属物种)的基因。
优选的靶基因包括表1A中指定的基因以及来自其它靶生物(如来自 其它害虫)的直向同源基因。
在本发明的方法中，使用dsRNA抑制昆虫生长或干扰昆虫的致病性或 感染性。
因此，本发明涉及包含退火互补链的分离的双链RNA，其中一条退火 互补链包含与昆虫靶基因的靶核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序 列。所述靶基因可以是本文所述的任意靶基因，或者其发挥同样功能的一 部分。
根据本发明的一个实施方案，提供了包含退火互补链的分离的双链 RNA，其中一条退火互补链包含与昆虫靶基因核苷酸序列之至少一部分互 补的核苷酸序列，其中所述靶基因包含选自以下的序列：
(i)与如下表示的任意序列具有至少75％一致性的序列：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188， 193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473， 478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596， 601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056， 1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097， 1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587， 1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662， 1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704， 1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095， 2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366， 2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，以及
(ii)包含以下任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：SEQ ID NO 1、 3、5、7、9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488， 493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605， 607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868， 873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071， 1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101， 1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597， 1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672， 1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至 2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102， 2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370， 2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，
或者，其中所述昆虫靶基因是包含以下任意序列之至少17个连续核苷酸的 基因的昆虫直系同源物：SEQ ID NO 49至158、275至472、533至575、 621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120 至2338、2384至2460或其互补序列。
取决于用于测量基因沉默的测定，与已用对照dsRNA处理的害虫相 比，生长抑制可定量为大于约5％、10％，更优选约20％、25％、33％、 50％、60％、75％、80％，最优选约90％、95％或约99％。
根据本发明的另一实施方案，提供了分离的双链RNA，其中至少一条 所述退火互补链包含如下表示的任意序列之至少一种核苷酸序列的RNA 等价物：SEQ ID NO 1、3、5、 7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493， 498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609， 621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883， 888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107， 1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617， 1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686， 1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055， 2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338， 2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471， 2476或2481，或者其中至少一条所述退火互补链包含其长度为至少17个 碱基对、优选其长度为至少18、19、20或21，更优选至少22、23或24 个碱基对的RNA等价物的片段。
如果本发明的方法用于在宿主细胞或宿主生物中或者对宿主细胞或宿 主生物特异性控制特定昆虫的生长或侵害，则优选所述双链RNA不与任 何宿主基因具有任何显著的同源性，或者至少不与宿主的任意必需基因具 有任何显著的同源性。在这种情况下，优选所述双链RNA与宿主细胞任 意基因的核酸序列一致性低于30％，更优选低于20％，更优选低于10％， 甚至更优选低于5％。序列一致性百分比应当在所述双链RNA的全长区域 上计算。如果可获得宿主生物的基因组序列数据，则可以使用标准生物信 息学工具来相互校验与所述双链RNA的序列一致性。在一个实施方案中， 所述dsRNA与宿主序列之间不存在超过21个连续核苷酸的序列一致性， 即在这种情况下，优选宿主生物的基因组中不存在所述dsRNA的21个连 续碱基对。在另一实施方案中，所述dsRNA与宿主物种任意核苷酸序列 之间在24个连续核苷酸上的序列一致性低于约10％或低于约12.5％。
所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条退火互补链包含对应于 待下调之靶基因的靶核苷酸序列的核苷酸序列。所述双链RNA的另一条 链能够与上述第一条链进行碱基配对。
所述昆虫靶基因的“靶区域”或“靶核苷酸序列”可以是基因的任何适当 的区域或核苷酸序列。所述靶区域应包含靶基因的至少17、至少18或至 少19个连续核苷酸，更优选至少20或至少21个核苷酸，并且更优选所述 靶基因的至少22、23或24个核苷酸。
优选(至少部分的)所述双链RNA与昆虫靶基因的靶区域具有100 ％的序列一致性。然而应当理解的是，在所述双链区域的全长上具有100 ％序列一致性不是功能性RNA抑制的必要条件。还发现，相对于靶序列 来说带有插入、缺失和单点突变的RNA序列对RNA抑制是有效的。术语 “对应于”或“与......互补”在本文可互换使用，并且当这些术语用于指所述 双链RNA和靶基因的靶区域之间的序列对应性时，应解释为并非绝对需 要100％的序列一致性。然而，所述双链RNA和靶区域之间的序列一致性 百分比通常为至少80％或85％一致，优选至少90％、95％、96％一致， 或者更优选至少97％、98％一致，以及更优选至少99％一致。当两条核酸 链的至少85％碱基配对时，它们是“基本上互补的”。
本文使用的术语“互补的”涉及DNA-DNA互补性和DNA-RNA互补 性。类似地，术语“RNA等价物”实际上指在DNA序列中碱基“T”可以被 通常存在于核糖核酸中的对应碱基“U”所替代。
尽管所述dsRNA包含对应于靶基因中靶区域的序列，然而整个dsRNA 都对应于靶区域的序列却不是绝对必需的。例如，所述dsRNA可在靶标 特异性序列的侧翼包含短的非靶区域，只要该序列不实质性影响该dsRNA 的RNA抑制性能即可。
所述dsRNA可包含一个或多个替代碱基从而优化RNAi的性能。对于 本领域技术人员来说，如何依次改变所述dsRNA的每个碱基并测试所得 dsRNA的活性(例如，在适当的体外测试系统中)从而优化给定dsRNA 的性能是显而易见的。
所述dsRNA还可以包含DNA碱基、非天然的碱基或者糖-磷酸主链的 非天然主链连接或修饰，从而例如提高保藏期间的稳定性或者增强对核酸 酶降解的抗性。
先前已有报道，对于有效的基因沉默来说，形成约21bp的小干扰RNA (siRNA)是理想的。然而，在申请人的应用中已显示，dsRNA的最小长 度优选至少约80-100bp以便被某些害虫有效摄取。有迹象表明，在无脊 椎动物(如自由生活的秀丽隐杆线虫或植物寄生性的南方根结线虫 (Meloidogyne incognita))中，这些较长的片段在基因沉默中更加有效， 这可能由于无脊椎动物摄取这些较长的dsRNA更为有效所致。
最近还提出，与常规的21聚体(21-mer)siRNA相比，由27聚体平 端组成的合成RNA双链体或者具有29bp的茎和2-nt 3’突出端的短发夹 (short hairpin，sh)RNA组成的合成RNA双链体是RNA干扰更有力的 诱导物。因此，基于上述已鉴定靶标、并且为27聚体平端RNA分子或者 具有29bp的茎和2-nt 3’突出端的短发夹RNA分子的分子也包括在本发 明的范围内。
因此，在一个实施方案中，所述双链RNA片段(或区域)本身的长 度优选为至少17bp，长度优选为18或19bp，更优选至少20bp，长度更 优选至少21bp，或至少22bp，或至少23bp，或至少24bp、25bp、26bp 或至少27bp。“双链RNA片段”或“双链RNA区域”是指对应于(部分) 靶基因的双链RNA小实体。
通常，所述双链RNA优选为约17-1500bp，更优选约80-1000bp，最 优选约17-27bp或约80-250bp；如双链RNA区域约为17bp、18bp、19 bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、27bp、50bp、80bp、 100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500 bp、550bp、600bp、650bp、700bp、900bp、100bp、1100bp、1200bp、 1300bp、1400bp或1500bp。
所述双链RNA的长度上限可取决于i)昆虫摄取该dsRNA的需要， 以及ii)该dsRNA在细胞内部加工成指导RNAi的片段的需要。所选长度 还可受RNA合成方法以及向细胞递送RNA的模式的影响。优选地，本发 明方法中待使用的双链RNA的长度小于10,000bp，更优选1000bp或更 小，更优选500bp或更小，更优选300bp或更小，更优选100bp或更小。 对于任何给定的靶基因和昆虫来说，所述dsRNA进行有效抑制的最佳长 度可通过实验来确定。
所述双链RNA可以是完全或部分双链的。部分双链RNA可在双链部 分的一端或两端包含短的单链突出端，只要所述RNA仍能被昆虫摄取并 指导RNAi即可。所述双链RNA还可包含内部的非互补区。
本发明的方法包括向同一昆虫同时或依次提供两种或更多种不同的双 链RNA或RNA构建体，从而实现下调或抑制多种靶基因或者更有效地抑 制单种靶基因。
或者，通过提供命中多种靶序列的一种双链RNA来命中多个靶标， 并且多于一个拷贝的对应于靶基因的双链RNA片段的存在可更有效地抑 制单个靶标。因此，在本发明的一个实施方案中，所述双链RNA构建体 包含多个dsRNA区域，每个dsRNA区域的至少一条链包含与昆虫靶基因 的靶核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列。根据本发明，所述RNA 构建体中的dsRNA区域可以与同样或不同的靶基因互补，和/或所述 dsRNA区域可以与来自相同或不同昆虫物种的靶标互补。
术语“命中”是指所述dsRNA的至少一条链与靶基因或核苷酸序列互 补，并由此可与之结合。
在一个实施方案中，所述双链RNA区域包含与靶基因互补的核苷酸 序列的多个拷贝。或者，所述dsRNA命中同一靶基因的多于一种靶序列。 因此，本发明包括分离的双链RNA构建体，其包含与昆虫靶标的核苷酸 序列之至少一部分互补的核苷酸序列的至少两个拷贝。
在本文中，本发明的术语“多种(个)”意指至少2种(个)、至少3 种(个)、至少4种(个)、至少5种(个)、至少6种(个)等。
“另一靶基因”或“至少另一种靶基因”是指例如第二、第三或第四种靶 基因等。
本发明的方法开发并使用了命中多于一种上述靶标的dsRNA或者针 对上述不同靶标的不同dsRNA的组合。
因此，本发明涉及分离的双链RNA构建体，其包含如下表示的至少 一种核苷酸序列之RNA等价物的至少两个拷贝：
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158， 159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253， 255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575， 576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795， 797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041， 1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091， 1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577， 1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652， 1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700， 1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090， 2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366， 2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或者其长度为至少 17个碱基对、优选其长度为至少18、19、20或21个碱基对，更优选至少 22、23或24个碱基对之片段的RNA等价物的至少两个拷贝，。优选地， 所述双链RNA包含核苷酸序列SEQ ID NO 159或160的RNA等价物， 或者其长度为至少17、优选至少18、19、20或21、更优选至少22、23 或24个碱基对的片段。在另一实施方案中，本发明涉及分离的双链RNA 构建体，其包含核苷酸序列SEQ ID NO 159或160的RNA等价物的至少 两个拷贝。
因此，本发明延伸至本文所述的方法，其中所述dsRNA包含退火的互 补链，其中一条退火互补链包含与昆虫靶基因的靶核苷酸序列之至少一部 分互补并包含彼此独立选择的至少两种核苷酸序列的RNA等价物的核苷 酸序列。在一个实施方案中，所述dsRNA包含独立选自如下表示的序列 之至少两种、优选至少三种、四种或五种核苷酸序列的RNA等价物：
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158， 159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253， 255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575， 576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795， 797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041， 1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091， 1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577， 1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652， 1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700， 1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090， 2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366， 2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或者其长度为至少 17个碱基对，优选至少18、19、20或21、更优选至少22、23或24个碱 基对的片段。
所述至少两种核苷酸序列可以来源于本文所述的靶基因。根据一个优 选的实施方案，所述dsRNA命中对昆虫生存、生长、发育或繁殖必需的 至少一种靶基因，并命中参与上文所述的致病性或感染性的至少一种基 因。或者，所述dsRNA命中同类的多种基因，例如所述dsRNA命中至少 两种必需基因或者至少两种参与同样细胞功能的基因。根据又一实施方 案，所述dsRNA命中至少两种靶基因，所述靶基因参与不同的细胞功能。 例如，所述dsRNA命中参与蛋白质合成(例如核糖体亚基)、细胞内蛋 白质转运、细胞核mRNA剪接或者参与表1A中所述功能之一的两种或更 多种基因。
优选地，本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫靶基因包含选 自以下的序列：
(i)与如下表示的任意序列具有至少75％一致性的序列：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188， 193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473， 478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596， 601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056， 1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097， 1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587， 1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662， 1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704， 1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095， 2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366， 2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，以及
(ii)包含以下任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：SEQ ID NO 1、 3、5、7、 9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488， 493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605， 607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868， 873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071， 1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101， 1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597， 1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672， 1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至 2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102， 2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370， 2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，
或者其中所述昆虫靶基因是包含以下任意序列之至少17个连续核苷 酸的基因的昆虫直系同源物：SEQ ID NO 49至158、275至472、533至 575、621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、 2120至2338、2384至2460或其互补序列。
所述双链RNA中的dsRNA区域(或片段)可如下进行组合：
a)当组合那些靶向单一靶基因的多个dsRNA区域时，在RNA构建体中 可以以原始的顺序(即，该区域在靶基因中出现的顺序)对它们进行组合，
b)或者，可以不管所述片段的原始顺序，将它们随机地或有目的地以任 意顺序组合成双链RNA构建体，
c)或者，一种片段可以在所述dsRNA构建体中重复若干次，例如1～10 次，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或者
d)所述dsRNA区域(靶向一种或不同的靶基因)可以以有义或反义的方 向进行组合。
另外，所述待组合的靶基因可选自以下种类的一种或多种基因：
e)上述“必需的”基因或“致病性基因”包括对于一种或多种靶昆虫来说关键 性的基因，当其被沉默时导致致死的或严重的(例如，进食、繁殖、生长) 表型。选择强致死性靶基因导致有效的RNAi效果。在本发明的RNA构 建体中，靶向相同或不同的(非常有效的)致死基因的多个dsRNA区域 可以进行组合，以进一步增强RNAi作用在防治害虫中的效力、功效或速 度。
f)“弱”基因包括在本文所述的细胞途径之一中具有特别感兴趣的功能、但 当其被单独沉默时导致弱表型效果的靶基因。在本发明的RNA构建体中， 靶向一种或不同弱基因的多个dsRNA区域可以进行组合从而获得较强的 RNAi效果。
g)“昆虫特异性”基因包括在非昆虫生物中没有显著同源性对应物的基因， 其可以通过生物信息同源性检索来确定，例如通过BLAST检索。选择昆 虫特异性靶基因导致物种特异性的RNAi作用，而在非靶生物中没有作用 或没有显著的(不利)作用。
h)“保守基因”包括在靶生物和非靶生物之间(在氨基酸水平上)保守的 基因。为了降低对非靶物种的可能的作用，分析这些有效但保守的基因， 并选择这些保守基因可变区域的靶序列作为RNA构建体中的dsRNA区域 的靶标。此时，在核酸序列水平评估保守性。因此，这些可变区域包括保 守靶基因中最不保守的部分(核酸序列水平)。
i)“保守途径”基因包括参与相同生物学途径或细胞过程的基因，或者包括 在不同昆虫物种中具有相同功能的基因，其导致特异性且有力的RNAi作 用并更有效地防治昆虫；
j)或者，本发明的RNA构建体靶向来自不同生物学途径的多种基因，其 导致广泛的细胞RNAi作用并更有效地防治害虫。
根据本发明，所有双链RNA区域包含与本文所述任何靶基因之至少 一部分核苷酸序列互补的至少一条链。然而，如果一个双链RNA区域包 含与本文所述任一靶基因的核苷酸序列一部分互补的至少一条链，则另一 个双链RNA区域可包含与任何其它昆虫靶基因(包括已知靶基因)的一 部分互补的至少一条链。
根据本发明的另一实施方案，提供了本文所述的分离的双链RNA或 RNA构建体，其还包含至少一种另外的序列以及任选地包含接头。在一个 实施方案中，所述另一序列选自：(i)有利于大规模生产所述dsRNA构 建体的序列；(ii)提高或降低所述dsRNA稳定性的序列；(iii)允许结 合蛋白质或其它分子从而有利于昆虫摄取所述RNA构建体的序列；(iv) 适配子序列，其结合昆虫表面上或细胞质中的受体或分子，从而有利于昆 虫的摄取、胞吞和/或转胞吞；或者(v)催化dsRNA区域加工的其它序列。 在一个实施方案中，所述接头是条件性自切割RNA序列，优选pH敏感性 接头或疏水敏感性接头。在一个实施方案中，所述接头是内含子。
在一个实施方案中，所述双链RNA构建体的多个dsRNA区域通过一 个或多个接头进行连接。在另一实施方案中，所述接头存在于所述RNA 构建体中使得所述dsRNA区域与另一目的区域分隔的位点。本发明提供 了用于所述dsRNA构建体的不同类型接头。
在另一实施方案中，所述双链RNA构建体的多个dsRNA区域不使用 接头而进行连接。
在本发明的一个具体实施方案中，所述接头可用于隔开害虫中多个较 小的dsRNA区域。有利的是，在该情形中所述接头序列可以在特定的条 件下促使将长的dsRNA拆分为较小的dsRNA区域，这导致在这些条件下 释放单独的dsRNA区域，并且这些较小的dsRNA区域导致更有效地基因 沉默。适当的条件性自切割接头的实例是在高pH条件下自切割的RNA 序列。这些RNA序列的适当实例由Borda等(Nucleic Acids Res.2003 May 15；31(10)：2595-600)描述，该文献通过参考并入本文中。所述序列源自锤 头核酶HH16的催化核心。
在本发明的另一方面，接头定位于所述RNA构建体中使得所述 dsRNA区域与例如另一目的序列分隔的位点，所述另一目的序列优选地向 所述RNA构建体提供某种额外的功能。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的dsRNA构建体包含适配子 从而有利于昆虫摄取该dsRNA。设计所述适配子使之结合昆虫摄取的物 质。这样的物质可来源于昆虫或植物。适配子的一个具体实例是结合跨膜 蛋白(例如，昆虫的跨膜蛋白)的适配子。或者，所述适配子可以结合昆 虫摄取的(植物)代谢物或营养物。
或者，所述接头在内体中进行自切割。这在本发明的构建体通过胞吞 作用或转胞吞作用被昆虫摄取并因此在昆虫的内体中被区室化时可能是 有利的。所述内体可具有低的pH环境，导致所述接头被切割。
当通过细胞壁转运从一个细胞向另一细胞转移时，例如当穿过昆虫 害虫的细胞壁时，上述在疏水条件中自切割的接头对于本发明的dsRNA 构建体尤其有用。
内含子也可用作接头。本文使用的“内含子”可以是信使RNA的任何 非编码RNA序列。用于本发明构建体的适当的具体内含子序列为(1)富 含U(35-45％)；(2)平均长度为100bp(在约50和约500bp之间变化)， 可随机选择其碱基对或者可以基于已知的内含子序列；(3)在5’端以 -AG:GT-或-CG:GT-起始，和/或(4)在其3’端具有-AG:GC-或-AG:AA。
约1个碱基对至约10,000个碱基对的非互补RNA序列也可用作接 头。
不希望拘泥于任何特定的理论或机制，认为昆虫从其邻近的环境 摄取长的双链RNA。双链RNA被摄取进入肠道并转移至肠上皮细胞， 然后通过内源核酸内切酶的作用在细胞内加工成为短的双链RNA(称 为小干扰RNA(siRNA))。然后，所得的siRNA通过形成多组分的RNA 酶复合体(称为RISC或RNA干扰性沉默复合体)来介导RNAi。
为了实现在昆虫细胞内下调靶基因，加至细胞壁外部的双链RNA 可以是可被摄取进入细胞然后在细胞内加工成siRNA从而介导RNAi 的任何dsRNA或dsRNA构建体，或者加至细胞外部的RNA本身可以 是可被摄取进入细胞从而指导RNAi的siRNA。
siRNA通常是短的双链RNA，其长度范围为19～25个碱基对， 或20～24个碱基对。在优选的实施方案中，可使用对应于待下调靶基 因的siRNA，其具有19、20、21、22、23、24或25个碱基对，尤其是 21或22个碱基对。然而，本发明不意在限于这样的siRNA的用途。
siRNA可以在双链部分侧翼的一端或两端包含单链突出端。在一个 特别优选的实施方案中，所述siRNA可包含3’突出的核苷酸，优选两个3’ 突出的胸苷(dTdT)或尿苷(UU)。如果紧接所述dsRNA双链部分所包 含序列的上游靶基因序列是AA，则在siRNA中可包含3’TT或UU突出 端。这使得所述siRNA中的TT或UU突出端与靶基因杂交。尽管所述 siRNA的另一端也可包含3’TT或UU突出端，然而所述siRNA双链部分 所包含序列的下游靶序列中包含AA不是必需的。在本文中，RNA/DNA 嵌合体形式的siRNA也涵盖在内。这些嵌合体包括：例如，包含具有3’DNA 碱基突出端(例如，dTdT)的双链RNA的siRNA(如上所述)，以及其 中一个或多个RNA碱基(或核糖核苷酸)或者甚至整条链上所有核糖核 苷酸被替换为DNA碱基(或脱氧核糖核苷酸)的多核苷酸形式的双链 RNA。
所述dsRNA可由通过(非共价)碱基配对退火到一起的两条单独的 (有义和反义)RNA链形成。或者，所述dsRNA可具有折回的茎-环或发 夹结构，其中所述dsRNA的两条退火链是共价连接的。在该实施方案中， 所述dsRNA的有义链和反义链由部分自我互补的单个多核苷酸分子的不 同区域形成。如果所述dsRNA欲通过体内表达(例如在如下所述的宿主 细胞或生物中)或通过体外转录进行合成，则具有该结构的RNA是方便 的。除了不应当破坏所述分子的双链部分介导RNAi的能力以外，连接所 述两条RNA链的“环”的确切性质和序列对于本发明来说通常是不重要的。 用于RNAi中的“发夹”或“茎-环”RNA的特征通常是本领域已知的(参见， 例如CSIRO名下的WO 99/53050，其内容通过参考并入本文中)。在本 发明的另一些实施方案中，所述环结构可包含接头序列或如上所述的其它 序列。
所述双链RNA或构建体可以通过本身已知的方式进行制备。例如， 可以使用本领域公知的化学或酶促RNA合成技术在体外合成双链RNA。 在一个方法中，可以分别合成两条单独的RNA链，然后退火从而形成双 链。在另一实施方案中，可以在宿主细胞或生物中从适当的表达载体通过 细胞内表达来合成双链RNA或构建体。以下将进一步详细地讨论该方法。
昆虫接触的所述双链RNA的量要能够实现特异性下调所述一种或 多种靶基因。所述RNA可以以每个细胞递送至少一拷贝的量被引入。然 而，在某些实施方案中，较高剂量(例如，每个细胞至少5、10、100、500 或1000个拷贝)的双链RNA可得到更有效地抑制。对于任意给定的昆虫 基因靶标来说，可通过常规实验来确定有效抑制的最佳dsRNA量。
所述昆虫可以以允许昆虫直接摄取所述双链RNA的任何适当的方 式与所述双链RNA接触。例如，所述昆虫可以接触纯净或基本纯净形式 的所述双链RNA，例如含有所述dsRNA的水溶液。在该实施方案中，可 以仅用含有所述双链RNA的水溶液将所述昆虫“浸湿”。在另一实施方案 中，可通过用包含所述双链RNA的液体组合物向昆虫喷洒从而使所述昆 虫与所述双链RNA进行接触。
或者，所述双链RNA可以与所述昆虫的食物组分(如哺乳动物病原 性昆虫的食物组分)连接，从而增强该昆虫对所述dsRNA的摄取。
还可以将所述双链RNA掺入所述昆虫生长的培养基中，或者被该昆 虫侵扰的物品或基层中(或其上)，或者浸入对昆虫侵害敏感的基层或物 品中。
根据另一实施方案，所述dsRNA表达在细菌或真菌的细胞中，并且 所述细菌或真菌的细胞被所述昆虫摄取或摄食。
如实施例中举例说明的，可以改造细菌从而产生本发明的任何 dsRNA或dsRNA构建体。这些细菌可被昆虫摄食。一旦被摄取，所述 dsRNA可以起始RNAi应答，其导致靶mRNA降解并削弱或杀死摄食昆 虫。
因此，在更具体的实施方案中，所述双链RNA或RNA构建体通过 原核的(如细菌)或真核的(如酵母)宿主细胞或宿主生物来表达。根据 该实施方案，可以使用能够表达dsRNA或dsRNA构建体的任何细菌或酵 母细胞。所述细菌选自革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，例如但不限于 埃希氏菌属物种(Escherichia spp.)(例如，大肠杆菌(E.coli)、芽孢 杆菌属物种(Bacillus spp.)(例如，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis))、 根瘤菌属物种(Rhizobium spp.)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)、 乳球菌属物种(Lactococcus spp.)等。所述酵母可选自酵母属物种 (Saccharomyces spp.)等。
某些细菌与宿主植物具有非常紧密的相互作用，例如但不限于共生 的根瘤菌与豆科植物(Legminosea)(例如，大豆)。这样的重组细菌可 以与种子混合(例如，作为涂层)并用作土壤改良剂。
因此，本发明还包括包含本文所述的任何核苷酸序列或重组DNA构 建体的细胞。本发明还包括原核细胞(例如但不限于革兰氏阳性和革兰氏 阴性细菌细胞)和真核细胞(例如但不限于酵母细胞或植物细胞)。优选 地，所述细胞是细菌细胞或酵母细胞或藻类细胞。
在另一些实施方案中，所述昆虫可以与本文进一步描述的组合物接 触。除了所述dsRNA或DNA，所述组合物还可包含赋形剂、稀释剂或载 体。这样的组合物的优选特征在以下更详细地讨论。
或者，可以将产生dsRNA的细菌或酵母细胞直接喷洒到作物上。
因此，如上所述，本发明提供包含本发明的RNA构建体和/或DNA 构建体和/或表达构建体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞是细菌或酵母 的细胞，也可以是例如病毒。可以使用特异性感染昆虫的病毒(如杆状病 毒)。这确保了对哺乳动物(尤其是人类)的安全性，因为所述病毒不会 感染哺乳动物，所以不会发生不希望的RNAi作用。
优选地，所述细菌细胞或酵母细胞在用作生物杀虫剂前应被灭活， 例如当该试剂用于人类或其它哺乳动物可能接触的环境(如厨房)时。可 通过任何方法实现灭活，如通过热处理、苯酚或甲醛处理，或通过机械处 理。
在一个可替代的实施方案中，可利用灭活的病毒(如适当修饰的杆 状病毒)来递送本发明的dsRNA区域用于介导昆虫害虫的RNAi。
可能的应用包括集中的温室培育(例如从GMO角度而言意义较小 的作物)以及更广泛的农田作物(如大豆)。
该方法具有几个优势，例如：因为不存在可能的植物宿主切割 (dicing)的问题，所以它允许将大的dsRNA片段递送进入摄食害虫的肠 内腔；使用细菌作为杀虫剂不涉及产生转基因作物，尤其是对于某些难以 获得转基因变体的作物；存在广泛和灵活的应用，因为可以在同一块农田 上同时处理不同的作物和/或可以同时靶向不同的害虫，例如通过组合那些 产生不同dsRNA的不同细菌。
本发明的另一方面是本文公开的昆虫靶基因的靶核苷酸序列。所述 靶核苷酸序列对于设计本发明的dsRNA构建体特别重要。这些靶核苷酸 序列的长度优选至少17、优选至少18、19、20或21、更优选至少22、23 或24个核苷酸。优选靶核苷酸序列的非限制性实例在实施例中给出。
根据一个实施方案，本发明提供了编码本文所述的双链RNA或双链 RNA构建体的分离的核苷酸序列。
根据一个更具体的实施方案，本发明涉及由如下表示的任意序列组 成的分离的核酸序列：SEQ ID NO 49至158、275至472、533至575、621 至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至 2338、2384至2460，或者其至少17、优选至少18、19、20或21、更优选 至少22、23或24个核苷酸的片段。
本领域技术人员会认识到，可以找到这些靶基因的同源物，并且这 些同源物也用于本发明的方法。
如果蛋白质或核苷酸序列显示“显著”水平的序列相似性或更优选地 序列一致性，则它们可能是同源的。真正同源的序列通过从共同的祖先基 因趋异从而具有相关性。序列同源物可以有两种类型：(i)当同源物存在 于不同物种中时，它们被称为直系同源物(orthologue)。例如，小鼠和 人中的α-珠蛋白基因是直系同源物。(ii)旁系同源物是在一个物种内部 的同源基因，例如小鼠中的α-和β-珠蛋白基因是旁系同源物(paralogue)。
优选的同源物是包含与选自如下表示的序列具有至少约85％或87.5 ％，更优选约90％，更优选至少约95％以及最优选至少约99％一致性的 序列的基因：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168， 173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275 至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591， 596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061， 1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099， 1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597， 1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672， 1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039， 2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104， 2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至 2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列。用于确定序列一致性 的方法是本领域常规的，其包括使用Blast软件和EMBOSS软件(The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)，Rice，P.Longden， I.and Bleasby，A.Trends in Genetics 16，(6)pp276-277)。本文使用的术语 “一致性”是指序列之间在核苷酸水平上的关系。通过在比较窗中对最优比 对的序列(例如，两条或更多)进行比较来确定“一致性百分比”，其中所 述比较窗中的序列部分与最优序列比对的参考序列相比可包含插入或缺 失。所述参考序列不包含插入或缺失。所述参考窗选自至少10个连续核苷 酸至约50、约100或者至约150个核苷酸，优选约50～150个核苷酸。然 后，通过测定所述窗中的序列之间一致的核苷酸数目并将该数目除以所述 窗中的核苷酸数并乘以100来计算“一致性百分比”。
另一些同源物是包含如下表示的任意序列的等位基因： SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160- 163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255， 257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576， 581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797， 799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046， 1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093， 1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582， 1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657， 1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702， 1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095， 2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368， 2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481。另一些优选的同源物是 与包含如下表示的任意序列的基因相比包含至少一种单核苷酸多态性 (SNP)的基因：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21， 23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247， 249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519， 521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783， 788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087， 1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571， 1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642， 1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696， 1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080， 2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359， 2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481。
根据另一实施方案，本发明包括那些包含如下表示的任意核苷酸序 列的基因的昆虫直系同源物的靶基因：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193， 198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483， 488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605， 607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873， 878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075， 1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105， 1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612， 1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684， 1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050， 2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至 2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466， 2471，2476或2481。举例来说，直系同源物可包含如下表示的任意核苷酸 序列：SEQ ID NO 49至123、275至434、533至562、621至738、813 至852、908至1010、1161至1437、1730至1987、2120至2290以及2384 至2438，或其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核 苷酸的片段。表4中给出了包含本发明所述序列之一的至少17bp片段的 昆虫或蛛形纲直系同源物基因或序列的非限制性列表。
根据另一实施方案，本发明包括那些包含如下表示的任意核苷酸序 列的基因的线虫直系同源物的靶基因：1、3、 5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493， 498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609， 621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883， 888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107， 1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617， 1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686， 1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055， 2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338， 2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471， 2476或248。举例来说，线虫直系同源物可包含如下表示的任意核苷酸序 列：SEQ ID NO 124至135、435至446、563至564、739至751、853、 854、1011至1025、1438至1473、1988至2001、2291至2298、2439或 2440，或者其至少17、18、19、20或21个核苷酸的片段。根据另一方面， 本发明因此包括本文所述的用于控制线虫在生物中生长的任何方法，或者 用于防止线虫侵害对线虫感染敏感的生物的任何方法，所述方法包括将线 虫细胞与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其中一 条退火互补链包含与靶基因的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序 列，其包含如下表示的任意序列之至少17、18、19、20或21个核苷酸的 片段：SEQ ID NO 124至135、435至446、563至564、739至751、853、 854、1011至1025、1438至1473、1988至2001、2291至2298、2439或 2440，所述双链RNA被线虫摄取并因此控制生长或防止侵害。表5中给 出了包含本发明的序列之一的至少17bp片段的线虫直系同源物基因或序 列的非限制性列表。
根据另一实施方案，本发明包括那些包含如下表示的任意核苷酸序 列的基因的真菌直系同源物的靶基因：1、3、5、7、 9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208， 215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498， 503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至 767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888， 890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079， 1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109， 1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622， 1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688， 1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060， 2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339， 2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或 2481。举例来说，真菌直系同源物可包含如下表示的任意核苷酸序列：SEQ ID NO 136至158、447至472、565至575、752至767、855至862、1026 至1040、1475至1571、2002至2039、2299至2338、2441至2460，或者 其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸的片段。 根据另一方面，本发明因此包括本文所述的用于控制真菌在细胞或生物上 的生长、或者用于防止真菌侵害对真菌感染敏感的细胞或生物的任何方 法，该方法包括将真菌细胞与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退 火的互补链，其中一条退火互补链包含与靶基因的核苷酸序列之至少一部 分互补的核苷酸序列，其包含如下表示的任意序列之至少17、18、19、20 或21个核苷酸的片段：SEQ ID NO 136至158、447至472、565至575、 752至767、855至862、1026至1040、1475至1571、2002至2039、2299 至2338、2441至2460，所述双链RNA被真菌摄取并因此控制生长或防止 侵害。表6中给出了包含本发明的序列之一的至少17bp片段的真菌直系 同源物基因或序列的非限制性列表。
术语“调节序列”涉及较宽的范围，其指能够实现与其有效连接之序 列的表达的调节性核酸。
上述术语包括激活或增强核酸表达的启动子和核酸或其合成的融合 分子或衍生物，称为激活子或增强子。本文使用的术语“有效连接”是指在 “启动子”序列与目的核酸分子之间的功能性连接，使得所述“启动子”序列 能够起始核酸分子转录从而产生适当的dsRNA。
优选的调节序列是启动子，其可以是组成型或诱导型启动子。优选 的启动子是诱导型启动子，从而严格控制所述RNA分子的表达。优选可 通过使用适当的化学试剂(如IPTG)来诱导的启动子。或者，将编码所 述RNA分子的转基因置于强组成型启动子的控制下。优选地，所使用的 任何启动子将指导所述RNA强烈表达。所使用启动子的性质可部分地由 用于产生所述RNA的特定宿主细胞来决定。在一个实施方案中，所述调 节序列包含噬菌体启动子，如T7、T3、SV40或SP6启动子，最优选T7 启动子。在本发明的另一些实施方案中，使用用于表达RNA的另一些启 动子，其包括但不限于来自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合 酶III的启动子。也可以酌情使用来源于酵母或病毒基因的其它启动子。
在一个可替代的实施方案中，所述调节序列包含启动子，该启动子 选自公知的tac、trc和lac启动子。适用于细菌宿主的诱导型启动子包括 β-内酰胺酶启动子、大肠杆菌λ噬菌体PL和PR启动子以及大肠杆菌半乳 糖启动子、阿拉伯糖启动子和碱性磷酸酶启动子。因此，本发明还包括用 于得到本发明的任何RNA分子或RNA构建体的方法。该方法包括以下步 骤：在允许所述核酸或重组(DNA)构建体转录从而产生下调目的靶基因 的RNA(当所述宿主细胞被靶生物摄食时，或者当宿主细胞或从其来源的 提取物被靶生物摄取时)的条件下，将本发明的分离的核酸或重组(DNA) 构建体引入(例如，通过转化、转染或注射)本发明的宿主细胞中。
任选地，也可以将一种或多种转录终止序列或“终止子”引入本发明 的重组构建体中。术语“转录终止序列”包括转录单元末端的控制序列，其 发出初级转录物的3’加工和多聚腺苷酸化作用以及转录终止的信号。所述 转录终止序列用于防止转录的连读，从而所述RNA分子在宿主细胞中或 者由宿主细胞正确地产生。在一个实施方案中，所述终止子包括T7、T3、 SV40或SP6终止子，优选T7终止子。也可以酌情使用来源于酵母或病毒 基因的其它终止子。
可以将另外的调节元件(如转录或翻译的增强子)引入所述表达构 建体中。
本发明的重组构建体还可包含在特定细胞类型中维持和/或复制所 需的复制起点。一个实例是表达构建体需要作为细胞中的附加型遗传元件 (例如，质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情形。优选的复制起点包 括但不限于f1-ori和colE1 ori。
所述重组构建体任选地可包含选择性标记基因。本文使用的术语“选 择性标记基因”包括赋予细胞一种表型的任何基因，该基因在所述细胞中表 达从而有利于鉴定和/或选择用本发明的重组(表达)构建体转染或转化的 细胞。适当的选择性标记的实例包括抗氨苄青霉素的基因(Ampr)、抗 四环素的基因(Tcr)、抗卡那霉素的基因(Kanr)、抗膦丝菌素的基因 和抗氯霉素的基因(CAT)。另一些适当的标记基因提供了代谢性状，例 如manA。还可使用可见的标记基因，其包括例如β-葡糖醛酸酶(GUS)、 萤光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。
在本发明的另一些实施方案中，使用可用于表达dsRNA的另一些启 动子，其包括但不限于来自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶 III、T7 RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶的启动子。这些启动子通常用于 体外产生dsRNA，然后将所述dsRNA包含在杀虫剂(antiinsecticidal agent)中，例如在杀虫剂液体、喷雾剂或粉末中。
因此，本发明还包括用于产生本发明的任何双链RNA或RNA构建 体的方法。该方法包括以下步骤：
a.将本发明的分离的核酸或重组DNA构建体与无细胞组分接触；或 者
b.将本发明的分离的核酸或重组DNA构建体引入(例如，通过转化、 转染或注射)细胞，
以上在允许所述核酸或重组DNA构建体转录从而产生所述dsRNA或 RNA构建体的条件下进行。
任选地，本发明的重组构建体中还可以引入一种或多种转录终止序 列。术语“转录终止序列”包括转录单元末端的控制序列，其发出初级转录 物的3’加工和多聚腺苷酸化作用以及转录终止的信号。可将另一些调节元 件(如转录或翻译的增强子)引入所述表达构建体。
本发明的重组构建体还可包括在特定细胞类型中维持和/或复制所 需的复制起点。一个实例是表达构建体需要作为细胞中的附加型遗传元件 (例如，质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持。优选的复制起点包括但不 限于f1-ori和colE1 ori。
所述重组构建体任选地可包含选择性标记基因。本文使用的术语“选 择性标记基因”包括赋予细胞以表型的任何基因，该基因在所述细胞中表达 从而有利于鉴定和/或选择经本发明的重组(表达)构建体转染或转化的细 胞。适当的选择性标记的实例包括抗氨苄青霉素的基因(Ampr)、抗四 环素的基因(Tcr)、抗卡那霉素的基因(Kanr)、抗膦丝菌素的基因和 抗氯霉素的基因(CAT)。另一些适当的标记基因提供了代谢性状，例如 manA。还可使用可见的标记基因，其包括例如β-葡糖醛酸酶(GUS)、 荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。
本发明涉及用于阻止昆虫在植物上生长或用于防止昆虫侵害植物的 方法。根据本发明的方法待处理的植物包括选自以下的植物：苜蓿、苹果、 杏、朝鲜蓟、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜、黑莓、蓝莓、嫩茎花 椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、蓖麻、胡萝卜、木薯、花椰菜、谷类、芹菜、 樱桃、柑桔、克莱门氏小柑橘(clemintine)、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、 茄子、菊苣、桉树、无花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、猕猴桃、莴 苣、韭、柠檬、莱姆酸橙、松树、玉米、芒果、瓜、小米、蘑菇、燕麦(nut aot)、菜秋葵、洋葱、橙、观赏性植物或花或树、番木瓜、欧芹、豌豆、 桃、花生、豌豆(peat)、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马 铃薯、南瓜、菊苣、萝卜、油菜籽、悬钩子、稻、黑麦、高粱、黄豆(soy)、 大豆(soybean)、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、红薯、橘子、 茶、烟草、番茄、藤本植物、西瓜、小麦、山药或西葫芦；优选马铃薯、 茄子、番茄、胡椒、烟草、醋栗、稻米或棉花植物)，或者种子或块茎(例 如，苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜、黑 莓、蓝莓、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、蓖麻、胡萝卜、木薯、花椰 菜、谷类、芹菜、樱桃、柑桔、克莱门氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄 瓜、茄子、菊苣、桉树、无花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、猕猴桃、 莴苣、韭、柠檬、莱姆酸橙、松树、玉米、芒果、瓜、小米、蘑菇、燕麦 (nut aot)、菜秋葵、橙、观赏性植物或花或树、番木瓜、欧芹、豌豆、 桃、花生、豌豆(peat)、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马 铃薯、南瓜、菊苣、萝卜、油菜籽、悬钩子、稻、黑麦、高粱、大豆、大 豆、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、红薯、橘子、茶、烟草、番 茄、藤本植物、西瓜、小麦、山药或西葫芦。
所述靶生物摄取(优选摄食)靶向RNA的量要实现特异性下调一种 或多种靶基因。所述RNA可以以每个细胞递送至少一拷贝的量在宿主细 胞中表达。然而，在某些实施方案中，较高剂量(例如，每个靶生物细胞 至少5、10、100、500或1000个拷贝)的双链RNA可得到更有效的抑制。 对于任意给定的靶基因和靶生物来说，可通过常规实验来确定有效抑制的 靶标RNA分子的最佳量。
所述靶生物可以以任何适当的方式与表达所述RNA分子的宿主细 胞接触，从而允许靶生物摄食。优选地，表达所述dsRNA的宿主细胞可 以与所述靶生物的食物组分连接，从而增强该靶生物对所述dsRNA进行 摄取。还可以将表达所述dsRNA的宿主细胞引入所述靶生物生长的培养 基中，或者被害虫生物侵扰的物品或基层中(或其上)，或者浸入对害虫 生物侵害敏感的基层或物品中。
在可替代的实施方案中，可使用源自表达所述RNA分子的宿主细胞 的适当提取物来实现下调靶生物中的靶基因。此时，所述提取物可以通过 裂解表达所述RNA分子的宿主细胞的任何适当的方法来产生。例如，可 以使用如超声处理、弗氏压碎(French press)、冻融和溶菌酶处理的技 术(参见Sambrook and Russell-Molecular Cloning A laboratory manual- third edition以及表15-4中提供的参考文献)来制备宿主细胞粗提物(裂 解物)。可以酌情对该提取物进行进一步纯化，只要所述提取物介导靶基 因表达的靶向下调的能力不受不利影响即可。例如可以使用亲和纯化。向 所述提取物添加某些成分以防止RNA分子降解可能也是合适的。例如， 可以向源自表达RNA的宿主细胞的提取物添加RNA酶抑制剂。在一个实 例中，所述靶生物可以接触纯净或基本纯净形式的表达RNA的宿主细胞， 例如含有所述细胞提取物的水溶液。在该实施方案中，可以简单地用含有 所述宿主细胞提取物的水溶液将所述靶生物(尤其是害虫生物，如昆虫) “浸湿”。在另一实施方案中，可通过用包含所述细胞提取物的液体组合物 向所述靶生物喷洒从而使所述靶生物与所述表达RNA分子的宿主细胞进 行接触。
如果使用本发明的方法来特异性控制特定害虫的生长或侵害，则优 选宿主细胞中表达的RNA不与非害虫生物的基因具有任何显著的同源性， 尤其是不与非害虫生物的任何必需基因具有任何显著的同源性。因此，所 述非害虫生物通常是对害虫侵害敏感的生物，为此根据本发明的方法保护 所述非害虫生物免受所述害虫侵害。因此，例如，非害虫物种可包括植物 或哺乳动物物种。优选地，所述哺乳动物物种为人类。所述非靶物种还可 包括除了人以外的动物，其可以暴露于所述保护免受侵害的生物或基层。 实例包括鸟类(其可以以被保护的植物为食)以及牲畜和家畜(如猫、犬、 马、牛、鸡、猪、绵羊等)。在这种情况下，优选所述dsRNA与敏感生 物或非靶生物的任一基因的核酸序列一致性低于30％，更优选低于20％， 更优选低于10％，甚至更优选低于5％。序列一致性百分比应当在所述靶 标RNA的全长区域上来计算。如果可获得本发明待保护生物或任一非靶 生物的基因组序列数据，则可以使用标准生物信息学工具来相互校验与所 述靶标RNA的序列一致性。在一个实施方案中，所述RNA分子与非害虫 生物的基因之间不存在21个连续核苷酸上的序列一致性，即在这种情况 下，优选所述非害虫生物的基因组中不存在所述RNA的21个连续核苷酸。 在另一实施方案中，所述RNA与非害虫(敏感的)物种的任一核苷酸序 列之间在24个连续核苷酸上的序列一致性低于约10％或低于约12.5％。 特别地，可以特别注意非害虫物种的直向同源基因，因为所述害虫生物的 必需基因常可成为本发明的方法的靶标。因此，在一个实施方案中，所述 RNA分子与非害虫物种直向同源基因的对应核苷酸序列具有低于12.5％ 的序列一致性。
在另一实施方案中，本发明涉及用于控制昆虫生长和/或防止或降低 昆虫侵害的组合物，该组合物包含至少一种双链RNA，其中所述双链RNA 包含退火的互补链，其中一条退火互补链包含与昆虫靶基因的核苷酸序列 之至少一部分互补的核苷酸序列。本发明还涉及包含本文所述的至少一种 核苷酸序列或至少一种重组DNA构建体的组合物。本发明还涉及包含至 少一种细菌细胞或酵母细胞的组合物，所述细菌细胞或酵母细胞表达本文 所述的至少一种双链RNA或双链RNA构建体，或者表达本文所述的至少 一种核苷酸序列或重组DNA构建体。任选地，所述组合物还包含至少一 种适当的载体、赋形剂或稀释剂。所述靶基因可以是本文所述的任一靶基 因。优选地，所述昆虫靶基因是昆虫生存、生长、发育或繁殖所必需的。
另一方面，本发明涉及如上所述的组合物，其中所述昆虫靶基因包 含与选自如下表示的的任意序列具有至少75％，优选至少80％、85％、90 ％，更优选至少95％、98％或99％的一致性的序列： SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158， 159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249， 251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519， 521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783， 788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085， 1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至 1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637， 1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694， 1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075， 2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354， 2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，
或其互补序列，或者其中所述昆虫靶基因是包含如下表示的任意序列之至 少17个连续核苷酸的基因的昆虫直系同源物：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17， 19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225， 230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508 至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至 767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888， 890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107， 1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617， 1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686， 1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055， 2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338， 2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471， 2476，2481或2486，或其互补序列。
本发明还涉及组合物，其包含至少一种双链RNA、至少一种双链 RNA构建体、至少一种核苷酸序列、至少一种重组DNA构建体和/或至少 一种表达本发明的dsRNA的宿主细胞(例如，细菌细胞或酵母)，或者 编码本发明的dsRNA的病毒，任选地还包含至少一种适当的载体、赋形 剂或稀释剂。
所述组合物可以采用向昆虫应用的任何适当的物理形式。例如，所 述组合物可以采用固体形式(如粉剂、丸剂或饵剂)、液体形式(如，喷 雾剂)或凝胶形式。
根据非常优选的实施方案，所述组合物采用适于昆虫摄食的形式。
所述组合物可包含另外的组分，所述组分作用于在组合物长期储存 期间稳定所述dsRNA和/或防止dsRNA降解。
所述组合物还可包含增强或促进昆虫摄取所述dsRNA的组分。这些 可包括例如通常促进RNA摄取进入细胞的化学试剂，例如lipofectamin(脂 转染胺)等。
所述组合物还可包含在长期储存期间保持所述宿主细胞生存力的组 分。
所述组合物可采取向昆虫、基层、细胞(例如，植物细胞)或者被 昆虫感染的或对昆虫侵害敏感的生物应用的任何适当的物理形式。
在一个实施方案中，所述组合物可以采用喷雾剂的形式。因此，使 用者可以直接用该组合物喷洒昆虫或基层。
因此，本发明涉及喷雾剂，其包含含有至少一种细菌细胞或酵母细 胞的组合物，所述细菌细胞或酵母细胞表达本文所述的至少一种双链RNA 或双链RNA构建体，或表达本文所述的至少一种核苷酸序列或重组DNA 构建体。更特别地，本发明涉及如上定义的喷雾剂，其中所述细菌细胞包 含如下表示的任意序列之至少一种序列：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17， 19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225， 230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508 至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至 767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888， 890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107， 1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617， 1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686， 1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055， 2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338， 2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471， 2476、2481或2486，或其至少17个连续核苷酸的片段。优选地，所述喷 雾剂包含至少一种如下表示的任意序列：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17， 19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225， 230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508 至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至 767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888， 890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107， 1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617， 1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686， 1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055， 2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338， 2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471， 2476、2481或2486，或其至少17个连续核苷酸的片段。
本发明还涉及喷雾剂，其包含本文所述的至少一种组合物或者包含 至少一种宿主细胞，还包含至少一种佐剂以及任选地至少一种表面活性 剂。
杀虫剂的有效性可取决于所述喷雾剂应用的有效性。佐剂可以减少 或消除喷雾剂应用的许多问题，所述问题与杀虫剂的稳定性、溶解度、不 相容性、悬浮、泡沫形成、飘移、蒸发、挥发、降解、粘附、渗透、表面 张力和覆盖范围有关。将佐剂设计成实现特定的功能，包括润湿、分散 (spread)、粘着、降低蒸发、降低挥发、缓冲、乳化、散布(disperse)、 降低喷雾剂飘移以及减少泡沫形成。没有一种佐剂可以实现所有这些功 能，然而常常可以将不同的相容性佐剂进行组合来同时实现多种功能。这 些化学品(也叫作润湿剂和分散剂)从物理上改变了喷雾剂液滴的表面张 力。为了使杀虫剂正确地发挥其功能，喷雾剂液滴必须能够使叶子润湿并 在叶上均匀散开。表面活性剂扩大了杀虫剂覆盖的范围，从而增加了害虫 接触化学试剂的机会。将杀虫剂施加于蜡质或具毛的叶时，表面活性剂尤 为重要。不进行适当的润湿和分散，则喷雾剂液滴常常流失或者不能充分 地覆盖这些表面。然而，过多的表面活性剂可导致过度的流失或沉淀损失， 因此降低了杀虫剂的功效。杀虫剂配方常包含表面活性剂以改进该杀虫剂 活性成分的悬浮。这尤其用于可乳化浓缩物(EC)配方。
本文使用的术语“佐剂”指添加至杀虫剂产品或杀虫剂喷雾剂混合物 以改进喷雾箱中产品的混合和稳定性以及应用的任何非杀虫剂材料。本文 另外使用的术语“表面活性剂”指改变表表面张力的化学试剂。表面活性剂 可以影响液体的润湿和分散，并且可以改变杀虫剂在水中的分散、悬浮或 沉淀。存在非离子型表面活性剂(不带电荷)、阴离子表面活性剂(负电 荷)和阳离子表面活性剂(正电荷)。
在特别的实施方案中，所述喷雾剂中包含的所述宿主细胞是灭活的， 例如通过热灭活或者机械破坏(如本文所详细讨论地)来实现。
所述赋形剂的性质和所述组合物的物理形式可根据期望处理的基层 的性质而变化。例如，所述组合物可以是被刷至或喷洒至待处理的物品或 基层上或者压印至待处理的物品或基层中的液体，抑或是应用于待处理的 物品或基层的涂层或粉末。因此，在一个实施方案中，所述组合物在适当 的表面上采用涂层的形式，其粘附昆虫并最终被接触该涂层的昆虫所摄 取。
根据一个优选的实施方案，所述基层是意在针对昆虫害虫侵害而进 行处理的植物或作物。然后，所述组合物被昆虫内化或摄食，在其中该组 合物可以介导RNA干扰，从而防治昆虫。所述喷雾剂优选为加压的/气雾 状的喷雾剂或泵式喷雾剂。所述颗粒可以采取适当的大小，从而其粘附于 待处理的基层或者粘附于昆虫，例如粘附于昆虫和/或蛛形纲动物的外骨 骼，并可以从此处被吸收。
在一个实施方案中，所述组合物采用饵剂的形式。设计所述饵剂使 之引诱昆虫与所述组合物接触。一旦接触后，所述组合物被昆虫内化(例 如通过摄食)并介导RNAi从而杀死昆虫。所述饵剂可包含食物，如基于 蛋白质的食物，例如鱼粉。也可以使用硼酸作为饵剂。所述饵剂可取决于 作为靶标的物种。还可以使用引诱剂。所述引诱剂可以是信息素，例如雄 性或雌性信息素。作为一个实例，本发明可使用《昆虫信息素及其在害虫 管理中的应用(Insect Pheremones and their use in Pest Management)》 (Howse et al，Chapman and Hall，1998)中提及的信息素。所述引诱剂将 昆虫引诱至所述饵剂，并可以靶向特定昆虫或可以引诱所有昆虫。所述饵 剂可采用任何适当的形式，如固体、糊剂、丸剂或粉剂形式。
所述饵剂还可被昆虫携带回群体。然后，该饵剂可以作为群体中其 它成员的食物来源，因而对大量昆虫并且可能对整个昆虫害虫群体实现有 效控制。使用双链RNA或表达本发明的dsRNA的细菌是有利的，因为 RNAi介导的对害虫影响的延迟作用使饵剂被携带回群体，从而实现了在 接触昆虫方面的最大影响。
另外，与所述昆虫接触的组合物可残留在该昆虫的角质层上。当清 洁(一只昆虫清洁其自身或昆虫相互清洁)时，所述组合物可以被摄取， 并可以因此介导其在昆虫中的作用。这需要所述组合物足够稳定，从而即 使暴露于外界环境条件一段时间(例如，可以是几天)后，所述dsRNA 或表达dsRNA的宿主细胞仍保持完好并能够介导RNAi。
所述饵剂可以以适当的“外罩”或“陷阱”来提供。这样的外罩和陷阱 是市售的，并且现有的陷阱可适于包含本发明的组合物。本发明的范围包 括可吸引昆虫进入的任何外罩或陷阱。所述外罩或陷阱可以例如是盒形 的，并且可以例如以预成型状态提供或者可以由可折叠纸板形成。用于外 罩或陷阱的适当的材料包括塑料和纸板，尤其是瓦楞纸板(corrugated cardboard)。这样的外罩或陷阱的合适尺寸为例如7-15cm宽，15-20cm 长以及1-5cm高。所述陷阱的内表面可覆盖粘性物质，使得昆虫一旦进入 该陷阱则被限制移动。所述外罩或陷阱可包含适当的槽，所述槽的内部可 以在适当的位置装有所述饵剂。陷阱不同于外罩是因为昆虫在进入后不能 轻易地逃离陷阱，而外罩作为“饲喂处”，其向昆虫蛛形纲动物提供较佳的 环境，在其中它们可以进食并且感觉远离捕食者的安全感。
因此，本发明的另一方面提供了针对昆虫的外罩或陷阱，其包含本 发明的组合物，该组合物可以合并本文所述组合物的任何特征。
本发明的“组合物”可以是“组合试剂盒(kit-of-parts)”，其包含一 个容器中的所述双链RNA以及一个单独容器中的针对含有RNA的实体 (如dsRNA或dsRNA构建体、DNA构建体、表达构建体)的适当稀释 剂、赋形剂或载体；或者包含一个容器中的宿主细胞以及一个单独容器中 的针对该宿主细胞的适当稀释剂、赋形剂、载体或防腐剂。本发明还涉及 提供单独的双链RNA或宿主细胞，而没有任何其它组分。在这些实施方 案中，所述dsRNA或宿主细胞可以以浓缩形式来提供，如浓缩的水溶液。 它甚至可以以冷冻形式或者以冻干形式来提供。后者对于长期保藏来说可 能更稳定，并且可以在临使用前被解冻和/或用适当的稀释剂复原。
本发明还包括在基层上控制害虫生物的生长和/或防止敏感生物被 害虫生物侵害的方法，其包括向所述基层应用本文所述的有效量的任何组 合物和/或喷雾剂。
本发明还包括用于治疗和/或预防由靶生物导致的疾病或病症的方 法，其包括向有此治疗和/或预防需要的对象施用本文所述的组合物或喷雾 剂，其中由所述组合物或喷雾剂造成的所述靶生物中靶基因的表达下调对 于治疗和/或预防由靶生物导致的疾病是有效的。优选的靶生物是害虫，尤 其是本文详细描述的昆虫。
本发明还涉及本文所述的任何双链RNA、双链RNA构建体、核苷 酸序列、重组DNA构建体或组合物的医学用途。
昆虫和另一些节肢动物可通过其叮咬或螫刺而导致损伤甚至死亡。 在美国，每年由于蜜蜂和黄蜂螫伤而死亡的人比被蛇咬伤而死亡的人更 多。许多昆虫可以传播导致疾病的细菌和其它病原体。在每次国家间大规 模战争期间，由于昆虫传播的疾病而受伤或死去的人比由于子弹和炸弹而 受伤或死去的人更多。叮咬人和家畜的昆虫大多是具有如半翅目和某些 翅目昆虫中所见的刺吸式口器的昆虫。叮咬引起的主要不适是由昆虫注入 对象的酶所致。蜱和恙螨是不同种类的螨(蛛形纲)，其以动物血液为食。 蜱还可以传播导致疾病的病毒和另一些病原体，所述疾病包括莱姆病和落 矶山斑疹热。另一些种类的螨可引起人、犬、猫和其它动物的兽疥癣。半 翅目包括床虱、接吻虫(kissing bug)和猎蝽(assassin bug)，所有这些 昆虫具有用于刺入其宿主的喙。所有昆虫中最疼痛的叮咬是猎蝽的叮咬。 在中美州和南美洲，接吻虫参与导致查加斯病。某些蛾的毛虫可以“螫刺”。 双翅目是影响人类的最重要的昆虫目。叮咬飞虫(biting flies)包括多种蚊、 蚋、biting gnats、虻等。这些叮咬飞虫中有许多是疾病的传播者，如传播 非洲睡眠病的舌蝇。具有舐吸式口器的蝇(如家蝇)也传播导致伤寒热及 另一些疾病的细菌和其它病原体。蛆是这两种侵入动物活组织的飞虫的幼 虫。蚊子传播导致疟疾、黄热病、脑炎和另一些疾病的病原体。疟疾由原 生动物寄生物导致，所述原生动物寄生物的部分生活周期生活在按蚊属蚊 中，部分生活周期生活在人中。鼠疫也叫作腺鼠疫或黑死病，由感染大鼠 及另一些啮齿动物的细菌导致。该疾病针对人的主要转播者是东方具带病 蚤(Oriental rat flea)(蚤目)。许多蜜蜂、黄蜂和蚂蚁(膜翅目)可通 过其螫刺导致疼痛甚至死亡。死亡通常是对毒物的变态反应的结果。其它 重要的螫刺动物包括大黄蜂(hornets)、小黄蜂(yellow jackets)和胡蜂 (paper wasps)。非洲化蜜蜂(Africanized honey bee)或“杀人蜂”(“killer” bee)是人类驯化的蜜蜂品系。这两种品系在外观上几乎相同。然而，非洲 化蜜蜂品系更具攻击性，并且以更大的数目进行攻击。
在一个具体的实施方案中，所述组合物是分别用于治疗或预防人类 或动物的昆虫疾病或感染的药物组合物或兽用药组合物。这样的组合物包 含至少一种双链RNA或RNA构建体，或者编码所述双链RNA或RNA 构建体的核苷酸序列或重组DNA构建体(其中所述双链RNA包含退火的 互补链，其中一条退火互补链包含与导致所述疾病或感染的昆虫靶基因的 靶核苷酸序列互补的核苷酸序列)以及适用于药物用途的至少一种载体、 赋形剂或稀释剂。
所述组合物可以是适于局部使用的组合物，如应用在动物或人的皮 肤上，例如应用于皮肤的液体组合物(滴剂、凝胶剂、气雾剂)，或者通 过刷、或喷雾剂、乳剂、软膏等用于局部应用，或者作为透皮贴剂。
或者，所述昆虫dsRNA由细菌(例如，乳杆菌属)或真菌(例如酵 母属(Sacharomyces)物种)产生，其可以包含在食物中并作为抗御昆虫 感染的口服疫苗。
也可以制备成其它常规的药物剂型，包括片剂、胶囊、阴道栓剂、 透皮贴剂、栓剂等。所选形式取决于靶昆虫的性质以及期望治疗的疾病的 性质。
在一个具体的实施方案中，所述组合物可以是涂层、糊剂或粉剂， 其可以应用于基层从而保护所述基层免受昆虫和/或蛛形纲动物的侵害。在 该实施方案中，可使用所述组合物保护对昆虫侵害或昆虫造成的破坏敏感 的任何基层或物品，例如食物及其它易腐物品，以及基层(如木材)。白 蚁、粉蠹甲虫和木匠蚁可破坏房屋及其它木制品。散白蚁(subterranean termite)和台湾乳白蚁(Formosan termite)是美国南部和热带地区最严 重的房屋害虫。昆虫可以袭击任何收获的植物或动物产品。面象虫、谷类 象鼻虫、谷螟及其它储藏品害虫以储藏的粮食、谷类、宠物食品、巧克力 粉以及厨房食品柜中未得到保护的几乎所有其它食物为食。衣服蛀虫的幼 虫蛀蚀由动物产品(如毛皮、丝和羊毛)制成的衣服。地毯甲虫的幼虫蛀 蚀动物和植物产品，包括皮革、毛皮、棉花、储存的粮食甚至博物馆标本。 书虱和蠹虫是图书馆的害虫。这些昆虫蛀蚀书装订处的淀粉胶。侵入房屋 的其它昆虫包括蟑螂，其摄食几乎任何东西。蟑螂不被认为是疾病的特定 传播者，但是它们污染食物并带有令人不悦的气味。它们非常令人讨厌， 许多害虫防治公司致力于尝试对它们进行防治。在房屋、食品商店和饭店 中的最常见的蟑螂包括德国小蠊、美洲大蠊、东方蜚蠊和长须蜚蠊。
所述组合物的赋形剂和物理形式的性质可取决于期望处理的基层的 性质而有所变化。例如，所述组合物可以是被刷或喷洒至待处理的物品或 基层上的液体，或者压印至待处理的物品或基层中的液体，或者是应用至 待处理的物品或基层的涂层。
本发明还包括用于处理和/或防治昆虫对基层侵害的方法，其包括向 所述基层应用有效量的任何本文所述的组合物或喷雾剂。
本发明还包括用于治疗和/或预防昆虫疾病或病症的方法，其包括向 有此治疗和/或预防需要的对象施用本文所述的任何组合物或喷雾剂，所述 组合物或喷雾剂包含至少一种双链RNA或双链RNA构建体，其包含退火 的互补链，其中一条退火互补链包含与导致所述昆虫疾病或病症的昆虫的 昆虫靶基因核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列。根据一个更具体 的实施方案，所述待施用的组合物或喷雾剂包含和/或表达至少一种细菌细 胞或酵母细胞，所述细菌细胞或酵母细胞表达本文所述的至少一种双链 RNA或双链RNA构建体；或者包含和/或表达本文所述的至少一种核苷酸 序列或重组DNA构建体，所述RNA或核苷酸序列与导致所述昆虫疾病或 病症的昆虫的昆虫靶基因之至少一部分核苷酸序列是互补的。
在本发明的另一实施方案中，所述组合物用作植物或者植物的增殖 或繁殖材料(如种子)的杀虫剂。举例来说，所述组合物可通过向植物组 织喷洒或应用或者在幼苗出苗前后向土壤喷洒或混合而用作杀虫剂。
在另一实施方案中，本发明提供了用于处理和/或阻止昆虫生长和/ 或昆虫侵害植物或者植物的增殖或繁殖材料的方法，其包括向植物或者向 植物的增殖或繁殖材料应用有效量的任何本文所述的组合物或喷雾剂。
在另一实施方案中，本发明涉及任何双链RNA或RNA构建体、或 者编码所述双链RNA或RNA构建体的核苷酸序列或重组DNA构建体、 或者表达本发明的dsRNA的至少一种宿主细胞(例如，细菌或酵母)、 或者编码本文所述的dsRNA的病毒、或者包含上述的任何组合物或喷雾 剂的用途，其用于控制昆虫生长，用于防治昆虫侵害对昆虫感染敏感的植 物，或用于处理植物的昆虫感染。针对特定昆虫导致的昆虫感染而进行处 理的特定植物如前所述，并包含在所述用途中。
在一个更具体的实施方案中，本发明涉及包含至少一种宿主细胞， 或表达本发明的dsRNA的至少一种宿主细胞(例如，细菌或酵母)，或 编码本文所述的dsRNA的病毒，或者涉及包含上述的任何组合物的喷雾 剂的用途，该喷雾剂用于控制昆虫生长，用于防治昆虫侵害对昆虫感染敏 感的植物，或用于治疗植物的昆虫感染。优选地，所述宿主细胞包含如下 表示的任意序列之至少一种： SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158， 159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249， 251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519， 521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783， 788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085， 1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至 1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637， 1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694， 1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075， 2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354， 2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486， 或其至少17个连续核苷酸的片段。
另一方面，本发明还提供了用于防止或保护植物免受害虫侵害的方 法组合和组合物。例如，一种方法提供了使用转基因方法与使用双链RNA 分子以及与一种或多种对靶标害虫具有毒性的Bt杀虫蛋白或化学的(有机 的)化合物的组合物的方法组合。另一方法提供了使用转基因方法与使用 在细菌或酵母中表达双链RNA分子以及在同样的细菌或酵母中或者在不 同的细菌或酵母中表达所述Bt杀虫蛋白的方法的组合。例如根据这些方 法，可以使用基于RNAi的方法或技术来靶向或杀死一种昆虫，而使用Bt 杀虫剂或化学的(有机的)杀虫剂可以靶向或杀死另一种昆虫。
因此，本发明还涉及本文所述的用于处理植物的任何组合物、喷雾 剂或方法，其中所述组合物包含表达所述RNA分子的细菌细胞或酵母， 并且还包含杀虫剂或者包含含有或表达杀虫剂的细菌细胞或酵母细胞(可 以与上面提及的是同一细菌或酵母细胞或者不同的细菌或酵母细胞)，所 述杀虫剂选自化学的(有机的)杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌 杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋 白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。优选地，所述苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白选自： Cry1、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二元杀虫蛋白CryET33和 CryET34、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100 和TIC101以及二元杀虫蛋白PS149B1。
所述喷雾剂可用于温室中或农田上。对于水基喷雾剂来说，包含细 菌的生物杀虫剂(例如，作为可乳化的混悬液)的通常应用率为25-100升 /公顷(10-40升/英亩)：每公顷包含约2.5-5升的配制产品(可乳化的混 悬液)，其中所述配制产品包含约25％(体积/体积)的‘细菌细胞’加75 ％(体积/体积)的‘其它成分’。细菌细胞的量以单位来计，例如一个单位 定义为1ml中109个细菌细胞。取决于每公顷的作物密度和每株植物的叶 面积，1升的配制产品包含0.001～10000个单位的细菌，优选地至少0.001、 0.003、0.005、0.007、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.3、0.5、0.7，更优 选至少1、3、5、7、10、30、50、70、100、300、500、700，或者更优选 至少1000、3000、5000、7000或者10000个单位的细菌。
例如，马铃薯作物植物的通常植物密度约为每平方米4.5株植物或 者每公顷45,000株植物(成排种植，排与排之间距离为75cm，每排的植 物之间距离为30cm)。因此，本发明涉及喷雾剂，其包含至少0.001、0.003、 0.005、0.007、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.3、0.5、0.7，更优选至少1、 3、5、7、10、30、50、70、100、300、500、700，或者更优选至少1000、 3000、5000、7000或者10000个单位的细菌，所述细菌表达本文所述的至 少一种dsRNA分子或dsRNA构建体。
本发明还涉及用于处理植物中昆虫感染的试剂盒，其包含先前所述 的至少一种双链RNA、或双链RNA构建体、或核苷酸序列、或重组DNA 构建体、或宿主细胞、或组合物或喷雾剂。所述试剂盒可以与适当的使用 说明书一起提供。该说明书可印刷在提供其它组分的合适的包装上，或者 可作为单独的实体来提供，例如可以采用纸页或小册子的形式。该说明书 可以卷起或折叠(例如在储存状态时)，然后可以将其展开从而指导所述 试剂盒其余组分的用途。
参考以下非限制性实施例将进一步理解本发明。
附图说明
图1-LD：使用以dsRNA处理的人工饲料喂食的马铃薯叶甲的存活。 使用以50μl局部应用的dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的饲料喂食 第二幼虫阶段的昆虫。7天后，将饲料替换为包含局部应用的dsRNA的新 鲜饲料。在第2、5、7、8、9和13天评估存活昆虫数。相对于第0天(测 定开始时)来计算存活幼虫的百分比。靶标LD006：(SEQ ID NO 178)； 靶标LD007(SEQ ID NO 183)；靶标LD010(SEQ ID NO 188)；靶标 LD011(SEQ ID NO 193)；靶标LD014(SEQ ID NO 198)；gfp dsRNA (SEQ ID NO 235)。
图2-LD：使用以dsRNA处理的人工饲料喂食的马铃薯叶甲的存活。 使用以50μl局部应用的dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的饲料喂食 第二幼虫阶段的昆虫。7天后，将饲料替换成仅为新鲜饲料。在第2、5、6、 7、8、9、12和14天评估存活昆虫数。相对于第0天(测定开始时)来计 算存活幼虫的百分比。靶标LD001(SEQ ID NO 163)；靶标LD002(SEQ ID NO 168)；靶标LD003(SEQ ID NO 173)；靶标LD015(SEQ ID NO 215)；靶标LD016(SEQ ID NO 220)；gfp dsRNA(SEQ ID NO 235)。
图3-LD：使用用dsRNA处理的马铃薯叶盘喂食的马铃薯叶甲幼虫 的平均重量。使用以20μl局部应用的dsRNA(靶标LD002或gfp)溶液 (10ng/μl)处理的叶盘喂食第二幼虫阶段的昆虫。2天后，每天将昆虫转 移至未经处理的叶子上。
图4-LD：使用以较短形式的靶标LD014 dsRNA和多联体dsRNA 处理的人工饲料喂食的马铃薯叶甲的存活。使用以50μl局部应用的 dsRNA(gfp或靶标)溶液处理的饲料喂食第二幼虫阶段的昆虫。在第3、 4、5、6和7天评估存活昆虫数。相对于第0天(测定开始时)来计算存 活幼虫的百分比。
图5-LD：使用以不同浓度的dsRNA(靶标LD002(a)、靶标LD007 (b)、靶标LD010(c)、靶标LD011(d)、靶标LD014(e)、靶标 LD015(f)、LD016(g)和靶标LD027(h))处理的人工饲料喂食的马 铃薯叶甲幼虫的存活。使用以50μl局部应用的dsRNA溶液处理的饲料喂 食第二幼虫阶段的昆虫。7天后，将饲料替换为包含局部应用的dsRNA的 新鲜饲料。以固定的时间间隔评估存活昆虫数。相对于第0天(测定开始 时)来计算存活幼虫的百分比。
图6-LD.表达dsRNA(靶标LD010)的大肠杆菌菌株对马铃薯叶甲 幼虫存活的随时间的影响。在基于人工饲料的分别的生物测定中检测两株 细菌菌株：(a)AB301-105(DE3)，pGBNJ003和pGN29的数据点表 示来自5个不同细菌克隆的平均死亡率值，(b)BL21(DE3)，pGBNJ003 和pGN29的数据点分别表示来自5个不同的细菌克隆以及一个单独的细 菌克隆的平均死亡率值。误差条线代表标准差。
图7-LD.表达dsRNA(靶标LD010)的大肠杆菌菌株的不同克隆(a) AB301-105(DE3)和(b)BL21(DE3)在侵害后12天对马铃薯叶甲幼 虫存活的影响。数据点是pGN29和pGBNJ003的每个克隆的平均死亡率 值。在该时间点，包含质粒pGBNJ003的AB301-105(DE3)克隆1显示 出CPB 100％死亡率。误差条线代表标准差。
图8-LD.表达dsRNA(靶标LD010)的大肠杆菌菌株的不同克隆(a) AB301-105(DE3)和(b)BL21(DE3)在侵害后7天对存活的马铃薯叶 甲幼虫的生长和发育的影响。基于表10的数据，数据点是每个克隆(一个 pGN29克隆和5个pGBNJ003克隆)的幼虫平均重量值的百分数。只用饲 料处理代表100％的正常幼虫重量。
图9-LD.喂食马铃薯植物的马铃薯叶甲幼虫在侵害后7天的存活， 所述马铃薯植物用产生双链RNA的细菌喷洒。计算存活幼虫数并表示为 死亡率百分数。所使用的细菌宿主菌株是RNA聚合酶III缺陷型菌株 AB301-105(DE3)。昆虫基因靶标是LD010。
图10-LD.喂食马铃薯植物的存活的马铃薯叶甲幼虫在侵害后11天 的生长/发育延迟，所述马铃薯植物用产生dsRNA的细菌喷洒。所使用的 细菌宿主菌株是RNA聚合酶III缺陷型菌株AB301-105(DE3)。数据图 表示正常幼虫重量的百分比，只用饲料的处理代表100％的正常幼虫重量。 昆虫基因靶标是LD010。误差条线代表标准差。
图11-LD.在侵害后7天，产生双链RNA的细菌对马铃薯叶甲幼虫 导致的马铃薯损伤的抗性。左图，用含有pGN29质粒的7个单位的细菌 AB301-105(DE3)喷洒植物；右图，用含有pGBNJ003质粒的7个单位 的细菌AB301-105(DE3)喷洒植物。一个单位定义为在600nm OD值为 1的1ml细菌悬液的等价物。昆虫基因靶标为LD010。
图12-LD.使用以dsRNA处理的马铃薯叶盘喂食的马铃薯叶甲成虫 的存活。开始两天使用以双链RNA处理的叶盘喂食年幼成虫，然后将其 置于未经处理的马铃薯叶上。定期评估存活昆虫数；活的并且看起来运动 正常的昆虫记录为可动的昆虫；活的但似乎有病且运动缓慢的昆虫记录为 濒死的昆虫——一旦将其背部朝下，这些昆虫不能翻身。靶标LD002(SEQ ID NO 168)；靶标LD010(SEQ ID NO 188)；靶标LD014(SEQ ID NO 198)；靶标LD016(SEQ ID NO 220)；gfp dsRNA(SEQ ID NO 235)。
图13-LD.细菌产生的靶标双链RNA对马铃薯叶甲幼虫的影响。将 OD为1的经热处理的表达dsRNA(SEQ ID NO 188)的50μl细菌 AB301-105(DE3)悬液局部应用于48孔板每个孔中的固体人工饲料上。 将L2阶段的CPB幼虫置于每个孔中。在第7天，对包含(a)含有表达 靶标10双链RNA的细菌的饲料，(b)含有空载体pGN29的细菌的饲料， 以及(c)只有饲料的平板中的CPB幼虫进行拍照。
图14-LD.在昆虫侵害前，将不同量的含有质粒pGBNJ003的灭活 大肠杆菌AB301-105(DE3)菌株局部应用于马铃薯叶对CPB幼虫存活和 生长的影响。用经处理的马铃薯喂食10只L1幼虫7天。喷洒在植物上的 细菌悬液的量为：0.25U、0.08U、0.025U、0.008U的靶标10以及0.25U 的pGN29(阴性对照；还包含Milli-Q水)。一个单位(U)定义为与在 600nm吸光度值为1的1ml培养物中等量的细菌量。将1.6ml总体积喷洒 至每株植物上。昆虫基因靶标为LD010。
图15-LD在侵害后7天，含有质粒pGBNJ003的灭活大肠杆菌 AB301-105(DE3)菌株对CPB幼虫导致的马铃薯损伤的抗性。(a)水， (b)包含pGN29的0.25U大肠杆菌AB301-105(DE3)，(c)含有pGBNJ003 的0.025U大肠杆菌AB301-105(DE3)，(d)含有pGBNJ003的0.008U 大肠杆菌AB301-105(DE3)。一个单位(U)定义为与在600nm吸光 度值为1的1ml培养物等量的细菌量。将1.6ml总体积喷洒至每株植物上。 昆虫基因靶标为LD010。
图1-PC：喂食靶标dsRNA对辣根猿叶甲幼虫的存活和生长的影响。 使用以25μl局部应用的0.1μg/μl dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的 油菜叶盘喂食新生幼虫。2天后，将所述昆虫移至新鲜的经dsRNA处理的 叶盘上。在第4天，针对每种处理收集来自一次重复实验的幼虫，并置于 含有未经处理的新鲜油菜叶的培养皿中。在第2、4、7、9和11天评估所 述昆虫。(a)使用以dsRNA处理的油菜叶盘喂食的墨西哥豆瓢虫幼虫的 存活。相对于第0天(测定开始时)来计算存活幼虫百分比，(b)使用 以dsRNA处理的油菜叶盘喂食的辣根猿叶甲幼虫的平均重量。一起称重 来自每次重复的昆虫并确定每只幼虫的平均重量。误差条线代表标准差。 靶标1：SEQ ID 473；靶标3：SEQ ID NO 478；靶标5：SEQ ID NO 483； 靶标10：SEQ ID NO 488；靶标14：SEQ ID 493；靶标16：SEQ ID NO 498； 靶标27：SEQ ID NO 503；gfp dsRNA：SEQ ID NO 235。
图2-PC：使用以不同浓度dsRNA(a)靶标PC010和(b)靶标PC027 处理的油菜叶盘喂食辣根猿叶甲的存活。将初生幼虫置于用25μl局部应 用的dsRNA溶液处理的油菜叶盘上。在第2天，将昆虫移至经处理的新 鲜叶盘上。在第4天(针对靶标PC010)和第5天(针对靶标PC027)， 将昆虫移至未经处理的叶子。在第2、4、7、8、9和11天(针对PC010) 和第2、5、8、9和12天(针对PC027)评估昆虫的存活数。相对于第0 天(测定开始时)来计算存活幼虫的百分比。
图3-PC：表达dsRNA(靶标PC010)的大肠杆菌AB301-105(DE3) 菌株对辣根猿叶甲幼虫存活的随时间的影响。每种处理的数据点表示来自 3次不同重复实验的平均死亡率值。误差条线表示标准差。靶标10：SEQ ID NO 488。
图1-EV：使用以dsRNA处理的豆叶盘喂食的墨西哥豆瓢虫的存活。 使用以25μl局部应用的1μg/μl dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的豆 叶盘喂食初生幼虫。2天后，将所述昆虫移至经dsRNA处理的新鲜叶盘上。 在第4天，收集来自一种处理的幼虫，并置于含有未经处理的新鲜豆叶的 塑料盒中。在第2、4、6、8和10天评估昆虫的死亡率。相对于第0天(测 定开始时)来计算存活幼虫的百分比。靶标5：SEQ ID NO 576；靶标10： SEQ ID NO 586；靶标15：SEQ ID NO 591；靶标16：SEQ ID NO 596；gfp dsRNA：SEQ ID NO 235。
图2-EV：喂食靶标dsRNA对墨西哥豆瓢虫成虫的存活的影响，以 及对食荚菜豆叶的昆虫侵害的抗性。(a)使用以dsRNA处理的豆叶盘喂 食的墨西哥豆瓢虫成虫的存活。使用以75μl局部应用的0.1μg/μl dsRNA (靶标或gfp对照)溶液处理的豆叶盘喂食成虫。24小时后，将昆虫移至 经dsRNA处理的新鲜叶盘上。再过24小时后，收集来自一种处理的成虫， 并置于包含未经处理的新鲜的盆栽整株豆植物的塑料盒中。在第4、5、6、 7、8和11天评估昆虫的死亡率。相对于第0天(测定开始时)来计算存 活幼虫的百分比。靶标10：SEQ ID NO 586；靶标15：SEQ ID NO 591； 靶标16：SEQ ID NO 596；gfp dsRNA：SEQ ID NO 235。(b)dsRNA 对墨西哥豆瓢虫成虫所造成豆叶损伤的抗性。在第9天，目测检查包含来 自一种处理(参见(a))的昆虫的整株植物的叶损伤。(i)靶标10；(ii) 靶标15；(iii)靶标16；(iv)gfp dsRNA；(v)未处理。
图1-TC：使用以dsRNA(靶标14)处理的人工饲料喂食的赤拟谷 盗的存活。基于含有1mg dsRNA(靶标14)的面粉/奶混合物喂食初生幼 虫。饲料中的水(不含dsRNA)是对照。针对每种处理，进行4次重复实 验，每次重复实验使用10只1龄幼虫。在第6、17、31、45和60天评估 昆虫的存活的平均数百分比。相对于第0天(测定开始时)来计算存活幼 虫的百分比。误差条线代表标准差。靶标TC014：SEQ ID NO 878。
图1-MP：摄取dsRNA(靶标27)对桃蚜若虫存活的影响。将1龄 昆虫置于包含50μl液态饲料(含有2μg/μl dsRNA(靶标27或gfp dsRNA 对照))的喂料室中。针对每种处理，建立5个喂料室，其中每个喂料室 包括10只龄虫。在生物测定开始后的第8天评估存活数。误差条线代表标 准差。靶标MP027：SEQ ID NO 1061；gfp dsRNA：SEQ ID NO 235。
图1-NL：使用以dsRNA处理的液体人工饲料喂食的褐飞虱的存活。 在分别的生物测定中用补充有2mg/ml dsRNA靶标的溶液的饲料喂食第 一至第二幼虫阶段的若虫：(a)NL002、NL003、NL005、NL010；(b) NL009、NL016；(c)NL014、NL018；(d)NL013、NL015、NL021。 昆虫针对靶标的存活与喂食相同浓度的只有饲料和含有gfp dsRNA对照的 饲料进行比较。每两天将饲料替换为含有dsRNA的新鲜饲料。每天评估 存活昆虫数。
图2-NL：使用以不同浓度的靶标dsRNA(NL002)处理的液体人工 饲料喂食的褐飞虱的存活。用补充有1、0.2、0.08和0.04mg/ml(终浓度) NL002的饲料喂食第一至第二幼虫阶段的若虫。每两天将饲料替换为含有 dsRNA的新鲜饲料。每天评估存活昆虫数。
本发明的方法可实际应用在需要抑制昆虫的生存、生长、发育或繁殖 或者降低昆虫的致病性或感染性的任何技术领域。本发明的方法还实际应 用于需要特异性下调昆虫中一种或多种靶基因表达的情形。特别有用的实 际应用包括但不限于：(1)保护植物免受昆虫害虫侵害；(2)在人和动物 中的药物或兽医用途(例如，控制、治疗或预防人和动物中的昆虫感染)； (3)保护物品免遭昆虫破坏；(4)保护易腐的物品(如食品、种子等) 免遭昆虫破坏；以及通常需要防治昆虫和/或需要防止昆虫引起破坏的任何 应用。
根据一个实施方案，本发明涉及控制细胞或生物上昆虫生长的方法， 或者防止昆虫侵害对昆虫感染敏感的细胞或生物的方法，其包括将昆虫与 双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条退火互 补链包含与昆虫靶基因核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列，该双 链RNA被昆虫摄取并因此控制生长或防止侵害。
因此，本发明提供了分离的新的昆虫靶基因核苷酸序列，所述分离的 核苷酸序列包含选自以下的至少一种核酸序列：
(i)如下表示的任意序列：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23， 49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至 247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515， 517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773， 778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894， 896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081， 1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111， 1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627， 1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690， 1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065， 2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344， 2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384或2460，2461，2466，2471，2476，2481或 2486，或其互补序列，
(ii)与如下表示的任意序列具有至少70％，优选至少75％、80％、 85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％一致性的序 列： SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183， 188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472， 473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591， 596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061， 1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097， 1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592， 1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667， 1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至 2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102， 2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372， 2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互补序列，以及
(iii)包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷酸的序列： SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168， 173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249，251，253，255，257， 259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519，521，533至575， 576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795， 797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041， 1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089， 1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572， 1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647， 1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698， 1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085， 2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364， 2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，或其互补序列， 或者其中所述核酸序列是包含如下表示的任意序列之至少17个连续核苷 酸的基因的直系同源物：SEQ ID NO 49至158、275至472、533至575、 621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120 至2338、2384至2460，或其互补序列，所述核酸序列可用于制备本发明 的用于控制昆虫生长的双链RNA。
本发明使用的“防治害虫”意指杀死害虫，或阻止害虫发育或生长，或 防止害虫感染或侵害。本文使用的防治害虫还包括控制害虫的后代(卵的 发育)。本文使用的害虫防治还包括抑制昆虫的生存、生长、发育或繁殖， 或降低昆虫的致病性或感染性。本文所述的化合物和/或组合物可用于维持 生物健康，并可以治疗性、预防性或全身性地使用来防治害虫或者阻止昆 虫生长或发育或者感染或侵害。
本发明涉及的特定害虫是昆虫害虫。因此，本文使用的“防治昆虫”还 包括控制昆虫的后代(例如昆虫害虫的卵的发育)。本文使用的防治昆虫 还包括抑制昆虫的生存、生长、发育或繁殖，或者降低昆虫的致病性或感 染性。在本发明中，防治昆虫可以抑制昆虫中的生物活性，其导致一种或 多种以下特征：昆虫进食减少，昆虫生存力降低，昆虫死亡，抑制昆虫的 分化和发育，以下的缺失或能力下降：昆虫有性繁殖、肌肉形成、保幼激 素形成、保幼激素功能调节、离子调节和转运、细胞膜电势的维持、氨基 酸的生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合成、信息素的感知、触 角形成、翅的形成、足的形成、发育和分化、卵的形成、幼虫的成熟、消 化酶的形成、血淋巴的合成、血淋巴的维持、神经传递、细胞分裂、能量 代谢、呼吸、凋亡以及真核细胞的细胞骨架结构(如肌动蛋白和微管蛋白) 的任何组分。本文所述的化合物和/或组合物可用于维持生物健康，并可以 治疗性、预防性或全身性地使用来防治昆虫，或阻止害虫生长或发育或者 感染或侵害。因此，本发明可以使先前的敏感生物对昆虫侵害产生抗性。
本文使用的表述“与......的至少一部分互补”是指所述核苷酸序列与靶 标的核苷酸序列在超过两个核苷酸的长度上，例如超过至少15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24或更多个连续核苷酸的长度上完全互补。
根据又一实施方案，本发明涉及用于下调昆虫中靶基因表达的方法， 其包括将所述昆虫与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互补 链，其中一条退火互补链包含与待下调昆虫靶基因核苷酸序列之至少一部 分互补的核苷酸序列，其中所述双链RNA被昆虫摄取并因此下调昆虫靶 基因的表达。
在无数量词修饰时，“靶基因”是指“至少一种”靶基因。同样地，靶生 物是指“至少一种”靶生物，RNA分子或宿主细胞是指“至少一种”RNA分 子或宿主细胞。这在后面还有详述。
根据一个实施方案，本发明的方法依赖于昆虫摄取其外部的双链RNA (例如，通过进食)，而不需要在昆虫细胞中表达双链RNA。另外，本发 明还包括如上所述的方法，其中所述昆虫与包含该双链RNA的组合物接 触。
可通过原核的(例如但不限于细菌)或真核的(例如但不限于酵母) 宿主细胞或宿主生物来表达所述双链RNA。
所述昆虫可以是任何昆虫，意指属于动物界、特别是节肢动物门、尤 其是昆虫纲或蛛形纲的任何生物。本发明的方法适用于对利用RNA干扰 进行的基因沉默敏感的所有昆虫，以及能够从其邻近环境将双链RNA内 化的所有昆虫。本发明还适用于处于其任何发育阶段的昆虫。因为昆虫具 有无生命的外骨骼，所以它们不能以均一的速率生长，而是通过周期性蜕 落其外骨骼进行分阶段生长。该过程称作“蜕皮”。蜕皮之间的阶段称作 “龄”，而这些阶段可以作为本发明的靶标。同时，昆虫的卵或活的幼虫也 可作为本发明的靶标。发育周期中的所有阶段(包括有翅昆虫中的变态) 均可以作为本发明的靶标。因此，单个阶段(如幼虫、蛹、若虫等发育阶 段)均可以作为靶标。
在本发明的一个实施方案中，所述昆虫可以属于以下的目：蜱螨目、 蜘蛛目、虱目、鞘翅目、弹尾目、革翅目、网翅目、双尾目、双翅目、纺 足目、蜉蝣目、蛩蠊目、半翅目、同翅目、膜翅目、等翅目、鳞翅目、食 毛目、长翅目、脉翅目、蜻蜓目、直翅目、竹节虫目、翅目、原尾目、 啮虫目、蚤目、虱目、缨尾目、捻翅目、缨翅目、毛翅目和缺翅目。
在本发明优选的非限制性实施方案和方法中，所述昆虫选自：
(1)植物昆虫害虫，例如但不限于褐飞虱属物种(Nilaparvata spp.)) (例如，褐飞虱(N.lugens))、灰飞虱属物种(Laodelphax spp.)(例 如，灰飞虱(L.striatellus))、黑尾叶蝉属物种(Nephotettix spp.)(例 如，二点黑尾叶蝉(N.virescens)，或黑尾叶蝉(N.cincticeps)，或二条 黑尾叶蝉(N.nigropictus))、白背飞虱属物种(Sogatella spp.)(例如， 白背飞虱(S.furcifera))、杆长蝽属物种(Blissus spp.)(例如，美洲 谷杆长蝽(B.leucopterus leucopterus))、黑蝽属物种(Scotinophora spp.) (例如，稻黑蝽(S.vermidulate))、绿蝽属物种(Acrosternum spp.)(例 如，拟绿蝽(A.hilare))、稻弄蝶属物种(Parnara spp.)(例如，直纹 稻弄蝶(P.guttata))、禾草螟属物种(Chilo spp.)(例如，二化螟(C. suppressalis)、台湾稻螟(C.auricilius)或稻多丽螟(C.polychrysus))、 禾草螟属物种(Chilotraea spp.)(例如，稻杆螟(C.polychrysa))、蛀 茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)(例如，稻蛀茎夜蛾(S.inferens))、蛀 禾螟属物种(Tryporyza spp.)(例如，白稻螟(T.innotata)或三化螟(T. incertulas))、纵卷叶野螟属物种(Cnaphalocrocis spp.)(例如，稻纵 卷叶野螟(C.medinalis))、潜蝇属物种(Agromyza spp.)(例如，日本 稻潜蝇(A.oryzae)或玉米斑潜蝇(A.parvicornis))、杆草螟属物种(Diatraea spp.)(例如，小蔗螟(D.saccharalis)或西南玉米杆草螟(D.grandiosella))、 Narnaga属物种(例如，绿稻毛虫(N.aenescens))、黄夜蛾属物种 (Xanthodes spp.)(例如，犁纹黄夜蛾(X.transversa))、灰翅夜蛾属 物种(Spodoptera spp.)(例如，草地贪夜蛾(S.frugiperda)、甜菜夜蛾 (S.exigua)、海灰翅夜蛾(S.littoralis)或西部黄条夜蛾(S.praefica))、 秘夜蛾属物种(Mythimna spp.)(例如，粘虫(Mythmna(Pseudaletia) seperata))、铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)(例如，谷实夜蛾(H.zea))、 Colaspis属物种(Colaspis spp.)(例如，葡萄肖叶甲(C.brunnea)、稻 水象属物种(Lissorhoptrus spp.)(例如，稻水象甲(L.oryzophilus))、 稻象属物种(Echinocnemus spp.)(例如，稻象(E.squamos))、稻铁 甲属物种(Diclodispa spp.)(例如，水稻铁甲(D.armigera))、禾谷负 泥虫属物种(Oulema spp.)(例如，水稻负泥虫(O.oryzae))、米象属 物种(Sitophilus spp.)(例如，米象(S.oryzae))、Pachydiplosis属物 种(例如，稻瘿蚊(P.oryzae))、毛眼水蝇属物种(Hydrellia spp.)(例 如，麦叶毛眼水蝇(H.griseola)或日稻毛眼水蝇(H.sasakii))、Chlorops 属物种(例如，稻杆潜蝇(C.oryzae))、根萤叶甲属物种(Diabrotica spp.) (例如，玉米根叶甲(D.virgifera virgifera)、北美玉米根叶甲(D.barberi)、 黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi)、墨西哥玉米根 叶甲(D.virgifera zeae)、条纹黄瓜叶甲(D.balteata))、杆野螟属物种 (Ostrinia spp.)(例如，玉米螟(O.nubilalis))、地虎属物种(Agrotis spp.)(例如，小地老虎(A.ipsilon))、Elasmopalpus属物种(例如， 南美玉米苗斑螟(E.lignosellus))、梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.) (线虫)、圆头犀金龟属物种(Cyclocephala spp.)(例如，北部伪装金 龟(C.borealis)或南部伪装金龟(C.immaculata))、弧丽金龟属物种 (Popillia spp.)(例如，日本弧丽金龟(P.japonica))、跳甲属物种 (Chaetocnema spp.)(例如，玉米铜色跳甲(C.pulicaria))、龙颈象 属物种(Sphenophorus spp.)(例如，玉米长喙象(S.maidis))、缢管 蚜属物种(Rhopalosiphum spp.)(例如，玉米蚜(R.maidis))、圆尾蚜 属物种(Anuraphis spp.)(例如，玉米根蚜(A.maidiradicis))、黑蝗 属物种(Melanoplus spp.)(例如，红足黑蝗(M.femurrubrum))、特 异黑蝗(M.differentialis)或迁飞黑蝗(M.sanguinipes))、种蝇属物种 (Hylemya spp.)(例如，种蝇(H.platura))、呆蓟马属物种(Anaphothrips spp.)(例如，黄呆蓟马(A.obscrurus))、火蚁属物种(Solenopsis spp.) (例如，盗蚁(S.milesta))、叶螨属物种(Tetranychus spp.)(例如， 二点叶螨(T.urticae)、朱砂叶螨(T.cinnabarinus))、铃夜蛾属物种 (例如，谷实夜蛾或棉铃虫(H.armigera))、Pectinophora属物种(例 如，红铃麦蛾(P.gossypiella))、金刚钻属物种(Earias spp.)(例如， 翠纹钻夜蛾(E.vittella))、实夜蛾属物种(Heliothis spp.)(例如，烟 芽夜蛾(H.virescens))、花象属物种(Anthonomus spp.)(例如，墨西 哥棉铃象(A.grandis))、Pseudatomoscelis属物种(例如，棉伪斑腿盲 蝽(P.seriatus))、结翅粉虱属物种(Trialeurodes spp.)(例如，结翅 粉虱(T.abutiloneus)、温室粉虱(T.vaporariorum))、小粉虱属物种 (Bemisia spp.)(例如，银叶粉虱(B.argentifolii))、蚜属物种(Aphis spp.)(例如，棉蚜(A.gossypii))、草盲蝽属物种(Lygus spp.)(例 如，美国牧草盲蝽(L.lineolaris)或美洲牧草盲蝽(L.hesperus))、美 洲蝽属物种(Euschistus spp.)(例如，斑点美洲蝽(E.conspersus))、 Chlorochroa属物种(例如，赛氏蝽(C.sayi))、绿蝽属物种(Nezara spp.) (例如，稻绿蝽(N.viridula))、蓟马属物种(Thrips spp.)(例如，烟 蓟马(T.tabaci))、花蓟马属物种(Frankliniella spp.)(例如，烟褐蓟 马(F.fusca)或西方花蓟马(F.occidentalis))、马铃薯叶甲属物种 (Leptinotarsa spp.)(例如，马铃薯叶甲(L.decemlineata)、伪马铃薯 叶甲(L.juncta)或胡颓子叶茄叶甲(L.texana))、合爪负泥虫属物种 (Lema spp.)(例如，三条负泥虫(L.trilineata))、茄跳甲属物种(Epitrix spp.)(例如，美国马铃薯跳甲(E.cucumeris)、烟草跳甲(E.hirtipennis) 或块茎跳甲(E.tuberis))、豆芫菁属物种(Epicauta spp.)(例如，北 美豆芫菁(E.vittata))、猿叶甲属物种(Phaedon spp.)(例如，辣根猿 叶甲(P.cochleariae))、食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)(例如，墨 西哥豆瓢虫(E.varivetis))、Acheta属物种(例如，居屋艾蟋(A. domesticus))、绿小叶蝉属物种(Empoasca spp.)(例如，蚕豆小绿叶 蝉(E.fabae))、瘤蚜属(Myzus spp.)(例如，桃蚜(M.persicae))、 薯个木虱属物种(Paratrioza spp.)(例如，马铃薯木虱(P.cockerelli))、 宽胸金针虫属物种(Conoderus spp.)(例如，南部马铃薯线虫(C.falli) 或烟草线虫(C.vespertinus))、麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)(例如， 马铃薯麦蛾(P.operculella))、长管蚜属物种(Macrosiphum spp.)(例 如，大戟长管蚜(M.euphorbiae))、Thyanta属物种(例如，红肩蝽象 (T.pallidovirens))、麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)(例如，马铃薯 麦蛾(P.operculella))、铃夜蛾属物种(例如，谷实夜蛾)、Keiferia属 物种(例如，番茄蠹蛾(K.lycopersicella))、金针虫属物种(Limonius spp.) (线虫)、Manduca属物种(例如，烟草天蛾(M.sexta)或番茄天蛾(M. quinquemaculata))、斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)(例如，蔬菜斑潜 蝇(L.sativae)、三叶草斑潜蝇(L.trifolli)或南美斑潜蝇(L.huidobrensis))、 果蝇属物种(Drosophilla spp.)(例如，黑腹果蝇(D.melanogaster)、 D.yakuba、拟暗果蝇(D.pseudoobscura)或拟果蝇(D.simulans))、步 甲属物种(Carabus spp.)(例如，粒步甲(C.granulatus))、摇蚊属物 种(Chironomus spp.)(例如，摇蚊(C.tentanus))、栉首蚤属物种 (Ctenocephalides spp.)(例如，猫栉首蚤(C.felis))、非耳喙象属物 种(Diaprepes spp.)(例如，根象鼻虫(D.abbreviatus))、齿小蠹属物 种(Ips spp.)(例如，美松齿小蠹(I.pini))、拟谷盗属物种(Tribolium spp.)(例如，赤拟谷盗(T.castaneum))、舌蝇属物种(Glossina spp.) (例如，刺舌蝇(G.morsitans))、按蚊属物种(Anopheles spp.)(例 如，甘比亚按蚊(A.gambiae))、铃夜蛾属(例如，棉铃虫(H.armigera))、 Acyrthosiphon属物种(例如，豌豆蚜(A.pisum))、蜜蜂属物种(Apis spp.) (例如，意大利蜜蜂(A.melifera))、Homalodisca属物种(例如，琉璃 叶蝉(H.coagulate))、伊蚊属物种(Aedes spp.)(例如，埃及斑纹(Ae. aegypti))、蚕蛾属物种(Bombyx spp.)(例如，家蚕(B.mori))、 飞蝗属物种(Locusta spp.)(例如，飞蝗(L.migratoria))、牛蜱属物 种(Boophilus spp.)(例如，微小牛蜱(B.microplus))、Acanthoscurria 属物种(例如，红毛巧克力捕鸟蛛(A.gomesiana))、甲蠊属物种(Diploptera spp.)(例如，太平洋折翅蠊(D.punctata))、袖蝶属物种(Heliconius spp.)(例如，瓦氏袖蝶(H.erato)或诗神袖蝶(H.melpomene))、象 虫属物种(Curculio spp.)(例如，欧洲栎象(C.glandium))、Plutella 属物种(例如，菜蛾(P.xylostella))、钝眼蜱属物种(Amblyomma spp.) (例如，彩饰花蜱(A.variegatum))、柞蚕属物种(Anteraea spp.)(例 如，天蚕(A.yamamai))和阿蚊属物种(Armigeres spp.)(例如，骚扰 阿蚊(A.subalbatus))；
(2)能够侵扰或损伤人和/或动物的昆虫，例如但不限于具有可见于半翅 目和某些膜翅目以及双翅目(如蚊子、蜜蜂、黄蜂、虱、蚤和蚂蚁)的刺 吸式口器的昆虫以及蛛形纲动物(Arachnidae)(如蜱和螨)：蜱螨目(蜱 和螨)，例如代表性的科：软蜱科(Argasidae)、皮刺螨科(Dermanyssidae)、 硬蜱科(Ixodidae)、痒螨科(Psoroptidae)或疥螨科(Sarcoptidae)，以 及代表性的物种：花蜱属物种(Amblyomma spp.)、暗眼蜱属物种 (Anocentor spp.)、锐缘蜱属物种(Argas spp.)、牛蜱属物种(Boophilus spp.)、姬螯螨属物种(Cheyletiella spp.)、足螨属物种(Chorioptes spp.)、 蠕形螨属物种(Demodex spp.)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)、皮刺 螨属物种(Dermanyssus spp.)、血蜱属物种(Haemophysalis spp.)、璃 眼蜱属物种(Hyalomma spp.)、硬蜱属物种(Ixodes spp.)、Lynxacarus 属物种、中气门亚目物种(Mesostigmata spp.)、背肛螨属物种(Notoedres spp.)、钝缘蜱属物种(Ornithodoros spp.)、禽刺螨属物种(Ornithonyssus spp.)、残喙蜱属物种(Otobius spp.)、耳痒螨属物种(Otodectes spp.)、 肺刺螨属物种(Pneumonyssus spp.)、痒螨属物种(Psoroptes spp.)、扇 头蜱属物种(Rhipicephalus spp.)、疥螨属物种(Sarcoptes spp.)或恙螨 属物种(Trombicula spp.)；虱目(吸吮和叮咬的虱)，例如代表性物种： 牛毛虱属物种(Bovicola spp.)、血虱属物种(Haematopinus spp.)、颚 虱属物种(Linognathus spp.)、鸡虱属物种(Menopon spp.)、人虱属物 种(Pediculus spp.)、瘿绵蚜属物种(Pemphigus spp.)、根瘤蚜属物种 (Phylloxera spp.)或管虱属物种(Solenopotes spp.)；双翅目(蝇)，例 如代表性的物种：伊蚊属物种(Aedes spp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、 丽蝇属物种(Calliphora spp.)、金蝇属物种(Chrysomyia spp.)、斑虻属 物种(Chrysops spp.)、锥蝇属物种(Cochliomyia spp.)、库蚊属物种(Culex spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、黄蝇属物种(Cuterebra spp.)、 皮蝇属物种(Dermatobia spp.)、胃蝇属物种(Gastrophilus spp.)、舌蝇 属物种(Glossina spp.)、黑角蝇属物种(Haematobia spp.)、麻虻属物 种(Haematopota spp.)、虱蝇属物种(Hippobosca spp.)、皮蝇属物种 (Hypoderma spp.)、绿蝇属物种(Lucilia spp.)、角蝇属物种(Lyperosia spp.)、蜱蝇属物种(Melophagus spp.)、狂蝇属物种(Oestrus spp.)、 绿蝇属物种(Phaenicia spp.)、白蛉属物种(Phlebotomus spp.)、伏蝇 属物种(Phormia spp.)、麻蝇属物种(Sarcophaga spp.)、蚋属物种 (Simulium spp.)、螫蝇属物种(Stomoxys spp.)、虻属物种(Tabanus spp.)、 Tannia属物种或大蚊属(Tipula spp.)；食毛目(叮咬的虱)，例如代表 性的物种：Damalina属物种、猫毛虱属物种(Felicola spp.)、Heterodoxus 属物种或啮毛虱属物种(Trichodectes spp.)；蚤目(无翅昆虫)，例如角 叶蚤属物种(Ceratophyllus spp.)、蚤属物种(Pulex spp.)或客蚤属物种 (Xenopsylla spp.)；臭虫科(臭虫)，例如代表性的物种：臭虫属物种 (Cimex spp.)、Tritominae属物种、Rhodinius属物种或锥蝽属物种 (Triatoma spp.)以及
(3)导致对基层(substrate)或物品的不利破坏的昆虫，如攻击食品、 种子、木材、涂料、塑料、衣物等的昆虫。
(4)与公共健康和卫生相关的昆虫或蛛形纲动物，包括住屋昆虫和 体外寄生虫，例如但不限于蝇、叶螨、蓟马、蜱、红色家禽螨、蚂蚁、蟑 螂、白蚁、蟋蟀(包括住屋蟋蟀)、蠹虫、书虱、甲虫、蠼螋、蚊子和蚤。 更优选的靶标是蟑螂(蜚蠊目)，例如但不限于小蠊属物种(Blatella spp.) (例如，德国小蠊(Blatella germanica)、大蠊属物种(Periplaneta spp.) (例如，美洲大蠊(Periplaneta americana)和澳洲大蠊(Periplaneta australiasiae)、蜚蠊属物种(Blatta spp.)(例如，东方蜚蠊(Blatta orientalis)) 和皮蠊属物种(Supella spp.)(例如，长须蜚蠊(Supella longipalpa))， 蚂蚁(蚁总科)，如但不限于火蚁属(Solenopsis spp.)(例如，红火蚁 (Solenopsis invicta))、小家蚁属物种(Monomorium spp.)(例如，小 家蚁(Monomorium pharaonis))、弓背蚁属物种(Camponotus spp.)(例 如，弓背蚁属物种(木匠蚁))、毛蚁属物种(Lasius spp.)(例如，黑 毛蚁(lasius niger))、铺道蚁属物种(Tetramorium spp.)(例如，铺道 蚁(Tetramorium caespitum))、红蚁属物种(Myrmica spp.)(例如， 小红蚁(Myrmica rubra))、蚁属物种(Formica spp.)(木蚁)、举腹 蚁属物种(Crematogaster spp.)(例如，举腹蚁(Crematogaster lineolata))、 虹臭蚁属物种(Iridomyrmex spp.)(例如，阿根廷蚁(Iridomyrmex humilis))、大头蚁属物种(Pheidole spp.)(大头蚁)和Dasymutilla属 物种(例如，Dasymutilla occidentalis(蚁蜂))，白蚁(等翅目和/或白蚁 科)，例如但不限于丫白蚁属物种(Amitermes spp.)(例如佛罗里达黑翅 散白蚁(Amitermes floridensis))、散白蚁属物种(Reticulitermes spp.) (例如，黄肢散白蚁(Reticulitermes flavips)、西部散白蚁(Reticulitermes hesperus))、乳白蚁属物种(Coptotermes spp.)(例如，台湾乳白蚁 (Coptotermes formosanus))、楹白蚁属物种(Incisitermes spp.)(例如， 小楹白蚁(Incisitermes minor))、新白蚁属物种(Neotermes spp.)(例 如，森林树白蚁(Neotermes connexus))。
受益于本发明的“敏感生物”包括对害虫侵害敏感的任何生物。许多不 同生物的害虫，所述生物例如动物(如人、家畜(如宠物(如猫、犬等)) 和牲畜(包括绵羊、奶牛、猪、鸡等))。
由此，在本发明的优选但非限制的实施方案中，所述昆虫或蛛形纲动 物选自：
(1)蜱螨目：包括蜱亚目(蜱)的螨类
(2)蛛形纲：蜘蛛目(蜘蛛)和盲蛛目(盲蜘蛛)，实例包括黑寡 妇蜘蛛(Latrodectus mactans)和棕色隐遁蜘蛛(Loxosceles recluse)
(3)虱目：虱，如体虱(Pediculus humanus)
(4)蜚蠊目：蟑螂，包括德国小蠊、大蠊属的美洲大蠊和澳洲大蠊、 蜚蠊属的东方蜚蠊以及皮蠊属的长须蜚蠊。最优选的靶标是德国小蠊。
(5)鞘翅目：甲虫，实例包括长蠹总科；大小蠹属物种(Dendroctonus spp.)(Black Turpentine Beetle、南部松小蠹(Southern Pine Beetle)、 IPS雕刻小蠹(IPS Engraver Beetle))；地毯甲虫(Carpet Beetles)(圆 皮蠹属物种(Anthrenus spp.)、毛皮蠹属物种(Attagenus spp.))；Old House Borer(天牛科：家天牛(Hylotrupes bajulus))；家俱窃蠹(Anobium punctatum)；拟谷盗属物种(面象虫)；谷斑皮蠹(Trogoderma granarium)； Oryzaephilus sarinamensis(锯谷盗(Toothed Grain Beetle))等(书虫)
(6)革翅目：蠼螋类
(7)双翅目：蚊(蚊科)和蝇(短角亚目)，实例是Anophehnae(如 按蚊属物种)和库蚊亚科(如Aedes fulvus)；虻科如Tabanus punctifer (马蝇)、Glossina morsitans morsitans(舌蝇)、drain flies(毛蠓科)以 及有瓣蝇类(Calyptratae)如家蝇(Musca domestica)、肉蝇(麻蝇科) 等
(8)异翅亚目：臭虫，如温带臭虫(Cimex lectularius)(床虱)
(9)膜翅目：黄蜂(细腰亚目)，包括蚂蚁(蚁总科)、蜜蜂(蜜 蜂总科)：红火蚁、小家蚁、弓背蚁属物种(木匠蚁)、黑毛蚁、铺道蚁、 小红蚁、蚁属物种(木蚁)、举腹蚁、阿根廷蚁、大头蚁属物种(大头蚁) 和Dasymutilla occidentalis(蚁蜂)等
(10)等翅目：白蚁，实例包括佛罗里达黑翅散白蚁(Amitermes floridensis)、黄肢散白蚁、西部散白蚁(R.hesperus)、台湾乳白蚁、小 楹白蚁、森林树白蚁(Neotermes connexus))和白蚁科
(11)鳞翅目：蛾，实例包括谷蛾科和织蛾科(如衣蛾(Tineola bisselliella))以及螟蛾科(如紫斑谷螟(Pyralis farinalis))等
(12)啮虫目：书虱(啮虫目)
(13)蚤目：蚤，如致痒蚤(Pulex irritans)
(14)胸喙亚目：蚜虫(蚜科)
(15)衣鱼目：蠹虫，实例是：小灶衣鱼(Thermobia domestica)和 衣鱼(Lepisma saccharina)
本发明优选的植物病原性昆虫是植物害虫并选自：马铃薯叶甲属物种 (例如，马铃薯叶甲、伪马铃薯叶甲或胡颓子叶茄叶甲)、褐飞虱属物种 (例如，褐飞虱)、灰飞虱属物种(例如，灰飞虱)、黑尾叶蝉属物种(例 如，二点黑尾叶蝉，或黑尾叶蝉，或二条黑尾叶蝉)、白背飞虱属物种(例 如，白背飞虱)、禾草螟属物种(例如，二化螟、台湾稻螟或稻多丽螟)、 蛀茎夜蛾属物种(例如，稻蛀茎夜蛾)、蛀禾螟属物种(例如，白稻螟或 三化螟)、根萤叶甲属物种(例如，玉米根叶甲、北美玉米根叶甲、黄瓜 十一星叶甲食根亚种、墨西哥玉米根叶甲)、杆野螟属物种(例如，玉米 螟)、呆蓟马属物种(例如，黄呆蓟马)、Pectinophora属物种(例如， 红铃麦蛾)、实夜蛾属物种(例如，烟芽夜蛾)、结翅粉虱属物种(例如， 结翅粉虱、温室粉虱)、小粉虱属物种(例如，银叶粉虱)、蚜属物种(例 如，棉蚜)、草盲蝽属物种(例如，美国牧草盲蝽或美洲牧草盲蝽)、美 洲蝽属物种(例如，斑点美洲蝽)、Chlorochroa属物种(例如，赛氏蝽)、 绿蝽属物种(例如，稻绿蝽)、蓟马属物种(例如，烟蓟马)、花蓟马属 物种(例如，烟褐蓟马或西方花蓟马)、瘤蚜属物种(例如，桃蚜)、长 管蚜属物种(例如，大戟长管蚜)、杆长蝽属物种(例如，美洲谷杆长蝽)、 绿蝽属物种(例如，拟绿蝽)、禾草螟属物种(例如，稻杆螟(C.polychrysa))、 稻水象属物种(例如，稻水象甲)、缢管蚜属物种(例如，玉米蚜)和圆 尾蚜属物种(例如，玉米根蚜(A.maidiradicis))。
根据一个更具体的实施方案，本发明的方法适用于马铃薯叶甲属物种。 马铃薯叶甲属属于叶甲科或叶甲类。叶甲(如跳甲和玉米根虫)和象甲(如 苜蓿叶象甲)是特别重要的害虫。跳甲包括多种小型食叶甲虫，其以多种 草、谷类和草本植物的叶为食。跳甲包括多个属(例如，Attica、Apphthona、 Argopistes、Disonycha、茄跳甲属、长跗跳甲属、潜跳甲属 (Prodagricomela)、Systena和黄条跳甲属)。蔬菜黄条跳甲(Phyllotreta cruciferae)(也叫作油菜跳甲(Rape Flea Beetle))是特别重要的害虫。 玉米根虫包括叶甲属的物种(例如，黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata undecimpunctata)、黄瓜十一星叶甲食根亚种、D.longicornis、玉米根叶 甲和条纹黄瓜叶甲)。玉米根虫对玉米和瓜类(curcubit)造成广泛破坏。 黄瓜十一星叶甲(Western Spotted Cucumber Beetle)是美国西部的瓜类 害虫。苜蓿叶象甲(亦称三叶草象甲)属于叶象属(紫苜蓿叶象(H.postica)、 埃及苜蓿叶象(H.brunneipennis)、H.nigrirostris、三叶草叶象(H. punctata)和H.meles)，并被认为是重要的豆类害虫。埃及苜蓿叶象是 美国西部的重要苜蓿害虫。
马铃薯叶甲属物种超过30种。因此，本发明包括用于防治马铃薯叶甲 属物种的方法，更特别地用于杀死昆虫、或阻止马铃薯叶甲属昆虫发育或 生长、或者防止昆虫感染或侵害的方法。本发明所防治的特定马铃薯叶甲 属物种包括马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata(Say))和伪马铃薯叶甲 (Leptinotarsa juncta(Say))。
CPB(Colorado Potato Beetle，马铃薯叶甲)对我们本国的马铃薯、 其它栽培和野生的有块茎和无块茎的马铃薯物种(例如，S.demissum(墨 西哥马铃薯野生种)、富利亚薯(S.phureja a.o.))以及另一些茄属植物 物种是(严重的)害虫，所述植物物种包括：
(a)作物物种番茄(若干番茄属物种)、茄子、胡椒(若干辣椒属物种)、 烟草(若干烟草属物种，其包括观赏性植物)和醋栗(酸浆属物种)；
(b)杂草/草本植物物种，北美刺龙葵(S.carolinense)、欧白英(S. dulcamara)、颠茄(颠茄属物种)、曼陀罗(曼陀罗属物种)、天仙子 (天仙子属物种)和黄花刺茄(S.rostratum)。
FPB(False Potato Beetle，伪马铃薯叶甲)主要发现于北美刺龙葵上， 也发生在欧白英、醋栗和酸浆(酸浆属物种)上。
术语“昆虫”包括所有类型以及所有发育阶段的昆虫，包括卵、幼虫或 若虫、蛹和成虫阶段。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是马铃薯叶甲，所述植 物是马铃薯、茄子、番茄、胡椒、烟草、醋栗或者稻、玉米或棉花。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是辣根猿叶甲，所述植 物是芥菜、大白菜、芜菁、羽衣甘蓝或小白菜。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是墨西哥豆瓢虫，所述 植物是豆类、菜豆、四季豆、食英菜豆、利马豆、绿豆、青豆、牛眼豆、 绒毛豆、大豆、豇豆、木豆、三叶草或苜蓿。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是墨西哥棉铃象，所述 植物是棉花。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是赤拟谷盗，所述植物 以贮藏谷物的形式，如面粉、谷类、粗粉、饼干、豆类、调味品、面食、 点心粉、干的宠物食品、干花、巧克力、坚果、种子甚至干的博物馆标本。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是桃蚜，所述植物是树 木如李属，特别是桃、杏和李子；茄科、藜科、菊科、十字花科和葫芦科 的蔬菜作物，其包括但不限于：朝鲜蓟、芦笋、豆类、甜菜、嫩茎花椰菜、 抱子甘蓝、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、哈蜜瓜、芹菜、玉米、黄瓜、茴香、 无头甘蓝、大头菜、芜菁、茄子、莴苣、芥菜、菜秋葵、欧芹、欧洲防风 草、豌豆、胡椒、马铃薯、萝卜、菠菜、南瓜、番茄、芜菁、豆瓣菜和西 瓜；农田作物例如但不限于：烟草、糖用甜菜和向日葵；花作物或其它观 赏性植物。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是褐飞虱，所述植物是 稻类植物。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是二化螟，所述植物是 稻类植物、大麦(bareley)、高粱、玉米、小麦或草。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是菜蛾，所述植物是芸 苔属物种，例如但不限于卷心菜、大白菜、抱子甘蓝、无头甘蓝、油菜籽、 嫩茎花椰菜、花椰菜、芜菁、芥菜或萝卜。
本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫是居屋艾蟋，所述植物 是本文所述的任何植物或任何有机体。
在本文中，术语“植物”包括期望被处理从而阻止或降低昆虫生长和/ 或昆虫侵害的任何植物材料。这包括整株植物、幼苗、增殖或繁殖材料(如 种子、插条、接穗、外植体等)，以及植物细胞和组织培养物等。所述植 物材料应当表达RNA分子或者具有表达RNA分子的能力，所述RNA分 子包含至少一种核苷酸序列，该核苷酸序列是害虫至少一种靶基因的有义 链核苷酸序列之至少一部分的RNA互补序列或代表了其RNA等价物，从 而所述RNA分子通过植物与害虫的相互作用被害虫摄取，所述RNA分子 能够通过RNA干扰来抑制靶基因或者下调靶基因的表达。
所述靶基因可以是本文所述的任何靶基因，例如对于害虫的生存、生 长、发育或繁殖必需的靶基因。本发明涉及昆虫中可被下调的任何目的基 因(本文可称作“靶基因”)。
术语“下调基因表达”和“抑制基因表达”可互换使用，其指在靶基因的 蛋白质产物和/或mRNA产物水平上可测量的或可观察的基因表达减少或 者完全消除可检测的基因表达。优选地，所述下调不显著地直接抑制昆虫 其它基因的表达。当与正常的基因表达比较时，dsRNA对基因表达的下调 效果可计算为至少为30％、40％、50％、60％，优选70％、80％，或者更 优选90％或95％。取决于靶基因的性质，可通过对细胞或整只昆虫进行表 型分析或者使用分子技术测量mRNA或蛋白质的表达来验证昆虫细胞中 基因表达的下调或抑制，所述分子技术如RNA溶液杂交、PCR、核酸酶 保护实验、Northern杂交、逆转录、使用微列阵监测基因表达、抗体结合、 酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、放射免疫测定(RIA)、 其它免疫测定或荧光激活细胞分析(FACS)。
“靶基因”基本上可以是由于其干扰昆虫的生长或致病性或感染性而期 望被抑制的几乎任何基因。例如，如果本发明的方法用于阻止昆虫生长和 /或侵害，则优选地选择对昆虫的生存、生长、发育或繁殖必需的靶基因， 或者参与昆虫的致病性或感染性的任何基因，从而对靶基因的特异性抑制 导致致死性表型或者降低或阻止昆虫侵害。
根据一个非限制性的实施方案，所述靶基因是当使用本发明的方法下 调或抑制其表达时，昆虫被杀死或者昆虫的繁殖或生长被阻止或阻滞的那 些基因。认为这类靶基因是昆虫生存所必需的，并称作必需基因。因此， 本发明包括本文所述的方法，其中所述靶基因是必需基因。
根据另一非限制性的实施方案，所述靶基因是当使用本发明的方法将 其下调时，昆虫的侵害或感染、昆虫造成的破坏和/或昆虫侵害或感染宿主 生物和/或导致此类破坏的能力有所降低。一般地，术语“侵害”和“感染” 始终可互换使用。认为这类靶基因参与昆虫的致病性或感染性。因此，本 发明延伸至本文所述的方法，其中所述靶基因参与昆虫的致病性或感染 性。选择后一类型靶基因的优势在于阻断了昆虫进一步感染植物或植物部 分，并抑制其形成后代。
根据一个实施方案，靶基因是保守基因或昆虫特异性基因。
另外，在本发明的方法中可以使用能够指导RNAi或RNA介导的基 因沉默或者抑制昆虫靶基因的任何适当的双链RNA片段。
在另一实施方案中，选择实质性参与害虫(如昆虫)生长、发育和繁 殖的基因。示例性的基因包括但不限于核糖体蛋白的结构亚基和β-外被体 基因(如CHD3基因)。核糖体蛋白如S4(RpS4)和S9(RpS9)是参与 蛋白质生物合成的核糖体的结构组分，并且是胞质小核糖体亚基的组分， 核糖体蛋白如L9和L19是参与蛋白质生物合成的核糖体的结构组分，并 且定位于核糖体。秀丽隐杆线虫中的β-外被体基因编码蛋白质，所述蛋白 质形成膜泡外衣的多聚复合体的亚基。已在多种生物中发现类似的序列， 如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) 和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在多种生物中发现相关的序列， 如马铃薯叶甲、辣根猿叶甲、墨西哥豆瓢虫、墨西哥棉铃象、赤拟谷盗、 桃蚜、褐飞虱、二化螟、菜蛾和居屋艾蟋。
本发明使用的其它靶基因可包括例如在生存、生长、发育、繁殖和感 染性中扮演重要角色的基因。这些靶基因包括例如持家基因、转录因子和 害虫特异性基因或者线虫或果蝇中致死性敲除突变。本发明使用的靶基因 还可以是来自其它生物的基因，例如来自昆虫或蛛形纲动物(例如，马铃 薯叶甲属物种、猿叶甲属物种、食植瓢虫属物种、花象属物种、拟谷盗属 物种、瘤蚜属物种、褐飞虱属物种、禾草螟属物种、Plutella属物种或Acheta 属物种)的基因。
优选的靶基因包括表1A中指定的基因以及来自其它靶生物(如来自 其它害虫)的直向同源基因。
在本发明的方法中，使用dsRNA抑制昆虫生长或干扰昆虫的致病性或 感染性。
因此，本发明涉及包含退火互补链的分离的双链RNA，其中一条退火 互补链包含与昆虫靶基因的靶核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序 列。所述靶基因可以是本文所述的任意靶基因，或者其发挥同样功能的一 部分。
根据本发明的一个实施方案，提供了包含退火互补链的分离的双链 RNA，其中一条退火互补链包含与昆虫靶基因核苷酸序列之至少一部分互 补的核苷酸序列，其中所述靶基因包含选自以下的序列：
(i)与如下表示的任意序列具有至少75％一致性的序列：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188， 193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473， 478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596， 601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056， 1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097， 1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587， 1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662， 1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704， 1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095， 2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366， 2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，以及
(ii)包含以下任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：SEQ ID NO 1、 3、5、7、9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488， 493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605， 607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868， 873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071， 1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101， 1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597， 1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672， 1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至 2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102， 2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370， 2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，
或者，其中所述昆虫靶基因是包含以下任意序列之至少17个连续核苷酸的 基因的昆虫直系同源物：SEQ ID NO 49至158、275至472、533至575、 621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120 至2338、2384至2460或其互补序列。
取决于用于测量基因沉默的测定，与已用对照dsRNA处理的害虫相 比，生长抑制可定量为大于约5％、10％，更优选约20％、25％、33％、 50％、60％、75％、80％，最优选约90％、95％或约99％。
根据本发明的另一实施方案，提供了分离的双链RNA，其中至少一条 所述退火互补链包含如下表示的任意序列之至少一种核苷酸序列的RNA 等价物：SEQ ID NO 1、3、5、 7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493， 498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609， 621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883， 888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107， 1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617， 1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686， 1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055， 2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338， 2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471， 2476或2481，或者其中至少一条所述退火互补链包含其长度为至少17个 碱基对、优选其长度为至少18、19、20或21，更优选至少22、23或24 个碱基对的RNA等价物的片段。
如果本发明的方法用于在宿主细胞或宿主生物中或者对宿主细胞或宿 主生物特异性控制特定昆虫的生长或侵害，则优选所述双链RNA不与任 何宿主基因具有任何显著的同源性，或者至少不与宿主的任意必需基因具 有任何显著的同源性。在这种情况下，优选所述双链RNA与宿主细胞任 意基因的核酸序列一致性低于30％，更优选低于20％，更优选低于10％， 甚至更优选低于5％。序列一致性百分比应当在所述双链RNA的全长区域 上计算。如果可获得宿主生物的基因组序列数据，则可以使用标准生物信 息学工具来相互校验与所述双链RNA的序列一致性。在一个实施方案中， 所述dsRNA与宿主序列之间不存在超过21个连续核苷酸的序列一致性， 即在这种情况下，优选宿主生物的基因组中不存在所述dsRNA的21个连 续碱基对。在另一实施方案中，所述dsRNA与宿主物种任意核苷酸序列 之间在24个连续核苷酸上的序列一致性低于约10％或低于约12.5％。
所述双链RNA包含退火的互补链，其中一条退火互补链包含对应于 待下调之靶基因的靶核苷酸序列的核苷酸序列。所述双链RNA的另一条 链能够与上述第一条链进行碱基配对。
所述昆虫靶基因的“靶区域”或“靶核苷酸序列”可以是基因的任何适当 的区域或核苷酸序列。所述靶区域应包含靶基因的至少17、至少18或至 少19个连续核苷酸，更优选至少20或至少21个核苷酸，并且更优选所述 靶基因的至少22、23或24个核苷酸。
优选(至少部分的)所述双链RNA与昆虫靶基因的靶区域具有100 ％的序列一致性。然而应当理解的是，在所述双链区域的全长上具有100 ％序列一致性不是功能性RNA抑制的必要条件。还发现，相对于靶序列 来说带有插入、缺失和单点突变的RNA序列对RNA抑制是有效的。术语 “对应于”或“与......互补”在本文可互换使用，并且当这些术语用于指所述 双链RNA和靶基因的靶区域之间的序列对应性时，应解释为并非绝对需 要100％的序列一致性。然而，所述双链RNA和靶区域之间的序列一致性 百分比通常为至少80％或85％一致，优选至少90％、95％、96％一致， 或者更优选至少97％、98％一致，以及更优选至少99％一致。当两条核酸 链的至少85％碱基配对时，它们是“基本上互补的”。
本文使用的术语“互补的”涉及DNA-DNA互补性和DNA-RNA互补 性。类似地，术语“RNA等价物”实际上指在DNA序列中碱基“T”可以被 通常存在于核糖核酸中的对应碱基“U”所替代。
尽管所述dsRNA包含对应于靶基因中靶区域的序列，然而整个dsRNA 都对应于靶区域的序列却不是绝对必需的。例如，所述dsRNA可在靶标 特异性序列的侧翼包含短的非靶区域，只要该序列不实质性影响该dsRNA 的RNA抑制性能即可。
所述dsRNA可包含一个或多个替代碱基从而优化RNAi的性能。对于 本领域技术人员来说，如何依次改变所述dsRNA的每个碱基并测试所得 dsRNA的活性(例如，在适当的体外测试系统中)从而优化给定dsRNA 的性能是显而易见的。
所述dsRNA还可以包含DNA碱基、非天然的碱基或者糖-磷酸主链的 非天然主链连接或修饰，从而例如提高保藏期间的稳定性或者增强对核酸 酶降解的抗性。
先前已有报道，对于有效的基因沉默来说，形成约21bp的小干扰RNA (siRNA)是理想的。然而，在申请人的应用中已显示，dsRNA的最小长 度优选至少约80-100bp以便被某些害虫有效摄取。有迹象表明，在无脊 椎动物(如自由生活的秀丽隐杆线虫或植物寄生性的南方根结线虫 (Meloidogyne incognita))中，这些较长的片段在基因沉默中更加有效， 这可能由于无脊椎动物摄取这些较长的dsRNA更为有效所致。
最近还提出，与常规的21聚体(21-mer)siRNA相比，由27聚体平 端组成的合成RNA双链体或者具有29bp的茎和2-nt 3’突出端的短发夹 (short hairpin，sh)RNA组成的合成RNA双链体是RNA干扰更有力的 诱导物。因此，基于上述已鉴定靶标、并且为27聚体平端RNA分子或者 具有29bp的茎和2-nt 3’突出端的短发夹RNA分子的分子也包括在本发 明的范围内。
因此，在一个实施方案中，所述双链RNA片段(或区域)本身的长 度优选为至少17bp，长度优选为18或19bp，更优选至少20bp，长度更 优选至少21bp，或至少22bp，或至少23bp，或至少24bp、25bp、26bp 或至少27bp。“双链RNA片段”或“双链RNA区域”是指对应于(部分) 靶基因的双链RNA小实体。
通常，所述双链RNA优选为约17-1500bp，更优选约80-1000bp，最 优选约17-27bp或约80-250bp；如双链RNA区域约为17bp、18bp、19 bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、27bp、50bp、80bp、 100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500 bp、550bp、600bp、650bp、700bp、900bp、100bp、1100bp、1200bp、 1300bp、1400bp或1500bp。
所述双链RNA的长度上限可取决于i)昆虫摄取该dsRNA的需要， 以及ii)该dsRNA在细胞内部加工成指导RNAi的片段的需要。所选长度 还可受RNA合成方法以及向细胞递送RNA的模式的影响。优选地，本发 明方法中待使用的双链RNA的长度小于10,000bp，更优选1000bp或更 小，更优选500bp或更小，更优选300bp或更小，更优选100bp或更小。 对于任何给定的靶基因和昆虫来说，所述dsRNA进行有效抑制的最佳长 度可通过实验来确定。
所述双链RNA可以是完全或部分双链的。部分双链RNA可在双链部 分的一端或两端包含短的单链突出端，只要所述RNA仍能被昆虫摄取并 指导RNAi即可。所述双链RNA还可包含内部的非互补区。
本发明的方法包括向同一昆虫同时或依次提供两种或更多种不同的双 链RNA或RNA构建体，从而实现下调或抑制多种靶基因或者更有效地抑 制单种靶基因。
或者，通过提供命中多种靶序列的一种双链RNA来命中多个靶标， 并且多于一个拷贝的对应于靶基因的双链RNA片段的存在可更有效地抑 制单个靶标。因此，在本发明的一个实施方案中，所述双链RNA构建体 包含多个dsRNA区域，每个dsRNA区域的至少一条链包含与昆虫靶基因 的靶核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列。根据本发明，所述RNA 构建体中的dsRNA区域可以与同样或不同的靶基因互补，和/或所述 dsRNA区域可以与来自相同或不同昆虫物种的靶标互补。
术语“命中”是指所述dsRNA的至少一条链与靶基因或核苷酸序列互 补，并由此可与之结合。
在一个实施方案中，所述双链RNA区域包含与靶基因互补的核苷酸 序列的多个拷贝。或者，所述dsRNA命中同一靶基因的多于一种靶序列。 因此，本发明包括分离的双链RNA构建体，其包含与昆虫靶标的核苷酸 序列之至少一部分互补的核苷酸序列的至少两个拷贝。
在本文中，本发明的术语“多种(个)”意指至少2种(个)、至少3 种(个)、至少4种(个)、至少5种(个)、至少6种(个)等。
“另一靶基因”或“至少另一种靶基因”是指例如第二、第三或第四种靶 基因等。
本发明的方法开发并使用了命中多于一种上述靶标的dsRNA或者针 对上述不同靶标的不同dsRNA的组合。
因此，本发明涉及分离的双链RNA构建体，其包含如下表示的至少 一种核苷酸序列之RNA等价物的至少两个拷贝：
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158， 159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253， 255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575， 576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795， 797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041， 1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091， 1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577， 1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652， 1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700， 1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090， 2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366， 2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或者其长度为至少 17个碱基对、优选其长度为至少18、19、20或21个碱基对，更优选至少 22、23或24个碱基对之片段的RNA等价物的至少两个拷贝，。优选地， 所述双链RNA包含核苷酸序列SEQ ID NO 159或160的RNA等价物， 或者其长度为至少17、优选至少18、19、20或21、更优选至少22、23 或24个碱基对的片段。在另一实施方案中，本发明涉及分离的双链RNA 构建体，其包含核苷酸序列SEQ ID NO 159或160的RNA等价物的至少 两个拷贝。
因此，本发明延伸至本文所述的方法，其中所述dsRNA包含退火的互 补链，其中一条退火互补链包含与昆虫靶基因的靶核苷酸序列之至少一部 分互补并包含彼此独立选择的至少两种核苷酸序列的RNA等价物的核苷 酸序列。在一个实施方案中，所述dsRNA包含独立选自如下表示的序列 之至少两种、优选至少三种、四种或五种核苷酸序列的RNA等价物：
SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158， 159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253， 255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575， 576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795， 797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041， 1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091， 1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577， 1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652， 1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700， 1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090， 2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366， 2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或者其长度为至少 17个碱基对，优选至少18、19、20或21、更优选至少22、23或24个碱 基对的片段。
所述至少两种核苷酸序列可以来源于本文所述的靶基因。根据一个优 选的实施方案，所述dsRNA命中对昆虫生存、生长、发育或繁殖必需的 至少一种靶基因，并命中参与上文所述的致病性或感染性的至少一种基 因。或者，所述dsRNA命中同类的多种基因，例如所述dsRNA命中至少 两种必需基因或者至少两种参与同样细胞功能的基因。根据又一实施方 案，所述dsRNA命中至少两种靶基因，所述靶基因参与不同的细胞功能。 例如，所述dsRNA命中参与蛋白质合成(例如核糖体亚基)、细胞内蛋 白质转运、细胞核mRNA剪接或者参与表1A中所述功能之一的两种或更 多种基因。
优选地，本发明延伸至本文所述的方法，其中所述昆虫靶基因包含选 自以下的序列：
(i)与如下表示的任意序列具有至少75％一致性的序列：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188， 193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473， 478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596， 601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056， 1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097， 1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587， 1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662， 1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704， 1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095， 2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366， 2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，以及
(ii)包含以下任意序列之至少17个连续核苷酸的序列：SEQ ID NO 1、 3、5、7、 9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488， 493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605， 607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868， 873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071， 1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101， 1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597， 1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672， 1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至 2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102， 2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370， 2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列，
或者其中所述昆虫靶基因是包含以下任意序列之至少17个连续核苷 酸的基因的昆虫直系同源物：SEQ ID NO 49至158、275至472、533至 575、621至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、 2120至2338、2384至2460或其互补序列。
所述双链RNA中的dsRNA区域(或片段)可如下进行组合：
a)当组合那些靶向单一靶基因的多个dsRNA区域时，在RNA构建体中 可以以原始的顺序(即，该区域在靶基因中出现的顺序)对它们进行组合，
b)或者，可以不管所述片段的原始顺序，将它们随机地或有目的地以任 意顺序组合成双链RNA构建体，
c)或者，一种片段可以在所述dsRNA构建体中重复若干次，例如1～10 次，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或者
d)所述dsRNA区域(靶向一种或不同的靶基因)可以以有义或反义的方 向进行组合。
另外，所述待组合的靶基因可选自以下种类的一种或多种基因：
e)上述“必需的”基因或“致病性基因”包括对于一种或多种靶昆虫来说关键 性的基因，当其被沉默时导致致死的或严重的(例如，进食、繁殖、生长) 表型。选择强致死性靶基因导致有效的RNAi效果。在本发明的RNA构 建体中，靶向相同或不同的(非常有效的)致死基因的多个dsRNA区域 可以进行组合，以进一步增强RNAi作用在防治害虫中的效力、功效或速 度。
f)“弱”基因包括在本文所述的细胞途径之一中具有特别感兴趣的功能、但 当其被单独沉默时导致弱表型效果的靶基因。在本发明的RNA构建体中， 靶向一种或不同弱基因的多个dsRNA区域可以进行组合从而获得较强的 RNAi效果。
g)“昆虫特异性”基因包括在非昆虫生物中没有显著同源性对应物的基因， 其可以通过生物信息同源性检索来确定，例如通过BLAST检索。选择昆 虫特异性靶基因导致物种特异性的RNAi作用，而在非靶生物中没有作用 或没有显著的(不利)作用。
h)“保守基因”包括在靶生物和非靶生物之间(在氨基酸水平上)保守的 基因。为了降低对非靶物种的可能的作用，分析这些有效但保守的基因， 并选择这些保守基因可变区域的靶序列作为RNA构建体中的dsRNA区域 的靶标。此时，在核酸序列水平评估保守性。因此，这些可变区域包括保 守靶基因中最不保守的部分(核酸序列水平)。
i)“保守途径”基因包括参与相同生物学途径或细胞过程的基因，或者包括 在不同昆虫物种中具有相同功能的基因，其导致特异性且有力的RNAi作 用并更有效地防治昆虫；
j)或者，本发明的RNA构建体靶向来自不同生物学途径的多种基因，其 导致广泛的细胞RNAi作用并更有效地防治害虫。
根据本发明，所有双链RNA区域包含与本文所述任何靶基因之至少 一部分核苷酸序列互补的至少一条链。然而，如果一个双链RNA区域包 含与本文所述任一靶基因的核苷酸序列一部分互补的至少一条链，则另一 个双链RNA区域可包含与任何其它昆虫靶基因(包括已知靶基因)的一 部分互补的至少一条链。
根据本发明的另一实施方案，提供了本文所述的分离的双链RNA或 RNA构建体，其还包含至少一种另外的序列以及任选地包含接头。在一个 实施方案中，所述另一序列选自：(i)有利于大规模生产所述dsRNA构 建体的序列；(ii)提高或降低所述dsRNA稳定性的序列；(iii)允许结 合蛋白质或其它分子从而有利于昆虫摄取所述RNA构建体的序列；(iv) 适配子序列，其结合昆虫表面上或细胞质中的受体或分子，从而有利于昆 虫的摄取、胞吞和/或转胞吞；或者(v)催化dsRNA区域加工的其它序列。 在一个实施方案中，所述接头是条件性自切割RNA序列，优选pH敏感性 接头或疏水敏感性接头。在一个实施方案中，所述接头是内含子。
在一个实施方案中，所述双链RNA构建体的多个dsRNA区域通过一 个或多个接头进行连接。在另一实施方案中，所述接头存在于所述RNA 构建体中使得所述dsRNA区域与另一目的区域分隔的位点。本发明提供 了用于所述dsRNA构建体的不同类型接头。
在另一实施方案中，所述双链RNA构建体的多个dsRNA区域不使用 接头而进行连接。
在本发明的一个具体实施方案中，所述接头可用于隔开害虫中多个较 小的dsRNA区域。有利的是，在该情形中所述接头序列可以在特定的条 件下促使将长的dsRNA拆分为较小的dsRNA区域，这导致在这些条件下 释放单独的dsRNA区域，并且这些较小的dsRNA区域导致更有效地基因 沉默。适当的条件性自切割接头的实例是在高pH条件下自切割的RNA 序列。这些RNA序列的适当实例由Borda等(Nucleic Acids Res.2003 May 15；31(10)：2595-600)描述，该文献通过参考并入本文中。所述序列源自锤 头核酶HH16的催化核心。
在本发明的另一方面，接头定位于所述RNA构建体中使得所述 dsRNA区域与例如另一目的序列分隔的位点，所述另一目的序列优选地向 所述RNA构建体提供某种额外的功能。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的dsRNA构建体包含适配子 从而有利于昆虫摄取该dsRNA。设计所述适配子使之结合昆虫摄取的物 质。这样的物质可来源于昆虫或植物。适配子的一个具体实例是结合跨膜 蛋白(例如，昆虫的跨膜蛋白)的适配子。或者，所述适配子可以结合昆 虫摄取的(植物)代谢物或营养物。
或者，所述接头在内体中进行自切割。这在本发明的构建体通过胞吞 作用或转胞吞作用被昆虫摄取并因此在昆虫的内体中被区室化时可能是 有利的。所述内体可具有低的pH环境，导致所述接头被切割。
当通过细胞壁转运从一个细胞向另一细胞转移时，例如当穿过昆虫 害虫的细胞壁时，上述在疏水条件中自切割的接头对于本发明的dsRNA 构建体尤其有用。
内含子也可用作接头。本文使用的“内含子”可以是信使RNA的任何 非编码RNA序列。用于本发明构建体的适当的具体内含子序列为(1)富 含U(35-45％)；(2)平均长度为100bp(在约50和约500bp之间变化)， 可随机选择其碱基对或者可以基于已知的内含子序列；(3)在5’端以 -AG:GT-或-CG:GT-起始，和/或(4)在其3’端具有-AG:GC-或-AG:AA。
约1个碱基对至约10,000个碱基对的非互补RNA序列也可用作接 头。
不希望拘泥于任何特定的理论或机制，认为昆虫从其邻近的环境 摄取长的双链RNA。双链RNA被摄取进入肠道并转移至肠上皮细胞， 然后通过内源核酸内切酶的作用在细胞内加工成为短的双链RNA(称 为小干扰RNA(siRNA))。然后，所得的siRNA通过形成多组分的RNA 酶复合体(称为RISC或RNA干扰性沉默复合体)来介导RNAi。
为了实现在昆虫细胞内下调靶基因，加至细胞壁外部的双链RNA 可以是可被摄取进入细胞然后在细胞内加工成siRNA从而介导RNAi 的任何dsRNA或dsRNA构建体，或者加至细胞外部的RNA本身可以 是可被摄取进入细胞从而指导RNAi的siRNA。
siRNA通常是短的双链RNA，其长度范围为19～25个碱基对， 或20～24个碱基对。在优选的实施方案中，可使用对应于待下调靶基 因的siRNA，其具有19、20、21、22、23、24或25个碱基对，尤其是 21或22个碱基对。然而，本发明不意在限于这样的siRNA的用途。
siRNA可以在双链部分侧翼的一端或两端包含单链突出端。在一个 特别优选的实施方案中，所述siRNA可包含3’突出的核苷酸，优选两个3’ 突出的胸苷(dTdT)或尿苷(UU)。如果紧接所述dsRNA双链部分所包 含序列的上游靶基因序列是AA，则在siRNA中可包含3’TT或UU突出 端。这使得所述siRNA中的TT或UU突出端与靶基因杂交。尽管所述 siRNA的另一端也可包含3’TT或UU突出端，然而所述siRNA双链部分 所包含序列的下游靶序列中包含AA不是必需的。在本文中，RNA/DNA 嵌合体形式的siRNA也涵盖在内。这些嵌合体包括：例如，包含具有3’DNA 碱基突出端(例如，dTdT)的双链RNA的siRNA(如上所述)，以及其 中一个或多个RNA碱基(或核糖核苷酸)或者甚至整条链上所有核糖核 苷酸被替换为DNA碱基(或脱氧核糖核苷酸)的多核苷酸形式的双链 RNA。
所述dsRNA可由通过(非共价)碱基配对退火到一起的两条单独的 (有义和反义)RNA链形成。或者，所述dsRNA可具有折回的茎-环或发 夹结构，其中所述dsRNA的两条退火链是共价连接的。在该实施方案中， 所述dsRNA的有义链和反义链由部分自我互补的单个多核苷酸分子的不 同区域形成。如果所述dsRNA欲通过体内表达(例如在如下所述的宿主 细胞或生物中)或通过体外转录进行合成，则具有该结构的RNA是方便 的。除了不应当破坏所述分子的双链部分介导RNAi的能力以外，连接所 述两条RNA链的“环”的确切性质和序列对于本发明来说通常是不重要的。 用于RNAi中的“发夹”或“茎-环”RNA的特征通常是本领域已知的(参见， 例如CSIRO名下的WO 99/53050，其内容通过参考并入本文中)。在本 发明的另一些实施方案中，所述环结构可包含接头序列或如上所述的其它 序列。
所述双链RNA或构建体可以通过本身已知的方式进行制备。例如， 可以使用本领域公知的化学或酶促RNA合成技术在体外合成双链RNA。 在一个方法中，可以分别合成两条单独的RNA链，然后退火从而形成双 链。在另一实施方案中，可以在宿主细胞或生物中从适当的表达载体通过 细胞内表达来合成双链RNA或构建体。以下将进一步详细地讨论该方法。
昆虫接触的所述双链RNA的量要能够实现特异性下调所述一种或 多种靶基因。所述RNA可以以每个细胞递送至少一拷贝的量被引入。然 而，在某些实施方案中，较高剂量(例如，每个细胞至少5、10、100、500 或1000个拷贝)的双链RNA可得到更有效地抑制。对于任意给定的昆虫 基因靶标来说，可通过常规实验来确定有效抑制的最佳dsRNA量。
所述昆虫可以以允许昆虫直接摄取所述双链RNA的任何适当的方 式与所述双链RNA接触。例如，所述昆虫可以接触纯净或基本纯净形式 的所述双链RNA，例如含有所述dsRNA的水溶液。在该实施方案中，可 以仅用含有所述双链RNA的水溶液将所述昆虫“浸湿”。在另一实施方案 中，可通过用包含所述双链RNA的液体组合物向昆虫喷洒从而使所述昆 虫与所述双链RNA进行接触。
或者，所述双链RNA可以与所述昆虫的食物组分(如哺乳动物病原 性昆虫的食物组分)连接，从而增强该昆虫对所述dsRNA的摄取。
还可以将所述双链RNA掺入所述昆虫生长的培养基中，或者被该昆 虫侵扰的物品或基层中(或其上)，或者浸入对昆虫侵害敏感的基层或物 品中。
根据另一实施方案，所述dsRNA表达在细菌或真菌的细胞中，并且 所述细菌或真菌的细胞被所述昆虫摄取或摄食。
如实施例中举例说明的，可以改造细菌从而产生本发明的任何 dsRNA或dsRNA构建体。这些细菌可被昆虫摄食。一旦被摄取，所述 dsRNA可以起始RNAi应答，其导致靶mRNA降解并削弱或杀死摄食昆 虫。
因此，在更具体的实施方案中，所述双链RNA或RNA构建体通过 原核的(如细菌)或真核的(如酵母)宿主细胞或宿主生物来表达。根据 该实施方案，可以使用能够表达dsRNA或dsRNA构建体的任何细菌或酵 母细胞。所述细菌选自革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，例如但不限于 埃希氏菌属物种(Escherichia spp.)(例如，大肠杆菌(E.coli)、芽孢 杆菌属物种(Bacillus spp.)(例如，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis))、 根瘤菌属物种(Rhizobium spp.)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)、 乳球菌属物种(Lactococcus spp.)等。所述酵母可选自酵母属物种 (Saccharomyces spp.)等。
某些细菌与宿主植物具有非常紧密的相互作用，例如但不限于共生 的根瘤菌与豆科植物(Legminosea)(例如，大豆)。这样的重组细菌可 以与种子混合(例如，作为涂层)并用作土壤改良剂。
因此，本发明还包括包含本文所述的任何核苷酸序列或重组DNA构 建体的细胞。本发明还包括原核细胞(例如但不限于革兰氏阳性和革兰氏 阴性细菌细胞)和真核细胞(例如但不限于酵母细胞或植物细胞)。优选 地，所述细胞是细菌细胞或酵母细胞或藻类细胞。
在另一些实施方案中，所述昆虫可以与本文进一步描述的组合物接 触。除了所述dsRNA或DNA，所述组合物还可包含赋形剂、稀释剂或载 体。这样的组合物的优选特征在以下更详细地讨论。
或者，可以将产生dsRNA的细菌或酵母细胞直接喷洒到作物上。
因此，如上所述，本发明提供包含本发明的RNA构建体和/或DNA 构建体和/或表达构建体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞是细菌或酵母 的细胞，也可以是例如病毒。可以使用特异性感染昆虫的病毒(如杆状病 毒)。这确保了对哺乳动物(尤其是人类)的安全性，因为所述病毒不会 感染哺乳动物，所以不会发生不希望的RNAi作用。
优选地，所述细菌细胞或酵母细胞在用作生物杀虫剂前应被灭活， 例如当该试剂用于人类或其它哺乳动物可能接触的环境(如厨房)时。可 通过任何方法实现灭活，如通过热处理、苯酚或甲醛处理，或通过机械处 理。
在一个可替代的实施方案中，可利用灭活的病毒(如适当修饰的杆 状病毒)来递送本发明的dsRNA区域用于介导昆虫害虫的RNAi。
可能的应用包括集中的温室培育(例如从GMO角度而言意义较小 的作物)以及更广泛的农田作物(如大豆)。
该方法具有几个优势，例如：因为不存在可能的植物宿主切割 (dicing)的问题，所以它允许将大的dsRNA片段递送进入摄食害虫的肠 内腔；使用细菌作为杀虫剂不涉及产生转基因作物，尤其是对于某些难以 获得转基因变体的作物；存在广泛和灵活的应用，因为可以在同一块农田 上同时处理不同的作物和/或可以同时靶向不同的害虫，例如通过组合那些 产生不同dsRNA的不同细菌。
本发明的另一方面是本文公开的昆虫靶基因的靶核苷酸序列。所述 靶核苷酸序列对于设计本发明的dsRNA构建体特别重要。这些靶核苷酸 序列的长度优选至少17、优选至少18、19、20或21、更优选至少22、23 或24个核苷酸。优选靶核苷酸序列的非限制性实例在实施例中给出。
根据一个实施方案，本发明提供了编码本文所述的双链RNA或双链 RNA构建体的分离的核苷酸序列。
根据一个更具体的实施方案，本发明涉及由如下表示的任意序列组 成的分离的核酸序列：SEQ ID NO 49至158、275至472、533至575、621 至767、813至862、908至1040、1161至1571、1730至2039、2120至 2338、2384至2460，或者其至少17、优选至少18、19、20或21、更优选 至少22、23或24个核苷酸的片段。
本领域技术人员会认识到，可以找到这些靶基因的同源物，并且这 些同源物也用于本发明的方法。
如果蛋白质或核苷酸序列显示“显著”水平的序列相似性或更优选地 序列一致性，则它们可能是同源的。真正同源的序列通过从共同的祖先基 因趋异从而具有相关性。序列同源物可以有两种类型：(i)当同源物存在 于不同物种中时，它们被称为直系同源物(orthologue)。例如，小鼠和 人中的α-珠蛋白基因是直系同源物。(ii)旁系同源物是在一个物种内部 的同源基因，例如小鼠中的α-和β-珠蛋白基因是旁系同源物(paralogue)。
优选的同源物是包含与选自如下表示的序列具有至少约85％或87.5 ％，更优选约90％，更优选至少约95％以及最优选至少约99％一致性的 序列的基因：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168， 173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275 至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591， 596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至 862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061， 1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099， 1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597， 1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672， 1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039， 2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104， 2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至 2460，2461，2466，2471，2476或2481，或其互补序列。用于确定序列一致性 的方法是本领域常规的，其包括使用Blast软件和EMBOSS软件(The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)，Rice，P.Longden， I.and Bleasby，A.Trends in Genetics 16，(6)pp276-277)。本文使用的术语 “一致性”是指序列之间在核苷酸水平上的关系。通过在比较窗中对最优比 对的序列(例如，两条或更多)进行比较来确定“一致性百分比”，其中所 述比较窗中的序列部分与最优序列比对的参考序列相比可包含插入或缺 失。所述参考序列不包含插入或缺失。所述参考窗选自至少10个连续核苷 酸至约50、约100或者至约150个核苷酸，优选约50～150个核苷酸。然 后，通过测定所述窗中的序列之间一致的核苷酸数目并将该数目除以所述 窗中的核苷酸数并乘以100来计算“一致性百分比”。
另一些同源物是包含如下表示的任意序列的等位基因： SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160- 163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255， 257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576， 581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797， 799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046， 1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093， 1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582， 1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657， 1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702， 1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095， 2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368， 2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481。另一些优选的同源物是 与包含如下表示的任意序列的基因相比包含至少一种单核苷酸多态性 (SNP)的基因：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21， 23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，247， 249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，513，515，517，519， 521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783， 788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085，1087， 1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至1571， 1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637，1642， 1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694，1696， 1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075，2080， 2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354，2359， 2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或2481。
根据另一实施方案，本发明包括那些包含如下表示的任意核苷酸序 列的基因的昆虫直系同源物的靶基因：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193， 198，203，208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483， 488，493，498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605， 607，609，621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873， 878，883，888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075， 1077，1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105， 1107，1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612， 1617，1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684， 1686，1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050， 2055，2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至 2338，2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466， 2471，2476或2481。举例来说，直系同源物可包含如下表示的任意核苷酸 序列：SEQ ID NO 49至123、275至434、533至562、621至738、813 至852、908至1010、1161至1437、1730至1987、2120至2290以及2384 至2438，或其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核 苷酸的片段。表4中给出了包含本发明所述序列之一的至少17bp片段的 昆虫或蛛形纲直系同源物基因或序列的非限制性列表。
根据另一实施方案，本发明包括那些包含如下表示的任意核苷酸序 列的基因的线虫直系同源物的靶基因：1、3、 5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203， 208，215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493， 498，503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609， 621至767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883， 888，890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107， 1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617， 1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686， 1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055， 2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338， 2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471， 2476或248。举例来说，线虫直系同源物可包含如下表示的任意核苷酸序 列：SEQ ID NO 124至135、435至446、563至564、739至751、853、 854、1011至1025、1438至1473、1988至2001、2291至2298、2439或 2440，或者其至少17、18、19、20或21个核苷酸的片段。根据另一方面， 本发明因此包括本文所述的用于控制线虫在生物中生长的任何方法，或者 用于防止线虫侵害对线虫感染敏感的生物的任何方法，所述方法包括将线 虫细胞与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退火的互补链，其中一 条退火互补链包含与靶基因的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序 列，其包含如下表示的任意序列之至少17、18、19、20或21个核苷酸的 片段：SEQ ID NO 124至135、435至446、563至564、739至751、853、 854、1011至1025、1438至1473、1988至2001、2291至2298、2439或 2440，所述双链RNA被线虫摄取并因此控制生长或防止侵害。表5中给 出了包含本发明的序列之一的至少17bp片段的线虫直系同源物基因或序 列的非限制性列表。
根据另一实施方案，本发明包括那些包含如下表示的任意核苷酸序 列的基因的真菌直系同源物的靶基因：1、3、5、7、 9，11，13，15，17，19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208， 215，220，225，230，247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498， 503，513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至 767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888， 890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1071，1073，1075，1077，1079， 1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109， 1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622， 1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688， 1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060， 2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339， 2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476或 2481。举例来说，真菌直系同源物可包含如下表示的任意核苷酸序列：SEQ ID NO 136至158、447至472、565至575、752至767、855至862、1026 至1040、1475至1571、2002至2039、2299至2338、2441至2460，或者 其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸的片段。 根据另一方面，本发明因此包括本文所述的用于控制真菌在细胞或生物上 的生长、或者用于防止真菌侵害对真菌感染敏感的细胞或生物的任何方 法，该方法包括将真菌细胞与双链RNA接触，其中所述双链RNA包含退 火的互补链，其中一条退火互补链包含与靶基因的核苷酸序列之至少一部 分互补的核苷酸序列，其包含如下表示的任意序列之至少17、18、19、20 或21个核苷酸的片段：SEQ ID NO 136至158、447至472、565至575、 752至767、855至862、1026至1040、1475至1571、2002至2039、2299 至2338、2441至2460，所述双链RNA被真菌摄取并因此控制生长或防止 侵害。表6中给出了包含本发明的序列之一的至少17bp片段的真菌直系 同源物基因或序列的非限制性列表。
术语“调节序列”涉及较宽的范围，其指能够实现与其有效连接之序 列的表达的调节性核酸。
上述术语包括激活或增强核酸表达的启动子和核酸或其合成的融合 分子或衍生物，称为激活子或增强子。本文使用的术语“有效连接”是指在 “启动子”序列与目的核酸分子之间的功能性连接，使得所述“启动子”序列 能够起始核酸分子转录从而产生适当的dsRNA。
优选的调节序列是启动子，其可以是组成型或诱导型启动子。优选 的启动子是诱导型启动子，从而严格控制所述RNA分子的表达。优选可 通过使用适当的化学试剂(如IPTG)来诱导的启动子。或者，将编码所 述RNA分子的转基因置于强组成型启动子的控制下。优选地，所使用的 任何启动子将指导所述RNA强烈表达。所使用启动子的性质可部分地由 用于产生所述RNA的特定宿主细胞来决定。在一个实施方案中，所述调 节序列包含噬菌体启动子，如T7、T3、SV40或SP6启动子，最优选T7 启动子。在本发明的另一些实施方案中，使用用于表达RNA的另一些启 动子，其包括但不限于来自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合 酶III的启动子。也可以酌情使用来源于酵母或病毒基因的其它启动子。
在一个可替代的实施方案中，所述调节序列包含启动子，该启动子 选自公知的tac、trc和lac启动子。适用于细菌宿主的诱导型启动子包括 β-内酰胺酶启动子、大肠杆菌λ噬菌体PL和PR启动子以及大肠杆菌半乳 糖启动子、阿拉伯糖启动子和碱性磷酸酶启动子。因此，本发明还包括用 于得到本发明的任何RNA分子或RNA构建体的方法。该方法包括以下步 骤：在允许所述核酸或重组(DNA)构建体转录从而产生下调目的靶基因 的RNA(当所述宿主细胞被靶生物摄食时，或者当宿主细胞或从其来源的 提取物被靶生物摄取时)的条件下，将本发明的分离的核酸或重组(DNA) 构建体引入(例如，通过转化、转染或注射)本发明的宿主细胞中。
任选地，也可以将一种或多种转录终止序列或“终止子”引入本发明 的重组构建体中。术语“转录终止序列”包括转录单元末端的控制序列，其 发出初级转录物的3’加工和多聚腺苷酸化作用以及转录终止的信号。所述 转录终止序列用于防止转录的连读，从而所述RNA分子在宿主细胞中或 者由宿主细胞正确地产生。在一个实施方案中，所述终止子包括T7、T3、 SV40或SP6终止子，优选T7终止子。也可以酌情使用来源于酵母或病毒 基因的其它终止子。
可以将另外的调节元件(如转录或翻译的增强子)引入所述表达构 建体中。
本发明的重组构建体还可包含在特定细胞类型中维持和/或复制所 需的复制起点。一个实例是表达构建体需要作为细胞中的附加型遗传元件 (例如，质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持的情形。优选的复制起点包 括但不限于f1-ori和colE1 ori。
所述重组构建体任选地可包含选择性标记基因。本文使用的术语“选 择性标记基因”包括赋予细胞一种表型的任何基因，该基因在所述细胞中表 达从而有利于鉴定和/或选择用本发明的重组(表达)构建体转染或转化的 细胞。适当的选择性标记的实例包括抗氨苄青霉素的基因(Ampr)、抗 四环素的基因(Tcr)、抗卡那霉素的基因(Kanr)、抗膦丝菌素的基因 和抗氯霉素的基因(CAT)。另一些适当的标记基因提供了代谢性状，例 如manA。还可使用可见的标记基因，其包括例如β-葡糖醛酸酶(GUS)、 萤光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。
在本发明的另一些实施方案中，使用可用于表达dsRNA的另一些启 动子，其包括但不限于来自RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶 III、T7 RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶的启动子。这些启动子通常用于 体外产生dsRNA，然后将所述dsRNA包含在杀虫剂(antiinsecticidal agent)中，例如在杀虫剂液体、喷雾剂或粉末中。
因此，本发明还包括用于产生本发明的任何双链RNA或RNA构建 体的方法。该方法包括以下步骤：
a.将本发明的分离的核酸或重组DNA构建体与无细胞组分接触；或 者
b.将本发明的分离的核酸或重组DNA构建体引入(例如，通过转化、 转染或注射)细胞，
以上在允许所述核酸或重组DNA构建体转录从而产生所述dsRNA或 RNA构建体的条件下进行。
任选地，本发明的重组构建体中还可以引入一种或多种转录终止序 列。术语“转录终止序列”包括转录单元末端的控制序列，其发出初级转录 物的3’加工和多聚腺苷酸化作用以及转录终止的信号。可将另一些调节元 件(如转录或翻译的增强子)引入所述表达构建体。
本发明的重组构建体还可包括在特定细胞类型中维持和/或复制所 需的复制起点。一个实例是表达构建体需要作为细胞中的附加型遗传元件 (例如，质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持。优选的复制起点包括但不 限于f1-ori和colE1 ori。
所述重组构建体任选地可包含选择性标记基因。本文使用的术语“选 择性标记基因”包括赋予细胞以表型的任何基因，该基因在所述细胞中表达 从而有利于鉴定和/或选择经本发明的重组(表达)构建体转染或转化的细 胞。适当的选择性标记的实例包括抗氨苄青霉素的基因(Ampr)、抗四 环素的基因(Tcr)、抗卡那霉素的基因(Kanr)、抗膦丝菌素的基因和 抗氯霉素的基因(CAT)。另一些适当的标记基因提供了代谢性状，例如 manA。还可使用可见的标记基因，其包括例如β-葡糖醛酸酶(GUS)、 荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。
本发明涉及用于阻止昆虫在植物上生长或用于防止昆虫侵害植物的 方法。根据本发明的方法待处理的植物包括选自以下的植物：苜蓿、苹果、 杏、朝鲜蓟、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜、黑莓、蓝莓、嫩茎花 椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、蓖麻、胡萝卜、木薯、花椰菜、谷类、芹菜、 樱桃、柑桔、克莱门氏小柑橘(clemintine)、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、 茄子、菊苣、桉树、无花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、猕猴桃、莴 苣、韭、柠檬、莱姆酸橙、松树、玉米、芒果、瓜、小米、蘑菇、燕麦(nut aot)、菜秋葵、洋葱、橙、观赏性植物或花或树、番木瓜、欧芹、豌豆、 桃、花生、豌豆(peat)、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马 铃薯、南瓜、菊苣、萝卜、油菜籽、悬钩子、稻、黑麦、高粱、黄豆(soy)、 大豆(soybean)、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、红薯、橘子、 茶、烟草、番茄、藤本植物、西瓜、小麦、山药或西葫芦；优选马铃薯、 茄子、番茄、胡椒、烟草、醋栗、稻米或棉花植物)，或者种子或块茎(例 如，苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜、黑 莓、蓝莓、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、蓖麻、胡萝卜、木薯、花椰 菜、谷类、芹菜、樱桃、柑桔、克莱门氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄 瓜、茄子、菊苣、桉树、无花果、葡萄、葡萄柚、落花生、醋栗、猕猴桃、 莴苣、韭、柠檬、莱姆酸橙、松树、玉米、芒果、瓜、小米、蘑菇、燕麦 (nut aot)、菜秋葵、橙、观赏性植物或花或树、番木瓜、欧芹、豌豆、 桃、花生、豌豆(peat)、胡椒、柿子、菠萝、车前草、李子、石榴、马 铃薯、南瓜、菊苣、萝卜、油菜籽、悬钩子、稻、黑麦、高粱、大豆、大 豆、菠菜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、红薯、橘子、茶、烟草、番 茄、藤本植物、西瓜、小麦、山药或西葫芦。
所述靶生物摄取(优选摄食)靶向RNA的量要实现特异性下调一种 或多种靶基因。所述RNA可以以每个细胞递送至少一拷贝的量在宿主细 胞中表达。然而，在某些实施方案中，较高剂量(例如，每个靶生物细胞 至少5、10、100、500或1000个拷贝)的双链RNA可得到更有效的抑制。 对于任意给定的靶基因和靶生物来说，可通过常规实验来确定有效抑制的 靶标RNA分子的最佳量。
所述靶生物可以以任何适当的方式与表达所述RNA分子的宿主细 胞接触，从而允许靶生物摄食。优选地，表达所述dsRNA的宿主细胞可 以与所述靶生物的食物组分连接，从而增强该靶生物对所述dsRNA进行 摄取。还可以将表达所述dsRNA的宿主细胞引入所述靶生物生长的培养 基中，或者被害虫生物侵扰的物品或基层中(或其上)，或者浸入对害虫 生物侵害敏感的基层或物品中。
在可替代的实施方案中，可使用源自表达所述RNA分子的宿主细胞 的适当提取物来实现下调靶生物中的靶基因。此时，所述提取物可以通过 裂解表达所述RNA分子的宿主细胞的任何适当的方法来产生。例如，可 以使用如超声处理、弗氏压碎(French press)、冻融和溶菌酶处理的技 术(参见Sambrook and Russell-Molecular Cloning A laboratory manual- third edition以及表15-4中提供的参考文献)来制备宿主细胞粗提物(裂 解物)。可以酌情对该提取物进行进一步纯化，只要所述提取物介导靶基 因表达的靶向下调的能力不受不利影响即可。例如可以使用亲和纯化。向 所述提取物添加某些成分以防止RNA分子降解可能也是合适的。例如， 可以向源自表达RNA的宿主细胞的提取物添加RNA酶抑制剂。在一个实 例中，所述靶生物可以接触纯净或基本纯净形式的表达RNA的宿主细胞， 例如含有所述细胞提取物的水溶液。在该实施方案中，可以简单地用含有 所述宿主细胞提取物的水溶液将所述靶生物(尤其是害虫生物，如昆虫) “浸湿”。在另一实施方案中，可通过用包含所述细胞提取物的液体组合物 向所述靶生物喷洒从而使所述靶生物与所述表达RNA分子的宿主细胞进 行接触。
如果使用本发明的方法来特异性控制特定害虫的生长或侵害，则优 选宿主细胞中表达的RNA不与非害虫生物的基因具有任何显著的同源性， 尤其是不与非害虫生物的任何必需基因具有任何显著的同源性。因此，所 述非害虫生物通常是对害虫侵害敏感的生物，为此根据本发明的方法保护 所述非害虫生物免受所述害虫侵害。因此，例如，非害虫物种可包括植物 或哺乳动物物种。优选地，所述哺乳动物物种为人类。所述非靶物种还可 包括除了人以外的动物，其可以暴露于所述保护免受侵害的生物或基层。 实例包括鸟类(其可以以被保护的植物为食)以及牲畜和家畜(如猫、犬、 马、牛、鸡、猪、绵羊等)。在这种情况下，优选所述dsRNA与敏感生 物或非靶生物的任一基因的核酸序列一致性低于30％，更优选低于20％， 更优选低于10％，甚至更优选低于5％。序列一致性百分比应当在所述靶 标RNA的全长区域上来计算。如果可获得本发明待保护生物或任一非靶 生物的基因组序列数据，则可以使用标准生物信息学工具来相互校验与所 述靶标RNA的序列一致性。在一个实施方案中，所述RNA分子与非害虫 生物的基因之间不存在21个连续核苷酸上的序列一致性，即在这种情况 下，优选所述非害虫生物的基因组中不存在所述RNA的21个连续核苷酸。 在另一实施方案中，所述RNA与非害虫(敏感的)物种的任一核苷酸序 列之间在24个连续核苷酸上的序列一致性低于约10％或低于约12.5％。 特别地，可以特别注意非害虫物种的直向同源基因，因为所述害虫生物的 必需基因常可成为本发明的方法的靶标。因此，在一个实施方案中，所述 RNA分子与非害虫物种直向同源基因的对应核苷酸序列具有低于12.5％ 的序列一致性。
在另一实施方案中，本发明涉及用于控制昆虫生长和/或防止或降低 昆虫侵害的组合物，该组合物包含至少一种双链RNA，其中所述双链RNA 包含退火的互补链，其中一条退火互补链包含与昆虫靶基因的核苷酸序列 之至少一部分互补的核苷酸序列。本发明还涉及包含本文所述的至少一种 核苷酸序列或至少一种重组DNA构建体的组合物。本发明还涉及包含至 少一种细菌细胞或酵母细胞的组合物，所述细菌细胞或酵母细胞表达本文 所述的至少一种双链RNA或双链RNA构建体，或者表达本文所述的至少 一种核苷酸序列或重组DNA构建体。任选地，所述组合物还包含至少一 种适当的载体、赋形剂或稀释剂。所述靶基因可以是本文所述的任一靶基 因。优选地，所述昆虫靶基因是昆虫生存、生长、发育或繁殖所必需的。
另一方面，本发明涉及如上所述的组合物，其中所述昆虫靶基因包 含与选自如下表示的的任意序列具有至少75％，优选至少80％、85％、90 ％，更优选至少95％、98％或99％的一致性的序列： SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158， 159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249， 251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519， 521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783， 788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085， 1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至 1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637， 1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694， 1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075， 2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354， 2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486，
或其互补序列，或者其中所述昆虫靶基因是包含如下表示的任意序列之至 少17个连续核苷酸的基因的昆虫直系同源物：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17， 19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225， 230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508 至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至 767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888， 890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107， 1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617， 1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686， 1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055， 2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338， 2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471， 2476，2481或2486，或其互补序列。
本发明还涉及组合物，其包含至少一种双链RNA、至少一种双链 RNA构建体、至少一种核苷酸序列、至少一种重组DNA构建体和/或至少 一种表达本发明的dsRNA的宿主细胞(例如，细菌细胞或酵母)，或者 编码本发明的dsRNA的病毒，任选地还包含至少一种适当的载体、赋形 剂或稀释剂。
所述组合物可以采用向昆虫应用的任何适当的物理形式。例如，所 述组合物可以采用固体形式(如粉剂、丸剂或饵剂)、液体形式(如，喷 雾剂)或凝胶形式。
根据非常优选的实施方案，所述组合物采用适于昆虫摄食的形式。
所述组合物可包含另外的组分，所述组分作用于在组合物长期储存 期间稳定所述dsRNA和/或防止dsRNA降解。
所述组合物还可包含增强或促进昆虫摄取所述dsRNA的组分。这些 可包括例如通常促进RNA摄取进入细胞的化学试剂，例如lipofectamin(脂 转染胺)等。
所述组合物还可包含在长期储存期间保持所述宿主细胞生存力的组 分。
所述组合物可采取向昆虫、基层、细胞(例如，植物细胞)或者被 昆虫感染的或对昆虫侵害敏感的生物应用的任何适当的物理形式。
在一个实施方案中，所述组合物可以采用喷雾剂的形式。因此，使 用者可以直接用该组合物喷洒昆虫或基层。
因此，本发明涉及喷雾剂，其包含含有至少一种细菌细胞或酵母细 胞的组合物，所述细菌细胞或酵母细胞表达本文所述的至少一种双链RNA 或双链RNA构建体，或表达本文所述的至少一种核苷酸序列或重组DNA 构建体。更特别地，本发明涉及如上定义的喷雾剂，其中所述细菌细胞包 含如下表示的任意序列之至少一种序列：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17， 19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225， 230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508 至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至 767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888， 890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107， 1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617， 1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686， 1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055， 2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338， 2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471， 2476、2481或2486，或其至少17个连续核苷酸的片段。优选地，所述喷 雾剂包含至少一种如下表示的任意序列：SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17， 19，21，23，49至158，159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225， 230，240至247，249，251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508 至513，515，517，519，521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至 767，768，773，778，783，788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888， 890，892，894，896，908至1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077， 1079，1081，1083，1085，1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107， 1109，1111，1113，1161至1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617， 1622，1627，1632，1637，1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686， 1688，1690，1692，1694，1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055， 2060，2065，2070，2075，2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338， 2339，2344，2349，2354，2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471， 2476、2481或2486，或其至少17个连续核苷酸的片段。
本发明还涉及喷雾剂，其包含本文所述的至少一种组合物或者包含 至少一种宿主细胞，还包含至少一种佐剂以及任选地至少一种表面活性 剂。
杀虫剂的有效性可取决于所述喷雾剂应用的有效性。佐剂可以减少 或消除喷雾剂应用的许多问题，所述问题与杀虫剂的稳定性、溶解度、不 相容性、悬浮、泡沫形成、飘移、蒸发、挥发、降解、粘附、渗透、表面 张力和覆盖范围有关。将佐剂设计成实现特定的功能，包括润湿、分散 (spread)、粘着、降低蒸发、降低挥发、缓冲、乳化、散布(disperse)、 降低喷雾剂飘移以及减少泡沫形成。没有一种佐剂可以实现所有这些功 能，然而常常可以将不同的相容性佐剂进行组合来同时实现多种功能。这 些化学品(也叫作润湿剂和分散剂)从物理上改变了喷雾剂液滴的表面张 力。为了使杀虫剂正确地发挥其功能，喷雾剂液滴必须能够使叶子润湿并 在叶上均匀散开。表面活性剂扩大了杀虫剂覆盖的范围，从而增加了害虫 接触化学试剂的机会。将杀虫剂施加于蜡质或具毛的叶时，表面活性剂尤 为重要。不进行适当的润湿和分散，则喷雾剂液滴常常流失或者不能充分 地覆盖这些表面。然而，过多的表面活性剂可导致过度的流失或沉淀损失， 因此降低了杀虫剂的功效。杀虫剂配方常包含表面活性剂以改进该杀虫剂 活性成分的悬浮。这尤其用于可乳化浓缩物(EC)配方。
本文使用的术语“佐剂”指添加至杀虫剂产品或杀虫剂喷雾剂混合物 以改进喷雾箱中产品的混合和稳定性以及应用的任何非杀虫剂材料。本文 另外使用的术语“表面活性剂”指改变表表面张力的化学试剂。表面活性剂 可以影响液体的润湿和分散，并且可以改变杀虫剂在水中的分散、悬浮或 沉淀。存在非离子型表面活性剂(不带电荷)、阴离子表面活性剂(负电 荷)和阳离子表面活性剂(正电荷)。
在特别的实施方案中，所述喷雾剂中包含的所述宿主细胞是灭活的， 例如通过热灭活或者机械破坏(如本文所详细讨论地)来实现。
所述赋形剂的性质和所述组合物的物理形式可根据期望处理的基层 的性质而变化。例如，所述组合物可以是被刷至或喷洒至待处理的物品或 基层上或者压印至待处理的物品或基层中的液体，抑或是应用于待处理的 物品或基层的涂层或粉末。因此，在一个实施方案中，所述组合物在适当 的表面上采用涂层的形式，其粘附昆虫并最终被接触该涂层的昆虫所摄 取。
根据一个优选的实施方案，所述基层是意在针对昆虫害虫侵害而进 行处理的植物或作物。然后，所述组合物被昆虫内化或摄食，在其中该组 合物可以介导RNA干扰，从而防治昆虫。所述喷雾剂优选为加压的/气雾 状的喷雾剂或泵式喷雾剂。所述颗粒可以采取适当的大小，从而其粘附于 待处理的基层或者粘附于昆虫，例如粘附于昆虫和/或蛛形纲动物的外骨 骼，并可以从此处被吸收。
在一个实施方案中，所述组合物采用饵剂的形式。设计所述饵剂使 之引诱昆虫与所述组合物接触。一旦接触后，所述组合物被昆虫内化(例 如通过摄食)并介导RNAi从而杀死昆虫。所述饵剂可包含食物，如基于 蛋白质的食物，例如鱼粉。也可以使用硼酸作为饵剂。所述饵剂可取决于 作为靶标的物种。还可以使用引诱剂。所述引诱剂可以是信息素，例如雄 性或雌性信息素。作为一个实例，本发明可使用《昆虫信息素及其在害虫 管理中的应用(Insect Pheremones and their use in Pest Management)》 (Howse et al，Chapman and Hall，1998)中提及的信息素。所述引诱剂将 昆虫引诱至所述饵剂，并可以靶向特定昆虫或可以引诱所有昆虫。所述饵 剂可采用任何适当的形式，如固体、糊剂、丸剂或粉剂形式。
所述饵剂还可被昆虫携带回群体。然后，该饵剂可以作为群体中其 它成员的食物来源，因而对大量昆虫并且可能对整个昆虫害虫群体实现有 效控制。使用双链RNA或表达本发明的dsRNA的细菌是有利的，因为 RNAi介导的对害虫影响的延迟作用使饵剂被携带回群体，从而实现了在 接触昆虫方面的最大影响。
另外，与所述昆虫接触的组合物可残留在该昆虫的角质层上。当清 洁(一只昆虫清洁其自身或昆虫相互清洁)时，所述组合物可以被摄取， 并可以因此介导其在昆虫中的作用。这需要所述组合物足够稳定，从而即 使暴露于外界环境条件一段时间(例如，可以是几天)后，所述dsRNA 或表达dsRNA的宿主细胞仍保持完好并能够介导RNAi。
所述饵剂可以以适当的“外罩”或“陷阱”来提供。这样的外罩和陷阱 是市售的，并且现有的陷阱可适于包含本发明的组合物。本发明的范围包 括可吸引昆虫进入的任何外罩或陷阱。所述外罩或陷阱可以例如是盒形 的，并且可以例如以预成型状态提供或者可以由可折叠纸板形成。用于外 罩或陷阱的适当的材料包括塑料和纸板，尤其是瓦楞纸板(corrugated cardboard)。这样的外罩或陷阱的合适尺寸为例如7-15cm宽，15-20cm 长以及1-5cm高。所述陷阱的内表面可覆盖粘性物质，使得昆虫一旦进入 该陷阱则被限制移动。所述外罩或陷阱可包含适当的槽，所述槽的内部可 以在适当的位置装有所述饵剂。陷阱不同于外罩是因为昆虫在进入后不能 轻易地逃离陷阱，而外罩作为“饲喂处”，其向昆虫蛛形纲动物提供较佳的 环境，在其中它们可以进食并且感觉远离捕食者的安全感。
因此，本发明的另一方面提供了针对昆虫的外罩或陷阱，其包含本 发明的组合物，该组合物可以合并本文所述组合物的任何特征。
本发明的“组合物”可以是“组合试剂盒(kit-of-parts)”，其包含一 个容器中的所述双链RNA以及一个单独容器中的针对含有RNA的实体 (如dsRNA或dsRNA构建体、DNA构建体、表达构建体)的适当稀释 剂、赋形剂或载体；或者包含一个容器中的宿主细胞以及一个单独容器中 的针对该宿主细胞的适当稀释剂、赋形剂、载体或防腐剂。本发明还涉及 提供单独的双链RNA或宿主细胞，而没有任何其它组分。在这些实施方 案中，所述dsRNA或宿主细胞可以以浓缩形式来提供，如浓缩的水溶液。 它甚至可以以冷冻形式或者以冻干形式来提供。后者对于长期保藏来说可 能更稳定，并且可以在临使用前被解冻和/或用适当的稀释剂复原。
本发明还包括在基层上控制害虫生物的生长和/或防止敏感生物被 害虫生物侵害的方法，其包括向所述基层应用本文所述的有效量的任何组 合物和/或喷雾剂。
本发明还包括用于治疗和/或预防由靶生物导致的疾病或病症的方 法，其包括向有此治疗和/或预防需要的对象施用本文所述的组合物或喷雾 剂，其中由所述组合物或喷雾剂造成的所述靶生物中靶基因的表达下调对 于治疗和/或预防由靶生物导致的疾病是有效的。优选的靶生物是害虫，尤 其是本文详细描述的昆虫。
本发明还涉及本文所述的任何双链RNA、双链RNA构建体、核苷 酸序列、重组DNA构建体或组合物的医学用途。
昆虫和另一些节肢动物可通过其叮咬或螫刺而导致损伤甚至死亡。 在美国，每年由于蜜蜂和黄蜂螫伤而死亡的人比被蛇咬伤而死亡的人更 多。许多昆虫可以传播导致疾病的细菌和其它病原体。在每次国家间大规 模战争期间，由于昆虫传播的疾病而受伤或死去的人比由于子弹和炸弹而 受伤或死去的人更多。叮咬人和家畜的昆虫大多是具有如半翅目和某些 翅目昆虫中所见的刺吸式口器的昆虫。叮咬引起的主要不适是由昆虫注入 对象的酶所致。蜱和恙螨是不同种类的螨(蛛形纲)，其以动物血液为食。 蜱还可以传播导致疾病的病毒和另一些病原体，所述疾病包括莱姆病和落 矶山斑疹热。另一些种类的螨可引起人、犬、猫和其它动物的兽疥癣。半 翅目包括床虱、接吻虫(kissing bug)和猎蝽(assassin bug)，所有这些 昆虫具有用于刺入其宿主的喙。所有昆虫中最疼痛的叮咬是猎蝽的叮咬。 在中美州和南美洲，接吻虫参与导致查加斯病。某些蛾的毛虫可以“螫刺”。 双翅目是影响人类的最重要的昆虫目。叮咬飞虫(biting flies)包括多种蚊、 蚋、biting gnats、虻等。这些叮咬飞虫中有许多是疾病的传播者，如传播 非洲睡眠病的舌蝇。具有舐吸式口器的蝇(如家蝇)也传播导致伤寒热及 另一些疾病的细菌和其它病原体。蛆是这两种侵入动物活组织的飞虫的幼 虫。蚊子传播导致疟疾、黄热病、脑炎和另一些疾病的病原体。疟疾由原 生动物寄生物导致，所述原生动物寄生物的部分生活周期生活在按蚊属蚊 中，部分生活周期生活在人中。鼠疫也叫作腺鼠疫或黑死病，由感染大鼠 及另一些啮齿动物的细菌导致。该疾病针对人的主要转播者是东方具带病 蚤(Oriental rat flea)(蚤目)。许多蜜蜂、黄蜂和蚂蚁(膜翅目)可通 过其螫刺导致疼痛甚至死亡。死亡通常是对毒物的变态反应的结果。其它 重要的螫刺动物包括大黄蜂(hornets)、小黄蜂(yellow jackets)和胡蜂 (paper wasps)。非洲化蜜蜂(Africanized honey bee)或“杀人蜂”(“killer” bee)是人类驯化的蜜蜂品系。这两种品系在外观上几乎相同。然而，非洲 化蜜蜂品系更具攻击性，并且以更大的数目进行攻击。
在一个具体的实施方案中，所述组合物是分别用于治疗或预防人类 或动物的昆虫疾病或感染的药物组合物或兽用药组合物。这样的组合物包 含至少一种双链RNA或RNA构建体，或者编码所述双链RNA或RNA 构建体的核苷酸序列或重组DNA构建体(其中所述双链RNA包含退火的 互补链，其中一条退火互补链包含与导致所述疾病或感染的昆虫靶基因的 靶核苷酸序列互补的核苷酸序列)以及适用于药物用途的至少一种载体、 赋形剂或稀释剂。
所述组合物可以是适于局部使用的组合物，如应用在动物或人的皮 肤上，例如应用于皮肤的液体组合物(滴剂、凝胶剂、气雾剂)，或者通 过刷、或喷雾剂、乳剂、软膏等用于局部应用，或者作为透皮贴剂。
或者，所述昆虫dsRNA由细菌(例如，乳杆菌属)或真菌(例如酵 母属(Sacharomyces)物种)产生，其可以包含在食物中并作为抗御昆虫 感染的口服疫苗。
也可以制备成其它常规的药物剂型，包括片剂、胶囊、阴道栓剂、 透皮贴剂、栓剂等。所选形式取决于靶昆虫的性质以及期望治疗的疾病的 性质。
在一个具体的实施方案中，所述组合物可以是涂层、糊剂或粉剂， 其可以应用于基层从而保护所述基层免受昆虫和/或蛛形纲动物的侵害。在 该实施方案中，可使用所述组合物保护对昆虫侵害或昆虫造成的破坏敏感 的任何基层或物品，例如食物及其它易腐物品，以及基层(如木材)。白 蚁、粉蠹甲虫和木匠蚁可破坏房屋及其它木制品。散白蚁(subterranean termite)和台湾乳白蚁(Formosan termite)是美国南部和热带地区最严 重的房屋害虫。昆虫可以袭击任何收获的植物或动物产品。面象虫、谷类 象鼻虫、谷螟及其它储藏品害虫以储藏的粮食、谷类、宠物食品、巧克力 粉以及厨房食品柜中未得到保护的几乎所有其它食物为食。衣服蛀虫的幼 虫蛀蚀由动物产品(如毛皮、丝和羊毛)制成的衣服。地毯甲虫的幼虫蛀 蚀动物和植物产品，包括皮革、毛皮、棉花、储存的粮食甚至博物馆标本。 书虱和蠹虫是图书馆的害虫。这些昆虫蛀蚀书装订处的淀粉胶。侵入房屋 的其它昆虫包括蟑螂，其摄食几乎任何东西。蟑螂不被认为是疾病的特定 传播者，但是它们污染食物并带有令人不悦的气味。它们非常令人讨厌， 许多害虫防治公司致力于尝试对它们进行防治。在房屋、食品商店和饭店 中的最常见的蟑螂包括德国小蠊、美洲大蠊、东方蜚蠊和长须蜚蠊。
所述组合物的赋形剂和物理形式的性质可取决于期望处理的基层的 性质而有所变化。例如，所述组合物可以是被刷或喷洒至待处理的物品或 基层上的液体，或者压印至待处理的物品或基层中的液体，或者是应用至 待处理的物品或基层的涂层。
本发明还包括用于处理和/或防治昆虫对基层侵害的方法，其包括向 所述基层应用有效量的任何本文所述的组合物或喷雾剂。
本发明还包括用于治疗和/或预防昆虫疾病或病症的方法，其包括向 有此治疗和/或预防需要的对象施用本文所述的任何组合物或喷雾剂，所述 组合物或喷雾剂包含至少一种双链RNA或双链RNA构建体，其包含退火 的互补链，其中一条退火互补链包含与导致所述昆虫疾病或病症的昆虫的 昆虫靶基因核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列。根据一个更具体 的实施方案，所述待施用的组合物或喷雾剂包含和/或表达至少一种细菌细 胞或酵母细胞，所述细菌细胞或酵母细胞表达本文所述的至少一种双链 RNA或双链RNA构建体；或者包含和/或表达本文所述的至少一种核苷酸 序列或重组DNA构建体，所述RNA或核苷酸序列与导致所述昆虫疾病或 病症的昆虫的昆虫靶基因之至少一部分核苷酸序列是互补的。
在本发明的另一实施方案中，所述组合物用作植物或者植物的增殖 或繁殖材料(如种子)的杀虫剂。举例来说，所述组合物可通过向植物组 织喷洒或应用或者在幼苗出苗前后向土壤喷洒或混合而用作杀虫剂。
在另一实施方案中，本发明提供了用于处理和/或阻止昆虫生长和/ 或昆虫侵害植物或者植物的增殖或繁殖材料的方法，其包括向植物或者向 植物的增殖或繁殖材料应用有效量的任何本文所述的组合物或喷雾剂。
在另一实施方案中，本发明涉及任何双链RNA或RNA构建体、或 者编码所述双链RNA或RNA构建体的核苷酸序列或重组DNA构建体、 或者表达本发明的dsRNA的至少一种宿主细胞(例如，细菌或酵母)、 或者编码本文所述的dsRNA的病毒、或者包含上述的任何组合物或喷雾 剂的用途，其用于控制昆虫生长，用于防治昆虫侵害对昆虫感染敏感的植 物，或用于处理植物的昆虫感染。针对特定昆虫导致的昆虫感染而进行处 理的特定植物如前所述，并包含在所述用途中。
在一个更具体的实施方案中，本发明涉及包含至少一种宿主细胞， 或表达本发明的dsRNA的至少一种宿主细胞(例如，细菌或酵母)，或 编码本文所述的dsRNA的病毒，或者涉及包含上述的任何组合物的喷雾 剂的用途，该喷雾剂用于控制昆虫生长，用于防治昆虫侵害对昆虫感染敏 感的植物，或用于治疗植物的昆虫感染。优选地，所述宿主细胞包含如下 表示的任意序列之至少一种： SEQ ID NO 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，49至158， 159，160-163，168，173，178，183，188，193，198，203，208，215，220，225，230，240至247，249， 251，253，255，257，259，275至472，473，478，483，488，493，498，503，508至513，515，517，519， 521，533至575，576，581，586，591，596，601，603，605，607，609，621至767，768，773，778，783， 788，793，795，797，799，801，813至862，863，868，873，878，883，888，890，892，894，896，908至 1040，1041，1046，1051，1056，1061，1066至1071，1073，1075，1077，1079，1081，1083，1085， 1087，1089，1091，1093，1095，1097，1099，1101，1103，1105，1107，1109，1111，1113，1161至 1571，1572，1577，1582，1587，1592，1597，1602，1607，1612，1617，1622，1627，1632，1637， 1642，1647，1652，1657，1662，1667，1672，1677，1682，1684，1686，1688，1690，1692，1694， 1696，1698，1700，1702，1704，1730至2039，2040，2045，2050，2055，2060，2065，2070，2075， 2080，2085，2090，2095，2100，2102，2104，2106，2108，2120至2338，2339，2344，2349，2354， 2359，2364，2366，2368，2370，2372，2384至2460，2461，2466，2471，2476，2481或2486， 或其至少17个连续核苷酸的片段。
另一方面，本发明还提供了用于防止或保护植物免受害虫侵害的方 法组合和组合物。例如，一种方法提供了使用转基因方法与使用双链RNA 分子以及与一种或多种对靶标害虫具有毒性的Bt杀虫蛋白或化学的(有机 的)化合物的组合物的方法组合。另一方法提供了使用转基因方法与使用 在细菌或酵母中表达双链RNA分子以及在同样的细菌或酵母中或者在不 同的细菌或酵母中表达所述Bt杀虫蛋白的方法的组合。例如根据这些方 法，可以使用基于RNAi的方法或技术来靶向或杀死一种昆虫，而使用Bt 杀虫剂或化学的(有机的)杀虫剂可以靶向或杀死另一种昆虫。
因此，本发明还涉及本文所述的用于处理植物的任何组合物、喷雾 剂或方法，其中所述组合物包含表达所述RNA分子的细菌细胞或酵母， 并且还包含杀虫剂或者包含含有或表达杀虫剂的细菌细胞或酵母细胞(可 以与上面提及的是同一细菌或酵母细胞或者不同的细菌或酵母细胞)，所 述杀虫剂选自化学的(有机的)杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌 杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋 白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。优选地，所述苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白选自： Cry1、Cry3、TIC851、CryET170、Cry22、二元杀虫蛋白CryET33和 CryET34、二元杀虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀虫蛋白TIC100 和TIC101以及二元杀虫蛋白PS149B1。
所述喷雾剂可用于温室中或农田上。对于水基喷雾剂来说，包含细 菌的生物杀虫剂(例如，作为可乳化的混悬液)的通常应用率为25-100升 /公顷(10-40升/英亩)：每公顷包含约2.5-5升的配制产品(可乳化的混 悬液)，其中所述配制产品包含约25％(体积/体积)的‘细菌细胞’加75 ％(体积/体积)的‘其它成分’。细菌细胞的量以单位来计，例如一个单位 定义为1ml中109个细菌细胞。取决于每公顷的作物密度和每株植物的叶 面积，1升的配制产品包含0.001～10000个单位的细菌，优选地至少0.001、 0.003、0.005、0.007、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.3、0.5、0.7，更优 选至少1、3、5、7、10、30、50、70、100、300、500、700，或者更优选 至少1000、3000、5000、7000或者10000个单位的细菌。
例如，马铃薯作物植物的通常植物密度约为每平方米4.5株植物或 者每公顷45,000株植物(成排种植，排与排之间距离为75cm，每排的植 物之间距离为30cm)。因此，本发明涉及喷雾剂，其包含至少0.001、0.003、 0.005、0.007、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.3、0.5、0.7，更优选至少1、 3、5、7、10、30、50、70、100、300、500、700，或者更优选至少1000、 3000、5000、7000或者10000个单位的细菌，所述细菌表达本文所述的至 少一种dsRNA分子或dsRNA构建体。
本发明还涉及用于处理植物中昆虫感染的试剂盒，其包含先前所述 的至少一种双链RNA、或双链RNA构建体、或核苷酸序列、或重组DNA 构建体、或宿主细胞、或组合物或喷雾剂。所述试剂盒可以与适当的使用 说明书一起提供。该说明书可印刷在提供其它组分的合适的包装上，或者 可作为单独的实体来提供，例如可以采用纸页或小册子的形式。该说明书 可以卷起或折叠(例如在储存状态时)，然后可以将其展开从而指导所述 试剂盒其余组分的用途。
参考以下非限制性实施例将进一步理解本发明。
附图说明
图1-LD：使用以dsRNA处理的人工饲料喂食的马铃薯叶甲的存活。 使用以50μl局部应用的dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的饲料喂食 第二幼虫阶段的昆虫。7天后，将饲料替换为包含局部应用的dsRNA的新 鲜饲料。在第2、5、7、8、9和13天评估存活昆虫数。相对于第0天(测 定开始时)来计算存活幼虫的百分比。靶标LD006：(SEQ ID NO 178)； 靶标LD007(SEQ ID NO 183)；靶标LD010(SEQ ID NO 188)；靶标 LD011(SEQ ID NO 193)；靶标LD014(SEQ ID NO 198)；gfp dsRNA (SEQ ID NO 235)。
图2-LD：使用以dsRNA处理的人工饲料喂食的马铃薯叶甲的存活。 使用以50μl局部应用的dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的饲料喂食 第二幼虫阶段的昆虫。7天后，将饲料替换成仅为新鲜饲料。在第2、5、6、 7、8、9、12和14天评估存活昆虫数。相对于第0天(测定开始时)来计 算存活幼虫的百分比。靶标LD001(SEQ ID NO 163)；靶标LD002(SEQ ID NO 168)；靶标LD003(SEQ ID NO 173)；靶标LD015(SEQ ID NO 215)；靶标LD016(SEQ ID NO 220)；gfp dsRNA(SEQ ID NO 235)。
图3-LD：使用用dsRNA处理的马铃薯叶盘喂食的马铃薯叶甲幼虫 的平均重量。使用以20μl局部应用的dsRNA(靶标LD002或gfp)溶液 (10ng/μl)处理的叶盘喂食第二幼虫阶段的昆虫。2天后，每天将昆虫转 移至未经处理的叶子上。
图4-LD：使用以较短形式的靶标LD014 dsRNA和多联体dsRNA 处理的人工饲料喂食的马铃薯叶甲的存活。使用以50μl局部应用的 dsRNA(gfp或靶标)溶液处理的饲料喂食第二幼虫阶段的昆虫。在第3、 4、5、6和7天评估存活昆虫数。相对于第0天(测定开始时)来计算存 活幼虫的百分比。
图5-LD：使用以不同浓度的dsRNA(靶标LD002(a)、靶标LD007 (b)、靶标LD010(c)、靶标LD011(d)、靶标LD014(e)、靶标 LD015(f)、LD016(g)和靶标LD027(h))处理的人工饲料喂食的马 铃薯叶甲幼虫的存活。使用以50μl局部应用的dsRNA溶液处理的饲料喂 食第二幼虫阶段的昆虫。7天后，将饲料替换为包含局部应用的dsRNA的 新鲜饲料。以固定的时间间隔评估存活昆虫数。相对于第0天(测定开始 时)来计算存活幼虫的百分比。
图6-LD.表达dsRNA(靶标LD010)的大肠杆菌菌株对马铃薯叶甲 幼虫存活的随时间的影响。在基于人工饲料的分别的生物测定中检测两株 细菌菌株：(a)AB301-105(DE3)，pGBNJ003和pGN29的数据点表 示来自5个不同细菌克隆的平均死亡率值，(b)BL21(DE3)，pGBNJ003 和pGN29的数据点分别表示来自5个不同的细菌克隆以及一个单独的细 菌克隆的平均死亡率值。误差条线代表标准差。
图7-LD.表达dsRNA(靶标LD010)的大肠杆菌菌株的不同克隆(a) AB301-105(DE3)和(b)BL21(DE3)在侵害后12天对马铃薯叶甲幼 虫存活的影响。数据点是pGN29和pGBNJ003的每个克隆的平均死亡率 值。在该时间点，包含质粒pGBNJ003的AB301-105(DE3)克隆1显示 出CPB 100％死亡率。误差条线代表标准差。
图8-LD.表达dsRNA(靶标LD010)的大肠杆菌菌株的不同克隆(a) AB301-105(DE3)和(b)BL21(DE3)在侵害后7天对存活的马铃薯叶 甲幼虫的生长和发育的影响。基于表10的数据，数据点是每个克隆(一个 pGN29克隆和5个pGBNJ003克隆)的幼虫平均重量值的百分数。只用饲 料处理代表100％的正常幼虫重量。
图9-LD.喂食马铃薯植物的马铃薯叶甲幼虫在侵害后7天的存活， 所述马铃薯植物用产生双链RNA的细菌喷洒。计算存活幼虫数并表示为 死亡率百分数。所使用的细菌宿主菌株是RNA聚合酶III缺陷型菌株 AB301-105(DE3)。昆虫基因靶标是LD010。
图10-LD.喂食马铃薯植物的存活的马铃薯叶甲幼虫在侵害后11天 的生长/发育延迟，所述马铃薯植物用产生dsRNA的细菌喷洒。所使用的 细菌宿主菌株是RNA聚合酶III缺陷型菌株AB301-105(DE3)。数据图 表示正常幼虫重量的百分比，只用饲料的处理代表100％的正常幼虫重量。 昆虫基因靶标是LD010。误差条线代表标准差。
图11-LD.在侵害后7天，产生双链RNA的细菌对马铃薯叶甲幼虫 导致的马铃薯损伤的抗性。左图，用含有pGN29质粒的7个单位的细菌 AB301-105(DE3)喷洒植物；右图，用含有pGBNJ003质粒的7个单位 的细菌AB301-105(DE3)喷洒植物。一个单位定义为在600nm OD值为 1的1ml细菌悬液的等价物。昆虫基因靶标为LD010。
图12-LD.使用以dsRNA处理的马铃薯叶盘喂食的马铃薯叶甲成虫 的存活。开始两天使用以双链RNA处理的叶盘喂食年幼成虫，然后将其 置于未经处理的马铃薯叶上。定期评估存活昆虫数；活的并且看起来运动 正常的昆虫记录为可动的昆虫；活的但似乎有病且运动缓慢的昆虫记录为 濒死的昆虫——一旦将其背部朝下，这些昆虫不能翻身。靶标LD002(SEQ ID NO 168)；靶标LD010(SEQ ID NO 188)；靶标LD014(SEQ ID NO 198)；靶标LD016(SEQ ID NO 220)；gfp dsRNA(SEQ ID NO 235)。
图13-LD.细菌产生的靶标双链RNA对马铃薯叶甲幼虫的影响。将 OD为1的经热处理的表达dsRNA(SEQ ID NO 188)的50μl细菌 AB301-105(DE3)悬液局部应用于48孔板每个孔中的固体人工饲料上。 将L2阶段的CPB幼虫置于每个孔中。在第7天，对包含(a)含有表达 靶标10双链RNA的细菌的饲料，(b)含有空载体pGN29的细菌的饲料， 以及(c)只有饲料的平板中的CPB幼虫进行拍照。
图14-LD.在昆虫侵害前，将不同量的含有质粒pGBNJ003的灭活 大肠杆菌AB301-105(DE3)菌株局部应用于马铃薯叶对CPB幼虫存活和 生长的影响。用经处理的马铃薯喂食10只L1幼虫7天。喷洒在植物上的 细菌悬液的量为：0.25U、0.08U、0.025U、0.008U的靶标10以及0.25U 的pGN29(阴性对照；还包含Milli-Q水)。一个单位(U)定义为与在 600nm吸光度值为1的1ml培养物中等量的细菌量。将1.6ml总体积喷洒 至每株植物上。昆虫基因靶标为LD010。
图15-LD在侵害后7天，含有质粒pGBNJ003的灭活大肠杆菌 AB301-105(DE3)菌株对CPB幼虫导致的马铃薯损伤的抗性。(a)水， (b)包含pGN29的0.25U大肠杆菌AB301-105(DE3)，(c)含有pGBNJ003 的0.025U大肠杆菌AB301-105(DE3)，(d)含有pGBNJ003的0.008U 大肠杆菌AB301-105(DE3)。一个单位(U)定义为与在600nm吸光 度值为1的1ml培养物等量的细菌量。将1.6ml总体积喷洒至每株植物上。 昆虫基因靶标为LD010。
图1-PC：喂食靶标dsRNA对辣根猿叶甲幼虫的存活和生长的影响。 使用以25μl局部应用的0.1μg/μl dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的 油菜叶盘喂食新生幼虫。2天后，将所述昆虫移至新鲜的经dsRNA处理的 叶盘上。在第4天，针对每种处理收集来自一次重复实验的幼虫，并置于 含有未经处理的新鲜油菜叶的培养皿中。在第2、4、7、9和11天评估所 述昆虫。(a)使用以dsRNA处理的油菜叶盘喂食的墨西哥豆瓢虫幼虫的 存活。相对于第0天(测定开始时)来计算存活幼虫百分比，(b)使用 以dsRNA处理的油菜叶盘喂食的辣根猿叶甲幼虫的平均重量。一起称重 来自每次重复的昆虫并确定每只幼虫的平均重量。误差条线代表标准差。 靶标1：SEQ ID 473；靶标3：SEQ ID NO 478；靶标5：SEQ ID NO 483； 靶标10：SEQ ID NO 488；靶标14：SEQ ID 493；靶标16：SEQ ID NO 498； 靶标27：SEQ ID NO 503；gfp dsRNA：SEQ ID NO 235。
图2-PC：使用以不同浓度dsRNA(a)靶标PC010和(b)靶标PC027 处理的油菜叶盘喂食辣根猿叶甲的存活。将初生幼虫置于用25μl局部应 用的dsRNA溶液处理的油菜叶盘上。在第2天，将昆虫移至经处理的新 鲜叶盘上。在第4天(针对靶标PC010)和第5天(针对靶标PC027)， 将昆虫移至未经处理的叶子。在第2、4、7、8、9和11天(针对PC010) 和第2、5、8、9和12天(针对PC027)评估昆虫的存活数。相对于第0 天(测定开始时)来计算存活幼虫的百分比。
图3-PC：表达dsRNA(靶标PC010)的大肠杆菌AB301-105(DE3) 菌株对辣根猿叶甲幼虫存活的随时间的影响。每种处理的数据点表示来自 3次不同重复实验的平均死亡率值。误差条线表示标准差。靶标10：SEQ ID NO 488。
图1-EV：使用以dsRNA处理的豆叶盘喂食的墨西哥豆瓢虫的存活。 使用以25μl局部应用的1μg/μl dsRNA(靶标或gfp对照)溶液处理的豆 叶盘喂食初生幼虫。2天后，将所述昆虫移至经dsRNA处理的新鲜叶盘上。 在第4天，收集来自一种处理的幼虫，并置于含有未经处理的新鲜豆叶的 塑料盒中。在第2、4、6、8和10天评估昆虫的死亡率。相对于第0天(测 定开始时)来计算存活幼虫的百分比。靶标5：SEQ ID NO 576；靶标10： SEQ ID NO 586；靶标15：SEQ ID NO 591；靶标16：SEQ ID NO 596；gfp dsRNA：SEQ ID NO 235。
图2-EV：喂食靶标dsRNA对墨西哥豆瓢虫成虫的存活的影响，以 及对食荚菜豆叶的昆虫侵害的抗性。(a)使用以dsRNA处理的豆叶盘喂 食的墨西哥豆瓢虫成虫的存活。使用以75μl局部应用的0.1μg/μl dsRNA (靶标或gfp对照)溶液处理的豆叶盘喂食成虫。24小时后，将昆虫移至 经dsRNA处理的新鲜叶盘上。再过24小时后，收集来自一种处理的成虫， 并置于包含未经处理的新鲜的盆栽整株豆植物的塑料盒中。在第4、5、6、 7、8和11天评估昆虫的死亡率。相对于第0天(测定开始时)来计算存 活幼虫的百分比。靶标10：SEQ ID NO 586；靶标15：SEQ ID NO 591； 靶标16：SEQ ID NO 596；gfp dsRNA：SEQ ID NO 235。(b)dsRNA 对墨西哥豆瓢虫成虫所造成豆叶损伤的抗性。在第9天，目测检查包含来 自一种处理(参见(a))的昆虫的整株植物的叶损伤。(i)靶标10；(ii) 靶标15；(iii)靶标16；(iv)gfp dsRNA；(v)未处理。
图1-TC：使用以dsRNA(靶标14)处理的人工饲料喂食的赤拟谷 盗的存活。基于含有1mg dsRNA(靶标14)的面粉/奶混合物喂食初生幼 虫。饲料中的水(不含dsRNA)是对照。针对每种处理，进行4次重复实 验，每次重复实验使用10只1龄幼虫。在第6、17、31、45和60天评估 昆虫的存活的平均数百分比。相对于第0天(测定开始时)来计算存活幼 虫的百分比。误差条线代表标准差。靶标TC014：SEQ ID NO 878。
图1-MP：摄取dsRNA(靶标27)对桃蚜若虫存活的影响。将1龄 昆虫置于包含50μl液态饲料(含有2μg/μl dsRNA(靶标27或gfp dsRNA 对照))的喂料室中。针对每种处理，建立5个喂料室，其中每个喂料室 包括10只龄虫。在生物测定开始后的第8天评估存活数。误差条线代表标 准差。靶标MP027：SEQ ID NO 1061；gfp dsRNA：SEQ ID NO 235。
图1-NL：使用以dsRNA处理的液体人工饲料喂食的褐飞虱的存活。 在分别的生物测定中用补充有2mg/ml dsRNA靶标的溶液的饲料喂食第 一至第二幼虫阶段的若虫：(a)NL002、NL003、NL005、NL010；(b) NL009、NL016；(c)NL014、NL018；(d)NL013、NL015、NL021。 昆虫针对靶标的存活与喂食相同浓度的只有饲料和含有gfp dsRNA对照的 饲料进行比较。每两天将饲料替换为含有dsRNA的新鲜饲料。每天评估 存活昆虫数。
图2-NL：使用以不同浓度的靶标dsRNA(NL002)处理的液体人工 饲料喂食的褐飞虱的存活。用补充有1、0.2、0.08和0.04mg/ml(终浓度) NL002的饲料喂食第一至第二幼虫阶段的若虫。每两天将饲料替换为含有 dsRNA的新鲜饲料。每天评估存活昆虫数。
具体实施方式
实施例
实施例1：在高通量筛选中沉默秀丽隐杆线虫中的靶基因
在pGN9A载体(WO 01/88121)中相同的两个T7启动子和终止 子之间制备秀丽隐杆线虫基因组范围的文库，其在T7聚合酶表达的情 况下通过IPTG诱导而驱动有义和反义方向的表达。
以96孔板的形式，将此文库转化入AB301-105(DE3)细菌菌株。 为了在基因组范围进行筛选，用这些细菌细胞喂食核酸酶缺陷型秀丽隐 杆线虫nuc-1(e1392)株。
遵循下述步骤，在96孔板中用所述AB301-105(DE3)细菌菌株 中产生的dsRNA喂食秀丽隐杆线虫nuc-1(e1392)：将nuc-1卵移至不 同的板中，并使其在20℃同时孵化从而使L1代同步化。将包含IPTG 的100μL液体生长培养基以及含有秀丽隐杆线虫dsRNA文库的OD6001 的10μL AB301-105(DE3)细菌细胞培养物加至96孔板中，所述文库 中每个载体包含用于表达所述dsRNA的秀丽隐杆线虫基因组片段。将 4只同步化的L1线虫加至每个孔中，在25℃孵育至少4至5天。这些 实验一式四份进行。在所述筛选中使用了6种对照：
-pGN29＝阴性对照，野生型
-pGZ1＝unc-22＝颤搐表型
-pGZ18＝几丁质合酶＝胚胎致死
-pGZ25＝pos-1＝胚胎致死
-pGZ59＝bli-4D＝急性致死
-ACC＝乙酰辅酶A羧化酶＝急性致死
5天后，将用产生dsRNA的细菌喂食的秀丽隐杆线虫nuc-1 (e1392)与用空载体(pGN29)及其它对照喂食的线虫的表型进行比 较。针对亲代(P0)的(急性的或幼虫的)致死性、子一代(F1)的(胚 胎)致死性或者针对P0的生长阻滞对使用所述dsRNA喂食的线虫进行 筛选，具体如下：(i)P0的急性致死：L1不发育且死亡，该表型不产 生后代，所述孔看上去相当空；(ii)P0的(幼虫)致死：P0在比L1 更晚的阶段死亡，该表型也不产生后代。在孔中发现死亡的幼虫或死亡 的成虫；(iii)F1致死：L1发育至成虫阶段并仍然存活。该表型不产生 后代。这可能是由于不育、胚胎致死(孔底部有死亡的卵)、胚胎停滞 或幼虫停滞(最终致死)；(iv)生长停滞及生长阻滞/延迟：与包含正常 发育和正常后代数的孔进行比较。
对于表1A中所示的靶序列来说，所得结论为：在线虫(如秀丽 隐杆线虫)中由dsRNA介导的秀丽隐杆线虫靶基因沉默对线虫的生长 和存活具有重要影响。
在上述dsRNA沉默实验之后，在24孔板中以高通量形式对秀丽 隐杆线虫进行更细致的表型实验。按照如下步骤，用如上所述 AB301-105(DE3)细菌菌株中得到的dsRNA文库喂食24孔板中的秀 丽隐杆线虫nuc-1(e1392)，具体如下：将nuc-1卵移至不同的板中， 并使其在20℃同时孵化从而使L1代同步化。然后，将100只同步化的 L1线虫浸泡于500μL S完全喂食培养基(含有5μg/mL胆固醇、4μL/mL PEG和1mM IPTG)和包含秀丽隐杆线虫dsRNA文库的OD600为1的 500μL AB301-105(DE3)细菌细胞培养物的混合物中，所述文库中每 个载体包含用于表达所述dsRNA的秀丽隐杆线虫基因组片段。将被浸 泡的L1线虫在25℃滚动孵育2小时。
在离心并除去950μL上清液后，将所剩5μL经重悬的沉淀(包 含约10至15只线虫)移至24孔板每个孔的中部，加入一层琼脂LB 液体培养基。将所接种的板在25℃孵育2天。在成虫阶段，挑出单只成 虫并在25℃孵育2天用于检查其后代。在最初的24孔板上原位检查其 它线虫成虫。一式四份地进行这些实验。
用另一批线虫重复上述细致的表型筛选，唯一的区别在于第二批 线虫在20℃孵育3天。
对用秀丽隐杆线虫dsRNA喂食的线虫之表型以及用所述空载体 喂食的秀丽隐杆线虫nuc-1(e1392)之表型进行比较。
基于该实验，所得结论为：如表1A中所示秀丽隐杆线虫靶基因 的沉默对于线虫的生长和存活具有重要影响，所述靶基因对于线虫的存 活是必需的。因此，这些基因是利用dsRNA介导的基因沉默来防治(杀 死或阻止其生长)线虫的理想靶基因。因此，本发明包括上述秀丽隐杆 线虫靶基因的线虫直向同源物用于防治线虫侵害(例如线虫对植物的侵 害)的用途。
实施例2：鉴定黑腹果蝇的直系同源物
如实施例1中所述，鉴定了许多秀丽隐杆线虫的致死序列，并且 所述致死序列可用于鉴定其它种属中的直向同源物。例如，所述秀丽隐 杆线虫致死序列可用于鉴定黑腹果蝇的直向同源序列。也就是说，可使 用每种秀丽隐杆线虫序列在公共数据库(例如GenBank)中检索黑腹果 蝇的直向同源物。选择具有高度序列同源性的(E值优选小于或等于 1E-30)可能的黑腹果蝇直向同源物，所述序列是相互blast的最佳命中 结果，后者指来自不同生物(例如秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇)的序列相 互为最佳blast命中结果。例如，使用BLAST将来自秀丽隐杆线虫的 序列C与黑腹果蝇的序列D进行比对。如果黑腹果蝇序列D是序列C 的最佳命中结果，并且与秀丽隐杆线虫的所有序列进行比对时序列C也 是D的最佳命中结果，那么D和C是相互最佳命中结果。该标准常用 于定义直系同源物，意指不同物种中具有相似功能的相似序列。所鉴定 的黑腹果蝇序列示于表1A。
实施例3：马铃薯叶甲(Colorado potato beetle，CPB)
A.克隆来自马铃薯叶甲的部分基因序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从4个不 同幼虫阶段的马铃薯叶甲(科罗拉多甲虫；来源：Jeroen van Schaik， Entocare CV Biologische Gewasbescherming，Postbus 162，6700 AD Wageningen，the Netherlands)分离高质量的完整RNA。按照制造商 的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去该RNA制备 物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售试剂盒 (SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen，Rockville， Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含LD001、LD002、LD003、LD006、LD007、LD010、 LD011、LD014、LD015、LD016、LC018和LD027基因一部分的cDNA 序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold(Cat.Nr. N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-LD中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列，其显示了包 括引物序列和所得cDNA序列的马铃薯叶甲靶基因。使用这些引物进行 各自的PCR反应，其使用以下条件：95℃ 10分钟，然后是40个循环 的95℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼 脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR8/GW/topo载体(Cat.Nr. K2500 20，Invitrogen)并测序。表2-LD中给出了用各自SEQ ID NO表 示的所得PCR产物的序列，并且其为部分序列。表3-LD中给出了用各 自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序列，其中读码框的起点在括号 中指明。
B.产生马铃薯叶甲基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个单独的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-LD中给出了用于扩增每种靶序列有义模板 的各引物的序列。所述PCR反应的条件如下：95℃ 4分钟，然后是35 个循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。 在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7 反向引物得到反义T7模板。表8-LD中给出了用于扩增每种靶基因反 义模板的各引物的序列。在琼脂糖凝胶上分析所得的PCR产物，并通 过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106， Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的 T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA 酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-LD中给出了每种靶基 因所得dsRNA的有义链。表8-LD显示了用于制备马铃薯叶甲靶序列 的dsRNA片段的序列和多联体序列，其包括引物序列。
C.针对马铃薯叶甲的活性，使用人工饲料对dsRNA靶标进行筛选
如下制备马铃薯叶甲的人工饲料(修改自Gelman et al.，2001，J. Ins.Sc.，vol.1，no.7，1-10)：对水和琼脂进行高压灭菌，当温度降至55℃ 时加入其余的成分(如下文表A中所示)。在此温度下，均匀混合所述 成分，然后将所述饲料以每孔1ml的量等分至24孔板(Nunc)。使所 述人工饲料在室温下冷却而固化。饲料在4℃最多保存3周。
表A：人工饲料的成分
成分 1L体积 水 768ml 琼脂 14g 燕麦片 40g 圆酵母 60g 水解乳白蛋白 30g 酪蛋白 10g 果糖 20g Wesson盐混合物 4g 番茄果粉末 12.5g 土豆叶粉末 25g β-谷甾醇 1g 山梨酸 0.8g 羟苯甲酸甲酯 0.8g Vanderzant维生素混合物 12g 硫酸新霉素 0.2g 金霉素 0.130g 利福平 0.130g 氯霉素 0.130g 制霉菌素 0.050g 大豆油 2ml 小麦胚芽油 2ml
将浓度为1mg/ml的50μl dsRNA溶液局部应用至多孔板孔内的 固体人工饲料上。所述饲料在层流柜(laminair flow cabin)中进行干 燥。针对每种处理，测试24只马铃薯叶甲幼虫(第2阶段)，其中每孔 两只昆虫。所述板在昆虫饲养室中保存，其条件为25±2℃，60％相对 湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。每1、2或3天评估所述甲虫的存 活情况。7天后，对于靶标LD006、LD007、LD010、LD011和LD014， 用包含相同浓度(1mg/ml)的局部应用dsRNA的新鲜饲料替换所述饲 料；对于LD001、LD002、LD003、LD015和LD016，仅用新鲜饲料替 换所述饲料。将所述dsRNA靶标与只有饲料或包含局部应用dsRNA的 饲料(对应于GFP(green fluorescent protein，绿色荧光蛋白)编码序 列(SEQ ID NO 235)片段)进行比较。
如两个独立的生物测定中所显示的，用含有完整裸dsRNA的人工 饲料喂食马铃薯叶甲幼虫导致幼虫死亡率显著增加(图1LD-2LD)。
7至14天后，所有被测的dsRNA最终导致100％死亡率。在整个 所述的生物测定中，含有或不含GFP dsRNA的饲料使所述昆虫几乎没 有或没有死亡。
通常，在所观察的所有测定中，用含有或不含dsRNA的饲料喂食 的CPB第二阶段幼虫正常喂食2天并蜕皮成为第3阶段幼虫。在该新 的幼虫阶段，观察到CPB的进食显著减少或完全停止，导致死亡率提 高。
D.针对马铃薯叶甲的活性，使用马铃薯叶盘对dsRNA靶标进行生物测 定
应用了使用马铃薯叶材料而非人工饲料作为CPB食物来源的可 替代的生物测定法。使用合适尺寸的穿孔器从2至3周龄的马铃薯植物 叶子切下直径约1.1cm(或0.95cm2)的叶盘。通过将10ng/μl的20μl 靶标LD002 dsRNA或对照gfp dsRNA溶液施加到近轴叶表面来制备经 处理的叶盘。使叶盘干燥并分别单独置于24孔板(Nunc)的24个孔中。 将单只第2幼虫阶段的CPB置于每个孔中，然后用棉纸和多孔板的塑 料盖将其覆盖。将包含所述昆虫和叶盘的板置于昆虫室中，其条件为 28℃以及16小时光照/8小时黑暗的光周期。使所述昆虫进食叶盘2天， 之后将所述昆虫移至包含经处理的新鲜叶盘的新平板中。之后，每天将 所述昆虫移至包含未处理叶盘的平板，直至第7天。记录昆虫死亡率和 重量。
用包含表面施加的完整裸dsRNA(靶标LD002)的马铃薯叶盘喂 食马铃薯叶甲幼虫导致幼虫死亡率显著增加(即在第7天所有昆虫死亡； 100％死亡率)，而对照gfp dsRNA对CPB的存活没有影响。靶标LD002 dsRNA在2至3天后严重影响幼虫的生长，而用相同浓度gfp dsRNA 喂食的幼虫发育正常(图3-LD)。
E.针对马铃薯叶甲的活性，使用人工饲料对较短形式的dsRNA进行筛 选
本实施例举例说明：较短的(60或100bp)dsRNA片段本身或 作为多联体构建体足以造成对马铃薯叶甲的毒性。
选择LD014用于该实施例，已知其是在马铃薯叶甲中诱导致死性 的靶标。该基因编码V-ATP酶亚基E(SEQ ID NO 15)。
还选择了100个碱基对的片段LD014_F1(在SEQ ID NO 15的 195-294位，SEQ ID NO 159)和60个碱基对的片段LD014_F2(在SEQ ID NO 15的235-294位，SEQ ID NO 160)。也参见表7-LD。
设计了两个300碱基对的多联体，LD014_C1和LD014_C2(SEQ ID NO 161和SEQ ID NO 162)。LD014_C1包含上述100个碱基对片段 (SEQ ID NO 159)的3个重复，LD014_C2包含上述60个碱基对片段 (SEQ ID NO 160)的5个重复。也参见表7-LD。
合成片段LD014_F1和LD014_F2作为有义和反义引物。在进行 克隆之前，将这些引物退火从而得到双链DNA分子。在所述引物的5’ 和3’端分别包含XbaI和XmaI限制性位点，以便进行克隆。
所述多联体为300个碱基对的合成基因。在该合成DNA片段的5’ 和3’端分别包含XbaI和XmaI限制性位点，以便进行克隆。
用XbaI和XmaI消化4种DNA分子，即两种单一单元(LD014_F1 和LD014_F2)和两种多联体(LD014_C1和LD014_C2)，并将其分别 亚克隆至被XbaI和XmaI消化从而线性化的pBluescriptII SK+中，分 别得到重组质粒p1、p2、p3和p4。
双链RNA的产生：使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr.P1700，Promega)合成dsRNA。在两个独立的PCR反 应中得到最初两种独立的单个5’T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应 包含与T7启动子方向不同的靶序列。对于LD014_F1来说，使用特异 性T7正向引物oGBM159和特异性反向引物oGBM164(本文分别用 SEQ ID NO 204和SEQ ID NO205表示)在PCR反应中使用下述条件 产生有义T7模板：95℃ 4分钟，然后是35个循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。使用特异性正向引物 oGBM163和特异性T7反向引物oGBM160(本文分别用SEQ ID NO 206 和SEQ ID NO 207表示)在使用与上述相同条件的PCR反应中产生反 义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试 剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以及 NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向 模板混合从而进行转录，将所得到的RNA链退火、进行DNA酶和RNA 酶处理并利用醋酸钠进行纯化。所得dsRNA的有义链在本文中表示为 SEQ ID NO 203。
对于LD014_F2来说，使用特异性T7正向引物oGBM161和特异 性反向引物oGBM166(本文分别用SEQ ID NO 209和SEQ ID NO 210 表示)在PCR反应中使用下述条件产生有义T7模板：95℃ 4分钟，然 后是35个循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10 分钟。使用特异性正向引物oGBM165和特异性T7反向引物oGBM162 (此处分别用SEQ ID NO 211和SEQ ID NO 212表示)在使用与上述 相同条件的PCR反应中产生反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所得 PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat. Nr.28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将 所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得到的RNA链 退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。所得dsRNA 的有义链在本文中表示为SEQ ID NO 208。
同样地，对于所述多联体来说，在两个独立的PCR反应中得到最 初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7 启动子方向不同的靶序列。用XbaI或XmaI对包含LD014_C1和 LD014_C2的所述重组质粒p3和p4进行线性化，对每种构建体的两种 线性片段进行纯化，并用作体外转录测定的模板，所述体外转录使用所 述克隆位点侧翼的T7启动子。使用T7RiboMAXTM Express RNAi System(Promega)通过体外转录制备双链RNA。所得dsRNA(针对 LD014_C1和LD014_C2)的有义链在本文中分别表示为SEQ ID NO 213和214。
如图4-LD所示，靶标LD014的较短序列和多联体能够在马铃薯 叶甲中诱导致死性。
F.针对马铃薯叶甲的活性，使用人工饲料对不同浓度的dsRNA进行筛 选
将50μl dsRNA溶液局部应用至24孔板(Nunc)孔内的固体人 工饲料上，所述dsRNA溶液采用从1μg/μl(对于靶标LD027来说从 0.1μg/μl)降至0.01ng/μl的一系列十倍浓度。所述饲料在层流柜中进 行干燥。针对每种处理，测试24只马铃薯叶甲幼虫(第2阶段)，其中 每孔两只昆虫。所述板在昆虫饲养室中保存，其条件为25±2℃，60％ 相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。以固定的时间间隔(最多 14天)来评估所述甲虫的存活情况。7天后，用包含相同浓度的局部应 用dsRNA的新鲜饲料替换所述饲料。将所述dsRNA靶标与只有饲料时 进行比较。
如图5-LD所示，，用含有针对不同靶标的完整裸dsRNA(浓度低 至0.1～10ng dsRNA/μl)的人工饲料喂食马铃薯叶甲幼虫导致高幼虫 死亡率。
G.将CPB基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具 有活性的双链RNA
尽管可使用任何有效的细菌启动子，然而将对应于CPB基因靶标 的DNA片段克隆进用于在细菌宿主中表达双链RNA的载体中(参见 WO 00/01846)。
表8-LD提供了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模 板是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR 反应，其使用以下条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、 55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析 所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参 考WO00188121A1)并测序。表8-LD中给出了对应于各自序列的所得 PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称作pGBNJ003。
表8-LD中提供了用于扩增靶基因片段LD010的特异性引物的序 列(正向引物SEQ ID NO 191和反向引物SEQ ID NO 190)。所使用的 模板是含有LD010序列(SEQ ID NO 11)的pCR8/GW/topo载体。使 用所述引物进行PCR反应，其采用以下条件：98℃ 5分钟，然后是30 个循环的98℃ 10秒、55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。 在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化 的pGNA49A载体中(参考WO00188121A1)并测序。表8-LD中给出 了对应于SEQ ID NO 188的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组 载体称为pGBNJ003。
H.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的靶标LD010的双链 RNA，该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株 (AB301-105(DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21 (DE3))进行比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGBNJ003的双链 RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合 酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的侧翼 是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
I.针对马铃薯叶甲，对表达dsRNA靶标LD010的大肠杆菌进行实验室 试验检测
使用两种生物测定方法来检测针对马铃薯叶甲幼虫的大肠杆菌所 产生的双链RNA：(1)基于人工饲料的生物测定，和(2)基于植物的 生物测定。
基于人工饲料的生物测定
如前面实施例3C中所述制备马铃薯叶甲的人工饲料。将半毫升 饲料分配至48孔多孔测试板(Nunc)的每个孔中。对于每种处理来说， 将表达dsRNA的OD为1的50μl热处理细菌悬液(其等同于约5×107 个细菌细胞)局部应用至孔中的固体饲料上，并使该板在层流箱中干燥。 针对每种处理，检测48只第2阶段的马铃薯叶甲幼虫，其中每个含有 饲料和细菌的孔中包含一只马铃薯叶甲幼虫。板的每一行(即8个孔) 作为一个重复。将所述板保存在昆虫饲养室中，其条件为25±2℃，60 ±5％相对湿度，16:8小时的光照：黑暗光周期。每4天后，将所述甲虫 移至包含局部应用细菌的新鲜饲料。昆虫侵害后每1或3天评估所述甲 虫的存活情况。对于存活的昆虫，在侵害后第7天记录幼虫的重量从而 记录其生长和发育。
对于RNA酶III缺失的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌株来说， 在生物测定中测试含有质粒pGBNJ003及含有空质粒pGN29(参照WO 00/188121A1)的细菌对CPB的毒性。包含pGBNJ003质粒的细菌显示 昆虫死亡率随时间而明显增加，然而观察到pGN29和只有饲料的对照 几乎没有或没有死亡(图6a-LD和7a-LD)。在喂食含表达dsRNA靶标 LD010的细菌的人工饲料后第7天，存活的马铃薯叶甲幼虫的生长严重 阻滞(表10-LD，图8a-LD，图13-LD)。
对于大肠杆菌BL21(DE3)菌株来说，针对马铃薯叶甲幼虫检测 包含质粒pGBNJ003的细菌和包含空载体pGN29的细菌。用含BL21 (DE3)细菌的饲料喂食的幼虫中观察到与RNA酶III缺失菌株 AB301-105(DE3)类似的有害影响(图6b-LD和7b-LD)。然而，对 于5个克隆的存活数来说，BL21(DE3)要高于AB301-105(DE3)； 在第12天，该菌株的平均死亡率值比RNA酶III缺失菌株约低25％。 另外，用含有表达dsRNA(对应于靶标LD010)的BL21(DE3)的饲 料喂食的存活昆虫的平均重量显著降低(表10-LD，图8b-LD)。
用包含两细菌菌株(含有质粒pGBNJ003)之一的饲料喂食的CPB 幼虫的生长和发育延迟直接与进食抑制有关，因为与包含空载体pGN29 的细菌或只有饲料的平板相比，从第4天起所更换平板的孔中无可见幼 虫粪便。该观察类似于用局部应用至人工饲料的体外转录的双链RNA 喂食CPB的情形(参见实施例3D)；这里，从处理饲料第2天起发生 停止进食。
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的悬液喷洒整株马铃薯植物，然后用所 述植物喂食CPB幼虫。“V系”品种的马铃薯植物(Wageningen University)在具有下述条件的植物培养室中从块茎生长至8-12片展开 叶的阶段：25±2℃，60％相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。通 过将500ml塑料瓶倒置于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于 盆内泥土中，在瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少 内部凝结(condensation)并防止幼虫逃脱。将15只L1阶段的马铃薯 叶甲幼虫放置在罩中的每株经处理植物上。用包含pGBNJ003质粒(克 隆1；图7a-LD)或pGN29质粒(克隆1；参见图7a-LD)的大肠杆菌 AB301-105(DE3)的悬液处理植物。向植物应用不同量的细菌：66、 22和7个单位，其中一个单位定义为：在600nm波长下吸光度值为1 的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用喷雾器将总体积 1.6ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用一株植物。计数存活 昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGBNJ003的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。当细菌细胞悬液的量稀释9倍时，死亡率计数保持不变(图 9-LD)。用包含pGBNJ003载体的细菌喷洒的植物上第11天的存活幼 虫平均重量比pGN29的约低10倍(图10-LD)。与用包含空载体pGN29 的细菌喷洒的马铃薯植物相比，CPB幼虫对用包含pGBNJ003质粒的 细菌喷洒的马铃薯植物造成的进食损害显著降低(图11-LD)。
这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺失的细菌表达系统中产 生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫具有毒性，所述毒性表 现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验 还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损 害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA的细 菌组成。
J.针对马铃薯叶甲，测试表达dsRNA靶标LD010的大肠杆菌培养物的 多种悬液密度
细菌培养物的制备和处理描述于实施例3J中。将表达靶标LD010 双链RNA的大肠杆菌RNA酶III缺失菌株AB301-105(DE3)培养物 的三倍系列稀释物(从0.25个单位等价物开始)施加至8-12片展开叶 阶段的马铃薯植物变种“Bintje”。将10只马铃薯叶甲L1幼虫置于经处 理的植物上，每种处理一株植物。在第7天(即昆虫侵害后7天)对昆 虫的死亡率和生长阻滞打分。
如图14-LD所示，在用经处理的马铃薯植物喂食昆虫1周后记录 到高CPB幼虫死亡率(90～100％)，所述处理是通过细密喷洒浓度为 0.25、0.08和0.025细菌单位的大肠杆菌热灭活培养物进行局部应用， 所述大肠杆菌包含质粒pGBNJ003(用于表达靶标10dsRNA)。在0.008 单位时，约三分之一的昆虫死亡，但是，存活昆虫显著小于对照组(包 含空载体pGN29的大肠杆菌以及只有水)。与用包含空载体pGN29的 细菌喷洒的马铃薯植物相比，CPB幼虫对用包含pGBNJ003质粒的浓 度为0.025或0.008单位的细菌喷洒的马铃薯植物造成的进食损害显著 降低(图15-LD)。
K.成虫对经口摄取的对应于靶基因的dsRNA极其敏感
下文所提供的实施例突出显示了，昆虫成虫(不仅是幼虫阶段的 昆虫)对经口摄取的对应于靶基因的dsRNA极其敏感。
选择4种靶标用于该实验：靶标2、10、14和16(分别为SEQ ID NO 168、188、198和220)。GFP片段dsRNA(SEQ ID NO 235)用作 对照。从我们实验室饲养的培养物中随机挑选年幼成虫(2-3日龄)，对 昆虫性别无偏好性。每种处理选择10只成虫。在处理开始前，所述成 虫预先饥饿至少6小时。在处理的第一天，用4个马铃薯叶盘(直径1.5 cm2)喂食每只成虫，每个所述马铃薯叶盘通过局部应用0.1μg/μl的25 μl靶标dsRNA(如实施例3A所述进行合成；局部应用如实施例3E所 述)进行预处理。将每只成虫限制在小的培养皿(直径3cm)中以确保 所有昆虫摄食等量的食物，并因此接受等剂量的dsRNA。第二天，如 上所述再次对每只成虫喂食4个经处理的叶盘。第三天，收集每种处理 的所有10只昆虫，并一起放置于由塑料盒(尺寸30cm×20cm×15cm) 组成的罩中，所述塑料盒的盖子中带有细密尼龙网以提供良好通风。在 所述塑料盒中，其底部放置了一些潮湿滤纸。所述滤纸上面放置了一些 (未处理的)马铃薯叶，从而在实验过程中维持成虫。从第5天起，进 行定期评估从而对死亡、存活(可动的)和濒死昆虫数目进行计数。对 于濒死昆虫来说，将其背部朝下放置来检查它们能否在几分钟内自己翻 身；只有不能翻身的昆虫被认为是濒死的。
在该实验中表明，对应于不同靶标的双链RNA对马铃薯叶甲成 虫明显的特异性毒性作用(图12-LD)。对应于gfp片段的双链RNA在 最终评估日(第19天)显示出对CPB成虫没有毒性。该实验清楚地显 示，当经口递送接触到dsRNA仅几天后CPB成虫的存活就显著降低。 例如，对于靶标10来说，在第5天，10只成虫中的5只濒死(病态且 移动缓慢)；在第6天，10只成虫中的4只死亡，存活昆虫中3只濒死； 在第9天，观察到所有成虫均死亡。
作为该实验的结论，可将针对昆虫害虫的靶标双链RNA的应用 扩展至包括可造成广泛的作物破坏之昆虫害虫的两个生活阶段(即幼虫 和成虫)，所述昆虫害虫，如马铃薯叶甲的情形。
实施例4：辣根猿叶甲(Mustard leaf beetle，MLB)
A.通过家族PCR(family PCR)克隆辣根猿叶甲PC001、PC003、PC005、 PC010、PC014、PC016和PC027基因的部分序列。
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从辣根猿叶 甲(辣根猿叶甲；来源：Dr.Caroline Muller，Julius-von-Sachs-Institute for Biosciences，Chemical Ecology Group，University of Wuerzburg， Julius-von-Sachs-Platz 3，D-97082 Wuerzburg，Germany)第3阶段幼 虫分离高质量的总RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700， Promega)处理除去RNA制备物中存在的基因组DNA。按照制造商的 说明，使用市售试剂盒(SuperscriptTM III Reverse Transcriptase，Cat.Nr. 18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含PC001、PC003、PC005、PC010、PC014、PC016 和PC027基因一部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明 使用Amplitaq Gold(Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系 列PCR反应。
表2-PC中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些 引物进行各PCR反应，其使用以下条件：95℃ 10分钟，然后是40个 循环的95℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。 在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR4/TOPO载体 (Cat.Nr.K4530-20，Invitrogen)并测序。表2-PC中给出了用各自SEQ ID NO表示所得PCR产物的序列，并且其为部分序列。
表3-PC中给出了用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序 列。表3-PC提供了cDNA克隆的氨基酸序列，其中读码框的起点在括 号中指明。
B.产生辣根猿叶甲基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含 与T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-PC中给出了用于扩增每种靶序列有义模板 的各引物的序列。表8-PC提供了制备辣根猿叶甲靶序列的dsRNA片段 之细节，其包括引物序列。
PCR反应的条件如下：95℃ 1分钟，然后是20个循环的95℃ 30 秒、60℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是15个循环的95℃ 30秒、50℃ 30 秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在使用与上述相同条件的PCR 反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。 表8-PC中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂 糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。按 照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录， 将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯 化。表8-PC中给出每种靶基因所得dsRNA的有义链。
C.对转基因拟南芥植物进行桃蚜侵害实验室试验
得到转基因植物
使用浸花法(Clough and Bent(1998)Plant Journal 16 735-743)转 化拟南芥植物。将所述植物的地上部分在含有以下物质的溶液中孵育数 秒，所述溶液含有5％蔗糖、来自过夜培养物的重悬根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1 Rif细胞以及0.03％的表面 活性剂Silwet L-77。接种后，用透明塑料覆盖植物16小时以保持湿度。 为了提高转化效率，一周后重复所述步骤。当种子成熟后停止浇水，收 获干燥的种子并冷处理两天。灭菌后，将种子铺在含卡那霉素的生长培 养基中用以选择转化植物。
将所选植物移至泥土用以最佳地产生T2种子。
生物测定
通过使分离的T2种子在适当的选择培养基上萌发来选择转基因 拟南芥植物。当这些转基因植物的根完全形成时，将它们移至新鲜的人 工生长培养基或泥土，使它们在最佳条件下生长。针对桃蚜若虫来检测 整株转基因植物，以显示(1)对摄食若虫造成的植物损害具有显著抗 性，(2)若虫死亡率提高，和/或(3)存活若虫的重量减少(或任何其 它的昆虫发育异常)。
D.针对辣根猿叶甲幼虫的活性，使用油菜叶盘对dsRNA靶标进行实验 室试验检测
下文提供的实施例举例说明了辣根猿叶甲幼虫对经口摄入的对应 于自身靶基因的dsRNA敏感。
为了测试针对MLB幼虫的不同双链RNA样品，采用了使用油菜 (Brassica napus变种SW Oban；来源Nick Balaam，Sw Seed Ltd.，49 North Road，Abington，Cambridge，CB1 6AS，UK)叶材料作为食物来源 的叶盘测定。在昆虫室中相同变种的油菜上维持所述昆虫培养物，其条 件为25±2℃，60±5％相对湿度，16小时光照/8小时黑暗的光周期。 使用合适尺寸的穿孔器从4至6周龄的油菜植物切下直径约1.1cm(或 0.95cm2)的叶盘。用含有0.05％ Triton X-100的Milli-Q水将双链RNA 样品稀释到0.1μg/μl。通过将25μl的靶标PC001、PC003、PC005、PC010、 PC014、PC016、PC027dsRNA和对照gfp dsRNA的稀释溶液或者0.05 ％ Triton X-100施加到近轴叶表面来制备经处理的叶盘。将所述叶盘干燥 并分别置于24孔板的每一个孔中，所述孔含有1ml凝胶化的2％琼脂， 其有利于防止所述叶盘干枯。将两只新生MLB幼虫置于所述板的每个 孔中，然后用多孔塑料盖将其盖上。将所述板(每种处理包含48只昆 虫)分为4个重复，每个重复包含12只昆虫(每行)。将包含所述昆虫 和叶盘的平板保存在昆虫室中，其条件为25±2℃，60±5％相对湿度， 16小时光照/8小时黑暗的光周期。用叶盘喂食昆虫2天，之后将它们 移至含有新近处理的叶盘的新平板。然后，在生物测定开始后4天，收 集来自每个重复的昆虫并移至含未经处理新鲜油菜叶的培养皿。在第2、 4、7、9和11天记录幼虫死亡率和平均重量。
对于所有被测靶标，用经完整裸靶标dsRNA处理的油菜叶喂食辣 根猿叶甲幼虫均导致幼虫死亡率显著增加，如图1(a)所示。针对靶标 PC010的被测双链RNA在第9天导致100％幼虫死亡，而针对靶标 PC027的被测双链RNA在第11天导致100％幼虫死亡。对于所有其它 的靶标，与对照gfp dsRNA、只有0.05％ Trition X-100或仅有未处理的 叶相比在第11天达到高死亡率值：(平均值百分数±α0.05的置信区间) PC001(94.4±8.2)，PC003(86.1±4.1)，PC005(83.3±7.8)，PC014(63.9 ±20.6)，PC016(75.0±16.8)，gfp dsRNA(11.1±8.2)，0.05％ Triton X-100 (19.4±10.5)，只有叶(8.3±10.5)。
基于它们的平均重量来评估存活的幼虫。对于所有被测靶标，在所 述生物测定4天后，辣根猿叶甲幼虫的平均重量显著降低；喂食对照gfp dsRNA或仅有0.05％ Trition X-100的昆虫发育正常，与仅摄食叶的幼 虫一样(图1(b)-PC)。
E.针对辣根猿叶甲幼虫的活性，使用油菜叶盘对不同浓度dsRNA进行 实验室试验筛选
如上文实施例4D所述，将25μl来自靶标PC010或PC027的 dsRNA溶液局部应用至油菜叶盘上，所述dsRNA溶液采用10倍系列 浓度(从0.1μg/μl降至0.1ng/μl)。作为阴性对照，将仅有0.05％ Triton X-100施加到所述叶盘。针对每种处理，检测24只辣根猿叶甲新生幼 虫，其中每孔两只昆虫。在昆虫饲养室中保存所述平板，其条件为25± 2℃，60±5％相对湿度，16：8小时的光照：黑暗光周期。在第2天，将 所述幼虫移至含有新鲜的经dsRNA处理的叶盘的新平板上。在第4天 (针对靶标PC010)和第5天(针对靶标PC027)，将来自每个重复实 验的昆虫移至含充足的未处理叶材料的培养皿。在第2、4、7、8、9和 11天(针对标PC010)以及在第2、5、8、9和12天(针对靶标PC027) 评估所述甲虫的存活情况。
如图2(a)和(b)中所示，用含有两种不同靶标(PC010和PC027) 之完整裸dsRNA(以低至1ng dsRNA/μl的溶液浓度)的油菜叶盘喂食 辣根猿叶甲导致高死亡率。针对不同浓度dsRNA的平均死亡率值百分 数±α0.05的置信区间：对于靶标PC010来说第11天为，0μg/μl：8.3 ±9.4，0.1μg/μl：100，0.01μg/μl：79.2±20.6，0.001μg/μl：58.3±9.4，0.0001 μg/μl：12.5±15.6；对于PC027来说在第12天为，0μg/μl：8.3±9.4，0.1 μg/μl：95.8±8.2，0.01μg/μl：95.8±8.2，0.001μg/μl：83.3±13.3，0.0001 μg/μl：12.5±8.2。
F.将MLB基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于MLB基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-PC中提供了用于扩增靶基因片段PC010的特异性引物序列。 所使用的模板是含有PC010序列(SEQ ID NO 253)的pCR8/GW/topo 载体。所述引物用于使用以下条件的递减PCR(touch-down PCR)反 应中：95℃ 1分钟，然后是20个循环的95℃ 30秒、60℃ 30秒(每个 循环其温度降低0.5℃)和72℃1分钟，然后是15个循环的95℃ 30秒、 50℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析 所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参 考WO00188121A1)并测序。表8-PC给出了对应于SEQ ID NO 488 的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGCDJ001。
G.在一个大肠杆菌菌株AB301-105(DE3)中表达和产生双链RNA靶 标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。在该实验中，使用RNA酶III缺失的 菌株AB301-105(DE3)。
转化AB301-105(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细胞20分钟，之后 对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回至冰上并再保持5 分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞，并将该悬液于37℃ 在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细胞悬液移至含有150 mlLB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液体培养基补充有100 μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在Innova 4430摇床(250 rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双链RNA。在化学诱 导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合物将以反义和正 义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述把序列的侧翼是相反方向的 T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于总体积为50ml的0.05％ Triton X-100溶液中。所述管 保存在4℃备用。
H.针对辣根猿叶甲，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检 测
叶盘生物测定
针对辣根猿叶甲幼虫，应用叶盘生物测定法来检测大肠杆菌产生 的靶标PC010双链RNA(来自质粒pGCDJ001)。如实施例4所述，从 油菜叶制备叶盘。将20μl细菌悬液(在600nm波长的吸光度值为1) 加至每个叶盘上。将所述叶盘置于24孔板的孔中，所述孔含有1ml凝 胶化的琼脂。将两只新生幼虫加至每个叶盘上。对于每种处理来说，准 备3个重复实验，其中每个重复实验包含16只新生幼虫。所述平板保 存在昆虫饲养室中，其条件为25±2℃，60±5％相对湿度，16:8小时 的光照：黑暗光周期。在第3天(即生物测定开始后3天)，将幼虫移至 含新鲜的经处理(相同剂量)叶盘的新平板。从第5天起，每隔一天更 换叶材料一次。该生物测定对死亡率和平均重量打分。阴性对照是用包 含质粒pGN29(空载体)的细菌处理的叶盘以及只有叶子。
在用含质粒pGCDJ001的RNA酶III缺失大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株处理的油菜叶喂食辣根猿叶甲幼虫后，所述昆虫的死亡率 随时间显著增加，而在对照的包含质粒pGN29的细菌或只有叶子的情 形中几乎没有或没有昆虫死亡(图3-PC)。
基于植物的生物测定
用热失活的化学诱导的表达dsRNA之细菌悬液喷洒整株植物，然 后用所述植物喂食MLB。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑 料瓶倒置于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在 瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止 幼虫逃脱。将MLB置于罩中的每株经处理的植物上。用包含pGCDJ001 或pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌株悬液处理植物。向 植物施加不同量的细菌：例如66、22和7个单位，其中一个单位定义 为：在600nm波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。 在每种情况下，用喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验 中，每种处理使用一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的 重量。
用表达来自pGCDJ001的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺失的细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例5：墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle，MBB)
A.克隆墨西哥豆瓢虫的部分基因序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从4个不 同幼虫阶段的墨西哥豆瓢虫(墨西哥豆瓢虫；来源：Thomas Dorsey， Supervising Entomologist，New Jersey Department of Agriculture，Division of Plant Industry，Bureau of Biological Pest Control，Phillip Alampi Beneficial Insect Laboratory，PO Box 330，Trenton，New Jersey 08625-0330， USA)中分离高质量的总RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat. Nr.1700，Promega)处理除去该RNA制备物中的基因组DNA。按照制 造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr. 18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含EV005、EV009、EV010、EV015和EV016基因一部 分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold (Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-EV中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列，其显示了包 括引物序列和所得cDNA序列的墨西哥豆瓢虫靶基因。使用这些引物进 行各PCR反应，其使用以下条件：对于EV005和EV009来说，95℃ 10 分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、50℃ 1分钟和72℃ 1分30秒， 然后是72℃ 7分钟；对于EV014来说，95℃ 10分钟，然后是40个循 环的95℃ 30秒、53℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 7分钟；对于 EV010和EV016来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、 54℃ 1分钟和72℃ 1分40秒，然后是72℃ 7分钟。在琼脂糖凝胶上分 析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其克隆入pCR4/TOPO载体(Cat.Nr.K4530-20， Invitrogen)并测序。表2-EV中给出了用各自SEQ ID NO表示的所得 PCR产物的序列，并且其为部分序列。表3-EV中给出了用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序列，其中读码框的起点在括号中指明。
B.产生墨西哥豆瓢虫基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个单独的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-EV中给出了用于扩增每种靶序列有义模板 的各引物的序列。
所述PCR反应的条件如下：95℃ 1分钟，然后是20个循环的95℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是15个循环的95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在使用与上述相同条件的 PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模 板。表8-EV中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的各引物序列。在 琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯 化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行 转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠 进行纯化。表8-EV中给出了每种靶基因所得dsRNA的有义链。
C.针对墨西哥豆瓢虫幼虫的活性，使用豆叶盘对dsRNA靶标进行实验 室试验检测
下文提供的实施例举例说明：墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle，MBB)幼虫对经口摄入的对应于自身靶基因的dsRNA敏感。
为了检测针对MBB幼虫的不同双链RNA样品，采用了使用菜豆 (Phaseolus vulgaris变种Montano；来源Aveve NV，Belgium)叶材料作 为食物来源的叶盘测定。在昆虫室中使用同样变种的菜豆以维持昆虫培 养物，其条件为25±2℃，60±5％相对湿度，16小时光照/8小时黑暗 的光周期。使用合适尺寸的穿孔器从1至2周龄的豆植物叶子切下直径 约1.1cm(或0.95cm2)的叶盘。用含有0.05％ Triton X-100的Milli-Q 水将双链RNA样品稀释到1μg/μl。通过将25μl的靶标Ev005，Ev010， Ev015，Ev016 dsRNA和对照gfp dsRNA的稀释溶液或0.05％ Triton X-100 施加到近轴叶表面来制备经处理的叶盘。将所述叶盘干燥并分别置于24 孔板的每一个孔中，所述孔含有1ml凝胶化的2％琼脂，其有利于防止 叶盘干枯。将一只新生MBB幼虫置于所述板的每个孔中，然后用多孔 塑料盖将其盖上。将所述板分为3个重复，每个重复包含8只昆虫(每 行)。将包含所述昆虫和叶盘的平板保存在昆虫室中，其条件为25±2℃， 60±5％相对湿度，16小时光照/8小时黑暗的光周期。用叶盘喂食昆虫 2天，之后将它们移至含有新鲜的经处理的叶盘的新平板。然后，在生 物测定开始后4天，每天将所述昆虫移至含有未经处理新鲜豆叶的培养 皿，直至第10天。在第2天以及之后每隔一天记录幼虫死亡率和平均 重量。
用包含表面应用的完整裸靶标dsRNA的菜豆叶喂食的墨西哥豆 瓢虫幼虫均导致幼虫死亡率显著增加，如图1所示。8天后，靶标EV010、 Ev015和Ev016的被测双链RNA导致100％死亡率，而靶标Ev005的 dsRNA用10天杀死所有幼虫。用包含对照gfp dsRNA或仅有表面活性 剂Triton X-100的叶盘喂食的大部分昆虫在整个生物测定中维持存活 (图1-EV)。
D.针对墨西哥豆瓢虫成虫的活性，使用豆叶盘对dsRNA靶标进行实验 室试验检测
下文提供的实施例举例说明了：墨西哥豆瓢虫成虫对经口摄入的 对应于自身靶基因的dsRNA敏感。
在与墨西哥豆瓢虫幼虫类似的生物测定设置中，检测MBB成虫 抗御局部应用至豆叶盘的双链RNA。用0.05％ Triton X-100将来自每种 靶标(Ev010、Ev015和Ev016)的测试dsRNA稀释至终浓度为0.1μg/μl。 通过将30μl测试溶液局部施加到每个叶盘上对豆叶盘进行处理。使所 述叶盘完全干燥，然后将其置于24孔板每个孔中的2％凝胶化琼脂薄片 上。从培养罩中收集三日龄成虫，7-8小时不喂食，然后将一只成虫置 于生物测定板的每个孔中(因此每种处理包括24只成虫)。所述板保存 在昆虫饲养室中(在与MBB幼虫相同的条件下保存24小时)，之后将 所述成虫移至包含新鲜的经dsRNA处理的叶盘的新板。再过24小时， 收集来自每种处理的成虫，将其置于30cm×15cm×10cm的塑料盒中， 所述塑料盒包含两盆未经处理的3周龄豆植物。从第4天到第11天评 估昆虫死亡率。
被墨西哥豆瓢虫成虫摄食的所有3种靶标dsRNA(Ev010、Ev015 和Ev016)导致死亡率从第4天(生物测定开始后4天)开始显著增加， 如图2(a)-EV所示。从第5天起，观察到在最初用靶标dsRNA处理 的豆叶盘喂食的昆虫与用包含对照gfp dsRNA或表面活性剂Triton X-100的叶盘喂食的昆虫之间摄食模式的明显改变。与gfp dsRNA和只 有表面活性剂的对照相比，对于所有3种靶标均明显可见MBB成虫对 未处理豆植物的叶损伤降低(尽管水平不同)；用靶标15喂食的昆虫对 豆叶损伤最小(图2(b)-EV)。
E.将MBB基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于MBB基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何的启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-EV中提供了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的 模板是包含任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR 反应，其使用以下条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、 55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析 所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参 考WO00188121A1)并测序。表8-EV中给出了对应于各自序列的所得 PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
F.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺失的菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
G.针对墨西哥豆瓢虫，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验 检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食MBB。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将MMB置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGBNJ001或pGN29 质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量 的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm波长 下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用 喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用 一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例6：墨西哥棉铃象(Cotton boll weevil，CBW)
A.克隆墨西哥棉铃象的部分基因序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从3龄墨 西哥棉铃象(墨西哥棉铃象；来源：Dr.Gary Benzon，Benzon Research lnc.， 7 Kuhn Drive，Carlisle，Pennsylvania 17013，USA)中分离高质量的完整 RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处 理除去RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售试 剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen， Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含AG001、AG005、AG010、AG014和AG016基因一 部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold (Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-AG中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列，其显示了包 括引物序列和所得cDNA序列的墨西哥棉铃象靶基因。使用这些引物进 行各自的PCR反应，其使用以下条件：对于AG001、AG005和AG016 来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、50℃ 1分钟和72℃ 1分30秒，然后是72℃ 7分钟；对于AG010来说，95℃ 10分钟，然 后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 2分30秒，然后是72℃ 7分钟；对于AG014来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30 秒、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 7分钟。在琼脂糖凝胶上 分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其克隆入pCR8/GW/TOPO载体(Cat.Nr.K2500-20， Invitrogen)并测序。表2-AG中给出了用各自SEQ ID NO表示的所得 PCR产物的序列，并且称为部分序列。表3-AG中给出了用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序列。
B.产生墨西哥棉铃象基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-AG中给出了用于扩增每种靶序列有义模板 的各引物的序列。如下进行递减PCR反应：95℃ 1分钟，然后是20个 循环的95℃ 30秒、60℃ 30秒(每个循环降低0.5℃)和72℃ 1分钟， 然后是15个循环的95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和 特异性T7反向引物得到反义T7模板。表8-AG中给出了用于扩增每种 靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物， 并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106， Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。将所得到的T7正向和反向模板 混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理 并利用醋酸钠进行纯化。表8-AG中给出了每种靶基因所得dsRNA的 有义链。
C.将CBW基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于CBW基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何的启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-AG中给出了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的 模板是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR 反应，其使用以下条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、 55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析 所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参 考WO00188121A1)并测序。表8-AG中给出了对应于各自序列的所得 PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
D.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺失的菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
E.针对墨西哥棉铃象，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验 检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食CBW。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将CBW置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或 pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加 不同量的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm 波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下， 用喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使 用一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例7：赤拟谷盗(Red flour beetle，RFB)
A.克隆赤拟谷盗的部分基因序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从所有不 同阶段的赤拟谷盗(赤拟谷盗；来源：Dr.Lara Senior，Insect Investigations Ltd.，Capital Business Park，Wentloog，Cardiff，CF3 2PX， Wales，UK)中分离高质量的完整RNA。按照制造商的说明，通过DNA 酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。 按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat. Nr.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含TC001、TC002、TC010、TC014和TC015基因一部 分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold (Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-TC中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引 物进行各PCR反应，其使用以下条件：95℃ 10分钟，然后是40个循 环的95℃ 30秒、50℃ 1分钟和72℃ 1分30秒，然后是72℃ 7分钟 (TC001、TC014、TC015)；95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30 秒、54℃ 1分钟和72℃ 2分30秒，然后是72℃ 7分钟(TC010)；95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、53℃ 1分钟和72℃ 1分钟， 然后是72℃ 7分钟(TC002)。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对 其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其 克隆入pCR8/GW/TOPO载体(Cat.Nr.K2500 20，Invitrogen)并测序。 表2-TC中给出了用各自SEQ ID NO表示的所得PCR产物的序列，并 且称为部分序列。表3-TC中给出了用各自SEQ ID NO表示的相应部分 氨基酸序列。
B.产生赤拟谷盗基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-TC中给出了用于扩增每种靶序列有义模板 的各引物的序列。所述PCR反应条件如下：95℃ 1分钟，然后是20个 循环的95℃ 30秒、60℃ 30秒(-0.5℃/循环)和72℃ 1分钟，然后是 15个循环的95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分 钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异 性T7反向引物得到反义T7模板。8-TC中给出了用于扩增每种靶基因 反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过 PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen) 以及NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向 和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和 RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-TC中给出了每种靶基因所得 dsRNA的有义链。
C.针对赤拟谷盗幼虫，使用人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试验检 测
下文提供的实施例举例说明了赤拟谷盗幼虫(RFB)对经口摄入 的对应于自身靶基因的dsRNA敏感。
赤拟谷盗维持于Insect Investigations Ltd.(来源：Imperial College of Science，Technology and Medicine，Silwood Park，Berkshire，UK)。根据 公司的SOP/251/01来饲养昆虫。简言之，将所述甲虫置于塑料罐或箱中。 这些罐或箱具有顶部开口用以通风。其顶部装有网并用弹性带固定从而防 止逃脱。将幼虫饲养培养基(面粉)放置于可饲养甲虫的容器中。在控温 室中饲养保存的产品甲虫群体，其条件为25±3℃，16:8小时的光照:黑 暗循环。
将来自靶标TC014的双链RNA(其序列对应于SEQ ID NO 799 的)掺入到面粉和奶粉的混合物(全麦粉：奶粉比值为4:1)中，使之 过夜干燥。分别制备每个重复：将10μg/μl的100μl dsRNA溶液(1mg dsRNA)加入到0.1g面粉/奶混合物中。将干燥的混合物研磨成细粉。 昆虫维持在培养皿(55mm直径)中，该培养皿中衬有双层滤纸。将经 处理的饲料放置于两层滤纸之间。将10只1龄混合性别的幼虫放置于 每个皿(重复)中。每种处理进行4次重复实验。对照是Milli-Q水。 以常规标准进行评估(存活昆虫数)。在试验过程中，测试条件是 25-33℃，20-25％相对湿度，12:12小时的光照:黑暗光周期。
与只有对照的饲料相比，用经靶标TC014dsRNA处理的人工饲 料喂食的赤拟谷盗幼虫之存活率随时间显著降低，如图1-TC所示。
D.将RFB基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具 有活性的双链RNA
以下是将对应于RFB基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-TC中提供了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的 模板是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR 反应，其使用下述条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、 55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析 所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参 考WO00188121A1)并测序。8-TC中给出了对应于各自序列的所得PCR 产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
E.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
F.针对赤拟谷盗，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食RFB。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将RFB置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或pGN29 质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量 的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm波长 下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用 喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用 一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例8：桃蚜(Green peach aphid，GPA)
A.克隆桃蚜的部分基序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从桃蚜若 虫(桃蚜；来源：Dr.Rachel Down，Insect & Pathogen Interactions，Central Science Laboratory，Sand Hutton，York，YO41 1LZ，UK)中分离高质量的 完整RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega) 处理除去RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售 试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen， Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含MP001、MP002、MP010、MP016和MP027基因一 部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold (Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-MP中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引 物进行各自的PCR反应，其使用以下条件：对于MP001、MP002和 MP016来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、50℃ 1分 钟和72℃ 1分30秒，然后是72℃ 7分钟；对于MP027来说，使用递 减PCR程序：95℃ 10分钟，然后是10个循环的95℃ 30秒、60℃ 40 秒(每循环降低1℃)和72℃ 1分10秒，然后是30个循环的95℃ 30 秒、50℃ 40秒和72℃ 1分10秒，然后是72℃ 7分钟；对于MP010来 说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 3分钟，然后是72℃ 7分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对 其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其 克隆入pCR8/GW/TOPO载体(Cat.Nr.K2500-20，Invitrogen)并测序。 表2-MP中给出了用各自SEQ ID NO表示的所得PCR产物的序列，并 且称为部分序列。表3-MP中给出了用各自SEQ ID NO表示的相应部 分氨基酸序列。
B.产生桃蚜基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-MP中给出了用于扩增每种靶序列有义模板的 各引物的序列。如下进行递减PCR反应：95℃ 1分钟，然后是20个循 环的95℃ 30秒、55℃ 30秒(针对MP001、MP002、MP016、MP027 和gfp)或50℃ 30秒(针对MP010)(每循环降低0.5℃)和72℃ 1分 钟，然后是15个循环的95℃ 30秒、45℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是 72℃ 10分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引 物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。表8-MP中给出了用于扩增 每种靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产 物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr. 28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所 得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、 进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-MP中给出了 每种靶基因所得dsRNA的有义链。
C.桃蚜对转基因拟南芥植物侵害的实验室试验
得到转基因植物
使用浸花法(Clough and Bent(1998)Plant Journal 16 735-743)转 化拟南芥植物。将所述植物的地上部分在含有以下物质的溶液中孵育数 秒，所述溶液含有5％蔗糖、来自过夜培养物的重悬根癌农杆菌菌株 C58C1 Rif细胞以及0.03％的表面活性剂Silwet L-77。接种后，用透明 塑料覆盖植物16小时以保持湿度。为了提高转化效率，一周后重复所 述步骤。当种子成熟后停止浇水，收获干燥的种子并冷处理两天。灭菌 后，将种子铺在含卡那霉素的生长培养基中用以选择转化植物。
将所选植物移至泥土用以最佳地产生T2种子。
生物测定
通过使分离的T2种子在适当的选择培养基上萌发来选择转基因 拟南芥植物。当这些转基因植物的根完全形成时，将它们移至新鲜的人 工生长培养基或泥土，使它们在最佳条件下生长。针对桃蚜若虫来检测 整株转基因植物，其显示(1)对摄食若虫造成的植物损害具有显著抗 性，(2)若虫死亡率提高，和/或(3)存活若虫的重量减少(或任何其 它的昆虫发育异常)。
D.针对桃蚜的活性，使用液体人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试验 检测
基于适于豌豆蚜的饲料制备用于桃蚜的液体人工饲料，如Febvay et al.(1988)[Influence of the amino acid balance on the improvement of an artificial diet for a biotype of Acyrthosiphon pisum(Homoptera Aphididae). Can.J.Zool.66：2449-2453]所述，但进行了某些修改。如下制备所述饲 料的氨基酸组分：以mg/100ml计，丙氨酸178.71，β-丙氨酸6.22，精氨 酸244.9，天冬酰胺298.55，天冬氨酸88.25，半胱氨酸29.59，谷氨酸 149.36，谷氨酰胺445.61，甘氨酸166.56，组氨酸136.02，异亮氨酸 164.75，亮氨酸231.56，盐酸赖氨酸351.09，蛋氨酸72.35，鸟氨酸(HCl) 9.41，苯丙氨酸293，脯氨酸129.33，丝氨酸124.28，苏氨酸127.16，色 氨酸42.75，酪氨酸38.63，L-缬氨酸190.85。除酪氨酸以外，将所述氨 基酸溶于30ml Milli-Q水中，酪氨酸在加入到氨基酸混合物之前首先 溶于数滴1M盐酸中。以如下5×浓缩原液的形式制备所述饲料的维生素 混合物组分：以mg/L计，氨基苯甲酸100、抗坏血酸1000、生物素1、 泛酸钙50、氯化胆碱500、叶酸10、肌醇420、烟酸100、盐酸吡哆醇 25、核黄素5、盐酸硫胺25。将核黄素溶于1ml50℃水中，然后加入 到维生素混合物原液中。将所述维生素混合物等分为每等份20ml，保 存于-20℃。将一等份维生素混合物加至所述氨基酸溶液。分别以下述 量将蔗糖和MgSO4·7H2O加入到所述混合物中：20g和242mg。如下 制备微量金属原液：以mg/100ml计，CuSO4·5H2O4.7，FeCl3·6H2O 44.5， MnCl2·4H2O 6.5，NaCl 25.4，ZnCl2 8.3。将10ml微量金属溶液和250mg KH2PO4加至饲料，加入Milli-Q水至液体饲料终体积为100ml。用1M KOH溶液将所述饲料的pH调节为7。通过0.22μm滤器(Millipore)将 所述液体饲料过滤灭菌。
在受控环境室中具有70μm网孔的铝框笼中用4至6周龄油菜 (Brassica napus变种SW Oban，来源Nick Balaam，Sw Seed Ltd.，49 North Road，Abington，Cambridge，CB1 6AS，UK)饲养桃蚜(桃蚜；来 源：Dr.Rachel Down，Insect & Pathogen Interactions，Central Science Laboratory，Sand Hutton，York，YO41 1LZ，UK)，所述室的条件如下：23 ±2℃，60±5％相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。
生物测定开始的前一天，从饲养笼中收集成虫并将其置于培养皿 中新近采摘的油菜叶上，并将其置于昆虫室中过夜。第二天，选取1龄 若虫并移至饲养室。一个饲养室包括置于小培养皿(直径3cm)的10 只1龄若虫，所述培养皿覆盖有薄的单层拉伸封口膜(parafilm M)， 向其上添加50μl饲料。用另一层封口膜密封所述饲养室，在与饲养成 虫相同的条件下进行孵育。每隔一天更换包含dsRNA的饲料，在第8 天(即生物测定开始后第8天)评估昆虫的存活率。针对每种处理，同 时建立5个生物测定饲养室(重复)。将测试和对照(gfp)dsRNA溶液 掺入饲料中至终浓度为2μg/μl。所述饲养室维持23±2℃，60±5％相 对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。利用GraphPad Prism版本4 测定Mann-Whitney检验，以确定靶标27(MP027)和gfp dsRNA之 间中值是否有显著差异。
在所述生物测定中，使用饲养室将添加有靶标27(SEQ ID NO 1061)完整裸dsRNA的液体人工饲料喂食桃蚜若虫，其导致死亡率显 著提高，如图1所示。用靶标27、gfp dsRNA和只有饲料处理的存活昆 虫平均百分数分别为2、34和82。使用Mann-Whitney检验比较靶标 027与gfp dsRNA组，得到0.004的单尾P值，这表明靶标027的中值 与gfpdsRNA的预期较大中值有显著差异(P<0.05)。用掺有靶标27 dsRNA的液体饲料喂食的桃蚜明显小于用只有饲料或掺有gfp dsRNA 对照的饲料喂食的桃蚜(数据未显示)。
E.将GPA基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于GPA基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-MP中给出了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模 板是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR反 应，其使用以下条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR 片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706， Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参考 WO00188121A1)并测序。表8-MP给出了对应于各自序列的所得PCR产 物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
F.在两个大肠杆菌(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3)菌株 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
G.针对桃蚜，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食GPA。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将GPA置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或pGN29 质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量 的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm波长 下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用 喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用 一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例9：褐飞虱(Brown plant hopper，BPH)
A.克隆褐飞虱的部分序列
按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶， Cat.N°.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从褐飞虱(来源： Dr.J.A.Gatehouse，Dept.Biological Sciences，Durham University，UK)高 质量的完整RNA得到cDNA。
为了分离包含褐飞虱NL001、NL002、NL003、NL004、NL005、 NL006、NL007、NL008、NL009、NL010、NL011、NL012、NL013、NL014、 NL015、NL016、NL018、NL019、NL021、NL022和NL027基因一部分 的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold(Cat. N°.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-NL中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引 物进行各PCR反应，其使用以下条件：对于NL001来说，95℃ 5分钟， 然后是40个循环的95℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10 分钟；对于NL002来说，95℃ 3分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、 55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟；对于NL003来说，95℃ 3分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、61℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后 是72℃ 10分钟；对于NL004来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、51℃ 1分钟和72℃ 1分钟；对于NL005来说，95℃ 10分钟，然后 是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分 钟；对于NL006来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 3分30秒，然后是72℃ 10分钟；对于NL007来说，95℃ 10 分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 1分15秒，然 后是72℃ 10分钟；对于NL008和NL014来说，95℃ 10分钟，然后是40 个循环的95℃ 30秒、53℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟； 对于NL009、NL011、NL012和NL019来说，95℃ 10分钟，然后是40 个循环的95℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟； 对于NL010来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1 分钟和72℃ 2分30秒，然后是72℃ 10分钟；对于NL013来说，95℃ 10 分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 1分10秒，然 后是72℃ 10分钟；对于NL015和NL016来说，95℃ 10分钟，然后是40 个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 1分40秒，然后是72℃ 10分钟； 对于NL018来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1 分钟和72℃ 1分35秒，然后是72℃ 10分钟；对于NL021、NL022和NL027 来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 1 分45秒，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对 其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其 克隆入pCR8/GW/topo载体(Cat.Nr.K2500 20，Invitrogen)并测序。表 2-NL中给出用各自SEQ ID NO表示的所得PCR产物的序列，并且称 为部分序列。表3-NL中给出了用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基 酸序列。
B.通过EST序列克隆褐飞虱NL023基因的部分序列
按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶， Cat.N°.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从褐飞虱(来源： Dr.J.A.Gatehouse，Dept.Biological Sciences，Durham University，UK)高 质量的完整RNA得到cDNA。
从褐飞虱cDNA扩增部分cDNA序列NL023，其对应于公共数据 库GenBank中的褐飞虱EST序列，其序列号为CAH65679.2。为了分 离包含NL023基因一部分的cDNA序列，按照制造商的说明使用基于 EST的特异性引物来进行一系列PCR反应，其使用PerfectShotTM ExTaq(Cat N°.RR005A，Takara Bio Inc.)。
对于NL023来说，在两个独立的PCR反应中使用特异性引物 oGBKW002和oGBKW003(在本文中分别用SEQ ID NO 1157和SEQ ID NO 1158表示)，其条件如下：95℃ 3分钟，然后是30个循环的95℃ 30秒、56℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上 分析所得PCR片段，对其进行纯化( Gel Extraction kit，Cat.N°. 28706，Qiagen)，并将其克隆入pCR4-TOPO载体(Cat N°K4575-40， Invitrogen)并测序。本文中用SEQ ID NO 1111表示对两种PCR产物测 序所得的一致序列，其指NL023基因的部分序列。本文中用SEQ ID NO 1112表示相应的部分氨基酸序列。
C.产生褐飞虱基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引物得 到有义T7模板。表8-NL中给出了用于扩增每种靶序列有义模板的各引物 的序列。所述PCR反应的条件如下：对于NL001和NL002来说，94℃ 4 分钟，然后是35个循环的94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是 72℃10分钟；对于NL003来说，94℃ 4分钟，然后是35个循环的94℃ 30 秒、66℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟；对于NL004、NL006、 NL008、NL009、NL010和NL019来说，95℃ 4分钟，然后是35个循环 的95℃ 30秒、54℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟；对于NL005 和NL016来说，95℃ 4分钟，然后是35个循环的95℃ 30秒、57℃ 30秒 和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟；对于NL007和NL014来说，95℃ 4 分钟，然后是35个循环的95℃ 30秒、51℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是 72℃ 10分钟；对于NL011、NL012和NL022来说，95℃ 4分钟，然后是 35个循环的95℃ 30秒、53℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟； 对于NL013、NL015、NL018和NL021来说，95℃ 4分钟，然后是35个 循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟；对于 NL023和NL027来说，95℃ 4分钟，然后是35个循环的95℃ 30秒、52℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在使用与上述相同条件的PCR 反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。表 8-NL中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶 上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)进行纯化。将所得到的T7正向 和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和 RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。但进行如下修改：RNA沉淀在70 ％乙醇中洗两次。表8-NL中给出每种靶基因所得dsRNA的有义链。
对于所述绿色荧光蛋白(gfp)对照来说，使用T7引物进行PCR反 应的模板DNA是pPD96.12质粒(the Fire Lab， http://genome-www.stanford.edu/group/fire/)，其含有被3个合成内含子隔 开的野生型gfp编码序列。使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.N°.P1700，Promega)合成双链RNA。在两个独立的PCR 反应中得到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应 包含与T7启动子方向不同的靶序列。对于gfp来说，使用特异性T7FW 引物oGAU183和特异性RV引物oGAU182(本文中分别用SEQ ID NO 236 和SEQ ID NO 237表示)在PCR反应中得到有义T7模板，其条件如下： 95℃ 4分钟，然后是35个循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟， 然后是72℃ 10分钟。使用特异性FW引物oGAU181和特异性T7 RV引 物oGAU184(本文中分别用SEQ ID NO 238和SEQ ID NO 239表示)在 与上述相同条件的PCR反应中得到反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所 得PCR产物，并对其进行纯化( PCR Purification Kit，C at.N°. 28106，Qiagen)。按照制造商的说明，将所得到的T7 FW和RV模板混 合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并 利用醋酸钠和异丙醇进行纯化，但进行如下修改：RNA沉淀在70％乙醇 中洗两次。本文中所得dsRNA的有义链用SEQ ID NO 235表示。
D.针对褐飞虱的活性，使用液体人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试 验筛选
如Koyama(1988)[Artificial rearing and nutritional physiology of the planthoppersand leafhoppers(Homoptera：Delphacidae and Deltocephalidae)on a holidic diet JARQ 22 20-27]所述制备用于褐飞虱的 液体人工饲料(MMD-1)，但改变了饲料蔗糖组分的终浓度：使用14.4 ％(重量/体积)。将饲料组分制备为独立的浓缩物：10×矿物质原液(保 存于4℃)，2×氨基酸原液(保存于-20℃)以及10×维生素原液(保存 于-20℃)。在生物测定临开始前混合所述原液组分至4/3×浓度，从而允 许用测试dsRNA溶液(4×浓度)进行稀释，调节pH至6.5，过滤灭菌 制成约500μl的等份。
在受控环境室中，用2-3月龄水稻(台中在来一号水稻(Oryza sativa cv Taichung Native 1))植物饲喂褐飞虱，所述室的条件为：27±2℃， 80％相对湿度，16:8小时的光照：黑暗光周期。一个饲养室中包括10只 1龄或2龄若虫，其被置于盖有拉薄的单层封口膜(parafilm M)的小 培养皿(直径3cm)中，所述封口膜上加有50μl饲料。用另一层封口 膜密封所述室，在与饲养成虫相同的条件下进行孵育，但是不直接接触 光。每隔一天更换包含dsRNA的饲料，每天评估昆虫的存活率。针对 每种处理，同时建立5个生物测定饲养室(重复)。将测试和对照(gfp) dsRNA溶液掺入饲料中至终浓度为2mg/ml。所述饲养室维持27±2℃， 80％相对湿度，16:8小时的光照：黑暗光周期。使用Kaplan-Meier存活 曲线模型对昆虫存活数据进行分析，使用时序检验(Prism版本4.0) 比较组之间的存活。
如四个独立的生物测定中所示，使用饲养室在体外用添加了完整 裸dsRNA的液体人工饲料喂食褐飞虱，导致若虫死亡率显著增加(图 1(a)-(d)-NL；表10-NL(a)-(d))(Durham University)。这些 结果表明，对应于不同的BPH必需基因的dsRNA显示出对褐飞虱的显 著毒性。
在这些生物测定中，gfp dsRNA对BPH存活的影响与只喂食饲料 的存活昆虫没有显著差异。
表10-NL(a)-(d)显示用添加有2mg/ml(终浓度)以下靶标 的人工饲料喂食褐飞虱的存活情况总结；在表10-NL(a)中：NL002、 NL003、NL005、NL010；在表10-NL(b)中：NL009、NL016；在表 10-NL(c)中：NL014、NL018；以及在表10-NL(d)中：NL013、 NL015、NL021。在存活分析栏中，RNAi的作用如下标明：+＝与gfp dsRNA对照相比存活率显著下降(α<0.05)；-＝与gfp dsRNA对照相 比无显著差异。使用时序检验比较存活曲线(在只有饲料和添加了测试 dsRNA的饲料之间，在gfp dsRNA和测试dsRNA之间，以及在只有饲 料和gfp dsRNA之间)。
E.针对褐飞虱的活性，使用人工饲料对不同浓度dsRNA进行实验室试 验筛选
将50μl添加了不同浓度靶标NL002 dsRNA(即终浓度为1、0.2、 0.08和0.04mg/ml)的液体人工饲料施加到褐飞虱饲养室。包含dsRNA 的饲料每隔一天更换一次，每天评估昆虫的存活。针对每种处理，同时 建立5个生物测定饲养室(重复)。所述饲养室维持27±2℃，80％相 对湿度，16:8小时的光照：黑暗光周期。使用Kaplan-Meier存活曲线模 型对昆虫存活数据进行分析，使用时序检验(Prism版本4.0)比较组 之间的存活。
喂食添加有不同浓度完整裸靶标NL002 dsRNA的液体人工饲料 导致在低至0.04mg dsRNA/ml饲料的终浓度下BPH死亡率显著高于仅 喂食饲料的存活率，如图2-NL和表11-NL所示。表11-NL总结了用添 加1、0.2、0.08和0.04mg/ml(终浓度)靶标NL002的人工饲料喂食 褐飞虱试验中的存活情况。在存活分析栏中，RNAi的作用如下标明：+ ＝与gfp dsRNA对照相比存活率显著下降(α<0.05)；-＝与gfp dsRNA 对照相比无显著差异。使用时序检验比较存活曲线。
F.将BPH基因片段克隆进到载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具 有活性的双链RNA
以下是将对应于BPH基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-NL中提供了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模 板是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。在PCR反应中使用所述引 物，其使用下述条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR 片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706， Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参考 WO00188121A1)并测序。表8-NL给出对应于各自序列的所得PCR产物 的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
G.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
H.针对褐飞虱，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食BPH。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将BPH置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或pGN29 质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量 的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm波长 下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用 喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用 一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例10：二化螟(Rice striped stem borer，SSB)
A.通过家族PCR克隆二化螟基因的部分序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从4个不 同幼虫阶段的二化螟分离高质量的完整RNA。按照制造商的说明，通 过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA制备物中的基因组 DNA。按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录 酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到 cDNA。
为了分离包含CS001、CS002、CS003、CS006、CS007、CS009、 CS011、CS013、CS014、CS015、CS016和CS018基因一部分的cDNA序 列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold(Cat.Nr. N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-CS中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引 物进行各PCR反应，其使用以下条件：95℃ 10分钟，然后是40个循 环的95℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在 琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR4/TOPO载体 (Cat.Nr.K2500 20，Invitrogen)并测序。表2-CS中给出用各自SEQ ID NO表示的所得PCR产物的序列，并且称为部分序列。表3-CS给出了 用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序列。
B.产生二化螟基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个单独的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-CS给出了用于扩增每种靶序列有义模板的各 引物的序列。所述PCR反应条件如下：95℃ 4分钟，然后是35个循环 的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在使用 与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引 物得到反义T7模板。表8-CS中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的 各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试 剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以及 NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向 模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶 处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-CS给出了每种靶基因所得dsRNA的 有义链。
C.针对二化螟幼虫的活性，使用人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试 验检测
二化螟(来源：Syngenta，Stein，Switzerland)以基于Kamano 和Sato，1985(Handbook of Insect Rearing Volumes I & II.P Singh and RF Moore，eds.，Elsevier Science Publishers，Amsterdam and New York， 1985，pp448)所述经修改的人工饲料为食。简言之，如下制备一升饲料 的：将20g琼脂加入到980ml Milli-Q水中并高压灭菌；使琼脂溶液冷 却至约55℃，加入其余成分并彻底混合：40g玉米粉(Polenta)、20g 纤维素、30g蔗糖、30g酪蛋白、20g麦芽(烘烤的)、8g Wesson盐 混合物、12g Vanderzant维生素混合物、1.8g抗坏血酸、1.6g尼泊金 (对羟基苯甲酸甲酯)、0.3g金霉素、0.4g胆固醇和0.6g L-半胱氨酸。 将饲料冷却至约45℃然后倒入饲养盘或杯中。将所述饲料置于水平层流 柜中。从饲养有成虫蛾的罩中移出带有昆虫所产卵的稻叶片，将其固定 至饲养杯或盘的固体饲料上。使卵孵化，新生幼虫用于生物测定以及昆 虫培养物的维持。在试验和饲养中，条件是28±2℃，80±5％相对湿 度，16:8小时的光照：黑暗光周期。
使用同样的人工饲料用于生物测定，但是在该情形中，将所述饲 料平均倒入24孔板中，每个孔含有1ml饲料。一旦饲料准备就绪，则 以1μg/μl的50μl靶标dsRNA的比率将测试制剂施加到该饲料表面(2 cm2)。使所述dsRNA溶液干燥，将2只1龄蛾幼虫置于每个孔中。7 天后，将所述幼虫移至多孔板中新鲜的经处理的饲料。在第14天(即 生物测定开始后14天)，记录存活和死亡昆虫的数目，并检查异常。对 每种处理共检测24只幼虫。
进行了一个可替代的生物测定，其中用经处理的稻叶喂食二化螟 新生幼虫。将籼稻品种台中在来一号的小叶片浸于含1μg/μl靶标 dsRNA的0.05％ Triton X-100溶液中，使之干燥，并将每片置于含有凝 胶化2％琼脂的24孔板的一个孔中。将两只新生幼虫从饲养盘转移到每 片经dsRNA处理的叶子(每种处理包括24只幼虫)。在4和8天后， 将所述幼虫转移到新鲜的经处理的稻叶片。在第4、8和12天评估存活 和死亡昆虫的数目，并记录任何异常。
D.将SSB基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于SSB基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-CS中提供了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模板 是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。在PCR反应中使用所述引物， 其使用下述条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、55℃ 30 秒和72℃ 2分钟，然后是72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片 段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)， 将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参考WO00188121A1) 并测序。表8-CS给出了对应于各自序列的所得PCR产物的序列。包含该 序列的重组载体称为pGXXX0XX。
E.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
F.针对褐飞虱，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食SSB。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将SSB置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或pGN29 质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量 的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm波长 下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用 喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用 一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例11：菜蛾(Diamondback moth，DBM)
A.克隆菜蛾的部分序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从所有不 同幼虫阶段的菜蛾(菜蛾；来源：Dr.Lara Senior，Insect Investigations Ltd.， Capital Business Park，Wentloog，Cardiff，CF3 2PX，Wales，UK)分离高质 量的完整RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700， Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明， 使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr.18080044， Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含PX001、PX009、PX010、PX015、PX016基因一部 分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold (Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-PX中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引 物分进行各PCR反应，其使用以下条件：95℃ 10分钟，然后是40个 循环的95℃ 30秒、50℃ 1分钟和72℃ 1分30秒，然后是72℃ 7分钟 (针对PX001、PX009、PX015、PX016)；95℃ 10分钟，然后是40个 循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 2分30秒，然后是72℃ 7分钟 (针对PX010)。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化 (QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入 pCR8/GW/TOPO载体(Cat.Nr.K2500 20，Invitrogen)并测序。表2-PX 中给出了用各自SEQ ID NO表示所得PCR产物的序列，并且称为部分 序列。表3-PX中给出用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序列。
B.产生菜蛾基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-PX中给出用于扩增每种靶序列有义模板的各 引物的序列。所述PCR反应条件如下：95℃ 1分钟，然后是20个循环 的95℃ 30秒、60℃ 30秒(-0.5℃/循环)和72℃ 1分钟，然后是15个 循环的95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在 使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7 反向引物得到反义T7模板。表8-PX中给出用于扩增每种靶基因反义模 板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯 化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以及 NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向 模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶 处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-PX中给出每种靶基因所得dsRNA的 有义链。
C.针对菜蛾幼虫的活性，使用人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试验 检测
菜蛾维持于Insect Investigations Ltd.(来源：Newcastle University，Newcastle-upon-Tyne，UK)。用卷心菜叶喂食所述昆虫。 选择1龄混合性别的幼虫(约1日龄)用于该试验。将昆虫置于Eppendorf 管(容积1.5ml)中。将按照制造商说明制备的市售菜蛾饲料(Bio-Serv， NJ，USA)置于每个管的盖中(容积0.25ml，直径8mm)。在仍为液 体时，将所述饲料找平以移去多余的部分并得到平的表面。
一旦所述饲料准备就绪，则将测试制剂施加到饲料表面，为每个 重复25μl未稀释制剂(1μg/μl靶标dsRNA)。使测试制剂干燥，将一 只1龄幼虫置于每个管中。将所述幼虫放置于盖中饲料的表面，然后将 管小心的闭合。将所述管倒置保存(在其盖上)，从而使每只幼虫保持 在所述饲料的表面。一周两次将所述幼虫转移到包含新鲜饲料的新 Eppendorf管。在试验的头两周向幼虫提供经处理的饲料，之后提供未 处理的饲料。
在总共38天中，一周两次进行评估，在第38天时所有幼虫均死 亡。在每次评估时，评估所述昆虫的存活情况并检查异常。对于每种处 理，进行40个单幼虫重复。在试验过程中，测试条件是23～26℃，50～ 65％相对湿度，16:8小时的光照：黑暗光周期。
D.将DBM基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于DBM基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-PX中给出了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模板 是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。在PCR反应中使用所述引物， 其使用下述条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、55℃ 30 秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR 片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706， Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参考 WO00188121A1)并测序。表8-PX给出了对应于各自序列的所得PCR 产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
E.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
F.针对菜蛾，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食DBM。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将DBM置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或 pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加 不同量的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm 波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下， 用喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使 用一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例12：居屋艾蟋(House cricket，HC)
A.克隆居屋艾蟋的部分序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从所有不 同昆虫阶段的居屋艾蟋(居屋艾蟋；来源：Dr.Lara Senior，Insect Investigations Ltd.，Capital Business Park，Wentloog，Cardiff，CF3 2PX， Wales，UK)中分离高质量的完整RNA。按照制造商的说明，通过DNA 酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。 按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat. Nr.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含AD001、AD002、AD009、AD015和AD016基因一 部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold (Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-AD中给出用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引物 进行各自的PCR反应，其使用以下条件：95℃ 10分钟，然后是40个 循环的95℃ 30秒、50℃ 1分钟和72℃ 1分30秒，然后是72℃ 7分钟。 在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR8/GW/topo载体 (Cat.Nr.K2500 20，Invitrogen)并测序。表2-AD中给出用各自SEQ ID NO表示的所得PCR产物的序列，并且称为部分序列。表3-AD中给出 用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序列。
B.产生居屋艾蟋基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个单独的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含 与T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-AD中给出用于扩增每种靶序列有义模板的各 引物的序列。所述PCR反应条件如下：95℃ 1分钟，然后是20个循环 的95℃ 30秒、60℃ 30秒(-0.5℃/循环)和72℃ 1分钟，然后是15个 循环的95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在 使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7 反向引物得到反义T7模板。表8-AD中给出用于扩增每种靶基因反义 模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR 纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以 及NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和 反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA 酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-AD中给出了每种靶基因所得 dsRNA的有义链。
C.针对居屋艾蟋幼虫的活性，使用人工饲料对dsRNA靶标进行实验室 试验检测
美洲蟋蟀维持于Insect Investigations Ltd.(来源：Blades Biological Ltd.，Kent，UK)。所述昆虫以麦麸颗粒和卷心菜叶为食。选 择相同尺寸的不超过5日龄的混合性别若虫用于该试验。将双链RNA 与基于小麦的颗粒状啮齿类动物饲料(大鼠和小鼠标准饲料，B&K Universal Ltd.，Grimston，Aldbrough，Hull，UK)混合。所述饲料 BK001P含有下述成分(以重量降序排列)：小麦、大豆、麸皮、大麦、 颗粒状粘合剂、啮齿动物5vit min、混合脂、磷酸二钙、mould carb。 细细研磨颗粒状啮齿动物饲料，在微波炉中进行热处理从而使任何酶组 分失活，然后进行混合。所有啮齿动物饲料取自同一批次以确保一致性。 将研磨过的饲料与dsRNA完全混合，形成等重的小颗粒，将其在室温 过夜干燥。
将靶标和gfp对照的双链RNA样品以10μg/μl的浓度应用，其比 例为1g研磨过的饲料加1ml dsRNA溶液，由此得到施加比例为10mg dsRNA/g颗粒。每周更换颗粒。在试验的头三周，向昆虫提供经处理的 颗粒。之后提供未处理的颗粒。将昆虫置于带盖的塑料容器中(直径9 cm，深4.5cm)，每个容器包含10只昆虫。每个容器中包含一个经处理 的诱饵颗粒和一个水源(潮湿棉球)，将上述两者置于独立的小型称重 船型皿(weigh boat)中。在整个实验中，水被无限制地补充。
以一周两次的间隔进行评估，两次评估之间不超过4天，直至所 有对照昆虫死亡或蜕皮至成虫阶段(84天)。在每次评估中，对存活情 况进行评估并且检查异常。从第46天起，一旦开始蜕皮至成虫，则评 估所有昆虫(存活和死亡的)是若虫还是成虫。在试验第55天对存活 的昆虫称重。每种处理进行4次重复实验。在试验过程中，测试条件是 25～33℃，20～25％相对湿度，12:12小时的光照：黑暗光周期。 D.将HC基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于HC基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-AD中给出了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模 板是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。在PCR反应中使用所述引 物，其使用下述条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR 片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706， Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参考 WO00188121A1)并测序。表8-AD给出了对应于各自序列的所得PCR产 物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
E.在两个大肠杆菌(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3)菌株 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
F.针对居屋艾蟋，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食HC。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置于 植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切个 开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将HC置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或pGN29 质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量 的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm波长 下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用 喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用 一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显著增 加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统中产生的 对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性表现为昆虫 死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验中还明显看 出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损害的实例，所 述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA的细菌组成。
表10-NL(a)
1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
x2 P值 Sig.Dif.2 食物对： NL002 29.06 <0.0001 是 NL003 39.59 <0.0001 是 NL005 2955 <0.0001 是 NL010 21.04 <0.0001 是 gfp dsRNA对： NL002 15.09 0.0001 是 NL003 22.87 <0.0001 是 NL005 15.12 <0.0001 是 NL010 8.838 0.0029 是 食物对gfp dsRNA 4.030 0.0447(～0.05) 否
2α<0.05
表10-NL(b)
1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
x2 P值 Sig.Dif.2 食物对： NL009 11.98 0.0005 是 NL016 8.98 0.0027 是 gfp dsRNA对： NL009 13.69 0.0002 是 NL016 11.37 0.0007 是 食物对gfp dsRNA 0.03317 0.8555 否
2α<0.05
表10-NL(c)
1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
x2 P值 Sig.Dif.2 食物对： NL014 8.088 0.0045 是 NL018 10.47 0.0012 是 gfp dsRNA对： NL014 14.55 0.0001 是 NL018 17.64 <0.0001 是 食物对gfp dsRNA 0.6548 0.4184 否
2α<0.05
表10-NL(d)
1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
x2 P值 Sig.Dif.2 食物对： NL013 15.73 <0.0001 是 NL015 39.44 <0.0001 是 NL021 12.75 0,0004 是 gfp dsRNA对： NL013 16.42 <0.0001 是 NL015 39.15 <0.0001 是 NL021 14.1 0,0002 是 食物对gfpdsRNA 0.1031 0,7481 否
2α<0.05
表11-NL
1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
x2 P值 Sig.Dif.2 食物对： NL002 1μg/μl 57.53 <0.0001 是 NL002 0.2μg/μl 74.54 <0.0001 是 NL002 0.08μg/μl 64 <0.0001 是 NL002 0.04μg/μl 39.49 <0.0001 是
2α<0.05
实施例1：在高通量筛选中沉默秀丽隐杆线虫中的靶基因
在pGN9A载体(WO 01/88121)中相同的两个T7启动子和终止 子之间制备秀丽隐杆线虫基因组范围的文库，其在T7聚合酶表达的情 况下通过IPTG诱导而驱动有义和反义方向的表达。
以96孔板的形式，将此文库转化入AB301-105(DE3)细菌菌株。 为了在基因组范围进行筛选，用这些细菌细胞喂食核酸酶缺陷型秀丽隐 杆线虫nuc-1(e1392)株。
遵循下述步骤，在96孔板中用所述AB301-105(DE3)细菌菌株 中产生的dsRNA喂食秀丽隐杆线虫nuc-1(e1392)：将nuc-1卵移至不 同的板中，并使其在20℃同时孵化从而使L1代同步化。将包含IPTG 的100μL液体生长培养基以及含有秀丽隐杆线虫dsRNA文库的OD6001 的10μL AB301-105(DE3)细菌细胞培养物加至96孔板中，所述文库 中每个载体包含用于表达所述dsRNA的秀丽隐杆线虫基因组片段。将 4只同步化的L1线虫加至每个孔中，在25℃孵育至少4至5天。这些 实验一式四份进行。在所述筛选中使用了6种对照：
-pGN29＝阴性对照，野生型
-pGZ1＝unc-22＝颤搐表型
-pGZ18＝几丁质合酶＝胚胎致死
-pGZ25＝pos-1＝胚胎致死
-pGZ59＝bli-4D＝急性致死
-ACC＝乙酰辅酶A羧化酶＝急性致死
5天后，将用产生dsRNA的细菌喂食的秀丽隐杆线虫nuc-1 (e1392)与用空载体(pGN29)及其它对照喂食的线虫的表型进行比 较。针对亲代(P0)的(急性的或幼虫的)致死性、子一代(F1)的(胚 胎)致死性或者针对P0的生长阻滞对使用所述dsRNA喂食的线虫进行 筛选，具体如下：(i)P0的急性致死：L1不发育且死亡，该表型不产 生后代，所述孔看上去相当空；(ii)P0的(幼虫)致死：P0在比L1 更晚的阶段死亡，该表型也不产生后代。在孔中发现死亡的幼虫或死亡 的成虫；(iii)F1致死：L1发育至成虫阶段并仍然存活。该表型不产生 后代。这可能是由于不育、胚胎致死(孔底部有死亡的卵)、胚胎停滞 或幼虫停滞(最终致死)；(iv)生长停滞及生长阻滞/延迟：与包含正常 发育和正常后代数的孔进行比较。
对于表1A中所示的靶序列来说，所得结论为：在线虫(如秀丽 隐杆线虫)中由dsRNA介导的秀丽隐杆线虫靶基因沉默对线虫的生长 和存活具有重要影响。
在上述dsRNA沉默实验之后，在24孔板中以高通量形式对秀丽 隐杆线虫进行更细致的表型实验。按照如下步骤，用如上所述 AB301-105(DE3)细菌菌株中得到的dsRNA文库喂食24孔板中的秀 丽隐杆线虫nuc-1(e1392)，具体如下：将nuc-1卵移至不同的板中， 并使其在20℃同时孵化从而使L1代同步化。然后，将100只同步化的 L1线虫浸泡于500μL S完全喂食培养基(含有5μg/mL胆固醇、4μL/mL PEG和1mM IPTG)和包含秀丽隐杆线虫dsRNA文库的OD600为1的 500μL AB301-105(DE3)细菌细胞培养物的混合物中，所述文库中每 个载体包含用于表达所述dsRNA的秀丽隐杆线虫基因组片段。将被浸 泡的L1线虫在25℃滚动孵育2小时。
在离心并除去950μL上清液后，将所剩5μL经重悬的沉淀(包 含约10至15只线虫)移至24孔板每个孔的中部，加入一层琼脂LB 液体培养基。将所接种的板在25℃孵育2天。在成虫阶段，挑出单只成 虫并在25℃孵育2天用于检查其后代。在最初的24孔板上原位检查其 它线虫成虫。一式四份地进行这些实验。
用另一批线虫重复上述细致的表型筛选，唯一的区别在于第二批 线虫在20℃孵育3天。
对用秀丽隐杆线虫dsRNA喂食的线虫之表型以及用所述空载体 喂食的秀丽隐杆线虫nuc-1(e1392)之表型进行比较。
基于该实验，所得结论为：如表1A中所示秀丽隐杆线虫靶基因 的沉默对于线虫的生长和存活具有重要影响，所述靶基因对于线虫的存 活是必需的。因此，这些基因是利用dsRNA介导的基因沉默来防治(杀 死或阻止其生长)线虫的理想靶基因。因此，本发明包括上述秀丽隐杆 线虫靶基因的线虫直向同源物用于防治线虫侵害(例如线虫对植物的侵 害)的用途。
实施例2：鉴定黑腹果蝇的直系同源物
如实施例1中所述，鉴定了许多秀丽隐杆线虫的致死序列，并且 所述致死序列可用于鉴定其它种属中的直向同源物。例如，所述秀丽隐 杆线虫致死序列可用于鉴定黑腹果蝇的直向同源序列。也就是说，可使 用每种秀丽隐杆线虫序列在公共数据库(例如GenBank)中检索黑腹果 蝇的直向同源物。选择具有高度序列同源性的(E值优选小于或等于 1E-30)可能的黑腹果蝇直向同源物，所述序列是相互blast的最佳命中 结果，后者指来自不同生物(例如秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇)的序列相 互为最佳blast命中结果。例如，使用BLAST将来自秀丽隐杆线虫的 序列C与黑腹果蝇的序列D进行比对。如果黑腹果蝇序列D是序列C 的最佳命中结果，并且与秀丽隐杆线虫的所有序列进行比对时序列C也 是D的最佳命中结果，那么D和C是相互最佳命中结果。该标准常用 于定义直系同源物，意指不同物种中具有相似功能的相似序列。所鉴定 的黑腹果蝇序列示于表1A。
实施例3：马铃薯叶甲(Colorado potato beetle，CPB)
A.克隆来自马铃薯叶甲的部分基因序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从4个不 同幼虫阶段的马铃薯叶甲(科罗拉多甲虫；来源：Jeroen van Schaik， Entocare CV Biologische Gewasbescherming，Postbus 162，6700 AD Wageningen，the Netherlands)分离高质量的完整RNA。按照制造商 的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去该RNA制备 物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售试剂盒 (SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen，Rockville， Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含LD001、LD002、LD003、LD006、LD007、LD010、 LD011、LD014、LD015、LD016、LC018和LD027基因一部分的cDNA 序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold(Cat.Nr. N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-LD中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列，其显示了包 括引物序列和所得cDNA序列的马铃薯叶甲靶基因。使用这些引物进行 各自的PCR反应，其使用以下条件：95℃ 10分钟，然后是40个循环 的95℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼 脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR8/GW/topo载体(Cat.Nr. K2500 20，Invitrogen)并测序。表2-LD中给出了用各自SEQ ID NO表 示的所得PCR产物的序列，并且其为部分序列。表3-LD中给出了用各 自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序列，其中读码框的起点在括号 中指明。
B.产生马铃薯叶甲基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个单独的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-LD中给出了用于扩增每种靶序列有义模板 的各引物的序列。所述PCR反应的条件如下：95℃ 4分钟，然后是35 个循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。 在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7 反向引物得到反义T7模板。表8-LD中给出了用于扩增每种靶基因反 义模板的各引物的序列。在琼脂糖凝胶上分析所得的PCR产物，并通 过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106， Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的 T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA 酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-LD中给出了每种靶基 因所得dsRNA的有义链。表8-LD显示了用于制备马铃薯叶甲靶序列 的dsRNA片段的序列和多联体序列，其包括引物序列。
C.针对马铃薯叶甲的活性，使用人工饲料对dsRNA靶标进行筛选
如下制备马铃薯叶甲的人工饲料(修改自Gelman et al.，2001，J. Ins.Sc.，vol.1，no.7，1-10)：对水和琼脂进行高压灭菌，当温度降至55℃ 时加入其余的成分(如下文表A中所示)。在此温度下，均匀混合所述 成分，然后将所述饲料以每孔1ml的量等分至24孔板(Nunc)。使所 述人工饲料在室温下冷却而固化。饲料在4℃最多保存3周。
表A：人工饲料的成分
成分 1L体积 水 768ml 琼脂 14g 燕麦片 40g 圆酵母 60g 水解乳白蛋白 30g 酪蛋白 10g 果糖 20g Wesson盐混合物 4g 番茄果粉末 12.5g 土豆叶粉末 25g β-谷甾醇 1g 山梨酸 0.8g 羟苯甲酸甲酯 0.8g Vanderzant维生素混合物 12g 硫酸新霉素 0.2g 金霉素 0.130g 利福平 0.130g 氯霉素 0.130g 制霉菌素 0.050g 大豆油 2ml 小麦胚芽油 2ml
将浓度为1mg/ml的50μl dsRNA溶液局部应用至多孔板孔内的 固体人工饲料上。所述饲料在层流柜(laminair flow cabin)中进行干 燥。针对每种处理，测试24只马铃薯叶甲幼虫(第2阶段)，其中每孔 两只昆虫。所述板在昆虫饲养室中保存，其条件为25±2℃，60％相对 湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。每1、2或3天评估所述甲虫的存 活情况。7天后，对于靶标LD006、LD007、LD010、LD011和LD014， 用包含相同浓度(1mg/ml)的局部应用dsRNA的新鲜饲料替换所述饲 料；对于LD001、LD002、LD003、LD015和LD016，仅用新鲜饲料替 换所述饲料。将所述dsRNA靶标与只有饲料或包含局部应用dsRNA的 饲料(对应于GFP(green fluorescent protein，绿色荧光蛋白)编码序 列(SEQ ID NO 235)片段)进行比较。
如两个独立的生物测定中所显示的，用含有完整裸dsRNA的人工 饲料喂食马铃薯叶甲幼虫导致幼虫死亡率显著增加(图1LD-2LD)。
7至14天后，所有被测的dsRNA最终导致100％死亡率。在整个 所述的生物测定中，含有或不含GFP dsRNA的饲料使所述昆虫几乎没 有或没有死亡。
通常，在所观察的所有测定中，用含有或不含dsRNA的饲料喂食 的CPB第二阶段幼虫正常喂食2天并蜕皮成为第3阶段幼虫。在该新 的幼虫阶段，观察到CPB的进食显著减少或完全停止，导致死亡率提 高。
D.针对马铃薯叶甲的活性，使用马铃薯叶盘对dsRNA靶标进行生物测 定
应用了使用马铃薯叶材料而非人工饲料作为CPB食物来源的可 替代的生物测定法。使用合适尺寸的穿孔器从2至3周龄的马铃薯植物 叶子切下直径约1.1cm(或0.95cm2)的叶盘。通过将10ng/μl的20μl 靶标LD002 dsRNA或对照gfp dsRNA溶液施加到近轴叶表面来制备经 处理的叶盘。使叶盘干燥并分别单独置于24孔板(Nunc)的24个孔中。 将单只第2幼虫阶段的CPB置于每个孔中，然后用棉纸和多孔板的塑 料盖将其覆盖。将包含所述昆虫和叶盘的板置于昆虫室中，其条件为 28℃以及16小时光照/8小时黑暗的光周期。使所述昆虫进食叶盘2天， 之后将所述昆虫移至包含经处理的新鲜叶盘的新平板中。之后，每天将 所述昆虫移至包含未处理叶盘的平板，直至第7天。记录昆虫死亡率和 重量。
用包含表面施加的完整裸dsRNA(靶标LD002)的马铃薯叶盘喂 食马铃薯叶甲幼虫导致幼虫死亡率显著增加(即在第7天所有昆虫死亡； 100％死亡率)，而对照gfp dsRNA对CPB的存活没有影响。靶标LD002 dsRNA在2至3天后严重影响幼虫的生长，而用相同浓度gfp dsRNA 喂食的幼虫发育正常(图3-LD)。
E.针对马铃薯叶甲的活性，使用人工饲料对较短形式的dsRNA进行筛 选
本实施例举例说明：较短的(60或100bp)dsRNA片段本身或 作为多联体构建体足以造成对马铃薯叶甲的毒性。
选择LD014用于该实施例，已知其是在马铃薯叶甲中诱导致死性 的靶标。该基因编码V-ATP酶亚基E(SEQ ID NO 15)。
还选择了100个碱基对的片段LD014_F1(在SEQ ID NO 15的 195-294位，SEQ ID NO 159)和60个碱基对的片段LD014_F2(在SEQ ID NO 15的235-294位，SEQ ID NO 160)。也参见表7-LD。
设计了两个300碱基对的多联体，LD014_C1和LD014_C2(SEQ ID NO 161和SEQ ID NO 162)。LD014_C1包含上述100个碱基对片段 (SEQ ID NO 159)的3个重复，LD014_C2包含上述60个碱基对片段 (SEQ ID NO 160)的5个重复。也参见表7-LD。
合成片段LD014_F1和LD014_F2作为有义和反义引物。在进行 克隆之前，将这些引物退火从而得到双链DNA分子。在所述引物的5’ 和3’端分别包含XbaI和XmaI限制性位点，以便进行克隆。
所述多联体为300个碱基对的合成基因。在该合成DNA片段的5’ 和3’端分别包含XbaI和XmaI限制性位点，以便进行克隆。
用XbaI和XmaI消化4种DNA分子，即两种单一单元(LD014_F1 和LD014_F2)和两种多联体(LD014_C1和LD014_C2)，并将其分别 亚克隆至被XbaI和XmaI消化从而线性化的pBluescriptII SK+中，分 别得到重组质粒p1、p2、p3和p4。
双链RNA的产生：使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr.P1700，Promega)合成dsRNA。在两个独立的PCR反 应中得到最初两种独立的单个5’T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应 包含与T7启动子方向不同的靶序列。对于LD014_F1来说，使用特异 性T7正向引物oGBM159和特异性反向引物oGBM164(本文分别用 SEQ ID NO 204和SEQ ID NO205表示)在PCR反应中使用下述条件 产生有义T7模板：95℃ 4分钟，然后是35个循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。使用特异性正向引物 oGBM163和特异性T7反向引物oGBM160(本文分别用SEQ ID NO 206 和SEQ ID NO 207表示)在使用与上述相同条件的PCR反应中产生反 义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试 剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以及 NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向 模板混合从而进行转录，将所得到的RNA链退火、进行DNA酶和RNA 酶处理并利用醋酸钠进行纯化。所得dsRNA的有义链在本文中表示为 SEQ ID NO 203。
对于LD014_F2来说，使用特异性T7正向引物oGBM161和特异 性反向引物oGBM166(本文分别用SEQ ID NO 209和SEQ ID NO 210 表示)在PCR反应中使用下述条件产生有义T7模板：95℃ 4分钟，然 后是35个循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10 分钟。使用特异性正向引物oGBM165和特异性T7反向引物oGBM162 (此处分别用SEQ ID NO 211和SEQ ID NO 212表示)在使用与上述 相同条件的PCR反应中产生反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所得 PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat. Nr.28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将 所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得到的RNA链 退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。所得dsRNA 的有义链在本文中表示为SEQ ID NO 208。
同样地，对于所述多联体来说，在两个独立的PCR反应中得到最 初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与T7 启动子方向不同的靶序列。用XbaI或XmaI对包含LD014_C1和 LD014_C2的所述重组质粒p3和p4进行线性化，对每种构建体的两种 线性片段进行纯化，并用作体外转录测定的模板，所述体外转录使用所 述克隆位点侧翼的T7启动子。使用T7RiboMAXTM Express RNAi System(Promega)通过体外转录制备双链RNA。所得dsRNA(针对 LD014_C1和LD014_C2)的有义链在本文中分别表示为SEQ ID NO 213和214。
如图4-LD所示，靶标LD014的较短序列和多联体能够在马铃薯 叶甲中诱导致死性。
F.针对马铃薯叶甲的活性，使用人工饲料对不同浓度的dsRNA进行筛 选
将50μl dsRNA溶液局部应用至24孔板(Nunc)孔内的固体人 工饲料上，所述dsRNA溶液采用从1μg/μl(对于靶标LD027来说从 0.1μg/μl)降至0.01ng/μl的一系列十倍浓度。所述饲料在层流柜中进 行干燥。针对每种处理，测试24只马铃薯叶甲幼虫(第2阶段)，其中 每孔两只昆虫。所述板在昆虫饲养室中保存，其条件为25±2℃，60％ 相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。以固定的时间间隔(最多 14天)来评估所述甲虫的存活情况。7天后，用包含相同浓度的局部应 用dsRNA的新鲜饲料替换所述饲料。将所述dsRNA靶标与只有饲料时 进行比较。
如图5-LD所示，，用含有针对不同靶标的完整裸dsRNA(浓度低 至0.1～10ng dsRNA/μl)的人工饲料喂食马铃薯叶甲幼虫导致高幼虫 死亡率。
G.将CPB基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具 有活性的双链RNA
尽管可使用任何有效的细菌启动子，然而将对应于CPB基因靶标 的DNA片段克隆进用于在细菌宿主中表达双链RNA的载体中(参见 WO 00/01846)。
表8-LD提供了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模 板是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR 反应，其使用以下条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、 55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析 所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参 考WO00188121A1)并测序。表8-LD中给出了对应于各自序列的所得 PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称作pGBNJ003。
表8-LD中提供了用于扩增靶基因片段LD010的特异性引物的序 列(正向引物SEQ ID NO 191和反向引物SEQ ID NO 190)。所使用的 模板是含有LD010序列(SEQ ID NO 11)的pCR8/GW/topo载体。使 用所述引物进行PCR反应，其采用以下条件：98℃ 5分钟，然后是30 个循环的98℃ 10秒、55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。 在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化 的pGNA49A载体中(参考WO00188121A1)并测序。表8-LD中给出 了对应于SEQ ID NO 188的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组 载体称为pGBNJ003。
H.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的靶标LD010的双链 RNA，该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株 (AB301-105(DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21 (DE3))进行比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGBNJ003的双链 RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合 酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的侧翼 是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
I.针对马铃薯叶甲，对表达dsRNA靶标LD010的大肠杆菌进行实验室 试验检测
使用两种生物测定方法来检测针对马铃薯叶甲幼虫的大肠杆菌所 产生的双链RNA：(1)基于人工饲料的生物测定，和(2)基于植物的 生物测定。
基于人工饲料的生物测定
如前面实施例3C中所述制备马铃薯叶甲的人工饲料。将半毫升 饲料分配至48孔多孔测试板(Nunc)的每个孔中。对于每种处理来说， 将表达dsRNA的OD为1的50μl热处理细菌悬液(其等同于约5×107 个细菌细胞)局部应用至孔中的固体饲料上，并使该板在层流箱中干燥。 针对每种处理，检测48只第2阶段的马铃薯叶甲幼虫，其中每个含有 饲料和细菌的孔中包含一只马铃薯叶甲幼虫。板的每一行(即8个孔) 作为一个重复。将所述板保存在昆虫饲养室中，其条件为25±2℃，60 ±5％相对湿度，16:8小时的光照：黑暗光周期。每4天后，将所述甲虫 移至包含局部应用细菌的新鲜饲料。昆虫侵害后每1或3天评估所述甲 虫的存活情况。对于存活的昆虫，在侵害后第7天记录幼虫的重量从而 记录其生长和发育。
对于RNA酶III缺失的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌株来说， 在生物测定中测试含有质粒pGBNJ003及含有空质粒pGN29(参照WO 00/188121A1)的细菌对CPB的毒性。包含pGBNJ003质粒的细菌显示 昆虫死亡率随时间而明显增加，然而观察到pGN29和只有饲料的对照 几乎没有或没有死亡(图6a-LD和7a-LD)。在喂食含表达dsRNA靶标 LD010的细菌的人工饲料后第7天，存活的马铃薯叶甲幼虫的生长严重 阻滞(表10-LD，图8a-LD，图13-LD)。
对于大肠杆菌BL21(DE3)菌株来说，针对马铃薯叶甲幼虫检测 包含质粒pGBNJ003的细菌和包含空载体pGN29的细菌。用含BL21 (DE3)细菌的饲料喂食的幼虫中观察到与RNA酶III缺失菌株 AB301-105(DE3)类似的有害影响(图6b-LD和7b-LD)。然而，对 于5个克隆的存活数来说，BL21(DE3)要高于AB301-105(DE3)； 在第12天，该菌株的平均死亡率值比RNA酶III缺失菌株约低25％。 另外，用含有表达dsRNA(对应于靶标LD010)的BL21(DE3)的饲 料喂食的存活昆虫的平均重量显著降低(表10-LD，图8b-LD)。
用包含两细菌菌株(含有质粒pGBNJ003)之一的饲料喂食的CPB 幼虫的生长和发育延迟直接与进食抑制有关，因为与包含空载体pGN29 的细菌或只有饲料的平板相比，从第4天起所更换平板的孔中无可见幼 虫粪便。该观察类似于用局部应用至人工饲料的体外转录的双链RNA 喂食CPB的情形(参见实施例3D)；这里，从处理饲料第2天起发生 停止进食。
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的悬液喷洒整株马铃薯植物，然后用所 述植物喂食CPB幼虫。“V系”品种的马铃薯植物(Wageningen University)在具有下述条件的植物培养室中从块茎生长至8-12片展开 叶的阶段：25±2℃，60％相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。通 过将500ml塑料瓶倒置于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于 盆内泥土中，在瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少 内部凝结(condensation)并防止幼虫逃脱。将15只L1阶段的马铃薯 叶甲幼虫放置在罩中的每株经处理植物上。用包含pGBNJ003质粒(克 隆1；图7a-LD)或pGN29质粒(克隆1；参见图7a-LD)的大肠杆菌 AB301-105(DE3)的悬液处理植物。向植物应用不同量的细菌：66、 22和7个单位，其中一个单位定义为：在600nm波长下吸光度值为1 的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用喷雾器将总体积 1.6ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用一株植物。计数存活 昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGBNJ003的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。当细菌细胞悬液的量稀释9倍时，死亡率计数保持不变(图 9-LD)。用包含pGBNJ003载体的细菌喷洒的植物上第11天的存活幼 虫平均重量比pGN29的约低10倍(图10-LD)。与用包含空载体pGN29 的细菌喷洒的马铃薯植物相比，CPB幼虫对用包含pGBNJ003质粒的 细菌喷洒的马铃薯植物造成的进食损害显著降低(图11-LD)。
这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺失的细菌表达系统中产 生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫具有毒性，所述毒性表 现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验 还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损 害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA的细 菌组成。
J.针对马铃薯叶甲，测试表达dsRNA靶标LD010的大肠杆菌培养物的 多种悬液密度
细菌培养物的制备和处理描述于实施例3J中。将表达靶标LD010 双链RNA的大肠杆菌RNA酶III缺失菌株AB301-105(DE3)培养物 的三倍系列稀释物(从0.25个单位等价物开始)施加至8-12片展开叶 阶段的马铃薯植物变种“Bintje”。将10只马铃薯叶甲L1幼虫置于经处 理的植物上，每种处理一株植物。在第7天(即昆虫侵害后7天)对昆 虫的死亡率和生长阻滞打分。
如图14-LD所示，在用经处理的马铃薯植物喂食昆虫1周后记录 到高CPB幼虫死亡率(90～100％)，所述处理是通过细密喷洒浓度为 0.25、0.08和0.025细菌单位的大肠杆菌热灭活培养物进行局部应用， 所述大肠杆菌包含质粒pGBNJ003(用于表达靶标10dsRNA)。在0.008 单位时，约三分之一的昆虫死亡，但是，存活昆虫显著小于对照组(包 含空载体pGN29的大肠杆菌以及只有水)。与用包含空载体pGN29的 细菌喷洒的马铃薯植物相比，CPB幼虫对用包含pGBNJ003质粒的浓 度为0.025或0.008单位的细菌喷洒的马铃薯植物造成的进食损害显著 降低(图15-LD)。
K.成虫对经口摄取的对应于靶基因的dsRNA极其敏感
下文所提供的实施例突出显示了，昆虫成虫(不仅是幼虫阶段的 昆虫)对经口摄取的对应于靶基因的dsRNA极其敏感。
选择4种靶标用于该实验：靶标2、10、14和16(分别为SEQ ID NO 168、188、198和220)。GFP片段dsRNA(SEQ ID NO 235)用作 对照。从我们实验室饲养的培养物中随机挑选年幼成虫(2-3日龄)，对 昆虫性别无偏好性。每种处理选择10只成虫。在处理开始前，所述成 虫预先饥饿至少6小时。在处理的第一天，用4个马铃薯叶盘(直径1.5 cm2)喂食每只成虫，每个所述马铃薯叶盘通过局部应用0.1μg/μl的25 μl靶标dsRNA(如实施例3A所述进行合成；局部应用如实施例3E所 述)进行预处理。将每只成虫限制在小的培养皿(直径3cm)中以确保 所有昆虫摄食等量的食物，并因此接受等剂量的dsRNA。第二天，如 上所述再次对每只成虫喂食4个经处理的叶盘。第三天，收集每种处理 的所有10只昆虫，并一起放置于由塑料盒(尺寸30cm×20cm×15cm) 组成的罩中，所述塑料盒的盖子中带有细密尼龙网以提供良好通风。在 所述塑料盒中，其底部放置了一些潮湿滤纸。所述滤纸上面放置了一些 (未处理的)马铃薯叶，从而在实验过程中维持成虫。从第5天起，进 行定期评估从而对死亡、存活(可动的)和濒死昆虫数目进行计数。对 于濒死昆虫来说，将其背部朝下放置来检查它们能否在几分钟内自己翻 身；只有不能翻身的昆虫被认为是濒死的。
在该实验中表明，对应于不同靶标的双链RNA对马铃薯叶甲成 虫明显的特异性毒性作用(图12-LD)。对应于gfp片段的双链RNA在 最终评估日(第19天)显示出对CPB成虫没有毒性。该实验清楚地显 示，当经口递送接触到dsRNA仅几天后CPB成虫的存活就显著降低。 例如，对于靶标10来说，在第5天，10只成虫中的5只濒死(病态且 移动缓慢)；在第6天，10只成虫中的4只死亡，存活昆虫中3只濒死； 在第9天，观察到所有成虫均死亡。
作为该实验的结论，可将针对昆虫害虫的靶标双链RNA的应用 扩展至包括可造成广泛的作物破坏之昆虫害虫的两个生活阶段(即幼虫 和成虫)，所述昆虫害虫，如马铃薯叶甲的情形。
实施例4：辣根猿叶甲(Mustard leaf beetle，MLB)
A.通过家族PCR(family PCR)克隆辣根猿叶甲PC001、PC003、PC005、 PC010、PC014、PC016和PC027基因的部分序列。
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从辣根猿叶 甲(辣根猿叶甲；来源：Dr.Caroline Muller，Julius-von-Sachs-Institute for Biosciences，Chemical Ecology Group，University of Wuerzburg， Julius-von-Sachs-Platz 3，D-97082 Wuerzburg，Germany)第3阶段幼 虫分离高质量的总RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700， Promega)处理除去RNA制备物中存在的基因组DNA。按照制造商的 说明，使用市售试剂盒(SuperscriptTM III Reverse Transcriptase，Cat.Nr. 18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含PC001、PC003、PC005、PC010、PC014、PC016 和PC027基因一部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明 使用Amplitaq Gold(Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系 列PCR反应。
表2-PC中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些 引物进行各PCR反应，其使用以下条件：95℃ 10分钟，然后是40个 循环的95℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。 在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR4/TOPO载体 (Cat.Nr.K4530-20，Invitrogen)并测序。表2-PC中给出了用各自SEQ ID NO表示所得PCR产物的序列，并且其为部分序列。
表3-PC中给出了用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序 列。表3-PC提供了cDNA克隆的氨基酸序列，其中读码框的起点在括 号中指明。
B.产生辣根猿叶甲基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含 与T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-PC中给出了用于扩增每种靶序列有义模板 的各引物的序列。表8-PC提供了制备辣根猿叶甲靶序列的dsRNA片段 之细节，其包括引物序列。
PCR反应的条件如下：95℃ 1分钟，然后是20个循环的95℃ 30 秒、60℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是15个循环的95℃ 30秒、50℃ 30 秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在使用与上述相同条件的PCR 反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。 表8-PC中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂 糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。按 照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录， 将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯 化。表8-PC中给出每种靶基因所得dsRNA的有义链。
C.对转基因拟南芥植物进行桃蚜侵害实验室试验
得到转基因植物
使用浸花法(Clough and Bent(1998)Plant Journal 16 735-743)转 化拟南芥植物。将所述植物的地上部分在含有以下物质的溶液中孵育数 秒，所述溶液含有5％蔗糖、来自过夜培养物的重悬根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1 Rif细胞以及0.03％的表面 活性剂Silwet L-77。接种后，用透明塑料覆盖植物16小时以保持湿度。 为了提高转化效率，一周后重复所述步骤。当种子成熟后停止浇水，收 获干燥的种子并冷处理两天。灭菌后，将种子铺在含卡那霉素的生长培 养基中用以选择转化植物。
将所选植物移至泥土用以最佳地产生T2种子。
生物测定
通过使分离的T2种子在适当的选择培养基上萌发来选择转基因 拟南芥植物。当这些转基因植物的根完全形成时，将它们移至新鲜的人 工生长培养基或泥土，使它们在最佳条件下生长。针对桃蚜若虫来检测 整株转基因植物，以显示(1)对摄食若虫造成的植物损害具有显著抗 性，(2)若虫死亡率提高，和/或(3)存活若虫的重量减少(或任何其 它的昆虫发育异常)。
D.针对辣根猿叶甲幼虫的活性，使用油菜叶盘对dsRNA靶标进行实验 室试验检测
下文提供的实施例举例说明了辣根猿叶甲幼虫对经口摄入的对应 于自身靶基因的dsRNA敏感。
为了测试针对MLB幼虫的不同双链RNA样品，采用了使用油菜 (Brassica napus变种SW Oban；来源Nick Balaam，Sw Seed Ltd.，49 North Road，Abington，Cambridge，CB1 6AS，UK)叶材料作为食物来源 的叶盘测定。在昆虫室中相同变种的油菜上维持所述昆虫培养物，其条 件为25±2℃，60±5％相对湿度，16小时光照/8小时黑暗的光周期。 使用合适尺寸的穿孔器从4至6周龄的油菜植物切下直径约1.1cm(或 0.95cm2)的叶盘。用含有0.05％ Triton X-100的Milli-Q水将双链RNA 样品稀释到0.1μg/μl。通过将25μl的靶标PC001、PC003、PC005、PC010、 PC014、PC016、PC027dsRNA和对照gfp dsRNA的稀释溶液或者0.05 ％ Triton X-100施加到近轴叶表面来制备经处理的叶盘。将所述叶盘干燥 并分别置于24孔板的每一个孔中，所述孔含有1ml凝胶化的2％琼脂， 其有利于防止所述叶盘干枯。将两只新生MLB幼虫置于所述板的每个 孔中，然后用多孔塑料盖将其盖上。将所述板(每种处理包含48只昆 虫)分为4个重复，每个重复包含12只昆虫(每行)。将包含所述昆虫 和叶盘的平板保存在昆虫室中，其条件为25±2℃，60±5％相对湿度， 16小时光照/8小时黑暗的光周期。用叶盘喂食昆虫2天，之后将它们 移至含有新近处理的叶盘的新平板。然后，在生物测定开始后4天，收 集来自每个重复的昆虫并移至含未经处理新鲜油菜叶的培养皿。在第2、 4、7、9和11天记录幼虫死亡率和平均重量。
对于所有被测靶标，用经完整裸靶标dsRNA处理的油菜叶喂食辣 根猿叶甲幼虫均导致幼虫死亡率显著增加，如图1(a)所示。针对靶标 PC010的被测双链RNA在第9天导致100％幼虫死亡，而针对靶标 PC027的被测双链RNA在第11天导致100％幼虫死亡。对于所有其它 的靶标，与对照gfp dsRNA、只有0.05％ Trition X-100或仅有未处理的 叶相比在第11天达到高死亡率值：(平均值百分数±α0.05的置信区间) PC001(94.4±8.2)，PC003(86.1±4.1)，PC005(83.3±7.8)，PC014(63.9 ±20.6)，PC016(75.0±16.8)，gfp dsRNA(11.1±8.2)，0.05％ Triton X-100 (19.4±10.5)，只有叶(8.3±10.5)。
基于它们的平均重量来评估存活的幼虫。对于所有被测靶标，在所 述生物测定4天后，辣根猿叶甲幼虫的平均重量显著降低；喂食对照gfp dsRNA或仅有0.05％ Trition X-100的昆虫发育正常，与仅摄食叶的幼 虫一样(图1(b)-PC)。
E.针对辣根猿叶甲幼虫的活性，使用油菜叶盘对不同浓度dsRNA进行 实验室试验筛选
如上文实施例4D所述，将25μl来自靶标PC010或PC027的 dsRNA溶液局部应用至油菜叶盘上，所述dsRNA溶液采用10倍系列 浓度(从0.1μg/μl降至0.1ng/μl)。作为阴性对照，将仅有0.05％ Triton X-100施加到所述叶盘。针对每种处理，检测24只辣根猿叶甲新生幼 虫，其中每孔两只昆虫。在昆虫饲养室中保存所述平板，其条件为25± 2℃，60±5％相对湿度，16：8小时的光照：黑暗光周期。在第2天，将 所述幼虫移至含有新鲜的经dsRNA处理的叶盘的新平板上。在第4天 (针对靶标PC010)和第5天(针对靶标PC027)，将来自每个重复实 验的昆虫移至含充足的未处理叶材料的培养皿。在第2、4、7、8、9和 11天(针对标PC010)以及在第2、5、8、9和12天(针对靶标PC027) 评估所述甲虫的存活情况。
如图2(a)和(b)中所示，用含有两种不同靶标(PC010和PC027) 之完整裸dsRNA(以低至1ng dsRNA/μl的溶液浓度)的油菜叶盘喂食 辣根猿叶甲导致高死亡率。针对不同浓度dsRNA的平均死亡率值百分 数±α0.05的置信区间：对于靶标PC010来说第11天为，0μg/μl：8.3 ±9.4，0.1μg/μl：100，0.01μg/μl：79.2±20.6，0.001μg/μl：58.3±9.4，0.0001 μg/μl：12.5±15.6；对于PC027来说在第12天为，0μg/μl：8.3±9.4，0.1 μg/μl：95.8±8.2，0.01μg/μl：95.8±8.2，0.001μg/μl：83.3±13.3，0.0001 μg/μl：12.5±8.2。
F.将MLB基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于MLB基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-PC中提供了用于扩增靶基因片段PC010的特异性引物序列。 所使用的模板是含有PC010序列(SEQ ID NO 253)的pCR8/GW/topo 载体。所述引物用于使用以下条件的递减PCR(touch-down PCR)反 应中：95℃ 1分钟，然后是20个循环的95℃ 30秒、60℃ 30秒(每个 循环其温度降低0.5℃)和72℃1分钟，然后是15个循环的95℃ 30秒、 50℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析 所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参 考WO00188121A1)并测序。表8-PC给出了对应于SEQ ID NO 488 的所得PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGCDJ001。
G.在一个大肠杆菌菌株AB301-105(DE3)中表达和产生双链RNA靶 标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。在该实验中，使用RNA酶III缺失的 菌株AB301-105(DE3)。
转化AB301-105(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细胞20分钟，之后 对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回至冰上并再保持5 分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞，并将该悬液于37℃ 在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细胞悬液移至含有150 mlLB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液体培养基补充有100 μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在Innova 4430摇床(250 rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双链RNA。在化学诱 导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7聚合物将以反义和正 义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述把序列的侧翼是相反方向的 T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于总体积为50ml的0.05％ Triton X-100溶液中。所述管 保存在4℃备用。
H.针对辣根猿叶甲，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检 测
叶盘生物测定
针对辣根猿叶甲幼虫，应用叶盘生物测定法来检测大肠杆菌产生 的靶标PC010双链RNA(来自质粒pGCDJ001)。如实施例4所述，从 油菜叶制备叶盘。将20μl细菌悬液(在600nm波长的吸光度值为1) 加至每个叶盘上。将所述叶盘置于24孔板的孔中，所述孔含有1ml凝 胶化的琼脂。将两只新生幼虫加至每个叶盘上。对于每种处理来说，准 备3个重复实验，其中每个重复实验包含16只新生幼虫。所述平板保 存在昆虫饲养室中，其条件为25±2℃，60±5％相对湿度，16:8小时 的光照：黑暗光周期。在第3天(即生物测定开始后3天)，将幼虫移至 含新鲜的经处理(相同剂量)叶盘的新平板。从第5天起，每隔一天更 换叶材料一次。该生物测定对死亡率和平均重量打分。阴性对照是用包 含质粒pGN29(空载体)的细菌处理的叶盘以及只有叶子。
在用含质粒pGCDJ001的RNA酶III缺失大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株处理的油菜叶喂食辣根猿叶甲幼虫后，所述昆虫的死亡率 随时间显著增加，而在对照的包含质粒pGN29的细菌或只有叶子的情 形中几乎没有或没有昆虫死亡(图3-PC)。
基于植物的生物测定
用热失活的化学诱导的表达dsRNA之细菌悬液喷洒整株植物，然 后用所述植物喂食MLB。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑 料瓶倒置于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在 瓶底部切个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止 幼虫逃脱。将MLB置于罩中的每株经处理的植物上。用包含pGCDJ001 或pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)菌株悬液处理植物。向 植物施加不同量的细菌：例如66、22和7个单位，其中一个单位定义 为：在600nm波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。 在每种情况下，用喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验 中，每种处理使用一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的 重量。
用表达来自pGCDJ001的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺失的细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例5：墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle，MBB)
A.克隆墨西哥豆瓢虫的部分基因序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从4个不 同幼虫阶段的墨西哥豆瓢虫(墨西哥豆瓢虫；来源：Thomas Dorsey， Supervising Entomologist，New Jersey Department of Agriculture，Division of Plant Industry，Bureau of Biological Pest Control，Phillip Alampi Beneficial Insect Laboratory，PO Box 330，Trenton，New Jersey 08625-0330， USA)中分离高质量的总RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat. Nr.1700，Promega)处理除去该RNA制备物中的基因组DNA。按照制 造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr. 18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含EV005、EV009、EV010、EV015和EV016基因一部 分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold (Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-EV中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列，其显示了包 括引物序列和所得cDNA序列的墨西哥豆瓢虫靶基因。使用这些引物进 行各PCR反应，其使用以下条件：对于EV005和EV009来说，95℃ 10 分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、50℃ 1分钟和72℃ 1分30秒， 然后是72℃ 7分钟；对于EV014来说，95℃ 10分钟，然后是40个循 环的95℃ 30秒、53℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 7分钟；对于 EV010和EV016来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、 54℃ 1分钟和72℃ 1分40秒，然后是72℃ 7分钟。在琼脂糖凝胶上分 析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其克隆入pCR4/TOPO载体(Cat.Nr.K4530-20， Invitrogen)并测序。表2-EV中给出了用各自SEQ ID NO表示的所得 PCR产物的序列，并且其为部分序列。表3-EV中给出了用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序列，其中读码框的起点在括号中指明。
B.产生墨西哥豆瓢虫基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个单独的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-EV中给出了用于扩增每种靶序列有义模板 的各引物的序列。
所述PCR反应的条件如下：95℃ 1分钟，然后是20个循环的95℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是15个循环的95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在使用与上述相同条件的 PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模 板。表8-EV中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的各引物序列。在 琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯 化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向模板混合从而进行 转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠 进行纯化。表8-EV中给出了每种靶基因所得dsRNA的有义链。
C.针对墨西哥豆瓢虫幼虫的活性，使用豆叶盘对dsRNA靶标进行实验 室试验检测
下文提供的实施例举例说明：墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle，MBB)幼虫对经口摄入的对应于自身靶基因的dsRNA敏感。
为了检测针对MBB幼虫的不同双链RNA样品，采用了使用菜豆 (Phaseolus vulgaris变种Montano；来源Aveve NV，Belgium)叶材料作 为食物来源的叶盘测定。在昆虫室中使用同样变种的菜豆以维持昆虫培 养物，其条件为25±2℃，60±5％相对湿度，16小时光照/8小时黑暗 的光周期。使用合适尺寸的穿孔器从1至2周龄的豆植物叶子切下直径 约1.1cm(或0.95cm2)的叶盘。用含有0.05％ Triton X-100的Milli-Q 水将双链RNA样品稀释到1μg/μl。通过将25μl的靶标Ev005，Ev010， Ev015，Ev016 dsRNA和对照gfp dsRNA的稀释溶液或0.05％ Triton X-100 施加到近轴叶表面来制备经处理的叶盘。将所述叶盘干燥并分别置于24 孔板的每一个孔中，所述孔含有1ml凝胶化的2％琼脂，其有利于防止 叶盘干枯。将一只新生MBB幼虫置于所述板的每个孔中，然后用多孔 塑料盖将其盖上。将所述板分为3个重复，每个重复包含8只昆虫(每 行)。将包含所述昆虫和叶盘的平板保存在昆虫室中，其条件为25±2℃， 60±5％相对湿度，16小时光照/8小时黑暗的光周期。用叶盘喂食昆虫 2天，之后将它们移至含有新鲜的经处理的叶盘的新平板。然后，在生 物测定开始后4天，每天将所述昆虫移至含有未经处理新鲜豆叶的培养 皿，直至第10天。在第2天以及之后每隔一天记录幼虫死亡率和平均 重量。
用包含表面应用的完整裸靶标dsRNA的菜豆叶喂食的墨西哥豆 瓢虫幼虫均导致幼虫死亡率显著增加，如图1所示。8天后，靶标EV010、 Ev015和Ev016的被测双链RNA导致100％死亡率，而靶标Ev005的 dsRNA用10天杀死所有幼虫。用包含对照gfp dsRNA或仅有表面活性 剂Triton X-100的叶盘喂食的大部分昆虫在整个生物测定中维持存活 (图1-EV)。
D.针对墨西哥豆瓢虫成虫的活性，使用豆叶盘对dsRNA靶标进行实验 室试验检测
下文提供的实施例举例说明了：墨西哥豆瓢虫成虫对经口摄入的 对应于自身靶基因的dsRNA敏感。
在与墨西哥豆瓢虫幼虫类似的生物测定设置中，检测MBB成虫 抗御局部应用至豆叶盘的双链RNA。用0.05％ Triton X-100将来自每种 靶标(Ev010、Ev015和Ev016)的测试dsRNA稀释至终浓度为0.1μg/μl。 通过将30μl测试溶液局部施加到每个叶盘上对豆叶盘进行处理。使所 述叶盘完全干燥，然后将其置于24孔板每个孔中的2％凝胶化琼脂薄片 上。从培养罩中收集三日龄成虫，7-8小时不喂食，然后将一只成虫置 于生物测定板的每个孔中(因此每种处理包括24只成虫)。所述板保存 在昆虫饲养室中(在与MBB幼虫相同的条件下保存24小时)，之后将 所述成虫移至包含新鲜的经dsRNA处理的叶盘的新板。再过24小时， 收集来自每种处理的成虫，将其置于30cm×15cm×10cm的塑料盒中， 所述塑料盒包含两盆未经处理的3周龄豆植物。从第4天到第11天评 估昆虫死亡率。
被墨西哥豆瓢虫成虫摄食的所有3种靶标dsRNA(Ev010、Ev015 和Ev016)导致死亡率从第4天(生物测定开始后4天)开始显著增加， 如图2(a)-EV所示。从第5天起，观察到在最初用靶标dsRNA处理 的豆叶盘喂食的昆虫与用包含对照gfp dsRNA或表面活性剂Triton X-100的叶盘喂食的昆虫之间摄食模式的明显改变。与gfp dsRNA和只 有表面活性剂的对照相比，对于所有3种靶标均明显可见MBB成虫对 未处理豆植物的叶损伤降低(尽管水平不同)；用靶标15喂食的昆虫对 豆叶损伤最小(图2(b)-EV)。
E.将MBB基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于MBB基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何的启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-EV中提供了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的 模板是包含任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR 反应，其使用以下条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、 55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析 所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参 考WO00188121A1)并测序。表8-EV中给出了对应于各自序列的所得 PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
F.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺失的菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
G.针对墨西哥豆瓢虫，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验 检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食MBB。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将MMB置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGBNJ001或pGN29 质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量 的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm波长 下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用 喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用 一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例6：墨西哥棉铃象(Cotton boll weevil，CBW)
A.克隆墨西哥棉铃象的部分基因序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从3龄墨 西哥棉铃象(墨西哥棉铃象；来源：Dr.Gary Benzon，Benzon Research lnc.， 7 Kuhn Drive，Carlisle，Pennsylvania 17013，USA)中分离高质量的完整 RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处 理除去RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售试 剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen， Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含AG001、AG005、AG010、AG014和AG016基因一 部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold (Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-AG中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列，其显示了包 括引物序列和所得cDNA序列的墨西哥棉铃象靶基因。使用这些引物进 行各自的PCR反应，其使用以下条件：对于AG001、AG005和AG016 来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、50℃ 1分钟和72℃ 1分30秒，然后是72℃ 7分钟；对于AG010来说，95℃ 10分钟，然 后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 2分30秒，然后是72℃ 7分钟；对于AG014来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30 秒、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 7分钟。在琼脂糖凝胶上 分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其克隆入pCR8/GW/TOPO载体(Cat.Nr.K2500-20， Invitrogen)并测序。表2-AG中给出了用各自SEQ ID NO表示的所得 PCR产物的序列，并且称为部分序列。表3-AG中给出了用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序列。
B.产生墨西哥棉铃象基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-AG中给出了用于扩增每种靶序列有义模板 的各引物的序列。如下进行递减PCR反应：95℃ 1分钟，然后是20个 循环的95℃ 30秒、60℃ 30秒(每个循环降低0.5℃)和72℃ 1分钟， 然后是15个循环的95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和 特异性T7反向引物得到反义T7模板。表8-AG中给出了用于扩增每种 靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物， 并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106， Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。将所得到的T7正向和反向模板 混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理 并利用醋酸钠进行纯化。表8-AG中给出了每种靶基因所得dsRNA的 有义链。
C.将CBW基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于CBW基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何的启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-AG中给出了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的 模板是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR 反应，其使用以下条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、 55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析 所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参 考WO00188121A1)并测序。表8-AG中给出了对应于各自序列的所得 PCR产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
D.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺失的菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
E.针对墨西哥棉铃象，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验 检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食CBW。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将CBW置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或 pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加 不同量的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm 波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下， 用喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使 用一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例7：赤拟谷盗(Red flour beetle，RFB)
A.克隆赤拟谷盗的部分基因序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从所有不 同阶段的赤拟谷盗(赤拟谷盗；来源：Dr.Lara Senior，Insect Investigations Ltd.，Capital Business Park，Wentloog，Cardiff，CF3 2PX， Wales，UK)中分离高质量的完整RNA。按照制造商的说明，通过DNA 酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。 按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat. Nr.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含TC001、TC002、TC010、TC014和TC015基因一部 分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold (Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-TC中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引 物进行各PCR反应，其使用以下条件：95℃ 10分钟，然后是40个循 环的95℃ 30秒、50℃ 1分钟和72℃ 1分30秒，然后是72℃ 7分钟 (TC001、TC014、TC015)；95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30 秒、54℃ 1分钟和72℃ 2分30秒，然后是72℃ 7分钟(TC010)；95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、53℃ 1分钟和72℃ 1分钟， 然后是72℃ 7分钟(TC002)。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对 其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其 克隆入pCR8/GW/TOPO载体(Cat.Nr.K2500 20，Invitrogen)并测序。 表2-TC中给出了用各自SEQ ID NO表示的所得PCR产物的序列，并 且称为部分序列。表3-TC中给出了用各自SEQ ID NO表示的相应部分 氨基酸序列。
B.产生赤拟谷盗基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-TC中给出了用于扩增每种靶序列有义模板 的各引物的序列。所述PCR反应条件如下：95℃ 1分钟，然后是20个 循环的95℃ 30秒、60℃ 30秒(-0.5℃/循环)和72℃ 1分钟，然后是 15个循环的95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分 钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异 性T7反向引物得到反义T7模板。8-TC中给出了用于扩增每种靶基因 反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过 PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen) 以及NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向 和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和 RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-TC中给出了每种靶基因所得 dsRNA的有义链。
C.针对赤拟谷盗幼虫，使用人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试验检 测
下文提供的实施例举例说明了赤拟谷盗幼虫(RFB)对经口摄入 的对应于自身靶基因的dsRNA敏感。
赤拟谷盗维持于Insect Investigations Ltd.(来源：Imperial College of Science，Technology and Medicine，Silwood Park，Berkshire，UK)。根据 公司的SOP/251/01来饲养昆虫。简言之，将所述甲虫置于塑料罐或箱中。 这些罐或箱具有顶部开口用以通风。其顶部装有网并用弹性带固定从而防 止逃脱。将幼虫饲养培养基(面粉)放置于可饲养甲虫的容器中。在控温 室中饲养保存的产品甲虫群体，其条件为25±3℃，16:8小时的光照:黑 暗循环。
将来自靶标TC014的双链RNA(其序列对应于SEQ ID NO 799 的)掺入到面粉和奶粉的混合物(全麦粉：奶粉比值为4:1)中，使之 过夜干燥。分别制备每个重复：将10μg/μl的100μl dsRNA溶液(1mg dsRNA)加入到0.1g面粉/奶混合物中。将干燥的混合物研磨成细粉。 昆虫维持在培养皿(55mm直径)中，该培养皿中衬有双层滤纸。将经 处理的饲料放置于两层滤纸之间。将10只1龄混合性别的幼虫放置于 每个皿(重复)中。每种处理进行4次重复实验。对照是Milli-Q水。 以常规标准进行评估(存活昆虫数)。在试验过程中，测试条件是 25-33℃，20-25％相对湿度，12:12小时的光照:黑暗光周期。
与只有对照的饲料相比，用经靶标TC014dsRNA处理的人工饲 料喂食的赤拟谷盗幼虫之存活率随时间显著降低，如图1-TC所示。
D.将RFB基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具 有活性的双链RNA
以下是将对应于RFB基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-TC中提供了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的 模板是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR 反应，其使用下述条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、 55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析 所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr. 28706，Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参 考WO00188121A1)并测序。8-TC中给出了对应于各自序列的所得PCR 产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
E.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
F.针对赤拟谷盗，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食RFB。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将RFB置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或pGN29 质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量 的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm波长 下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用 喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用 一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例8：桃蚜(Green peach aphid，GPA)
A.克隆桃蚜的部分基序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从桃蚜若 虫(桃蚜；来源：Dr.Rachel Down，Insect & Pathogen Interactions，Central Science Laboratory，Sand Hutton，York，YO41 1LZ，UK)中分离高质量的 完整RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega) 处理除去RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明，使用市售 试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen， Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含MP001、MP002、MP010、MP016和MP027基因一 部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold (Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-MP中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引 物进行各自的PCR反应，其使用以下条件：对于MP001、MP002和 MP016来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、50℃ 1分 钟和72℃ 1分30秒，然后是72℃ 7分钟；对于MP027来说，使用递 减PCR程序：95℃ 10分钟，然后是10个循环的95℃ 30秒、60℃ 40 秒(每循环降低1℃)和72℃ 1分10秒，然后是30个循环的95℃ 30 秒、50℃ 40秒和72℃ 1分10秒，然后是72℃ 7分钟；对于MP010来 说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 3分钟，然后是72℃ 7分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对 其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其 克隆入pCR8/GW/TOPO载体(Cat.Nr.K2500-20，Invitrogen)并测序。 表2-MP中给出了用各自SEQ ID NO表示的所得PCR产物的序列，并 且称为部分序列。表3-MP中给出了用各自SEQ ID NO表示的相应部 分氨基酸序列。
B.产生桃蚜基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-MP中给出了用于扩增每种靶序列有义模板的 各引物的序列。如下进行递减PCR反应：95℃ 1分钟，然后是20个循 环的95℃ 30秒、55℃ 30秒(针对MP001、MP002、MP016、MP027 和gfp)或50℃ 30秒(针对MP010)(每循环降低0.5℃)和72℃ 1分 钟，然后是15个循环的95℃ 30秒、45℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是 72℃ 10分钟。在使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引 物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。表8-MP中给出了用于扩增 每种靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产 物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr. 28106，Qiagen)以及NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所 得到的T7正向和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、 进行DNA酶和RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-MP中给出了 每种靶基因所得dsRNA的有义链。
C.桃蚜对转基因拟南芥植物侵害的实验室试验
得到转基因植物
使用浸花法(Clough and Bent(1998)Plant Journal 16 735-743)转 化拟南芥植物。将所述植物的地上部分在含有以下物质的溶液中孵育数 秒，所述溶液含有5％蔗糖、来自过夜培养物的重悬根癌农杆菌菌株 C58C1 Rif细胞以及0.03％的表面活性剂Silwet L-77。接种后，用透明 塑料覆盖植物16小时以保持湿度。为了提高转化效率，一周后重复所 述步骤。当种子成熟后停止浇水，收获干燥的种子并冷处理两天。灭菌 后，将种子铺在含卡那霉素的生长培养基中用以选择转化植物。
将所选植物移至泥土用以最佳地产生T2种子。
生物测定
通过使分离的T2种子在适当的选择培养基上萌发来选择转基因 拟南芥植物。当这些转基因植物的根完全形成时，将它们移至新鲜的人 工生长培养基或泥土，使它们在最佳条件下生长。针对桃蚜若虫来检测 整株转基因植物，其显示(1)对摄食若虫造成的植物损害具有显著抗 性，(2)若虫死亡率提高，和/或(3)存活若虫的重量减少(或任何其 它的昆虫发育异常)。
D.针对桃蚜的活性，使用液体人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试验 检测
基于适于豌豆蚜的饲料制备用于桃蚜的液体人工饲料，如Febvay et al.(1988)[Influence of the amino acid balance on the improvement of an artificial diet for a biotype of Acyrthosiphon pisum(Homoptera Aphididae). Can.J.Zool.66：2449-2453]所述，但进行了某些修改。如下制备所述饲 料的氨基酸组分：以mg/100ml计，丙氨酸178.71，β-丙氨酸6.22，精氨 酸244.9，天冬酰胺298.55，天冬氨酸88.25，半胱氨酸29.59，谷氨酸 149.36，谷氨酰胺445.61，甘氨酸166.56，组氨酸136.02，异亮氨酸 164.75，亮氨酸231.56，盐酸赖氨酸351.09，蛋氨酸72.35，鸟氨酸(HCl) 9.41，苯丙氨酸293，脯氨酸129.33，丝氨酸124.28，苏氨酸127.16，色 氨酸42.75，酪氨酸38.63，L-缬氨酸190.85。除酪氨酸以外，将所述氨 基酸溶于30ml Milli-Q水中，酪氨酸在加入到氨基酸混合物之前首先 溶于数滴1M盐酸中。以如下5×浓缩原液的形式制备所述饲料的维生素 混合物组分：以mg/L计，氨基苯甲酸100、抗坏血酸1000、生物素1、 泛酸钙50、氯化胆碱500、叶酸10、肌醇420、烟酸100、盐酸吡哆醇 25、核黄素5、盐酸硫胺25。将核黄素溶于1ml50℃水中，然后加入 到维生素混合物原液中。将所述维生素混合物等分为每等份20ml，保 存于-20℃。将一等份维生素混合物加至所述氨基酸溶液。分别以下述 量将蔗糖和MgSO4·7H2O加入到所述混合物中：20g和242mg。如下 制备微量金属原液：以mg/100ml计，CuSO4·5H2O4.7，FeCl3·6H2O 44.5， MnCl2·4H2O 6.5，NaCl 25.4，ZnCl2 8.3。将10ml微量金属溶液和250mg KH2PO4加至饲料，加入Milli-Q水至液体饲料终体积为100ml。用1M KOH溶液将所述饲料的pH调节为7。通过0.22μm滤器(Millipore)将 所述液体饲料过滤灭菌。
在受控环境室中具有70μm网孔的铝框笼中用4至6周龄油菜 (Brassica napus变种SW Oban，来源Nick Balaam，Sw Seed Ltd.，49 North Road，Abington，Cambridge，CB1 6AS，UK)饲养桃蚜(桃蚜；来 源：Dr.Rachel Down，Insect & Pathogen Interactions，Central Science Laboratory，Sand Hutton，York，YO41 1LZ，UK)，所述室的条件如下：23 ±2℃，60±5％相对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。
生物测定开始的前一天，从饲养笼中收集成虫并将其置于培养皿 中新近采摘的油菜叶上，并将其置于昆虫室中过夜。第二天，选取1龄 若虫并移至饲养室。一个饲养室包括置于小培养皿(直径3cm)的10 只1龄若虫，所述培养皿覆盖有薄的单层拉伸封口膜(parafilm M)， 向其上添加50μl饲料。用另一层封口膜密封所述饲养室，在与饲养成 虫相同的条件下进行孵育。每隔一天更换包含dsRNA的饲料，在第8 天(即生物测定开始后第8天)评估昆虫的存活率。针对每种处理，同 时建立5个生物测定饲养室(重复)。将测试和对照(gfp)dsRNA溶液 掺入饲料中至终浓度为2μg/μl。所述饲养室维持23±2℃，60±5％相 对湿度，16:8小时的光照:黑暗光周期。利用GraphPad Prism版本4 测定Mann-Whitney检验，以确定靶标27(MP027)和gfp dsRNA之 间中值是否有显著差异。
在所述生物测定中，使用饲养室将添加有靶标27(SEQ ID NO 1061)完整裸dsRNA的液体人工饲料喂食桃蚜若虫，其导致死亡率显 著提高，如图1所示。用靶标27、gfp dsRNA和只有饲料处理的存活昆 虫平均百分数分别为2、34和82。使用Mann-Whitney检验比较靶标 027与gfp dsRNA组，得到0.004的单尾P值，这表明靶标027的中值 与gfpdsRNA的预期较大中值有显著差异(P<0.05)。用掺有靶标27 dsRNA的液体饲料喂食的桃蚜明显小于用只有饲料或掺有gfp dsRNA 对照的饲料喂食的桃蚜(数据未显示)。
E.将GPA基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于GPA基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-MP中给出了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模 板是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。使用所述引物进行PCR反 应，其使用以下条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR 片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706， Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参考 WO00188121A1)并测序。表8-MP给出了对应于各自序列的所得PCR产 物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
F.在两个大肠杆菌(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3)菌株 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
G.针对桃蚜，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食GPA。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将GPA置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或pGN29 质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量 的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm波长 下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用 喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用 一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例9：褐飞虱(Brown plant hopper，BPH)
A.克隆褐飞虱的部分序列
按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶， Cat.N°.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从褐飞虱(来源： Dr.J.A.Gatehouse，Dept.Biological Sciences，Durham University，UK)高 质量的完整RNA得到cDNA。
为了分离包含褐飞虱NL001、NL002、NL003、NL004、NL005、 NL006、NL007、NL008、NL009、NL010、NL011、NL012、NL013、NL014、 NL015、NL016、NL018、NL019、NL021、NL022和NL027基因一部分 的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold(Cat. N°.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-NL中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引 物进行各PCR反应，其使用以下条件：对于NL001来说，95℃ 5分钟， 然后是40个循环的95℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10 分钟；对于NL002来说，95℃ 3分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、 55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟；对于NL003来说，95℃ 3分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、61℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后 是72℃ 10分钟；对于NL004来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、51℃ 1分钟和72℃ 1分钟；对于NL005来说，95℃ 10分钟，然后 是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分 钟；对于NL006来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 3分30秒，然后是72℃ 10分钟；对于NL007来说，95℃ 10 分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 1分15秒，然 后是72℃ 10分钟；对于NL008和NL014来说，95℃ 10分钟，然后是40 个循环的95℃ 30秒、53℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟； 对于NL009、NL011、NL012和NL019来说，95℃ 10分钟，然后是40 个循环的95℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟； 对于NL010来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1 分钟和72℃ 2分30秒，然后是72℃ 10分钟；对于NL013来说，95℃ 10 分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 1分10秒，然 后是72℃ 10分钟；对于NL015和NL016来说，95℃ 10分钟，然后是40 个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 1分40秒，然后是72℃ 10分钟； 对于NL018来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1 分钟和72℃ 1分35秒，然后是72℃ 10分钟；对于NL021、NL022和NL027 来说，95℃ 10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 1 分45秒，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对 其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其 克隆入pCR8/GW/topo载体(Cat.Nr.K2500 20，Invitrogen)并测序。表 2-NL中给出用各自SEQ ID NO表示的所得PCR产物的序列，并且称 为部分序列。表3-NL中给出了用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基 酸序列。
B.通过EST序列克隆褐飞虱NL023基因的部分序列
按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶， Cat.N°.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从褐飞虱(来源： Dr.J.A.Gatehouse，Dept.Biological Sciences，Durham University，UK)高 质量的完整RNA得到cDNA。
从褐飞虱cDNA扩增部分cDNA序列NL023，其对应于公共数据 库GenBank中的褐飞虱EST序列，其序列号为CAH65679.2。为了分 离包含NL023基因一部分的cDNA序列，按照制造商的说明使用基于 EST的特异性引物来进行一系列PCR反应，其使用PerfectShotTM ExTaq(Cat N°.RR005A，Takara Bio Inc.)。
对于NL023来说，在两个独立的PCR反应中使用特异性引物 oGBKW002和oGBKW003(在本文中分别用SEQ ID NO 1157和SEQ ID NO 1158表示)，其条件如下：95℃ 3分钟，然后是30个循环的95℃ 30秒、56℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上 分析所得PCR片段，对其进行纯化( Gel Extraction kit，Cat.N°. 28706，Qiagen)，并将其克隆入pCR4-TOPO载体(Cat N°K4575-40， Invitrogen)并测序。本文中用SEQ ID NO 1111表示对两种PCR产物测 序所得的一致序列，其指NL023基因的部分序列。本文中用SEQ ID NO 1112表示相应的部分氨基酸序列。
C.产生褐飞虱基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引物得 到有义T7模板。表8-NL中给出了用于扩增每种靶序列有义模板的各引物 的序列。所述PCR反应的条件如下：对于NL001和NL002来说，94℃ 4 分钟，然后是35个循环的94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是 72℃10分钟；对于NL003来说，94℃ 4分钟，然后是35个循环的94℃ 30 秒、66℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟；对于NL004、NL006、 NL008、NL009、NL010和NL019来说，95℃ 4分钟，然后是35个循环 的95℃ 30秒、54℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟；对于NL005 和NL016来说，95℃ 4分钟，然后是35个循环的95℃ 30秒、57℃ 30秒 和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟；对于NL007和NL014来说，95℃ 4 分钟，然后是35个循环的95℃ 30秒、51℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是 72℃ 10分钟；对于NL011、NL012和NL022来说，95℃ 4分钟，然后是 35个循环的95℃ 30秒、53℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟； 对于NL013、NL015、NL018和NL021来说，95℃ 4分钟，然后是35个 循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟；对于 NL023和NL027来说，95℃ 4分钟，然后是35个循环的95℃ 30秒、52℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在使用与上述相同条件的PCR 反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引物得到反义T7模板。表 8-NL中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶 上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)进行纯化。将所得到的T7正向 和反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和 RNA酶处理并利用醋酸钠进行纯化。但进行如下修改：RNA沉淀在70 ％乙醇中洗两次。表8-NL中给出每种靶基因所得dsRNA的有义链。
对于所述绿色荧光蛋白(gfp)对照来说，使用T7引物进行PCR反 应的模板DNA是pPD96.12质粒(the Fire Lab， http://genome-www.stanford.edu/group/fire/)，其含有被3个合成内含子隔 开的野生型gfp编码序列。使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.N°.P1700，Promega)合成双链RNA。在两个独立的PCR 反应中得到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应 包含与T7启动子方向不同的靶序列。对于gfp来说，使用特异性T7FW 引物oGAU183和特异性RV引物oGAU182(本文中分别用SEQ ID NO 236 和SEQ ID NO 237表示)在PCR反应中得到有义T7模板，其条件如下： 95℃ 4分钟，然后是35个循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟， 然后是72℃ 10分钟。使用特异性FW引物oGAU181和特异性T7 RV引 物oGAU184(本文中分别用SEQ ID NO 238和SEQ ID NO 239表示)在 与上述相同条件的PCR反应中得到反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析所 得PCR产物，并对其进行纯化( PCR Purification Kit，C at.N°. 28106，Qiagen)。按照制造商的说明，将所得到的T7 FW和RV模板混 合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶处理并 利用醋酸钠和异丙醇进行纯化，但进行如下修改：RNA沉淀在70％乙醇 中洗两次。本文中所得dsRNA的有义链用SEQ ID NO 235表示。
D.针对褐飞虱的活性，使用液体人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试 验筛选
如Koyama(1988)[Artificial rearing and nutritional physiology of the planthoppersand leafhoppers(Homoptera：Delphacidae and Deltocephalidae)on a holidic diet JARQ 22 20-27]所述制备用于褐飞虱的 液体人工饲料(MMD-1)，但改变了饲料蔗糖组分的终浓度：使用14.4 ％(重量/体积)。将饲料组分制备为独立的浓缩物：10×矿物质原液(保 存于4℃)，2×氨基酸原液(保存于-20℃)以及10×维生素原液(保存 于-20℃)。在生物测定临开始前混合所述原液组分至4/3×浓度，从而允 许用测试dsRNA溶液(4×浓度)进行稀释，调节pH至6.5，过滤灭菌 制成约500μl的等份。
在受控环境室中，用2-3月龄水稻(台中在来一号水稻(Oryza sativa cv Taichung Native 1))植物饲喂褐飞虱，所述室的条件为：27±2℃， 80％相对湿度，16:8小时的光照：黑暗光周期。一个饲养室中包括10只 1龄或2龄若虫，其被置于盖有拉薄的单层封口膜(parafilm M)的小 培养皿(直径3cm)中，所述封口膜上加有50μl饲料。用另一层封口 膜密封所述室，在与饲养成虫相同的条件下进行孵育，但是不直接接触 光。每隔一天更换包含dsRNA的饲料，每天评估昆虫的存活率。针对 每种处理，同时建立5个生物测定饲养室(重复)。将测试和对照(gfp) dsRNA溶液掺入饲料中至终浓度为2mg/ml。所述饲养室维持27±2℃， 80％相对湿度，16:8小时的光照：黑暗光周期。使用Kaplan-Meier存活 曲线模型对昆虫存活数据进行分析，使用时序检验(Prism版本4.0) 比较组之间的存活。
如四个独立的生物测定中所示，使用饲养室在体外用添加了完整 裸dsRNA的液体人工饲料喂食褐飞虱，导致若虫死亡率显著增加(图 1(a)-(d)-NL；表10-NL(a)-(d))(Durham University)。这些 结果表明，对应于不同的BPH必需基因的dsRNA显示出对褐飞虱的显 著毒性。
在这些生物测定中，gfp dsRNA对BPH存活的影响与只喂食饲料 的存活昆虫没有显著差异。
表10-NL(a)-(d)显示用添加有2mg/ml(终浓度)以下靶标 的人工饲料喂食褐飞虱的存活情况总结；在表10-NL(a)中：NL002、 NL003、NL005、NL010；在表10-NL(b)中：NL009、NL016；在表 10-NL(c)中：NL014、NL018；以及在表10-NL(d)中：NL013、 NL015、NL021。在存活分析栏中，RNAi的作用如下标明：+＝与gfp dsRNA对照相比存活率显著下降(α<0.05)；-＝与gfp dsRNA对照相 比无显著差异。使用时序检验比较存活曲线(在只有饲料和添加了测试 dsRNA的饲料之间，在gfp dsRNA和测试dsRNA之间，以及在只有饲 料和gfp dsRNA之间)。
E.针对褐飞虱的活性，使用人工饲料对不同浓度dsRNA进行实验室试 验筛选
将50μl添加了不同浓度靶标NL002 dsRNA(即终浓度为1、0.2、 0.08和0.04mg/ml)的液体人工饲料施加到褐飞虱饲养室。包含dsRNA 的饲料每隔一天更换一次，每天评估昆虫的存活。针对每种处理，同时 建立5个生物测定饲养室(重复)。所述饲养室维持27±2℃，80％相 对湿度，16:8小时的光照：黑暗光周期。使用Kaplan-Meier存活曲线模 型对昆虫存活数据进行分析，使用时序检验(Prism版本4.0)比较组 之间的存活。
喂食添加有不同浓度完整裸靶标NL002 dsRNA的液体人工饲料 导致在低至0.04mg dsRNA/ml饲料的终浓度下BPH死亡率显著高于仅 喂食饲料的存活率，如图2-NL和表11-NL所示。表11-NL总结了用添 加1、0.2、0.08和0.04mg/ml(终浓度)靶标NL002的人工饲料喂食 褐飞虱试验中的存活情况。在存活分析栏中，RNAi的作用如下标明：+ ＝与gfp dsRNA对照相比存活率显著下降(α<0.05)；-＝与gfp dsRNA 对照相比无显著差异。使用时序检验比较存活曲线。
F.将BPH基因片段克隆进到载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具 有活性的双链RNA
以下是将对应于BPH基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-NL中提供了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模 板是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。在PCR反应中使用所述引 物，其使用下述条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR 片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706， Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参考 WO00188121A1)并测序。表8-NL给出对应于各自序列的所得PCR产物 的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
G.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
H.针对褐飞虱，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食BPH。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将BPH置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或pGN29 质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量 的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm波长 下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用 喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用 一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例10：二化螟(Rice striped stem borer，SSB)
A.通过家族PCR克隆二化螟基因的部分序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从4个不 同幼虫阶段的二化螟分离高质量的完整RNA。按照制造商的说明，通 过DNA酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA制备物中的基因组 DNA。按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录 酶，Cat.Nr.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到 cDNA。
为了分离包含CS001、CS002、CS003、CS006、CS007、CS009、 CS011、CS013、CS014、CS015、CS016和CS018基因一部分的cDNA序 列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold(Cat.Nr. N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-CS中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引 物进行各PCR反应，其使用以下条件：95℃ 10分钟，然后是40个循 环的95℃ 30秒、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在 琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR4/TOPO载体 (Cat.Nr.K2500 20，Invitrogen)并测序。表2-CS中给出用各自SEQ ID NO表示的所得PCR产物的序列，并且称为部分序列。表3-CS给出了 用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序列。
B.产生二化螟基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个单独的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-CS给出了用于扩增每种靶序列有义模板的各 引物的序列。所述PCR反应条件如下：95℃ 4分钟，然后是35个循环 的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在使用 与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7反向引 物得到反义T7模板。表8-CS中给出了用于扩增每种靶基因反义模板的 各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯化试 剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以及 NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向 模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶 处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-CS给出了每种靶基因所得dsRNA的 有义链。
C.针对二化螟幼虫的活性，使用人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试 验检测
二化螟(来源：Syngenta，Stein，Switzerland)以基于Kamano 和Sato，1985(Handbook of Insect Rearing Volumes I & II.P Singh and RF Moore，eds.，Elsevier Science Publishers，Amsterdam and New York， 1985，pp448)所述经修改的人工饲料为食。简言之，如下制备一升饲料 的：将20g琼脂加入到980ml Milli-Q水中并高压灭菌；使琼脂溶液冷 却至约55℃，加入其余成分并彻底混合：40g玉米粉(Polenta)、20g 纤维素、30g蔗糖、30g酪蛋白、20g麦芽(烘烤的)、8g Wesson盐 混合物、12g Vanderzant维生素混合物、1.8g抗坏血酸、1.6g尼泊金 (对羟基苯甲酸甲酯)、0.3g金霉素、0.4g胆固醇和0.6g L-半胱氨酸。 将饲料冷却至约45℃然后倒入饲养盘或杯中。将所述饲料置于水平层流 柜中。从饲养有成虫蛾的罩中移出带有昆虫所产卵的稻叶片，将其固定 至饲养杯或盘的固体饲料上。使卵孵化，新生幼虫用于生物测定以及昆 虫培养物的维持。在试验和饲养中，条件是28±2℃，80±5％相对湿 度，16:8小时的光照：黑暗光周期。
使用同样的人工饲料用于生物测定，但是在该情形中，将所述饲 料平均倒入24孔板中，每个孔含有1ml饲料。一旦饲料准备就绪，则 以1μg/μl的50μl靶标dsRNA的比率将测试制剂施加到该饲料表面(2 cm2)。使所述dsRNA溶液干燥，将2只1龄蛾幼虫置于每个孔中。7 天后，将所述幼虫移至多孔板中新鲜的经处理的饲料。在第14天(即 生物测定开始后14天)，记录存活和死亡昆虫的数目，并检查异常。对 每种处理共检测24只幼虫。
进行了一个可替代的生物测定，其中用经处理的稻叶喂食二化螟 新生幼虫。将籼稻品种台中在来一号的小叶片浸于含1μg/μl靶标 dsRNA的0.05％ Triton X-100溶液中，使之干燥，并将每片置于含有凝 胶化2％琼脂的24孔板的一个孔中。将两只新生幼虫从饲养盘转移到每 片经dsRNA处理的叶子(每种处理包括24只幼虫)。在4和8天后， 将所述幼虫转移到新鲜的经处理的稻叶片。在第4、8和12天评估存活 和死亡昆虫的数目，并记录任何异常。
D.将SSB基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于SSB基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-CS中提供了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模板 是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。在PCR反应中使用所述引物， 其使用下述条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、55℃ 30 秒和72℃ 2分钟，然后是72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片 段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)， 将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参考WO00188121A1) 并测序。表8-CS给出了对应于各自序列的所得PCR产物的序列。包含该 序列的重组载体称为pGXXX0XX。
E.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
F.针对褐飞虱，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食SSB。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将SSB置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或pGN29 质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量 的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm波长 下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用 喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用 一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例11：菜蛾(Diamondback moth，DBM)
A.克隆菜蛾的部分序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从所有不 同幼虫阶段的菜蛾(菜蛾；来源：Dr.Lara Senior，Insect Investigations Ltd.， Capital Business Park，Wentloog，Cardiff，CF3 2PX，Wales，UK)分离高质 量的完整RNA。按照制造商的说明，通过DNA酶(Cat.Nr.1700， Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。按照制造商的说明， 使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat.Nr.18080044， Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含PX001、PX009、PX010、PX015、PX016基因一部 分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold (Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-PX中给出了用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引 物分进行各PCR反应，其使用以下条件：95℃ 10分钟，然后是40个 循环的95℃ 30秒、50℃ 1分钟和72℃ 1分30秒，然后是72℃ 7分钟 (针对PX001、PX009、PX015、PX016)；95℃ 10分钟，然后是40个 循环的95℃ 30秒、54℃ 1分钟和72℃ 2分30秒，然后是72℃ 7分钟 (针对PX010)。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化 (QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入 pCR8/GW/TOPO载体(Cat.Nr.K2500 20，Invitrogen)并测序。表2-PX 中给出了用各自SEQ ID NO表示所得PCR产物的序列，并且称为部分 序列。表3-PX中给出用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序列。
B.产生菜蛾基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7 RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个独立的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含与 T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-PX中给出用于扩增每种靶序列有义模板的各 引物的序列。所述PCR反应条件如下：95℃ 1分钟，然后是20个循环 的95℃ 30秒、60℃ 30秒(-0.5℃/循环)和72℃ 1分钟，然后是15个 循环的95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在 使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7 反向引物得到反义T7模板。表8-PX中给出用于扩增每种靶基因反义模 板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR纯 化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以及 NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和反向 模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA酶 处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-PX中给出每种靶基因所得dsRNA的 有义链。
C.针对菜蛾幼虫的活性，使用人工饲料对dsRNA靶标进行实验室试验 检测
菜蛾维持于Insect Investigations Ltd.(来源：Newcastle University，Newcastle-upon-Tyne，UK)。用卷心菜叶喂食所述昆虫。 选择1龄混合性别的幼虫(约1日龄)用于该试验。将昆虫置于Eppendorf 管(容积1.5ml)中。将按照制造商说明制备的市售菜蛾饲料(Bio-Serv， NJ，USA)置于每个管的盖中(容积0.25ml，直径8mm)。在仍为液 体时，将所述饲料找平以移去多余的部分并得到平的表面。
一旦所述饲料准备就绪，则将测试制剂施加到饲料表面，为每个 重复25μl未稀释制剂(1μg/μl靶标dsRNA)。使测试制剂干燥，将一 只1龄幼虫置于每个管中。将所述幼虫放置于盖中饲料的表面，然后将 管小心的闭合。将所述管倒置保存(在其盖上)，从而使每只幼虫保持 在所述饲料的表面。一周两次将所述幼虫转移到包含新鲜饲料的新 Eppendorf管。在试验的头两周向幼虫提供经处理的饲料，之后提供未 处理的饲料。
在总共38天中，一周两次进行评估，在第38天时所有幼虫均死 亡。在每次评估时，评估所述昆虫的存活情况并检查异常。对于每种处 理，进行40个单幼虫重复。在试验过程中，测试条件是23～26℃，50～ 65％相对湿度，16:8小时的光照：黑暗光周期。
D.将DBM基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于DBM基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-PX中给出了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模板 是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。在PCR反应中使用所述引物， 其使用下述条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、55℃ 30 秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR 片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706， Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参考 WO00188121A1)并测序。表8-PX给出了对应于各自序列的所得PCR 产物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
E.在两个大肠杆菌菌株(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3) 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
F.针对菜蛾，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食DBM。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置 于植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切 个开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将DBM置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或 pGN29质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加 不同量的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm 波长下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下， 用喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使 用一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显 著增加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统 中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性 表现为昆虫死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实 验中还明显看出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆 虫损害的实例，所述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA 的细菌组成。
实施例12：居屋艾蟋(House cricket，HC)
A.克隆居屋艾蟋的部分序列
按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Cat.Nr. 15596-026/15596-018，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)从所有不 同昆虫阶段的居屋艾蟋(居屋艾蟋；来源：Dr.Lara Senior，Insect Investigations Ltd.，Capital Business Park，Wentloog，Cardiff，CF3 2PX， Wales，UK)中分离高质量的完整RNA。按照制造商的说明，通过DNA 酶(Cat.Nr.1700，Promega)处理除去RNA制备物中的基因组DNA。 按照制造商的说明，使用市售试剂盒(SuperScriptTM III逆转录酶，Cat. Nr.18080044，Invitrogen，Rockville，Maryland，USA)得到cDNA。
为了分离包含AD001、AD002、AD009、AD015和AD016基因一 部分的cDNA序列，使用简并引物并按照制造商的说明使用Amplitaq Gold (Cat.Nr.N8080240，Applied Biosystems)进行一系列PCR反应。
表2-AD中给出用于扩增每种基因的简并引物序列。使用这些引物 进行各自的PCR反应，其使用以下条件：95℃ 10分钟，然后是40个 循环的95℃ 30秒、50℃ 1分钟和72℃ 1分30秒，然后是72℃ 7分钟。 在琼脂糖凝胶上分析所得PCR片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706，Qiagen)，将其克隆入pCR8/GW/topo载体 (Cat.Nr.K2500 20，Invitrogen)并测序。表2-AD中给出用各自SEQ ID NO表示的所得PCR产物的序列，并且称为部分序列。表3-AD中给出 用各自SEQ ID NO表示的相应部分氨基酸序列。
B.产生居屋艾蟋基因的dsRNA
使用市售试剂盒T7RibomaxTM Express RNAi System(Cat.Nr. P1700，Promega)合成毫克级的dsRNA。在两个单独的PCR反应中得 到最初两种独立的单个5’T7 RNA聚合酶启动子模板，每个反应包含 与T7启动子方向不同的靶序列。
对于每种靶基因来说，使用特异性T7正向引物和特异性反向引 物得到有义T7模板。表8-AD中给出用于扩增每种靶序列有义模板的各 引物的序列。所述PCR反应条件如下：95℃ 1分钟，然后是20个循环 的95℃ 30秒、60℃ 30秒(-0.5℃/循环)和72℃ 1分钟，然后是15个 循环的95℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是72℃ 10分钟。在 使用与上述相同条件的PCR反应中使用特异性正向引物和特异性T7 反向引物得到反义T7模板。表8-AD中给出用于扩增每种靶基因反义 模板的各引物序列。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR产物，并通过PCR 纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，Cat.Nr.28106，Qiagen)以 及NaClO4沉淀进行纯化。按照制造商的说明，将所得到的T7正向和 反向模板混合从而进行转录，将所得RNA链退火、进行DNA酶和RNA 酶处理并利用醋酸钠进行纯化。表8-AD中给出了每种靶基因所得 dsRNA的有义链。
C.针对居屋艾蟋幼虫的活性，使用人工饲料对dsRNA靶标进行实验室 试验检测
美洲蟋蟀维持于Insect Investigations Ltd.(来源：Blades Biological Ltd.，Kent，UK)。所述昆虫以麦麸颗粒和卷心菜叶为食。选 择相同尺寸的不超过5日龄的混合性别若虫用于该试验。将双链RNA 与基于小麦的颗粒状啮齿类动物饲料(大鼠和小鼠标准饲料，B&K Universal Ltd.，Grimston，Aldbrough，Hull，UK)混合。所述饲料 BK001P含有下述成分(以重量降序排列)：小麦、大豆、麸皮、大麦、 颗粒状粘合剂、啮齿动物5vit min、混合脂、磷酸二钙、mould carb。 细细研磨颗粒状啮齿动物饲料，在微波炉中进行热处理从而使任何酶组 分失活，然后进行混合。所有啮齿动物饲料取自同一批次以确保一致性。 将研磨过的饲料与dsRNA完全混合，形成等重的小颗粒，将其在室温 过夜干燥。
将靶标和gfp对照的双链RNA样品以10μg/μl的浓度应用，其比 例为1g研磨过的饲料加1ml dsRNA溶液，由此得到施加比例为10mg dsRNA/g颗粒。每周更换颗粒。在试验的头三周，向昆虫提供经处理的 颗粒。之后提供未处理的颗粒。将昆虫置于带盖的塑料容器中(直径9 cm，深4.5cm)，每个容器包含10只昆虫。每个容器中包含一个经处理 的诱饵颗粒和一个水源(潮湿棉球)，将上述两者置于独立的小型称重 船型皿(weigh boat)中。在整个实验中，水被无限制地补充。
以一周两次的间隔进行评估，两次评估之间不超过4天，直至所 有对照昆虫死亡或蜕皮至成虫阶段(84天)。在每次评估中，对存活情 况进行评估并且检查异常。从第46天起，一旦开始蜕皮至成虫，则评 估所有昆虫(存活和死亡的)是若虫还是成虫。在试验第55天对存活 的昆虫称重。每种处理进行4次重复实验。在试验过程中，测试条件是 25～33℃，20～25％相对湿度，12:12小时的光照：黑暗光周期。 D.将HC基因片段克隆进载体中，所述载体适于细菌产生在昆虫中具有 活性的双链RNA
以下是将对应于HC基因靶标的DNA片段克隆进载体中的实施 例，所述载体用于在细菌宿主中表达双链RNA，尽管可使用包含T7启 动子或在细菌中有效转录之其它任何启动子的任何载体(参考 WO0001846)。
表8-AD中给出了用于扩增靶基因的特异性引物序列。所使用的模 板是含有任意靶序列的pCR8/GW/topo载体。在PCR反应中使用所述引 物，其使用下述条件：98℃ 5分钟，然后是30个循环的98℃ 10秒、55℃ 30秒和72℃ 2分钟，然后是72℃ 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析所得PCR 片段，对其进行纯化(QIAquick Gel Extraction kit，Cat.Nr.28706， Qiagen)，将其平端克隆进经SrfI线性化的pGNA49A载体中(参考 WO00188121A1)并测序。表8-AD给出了对应于各自序列的所得PCR产 物的序列。包含该序列的重组载体称为pGXXX0XX。
E.在两个大肠杆菌(1)AB301-105(DE3)和(2)BL21(DE3)菌株 中表达和产生双链RNA靶标
遵循下述步骤，在细菌中表达适当水平的昆虫靶标的双链RNA， 该双链RNA在昆虫中具有活性。RNA酶III缺陷型菌株(AB301-105 (DE3))用于与含有RNA酶III的野生型细菌(BL21(DE3))进行 比较。
转化AB301-105(DE3)和BL21(DE3)
将300ng质粒加至50μl冰冷的化学感受态大肠杆菌AB301-105 (DE3)或BL21(DE3)菌株等份中并轻柔混合。在冰上孵育所述细 胞20分钟，之后对其进行37℃热激处理5分钟，然后将所述细胞放回 至冰上并再保持5分钟。将450μl室温的SOC培养基加至所述细胞， 并将该悬液于37℃在摇床(250rpm)上孵育1小时。将100μl细菌细 胞悬液移至含有150ml LB液体培养基的500ml锥形瓶中，所述LB液 体培养基补充有100μg/ml的羧苄青霉素抗生素。所述培养物于37℃在 Innova 4430摇床(250rpm)上过夜(16-18小时)孵育。
在AB301-105(DE3)和BL21(DE3)中化学诱导双链RNA表达
因为存在所有控制表达的遗传组分，所以在AB301-105(DE3) 或BL21(DE3)细菌菌株中可以表达来自重组载体pGXXX0XX的双 链RNA。在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下，T7 聚合酶将以反义和有义方向驱动所述靶序列的转录，因为所述靶序列的 侧翼是相反方向的T7启动子。
使用合适的分光光度计测量细菌过夜培养物在600nm的吸光度， 并通过加入新鲜LB液体培养基将其值调整为1。将50ml该培养物移 至50ml Falcon管中，然后在15℃以3000g离心所述培养物10分钟。 除去上清液，将细菌沉淀用50ml补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG的新鲜S完全培养基(SNC培养基加5μg/ml胆固醇)进行重悬。 在室温诱导细菌2至4小时。
细菌的热处理
通过热处理杀死细菌从而使测试平板中人工饲料被污染的风险减 至最小。然而，对表达双链RNA的细菌进行热处理不是昆虫诱导由RNA 干扰所致毒性的前提。所诱导的细菌培养物在室温以3000g离心10分 钟，弃去上清液，并将沉淀在80℃水浴中保持20分钟。热处理后，将 细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，并将悬液移至微离心管中。对每次 更新准备数个管并用于生物测定中。所述管保存在-20℃备用。
F.针对居屋艾蟋，对表达dsRNA靶标的大肠杆菌进行实验室试验检测
基于植物的生物测定
用化学诱导的表达dsRNA的细菌悬液喷洒整株植物，然后用所述 植物喂食HC。它们在植物培养室中生长。通过将500ml塑料瓶倒置于 植物上从而罩住所述植物，瓶颈牢固地置于盆内泥土中，在瓶底部切个 开口，并覆盖上细密尼龙网用以通风、减少内部凝结并防止幼虫逃脱。 将HC置于罩中每株经处理过的植物上。用包含pGXXX0XX或pGN29 质粒的大肠杆菌AB301-105(DE3)悬液处理植物。向植物施加不同量 的细菌：例如66、22和7单位，其中一个单位定义为：在600nm波长 下吸光度值为1的1ml细菌悬液中109个细菌细胞。在每种情况下，用 喷雾器将总体积1～10ml喷洒到植物上。在该试验中，每种处理使用 一株植物。计数存活昆虫数，并记录每只存活昆虫的重量。
用表达来自pGXXX0XX的靶标dsRNA的大肠杆菌AB301-105 (DE3)菌株悬液喷洒植物，与pGN29对照相比其导致昆虫死亡率显著增 加。这些实验显示，在野生型或RNA酶III缺陷型细菌表达系统中产生的 对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，所述毒性表现为昆虫 死亡率显著增加以及存活幼虫的生长/发育延迟。从这些实验中还明显看 出，提供了通过使用喷雾制剂有效保护植物/作物免受昆虫损害的实例，所 述喷雾制剂由表达对应于昆虫基因靶标之双链RNA的细菌组成。
表10-NL(a)
1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
x2 P值 Sig.Dif.2 食物对： NL002 29.06 <0.0001 是 NL003 39.59 <0.0001 是 NL005 2955 <0.0001 是 NL010 21.04 <0.0001 是 gfp dsRNA对： NL002 15.09 0.0001 是 NL003 22.87 <0.0001 是 NL005 15.12 <0.0001 是 NL010 8.838 0.0029 是 食物对gfp dsRNA 4.030 0.0447(～0.05) 否
2α<0.05
表10-NL(b)
1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
x2 P值 Sig.Dif.2 食物对： NL009 11.98 0.0005 是 NL016 8.98 0.0027 是 gfp dsRNA对： NL009 13.69 0.0002 是 NL016 11.37 0.0007 是 食物对gfp dsRNA 0.03317 0.8555 否
2α<0.05
表10-NL(c)
1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
x2 P值 Sig.Dif.2 食物对： NL014 8.088 0.0045 是 NL018 10.47 0.0012 是 gfp dsRNA对： NL014 14.55 0.0001 是 NL018 17.64 <0.0001 是 食物对gfp dsRNA 0.6548 0.4184 否
2α<0.05
表10-NL(d)
1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
x2 P值 Sig.Dif.2 食物对： NL013 15.73 <0.0001 是 NL015 39.44 <0.0001 是 NL021 12.75 0,0004 是 gfp dsRNA对： NL013 16.42 <0.0001 是 NL015 39.15 <0.0001 是 NL021 14.1 0,0002 是 食物对gfpdsRNA 0.1031 0,7481 否
2α<0.05
表11-NL
1＝使用Kaplan-Meier存活曲线分析来分析数据
x2 P值 Sig.Dif.2 食物对： NL002 1μg/μl 57.53 <0.0001 是 NL002 0.2μg/μl 74.54 <0.0001 是 NL002 0.08μg/μl 64 <0.0001 是 NL002 0.04μg/μl 39.49 <0.0001 是
2α<0.05
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