专利汇可以提供具优良基因组合的高效Bt15A3菌株、分离及应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 是具有优良基因组合的苏 云 金芽孢杆菌科默尔亚种15A3株及分离筛选方法;其独特的cry基因的组合,这些基因分别是:cry1Aa,cry1Ac,cry1C,cry1D,cryII和cryV,利用多种cry基因特异引物的PCR方法及 生物 活性测定方法筛选到的Bt15A3菌株; 可湿性粉剂 和液剂对重大 害虫 甜菜夜蛾、 棉 铃虫、 小菜蛾 和美国白蛾均收到很好的田间防治效果。,下面是具优良基因组合的高效Bt15A3菌株、分离及应用专利的具体信息内容。
1、一种生产细菌杀虫剂的高效广谱菌株,其特征在于所述的菌株是苏云金芽孢杆 菌科默尔亚种15A3菌株(Bacillus thuringiensis subsp.colmer 15A3,Bt 15A3), 保藏号为CGMCC NO.0528,包括:
A.该菌株鞭毛抗原属H21型,为苏云金芽孢杆菌科默尔亚种,具有菱、方、镶嵌、 不规则多型晶体及正常的芽孢形态,但与标准的科默尔亚种的基因组成有差异;
B.该菌株编码杀虫晶体蛋白(ICP)的基因有:cryIAa,cryIAc,cryIC, cryID,cryII和cryV;
C.该菌株cryIAa基因与已发现的cryIAa基因的序列不同,仅含有726bp和237bp 的酶切片断而缺少496bp的片断,在这段序列中多出一个pstI切点。
2、权利要求1所述的Bt 15A3菌株的分离筛选方法,其特征在于它包括下述步骤:
A.称取1克土壤样品置于10ml无菌水中,充分混匀后取1ml加入混有多粘菌素 及青霉素的NB培养基中,30℃培养72小时,挑选类似苏云金芽孢杆菌的菌落,涂片 染色后镜检,将芽孢晶体形成同步率高、并同时含有菱形、方形、多型晶体的菌落进 一步纯化;
B.依据各类cry基因的保守区设计特异引物,对纯化好的Bt菌株进行各类cry 基因的检测,将具有期望的基因组合的菌株选出;
C.将所筛选到的菌株及参比菌株分别接种No.1发酵培养基,其配方为:鱼粉 3.0-3.5%,玉米淀粉1.2-1.5%,牛肉膏0.2-0.5%,无机盐0.1-0.2%,pH7.5-8.0,30 ℃,180-220rpm/分培养26-30小时;
D.将培养液稀释至500、1000倍,混入人工饲料,饲喂初孵棉铃虫及甜菜夜蛾, 筛选出对两种试虫毒力均高的菌株。
3、一种利用权利要求1所述的Bt 15A3菌株生产芽孢的方法,其特征在于包括下 述步骤:
A.生产用菌种用NB培养基斜面,其配方为:牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCl0.5%, 琼脂粉1.8%,pH7.2-7.4,培养基制备好后分装试管或克氏瓶,121℃高压蒸气灭菌 30分钟,取出后摆成斜面,置于30℃温箱中培养24-48小时;无杂菌生长便可以接 种:取保藏菌种一环接种新鲜斜面,30℃培养10-12小时,涂片染色后显微镜观察, 菌体为粗杆状,两端钝圆,原生质均匀无杂菌;
B.克氏瓶扩大培养,将上述活化的菌种取一环接入液体NB培养基中,30℃ 180rpm/min振荡培养5-6小时,取2ml至克氏瓶内,使其均匀分布于培养基表面,置 30℃培养72小时,检查菌苔厚而丰满,菌落表面灰白色、无光泽、无杂菌,镜检芽 孢晶体形成率为98%以上;
C.发酵罐种子液制备,将100ml无菌水倒入克氏瓶洗下菌苔,移入装有少量玻璃 珠的无菌烧瓶内,充分振荡将菌苔打散,移入专用接种瓶,置75℃水浴20分钟。
4、一种利用权利要求1所述的Bt 15A3菌株生产ICP的方法,其特征在于包括 下述步骤:
A.生产用菌种用NB培养基斜面,其配方为:牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCl0.5%, 琼脂粉1.8%,pH7.2-7.4,培养基制备好后分装试管或克氏瓶,121℃高压蒸气灭菌 30分钟,取出后摆成斜面,置于30℃温箱中培养24-48小时;无杂菌生长便可以接 种:取保藏菌种一环接种新鲜斜面,30℃培养10-12小时,涂片染色后显微镜观察, 菌体为粗杆状,两端钝圆,原生质均匀无杂菌;
B.克氏瓶扩大培养,将上述活化的菌种取一环接入液体NB培养基中,30℃ 180rpm/min振荡培养5-6小时,取2ml至克氏瓶内,使其均匀分布于培养基表面,置 30℃培养72小时,检查菌苔厚而丰满,菌落表面灰白色、无光泽、无杂菌,镜检芽 孢晶体形成率为98%以上;
C.发酵罐种子液制备,将100ml无菌水倒入克氏瓶洗下菌苔,移入装有少量玻璃 珠的无菌烧瓶内,充分振荡将菌苔打散,移入专用接种瓶,置75℃水浴20分钟;
D.发酵罐培养
发酵培养基配方:豆饼粉4.0%,玉米淀粉1.5%,棉籽粉1.5%,酵母粉1.0%,无 机盐类0.5%,泡敌0.03-0.05%,全部原料需达到180μm筛的细度,pH8.5-9.0。按发 酵容积的70-75%投料,灭菌后冷却至40℃左右,按投料体积的0.02%接入种子液,搅 拌转数为250转,温度30℃±1℃,罐压0.5kg,通气量1∶1.0-1∶1.3,发酵周期35-48 小时,视30%左右的孢晶游离,发酵液pH达8.0以上终止发酵。
5、权利要求3所述的方法生产的芽孢,其特征在于所述的芽孢是卵园形,其芽 孢萌发的菌体鞭毛抗原属H21型,是苏云金芽孢杆菌科默尔亚种,抗生素谱测定结果: ampr、polymyr、strs、erys、tets、chls。
6、权利要求4所述的方法生产的杀虫晶体蛋白,其特征在于所述的杀虫晶体蛋 白由cryIAa,cryIAc,cryIC,cryID,cryII和cryV六种基因编码。
7、权利要求6所述的杀虫晶体蛋白用作防治鳞翅目夜蛾科害虫甜菜夜蛾、棉铃 虫、小菜蛾及美国白蛾的细菌杀虫剂。
本发明涉及对鳞翅目重大害虫甜菜夜蛾及棉铃虫等均具高毒力的苏云金芽孢杆 菌科默尔亚种15A3菌株,属于芽孢杆菌属,苏云金芽孢杆菌种,科默尔亚种,15A3菌 株(Bacillus thuringiensis subsp.colmer 15A3),简称Bt15A3,由这一菌株携带 的编码杀虫晶体蛋白(ICP)的基因及其优良组合,以及由此菌株所开发的高效细菌杀 虫剂。
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