[0001] 本
申请要求2016年6月1日提交的美国临时
专利申请62/344,247的优先权。
技术领域
[0002] 本申请一般涉及用于元蛋白质组学的组合物和方法，更具体地涉及用于微生物群蛋白质组份分析的组合物和方法。
背景技术
[0003] 人体拥有数万亿个微生物，它们共同构成人类微生物群。越来越多的证据表明微生物群组成与许多
疾病相关，包括
炎症性肠病(IBD)，肥胖，糖尿病，癌症，心脏病，尿石症，过敏等[2]。微生物群是一个高度复杂且极其敏感的系统，已经证明微生物群组合物由于
接触各种化合物而易于改变，包括但不限于
治疗剂，赋形剂，添加剂，
防腐剂，化学品，压
力，运动，食品和饮料，这些化合物可影响健康的维持以及疾病的发展。除了整个微生物群外，还描述了器官和区域特异性微生物群，其中这些微生物的子集形成群体，例如肠，
皮肤，
阴道，
口腔，肾，膀胱，眼睛，
肺和乳房。此外，已经表明，许多这些环境，化学和营养化合物引起的变化有可能引起这些区域的积极变化，以改善微生物群的组成和多样性，而其他患病或不健康的微生物群而引起的负面变化有关。例如，已经证明乳化剂，加工食品的普遍成分，导致肠道微生物群组成的负面变化，引起炎症和疾病，同时显示
益生元增加有益微生物的
水平，增加肠道微生物的健康。但是这些成分的改变将如何影响整体功能，这仍是一个悬而未决的重要问题。
[0004] 最大的微生物群之一存在于胃肠道并构成肠道微生物群[1]。利用
粪便微生物群移植(FMT)治疗复发性艰难梭菌感染[3]，说明肠道微生物群对人类健康的重要性。此外，已经显示，微生物群继续在整个疾病的过程中经历变化，这是最近在IBD中显示出来的，其中，肠道微生物群合物的变化与克罗恩病的疾病严重程度紧紧地相关。显然，微生物群似乎参与多种疾病的发展，进展和消退，并且在某些情况下，可以对其调节以影响疾病结果，使得微生物群在科学和公共卫生社区中引起全球关注。
[0005] 除人类微生物群外，还可以识别和描述许多其他微
生物群落或微生物群。其中最突出的是
土壤微生物群，这是一个复杂的微生物群落，可能因地区，
气候和耕种而异。可以评估土壤微生物群的组成以确定
生物多样性，并且这些微生物在营养物的产生和分解中的后续功能对农业具有广泛的影响。
生物膜是另一个经过充分研究的微生物群，其可能在许多环境和工业环境中具有不同的复杂性，并且可能导致污染或毒性。了解生物膜内微生物的组成和功能对于了解生物膜的
预防和分解非常重要。最后，农业和实验场景中的动物微生物群分别对于食品生产和研究的进步非常重要。农业动物的微生物群可以通过抗生素和
饲料来影响，这些变化具有影响到繁殖，动物健康和随后的食物生产的潜力。此外，最近已经认识到，实验室研究动物的微生物可能对他们的治疗反应产生深远的影响。更深入地了解这些动物的微生物群成和功能可能会改善对药物代谢的理解和治疗反应的微生物群效应。
[0006] 下一代测序(NGS)，如元基因组学和元转录组学，是非常适合于检查微生物群的组成和预测其潜在的功能，但是，它并没有提供关于基因是否被转
化成蛋白质的直接证据。因此这些信息，不提供微生物群的功能变化的数据，需要这样的数据来了解组成的改变如何影响功能，及其是否在生理上产生有意义的方式的影响。相反，元蛋白质组学可以通过直接分析蛋白质表达水平，提供关于微生物的功能活动的宝贵信息，其指示功能[4，5]。与元基因组学形成鲜明对比的元蛋白质组学方法只被应用到对微生物的有限研究。这至少部分是由于与微生物肽/蛋白质的识别和定量相关的困难。最近通过使用大型微生物蛋白质
数据库[6]的
迭代搜索显著改善了肽/蛋白质识别
算法。相反，仍然缺乏用于肽/蛋白质定量的准确方法。大多数当前的元蛋白质组学方法是基于无标记量化(LFQ)，其在单独的样本处理和质谱运行时存在显著变化的缺点，使得数据极难在实验或数据集之间进行比较。通过细胞培养中的
氨基酸(SILAC)和
哺乳动物的稳定同位素标记(SILAM)进行的稳定同位素标记是目前最广泛使用的定量蛋白质组学方法，并提供较低的可变性[7]。在SILAC/SILAM中，一个测试或参考样本中的蛋白质用同位素重氨基酸代谢标记，使得能够在不同样本之间进行定量比较。然而，这种方法在细菌中的应用，尤其是复杂的细菌种群，如微生物，是受到限制的。一个应用这些代谢标记到微生物群的挑战是固有的高的物种多样性，这于哺乳动物细胞中是不存在的。此外，不同的微生物群通常包括需
氧物种和许多厌氧物种，这些物种极难培养以获得足够的标记。这些复杂的种群也几乎不可避免地导致生物合成氨基酸的多样化
代谢能力，这阻碍了重标记氨基酸完全掺合微生物蛋白质中。相反，氮或
碳的完全代谢标记仅适用于单个细菌[8]，和环境微生物群落，如酸性矿山排水生物膜[9]。然而，缺乏用于表征微生物群蛋白质组的应用。
[0007] 因此，需要更好的元蛋白质组学方法来分析微生物。
发明内容
[0008] 第一个广泛的应用方面是一种快速且经济的整个人体微生物群代谢标记策略，被称为稳定同位素标记的微生物群(SILAMi)。应当理解，整个人体微生物群，意味着SILAMi可用于提供取自人微生物群的任何微生物群样本的代谢标记。人微生物群样本，它是指这样的样本，但不限定于，肠道菌群样本，阴道微生物群样本，口腔微生物群样本，表皮微生物群样本，阴道微生物群样本，膀胱微生物群样本，肾微生物群样本，肺微生物群样本，眼部微生物群样本，乳腺微生物群样本，阴茎微生物群样本，微生物群粘膜样本等。技术人员也将容易理解SILAMi也可以应用于源自动物样本的微生物群，其中该动物例如是哺乳动物，
鸟类，爬行动物等。
[0009]
申请人已经发现，对于具有大的微生物群的给定微生物群样本，可以使用同位素标记标准品。在申请人的发现之前，人们认为不能同时标记多样的微生物群，并且在掺合标记期间微生物群将迅速变化，从而不能获得代表所
采样的原始微生物群的可靠标准品。然而，申请人已经发现，在同位素掺合过程之后实现的同位素标记的标准品实际上代表了原始样本的微生物群的主要群体和及其蛋白质的代表。微生物群的这种同位素标记称为SILAMi。
[0010] 因此，SILAMi是实现成功标记大型微生物群(微生物群)的方法，例如在人或动物目标对象中发现的微生物群。获得这样一个标准品的困难在于例如在所需的微生物群样本中发现的一些微生物物种的脆弱性和低丰度，例如对环境变化或暴露于氧气敏感(例如，这些微生物中的一些在厌氧条件下生长)。此外，并非所有这些微生物都具有相同的细胞周期或生命周期，一些微生物需要更长的时间来生长和掺合同位素。然而，在培养中生长和掺合同位素所花费的时间越长，在微生物群样本中发现的某些物种将死亡或不成比例地增殖的
风险就越大，将不能忠实地描述样本中发现的微生物群。SILAMi已经克服了这些先前的问题并成功地为来自微生物群样本的给定微生物提供了同位素标记的标准品，其中样本可以取自，例如，人类，动物，土壤，
植物，水或任何其他具有大量微生物的来源。
[0011] 此外，申请人已经发现使用同位素标记的标准品，例如使用SILAMi实现的标准品，允许研究给定微生物群样本中的大量微生物。该标准品允许确定功能和组成，包括确定微生物群样本的功能和组成的变化。此外，标准品提供了在进行微生物群样本的元蛋白质组分析时减少变异性的方法。例如，这可以通过向微生物群样本中添加已知量的标准品物(具有已知比率并测量样本的重量与光照比，同时将比率与理论知识结果进行比较)来实现。
[0012] 在一些实例中，对目标对象，例如人或动物目标对象的微生物群的分析可以提供疾病或折磨目标对象的其他病症的指示，其中这些病症对目标对象的微生物群，在该目标对象的不同
位置(例如目标对象的器官)具有测量的影响。同位素标记的标准品和微生物群样本之间的比较可以提供例如治疗的有效性，治疗的性质，包括对疾病或疾病的诊断和治疗反应，目标对象的体重增加或丧失的可能性的指示等。
[0013] 另一个广泛的方面是人类微生物群标记蛋白质标准品具有标记的蛋白质代表来自如本文所述的人体微生物群的元蛋白质组。在一些实例中，所述标记的蛋白具有至少约50％，优选90％，更优选至少大约95％平均重同位素富集率。
[0014] 在另一个实施方案中，提供了人肠道标记蛋白质的微生物群标准品，其可以具有代表来自肠道微生物群的元蛋白质组的标记蛋白质。在一些实施方案中，所述标记的蛋白质可具有至少约90％，优选至少约95％的平均重同位素富集率。
[0015] 在另一个实施方案中，标记蛋白质的微生物群标准品可以是微生物群样本中存在的微生物的至少约90％，优选至少95％的分类群特异性。优选地，标记的蛋白质对于微生物群样本中存在的100％的生物界是分类群特异性的。优选地，标记的蛋白质对于微生物群样本中的95％，优选至少100％的生物
门也是分类群特异性的。优选地，标记的蛋白质对于微生物群样本中的90％，优选至少95％的生物属也是分类群特异性的。优选地，标记的蛋白质对微生物群样本中存在的至少约90％，优选至少95％的生物种也是分类群特异性的。
[0016] 在另一个实施方案中，标记蛋白质的微生物群标准品可以是针对肠道微生物群中存在的微生物的至少约90％，优选至少95％的分类群特异性。标记的蛋白质对于肠道微生物群中存在的100％的生物界是分类群特异性的。标记的蛋白质对于肠道微生物群中的95％，优选至少100％的生物门也是分类群特异性的。标记的蛋白质对于肠道微生物群中的
90％，优选至少95％的生物属也是分类群特异性的。标记的蛋白质对肠道微生物群中的至少约70％，优选至少95％的生物种也是分类群特异性的。
[0017] 在另一个实施方案中，标记蛋白质的微生物群标准品可以是微生物群样本中存在的微生物的至少约90％，优选至少95％的分类群特异性，包括但不限于来自阴道，口腔，皮肤，膀胱，肾脏，肺，眼睛和乳房。标记的蛋白质对于微生物群样本中存在的100％的生物界是分类群特异性的。标记的蛋白质对于微生物群样本中的95％，优选至少100％的生物门也是分类群特异性的。标记的蛋白质对于微生物群样本中的90％，优选至少95％的生物属也是分类群特异性的。标记的蛋白质对微生物群样本中存在的至少约90％，优选至少95％的生物种也是分类群特异性的。
[0018] 对于示例性的肠道微生物群样本，域可以是细菌，真核生物和古细菌，该门类是，但不限于，拟杆菌门，
变形菌门，疣微菌门，梭桿菌门，螺旋菌门，奇古菌门，厚壁菌门，放线菌门，子囊菌门，担子菌门，广古菌门，顶复门，
节肢动物门，脊索动物门，
线虫动物门，链型植物门，生物属是表1中列出的物种，生物种是表中列出的物种2。表1：可以在示例性肠道微生物群样本中发现的一组示例性的生物属。
表2：可以在示例性肠道微生物群样本中发现的示例性生物种。
[0019] 在另一个方面中，标记的蛋白质标准品可以具有同位素(或多个)标记的蛋白，并且其中所述同位素(或多个同位素)可以是稳定的或
放射性同位素。同位素可以选自，例如，13C，14C，15N，32S，35S，32P和氘，以及它们的组合。
[0020] 在另一方面，提供了一种用于获得标记蛋白质的微生物群标准品的方法，如上所述，包括：从个体获得微生物群样本；将所述样本暴露于同位素富集生长培养基(即富集的培养基，例如富含同位素的培养基，在本文中也定义为富含同位素的培养基质)；和以一个足够长的时间培养所述暴露的样本，以获得富集的预定水平。
[0021] 在另一方面，提供了一种用于获得标记蛋白质的微生物群标准品的方法，如上所述，包括：从个体获得微生物群样本，包括但不限于肠，阴道，口腔，皮肤，膀胱，肾，肺，眼睛或乳房微生物群；将所述样本暴露于同位素富集生长培养基；和以一个足够长的时间培养所述暴露的样本，以获得富集的预定水平。
[0022] 在另一个方面，提供了一种用于测量微生物群样本中一种或多种蛋白质的量的方法，包括：从所述微生物群样本获得蛋白质，将蛋白质提取物与蛋白质标准品掺合，如上所述，并获得标准品中的标记/未标记的蛋白质比，和微生物群样本中的一种或多种细菌(或视情况而定，也可以使其它形式的微生物)的标记/未标记的蛋白质比。
[0023] 在另一个方面，还提供了一种用于测量肠道微生物群样本中一种或多种蛋白质的量的方法，包括：从所述微生物群样本获得蛋白质，将蛋白质提取物与蛋白质标准品掺合，如上所述，并获得标准品中的标记/未标记的蛋白质比，和肠道微生物群样本中的一种或多种细菌的标记/未标记的蛋白质比。
[0024] 在另一个方面，还提供了一种用于测量微生物群样本中一种或多种蛋白质的量的方法，包括：从所述微生物群样本获得蛋白质，包括但不限于阴道，口腔，皮肤，膀胱，肾，肺，眼睛或膀胱微生物群，将蛋白质提取物与蛋白质标准品掺合，如上所述，并获得标准品中的标记/未标记的蛋白质比，和微生物群样本中的一种或多种细菌的标记/未标记的蛋白质比。
[0025] 用于微生物群测量样本中一种或多种蛋白的量的方法，可进一步包括获得所述微生物群样本的无标记定量(LFQ)。SILAMi和LFQ方法可以被组合以提高样本中蛋白质测定的精确度。该方法还可涉及进行气相色谱/质谱分析。在一些实施方案中，该方法可涉及进行质谱分析。
[0026] 在一些实施方案中，用于测量肠道微生物群样本中一种或多种蛋白质的量的方法可以进一步包括获得肠道微生物群样本的无标记定量(LFQ)。SILAMi和LFQ方法可以结合使用，以提高样本中蛋白质测量的准确性。
[0027] 用于测量微生物群样本中一种或多种蛋白质的量的方法，可以来自但不限于：阴道，口腔，皮肤，膀胱，肾，肺，眼，或膀胱微生物群，其包括获得微生物群样本的无标记定量(LFQ)。SILAMi和LFQ方法可以结合使用，以提高样本中蛋白质测量的准确性。
[0028] 在又一个
实施例中，提供了一种用于诊断疾病的方法，例如但不限于肠疾病(例如IBD)，其包括测量来自患者的微生物群样本中一种或多种蛋白质的量(其中使用如关于测量微生物群样本中的一种或多种蛋白质的量的方法所述的标准品进行测量)，并且其中与正常值的偏差指示了疾病。在该方法中在一个或多个时间点进行测量，并进行比较，在预定的时间在个体的生命或来自个体健康的预定状态下获得的优选的对照样本。
[0029] 还提供了一种用于治疗患者的疾病的方法，其涉及评估如上所述的患者的微生物群，来诊断疾病和根据诊断以治疗患者。
[0030] 在另一个方面，提供了一种用于确定患有疾病的患者的治疗反应的方法，包括测量来自患者的微生物群样本中的一种或多种蛋白质，并且其中远离患病的状态和/或朝向正常值的方向指示了有利的治疗反应。该方法中在一个或多个时间点进行测量，并进行比较，在预定的时间在个体的生命或来自个体健康或疾病的预定状态下获得的优选的对照样本。
[0031] 在另一个方面，提供了一种用于确定患有疾病的患者的疾病缓解的方法，包括测量来自患者的微生物群样本中的一种或多种蛋白质，并且其中正常水平指示不存在先前存在的疾病。该方法中在一个或多个时间点进行测量，并进行比较，在预定的时间在个体的生命或来自个体健康或疾病的预定状态下获得的优选的对照样本。
[0032] 另一方面，提供了一种筛选异
生物质对人微生物群的影响的方法，其包含将微生物群暴露于一种或多种异生物质，和如上所述测量一种或多种蛋白的量。
[0033] 另一方面，提供了一种筛选异生物质对人微生物群的影响的方法，包括但不限于肠，阴道，口腔，皮肤，膀胱，肾，肺，眼睛或乳房微生物群，其包含将微生物群暴露于一种或多种异生物质，和如上所述测量一种或多种蛋白的量。
[0034] 另一方面，提供了一种筛选异生物质对人肠道微生物群的影响的方法，其包含将微生物群暴露于一种或多种异生物质，包括但不限于化学物质，毒素，环境毒素和毒物，和如上所述测量一种或多种蛋白的量。
[0035] 从异生物质效应的筛选中，可以基于蛋白质测量产生该患者的概况。该概况可以整合到诊断或
预后方法中。
[0036] 在进一步的方面，提供了一种方法，用于筛选对人微生物群的治疗剂的效果，包括但不限于免疫治疗，抗生素，关卡
抑制剂，化疗药，抗抑郁药，抗
癫痫，止吐剂，止痛剂，抗病毒剂，
镇静药，抗糖尿病药，抗
精神病药和抗凝血剂，包括将微生物群暴露于一种或多种药物并测量如上所述的一种或多种蛋白质的量。
[0037] 在另一方面，提供了使用本文公开的RapidAIM和/或SILAMi技术筛选治疗剂对人微生物群的影响的方法，包括但不限于治疗或
抗体，以用于PD-1/PDCD1/CD279；PD-L1/CD274；PD-L2/PDCD1LG2；CTLA-4/CD152；CD80/B7/B7-1；CD86；TIM-3/HAVCR2；半乳凝素9/GAL9/LGALS9；TIGIT；CD155/PVR；LAG-3；VISTA/C10orf54；B7-H3/CD276；B7-H4/VTCN1；BTLA/CD272；HVEM/TR2/TNFRSF14；A2AR；CD28；CD80/B7/B7-1；CD86；ICOS/CD278；CD275/ICOSLG/B7RP1；CD40L/CD154；CD40；CD137/4-1BB；CD137L；CD27；CD70/CD27L；OX40/CD134/TNFRSF4；OX40L/TNFSF4；GITR；GITRL；SIRPα；CD47，包括将微生物群暴露于一种或多种药物并测量如上所述的一种或多种蛋白质的量。
[0038] 在进一步的方面，提供了一种方法，用于筛选对人微生物群的食物的效果，包括将微生物群暴露于一种或多种食物并测量如上所述的一种或多种蛋白质的量。
[0039] 在进一步的方面，提供了一种方法，用于筛选对人微生物群的食品成分的效果，包括但不限于
食品添加剂，氨基酸，
调味剂，染料，乳化剂，
甜味剂，水胶体和防腐剂，包括将微生物群暴露于一种或多种成分并测量如上所述的一种或多种蛋白质的量。
[0040] 在进一步的方面，提供了一种用于筛选对人微生物群的饮料的效果的方法，包括但不限于苏打饮料，运动饮料，婴儿配方，
牛奶，酒，果汁，饮用酸奶和
发酵茶，包括将微生物群暴露于一种或多种饮料并测量如上所述的一种或多种蛋白质的量。
[0041] 在另一个方面，提供了一种用于筛选对人微生物群的
包装组件的效果的方法，包括但不限于涂料和塑料，包括将微生物群暴露于一种或多种包装组件并测量如上所述的一种或多种蛋白质的量。
[0042] 在另一个方面，提供了一种方法，用于筛选
化妆品和化妆品成分对人微生物群的效果，包括但不限于赋形剂，天然和合成的颜料，
增稠剂，和乳化剂，包括微生物群暴露于一种或更多化妆品或化妆品组分并测量如上所述的一种或多种蛋白质的量。
[0043] 在另一个方面，提供了一种方法，用于筛选消费类产品对人微生物群的影响，包括但不限于婴幼儿产品，家用清洁剂，洗剂，洗发水和香料，包括微生物群暴露于一个或多个消费类产品并测量如上所述的一种或多种蛋白质的量。
[0044] 在另一个方面，提供了一种方法用于筛选的消费者健康产品对人微生物群的影响，包括但不限于补充剂，维生素，氨基酸，和
植物提取物，包括微生物群暴露于一个或多个消费者健康产品和测量如上所述的一种或多种蛋白质的量
[0045] 在另一个方面，提供了一种快速和经济的方法用于代谢标记土壤的微生物群。如上所述，获得土壤微生物群标记蛋白质标准品的方法，包括获得土壤微生物群样本；将所述样本暴露于同位素富集培养基中；将所述暴露的样本培养一段足以获得预定浓度水平的时间。
[0046] 另一个方面是用于测量土壤的微生物群样本中的一种或多种蛋白质的量的方法，其包括：从所述微生物群样本获得蛋白质提取物，将蛋白质提取物与蛋白质标准品掺合，如上所述，并获得标准品中的标记/未标记的蛋白质比，和微生物群样本中的一种或多种细菌的标记/未标记的蛋白质比。
[0047] 在另一个方面，提供了一种方法，用于在土壤的微生物群筛选异生物质的效果，涉及微生物群暴露于一种或多种异生物质，包括但不限于
杀虫剂，毒素，氨基酸，和
硝酸盐，以及然后测量一种或多种蛋白质的量。
[0048] 在另一个方面，提供了一种快速和经济的方法用于动物微生物群的代谢标记，其中所述动物的微生物群可以来源于动物微生物群样本，诸如牛，猪，鸡，骆驼，
绵羊，山羊，兔子，鼠等。
[0049] 在进一步的方面，提供了一种方法，用于获得动物标记蛋白质的微生物群标准品，如上所述，涉及获得动物微生物群样本，如牛，猪，鸡，骆驼，绵羊，山羊，兔子，鼠等；将所述样本暴露于同位素富集培养基中；将所述暴露的样本培养一段足以获得预定浓度水平的时间。
[0050] 在又一个方面，提供了一种用于诊断疾病的方法，包括测量动物微生物群样本中的一种或多种蛋白质的量，包括但不限于牛，猪，鸡，骆驼，绵羊，山羊，兔，和鼠，其中与正常值的偏差表示疾病。在该方法的一个方面，在一个或多个时间点进行测量，并且与在动物的生命中的预定时间或在动物的预定
健康状态下任选地获得的对照样本进行比较。
[0051] 在另一个方面，提供了一种筛选异生物质对动物微生物群的影响的方法，包括但不限于牛，猪，鸡，骆驼，绵羊，山羊，兔，和鼠；包括将微生物群暴露于一种或多种异生物质，包括但不限于饲料，氨基酸，补充剂，杀虫剂和毒素，和测量一种或多种蛋白质的量。
[0052] 在一个方面，提供了一种快速和经济的方法用于生物膜微生物群的代谢标记。筛选异生物质对生物膜微生物群的影响的方法；包括将微生物群暴露于一种或多种异生物质，包括但不限于化学品，杀虫剂，毒素和肥皂，以及测量一种或多种蛋白质的量。
[0053] 在另一个方面中，提供了从工业生产设备用于微生物群的代谢标记的快速且经济的策略。
[0054] 另一个广泛的方面是标记微生物群样本的方法，其包括从一个给定的来源获得的微生物群样本。该方法涉及暴露微生物群样本到富集培养基，并培养所述微生物群样本，以获得经标记的蛋白质组的微生物群样本。在一些实施方案中，当最初从给定来源获得时，标记的微生物群样本可以是对第一微生物群样本中存在分类群特异的分类群。
[0055] 在一些实施方案中，富集的介质可以是富含同位素的培养基，其中所述的蛋白质组的微生物群样本可以是同位素标记的。然而，标记富集培养基可以提供除同位素之外的标记。
[0056] 另一个广泛的方面是通过如本文定义的获得被标记的微生物群样本的方法，其中，执行获得的标记蛋白质的微生物群标准品具有：来自所选择的微生物群的蛋白质组的标记的蛋白质代表。
[0057] 另一个广泛方面是一种用于微生物群样本的蛋白质的标记方法，其包括提供一个从给定来源获得的第一微生物群样本；将第一微生物群样本暴露于富集培养基中；在富集的培养基中培养暴露的第一微生物群样本以获得标记的微生物群样本，其中标记的微生物群样本的标记的元蛋白质组对于当最初从给定来源获得时存在于第一微生物群样本中的分类群具有分类特异性。在一些实施方案中，该方法可以进一步包括通过对所述标记的微生物群样本进行元蛋白质组分析来表征所述标记的微生物群样本。在一些实施方案中，所述标记的微生物群样本可以是最初从给定来源获得的第一微生物群样本中存在的预定比例的微生物群的特异分类群。在一些实施方案中，富集培养基可以是富含同位素的培养基。
[0058] 在一些实施方案中，标记的微生物群样本是当最初从给定来源获得时对第一微生物群样本中存在的预定比例的微生物群的特异分类群。这意味着，按照预先确定的比例，某些微生物类群特别寻求在标记样本的标签上进行标记。例如，用户可能正在搜索与给定疾病相关的特定细菌物种(例如，在某些肠道疾病的情况下为极小奇异菌)。在该实施例中，预定比例将是或将包括已知相对应于该疾病的细菌物种。此外，当给予患者特定化合物(例如药物)或患者对给定的诊断治疗有反应时，可知已知某些微生物群呈阳性或阴性反应。在这些实施例中，预定的群体可以是或可以包括那些
反应性微生物群或分类群。
[0059] 在一些实施方案中，该方法可以包括通过执行元蛋白质组分析所述标记的微生物群样本来表征标记的微生物群样本。暴露的第一微生物群样本的培养可持续一段时间以获得代表至少70％的元蛋白质组的标记蛋白质的平均富集水平，并且对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中存在的预定比例的微生物群具有分类特异性。
[0060] 暴露的第一微生物群样本的培养可以是一段时间，以获得所述标记的蛋白质代表的至少90％的元蛋白质组的富集平均水平，并对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中存在的预定比例的微生物群具有分类特异性。暴露的第一微生物群样本的培养可以是一段时间，以获得所述标记的蛋白质代表的至少95％的元蛋白质组的富集平均水平，并对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中存在的预定比例的微生物群具有分类特异性。暴露的第一微生物群样本的培养可持续一段时间以获得代表暴露的第一微生物群样本的元蛋白质组的标记蛋白质的预定平均富集水平，并且对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中的至少50％的微生物群具有分类特异性。暴露的第一微生物群样本的培养可持续一段时间以获得代表暴露的第一微生物群样本的元蛋白质组的标记蛋白质的预定平均富集水平，并且对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中的至少90％的微生物群具有分类特异性。暴露的第一微生物群样本的培养可持续一段时间以获得代表暴露的第一微生物群样本的元蛋白质组的标记蛋白质的预定平均富集水平，并且对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中的至少90％的微生物分类门具有分类特异性。暴露的第一微生物群样本的培养可持续一段时间以获得代表暴露的第一微生物群样本的元蛋白质组的标记蛋白质的预定平均富集水平，并且对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中的至少90％的微生物分类属具有分类特异性。暴露的第一微生物群样本的培养可持续一段时间以获得代表暴露的第一微生物群样本的元蛋白质组的标记蛋白质的预定平均富集水平，并且对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中的至少90％的微生物分类物种具有分类特异性。
[0061] 在一些实施方案中，第一微生物群样本暴露其中的富含同位素的培养基，可以含有同位素从13C，14C，15N，32S，35S，32P和氘，和它们的组合中选择。微生物群样本暴露其中的含有同位素的富集培养基可包括同位素15N。
[0062] 在一些实施方案中，所述第一微生物群样本可以从人目标对象获得。在其他实施方案中，提供的第一微生物群样本可以从动物目标对象获得。
[0063] 提供的第一微生物群样本可提供一种类型的微生物群样本，其中所述微生物群样本类型可以是肠道微生物群样本，表皮微生物群样本，阴道微生物群样本，口腔微生物群样本，肺微生物群样本，粘膜微生物群样本，膀胱微生物群样本，肾脏微生物群样本，眼微生物群样本，阴茎微生物群样本，或乳房微生物群样本。
[0064] 另一个广泛的方面可以是对第二微生物群样本进行组份分析的方法，其涉及使用标记的微生物群样本，通过执行如本文所述的方法得到这样的样本，作为标记的标准品来执行第二微生物群样本的组份分析，其中由于使用标记的标准品而增强了组份分析。
[0065] 组份分析可以在具有与所述第一微生物群样本相同的微生物群样本类型的第二微生物群样本中进行。该方法可以包括，在使用标记标准品进行第二微生物群样本的组份分析之前，提供从与用于获得标记标准品的微生物群样本相同的来源获得的第二微生物群样本。使用标记的微生物群样本作为标记的标准品来执行组份分析的第二微生物群样本可以包括进行元蛋白质组分析，并且元蛋白质组分析可以用于测量第二微生物群样本的一种或多种蛋白的量。元蛋白质组分析可以包括从第二微生物群样本获得蛋白提取物，将蛋白质提取物与蛋白质标准品掺合；和并获得标记标准品中的标记/未标记的蛋白质比，和第二微生物群样本中的一种或多种蛋白质的标记/未标记的蛋白质比。元蛋白质组分析还可涉及获得第二微生物群样本的无标记定量(LFQ)。使用标记的微生物群样本作为标记的标准品来执行组份分析的第二微生物群样本可以包括进行元基因组分析。在一些实施方案中，元基因组分析可涉及基于16S的测序。元基因组分析可能涉及鸟枪法测序。
[0066] 可以执行组份分析，以达到目标对象的疾病诊断，评估目标对象对治疗的反应，评估目标对象对治疗的症状缓解，筛选异生物质对目标对象微生物群的影响，筛选化合物对目标对象微生物群的影响，其中所述化合物是食物，药物，化学物质，治疗剂，毒素，毒物，饮料，食品添加剂，化妆品，化妆品成分，
包装材料，杀虫剂，
除草剂，消费品中的一种，和/或筛选微生物群以识别目标对象对理疗或治疗的反应性。
[0067] 可以执行所述的组份分析，以实现筛选异生物质对目标对象微生物的影响，第二微生物群样本可以从目标对象获得，可以在所述目标对象接触一种或多种异生物质之后执行组份分析。可以执行所述的组份分析，以实现筛选化合物对目标对象微生物的影响，第二微生物群样本可以从目标对象获得，可以在所述目标对象接触一种或多种化合物之后执行组份分析。可以基于组份分析生成目标对象的概况。概况可以被集成到诊断或预后的方法中。可以执行组份分析以实现对目标对象的疾病诊断，其中使用标记的微生物群样本作为标记的标准品来执行组份分析，还可以包括测量所述第二微生物群样本中的一种或多种蛋白质的量，并且其中与正常值的偏差表示疾病。可以在一个或多个时间点采集微生物群样本，且在一个或多个时间点进行元蛋白质组分析，并且对该时间点微生物群样本进行的元蛋白质组分析之后，测量其中的一种或多种蛋白质，并可以与对照样本进行比较。对照样本可以是取自预定健康状态下的目标对象的标准品对照样本，和/或在目标对象的生命中的预定时间获得的对照样本。另一个广泛的方面是用于治疗患有疾病的患者的方法，包括评估患者的微生物群以诊断疾病，并根据诊断对患者进行治疗。
[0068] 另一个广泛方面是一种用于样本的元蛋白质组分析的多种微生物群样本的高通量筛选的方法。该方法需要培养多个微生物群样本，其中多个微生物群样本的每个样本在多孔容器的孔中培养。该方法包括洗涤多个微生物群培养物样本的细胞，用蛋白酶抑制剂重悬浮在裂解缓冲液中的微生物群培养物样本，裂解多个微生物群培养物样本的细胞，稀释多个微生物群培养物样本，并消化在微生物群培养样本中的蛋白质。该方法通过使用给定目标对象类型的微生物基因目录和迭代数据库搜索策略，添加对多个微生物群样本进行同时的元蛋白质组识别和定量。
[0069] 在一些实施方案中，一个给定的目标对象类型的微生物基因目录是人的微生物基因目录。在一些实施方案中，给定目标对象类型的微生物基因目录可以是动物的微生物基因目录。
[0070] 在一些实施方案中，在消化微生物群培养物样本中的蛋白质之前，该方法可涉及将微生物群培养物样本与对应于给定微生物群样本的同位素标记的标准品进行掺合。在一些实施方案中，在消化之前，该方法可以包括减少和烷基化微生物群培养物样本中包含的蛋白质中的半胱氨酸。掺合步骤可以包括添加足够的同位素标记的标准品，以使其蛋白质与微生物群培养物样本中包含的蛋白质达到1∶1的
质量比。
[0071] 在一些实施方案中，多孔容器是多孔板。
[0072] 在一些实施方案中，该方法可以包括评估所述多个微生物群样本的元蛋白质组识别和定量的结果，对目标对象进行疾病诊断，评估目标对象的治疗响应，评估目标对象接受治疗后的缓解情况，筛选对目标对象的微生物群的异生物质的反应，筛选化合物对目标对象的微生物群的影响，其中该化合物是食物，药物，化学物质，治疗剂，毒素，毒物，饮料，食品添加剂，化妆品，化妆品成分，包装材料，杀虫剂，除草剂，消费品之一，和/或筛选微生物群以识别目标对象对理疗或治疗的反应性。
[0073] 另一个广泛方面是一种用于样本的元组学分析的多种微生物群样本的高通量筛选的方法，包括提供在培养液中的多个微生物群样本。该方法还涉及使用元组学技术进行预筛选，以识别微生物群样本的微生物群的变化，以选择表现出预定变化的微生物群，并分析所选择的微生物群以表征变化。提供的微生物群样本可以在微孔容器中培养。提供的微生物群样本可以在微孔板中培养。
[0074] 在一些实施例中，分析可涉及使用给定的目标对象类型的微生物基因目录和迭代数据库搜索策略。分析可涉及进行与元基因组分析相结合的元蛋白质组分析。给定目标对象类型的微生物基因目录可以是人的微生物基因目录。给定目标对象类型的微生物基因目录可以是动物的微生物基因目录。
[0075] 在一些实施方案中，该方法可以包括，所述提供之后，将多个微生物群培养物样本与对应于给定微生物群样本的同位素标记的标准品进行掺合。掺合步骤可以包括添加足够的同位素标记的标准品，以使其蛋白质与多个微生物群培养物样本中包含的蛋白质达到1∶1的质量比。使用元组学技术进行预筛选可涉及进行元蛋白质组学分析。
[0076] 该方法可以包括评估对所选择的微生物群的分析来执行目标对象疾病的诊断的结果；评估目标对象的治疗反应；评估接受治疗的目标对象的缓解情况；筛选目标对象微生物群对异生物质的反应；筛选化合物对目标对象微生物群的影响，其中所述化合物是食物，药物，化学物质，治疗剂，毒素，毒物，饮料，食品添加剂，化妆品，化妆品成分，包装材料，杀虫剂，除草剂，消费品中的一种，和/或筛选微生物群以识别目标对象对理疗或治疗的反应性。
[0077] 另一方面是用于同位素标记微生物群样本的蛋白质的方法，包括：提供从给定来源获得的第一微生物群样本；
将所述第一微生物群样本暴露于富含同位素的培养基中；和
在所述富含同位素的培养基中培养所述暴露的第一微生物群样本，以获得同位素标记的微生物群样本，其中，所述同位素标记的微生物群样本的所述同位素标记的元蛋白质组是最初从所给定的来源获得的第一微生物群样本所携带的分类群的特异分类群。
附图的简要说明
[0078] 本发明将通过参考附图，以下详细描述来更好地理解本发明的实施例，其中：
[0079] 图1是示意图的示例性的标记方法，包括用于定量的元蛋白质组的人类菌群的同位素15N代谢标记。(A)微生物群的稳定同位素标记(SILAMi)的简要流程，和基于SILAMi定量15
元蛋白质组方法，可应用于任何人的微生物群样本。(B)识别的肠道微生物肽的 N同位素富集。通过三个技术重复分别标记粘膜-腔界面抽吸样本或来自五个不同个体的
浆液态的粪便样本。显示了每个个体微生物群的所有识别肽的平均15N富集率。应当理解，即使使用粘膜-腔界面抽吸样本或粪便样本(浆液)作为微生物群样本，也可以使用任何肠道微生物群样本进行以下方法。此外，技术人员将理解，当执行以下方法时，可以使用从人或动物的任何微生物群样本。
[0080] 图2描述了基于SILAMi的元蛋白质组的定量
精度。(A)
密度图，显示具有不同L/H掺合比(1∶1，1.25∶1，2∶1和5∶1)的样本中定量蛋白质组的计算L/H比。散点图显示计算的L/H蛋白质比率(中位数)和掺合比率之间的相关性。皮尔逊的r值被示出；(B)密度图，显示与具有1∶1掺合比的样本相比的倍数变化的分布。Log2转化的L/H比率或倍数变化用于产生带宽为0.2的密度图。虚线表示中值。括号中显示了与中位数相差两倍的蛋白质百分比。
[0081] 图3示出了基于SILAMi定量元蛋白质组用于微生物群研究的例子，和使用这种技术用于筛选化学品和/或化合物一段时间后对微生物群的蛋白表达的效果。(A)FOS介导的元蛋白质组变化的主成分的分析得分图。(B)蛋白质EF-Tu的定量肽的代表性总离子流(TIC)。同时显示了重离子(红色)和轻离子(蓝色)。(C)246微生物蛋白质的热图，其在体外培养期间在单糖补充时显著改变。列和行聚类都基于欧几里德距离。蓝色方形，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)；蓝色圆圈，
葡萄糖；黄色圆圈，半乳糖；绿色圆圈，甘露糖；红三
角，岩藻糖；C，控制。(D)参与细菌岩藻糖利用途径的定量蛋白质。平均值±SD显示在条形图中。DHAP，
磷酸二羟丙
酮；FucP，L-岩藻糖：H+同向转运酶；FucM，L-岩藻糖变位酶；FucI，L-岩藻糖异构酶；FucA，L-富
马酸-1-磷酸
醛缩酶；FucK，L-墨角藻糖激酶；FucO，L-1，2-丙二醇氧化还原酶或乳醛还原酶。将理解的是，虽然微生物群样本与单糖进行处理，任何化合物可以在该方法中用于处理该微生物群样本，并评定了微生物群的蛋白质表达的后续影响。
[0082] 图4是示出了代谢标记期间五个人肠微生物群样本的每个传代的14N和15N肽识别代表。显示了识别的独特肽序列的平均值和标准品误差。
[0083] 图5示出了在初始接种物(传代0)的微生物群的组合物，并且在门和属级别的SILAMi。使用元蛋白质组学进行分类学分析。对于元蛋白质组分析，如果它们具有≥2个检测到的独特肽序列，则认为门(A)和属(B)存在。橙色表示仅在传代0中存在分类群，而紫色表示在传代0和在SILAMi中都存在分类群。
[0084] 图6表示由果糖低聚糖(FOS)处理改变了187个识别的蛋白质组的热图。完整的蛋白质名称列于表3中；指出了一些感兴趣的蛋白质。基于Perseus中的欧几里德距离生成行的聚类。应当理解，尽管该实施例证明了用FOS处理的变化，但是使用本文所述的方法用任何化合物处理后，微生物群蛋白质变化可以产生变化的热图。
[0085] 图7示出了单糖对人类微生物群样本中的N-乙酰葡糖胺降解相关蛋白的相对丰度的影响。显示Log2转化的L/H比率并表示为平均值±SD。使用双样本t检验来比较未处理对照组(n＝3)和处理样本(n＝3)之间的差异。＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001。
[0086] 图8示出了一个示例性RapidAIM的工作流程。个体微生物群快速分析(RapidAIM)通过快速通过元蛋白质组学，以快速筛选和深入的元蛋白质组学/元基因组学机制解释。工作流包括高性能，易于使用的
软件平台，以快速的识别阳性反应，并提供微生物群的变化的功能性观察。
[0087] 图9示出示例性的基于96孔培养和元蛋白质组试验工作流程的RapidAIM测定，其可用于评估任何组微生物群样本，包括来自多个个体的，在多孔形式中。简而言之，在96孔中培养的微生物群样本用PBS洗涤，并重悬于尿素裂解缓冲液中。然后用多通道
超声波仪对样本进行超声处理以进行细胞裂解。测试对照样本的蛋白质浓度(一式三份)，并且所有样本将在相当于对照中100μg蛋白质的体积中被消化。在该步骤中可以掺合1∶1的SILAMi参考蛋白质含量(但SILAMi参考物掺合不是必须的)。还原和烷基化后，蛋白质被胰蛋白酶消化并脱盐。该工作流程允许在多孔中进行准确且可重复的高通量元蛋白质组分析。这提供了筛选平台，其能够评估在培养期间由于疾病，药物处理或微生物群样本的任何其他操作或处理而引起的变化。此外，这允许从多个个体的微生物群样本的在多孔形式同时培养和评估，从而允许在一个紧凑的和时间有效的方式下高通量筛选。
[0088] 图10示出了示例性的具有高(4-BBH)，中等(3-BBM)或低(2-BBL)剂量的小檗
碱处理的样本相比正常的控制(1-CN)的样本的RapidAIM测定结果。每个培养的微生物群样本中对物种水平的分类组成在MetaLab生物信息学平台上进行定量：图10A显示了主成分分析(PCA)与所有细菌物种的加载图的结果。图10B显示当用高浓度的小檗碱处理时，源自Akkermansia属的物种的丰度(在图10B中识别为Akkermansia物种1，Akkermansia物种2和Akkermansia物种3)显著增加。据报道，Akkermansia物种是肠道微生物群中的有益细菌，已在其他文献中显示其被另一种抗糖尿病药物二甲双胍增加。应当理解，虽然用小檗碱处理微生物群样本，但是可以在该筛选平台中使用任何化合物来处理微生物群样本，并且用系统评估随后对微生物群蛋白表达的影响，以对样本进行功能和定量分析。具体实施例
[0089] SILAMi是标记技术，其产生对于给定的微生物群样本的同位素标记的标准品。原始的微生物群样本可能具有大量的微生物。样本中的微生物群是从原核生物(细菌和古细菌)至真核生物的各种微生物，其中所述真核细胞可以包括
真菌，原生生物。
[0090] 在SILAMi中，微生物群样本接种到15N-标记的细菌生长培养基，在厌氧条件下培养，并每24小时进行传代。一旦15N同位素掺合，标记的微生物群可以被用作用于未标记的样本的研究的内标准。在本文提供的实施例中，使用新鲜肠道微生物群样本。然而，技术人员将容易理解，可以获得其他微生物群样本并在SILAMi中使用而不脱离本教导。
[0091] 在本申请中，″组份分析″是指一种分析技术来确定微生物群样本的组成。这种分析可以包括，例如，元蛋白质组分析，元基因组分析或用于确定微生物群样本的组成(可以是蛋白质组合物，微生物群合物)的任何其他分析技术，或其组合。
[0092] 此外，″微生物种群″是指存在于微生物群的不同分类群(包括，例如，样本中的域，界，门，纲，目，科，种类)。在一些实例中，如本文所定义的微生物群可涉及微生物群样本的微分集，或涉及微生物群样本中发现的不同分类群。
[0093] ″微生物群样本″是指包含来自一个特定源的微生物群样本。尽管本文描述的实验集中于源自人的微生物群样本(例如，如图1A和以下所示的人的肠道)，但是应当理解这些仅是同位素标记的标准品的实例。对于像人类目标对象中发现的那样多样化的群体，可以实现这一目标。因此，本领域技术人员将理解，可以通过采用如本文所述的SILAMi技术类似地获得并培养其他微生物群样本以达到同位素标记的标准品。例如，容易理解的是，这样的微生物群样本可以源自动物，土壤或水，甚至可以涉及具有位于其中或其上的多种微生物群的某些植物。
[0094] ″同位素代谢标记″是指掺合同位素到一个给定的如本文所述微生物群的技术。实验1：SILAMi技术标记不同微生物种群的有效性：
[0095] 由一个实验来证明SILAMi微生物标记技术在一个不同的混合微生物群的功效，它首先检查是否肠道元蛋白质组可以被15N有效地标记。选择肠道元蛋白质组用于本实验，是由于其微生物群的多样性，表明其他多样化的微生物群可能同样被标记，以提供同位素标记的标准品和对于肠道疾病的重要性。实验方案：
[0096] 五个肠道微生物群样本是从结肠中
抽取。在一些实例中，如图1A所示，样本可以从目标对象的粪便101中获得。将微生物群样本运输到厌氧工作站(37℃，10％H2，10％CO2和80％N2)进行处理和培养。将样本个别地培养于15N标记的生长培养基5天102(传代)，在此期间在厌氧条件下保持。使用的优化的富集培养基可以根据所用的微生物群样本被改变。
在一些实施方案中，技术人员将理解所使用的富集培养基可以调整以适合于特定的微生物群样本。举例来说，在此肠道微生物群样本的情况下，一个15N的细菌生长培养基是，补充有
0.1％w/v的巯基乙酸钠和一个0.5g/L的胆汁盐的混合物，以适应肠道细菌。应当理解，可以进行其他调整以提供合适的生长培养基，其可以与其他和/或另外的标记同位素组合用于样本中发现的微生物群。此外，应理解，生长培养基可包括待掺合微生物群中的其他同位素。即使15N用于本发明的肠道微生物群样本，也可以使用其他同位素，这取决于样本中存在的微生物的性质，样本本身的来源点和所需的标记(例如如果仅标记半胱氨酸则可以使用硫同位素)。
结果：
[0097] 如图1A所示，每个传代102之后，如本领域中已知的，微生物群样本通过质谱法进行分析，以确定微生物群样本的15N富集水平。这些结果如图1B所示。如图1B所示，对于测试的五个个体，两次传代后样本的15N富集率大约为95％。这说明对于具有不同微生物群的微生物群样本(例如源自肠的微生物群样本)，可以实现高同位素富集率。本领域技术人员将理解，即使在本实验中使用肠道微生物群样本来实现这种高富集率，除了在人类目标对象肠道中发现的那些，也可以通过使用具有不同微生物群的其他微生物群(例如肺微生物群，皮肤微生物群)来实现这种同位素富集。此外，基于这些结果，此类微生物群样本也可以从动物目标对象获得，其中动物目标对象类似地具有不同的微生物群。
[0098] 而且，对于暴露于空气(和氧气)的某些微生物群样本，它可能不需要保持厌氧条件。
[0099] 此外，本领域技术人员还将理解，通过使用其他同位素富集生长生长培养基，其中，所述同位素不是15N，可以理解，基于这些结果，标记其它同位素的微生物群样本，也仍然产生高的富集率，如图1B所示。
[0100] 通过质谱法进行元蛋白质组分析。容易理解的是，也可以使用气相色谱-质谱法。容易理解的是，选择肠道微生物群样本是因为其微生物群的多样性，以证明SILAMi为这种复杂的微生物群提供标准品的能力。然而，显而易见的是，在不脱离本教导的情况下，可以类似地使用具有不同微生物群的任何其他微生物群(例如粘膜，肺，皮肤等)。
[0101] 此外，完全识别的15N标记的肽的数目增加(三天后标记高达11800的肽/样本)，而识别的未标记的肽减小了(小于100的肽/样本；图4)。使用普查的百分比
原子富集计算[10]还表明，所有五个微生物群测试达到平均15N富集率＞95％，这是足以用于基于15N的定量蛋白质组学分析，在每天3个传代内(图1B)。然而，即使超过95％的富集率在本文中解释为足以用于如图1B的实例中所示的定量蛋白质组学分析，显示出非常高且最佳的富集率，本领域技术人员将理解，富集率定量蛋白质组学可以是任何超过50％的情况，并且仍然提供可接受的结果。在一些实例中，超过90％的富集率，如图1B所示为1个传代后的大多数目标对象，足以用于定量蛋白质组学或任何其它组份分析。这些数据证明这种技术是能有效地标记一个复杂和代谢多样的微生物群。
[0102] 为了使这种标记方法对于微生物群具有广泛的适用性，所述标记将示出微生物群15
样本内的跨越出现的各种门类和物种。例如，在一些实例中，为了检查所述的代表性的 N-标记SILAMi方法，所述SILAMi标记的微生物群合物与基于元蛋白质组方法的初始接种物(传代0)进行比较。这证明了SILAMi标记的蛋白质是否代表微生物群样本中的初始种群。简而言之，所有识别的肽序列(即SILAMi中的15N肽和传代0中的14N肽)使用Unipept法进行系统发育分类，Unipept法基于最低共同祖先(LCA)算法，UniProt数据库和NCBI分类法分配肽的分类信息[11]。如图5所示，18个微生物门中的16个(包括属于细菌，古细菌和真核生物界的那些)和在传代0中检测到的142个属中的138个保留在SILAMi参考中(图5)。这表明，这种标记方法可以跨越出现在人类微生物群样本中的所有生物界和广大的生物属。应当理解，这种同位素标记标准品可用于执行准确且可再现的元蛋白质组学分析。
[0103] 在一些实施例中，可使用同位素标记的标准品，其具有已标记的50％以上对应于初始微生物群样本的微生物种群(初始微生物群样本是当最初从患者获得的微生物群样本)。然而，应该理解，获得有效标准品的初始微生物群样本的微生物群的标记百分比，可以根据实验的性质而变化(如果仅需要某些群体，例如，在炎症性肠病中的产生
硫化氢的细菌研究)。实验2：使用SILAMi标记的样本进行精确的比率测量
[0104] 下一个被测试的是，是否可以使用基于SILAMi定量元蛋白质组分析来获得精确的比率测量。简言之，将相同量的SILAMi蛋白质组分别掺合不同量的未标记的人肠道元蛋白质组样本中，L/H比分别为1∶1，1.25∶1，2∶1和5∶1(例如图1A，103))。然后将混合物在OrbitrapElite质谱仪上处理4小时梯度质谱分析。对应于4，014个蛋白质组的总共6，943个独特肽序列进行定量，并使用Census普查计算L/H比率104。所有定量蛋白质组的计算L/H比率的分布显示在图2A中，其显示中值L/H比率与峰值比率非常一致(Pearson的r＝0.99)。然后通过″L/H比率″(图2B)计算四个样本之间每个蛋白质组的倍数变化(FC)，其显示获得窄的FC分布，具有81-92％的与中位数差异小于两倍的蛋白质群体。此外，中值蛋白质FC值(1.23，1.93和4.39倍；图2B)与理论FC值(分别为1.25，2和5倍)非常一致。这表明代谢标记SILAMi微生物可以有效地作为内部标准品使用，以减少实验中和/或实验内的变异性和优化元蛋白质组分析的定量。例如，如本文所述，使用同位素标记的微生物群标准品可以识别
假阳性，由于实验错误引起的蛋白质水平的变化，或者如果某些蛋白质存在某些增加或减少的结果，是来自于实验准备本身变化的结果，或实际上可能是由于原始微生物群样本中发现的微生物群的变化。
[0105] 总之，SILAMi表示快速(3天或更少)，高效率和经济的用于产生肠道微生物群的代谢标记的蛋白质组的方法，并产生具有高度灵活的实验设计和实现的多个样本的精确元蛋白质组分析。SILAMi允许对元蛋白质组进行高度标准品化和定量分析，这将有助于元蛋白质组分析在微生物群组成和功能的表征中的应用。实施例1：SILAMi的用途，以评估微生物群的变化，作为结合化合物进行治疗的结果：
[0106] 作为原理验证的示例演示，应用SILAMi以评估化合物处理一段时间后的微生物的变化，该方法应用于评价低聚果糖(FOS)，一种已知的益生元，对微生物群的影响。简而言之，未标记的肠道微生物群在
基础培养基(BCM)中培养，有或没有10mg/ml的FOS，培养13和36小时。从每种微生物培养物中提取的蛋白质组掺合标记的SILAMi参照物，并通过质谱法分析。2,280个量化蛋白的主成分分析表明，FOS显著地改变了第一主成分的整个元蛋白质组(图3A解释了总方差37.5％)。187种蛋白质发生了显著变化，如表3所示：
表3：通过低聚果糖(FOS)处理改变的187个识别的蛋白质组
[0107] 在所识别的187个显著改变的蛋白质(图6)，来自不同细菌物种的转译延伸因子Tu(EF-Tu)的八个同源基因被发现，由FOS而增加(高达6倍，图3B)。此外，来自不同细菌物种的甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白的九个同源基因也被定量测得，其中8个同种型下降，而一个可变梭杆菌增加了。还发现参与内毒素合成的蛋白质(例如，ADP-甘油-庚酸-庚糖-6-差向异构酶)减少了，表明了FOS对肠道中潜在的产生内毒素的病原体的抑制作用。这表明SILAMi可用于定量评估用化合物处理后的元蛋白质表达的变化，并且通过处理这些化合物而引起的这些变化可指示影响的特定途径和功能。该方法可用于识别治疗目标，诊断和评估治疗反应。
[0108] 最后，还测试了SILAMi标记的标准品是否可以被用来区分单糖作用于微生物群的不同的效果。应当理解，单糖在本文中用作可能对微生物群有影响的化合物的实例。然而，可以如本文所述类似地分析其他化合物被引入微生物群样本，或作用于已经获得微生物群样本的目标对象，其可以影响微生物群。
[0109] 总之，18个样本具有或不具有2.5g/L的每个单糖(N-乙酰葡糖胺或GlcNAc的糖，甘露糖，半乳糖，岩藻糖，或葡萄糖)被培养，并进行了分析，由基于SILAMi的元蛋白质组分析，其产生了3158种定量蛋白质。与未处理的对照组相比，确定了264个蛋白质组的丰度变化(表4)：表4：使用SILAMi的元蛋白质组与未处理的对照组相比，识别了264个蛋白质组的丰度变化。
[0110] 在响应于不同的单糖的处理(图3C)中观察到的唯一元蛋白质组图案。单糖岩藻糖对元蛋白质组的影响最小，但是主要由岩藻糖利用相关蛋白组成的簇206仅在岩藻糖处理的微生物群中增加了(图3C)。此外，岩藻糖利用途径中六种量化的岩藻糖利用蛋白均在岩藻糖补充后增加了(图3D)[12]。另一方面，GlcNAc导致了元蛋白质组最显著的改变，GlcNAc降解蛋白显著增加(图3A-C)，产生果糖6-磷酸和NH3。后者可用于天冬酰胺合成，因为天冬酰胺合酶也显著增加(图3D)。
[0111] 作为结果，它表明使用经由SILAMi获得的重标记的标准品可以被用来评估给定的化合物对微生物变化的影响的结果。更具体地，该方法允许识别特定途径和代谢过程，其可在经处理的微生物群样本中改变。本领域技术人员可以使用该数据来确定组成效应功能的变化，以及识别疾病的途径或药物和
化学治疗中的影响。应当理解，这些化合物可包括异生物质，还包括药物，化学品，治疗剂，毒素，毒药，饮料，食品添加剂，化妆品，化妆品成分，包装材料，杀虫剂，除草剂，消费品。技术人员认识到给定的微生物群对变化非常敏感，因此这种化合物可能对微生物群产生影响。由于使用SILAMi技术开发的重标记标准品，这种影响现在可以量化。总之，提供了快速和经济的方式，即SILAMi，对微生物进行准确的和大规模的定量元蛋白质组研究。此外，它已成功应用于筛选和评估不同化合物对人类微生物群的影响。更有趣的是，可以通过受益于SILAMi获得的重标记标准品的实验获得关于药物，微生物和宿主之间相互作用的新见解。因此，SILAMi的应用可以帮助提高元蛋白质组学的准确性，从而在很大程度上促进其在研究健康和疾病背景下的微生物群中的应用。应当理解，在上下文中这种疾病研究可以包括确定给定患者疾病是否处于缓解期或疾病的严重程度是否恶化。该研究还可涉及确定患者是否对给定治疗有反应，或甚至确定应对特定患者给予哪种治疗。此外，SILAMi也可以诊断疾病。众所周知，健康和疾病的变化通常会使患者的微生物群发生变化。由于使用SILAMi获得的重标记标准品，现在可以量化和分析这些变化，特别是深度元蛋白质组变化。
实施例2：RapidAIM，一种评估药物作用的高通量筛选平台：
[0112] 现在讨论RapidAIM，一个实验和计算
框架，以快速分析个体的微生物群(称为RapidAIM)，评估化合物的效果的平台，包括但不限于针对微生物群的药物和描述了药物的新陈代谢。使用RapidAIM以验证化合物的平台，具体地，在这个例子中，描述了那些在IBD中使用的化合物(图8，9)。简言之，RapidAIM包括源自多个个体的微生物群的板，这些个体由
选定的化合物治疗，并在一个多孔形式下筛选；这种方法允许对于化合物的快速的分类，该化合物对微生物群的组合物(生物群-影响器)具有或不具有影响，或该化合物受到使用元16
基因组( S测序)的微生物(生物改变的)的影响，和/或快速处理元蛋白质组，和/或微生物对该化合物的代谢活动的代谢组学的评估；任选地，所述RapidAIM平台将利用这些化合物结合功能元基因组学，元转录组学和深度元蛋白质组，获得机械论的见解。应当理解，RapidAIM的某些步骤可以单独执行。最后，该生物信息学平台可以用来快速地引导选择基于个体的微生物metaOMICS分析或许多微生物群的广泛筛选的命中化合物。目前，还没有技术可以快速测定单个微生物群，特别是在元蛋白质组学方面。该RapidAIM项目对制药，生物技术的开发和微生物学领域是变革性的，因为它允许在药物商业化前，针对人体微生物的候选药物的快速筛选，筛选目前的药物具有潜在不良微生物的影响，根据患者他们对药物治疗的反应进行分类，以及筛选对更广泛人群有效的化合物。
[0113] 在另一个实施方案中，RapidAIM可用于筛选从IBD和对照患者中获得的微生物群板，在多孔板上分析异生物质。然而，应理解，RapidAIM也可用于选择的治疗剂，氨基酸和膳食补充剂等的分析中。在不脱离本教导的情况下，可以类似地进行在健康个体的微生物群中使用的任何此类化合物或与炎性肠病之外的疾病相关的那些化合物治疗后，评估元蛋白质组的变化。生物群-影响器可以通过微生物群化合物的变化的元基因组(16S测序)分析，和快速通元蛋白质组对最丰富的500种蛋白质的影响来选择。生物转化改变的化合物可通过代谢组学识别。每个多孔板用于筛选大约需要2天，并且可以识别靶向特定微生物或微生物群和/或其代谢活性的化合物。此外，可以进行该筛选以确定任何化合物对微生物群的影响。可以在减少的化合物库上重复该测定以产生功能性元基因组学，元转录组学和更深入的元蛋白质组学(4000-5000蛋白质/样本)。建模算法可用于基于metaOMICS分析和途径数据库，以快速指导化合物的选择。
[0114] 以多孔板形式来发展RapidAIM：微生物群可以接种在培养基中生长。测定，在任何多壁板上执行(例如6孔到96孔板形式，或任何其他类型的格式，例如，使用的试管)和可以使用滴定法，在每一个阶段，检查每孔的产量是否提供了足够的材料用于下游分析。如张等人所述，可以使用元蛋白质组的工作流程进行分析。″MetaPro-IQ：a universal metaproteomic approach to studying human and mouse gut microbiota″研究人类和鼠肠道微生物群的通用元蛋白质方法，Microbiome，2016年6月24日：4(1)：31，doi：10.1186/s40168-016-0176-z.″。该工作流程使用接近完整的人或鼠肠道微生物基因目录作为数据库，并使用迭代数据库搜索策略。一个基于96孔形式的RapidAIM高通量试验工作流程已经被示出(图9)。该工作流程包括(A)基于96孔的微生物群培养，和(B)基于96孔的元蛋白质组分析。
[0115] 如图9所示，在工作流的一个步骤说明如何″在SILAMi掺合可以在这里加入″，其中SILAMi掺合可任选地加入。″SILAMi掺合″或″SILAMi参考标准品″的制备可如本文所述的方式实施。或者，可以使用用于定量元蛋白质组学的代表性superSILAMi标准品。为了制备superSILAMi标准品，可以使用培养基和来自许多个体的样本的战略添加来组合多个SILAMi参考样本。superSILAMi参考可用作各种样本的综合定量掺合。
[0116] RapidAIM的使用还可以包括参数，以便设定时间来测量(i)微生物群变化，和(ii)药物
代谢物的代。这些可以通过例如现有文献来指导，包括来自体外肝脏系统药物代谢测试[13]。简而言之，微生物群可以接种并在有或没有化合物的基础培养基中生长不同时间(范围从30分钟到24小时)，并收集样本用于分析。
[0117] RapidAIM的使用可能也涉及参数设置，设定在池中每种化合物的用量，其可以被测试并预先确定，以使用临床剂量或报告的浓度用于指导培养。来自多个个体(包括男性和女性)的微生物群可用于抵消肠道微生物群的个体间差异性。
[0118] 作为一个例子，RapidAIM被用于测定个体具有高，中，低剂量的小檗碱处理的微生物，并对比未经药物治疗的微生物样本(图10)。每个培养的微生物群样本中对物种水平的分类组成在MetaLab生物信息学平台上进行定量。图10A显示了主成分分析(PCA)与所有细菌物种的加载图的结果。图10B显示当用高浓度的小檗碱处理时，源自Akkermansia属的物种的丰度(在图10B中识别为Akkermansia物种1，Akkermansia物种2和Akkermansia物种3)显著增加。据报道，Akkermansia物种是肠道微生物群中的有益细菌，其被另一种抗糖尿病药物二甲双胍增加。
[0119] 本发明的描述出于说明的目的而阐述，但并非意在穷举或限制于所公开的实施例。许多
修改和变化对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。参考文件
1.Qin，J.，et al.Nature，2010年.464(7285)，59-65.
2.Clemente，J.C.，et al.Cell，2012年.148(6)，1258-70.
3.Kelly，C.P.N Engl J Med，2013年.368(5)，474-5.
4.Verberkmoes，N.C.，et al.ISME J，2009年.3(2)，179-89.
5.Juste，C.，et al.Gut，2014年.63(10)，1566-77.
6.Jagtap，P.，et al.J Proteomics，2013年.13，1352-1357.
7.Ong，S.E.，et al.Mol Cell Proteomics，2002年.1(5)，376-86.
8.Krijgsveld，J.，et al.Nat Biotechnol，2003年.21(8)，927-31.
9.Mueller，R.S.，et al.Environ Microbiol，2011年.13，2279-2292.
10.Park，S.K.，et al.Nat Methods，2008年.5(4)，319-22.
11.Mesuere，B.，et al.J Proteome Res，2012年.11(12)，5773-80.
12.Stahl，M.，et al.Proc Natl Acad Sci USA，2011年.108(17)，7194-9.
13.Zhong，S.et al.Drug Metab Dispos，2015年.
