发明领域

本发明涉及防治外寄生虫的方法和组合物。具体地说，本发明涉及抑制外寄生虫 卵孵化的方法和组合物。本发明还提供了预防或治疗外寄生虫侵染的方法和组合物。

现有技术

外寄生虫，包括某些昆虫在很多种动物和植物中引起显著的害虫问题。特别是， 外寄生虫通常会骚扰、叮咬人和家畜并引起感染。其中特别关注的是这些寄生物的 存在以及对人、家庭宠物或陪伴动物如狗和猫，以及其它驯养动物如马的影响。同 样关注的是外寄生虫也会对植物造成显著损害。幼虫会吃掉重要经济作物的叶、花 和果实，从而每年造成数百万美元的损失。

已知有各种用来防治或灭除叮咬和吸血害虫(外寄生虫)，如跳蚤、扁虱、苍蝇、 虱子和螨类的组合物和应用技术。在过去的数年里，已经提出许多种气雾剂和室内 喷洒剂、液体、肥皂、洗发香波、可湿性粉剂、颗粒剂、饵料和粉剂，用来防治这 类外寄生虫。

对外寄生虫常规的防治措施依赖于使用化学杀虫剂，例如，氯化烃类(DDT、硫 丹等)以及合成与天然除虫菊酯(除虫菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯)。与使用 化学杀虫剂相关的问题包括目标外寄生虫形成的抗药性，化学品在环境以及植物和 动物组织中的残留性以及对宿主和非目标生物体的伤害性。

杀外寄生虫药的其它类型包括杀虫剂，如昆虫生长调节剂(IGR)，已知能干扰壳 多糖合成和杀虫细菌毒素(如苏金杆菌(Bt)毒素)。更有用的杀虫剂是杀虫活性高且环 境残留性低的那些，如有机磷酸酯和天然除虫菊酯。然而，与这些杀虫剂相关的一 个突出问题是造成目标昆虫的抗药性。

例如，在EP0191236和美国专利5,288,483描述了用来防治虱子的杀虫剂。使用 这些制剂的一个突出的缺点是虱子会产生抗性。需要进一步的防治时要将它们暴露 于更强的制剂中并增加了成本。

采用化学方法防治侵害植物的外寄生虫的另一个问题是会产生抗性。尽管已经采 用生物和化学防治方法通过在植物外寄生虫从卵中出来之后防治或杀死幼虫以便防 治它们，但这种防治只是减轻而不是消除外寄生虫对植物造成的损害。

最近人们的注意力集中在昆虫蛋白酶上，蛋白酶能提供防治外寄生虫的可能的方 法。蛋白酶在生物体中发挥各种功能，包括调节和破坏蛋白质和肽类，因此有助于 消化。它们还涉及胚胎形成期间的组织重整，蜕皮和蛹化。蛋白酶是各种可变的酶， 包括有助消化的蛋白酶，它们在数量已经种类之间的催化性能明显不同。例如，一 直认为丝氨酸蛋白酶涉及蜕皮的关键生长调节剂领域(Samuels R.I.和Paterson C.J.， Comparative Biochemistry and Physiology(比较生物化学和生理学)，1995，110B：661- 669)。

已经提出蛋白酶抑制剂是另一种有用的化学防治方法，特别是外寄生虫已对这些 化学杀虫剂具有抗药性时。特别是，丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂已显示能减少 幼虫生长和/或各种昆虫存活(Dymock等，New Zealand Journal if Zoology，1992，19： 123-131)。用肠线的主要消化酶的抑制剂已达到抑制生长，并且一直以外寄生虫幼虫 或成熟的寄生虫为目标。然而，对各种类型蛋白酶抑制剂的活性和功能的了解很少。 杀外寄生虫药的存在的共同问题是它们对外寄生虫卵不起作用，因此施用驱虫剂给 宿主时，为达到效果，经常需要重复防治或延长暴露于驱虫剂时间。这不仅不方便， 而且会增加对环境以及宿主的危险。

因此，仍然需要提供能有效抑制外寄生虫卵孵化，来达到有效防治外寄生虫的方 法和组合物。

发明概述

在本发明的一个方面，提供了一种在植物宿主中治疗或预防外寄生虫侵染的方 法，所述方法包括施用有效量的至少一种金属蛋白酶抑制剂和/或至少一种金属螯合 剂，其中所述金属螯合剂是一种包含至少两个能同时与一个金属离子配位的杂原子 的化合物，两个杂原子中至少一个选自氮、硫、氧和磷，其中所述化合物包含至少 一个被至少一个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代的碳环，或所述 化合物包含至少一个含至少一个杂原子的杂环，其中所述杂环任选被至少一个杂原 子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基所取代。

在一些实施方式中，所述外寄生虫侵染由选自以下种类的外寄生虫造成：棉铃虫 属(Heliothis/Helicoverpa spp.)，包括澳洲棉铃虫(H.punctigera)，粘虫属(Mythimna spp.)，包括东方粘虫(Mythimna separata)，劳氏粘虫(Mythimna loreyimima)，Mythimna convecta，美洲粘虫(Mythimna unipuncta)，Persectania spp.，包括P.dyscrita和P. ewingii，一星粘虫(Pseudaletia unipuncta)和Pseudaletia evansii，Crocidolomia pavonana，菜青虫(Pieris rapae)，马铃薯蠹蛾(Phthorimaea operculella)，螟属 (Chrysodeixis spp.)，苹果蠢蛾(Cydia pomonella)，夜蛾属(Spodoptera spp.)，淡褐苹果 蛾(Epiphyas postvittana)和小菜蛾(Plutella xylostella)。

本申请人还确定了能抑制外寄生虫卵孵化的金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂的 有效剂量。采用金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂抑制外寄生虫卵孵化的优点在于能 预防外寄生虫的繁殖周期从而防治外寄生虫侵染。

在另一方面，提供了一种抑制外寄生虫卵孵化的方法，该方法包括将外寄生虫卵 暴露于至少一种金属蛋白酶抑制剂和/或至少一种金属螯合剂，其中所述金属螯合剂 是一种包含至少两个能同时与一个金属离子配位的杂原子的化合物，两个杂原子中 至少一个选自氮、硫、氧和磷，其中所述化合物包含至少一个被至少一个杂原子取 代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代的碳环，或所述化合物包含至少一个含至 少一个杂原子的杂环，其中所述杂环任选被至少一个杂原子取代和/或被含至少一个 杂原子的取代基所取代，其中所述外寄生虫卵是由选、以下种类的外寄生虫产的： 澳洲棉铃虫(H.punctigera)，粘虫属(Mythimna spp.)，Persectania spp.，一星粘虫 (Pseudaletia unipuncta)，Pseudoletia evansii，Crocidolomia pavonana，菜青虫(Pieris rapae)，马铃薯蠹蛾(Phthorimaea operculella)，夜蛾属(Spodoptera spp.)，螟属 (Chrysodeixis spp.)和淡褐苹果蛾(Epiphyas postvittana)。

再在本发明的另一方面，提供了一种抑制外寄生虫卵孵化的方法，该方法包括将 外寄生虫卵暴露于至少一种金属蛋白酶抑制剂和/或至少一种金属螯合剂，其中所述 金属螯合剂是一种包含至少两个能同时与一个金属离子配位的杂原子的化合物，两 个杂原子中至少一个选自氮、硫、氧和磷，其中所述化合物包含至少一个被至少一 个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代的碳环，或所述化合物包含至 少一个含至少一个杂原子的杂环，其中所述杂环任选被至少一个杂原子取代和/或被 含至少一个杂原子的取代基所取代，其中所述外寄生虫卵是由选自以下种类的外寄 生虫产的：绵羊虱(Bovicola ovis)(羊虱)，牛鸟虱(Bovicola bovis)，牛血虱(Haematopinus eurysternus)(短鼻牛虱)，蝇属(Hypoderma spp.)，扰血蝇(Haematobia irritans exigua)， 螺旋蝇属(Cochliomyia spp.)，金蝇属(Chrysomya spp.)，牛颚虱(Linognathus vituli)(长 鼻牛虱)，牛管虱(Solenopotes capillatus)(tubercule-bearing louse)，疥螨属(Sarcoptes spp.)(兽疥螨)包括犬疥螨(Sarcoptes scabiei canis)，猪疥螨(Sarcoptes scabiei suis)，牛 疥螨(Sarcoptes scabiei bovis)，人疥螨(Sarcoptes scabiei var.humani)，痒螨属(Psoroptes spp.)包括绵羊瘙螨(Psoroptes ovis)，和尘螨属(Dermatophgoides spp.)。

再在本发明的另一个方面，提供了一种抑制选自以下种类的外寄生虫产的外寄生 虫卵孵化的方法：澳洲棉铃虫(H.punctigera)，粘虫属(Mythimna spp.)，Persectania spp.， 一星粘虫(Pseudaletia unipuncta)，Pseudoletia evansii，Crocidolomia pavonana，菜青 虫(Pieris rapae)，马铃薯蠹蛾(Phthorimaea operculella)，夜蛾属(Spodoptera spp.)，螟 属(Chrysodeixis spp.)，淡褐苹果蛾(Epiphyas postvittana)，绵羊虱(Bovicola ovis)(羊虱)， 牛鸟虱(Bovicola bovis)，牛血虱(Haematopinus eurysternus)(短鼻牛虱)，蝇属 (Hypoderma spp.)，扰血蝇(Haematobia irritans exigua)，螺旋蝇属(Cochliomyia spp.)， 金蝇属(Chrysomya spp.)，牛颚虱(Linognathus vituli)(长鼻牛虱)，牛管虱(Solenopotes capillatus)(tubercule-bearing louse)，疥螨属(Sarcoptes spp.)(兽疥螨)包括犬疥螨 (Sarcoptes scabiei canis)，猪疥螨(Sarcoptes scabiei suis)，牛疥螨(Sarcoptes scabiei bovis)，人疥螨(Sarcoptes scabiei var.humani)，痒螨属(Psoroptes spp.)包括绵羊瘙螨 (Psoroptes ovis)，以及尘螨属(Dermatophgoides spp.)，所述方法包括将外寄生虫卵暴 露于有效量的至少一种式(Ia)的化合物或其药学上、兽医上或农业上可接受的盐：

式中，X选自：共价键、-C(R5)2-、-Z-或-C(R5)2-Z-C(R5)2-；

R1和R1’独立选、：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯 基(thiol)、C1-6烷硫基(alkylthio)、卤素、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6 烷基、NH2、NHC1-6烷基或N(C1-6烷基)2；

R2、R2’、R3、R3’、R4和R4’独立选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、 C1-6烷氧基、巯基、C1-6烷硫基(alkylthiol)、卤素、CN、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6烷基、 SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NHC1-6烷基或N(C1-6烷基)2或-CH2CHNH(CO2H)、NH(C1-6 亚烷基)N(C1-6烷基)2或五或六元碳环或杂环；或

R2和R3或R3和R4和/或R2’和R3’或R3’和R4’与它们连接的碳原子一起形成五或 六元碳环或杂环；

各R5独立选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯基、 C1-6烷硫基、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NHC1-6烷基或N(C1-6 烷基)2；和

各R6独立选自：氢和卤素；和

Z选、：共价键、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-和-C(S)-。

附图简述

图1：所示为用考马斯蓝染色凝胶和脱色后，由头发和虱卵各样品获得的洗涤物 的蛋白酶活性的明胶底物SDS-PAGE分析。泳道1显示由孵化12小时内未孵化的虱 卵获得的洗涤物中检测到的蛋白酶活性。蛋白酶活性在SDS凝胶的高分子量区。泳 道2显示从最近已经除去怀孕雌虱的头发洗涤物中检测到的蛋白酶活性，表明存在 许多高活性且稳定的可能是母体起源的蛋白酶。泳道3包含从上述类似头发样品收 集的洗涤物，该样品用1％次氯酸钠溶液洗涤1分钟，随后用水洗涤多次，试图除去 这些污染蛋白酶。这种处理能除去母系蛋白酶，导致只在头发样品中没有检测到蛋 白酶种类。泳道4显示从孵化12小时内的次氯酸钠处理的卵的卵洗涤物中检测到的 蛋白酶活性(如上所述)。这种处理除去了在未洗涤样品(与泳道1相比)中观察到的蛋 白酶活性。泳道5显示来自用次氯酸钠预处理后孵化的虱卵的卵洗涤物中存在一种 或两种高分子量的蛋白酶。泳道5中的样品在卵孵化0-2小时后收集。这些蛋白酶特 别与卵孵化时的虱卵相关，而称之为卵壳洗涤物(ESW)。

图2：所示为用次氯酸盐处理后，用抑制剂处理的虱卵卵壳洗涤物的明胶 SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色结果。很明显在约25-30kDa(括号中的)有三个条带。 泳道1，ESW阳性对照，没有抑制剂处理，泳道2，用10mM 1，10-菲咯啉处理后的 ESW，泳道3，用5mM PMSF处理后的ESW，以及泳道4，用10μM E-64处理后的 ESW。在37℃孵育3小时。注意到用1，10-菲咯啉(泳道2，括号内区域)处理后蛋白 酶活性明显降低。使用天冬氨酸抑制剂抑胃酶肽时，未观察到ESW的蛋白酶活性下 降(数据未列出)。

图3：显示1，10-菲咯啉对虱卵孵化的作用。虱卵处理5天后，随时间观察到的孵 化。

图4：显示苯丁抑制素对虱卵孵化的作用。虱卵处理5天后，随时间观察到的孵 化。

优选实施方式的详细描述

文中，术语″金属螯合剂″指包含至少两个能同时与一个金属离子配位的杂原子的 化合物，两个杂原子中至少一个选自氮、硫、氧或磷，所述化合物包含至少一个被 至少一个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基取代的碳环，或者包含至少 一个含至少一个杂原子的杂环的化合物，所述杂环任选被至少一个杂原子取代和/或 被含至少一个杂原子的取代基取代。优选地，金属螯合剂包含一个芳环或杂芳环。 更优选地，金属螯合剂包含至少一个氮杂原子。优选地，所述金属螯合剂是非嵌入 的。

文中，术语″金属蛋白酶抑制剂″指能抑制与外寄生虫卵孵化相关的金属蛋白酶活 性的分子、化合物、蛋白质或制剂。所述抑制可以是对金属蛋白酶表示抑制或对金 属蛋白酶酶活性的抑制。优选的金属蛋白酶抑制剂是金属螯合剂。

优选的金属螯合剂选自：联芳基化合物、肽和氨基酸衍生物、四环抗菌素和硫脲 类化合物。

优选的联芳基化合物包括联吡啶基化合物和1，10-菲咯啉化合物。

在一个实施方式中，所述金属螯合剂是式(I)的化合物或其药学上、兽医上或农业 上可接受的盐：

式中，X选自：共价键、-C(R5)2-、-Z-或-C(R5)2-Z-C(R5)2-；

R1和R1’独立地选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、 巯基、C1-6烷硫基、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NHC1-6烷基 或N(C1-6烷基)2，或R1和R1’一起是-C(R5)2-、-C(R5)2-C(R5)2-、-CR5＝CR5-、C(O)、 C(S)或NH；

R2、R2’、R3、R3’、R4和R4’独立地选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟 基、C1-6烷氧基、巯基、C1-6烷硫基、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、 NH2、NHC1-6烷基或N(C1-6烷基)2、或-CH2CHNH(CO2H)；或

R2和R3或R3和R4和/或R2’和R3’或R3’和R4’与它们连接的碳原子一起形成五或 六元碳环或杂环；

各R5独立地选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯基、 C1-6烷硫基、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NHC1-6烷基或N(C1-6 烷基)2；和

Z选自：共价键、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-和-C(S)-。

优选的式(I)的化合物具有至少一个以下特征：

R1和R1’独立选自：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯基、 C1-6烷硫基、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NHC1-6烷基或N(C1-6 烷基)2，更优选氢或C1-3烷基，再优选氢或甲基；

R2和R2’独立是氢或C1-3烷基，更优选氢；

R3、R3’、R4和R4独立选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、 C1-6烷硫基或CO2C1-6烷基，优选氢或C1-3烷基，更优选氢或甲基；或R3和R4和/或 R3’和R4’与它们连接的碳原子一起形成五或六元碳环或杂环，优选芳环；

各R5独立选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或 CO2C1-6烷基，优选氢或C1-3烷基，更优选氢或甲基；

各R6独立为氢或氟，尤其是各R6均为氟；

X是共价键、-CH2-Z-CH2-或Z，优选共价键；和

Z是-NH-、-O-或-S-，优选-NH-。

优选的式(I)的化合物是式(Ia)的联芳基化合物或其药学上、兽医上或农业上可接 受的盐：

式中，X选自：共价键、-C(R5)2-、-Z-或-C(R5)2-Z-C(R5)2-；

R1和R1’独立选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯 基、C1-6烷硫基、卤素、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、 NHC1-6烷基或N(C1-6烷基)2；

R2、R2’、R3、R3’、R4和R4’独立选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、 C1-6烷氧基、巯基、C1-6烷硫基、卤素、CN、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、 SO3C1-6烷基、NH2、NHC1-6烷基或N(C1-6烷基)2或-CH2CHNH(CO2H)、NH(C1-6亚烷 基)N(C1-6烷基)2或五或六元碳环或杂环；或

R2和R3或R3和R4和/或R2’和R3’或R3’和R4’与它们连接的碳原子一起形成五或 六元碳环或杂环；

各R5独立选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯基、 C1-6烷硫基、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NHC1-6烷基或N(C1-6 烷基)2；和

各R6独立选自：氢和卤素；和

Z选自：共价键、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-和-C(S)-。

优选的式(I)的化合物包括：

2，2’-联吡啶，

6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶，

5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶，

4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶，和

2-(2-吡啶基)喹诺酮。

在另一个实施方式中，所述金属螯合剂是式(II)的化合物或其药学上、兽医上或 农业上可接受的盐：

式中，X’选自：共价键、-C(R13)2-、Z’或C(R13)2-Z’-C(R13)2-；

U选自：N或C(R13)；

W选自：-NH-、-S-或-O-；

Z’选自：共价键、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-或-C(S)-；

R10选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯基、C1-6烷 硫基、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2 或-(CH2)nR14；

R11选自：(CH2)m芳基或(CH2)m杂芳基，其中各芳基或杂芳基任选被一个或多个 以下基团取代：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯基、C1-6烷硫 基、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2 或卤素；

各R12独立选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯基、 C1-6烷硫基、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NH(C1-6烷基)、N(C1-6 烷基)2或-(CH2)nR14；或

R10和R12与它们连接的碳原子一起形成五或六元碳环或杂环；

各R13独立选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯基、 C1-6烷硫基、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NH(C1-6烷基)、N(C1-6 烷基)2或-(CH2)nR14；

R14选自：NH2，OH、SH或CO2H；

m是0或1-4的整数；和

n是1-4的整数。

优选的式(II)的化合物具有至少一个以下特征：

X是共价键或-CH2-Z-CH2-；

U是N；

W是NH或S；

Z’是NH；

R10是氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或(CH2)nR14，优选氢、C1-3烷基或(CH2)nR14；

R11是苯基、被C1-3烷基或卤素取代的苯基、噻吩、吡啶、吡啶基甲基、咪唑或 被一个或两个C1-3烷基取代的咪唑；

R12是氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或(CH2)nR14，优选氢、C1-3烷基或(CH2)nR14； 或

R10和R12与它们连接的碳原子一起形成稠合的苯环；

R13是氢或C1-3烷基，优选氢或甲基；

R14是NH2或CO2H；

m是0或1；和

n是1或2。

在另一个实施方式中，所述金属螯合剂选自式(III)的化合物或其药学上、兽医上 或农业上可接受的盐：

式中，Ar是苯基、萘基或吲哚基，它们任选被一个或多个选自以下的基团取代： C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯基、C1-6烷硫基、CO2H、CO2C1-6 烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2；

R21选自：NH2、NHR25或-CH2SR25；

R22选自：氢、羟基或C1-6烷氧基；

R23选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基；

R24选自：OH、OR26、NH2、NHC1-6烷基或N(C1-6烷基)2；

R25选自：氢、C(O)C1-6烷基，其中的烷基可任选被-SH或-OH取代；

R26选自：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基或苄基；和

p是0或1。

优选的式(III)的化合物具有至少一个以下特征：

Ar是苯基或萘基；

R21是NH2、任选被SH取代的-NHC(O)C1-6烷基、-CH2SC(O)C1-6烷基或CH2SH；

R22是氢或羟基；

R23是氢或C1-3烷基，优选氢或甲基；

R24是OH、NH2或O苄基；和

p是0或1。

优选的式(III)的化合物包括苯丁抑制素(Bestatin)和Thiorophan或其药学上、兽医 上或农业上可接受的盐。

再在另一个实施方式中，所述金属螯合剂是式(IV)的化合物或其药学上、兽医上 或农业上可接受的盐：

式中，Ar是苯基、萘基或吲哚基，它们任选被一个或多个选自以下的基团取代：

C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯基、C1-6烷硫基、CO2H、CO2C1-6 烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2；

R31选自：CO2H、CO2C1-6烷基、CO2C2-6烯基、CO2C2-6炔基、CONH2、CONH(C1-6 烷基)或CON(C1-6烷基)2；

R32选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯基、C1-6烷 硫基、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2、 CH2CH2CO2H、CH2CH2CONH2、CH2CH2OH、CH2CH2SH；和

R33选自：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯基、C1-6烷硫基、 CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NH(C1-6烷基)、N(C1-6烷基)2、CH2CO2H、 CH2CO2C1-6烷基、CH2CONH2、CH2OH或CH2SH。

优选的式(IV)的化合物具有至少一个以下特征：

Ar是苯基或吲哚基，

R31是CO2H或CONH2，

R32是C1-6烷基、CH2CH2CO2H、CH2CH2CONH2、CH2CH2OH或CH2CH2SH，

R33是CH2CO2H、CH2CONH2、CH2OH或CH2SH。

再在另一个实施方式中，所述金属螯合剂是式(V)的化合物或其药学上、兽医上 或农业上可接受的盐：

式中，R41和R42独立选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，或R41和R42与 它们连接的氮原子一起形成五或六元杂环，该环任选被一个或多个选自以下的基团 取代：C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基；和

R43选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、C1-6烷氧基、巯基、C1-6烷 硫基、CO2H、CO2C1-6烷基、SO3H、SO3C1-6烷基、NH2、NHC1-6烷基或N(C1-6烷基)2。

优选的式(V)的化合物具有至少一个以下特征：

R41和R42独立选自C1-6烷基或与它们连接的氮原子一起形成哌啶、哌嗪、N-甲基 哌嗪或吗啉基团；

R43是氢、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基。

再在进一步的实施方式中，所述金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂是选自四环素、 强力霉素或二甲胺四环素或其药学上、兽医上或农业上可接受的盐的四环抗生素。

再在进一步的实施方式中，所述金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂选自：1-[(2S)-3- 巯基-2-甲基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸(卡托普利)或N-(α-吡喃鼠李糖氧基 (rhamnopyranosyloxy)-羟基氧膦基)-L-亮氨酰-L-色氨酸(磷酸阿米酮)，或其药学上、 兽医上或农业上可接受的盐。

文中，术语“烷基”指直链或支链饱和烃基，具有特定数量的碳原子。例如，在 “C1-C6烷基”中C1-C6包括具有以直链或支链排列的1、2、3、4、5或6个碳原子 的基团。合适烷基的例子包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、 异丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、4-甲基丁基、正己基、2-甲基 戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、5-甲基戊基、2-乙基丁基和3-乙基丁基。

文中，术语“烯基”指碳原子间有一个或多个双键的链或支链烃基，具有特定数 量的碳原子。例如，在“C2-C6烯基”中C2-C6包括具有以直链或支链排列的2、3、 4、5或6个碳原子的基团。合适烯基的例子包括但不限于：乙烯基、丙烯基、异丙 烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基。

文中，术语“炔基”指碳原子间有一个或多个三键的链或支链烃基，具有特定数 量的碳原子。例如，“C2-C6炔基”中C2-C6包括具有以直链或支链排列的2、3、4、 5或6个碳原子的基团。合适烯基的例子包括但不限于：乙炔基、丙炔基、丁炔基、 戊炔基和己炔基。

文中，术语“卤素”指氟、氯、溴和碘。

本文中术语“烷氧基”表示通过氧桥连接的如上所述的烷基。合适烷氧基的例子 包括但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔 丁氧基、正戊氧基和正己氧基。

本文中术语“烷硫基”表示通过硫桥连接的如上所述的烷基。合适烷硫基的例子 包括但不限于：甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、丁硫基、异丁硫基、叔丁硫 基、戊硫基和己硫基。

术语″亚烷基″在文中表示具有特定碳原子数目的二价烷基。例如，C1-6亚烷基包 括-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- 和-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-。

本文中术语“碳环”指3-10元环或稠环体系，其中形成环的所有原子是碳原子。 C3-10碳环可以是饱和、不饱和或芳族的。合适碳环的例子包括但不限于：环丙基、 环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、苯基、萘基和四氢萘基。

本文中所有“杂环”指3-10元环或稠环体系，其中至少一个成环的原子是杂原 子。优选地，杂原子选自氮、氧、硫和磷。C3-10杂环可以是饱和、不饱和或芳族的。 合适杂环的例子包括但不限于：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基 (benzofurazanyl)、苯并吡唑基、苯并三唑基，苯并苯硫基、苯并唑基、咔唑基、咔 啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、吲哚吖嗪基(indolazinyl)， 吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异唑基、萘并吡啶基 (naphthpyridinyl)、二唑基、唑基、唑啉、异唑啉、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、 吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基(pyridopyridinyl)、哒嗪基、吡啶 基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四唑吡喃基、四唑基、四氢 吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁烷基、氮杂环丙烷基、1，4- 二烷基、六氢吖庚因基(hexahydroazepinyl)、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、 硫代吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并苯硫基、二氢苯并唑 基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异唑基、二氢异噻唑基、二氢 二唑基，二氢唑基，二氢吡嗪基、二氢吡唑基，二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二 氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、 二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲基二氧代苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩 基，及其N-氧化物。通过碳原子或杂原子连接杂环取代基。

文中，术语“芳基”意指任何稳定的单环或双环碳环，每个环上至多有6个原子， 其中至少一个环是芳族的。这样的芳基的例子包括但不限于：苯基、萘基和四氢萘 基。

本文中术语“杂芳基”表示稳定的单环或双环碳环，每个环上至多有6个原子， 其中至少一个环是芳族，并且至少一个环含有1-4个选自O、N和S的杂原子。在此 定义范围之内的杂芳基包括但不限于：吖啶基、咔唑基、噌啉基、喹喔啉基、吡唑 基(pyrrazolyl)、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、 喹啉基、异喹啉基、唑基、异唑基、吲哚基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶 基、吡咯基、四氢喹啉。

本发明化合物可以药学上、兽医的或农业上可接受的盐形式。合适的药学上可接 受的盐包括但不限于：药学上可接受的无机酸，如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、 硼酸、磺酸、和氢溴酸的盐，或药学上可接受的有机酸，如乙酸、丙酸、丁酸、酒 石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、马来酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯 甲酸、琥珀酸、草酸、苯基乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、磺胺酸、 天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、丹宁 酸、抗坏血酸和戊酸的盐。

碱盐包括但不限于：与药学上可接受的阳离子，如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷 基铵形成的那些盐。

碱性含氮基团可以用如下试剂季铵化，例如低级卤代烷基，如氯代、溴代和碘代 甲烷、乙烷、丙烷和丁烷；硫酸二烷基酯，如硫酸二甲酯和硫酸二乙酯等。

还应认可本发明的许多化合物具有不对称中心，因此存在一种以上的立体异构体 形式。本发明还涉及基本上纯的一个或多个不对称中心的异构体形式，如约大于90 ％，如约95％或97％，或大于99％，以及包含其外消旋混合物的化合物。这些异构 体可以采用不对称合成例如用手性中间体，或通过手性拆分来制备。

对本发明有用的许多金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂可以从专业化学公司购得。 不能购得那些化合物可以用本领域普通技术人员已知的反应，由可市售的原料来合 成。

例如，取代的2，2-联吡啶和1，10-菲咯啉可以由适当卤代的2，2-联吡啶或1，10-菲 咯啉获得。例如，2，2’-联吡啶-6，6’-二羧酸可以由6，6’-二溴-2，2’-联吡啶，通过用丁基 锂的卤素-金属交换，用干冰处理并酸化获得[Buhleier等，Chem.Ber.，1978，111： 200-204]。联吡啶的单取代，例如在6位用CH2CHNH2(CO2H)取代可通过用N-溴琥 珀酰亚胺处理6-甲基-2，2’-联吡啶，随后用N-保护的-氨基乙酸酯进行烷基化来达到。 然后，通过酸水解除去保护基团(Imperiali B.和Fisher S.L.，J.Org.Chem.，1992，57： 757-759)。

2，2’-联吡啶可以在C6和C4位进行亲核取代反应，引入取代基。当用卤代联吡啶 作为原料时对该反应更有利。例如用6-单或二卤代的2，2’-联吡啶作为原料与氨反应， 可在C6和/或C6’引入胺。

联吡啶-磺酸可以由2，2’-联吡啶，与发烟硫酸(三氧化硫在浓硫酸的溶液)或硫酸汞 (II)/浓硫酸在300℃加热制备。

不对称取代的联吡啶可以由对称的联吡啶获得，例如，6’-甲基-2，2’-联吡啶-6-羧 酸可由6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶用二氧化硒氧化，随后用硝酸银处理获得(Al-Saya 等，European J.Org.Chem.，2004，173-182)。

式(III)和(IV)的化合物可以由可市售的氨基酸，例如苯基丙氨酸和色氨酸，采用 己知的与氨基酸羧酸或胺基的偶合反应制备(Jones J.，Amino Acid and Peptide Synthesis(氨基酸和肽的合成)，Oxford Chemistry Press，1992)。如本领域已知以及 Jones，1992，同上，或Green T.W.和Wutz P.，Protecting Groups in Organic Synthesis(有 机合成中的保扩基)，John Wiley&Son，第三版，1999中所示，需要合适的保护和 脱保护步骤。

式(V)的硫脲类可以通过合适苯甲酰胺与丁基锂，随后与硫光气反应制备。得到 的产物然后可以与合适的胺或氨基酸反应，如方案1所示。

方案1

本说明书中，术语“外寄生虫”用来包括外部感染宿主并通过产卵繁殖的任何寄 生动物种类。本发明优选的外寄生虫包括选自以下的目的物种：鳞翅目，半翅目(包 括同翅亚目和异翅亚目)，直翅目，啮虫目，膜翅目，异翅亚目，鞘翅目，网翅目， 缨翅目，双翅目，虱目(包括Anaplura或吸虱，以及象虱亚目、钝角亚目和丝角亚目)， 食毛目(Malophaga)或羽虱，蚤目和蛛形目。

适合采用本发明方法进行防治的外寄生虫包括：

(a)鳞翅目(lepidopterans)，例如，棉褐带卷蛾(Adoxophyes orana)，小地老虎(Agrotis ypsilon)、黄地老虎(Agrotis segetum)、木棉虫(Alabama argillacea)，黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、苹果巢蛾(Argyresthia conjugella)，汉马夜蛾(Autographa gamma)， Cacoecia murinana，Capua reticulana，云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)，玉米 禾螟(Chilo partellus)，西方云杉卷叶蛾(Choristoneura occidentalis)，螟属(Chrysodeixis spp.)，二化螟(Cirphis unipuncta)，稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)，大菜螟 (Crocidolomia binotalis)、Crocidolomia pavonana，苹果蠢蛾(Cydia pomonella)、松毛 虫(Dendrolimus pini)，瓜野螟(Diaphania nitidalis)，西南玉米秆草螟(Diatraea grandiosella)，埃及钻夜蛾(Earias insulana)、小玉米螟(Elasmopalpus lignosellus)、淡 褐苹果蛾(Epiphyas postvittana)(Walker)，Eupoecilia ambiguella，粒肤地虎(Feltia subterrallea)，李小食心虫(Grapholitha funebrana)、梨小食心虫(Grapholitha molesta)、 棉铃虫属(Heliothis/Helicoverpa spp.)如棉铃实夜蛾(Heliothis armigera)、澳洲棉铃虫 (Helicoverpa punctigera)，绿棉铃虫(Heliothis virescens)，谷实夜蛾(Heliothis zea)，菜 心野螟(Hellula undalis)、尺蠖(Hibernia defoliaria)，美国白蛾(Hyphantria cunea)、卫 茅巢蛾(Hyponomeuta malinellus)、番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella)，铁杉尺蛾 (Lambdina fiscellaria)，贪夜蛾(Laphygma exigua)、旋纹潜蛾(Leucoptera scitella)、 Lithocolletis blancardella，鲜食葡萄小卷蛾(Lobesia botrana)，网锥额野螟(Loxostege sticticalis)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、模毒蛾(Lymantria monacha)、桃潜蛾(Lyonetia clerkella)、烟草天蛾(Manduca sexta)，黄褐天幕毛虫(Malacosoma neustria)、甘蓝夜 蛾(Mamestra brassicae)、稻毛胫夜蛾(Mocis repanda)，粘虫属(Mythimna spp.)如东方 粘虫(Mythimna separata)，劳氏粘虫(Mythimna loreyimima)，Mythimna convecta，美洲 粘虫(Mythimna unipuncta)，冬尺蠖(Operophthera brumata)，黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)、玉米螟(Ostrinia nubilalis)，苹褐卷蛾(Pandemis heparana)，冬夜蛾 (Panolis flammea)，棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)，Persectania spp.如Persectania dyscrita和Persectania ewingii，马铃薯蠹蛾(Phthorimaea operculella)，柑橘潜叶蛾 (Phyllocnistis citrella)，大菜粉蝶(Pieris brassicae)，菜青虫(Pieris rapae)，苜蓿绿夜蛾 (Plathypena scabra)，荷兰石竹小卷蛾(Platynota stultana)，抗溴氰菊酯小菜蛾(Plutella xylostella)，桔花巢蛾(Prays citri)，油橄榄巢蛾(Prays oleae)，Prodenia sunia，黄条粘 虫(Prodenia ornithogalli)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，一星粘虫(Pseudaletia unipuncta)，Pseudaletia evansii，美松梢小卷蛾(Rhyacionia frustrana)，Scrobipalpula absoluta，大螟(Sesamia inferens)，葡萄卷叶蛾(Sparganothis pilleriana)，夜蛾属 (Spodoptera spp.)如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)，棉贪夜蛾(Spodoptera littoralis)， 斜纹夜蛾(Spodoptera litura)，Spodoptera exigua，棉大卷叶螟(Syllepta derogate)，苹 透翅蛾(Synanthedon myopaeformis)，松带蛾(Thaumatopoea pityocampa)，绿色橡木飞 蛾(Tortrix viridana)，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)，象三化螟(Tryporyza incertulas)，云杉 小卷叶蛾(Zeiraphera Canadensis)；尤其是棉铃虫属(Heliothis/Helicoverpa spp.)，包括 澳洲棉铃虫(Helicoverpa punctigera)，粘虫属(Mythimna spp.)，包括东方粘虫(M. separata)，劳氏粘虫(M. loreyimima)，M. convecta和美洲粘虫(M. unipuncta)， Persectania spp.，包括P.dyscrita和P.ewingii，一星粘虫(Pseudaletia unipuncta)， Pseudaletia evansii，苹果蠢蛾(Cydia pomonella)，Crocidolomia pavonana，菜青虫(Pieris rapae)，马铃薯蠹蛾(Phthorimaea operculella)，螟属(Chrysodeixis spp.)，淡褐苹果蛾 (Epiphyas postvittana)和小菜蛾(Plutella xylostella)；

(b)半翅目，例如，蚜属(Aphis)，小粉虱属(Bemisia)，疣芽属(Phorodon)， Aeneolanzia，叶蝉属(Enapoasca)，Parkinsiella，蜡蝉属(Pyrilla)，肾圆盾疥属 (Aonidiella)，球菌(Coccus)，粉蚧属(Pseudococcus)，角盲椿属(Helopeltis)，绿盲蝽 (Lygus)，姬赤星椿象(Dysdercus)，尖长春属(Oxycarenus)，绿椿属(Nezara)，粉虱属 (Aleyrodes)，传播媒介锥蝽(Triatoma)，木虱(Psylla)，瘤蚜属(Myzus)，修尾蚜属 (Megoura)，根瘤蚜属(Phylloxera)，钮灰蝶属(Adelges)，褐飞虱属(Nilaparvata)，黑尾 叶蝉(Nephotettix)或Cimwx spp.；

(c)直翅目，例如，欧洲蝼蛄(Gryllotalpa gryllotalpa)，飞蝗(Locusta migratoria)， 双带蚱蜢(Melanoplus bivittatus)，赤腿蚱蜢(Melanoplus femur-rubrum)，墨西哥蚱蜢 (Melanoplus mexicanus)，迁徒蚱蜢(Melanoplus sanguinipes)，落矶山蚱蜢(Melanoplus spretus)，红翅蝗(Nomadacris septemfasciata)，美洲蚱蜢(Schistocerca Americana)，荒 地蚱蜢(Schistocerca peregrine)，Stauronotus maroccanus，荒地蚱蜢(Schistocerca gregaria)；

(d)啮虫目，例如，中斑围啮虫属(Peripsocus spp.)；

(e)膜翅目，例如，芜菁叶蜂(Athalia rosae)，南非人用切叶蚁(Atta cephalotes)， 切叶蚁(Atta sexdens)，德州切叶蚁(Atta texana)，李实叶蜂(Hoplocamapa minuta)，苹 实叶蜂(Hoplocampa testudinea)，阿根庭蚁(Iridomyrmes humilis)，多霜虹臭蚁 (Iridomyrmex purpureus)，小黄家蚁(Monomorium pharaohis)，牛管虱(Solenopotes capillatus)，热带火蚁(Solenopsis geminate)，红入侵火蚁(Solenopsis invicta)，黑火蚁 (Solenopsis richteri)，白足狡臭蚁(Technomyrmex albipes)；

(f)白蚁科(等翅目)，例如，南部木白蚁(Calotermes flavicollis)，乳白蚁属 (Coptotermes spp)，Leucotermes flavipes，大白蚁(Macrotermes subhyalinus)，象白蚁属 (Nasutitermes spp)如Nasutitermes walkeri，黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)，南 欧网纹白蚁(Reticulitermes lucifugus)，Termes natalensis；

(g)鞘翅目，例如，墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis)，苹果象甲(Anthonomus pomorum)，豆长吻象甲(Apion vorax)，甜菜隐食甲(Atomariaq linearis)，松纵坑切梢小 蠹(Blastophagus piniperda)，甜菜大龟甲(Cassida nebulosa)，豆叶甲(Cerotoma trifurcate)，甘兰荚象甲(Ceuthorhynchus assimilis)，Ceuthorhynchus napi，甜菜跳甲 (Chaetocnema tibialis)，烟草金针虫(Conoderus vespertinus)，天门冬叶甲(Crioceris asparagi)，云杉红翅小蠹(Dendroctonus refipennis)，长角叶甲(Diabrotica longicornis)， Diabrotica12-punctata，玉米幼芽根叶甲(Diabrotica virgifera)，墨西哥豆瓢虫 (Epilachna varivestis)，烟草跳甲(Epitrix hirtipennis)，棉籽灰象甲(Eutinobothrus brasiliensis)，松树皮象(Hylobius abietis)，埃及苜蓿象甲(Hypera brunnipennis)，苜蓿 叶象甲(Hypera postica)，欧洲种松小蠹(Ips typographus)，烟草负泥虫(Lema bilineata)， 稻负泥虫(Lema melanopus)，马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)，甜菜金针虫 (Limonius californicus)，稻象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)，Melanotus communis，花 粉甲虫(Meligethes aeneus)，东方五月鳃金龟(Melolontha hippocastani)，西方五月鳃金 龟(Melolontha melolontha)，稻负泥虫(ulema oryzae)，葡萄黑象甲(Ortiorrhynchus sulcatus)，草莓根象甲(Otiorrhynchus ovatus)，辣根猿叶虫(Phaedon cochlearae)，庭院 丽金龟(Phyllopertha horticola)，六月鳃角金龟属(Phyllophaga spp.)，Phyllotreta chrysocephala，芜菁淡足跳甲(Phyllotreta nemorum)，曲条跳甲(Phyllotreta striolata)， 日本丽金龟(Popillia japonica，Psylliodes napi)，Scolytus intricatus，豆根直条象甲 (Sitona lineatus)；

(h)网翅目，例如，来自地鳖科(Polyphagidae)，折翅蠊科(Bladberidae)，蜚蠊科 (Blattidae)，光蠊科(Epilampridae)，Chaetecsidae，金螳科(Metallycidae)，类螳科 (Mantoididae)，怪足螳科(Amorphoscelidae)，方额螳科(Eremiaphilidae)，花螳科 (Hymenopodidae)，螳螂科(Mantidae)和锥头螳科(Empusidae)；

(i)缨翅目，例如，烟草褐蓟马(Frankliniella fusca)，苜蓿蓟马(Frankliniella occidentalis)，东方花蓟马(Frankliniella tritici)，小麦皮蓟马(Haplothrips tritici)，温室 蓟马(Heliothrips haemorrhoidalis)，桔实蓟马(Scirtothrips citri)，稻蓟马(Thrips oryzae)， 棕榈蓟马(Thrips palmi)，烟蓟马(Thrips tabaci)；

(j)半翅目、同翅亚目，例如，长管蚜(Acyrthosiphon onobrychis)，豆无网长管蚜 (Acyrthosiphon pisum)，落叶松球蚜(Adelges laricis)，安氏红圆蚧(Aonidiella aurantii)， Aphidula nasturtii，甜菜蚜(Aphis fabae)，棉蚜(Aphis gossypii)，苹果蚜(Aphis pomi)， 茄无网蚜(Aulacorthum solani)，甘薯粉蚜(Bemisia tabaci)，飞廉短尾蚜(Brachycaudus cardui)，甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)，玉米叶蝉(Dalbulus maidis)，高加索漏杉椎球 蚜(Dreyfusia nordmannianae)，云杉椎球蚜(Dreyfusia piceae)，南西圆尾蚜(Dysaphis radicola)，蚕豆小绿叶蝉(Empoasca fabae)，苹果绵蚜(Eriosoma lanigerum)，灰飞虱 (Laodelphax striatella)，麦长管蚜(Macrosiphum avenae)，大戟长管蚜(Macrosiphum euphorbiae)，蔷薇长管蚜(Macrosiphon rosae)，巢菜修尾蚜(Megoura viciae)，麦无网 蚜(Metopolophium dirhodum)，紫堇瘤蚜(Myzus persicae)，李瘤蚜(Myzus cerasi)，黑尾 叶蝉(Nephotettix cincticeps)，褐飞虱(Nilaparvata lugens)，甘飞虱(Perkinsiella saccharicida)，忽布疣蚜(Phorodon humuli)，苹木虱(Psylla mali)，梨木虱(Psylla piri)， 梨黄木虱(Psylla pyricola)，玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)，麦二叉蚜(Schizaphis graminum)，禾谷网蚜(Sitobion avenae)，白背飞虱(Sogatella furcifera)，桔蚜(Toxoptera citricida)，结翅粉虱(Trialeurodes abutilonea)，温室粉虱(Trialeurodes vaporariorum)， 葡萄根瘤蚜(Viteus vitifolii)；

(k)半翅目、异翅亚目，例如，盲蝽(Miridae)科(plant bug)如牧草盲蝽(Lygus lineolaris)，长蝽(Lygaeidae)科(seed bug)如多毛长蝽(Blissus leucopterus)，蝽 (Pentatomidae)科(stink bug)，网蝽(Tingidae)科(lace bug)，缘蝽(Coreidae)科(squash bug 和Leaffooted bug)，蛛缘蝽(Alydidae)科(broadheaded bug)，锤蝽(Rhopalidae)科 (scentless plant bug)和跷蝽(Berytidae)科(stilt bug)；

(l)双翅目，例如，墨西哥实蝇(Anastrepha ludens)，地中海实蝇(Ceratitis capitata)， 高梁瘿蚊(Contarinia sorghicola)，托莫洪连纹果实蝇(Dacus cucurbitiae)，油榄实蝇(Dacus oleae)，油菜叶瘿蚊(Dasineura brassicae)，麦地种蝇(Delia coarctata)，甘蓝地种蝇(Delia radicum)，麦叶毛眼水蝇(Hydrellia griseola)，种蝇(myia platura)，蔬菜斑潜蚊(Liriomyza sativae)，蝇属(Hypoderma spp.)，扰血蝇(Haematobia irritans exigua)，三叶草斑潜蚊 (Liriomyza trifolii)，绿蝇属(Lucilia Spp.)，螺旋蝇属(Cochliomyia spp.)，金蝇属 (Chrysomya spp.)，麦瘿蚊(Mayetiola destructor)，蝇属(Musca spp.)，亚洲稻瘿蚊(Orseolia oryzae)，瑞典麦杆蝇(Oscinella frit)，天仙子泉蝇(Pegomya hyoscyami)，Phorbia antiqua， 萝卜地种蝇(Photbia brassicae)，Phorbia coarctata，樱桃实蝇(Rhagoletis cerasi)，苹 果实蝇(Rhagolrtis pomonella)；

(m)虱目，例如，Anaplura(吸虱)，包括阴虱(Pthirus pubis)，头虱(Pediculus humanus capitus)，体虱(Pediculus humanus humanus)，牛颚虱(Linognathus vituli)，牛血虱 (Haematopinus eurysternus)，牛管虱(Solenoptes capillatus)；和钝角亚目、丝角亚目和 象虱亚目(Mallophaga或咬虱)，牛羽虱属(Bovicola)，如绵羊虱(Bovicola oviis)或牛鸟 虱(Bovicola bovis)，嚼虱(Trichodectus)和短角习虱(Menopon)；尤其是绵羊虱(Bovicola ovis)，牛鸟虱(Bovicola bovis)，牛颚虱(Linognathus vituli)，牛血虱(Haematopinus eurysternus)和牛管虱(Solenoptes capillatus)；

(n)蚤目，例如，头蚤(Ctenocephalides)或人蚤属)Pulex spp.)。

(o)蛛形目，例如，硬蜱属(Ixodes holocyclus)，牛蜱属(Boophilus rnicroplus)，血 红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)，疥螨属(Sarcoptes spp.)包括人疥螨(Sarcoptes scabiei var.humani)，犬疥螨(Sarcoptes scabiei canis)，猪疥螨(Sarcoptes scabiei suis)， 牛疥螨(Sarcoptes scabiei bovis)，痒螨属(Psoroptes spp.)包括绵羊瘙螨(Psoroptes ovis)， 以及尘螨属(Dermatophagoides spp.)，尤其是人疥螨(Sarcoptes scabiei var.humani)，犬 疥螨(Sarcoptes scabiei canis)，猪疥螨(Sarcoptes scabiei suis)，牛疥螨(Sarcoptes scabiei bovis)，绵羊瘙螨(Psoroptes ovis)和尘螨属(Dermatophagoides spp.)。

尤其优选的感染植物的外寄生虫包括棉铃虫属(Heliothis/Helicoverpa spp.)，如澳 洲棉铃虫(Helicoverpa punctigera)，粘虫属(Mythimna spp.)，包括东方粘虫(Mythimna separata)，劳氏粘虫(Mythimna loreyimima)，Mythimna convecta和美洲粘虫(Mythimna unipuncta)，Persectania spp.，包括Persectania dyscrita和Persectania ewingii，一星 粘虫(Pseudaletia unipuncta)，Pseudlaletia evansii，苹果蠢蛾(Cydia pomonella)， Crocidolomia pavonana，菜青虫(Pieris rapae)，马铃薯蠹蛾(Phthorimaea operculella)， 螟属(Chrysodeixis spp.)，淡褐苹果蛾(Epiphyas postvittana)和小菜蛾(Plutella xylostella)。

尤其优选的感染家畜的外寄生虫包括绵羊虱(Bovicola ovis)(羊虱)，牛鸟虱 (Bovicola bovis)，牛血虱(Haematopinus eurysternus)(短鼻牛虱)，蝇属(Hypoderma spp.)，扰血蝇(Haematobia irritans exigua)，螺旋蝇属(Cochliomyia spp.)，金蝇属 (Chrysomya spp.)，牛颚虱(Linognathus vituli)(长鼻牛虱)，牛管虱(Solenopotes capillatus) (tubercule-bearing louse)，犬疥螨(Sarcoptes scabiei canis)(兽疥癣)，猪疥螨(Sarcoptes scabiei suis)，牛疥螨(Sarcoptes scabiei boris)和绵羊瘙螨(Psoroptes ovis)。

尤其优选的感染人类的外寄生虫包括阴虱(Pthirus pubis)，头虱(Pediculus humanus zcapitus)，体虱(Pediculus humanus humanus)，人疥螨(Sarcoptes scabiei var.humani)和 尘螨属(Dermatophgoides spp.)。

在一个实施方式中，能通过本发明防止孵化的外寄生虫卵包括：选自虱子、跳蚤、 壁虱、苍蝇和其它刺入或吸血外寄生虫的卵。在一个实施方式中，外寄生虫卵是虱卵， 更优选是头虱卵。虱(Lice)是以动物皮肤和血液为食的寄生虫，它们将其消化液和排 泄物沉积到皮肤。这些物质以及在皮肤本身上的穿刺伤口引起皮肤刺激，并由于产 生的擦伤而病变，并可能由神经节炎症引起一系列感染。虱子也是某些疾病的病媒， 如疹病或流行性斑疹伤寒和回归热。成年雌性虱子的寿命约为1个月，并能每天产 10个卵。传染人的虱子包括阴虱(Pthirus pubis)物种和由两种次物种(subspecies)头虱和 衣虱组成的人虱(Busvine，Antenna，1993，17：196-201)。上述虱的次物种密切相关， 已知已成功杂种繁殖(Busvine，Cutaneous Infestations and Insect Bites(皮肤感染和昆虫噬 咬)，1985，163-174)。

头虱(Pediculus humanus var.capitis)是一种特定的宿主-外寄生虫，它们专门在人的头 上生存，并通过从头皮吸取血液为食。在进食血液后，成熟的成年雌性虱子会在2

4小时内在靠近头皮处最多产10个卵。这些卵通过胶体牢固地固定在发干上。根据 卵所处的温度和湿度，7-10天后，卵孵化，新产的若虫开始进食。若虫通过三次蜕 皮(第一龄期，第二龄期，第三龄期)生长，每一次蜕皮需要3-5天完成。最好一次蜕 皮后，成年雄性或雌性在以后的2天内尽快交配。在进食期间，会产卵并持续这一 周期。从卵到卵的整个生命周期约需20-30天完成，取决于温度和湿度条件。卵孵化 后，卵壳仍固定在发干上，并随头发长长而逐渐从发干上脱落。孵化后的卵(幼虫) 由于其折射特性在人造光下呈白色而相当容易发现，与之相反，未孵化的卵为淡棕 色，而混入大多数头发颜色中，因而难以发觉。

在另一个实施方式中，用本发明防止孵化的外寄生虫卵是感染植物宿主的外寄生 虫卵。在一个优选的实施方式中，所述外寄生虫卵是Lepodoptera卵。Lepodoptera 幼虫以经济作物如棉花，油籽作物如加拿大油菜，装饰植物，花卉，果树，粮食作 物，蔓生作物，块根作物，牧草，番茄、豆类和蔬菜，尤其是芸苔作物如花椰菜和 椰菜、棉花、玉米、甜玉米、番茄、烟草，以及豆类如大豆、海军豆、绿豆、木豆 和鹰嘴豆为食。

小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫以所有芥科植物包括加拿大油菜和芥菜，蔬菜如椰 菜、花椰菜和甘蓝，以及一些温室植物为食。小菜蛾从卵发育成成虫通常需要约32 天。然而，根据食物和天气条件，完成一代可能需要21-51天。成年雌蛾在约16天 的寿命内平均产160个卵。卵较小，球形或卵形，黄白色，并单独地或两个或三个 一组粘合在叶子的上表面或下表面。卵通常产在叶子表面不平整的叶脉上。卵在约 5-6天内孵化。孵化后，幼虫钻入叶中并开始从内部吃叶组织。约1周后，幼虫离开 叶片并从表面进食。幼虫在10-21天内蜕皮3次，成熟时长约12毫米。幼虫完美地 化蛹，茧附在叶片上，蛹阶段持续5-15天。

棉铃虫属(Heliothis/Helicoverpa spp.)如玉米穗蠕虫、番茄蛴螬、烟草蚜虫和棉螟 蛉是许多作物如向日葵、夏南瓜、豆类、胡椒、紫苜蓿、马铃薯、韭菜、棉花、玉 米、李、柑橘类植物、番茄、烟草和莴苣、以及花卉如天竺葵和石竹的严重害虫。 这些Lepodopteran昆虫出现在世界的许多地方，在温带气候下每季可产生2-3代，其 蛹在土壤中过冬。在热带区域，蚜虫可能全年都很活跃。卵较小(直径约0.5mm)， 圆顶形，底部略平。卵通常单独产在芽或开花部分附近或产在叶子上。成虫可产 500-3000个卵。卵在25℃通常仅3天后就孵化，在较低温度下孵化时间较长，例如 在17℃需9天。在适宜的温度和进食条件下，幼虫进食期约19-26天，当完全发育 后幼虫移到土壤中化蛹。蛹期通常持续8-21天，但在温带地区滞育的蛹可在土壤中 过冬。

淡褐苹果蛾(Epiphyas postivittana(Walker))幼虫对苹果、梨、葡萄、柑橘类、黑醋 栗和红醋栗、奇异果、酒花、红苜蓿和白苜蓿、紫苜蓿、tree lupin、车前草、tutu、 金雀花、菊花、紫苑的叶和果实以及其它花卉植物、灌木(尤其是生长期早期的刺槐 和枕叶树)造成损害。在温带地区，这种蛾每年可产生2-4代。卵被产在叶片或果实 上，每簇有3-150个卵，卵孵化成幼虫。

在澳洲东部发现了世界性的粘虫-东方粘虫(Mythimna separata)，这种粘虫是包 括牧草、谷物和玉米在内的草类的害虫。这种粘虫每年1-4月产卵。卵淡奶油色，成 簇产在草类较低的叶子中，通常在叶片或叶鞘之间。幼虫发育需要1个月，这取决 于幼虫生长到五龄虫期间的气候条件。蛹通常在1-3月发现，而成虫在1-4月发现。 在春天出现的蛾来自过冬幼虫。每年通常有3代。

苹果蠢蛾(Cydia pomonella)是包括仁果(如苹果和梨)在内的梨果的主要害虫。其它 不经常但也会受到攻击的植物是胡桃和李。其它已知宿主包括桃、油桃和杏。通常 在12月/1月产卵。滞育的五龄幼虫在宿主树的树皮下和树洞中的茧内过冬。这些幼 虫经历1月后在春天变为蛹。成虫在11、12和1月出现。直径约1毫米的卵通常单 独产在果实附近的叶子上或果实本身上。当每年只有一代时[一化]产卵期可延续整个 夏天，这与海外一代群体通常较短的产卵期不同。

在本发明的一个实施方式中，本发明的方法和组合物通过抑制虱卵孵化来治愈虱 子的目标。本申请人已识别出能作为抑制外寄生虫虱卵孵化的有效制剂的金属螯合 剂和金属蛋白酶抑制剂。用金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂来抑制外寄生虫虱卵孵 化的优点是能防止外寄生虫的繁殖周期，从而防治外寄生虫侵染。

在本发明的另一个实施方式中，本发明的方法和组合物通过抑制外寄生虫卵孵化 来防止幼虫侵染植物。本申请人已识别出能作为抑制外寄生虫卵孵化成以经济作物 为食的幼虫的有效制剂的金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂。用金属螯合剂或金属蛋 白酶抑制剂来抑制外寄生虫卵孵化的优点是能防止产生以经济作物为食的幼虫的外 寄生虫的繁殖周期从而防治外寄生虫侵染经济作物。

本文中术语“金属蛋白酶”指涉及外寄生虫卵孵化的蛋白酶，所述蛋白酶具有能 用作催化剂的活性金属离子。优选地，金属蛋白酶含有能参与催化反应，通过极化 水分子来攻击底物-肽连接的锌离子。更优选地，金属蛋白酶对能阻断其活性的金属 螯合剂敏感。金属蛋白酶可在卵内部发生作用而参与诱导卵孵化。例如，对于虱， 金属蛋白酶可作用于卵的卵盖或孵育襟翼(hatch-flap)而促进卵孵化。涉及外寄生虫卵 孵化的合适金属蛋白酶包括内蛋白酶(在肽链内分裂的酶)和外蛋白酶(从肽末端分裂 氨基酸的酶)。外蛋白酶也可以分类为羧基蛋白酶(从C末端分类氨基酸)或氨基肽酶 (N末端分类氨基酸)。为具备活性，金属-羧基蛋白酶需要二价阳离子(通常Zn2+)，而 氨基肽酶一般依据金属离子(Zn2+或Mg2+)来分类。它们以游离形式和膜束缚形式存 在，并且在高pH(8-10)下具有活性。检测愈卵孵化相关的金属蛋白酶的方法涉及收 集孵化卵时在形成胚胎周围的流体或在卵孵化后快速冲洗空卵壳，并采用明胶底物 SDS-PAGE分析来分析样品存在的蛋白酶。显示样品存在溶解蛋白活性时，则可以 在金属蛋白酶抑制剂，例如1，10-菲咯啉存在下孵化，然后再分析处理过的样品，以 确定从已经孵化的卵提取的蛋白酶是否有活性。从孵化后卵获得的金属蛋白酶显示 具有抑制活性时，则可以将未孵化的卵暴露于同样的抑制剂中，评价能否抑制卵发 生孵化。涉及卵孵化的金属蛋白酶的鉴别还可以通过鉴定金属蛋白酶的基因编码， 沉默该基因并显示该卵不能通过本领域技术人员已知的方法孵化来鉴别。

本文中词语“抑制外寄生虫卵孵化”指防止外寄生虫卵孵化。本发明中，与未处 理的外寄生虫卵相比，将外寄生虫卵暴露于能防止卵孵化的金属螯合剂或金属蛋白 酶抑制剂中。卵孵化的特征是卵的孵育襟翼(hatch-flap)或卵盖打开，之后若虫很快突 露。对于虱，首先露出头，随后连接腿的胸部。最后，腹部突露，若虫从卵中爬出。 对于蛾或蝴蝶的卵，卵孵化并产生幼虫。卵孵化排除了卵壳损坏或意外破碎。

优选地，金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂是在产卵和孵化之间任何时间施用于卵 时能抑制卵孵化的化合物。

外寄生虫卵优选地，但不限于存在于宿主生物体，如动物的皮肤、毛发、皮毛或 羊毛或人的头发中。在本发明的另一个实施方式中，外寄生虫卵可存在于宿主动物 包括人，宿主植物包括粮食作物、果树、棉花、油籽作物、观赏植物、花卉、蔓生 作物、根类作物、牧草和蔬菜，或其它繁殖地，例如但不限于，房屋和建筑物，家 畜和畜牧动物的围栏，地毯、毯子、帘子和家具。

根据本发明，通过任何合适的手段将外寄生虫卵暴露于金属螯合剂或金属蛋白酶 抑制剂。本领域技术人员会理解这些手段可以不同，取决于是否将抑制剂施用于宿 主，如植物或动物或其它各种繁殖地，并取决于目标外寄生虫的特性和种类。将存 在于动物的外寄生虫卵暴露于金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂的合适手段包括但不 限于，直接局部施用，如通过浸泡或喷涂，植入，缓释制剂或器件。本发明应用于 人时，适合于局部施用的制剂包括但不限于：喷剂、气雾剂、洗剂、起泡剂、乳膏 和洗液，适合于内部施用的制剂包括但不限于：片、胶囊和液体制剂。某些情况下， 肠胃外给药是用于人或动物的最合适的防治手段。将金属螯合剂或金属蛋白酶抑制 剂应用于植物时，合适的手段包括但不限于：喷剂、粉剂、颗粒或气雾剂。本发明 方法还包括同时或相继使用两种或多种金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂，或同时或 相继结合其它已知防治外寄生虫的制剂使用一种或多种金属螯合剂和/或金属蛋白酶 的方法。

在本发明另一方面，方法和组合物还包括能防治孵化、幼虫、若虫和/或成年外寄 生虫的杀外寄生虫药。例如，能同时、单独或依次与本发明金属螯合剂或金属蛋白 酶抑制剂结合使用的合适杀外寄生虫药包括：大环内酯如多杀菌素(spinosad)、植物 性杀虫剂、氨基甲酸酯杀虫剂、干燥剂杀虫剂、二硝基苯酚杀虫剂、含氟杀虫剂、 甲脒杀虫剂如双虫脒(armitraz)、熏蒸杀虫剂、无机杀虫剂、昆虫生长调节剂(包括几 丁质合成抑制剂、保幼激素模拟物、保幼激素、蜕皮激素激动剂、蜕皮激素拮抗剂、 蜕皮激素、蜕皮抑制剂)、烟碱类杀虫剂、有机氯杀虫剂、有机磷杀虫剂、杂环有机 硫代磷酸酯杀虫剂、苯基有机硫代磷酸酯杀虫剂、膦酸酯杀虫剂、硫代膦酸酯杀虫 剂、氨基磷酸酯杀虫剂、硫逐磷酰胺酯(phosphoramidothioate)杀虫剂、二酰胺基磷酸 酯(phosphorodiamide)杀虫剂、二嗪杀虫剂、邻苯二甲酰亚胺杀虫剂、吡唑杀虫剂、 拟除虫菊酯杀虫剂、嘧啶胺(pyrimidinamine)杀虫剂、吡咯(pyrrol)杀虫剂、特普酸类 杀虫剂、硫脲杀虫剂和EP0191236、US5,288,483和US6,727,228所述的脲杀虫剂。 其它有用的杀虫剂包括二甲基硅氧烷共聚醇，如US6,663,876和US6,607,716所述 的那些低毒性品种。这些组合的的优点是只需要一次施用就能防治外寄生虫的整个 生命周期。

金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂可施用于宿主的毛发和皮肤，优选在被外寄生虫 侵染的区域。外寄生虫侵染优选是由于选自虱子、跳蚤、壁虱、苍蝇和其它穿刺或 吸血外寄生虫，以及它们的组合造成的，尤其是外寄生虫侵染是由虱子引起的。金 属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂可以药膏、水性组合物包括溶液和悬浮液、乳膏、洗 液、气雾喷剂或粉化粉末形式局部施用。当宿主是植物时，外寄生虫侵染最好由选 自鳞翅类如蝴蝶或蛾的外寄生虫造成。金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂可以喷雾或 粉尘的形式局部施用。

术语“有效量”指足以提供治疗和防止宿主的外寄生虫侵染的至少一种金属螯合 剂或至少一种金属蛋白酶抑制剂的浓度。本发明方法中使用的金属螯合剂或金属蛋 白酶抑制剂的有效量可依据宿主以及外寄生虫侵染的种类和程度变化。在一个实施 方式中，金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂优选地施用到陷于头虱感染的人的发干， 并在被治疗的人上停留一段时间以防止虱卵孵化。优选地，这段时间为5-15分钟。 金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂的使用浓度优选在约0.0001mM至1M之间，优选 0.01mM-100mM，更优选0.1mM-30mM。有效量取决于所用的金属螯合剂或金属蛋 白酶。但是，一些联吡啶化合物可以适当在5mM-15mM，特别是以约10mM施用。 由于很多哺乳动物的蛋白酶需要锌用于它们的活性，可由金属螯合剂和/或金属蛋白 酶抑制剂实施，因此必须确保金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂以安全和有效量施用， 宜专门瞄准外寄生虫卵。

在另一个实施方式中，金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂被施用于经济作物以防止 外寄生虫卵孵化。金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂可通过喷雾、涂刷或撒粉直接施 用于存在于植物叶、芽、茎、花或果实上的卵。合适的组合物包括可乳化的浓缩物、 可直接喷洒或可稀释的溶液、微囊化乳液、稀释乳剂、可湿粉末、可溶粉末、悬浮 浓缩物、粉尘或颗粒。金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂的使用浓度优选在约 0.0001mM至1M之间，优选0.01mM-100mM，更优选0.1mM-30mM。有效量取决于 所用的金属螯合剂或金属蛋白酶。但是，一些联吡啶化合物可以适当在 0.01mM-15mM，特别是以约0.1-15mM，更特别是1-15mM，最特别是约10mM施用。

采用本发明方法治疗的宿主选自，但不限于：人、羊、牛、马、猪、家畜、狗和 猫。本发明的治疗或预防方法可应用于植物或外寄生虫的其它繁殖地。采用本发明 方法防治的植物优选选自：棉花，油籽作物如加拿大油菜，装饰植物如灌木，花卉 如菊花、紫苑、天竺葵和石竹，果树如苹果、梨、李、奇异果、醋栗以及柑橘类如 柠檬、桔、酸橙和柚子，粮食作物如玉米和甜玉米，蔓生作物如葡萄、根类作物、 牧草如红苜蓿和白苜蓿、紫苜蓿和羽扇豆，以及蔬菜如芸苔作物例如椰菜和花椰菜、 甘蓝、番茄、夏南瓜、韭菜、莴苣，以及豆类如海军豆、大豆、绿豆、木豆和鹰嘴 豆。

本发明的活性成分可用于抑制外寄生虫卵孵化，所述外寄生虫卵在植物(主要是 农业、园艺和造林的有用植物和观赏植物的作物)上，或在这种植物的一部分如果实、 花、树叶、茎、块茎或根上，一些情况下甚至在后来形成的用来抵御这些害虫的植 物部分上。在这些组合物中，活性成分与至少一种制剂领域通常使用的辅佐物质如 填料例如溶剂或固体载体或者如表面活性化合物(表面活性剂)一起使用。

合适溶剂的例子有：非氢化或部分氢化的芳烃，优选C8-C12的烷基苯组分，如二 甲苯混合物，烷基化萘或四氢化萘，脂肪烃或脂环烃如烷烃或环己烷，醇类如甲醇、 乙醇、丙醇或丁醇，乙二醇以及它们的醚和酯如丙二醇、二丙二醇醚、己二醇、乙 二醇、乙二醇单甲醚或乙二醇单乙醚，酮类如环己酮、异佛尔酮或双丙酮醇，强极 性溶剂如N-甲基吡咯-2-酮、N-甲基-吡咯烷、二甲亚砜或N，N-二甲基甲酰胺、水、 游离的或环氧化的油菜籽油、蓖麻油、椰油或大豆油，以及硅酮油。

例如用于粉剂和可分散粉末的固体载体原则上是天然研磨材料，如方解石、滑石、 高岭土、蒙脱土或绿坡缕石。为改善物理特性，还可以添加高分散性二氧化硅或高 分散性吸收性聚合物。粒剂的合适微粒吸附载体为多孔类型，如浮石、砖粉(brick grit)、 海泡石或膨润土，合适的非吸附性载体材料是方解石或砂。此外，可使用大量无机 或有机颗粒材料，尤其是白云石或粉末的植物残渣。

根据要配制的活性成分的性质，合适的表面活性化合物是具有良好乳化、分散和 可湿特性的非离子、阳离子和/或阴离子表面活性剂或是表面活性剂混合物。下面列 出的表面活性剂仅举例而已；通常用于制剂领域并适用于本发明的更多的表面活性 剂在有关文献中有记述。

合适的非离子表面活性剂主要是脂肪醇或脂环醇、饱和或不饱和脂肪酸以及烷基 酚的聚乙二醇醚衍生物，它可含有3-30个乙二醇醚基团，并在(脂肪)烃残基中含有 8-20个碳原子、在烷基酚的烷基残基中含有6-18个碳原子。同样适合的是与聚丙二 醇、乙二胺聚丙二醇和烷基聚丙二醇的水溶性聚环氧乙烷加合物，其在烷基链中含 有1-10个碳原子并含有20-250个乙二醇醚和10-100个丙二醇醚基团。上述化合物 通常每个丙二醇单元含有1-5个乙二醇单元。其例子有壬基苯基聚乙氧基乙醇、蓖麻 油聚乙二醇醚、聚丙烯/聚环氧乙烷加合物、三丁基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇 和辛基丙氧基聚乙氧基乙醇。同样适合的是聚氧乙烯脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，如 聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯。

阳离子表面活性剂主要是季铵盐，它含有至少一个8-22的碳原子的烷基残基作 为取代基，并含有可被卤化的低级烷基、苄基或低级羟烷基残基作为进一步的取代 基。所述盐异位卤化物、硫酸甲酯或硫酸乙酯形式。其例子有硬脂酰三甲基氯化铵 和苄基二(2-氯乙基)乙基溴化铵。

合适的阴离子表面活性剂可以是水溶性脂肪酸金属盐(soap)和水溶性合成表面活 性化合物。合适的脂肪酸金属盐是高级脂肪酸(C10-C22)的碱金属盐、碱土金属盐和未 取代或取代的铵盐，如油酸或硬脂酸或者可从例如椰油或妥尔油获得的天然脂肪酸 混合物的钠盐或钾盐；或是脂肪酸甲基牛磺酸(fatty acid methyltaurinate)。然而，更 频繁使用的是合成的表面活性剂，尤其是脂肪磺酸盐、脂肪硫酸盐、磺化苯并咪唑 衍生物或烷基芳基磺酸盐。原则上，脂肪磺酸盐和脂肪硫酸盐以碱金属盐、碱土金 属盐或者不饱和或饱和的铵盐存在并通常含有8-22个碳原子的烷基残基，烷基还包 含酰基残基的烷基部分。脂肪磺酸盐和脂肪硫酸盐的例子包括木素磺酸、十二烷基 硫酸酯或用天然脂肪酸制备的脂肪醇硫酸酯混合物的钠盐或钙盐。该组还包括脂肪 醇/环氧乙烷加合物的硫酸酯及磺酸的盐。磺化的苯并咪唑衍生物优选含有2个磺基 和1个具有约8-22个碳原子的脂肪酸残基。烷基芳基磺酸盐的例子是十二烷基苯磺 酸、二丁基萘磺酸或萘磺酸/甲醛缩合的钠盐、钙盐或三乙醇铵盐。同样适用的是相 应的磷酸盐，如对壬基苯酚(4-14)环氧乙烷加合物的磷酸酯的盐，或磷脂。

本发明组合物可配制为溶液和乳液。组合物可以存在合适的赋形剂，如乳化剂、 表面活性剂、稳定剂、染料、渗透增强剂和抗氧化剂。可加入组合物的合适载体包 括：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、硬脂酸镁和硅酸。组合物可以包括 灭菌和未灭菌水溶液。一实施方式中，组合物为溶液形式，金属螯合剂或金属蛋白 酶抑制剂以稀释在可溶的灭菌缓冲盐水或水溶液中较好。组合物还可以配制成在水 性介质、非水性介质或混合介质中的悬浮液。含水悬浮液还包含提高悬浮液粘度的 物质，并且还含有稳定剂。溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。 组合物可以包含与金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂活性相容的其它辅助组分。本发 明的组合物可以配制成泡沫体、乳液、微乳液、洗剂、幕司、乳膏和凝胶体使用。 上述组合物的制剂为杀外寄生虫药领域的技术人员已知。

在优选的实施方式中，组合物包含浓度为0.0001mM-1M，较好为0.1mM-100mM， 更好为0.1mM-30mM的金属螯合剂。含某些金属螯合剂或金属蛋白酶抑制剂，例如 联吡啶化合物的组合物，宜含有0.01-15mM，特别是约0.1-15mM，更特别是约 1-15mM，更特别是约10mM的化合物。

本发明还提供一种识别抑制外寄生虫卵孵化的化合物的方法，该方法包括评价化 合物对外寄生虫卵中存在的金属蛋白酶抑制能力。

可以采用各种方法来测试化合物对金属蛋白酶的作用，但是，评价方法总体上宜 涉及比较存在与不存在测试化合物时的金属蛋白酶的酶活性。一种检测与卵孵化相 关的金属蛋白酶的方法涉及收集孵化卵时在形成胚胎周围的流体或在卵孵化后快速 冲洗空卵壳，并采用明胶底物SDS-PAGE分析来分析样品存在的蛋白酶。显示样品 存在溶解蛋白活性时，则可以在金属蛋白酶抑制剂，例如1，10-菲咯啉存在下孵化， 然后再分析处理过的样品，以确定从已经孵化的卵提取的蛋白酶是否有活性。从孵 化后卵获得的金属蛋白酶显示具有抑制活性时，则可以将未孵化的卵暴露于同样的 抑制剂中，评价能否抑制卵发生孵化。涉及卵孵化的金属蛋白酶的鉴别还可以通过 鉴定金属蛋白酶的基因编码，沉默该基因并显示该卵不能通过本领域技术人员已知 的方法孵化来鉴别。该方法还可包括在外寄生虫卵孵化生物试验中测试该化合物。

合适的外寄生虫卵孵化生物试验宜包括：将外寄生虫卵的测试样品暴露于包含测 试化合物的溶液的同时，将外寄生虫卵的对照样品暴露于对照缓冲溶液。

在对照样品观察到卵孵化，而在测试样品中观察到少量孵化时，认为该化合物能 有效抑制外寄生虫卵孵化。在本发明优选的卵孵化试验中，外寄生虫卵选自：虱子、 跳蚤、壁虱、苍蝇和其它穿刺或吸血外寄生虫的卵。在一个优选实施方式中，外寄 生虫卵样品是虱子卵。优选地，所用卵样品(对照样品和测试样品)都是产卵后不超过 4-5天。更优选地，所用卵样品是产卵后不超过1天。

对照缓冲溶液包括但不限于：灭菌磷酸盐缓冲的盐水或水。测试的化合物较好是 金属螯合剂和/或金属蛋白酶抑制剂。在卵孵化生物试验中，观察到当卵的孵育襟翼 或卵盖打开时卵孵化，之后若虫很快开始突露。对于虱子，首先露出头，随后连接 腿的胸部。最后，腹部突露，若虫从卵中爬出。对于头虱，卵壳则仍粘着在发干上。

本发明另一方面，提供至少一种金属螯合剂在制备用于抑制外寄生虫卵孵化或治 疗或预防外寄生虫侵染的组合物中的应用，其中，所述金属螯合剂是一种包含至少 两个能同时与一个金属离子配位的杂原子的化合物，两个杂原子中至少一个选自氮、 硫、氧和磷，其中所述化合物包含至少一个被至少一个杂原子取代和/或被含至少一 个杂原子的取代基取代的碳环，或所述化合物包含至少一个含至少一个杂原子的杂 环，其中所述杂环任选被至少一个杂原子取代和/或被含至少一个杂原子的取代基所 取代。在一个实施方式中，所述外寄生虫卵侵染植物宿主。在另一个实施方式中， 所述外寄生虫卵侵染家畜。再在另一个实施方式中，所述外寄生虫卵侵染人类。在 本发明的另一方面，提供了至少一种金属螯合剂在制造用于抑制外寄生虫卵孵化或 用于治疗或预防外寄生虫侵染的组合物中的应用。

本发明还包括包含至少一种本文所述的金属螯合剂和/或至少一种金属蛋白酶抑 制剂的制剂，用来抑制外寄生虫卵孵化或治疗或预防外寄生虫侵染。

本说明书中词语“包括”或变体如“包含”应理解为意味着包括所指的一个整体 或分步的元素，或成组的整体或分步的元素，但不排除任何其它一个整体或分步的 元素，或成组的整体或分步的元素。

由下面的非限制性附图和实施例说明本发明。

实施例

实施例1：虱卵孵化机理的评价：

在解剖显微镜下评价虱卵孵化的机理。雌性衣虱在兔身上喂养半小时，之后转移 到有人头发的陪替氏培养皿中。然后将该陪替氏培养皿放入32℃和42％相对湿度的 孵化器中。5小时饲养期间，雌性虱子开始产卵。每一个雌性虱子在一次孵化时产至 多10个卵。卵在之后的7-9天发育。在孵化前的最好12小时内观察到以下变化。用 取向为其头靠近孵育襟翼或卵盖的发育胚胎，清楚地检测到在卵内的发育胚胎的眼 睛。观察到胚胎在卵内运动。孵化发生在卵盖打开时，之后胚胎很快突露。首先露 出头，随后连接腿的胸部。最后，腹部突露，若虫从卵中爬出，卵仍粘着在头发上。 在光学显微镜下，没有明显可视的与新突露的若虫头有关的结构，这便于孵化(即， 不存在卵齿)。由这一观察结果可认为虽然若虫在卵内的物理运动可能对卵孵化有用， 但也涉及其它特定的生物化学特征。

实施例2：检测虱卵提取物中的蛋白酶活性：

在孵化的12小时内，从头发上取下50个体虱(Pediculus humanus launzanus)卵， 放至一个1ml离心管中。将20μL蒸馏水加到未孵化卵中，在32℃制备孵化30分 钟。回收20μL并于-70℃储存。按上述还收集许多其它样品。并收集已取下未孵化 卵的头发样品，按上述步骤孵化。此外，收集在产卵后7天(卵孵化的24小时内)的 未孵化卵样品和除去虱卵的头发样品。两种样品都用10ml的1％次氯酸钠溶液洗涤 1分钟，随后用25ml蒸馏水洗涤5×1分钟，除去次氯酸盐。然后，这些样品按上述 在20μL蒸馏水中孵化。此外，一组25个在孵化的24小时内的虱卵用1％次氯酸钠 预处理，按上述洗涤，让它孵化。在孵化后的1-2小时内，空的卵壳按照上述在20μL 蒸馏水中孵化，从孵化卵壳收集洗涤液并在-70℃储存。然后，全部提取物样品冷冻 干燥过夜。冷冻干燥的样品然后再悬浮于15μL未还原的SDS样品缓冲液中，以 10,000g离心2分钟，然后将全部15μL悬浮液加在10％明胶底物SDS-PAGE凝胶上。 该凝胶在4℃，10mA下操作10分钟，随后在15mA/凝胶下再操作25分钟。然后， 它们在2.5％Triton-X100溶液中孵化2×20分钟，随后在pH 8.0的含1mM CaCl2的 0.1M Tris/HCl中孵化3小时。检测为凝胶上透明区的活性，蛋白酶活性的结果分解 凝胶中的明胶。

这些研究的结果表明，蛋白水解活性存在于许多不同制备物，如使用底物 SDS-PAGE所分析的。在孵化12小时内，在未孵化虱卵获得的洗涤物中检测到蛋白 酶活性(图1，泳道1)。这种活性在凝胶的高分子量区。在明胶底物SDS-PAGE上分 析已经除去虱卵的头发样品时检测到显著量的蛋白酶活性(图1，泳道2)。对这种活 性的最可能的说明是，它是在产量时产生的母性起源。用次氯酸钠处理头发样品能 完全除去污染的蛋白酶(图1，泳道3)。此外，对未孵化量的处理也能除去这种蛋白 酶活性(图1，泳道4)。因此，决定在孵化前按上述用1％次氯酸钠进行处理，以除去 这些母性蛋白酶。对新孵化后的卵壳(卵壳洗涤物)的分析表明：存在两种高分子量物 质(图1，泳道5)。注意到在这次收集中只用了25个虱卵，可能对低水平的蛋白酶活 性有用。这些结果证实存在直接与新孵化的虱卵相关的蛋白酶活性。

总之，用光学显微镜对虱子的孵化方案进行研究。卵孵化呈现出与卵内发育的若 虫的物理活性有关。但是，缺乏任何专门用来穿刺或松开孵育襟翼或卵盖的结构， 表明孵化方案还涉及生物化学构成。虽然在卵孵化时在虱子中检测到高活性蛋白酶， 但是这些蛋白酶的主要来源表现出是母性起源。对正进行成功孵化的虱子使用次氯 酸钠能达到在卵孵化前除去这种活性。随后对新孵化的虱子的ESW分析表明，存在 有限的蛋白酶物质，它们可作为对抑制虱子的卵孵化的目标作进一步的研究。

实施例3：卵壳洗涤物中蛋白酶的特征：

为评价在卵壳洗涤物中虱子孵化蛋白酶作为用来抑制卵孵化的目标的可能性，首 先必须确定孵化蛋白酶的特性。用四种蛋白酶类的抑制剂来分类ESW中的蛋白酶。

将10％SDS-PAGE明胶底物凝胶装在来自100个虱卵的冷冻干燥的卵壳洗涤物 中，该洗涤物已再悬浮于50μl非还原样品缓冲液，样品以10μl/泳道运行。凝胶以 10mA/凝胶在4℃运行10分钟，随后以15mA/凝胶再运行25分钟。然后，将凝胶切 成带，每个带在含特定抑制剂的2.5％Triton-X100溶液中孵化2×20分钟。所用抑 制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF(5mM)、金属蛋白酶抑制剂1，10-菲咯啉(10mM)、 天冬氨酸蛋白酶抑胃酶肽(5μM)和半胱氨酸抑制剂E-64(10mM)。然后，凝胶带在含 不同蛋白酶抑制剂的pH为8的含1mM CaCl2的0.1M Tris/HCl中，37℃孵化3小时， 之后用考马斯蓝染色并前面所述脱色。与图1不同，泳道5显示约25-30kDa的蛋白 水解活性的优势(参见图2括弧)。洗涤ESW的制备物的随后分析表明：这种约25-30 kDa的蛋白水解活性的三倍量能很好重现。抑制剂的研究结构表明：用1，10-菲咯啉 处理后蛋白酶的活性明显下降(泳道2括号区)。观察当用丝氨酸蛋白酶抑制剂PMS 或半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64时，ESW的蛋白酶活性没有下降。此外，天冬氨酸抑 制剂抑胃酶肽未显示蛋白酶活性的然后下降(数据未列出)。

实施例4：用来测定虱卵孵化的体外活体鉴定的改进：

为评价蛋白酶抑制剂对虱卵孵化的潜在作用，必须进行可靠的体外活体鉴定。雄 性和雌性衣虱按照前面所述在兔子上喂养。雌性和雄性成年虱子以3∶1的比例转移到 一个透明陪替氏培养皿，该培养皿中有约3×3cm2的尼龙布，在32℃保留12小时。 在此期间雌性虱子产卵并将卵固定在织物布上。然后除去所有虱子，让卵在孵化5 天。在第6天，将含有卵的布放入1％次氯酸钠溶液中1分钟，然后充分洗涤。卵通 过最好的发育阶段发展到孵出。在未处理的对照卵中，采用体外卵孵化评价，达到 85-95％的可靠的平均孵化％。随后发现对卵孵化评价，并不需用次氯酸钠预处理虱 卵。

实施例5：识别能抑制虱子孵化蛋白酶活性的化合物：

(a)采用虱卵-孵化活体鉴定测试蛋白酶抑制剂。

已改进用来测定虱卵孵化的活体鉴定，在研究的下一阶段，采用这种活体鉴定作 为测试不同蛋白酶抑制剂对卵孵化的作用。

如上所述，将虱卵放在布上。5天后，除去布上虱卵，并将其浸在1％次氯酸钠 溶液中，之后用蒸馏水充分洗涤，并在棉纸上吸干。在解剖显微镜下对虱卵计数， 将布切成一批有10-30卵的小块，对每一次处理有3-5个重复品。将含有虱卵的布浸 在蛋白酶抑制剂溶液中2-10分钟，再放在棉纸上吸干1分钟，然后转移到一个透明 陪替氏培养皿上，孵卵直到孵化。在接下来的1-2天，以规定时间间隔观察卵证明卵 孵化，这段时间对照卵孵化。通常将蛋白酶抑制剂溶液制备成储备溶液，以适当浓 度新鲜加入。具体的储备溶液如下制备：1，10-菲咯啉(200mM甲醇溶液)和苯丁抑制 素(5mg/ml甲醇溶液)。此外，在含对照卵的非抑制剂中加入等量溶剂，测试任何只 有缓冲剂时的作用。计算孵化抑制百分数为预未处理的对照相比，卵孵化减少的百 分数。未处理的对照指定为100％的孵化。

加入1，10-菲咯啉(一种金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂)在10mM时能显著抑制 虱子的卵孵化，与对照组相比在1mM时的抑制水平约为30％(参见图3)。苯丁抑制 素(一种金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂，更具体是氨基肽酶M和N)在5mM时也能 显著抑制虱卵孵化(图4)。

这些结果提供了特定金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂对虱卵孵化作用的数据。但 是，注意到在孵化24小时内加入1，10-菲咯啉或苯丁抑制素时，观察到不同的对卵孵 化的抑制作用(数据未示出)。这种对孵化抑制作用的变化的原因可能是涉及虱子特定 发育阶段的许多因素。而且，这些研究表明，很难预测卵孵化的确切时间，因此在 评价具体抑制剂对卵孵化作用时，可能较难选择处理卵的简单时间点。因此，考虑 到虱子发育中的这种变化性，改进体外活体鉴定系统。

(b)采用体外活体鉴定的时程实验。

进行一系列的时程实验，作为评价抑制剂对虱卵孵化作用的手段。如前面所述将 卵放置在布上，然后以24小时的间隔，将抑制剂加入新的一组卵，直到放置到120 小时。然后，卵在28℃再孵化8天，使卵孵化。这种评价抑制剂的方法更接近反映 出虱卵在各发育阶段的现场情况。

这些研究的结果列于表1。证明不同浓度的1，10-菲咯啉在虱子孵化方案中的显著 抑制作用。还观察到1，10-菲咯啉的抑制作用与浓度无关的程度。结果表明：时程实 验提供了一种评价抑制剂对虱卵孵化的抑制作用的更可靠的手段。加入苯丁抑制素 产生显著的抑制作用，不仅是在卵孵化前24小时施用时。

表1.在产卵后，用不同浓度1，10-菲咯啉和5mM苯丁抑制素处理后，以24小时 的间隔对卵孵化的抑制％

  产卵后的时间(小时)   抑制剂   24小时   48小时   72小时   96小时  120小时  144小时   10mM 1，10-菲咯啉   100   100   100   100  100  100   5mM 1，10-菲咯啉   100   100   100   100  93  96   2.5mM 1，10-菲咯啉   100   100   85   85  89  60   5mM苯丁抑制素   -   -   -   -  -  53

上面的研究结果表明：虱子孵化酶是金属类蛋白酶，如由金属螯合剂金属蛋白酶 抑制剂1，10-菲咯啉抑制其活性作用所判断的。而且，特别在孵化期间以低浓度处理 卵时，浓度依赖作用的明显证据说明，这种化合物能够在全部测试的时间点显著抑 制虱卵孵化。1，10-菲咯啉提供其螯合金属离子较好是锌的能力显示其作用，从而抑 制与锌相关的蛋白酶。

对苯丁抑制素的数据还表明，在卵发育后阶段将该化合物给予卵时，特别能抑制 虱子卵的孵化。苯丁抑制素是一种环化合物，包含被含胺、羟基、酰胺和羧基的取 代基取代的芳环。苯丁抑制素是一种微生物源的抗生素，可用来防治各种形式的毒 瘤，包括非淋巴细胞的白血病，以及不同形式的固态肿瘤，包括肺、胃、膀胱、头、 颈和食管，苯丁抑制素名下使用的情况。可以以低毒性给予培养的细胞，接触动物 和人。虽然苯丁抑制素常规以微摩尔浓度用作纯化蛋白酶的抑制剂(10μM和130μM)， 所获数据表明只到5mM才是有效。这一结果可能是由于多种因素包括苯丁抑制素穿 透卵的能力及其对虱子孵化蛋白酶的特异性能造成的。

实施例6：筛选抑制虱卵孵化的蛋白酶抑制剂：

按实施例4所述，将虱子卵放在布料上。按照实施例5(部分(b))所述组织一系列 的时程试验。对相当数量的市售蛋白酶抑制剂/金属螯合剂进行虱子孵化试验，以测 定各蛋白酶抑制剂对虱卵孵化的作用(表2)。计算的孵化抑制百分数为与未处理的对 照组相比卵孵化减少的百分数。设定未处理的对照组的孵化百分数为100％。

表2用各种蛋白酶抑制剂处理后对虱卵孵化抑制百分数。抑制百分数指在该试验 的时程中达到的最大卵孵化。

  编号   抑制剂  抑制％*   1   1，10-菲咯啉(10mM)  100   2   2，2-联吡啶(10mM)  100   3   6，6′-二甲基-2，2’-联吡啶(10mM)  100   4   5，5′-二甲基-2，2’-联吡啶(10mM)  100   5   卡托普利(23mM)  27   6   D-L Thiorophan(1mg/ml)  20   7   磷酸阿米酮(phosphoramidon)(5mM)  41   8   放线酰胺素(5mM)  0   9   苯丁抑制素(5mM)  58   10   硝基苯丁抑制素(1mg/ml)  0   11   阿吗他定(5mM)  26   12   leuhistin(5mM)  0   13   ebelactone(1，2和5mM)  0   14   L-亮氨酸硫醇(L-leucinthiol)(5mM)  0   15   烟曲霉素(5mM)  0   16   羧肽酶抑制剂(5mM)  26   17   N-CBZ-PRO-LEU-GLY羟肟酸酯(10mM)  0   18   四环素(5mg/ml)  89   19   强力霉素(5mg/ml)  69   20   二甲胺四环素(5mg/ml)  55   21   GM 1489  0   22   GM 6001  0   23   抑制剂IV  0   24   洗必太二盐酸盐  0

*不同蛋白酶抑制剂对卵孵化的抑制百分数相对于适当的对照进行计算，抑制百 分数代表所观察到的最大卵孵化抑制。

许多蛋白酶抑制剂显示能显著抑制虱卵孵化。测试显示最有效的抑制剂包括金属 螯合剂和金属蛋白酶抑制剂，如1，10-菲咯啉、2，2-联吡啶和6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶、 5，5′-二甲基-2，2′-联吡啶(各自在10mM时100％抑制)。苯丁抑制素(金属蛋白酶抑制剂) 也能显著抑制卵孵化(5mM时为58％)。

天然生成的基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂和金属螯合剂是一种四环化合物(其中 一个环是芳环，四环结构可以被多个羟基、羰基、胺和酰胺取代)，它包括：四环素 (5mg/ml时89％抑制)，强力霉素(5mg/ml时65％抑制)和二甲胺四环素(5mg/ml时55％ 抑制)。这些金属螯合剂显示对卵孵化的抑制活性，但是这些化合物的抑制效果量级 上有较大差别，并且表现出与时间相关。氧肟酸盐抑制剂的总体可用性由于降低抗 生素在一般环境的使用而受到限制。这些结果表明MMP抑制剂也对虱卵孵化显示抑 制作用。测试的其它蛋白酶抑制剂包括100mM EDTA、10mM EGTA和5％三乙醇 胺。结果表明这些抑制剂在所用浓度并未显示对卵孵化的作用(结果未示出)。

实施例7：用1，10-菲咯啉洗涤卵的后处理效果：

该试验用来测定洗涤卵是否能达到1，10-菲咯啉的抑制活性(表3)。还设定对照组 (5％甲醇)。金属孵化抑制％为与未处理对照组相比的卵孵化降低的百分数。设定未 处理对照组的抑制百分数为100％。此试验的结果表明在水中洗涤卵后1，10-菲咯啉 仍能有效抑制虱卵孵化。在后一阶段，卵适当孵化(5天)，其作用显示与使用低浓度 抑制剂时有类似的浓度依赖性。还注意到用一定比例的用1，10-菲咯啉处理的卵的胚 胎在正常发育下仍不能孵化。

表3.在虱子产卵后以24小时间隔，用10mM 1，10-菲咯啉处理，对卵孵化的抑制百分 数。虱子卵用抑制剂处理10分钟并且不洗涤，或进行处理并洗涤1分钟，然后孵化。

  产卵后的时间(小时)   24   48   72   96   120   处理/不洗涤   100   100   100   100   100   处理/洗涤   100   100   100   97   62

实施例8：用1，10-菲咯啉抑制头虱卵孵化：

该试验用来测定金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂1，10-菲咯啉是否能抑制头虱卵 (Pediculus humanus capitus)孵化，与体虱不同。将每组1-2只雄性头虱成虫和6-8只 雌性头虱成虫放在有棉布的24孔陪替氏培养皿的单个孔中，获得卵。将陪替氏培养 皿转移到32℃，70％RH的潮湿孵化器中12小时，使雌性虱子产卵。12小时后，从 陪替氏培养皿孔中取出成年虱子，进行一系列的时程试验。一组卵(24小时虫龄)用 200μl 10mM 1，10-菲咯啉处理10分钟。还包括对照组卵(即未经抑制剂处理)。从抑 制剂中除下的卵在棉纸上吸干，处于32℃和70％RH下孵化。第二组卵(48小时虫龄) 如前所述进行处理并且进行孵化。在产卵后以24小时间隔重复这一方案，至多为120 小时。这种测试抑制剂的方法更密切反映了虱子卵在头的发育不同阶段的现场并且 观察到对不同阶段的寄生虫的抑制作用。

上面的研究结果表明1，10-菲咯啉能显著抑制头虱的卵孵化(表4)。

表4.在产卵后以24小时间隔，用10mM 1，10-菲咯啉处理，相对于对照组对卵孵 化的抑制百分数。

  产卵后天数   1   2   3   4   5   处理   100   87   88   100   100

这些结果足以表明体虱是一种用来评价蛋白酶抑制剂对头虱的卵孵化的抑制作 用的有效方式。

实施例9：用金属螯合剂抑制虱卵孵化：

用两种可用作金属蛋白酶抑制剂的金属螯合剂进行试验，来测定它们对虱卵孵化 的作用。对这些化合物进行标准虱子试验，测定它们的杀卵作用(参见用来测试抑制 剂的方法的实施例5和6)。评价以下金属螯合剂：2，2′-联吡啶和6，6′-二甲基-2，2′-联 吡啶。此研究的结果列于表5和6。

表5.在产卵后以24小时间隔，用2，2′-联吡啶处理后的卵孵化结果。所列结果简称如 下：N(每次平行试验的卵数)，H(孵化成功的卵数)和Ph(部分孵化的卵数)。

  平行试验   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   1   7   0   0   6   0   0   7   0   0   13   0   0   10   0   0   2   8   0   0   14   0   0   7   0   0   9   1   0   10   0   0   3   11   0   0   -   -   -   14   0   0   10   0   0   13   0   0

表6.在产卵后以24小时间隔，用6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶处理后的卯孵化结果。所列 结果简称如下：N(每次平行试验的卵数)，H(孵化成功的卵数)和Ph(部分孵化的卵数)。

  平行试验   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   1   10   0   13   0   0   15   0   0   25   0   0   23   0   0   2   10   0   0   11   0   0   16   0   0   22   0   0   9   0   0   3   11   0   0   6   0   0   10   0   0   18   0   0   -   -   -

这些研究的结果表明6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶和2，2′-联吡啶都显示很强的杀卵活 性，在测试的全部时间完全抑制了虱卵孵化。6，6′-二甲基-2，2′-联吡啶和2，2′-联吡 啶都是非夹层的的金属螯合剂和金属蛋白酶抑制剂。

实施例10：用1，10-菲咯啉处理市售虱子产品的比较试验

对三种主要的市售头虱产品进行标准虱卵孵化试验，评价这些产品的杀卵性能。 这三种市售头虱产品如下：

1.KP-24Nelson Laboratories，活性成分：1％maldison(马拉硫磷)；

2.RIDBayer，活性成分：1％除虫菊酯；

3.NIXPfizer，活性成分：1％氯菊酯。

按照厂商的推荐测试这三种产品。按照厂商推荐用不同产品处理多组卵(24小时 虫龄)适当的时间(5-10分钟)，随后在32℃水中漂洗1-2分钟。还加入一个阳性对照 组(10mM 1，10-菲咯啉)和两个负对照组(未处理和20％甲醇)。暴露于不同产品后，卵 在32℃温水中漂洗，之后在棉纸上吸干，处于32℃，70％RH下孵化。第二组卵(48 小时虫龄)按照前述处理并进行孵化。在产卵后以24小时间隔重复这一方案，至多为 120小时。这种测试抑制剂的方法更密切反映了虱子卵在头部的发育不同阶段的现场 并且观察到对不同阶段的寄生虫的抑制作用。研究结果列于表7。

表7.在产卵后以24小时间隔，对三种市售头虱产品、10mM 1，10-菲咯啉和对照组 处理后的卵孵化结果。所列结果简称如下：N(每次平行试验的卵数)，H(孵化成功的 卵数)和Ph(部分孵化的卵数)。

  NIX-Pfizer   平行试验   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   1   16   12   2   9   7   0   18   3   3   12   8   3   19   12   3   2   10   4   3   6   2   3   10   3   3   15   7   5   18   8   7   3   10   7   2   9   4   3   17   5   7   -   -   -   36   21   5

  RID-Bayer   平行试验   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   1   8   0   3   12   3   4   7   0   0   8   0   0   14   0   1   2   8   2   5   7   0   1   5   1   2   8   0   0   -   -   -   3   5   0   2   10   0   2   6   1   3   11   0   0   -   -   -   KP24KP24   平行试验   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   1   7   7   0   10   10   0   10   1   3   10   0   0   10   0   0   2   6   6   0   10   9   0   0   0   0   7   0   0   8   0   0   3   9   8   0   -   -   -   -   -   -   -   -   -   12   0   1   1，10-菲咯啉(10mM)   平行试验   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   1   13   0   0   5   0   0   7   0   0   10   0   0   9   0   0   2   9   0   0   15   0   0   7   0   0   10   0   0   6   4   0   3   -   -   -   8   0   0   9   0   0   -   -   -   7   1   0   对照20％甲醇)   平行试验   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   1   -   -   -   14   14   0   10   10   0   10   10   0   13   13   0   2   -   -   -   5   4   0   8   8   0   10   9   0   7   7   0   3   -   -   -   -   -   0   9   7   0   4   4   0   10   10   0   对照(未处理)   平行试验   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   1   10   9   0   11   11   0   25   24   0   10   8   0   20   20   0   2   20   18   0   8   7   0   10   10   0   11   10   0   20   18   0   3   -   -   -   8   8   0   -   -   -   10   10   0   -   -   -

三种市售灭虱剂的测试结果表明，它们在虱卯孵化的不同阶段显示不一致的杀卵 活性孵化。而化合物1，10-菲咯啉显示能有效抑制虱卵孵化。

实施例11：其它市售产品的评价

两种主要的市售头虱产品进行标准虱卵孵化试验。这两种市售头虱产品如下：

1.Pronto PlusShampoo Del Laboratories，活性成分：0.33％除虫菊酯；

2.Pronto PlusMousse Shampoo Del Laboratories，活性成分：0.33％除虫菊酯。

按照厂商的推荐测试这两种产品。按照厂商推荐用不同产品处理多组卵(24小时 虫龄)适当的时间(5-10分钟)，随后在32℃水中漂洗1-2分钟。还加入两个负对照组(未 处理和20％乙醇)。暴露于不同产品后，卵在32℃温水中漂洗，之后在棉纸上吸干， 在32℃，70％RH下孵化。第二组卵(48小时虫龄)按照前述处理并进行孵化。在产卵 后以24小时间隔重复这一方案，至多为120小时。这种测试抑制剂的方法更密切反 映了虱子卵在头部的发育不同阶段的现场并且观察到对不同阶段的寄生虫的抑制作 用。研究结果列于表8。

表8.在产卵后以24小时间隔，对两种市售头虱产品和对照组处理后的卵孵化结果。 所列结果简称如下：N(每次平行试验的卵数)，H(孵化成功的卵数)和Ph(部分孵化的 卵数)。

  Pronto Plus Shampoo   平行试验   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时   N   II   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   1   14   10   2   11   9   0   30   27   0   35   30   0   40   38   2   2   20   15   3   21   18   0   19   16   0   42   36   0   38   29   5   3   -   -   -   -   -   -   -   -   -    -   -   -   -   -   -   Pronto Plus Mousse Shampoo   平行试验   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   1   10   8   0   18   15   0   47   31   9   63   8   34   51   7   40   2   15   13   0   10   6   0   30   14   8   29   5   10   50   8   30   3   11   9   0   -   -   -   34   13   17   21   1   15   31   1   17   对照(乙醇)   平行试验   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   1   12   10   0   18   16   0   40   36   1   21   20   0   49   47   0   2   11   9   0   21   18   0   41   37   0   28   26   0   39   36   0   3   11   11   0   13   11   0   75   70   0   29   27   0   36   34   0   对照(未处理)   平行试验   24小时   48小时   72小时   96小时   120小时   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   N   H   Ph   1   10   9   0   27   26   0   61   60   0   50   49   1   48   46   0   -   -   -   -   -   -   -   -    -   -   -   -   -   -   -   -   3   -   -   -   -   -   -   -    -   --   -   -   -   -   -   -

两种市售灭虱剂的测试结果表明，它们在虱卵孵化的不同阶段的杀卵活性很差， 且不一致。

实施例12：评价化合物对小菜蛾(Plutella xylostella)卵孵化的作用

收集数百只在24小时内产下的小菜蛾(Plutella xylostella)卵(Waite品系)。在收集 后3-5小时内用下述不同抑制剂处理卵。

将已经产在细布或石蜡膜(parafilm)上的一批小菜蛾卵在特定抑制剂溶液中浸 2-10秒，用干的棉纸吸去过量溶液。然后将卵块放在25℃下的潮湿的盒子中直到卵 孵化。对照卵如上所述暴露于纯甲醇。在产卵6天后评估不同处理方法及根据对照 确定的卵孵化百分比，结果示于表9。

表9.与对照相比抑制剂对小菜蛾(Plutella xvlostella)卵孵化的杀虫卵作用。

  抑制剂   孵化数   未孵化数   抑制％   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(10mM)   0   79   100   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(1mM)   0   26   100   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(0.1mM)   23   29   0   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(0.01mM)   13   7   0   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(0.00lmM)   11   6   0   1，10-菲咯啉(10mM)   0   45   100   1，10-菲咯啉(1mM)   15   16   0   对照(100％MeOH)   63   92   -

表9表明，金属螯合剂6，6’二甲基-2，2’联吡啶能够以剂量依赖的方式抑制小菜蛾 (Plutella xylostella)的卵孵化，在10和1mM时都具有强杀虫卵作用。此外，金属蛋 白酶抑制剂/金属螯合剂1，10-菲咯啉在10mM时还能够显著抑制这种昆虫的卵孵化。

实施例13：评价化合物对小菜蛾(Plutella xylostella)卵孵化的作用

收集数百只在24小时内产下的小菜蛾(Plutella xylostella)卵(Waite品系)。在收集 后3-5小时内用下述不同抑制剂处理所有的卵。

将已经产在细布或石蜡膜上的一批小菜蛾卵在特定抑制剂溶液中浸2-10秒，用 干的棉纸吸去过量溶液。然后将卵块放在25℃下的潮湿的盒子中直到卯孵化。对照 卵如上所述暴露于纯甲醇或不处理。在产卵6天后评估不同处理方法及根据对照确 定的卵孵化百分比，结果示于表10和11。

表10.与对照(产在布上的卵)相比抑制剂对小菜蛾(Plutella xylostella)卵孵化的杀 虫卵作用。

 抑制剂   孵化数   未孵化数   抑制％  6，6’二甲基-2，2’联吡啶(10mM)   0   53   100  6，6’二甲基-2，2’联吡啶(1mM)   0   23   100  6，6’二甲基-2，2’联吡啶(0.1mM)   49   49   0  6，6’二甲基-2，2’联吡啶(0.01mM)   23   4   12  5，5’-二甲基-2，2’联吡啶(10mM)   0   21   100  5，5’-二甲基-2，2’联吡啶(1mM)   5   22   78  4，4’-二甲基-2，2’联吡啶(10mM)   0   36   100  4，4’-二甲基-2，2’联吡啶(1mM)   0   30   100  对照(未处理)   32   1   -  对照(100％MeOH)   34   1   -

表11.与对照(产在石蜡膜上的卵)相比抑制剂对小菜蛾(plutella xylostella)卵孵化 的杀虫卵作用。

  抑制剂   孵化数   未孵化数   抑制％   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(10mM)   0   106   100   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(1mM)   0   63   100   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(0.1mM)   65   70   7   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(0.01mM)   92   4   0   5，5’-二甲基-2，2’联吡啶(10mM)   0   142   100   5，5’-二甲基-2，2’联吡啶(1mM)   18   151   88   4，4’-二甲基-2，2’联吡啶(10mM)   0   139   100   4，4’-二甲基-2，2’联吡啶(1mM)   10   121   91   对照(未处理)   108   3   -   对照(100％MeOH)   58   7   -

表10和11显示，与对照相比，将小菜蛾(Plutella xylostella)卵暴露于所选联吡啶 基化合物对卵孵化的影响。结果显示6，6’-二甲基-2，2’联吡啶的剂量依赖性作用，在 10和1mM时都有效抑制小菜蛾卵孵化。在0.1和0.01mM时未观察到对卵孵化有影 响。用该化合物进行的实施例12的结果证实了这些结果。此外，5，5’-二甲基-2，2’联 吡啶和4，4’-二甲基-2，2’联吡啶在10和1mM时都能够显著抑制卵孵化。

未观察到产在布上或石蜡膜上的卵之间有显著差别。

实施例14：评价化合物对小菜蛾(Plutella xylostella)卵孵化的作用

收集数百只在24小时内产下的小菜蛾(Plutella xylostella)卵(Waite品系)。在收集 后3-5小时内用下述不同抑制剂处理所有的卵。

将已经产在细布或石蜡膜上的一批小菜蛾卵在特定抑制剂溶液中浸2-10秒，用 干的棉纸吸去过量溶液。然后将卵块放在25℃下的潮湿的盒子中直到卵孵化。对照 卵如上所述暴露于纯甲醇或不处理。在产卵6天后评估不同处理方法及根据对照确 定的卵孵化百分比，结果示于表12。

表12.与对照(仅甲醇)相比抑制剂对小菜蛾(Plutella xylostella)卵孵化的杀虫卵作用。

  抑制剂   孵化数   未孵化数   抑制％   5，5’-二甲基-2，2’联吡啶(10mM)   0   68   100   5，5’-二甲基-2，2’联吡啶(1mM)   1   45   98   5，5’-二甲基-2，2’联吡啶(，0.1mM)   22   16   38   5，5’-二甲基-2，2’联吡啶(0.01mM)   37   3   -   4，4’-二甲基-2，2’联吡啶(10mM)   1   77   99   4，4’-二甲基-2，2’联吡啶(1mM)   0   63   100   4，4’-二甲基-2，2’联吡啶(0.1mM)   33   18   30   4，4’-二甲基-2，2’联吡啶(0.01mM)   29   1   -   对照(100％MeOH)   38   3   -

表12的结果显示，5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶和4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶在10和1mM 时对于抑制小菜蛾卵孵化都高度有效。此外，这两种化合物在0.1mM时都有部分抑 制作用。

实施例15：评价化合物对小菜蛾(Plutella xylostella)卵孵化的作用

收集数百只在24小时内产下的小菜蛾(Plutella xylostella)卵(Waite品系)。在收集 后3-5小时内用下述不同抑制剂处理所有的卵。

将已经产在细布或石蜡膜上的一批小菜蛾卵在特定抑制剂溶液中浸2-10秒，用 干的棉纸吸去过量溶液。然后将卵块放在25℃下的潮湿的盒子中直到卵孵化。对照 卵如上所述暴露于纯甲醇或不处理。在产卵6天后评估不同处理方法及根据对照确 定的卵孵化百分比，结果示于表12。

表13.与对照(仅甲醇)相比抑制剂对小菜蛾(Plutella xylostella)卵孵化的杀虫卵作用。

 抑制剂   孵化数   未孵化数   抑制％  5，5’-二甲基-2，2’联吡啶(1mM)   2   118   98  5，5’-二甲基-2，2’联吡啶(0.1mM)   32   52   58  对照(100％MeOH)   62   7   -

表13的结果显示，5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶在1MM时显著抑制小菜蛾卵的孵化。 此外，该化合物在0.1MM时有部分抑制作用。

实施例16：评价化合物对Helicoverpa armigera卵孵化的作用

收集数百只在24小时内产在细纱布上的Helicoverpa armigera卵 (Tat uraxToowoomba品系)。在收集后3-5小时内用下述不同抑制剂处理所有的卵。

将一批Helicoverpa卵在特定抑制剂溶液中浸2-10秒，用干的棉纸吸去过量溶液。 然后将卵块放在25℃下的潮湿的盒子中直到卵孵化。对照卵如上所述暴露于纯甲醇。 在产卵6天后评估不同处理方法及根据对照确定的卵孵化百分比，结果示于表14。

表14.与对照相比抑制剂对Helicoverpa armigera卵孵化的杀虫卵作用。

  抑制剂   孵化数   未孵化数   抑制％   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(10mM)   7   98   94   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(1mM)   4   140   97   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(0.1mM)   na   na   0   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(0.01mM)   na   na   0   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(0.001mM)   na   na   0   1，10-菲咯啉(10mM)   31   16   44   1，10-菲咯啉(1mM)   na   na   0   对照(100％MeOH)   na   na   0

na表示所有的卵都孵化并孵出新的幼虫。

表14的结果说明，6，6’二甲基-2，2’联吡啶在10和1mM时能显著抑制Helicoverpa armigera卵孵化。在低于该水平时未发现抑制作用。化合物1，10-菲咯啉仅在10mM 时能抑制卵孵化。

实施例17：评价化合物对Helicoverpa armigera卵孵化的作用

收集数百只在24小时内产在细纱布上的Helicoverpa armigera卵 (TaturaxToowoomba品系)。在收集后3-5小时内用下述不同抑制剂处理所有的卵。

将一批Helicoverpa卵在特定抑制剂溶液中浸2-10秒，用干的棉纸吸去过量溶液。 然后将卵块放在25℃下的潮湿的盒子中直到卵孵化。对照卵如上所述暴露于纯甲醇。 在产卵6天后评估不同处理方法及根据对照确定的卵孵化百分比，结果示于表15。

表15.与对照相比抑制剂对Helicoverpa armigera卵孵化的杀虫卵作用。

  抑制剂   孵化数   未孵化数   抑制％   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(10mM)   3   48   94   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(1mM)   2   61   97   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(0.1mM)   70   0   0   5，5’-二甲基-2，2’联吡啶(10mM)   0   42   100   4，4’-二甲基-2，2’联吡啶(10mM)   8   43   84   4，4’-二甲基-2，2’联吡啶(1mM)   23   29   66   对照(100％MeOH)   37   2   -

表15的数据支持之前由实施例4提供的结果，证明6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶在10 和1mM时都能够显著抑制Helicoverpa armigera卵孵化。在0.1mM时未观察到该化 合物抑制卵孵化。此外，该数据表明，5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶和4，4’-二甲基-2，2’-联 吡啶在10mM时都显著抑制卵孵化。此外，还观察到1mM的4，4’-二甲基-2，2’-联吡 啶显著抑制卵孵化。

实施例18：评价2-(2-吡啶基)喹啉对小菜蛾(Plutella xylostella)卵孵化的作用

收集数百只在24小时内产下的小菜蛾(Plutella xylostella)卵(Waite品系)。在收集 后24-48小时内用下述不同抑制剂处理卵。

将已经产在细布上的一批小菜蛾卵在特定抑制剂溶液中浸约2秒钟，用干的棉纸 吸去过量溶液。然后将卵块放在25℃下的潮湿的盒子中直到卵孵化。对照卵如上所 述暴露于无水乙醇。在产卵6天后评估不同处理方法及根据对照确定的卵孵化百分 比。

结果：

表16.与对照相比抑制剂对小菜蛾(plutella xylostella)卵孵化的杀虫卵作用。

  抑制剂   孵化数   未孵化数   抑制％   2-(2-吡啶基)喹啉(10mM)   2   56   96   对照(100％ETOH)   55   14   -

表16表明，金属螯合化合物2-(2-吡啶基)喹啉在10mM时能够抑制小菜蛾(plutella xylostella)卵孵化。

实施例19：评价加入的金属离子对6，6’-二甲基-2-2’-联吡啶对卵孵化的抑制作用 的影响

收集数百只在24小时内产下的小菜蛾(Plutella xylostella)卵(Waite品系)。在收集 后24小时内选择以下试验设计。将一批卵暴露于10mM 6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶或仅 溶剂(甲醇)2秒钟。使所有的卵空气在室温下空气干燥20分钟。然后使卵再暴露于 10、5或1mM的FeSO4，空气干燥，置于24℃的培养箱中并使其孵化6天。此外， 建立10mM 6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶的阳性对照，其中的卵被暴露于该化合物2秒钟， 空气干燥并置于培养箱中。

结果：

表17.与FeSO4对照相比，10mM 6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶对小菜蛾(Plutella xylostella)卵孵化的杀虫卵作用。

  抑制剂   孵化数   未孵化数   抑制％   6，6’二甲基-2，2’联吡啶(+ve)对照   0   44   100   6，6’二甲基-2，2’联吡啶，   然后暴露于MEOH 2秒   3   28   90   6，6’二甲基-2，2’联吡啶，   然后暴露于10mM FeSO42秒   12   19   38   6，6’二甲基-2，2’联吡啶，   然后暴露于5mM FeSO42秒   25   0   0   6，6’二甲基-2，2’联吡啶，   然后暴露于1mM FeSO42秒   33   1   3

表17的结果说明，以FeSO4中Fe的形式加入二价金属离子能够逆转金属螯合剂 6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶的作用。该结果表明，对6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶抑制作用的 逆转是由于Fe代替了这种抑制剂的作用而不是简单的用FeSO4稀释该抑制剂。将卵 暴露于抑制剂之后单独暴露于MEOH仍导致显著抑制卵孵化证明了这种作用。

实施例20：评价加入的金属离子对5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶对卵孵化的抑制作用 的影响

收集数百只在24小时内产下的小菜蛾(Plutella xylostella)卵(Waite品系)。在收集 后24小时内选择以下试验设计。将一批卵暴露于10mM 5，5’二甲基-2，2’-联吡啶或仅 溶剂(甲醇)2秒钟。使所有的卵空气在室温下空气干燥20分钟。然后使卵再暴露于 10、5或1mM的FeSO4，空气干燥，置于24℃的培养箱中并使其孵化6天。此外， 建立10mM 5，5’二甲基-2，2’-联吡啶的阳性对照，其中的卵被暴露于该化合物2秒钟， 空气干燥并置于培养箱中。

结果

表18.与FeSO4对照相比，10mM 5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶对小菜蛾(Plutella xylostella)卵孵化的杀虫卵作用

 抑制剂    孵化数   未孵化数   抑制％ 5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶(+ve)对照    0   38   100 5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶， 然后暴露于MEOH 2秒    16   19   55 5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶， 然后暴露于10mM FeSO42秒    23   2   8 5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶， 然后暴露于5mM FeSO42秒    25   0   0 5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶， 然后暴露于1mM FeSO42秒    39   0   0

表18的结果说明，以FeSO4中Fe的形式加入二价金属离子能够逆转金属螯合剂 5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶的作用。该结果表明，对5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶抑制作用的 逆转是由于Fe代替了这种抑制剂的作用而不是简单的用FeSO4稀释该抑制剂。将卵 暴露于抑制剂之后单独暴露于MEOH仍导致显著抑制卵孵化证明了这种作用。

实施例21：6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶和5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶对绵羊虱(Bovicola ovis)卵孵化的作用。

从被绵羊虱感染的绵羊羊毛中收集其卵。用镊子收集卵并在解剖显微镜的帮助下 将卵放入24孔组织培养平板，一式两份，每份10个卵。然后将卵暴露于单独的甲 醇(溶剂对照)或测试化合物10分钟或1分钟作为未处理的对照，然后将卵从孔中取 出并放入底部含有食物的单独的玻璃试管中。将试管放入含有盐溶液(以保持湿度恒 定为68％)的塑料容器中并将容器维持在32℃。在随后的12天监测卵的孵化并与对 照相比确定孵化％。

表19.6，6’-二甲基-2，2’-联吡啶和5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶对绵羊虱(Bovicola ovis) 卵孵化的作用。

  抑制剂   孵化数   未孵化数   抑制％   10mM 5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶   (暴露10分钟)   Rep 1.0   Rep 2.0   10   10   100   10mM 5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶   (暴露1分钟)   Rep 1.0   Rep 2.0   10   10   100   10mM 6，6’二甲基-2，2’联吡啶   (暴露10分钟)   Rep 1.0   Rep 2.0   10   10   100   10mM 6，6’二甲基-2，2’联吡啶   (暴露10分钟)   Rep 1.0   Rep 2.0   10   10   100   对照(乙醇)(暴露10分钟)   Rep 1.5   Rep 2.5   5   5   -   对照(乙醇)(暴露1分钟)   Rep 1.4   Rep 2.5   6   5   -   对照(未处理)   Rep 1.3   Rep 2.6   7   3   -

表19的结果说明，将绵羊虱卵暴露于10mM的5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶或6，6，- 二甲基-2，2’-联吡啶溶液10或1分钟后，在该试验中可完全抑制这种外寄生虫的卵孵 化。

本领域技术人员应理解，在不偏离广义所述的本发明的精神和范围下，可以对按 具体实施方式所示的本发明进行各种变动和/或修改。因此，认为在此的实施方式是 说明书性的不构成限制。

上面所述的所有出版物被全文参考结合于本文。

本说明书中包含的对文献、作用、材料、设备、制品等的所有讨论仅用于提供本发明的 背景。但是并不认为任何或所有这些物质形成现有技术的一部分或是与本发明相关的领域 的公知常识，就象它们在本申请的各权利要求的优先权日之前在任何国家已存在那样。

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