发明领域

本发明总的来讲涉及免疫学和免疫治疗领域。更具体地讲，本发 明涉及用于改变T细胞介导病理例如T细胞恶性肿瘤和/或自身免疫病 的方法和组合物。

                       发明背景

本发明总的来讲涉及免疫学和免疫治疗领域。更具体地讲，本发 明涉及用于改变T细胞介导病理例如T细胞恶性肿瘤和/或自身免疫病 的方法和组合物。

免疫系统既产生抗体介导的应答，也产生细胞介导的应答。每种 类型的免疫应答由淋巴细胞B细胞(对于抗体介导应答而言)和T细胞 (对于细胞介导应答而言)中的一种类型来调控。当某些外源性蛋白质 (抗原)的部分与主要组织相容性复合体(“MHC”)结合(通常通过抗原呈 递细胞(“APC”))时(所述抗原在APC中被消化为片段，与自身MHC结 合呈递到所述APC表面)，T细胞与所述蛋白的部分结合。

T细胞淋巴瘤是一种由于T细胞不当复制而引起、最终导致免疫 系统功能受损的一种T细胞介导的病理。T细胞淋巴瘤用目前可利用 的药物难以有效地治疗，其它的治疗策略将会被受欢迎地加入到医师 的武器库中。

其它T细胞介导病理包括越来越多的被分类为自身免疫病的人类 疾病，在自身免疫病中宿主自身的免疫系统攻击宿主自身组织。T细 胞是免疫系统的初级调节物之一，直接或间接地影响这类自身免疫病 理。这类自身免疫病的实例包括类风湿性关节炎(RA)、重症肌无力 (MG)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性甲状腺 炎(桥本甲状腺炎)、Graves病、炎性肠病、自身免疫性眼色素层视网 膜炎(uveoretinitis)、多肌炎和某些类型的糖尿病。本发明对于这些自身 免疫病的治疗并不治愈这些疾病，而是仅治疗症状。

现在已知这些和其它自身免疫病涉及T辅助细胞通过其T细胞受 体(TCR)与MHC/自身抗原(或非自身抗原)复合体结合而被刺激的作 用。有人提出，对这些自身免疫病的可能的治疗可以通过破坏MHC/ 抗原复合体和TCR之间的相互作用来完成。

在大多数成熟T淋巴细胞表面上发现的TCR是一种最常见包含α 链和β链的异二聚体膜内在蛋白。TCR的整体三维结构与B细胞上的 细胞表面相关免疫球蛋白(Ig)的三维结构类似，因为每个α链和β链都 含有一个负责抗原识别的氨基末端可变(V)区和一个在将识别事件信 号发送至细胞内部中重要的的羧基末端恒定(C)区。β链还含有由多样 性(D)基因和连接(J)基因区段编码的额外的氨基酸。这些V、D、J和C 基因区段在染色体上位于不同且隔开的位置上。Vβ、Dβ、Jβ和Cβ基因 区段重组产生编码β链的功能性转录单位。功能性α链转录单位通过 Vα、Dα、Jα和Cα区段重组而形成。在一个淋巴细胞克隆中Vα、Jα和 Cα基因区段加上Vβ、Dβ、Jβ和Cβ基因区段的独特重组，产生一种仅在 该特定淋巴细胞中发现的独特的蛋白决定簇-独特型(Id)。

存在区别TCR分子与免疫球蛋白分子的重大差异。免疫球蛋白一 般识别溶液相中或者作为B细胞抗原受体、或者作为分泌型分子的其 配体，而TCR仅识别作为与居留在其它细胞的细胞表面的MHC I类 和II类分子结合的来自蛋白质抗原的肽片段的配体。另外，与免疫球 蛋白不同，不发生TCR mRNA可变剪接而产生分泌型TCR链，因此， TCR分子仅作为T细胞表面的膜内在蛋白存在。最后，当T细胞在识 别抗原后被活化时，TCR可变区基因区段不发生超变，与B细胞中的 免疫球蛋白V基因区段相反，后者经历体细胞突变，从而增加其对其 配体的亲和力。

根据对自身免疫病的广泛研究，现已大量记载了T细胞及其表达 的TCR链可以作为其它T细胞免疫调节的靶(Vandenbark等，“Human TCR as antigen：Homologoies and potentially cross-reactive HLA-DR-2 restricted epitopes with the AV and BV CDR2 loops，”Critical Reviews in Immunol.，20：57-83，2000)。目前人们认为，TCR链的肽片段被酶促加 工，随后与MHC I类和II类分子结合而被呈递到活化T细胞的细胞表 面。MHC II类分子仅存在于活化后的T细胞上，最近的证据提示，TCR 肽呈递通过其表达也在活化后被正调节的一个亚类的MHC I类分子而 发生(Ware等，Immunity 2：177-184，1995；Jiang等，Immunity 2：185-94， 1995)。这些MHC/TCR-肽复合体以MHC I类限制性CD8+效应T细胞 和MHC II类限制性CD4+效应T细胞的形式诱发自身调节性免疫。所 选TCR肽疫苗在T细胞介导自身免疫病环境中的免疫调节特性已有报 道(Gold等，Critical Reviews Immunol.，17：507-10，1997)。此外，因为完 整TCR链克隆分布在T细胞上(正如B细胞克隆上的免疫球蛋白一 样)，完整的功能性TCR是作为T细胞淋巴瘤的潜在肿瘤特异性抗原 的候选物。在采用完整TCR作为抗原的潜在缺点中，有可能因产生针 对α链和β链的恒定区的免疫应答而引起的并发症。

免疫调节细胞介导的对TCR链特异性的应答，看来针对所述TCR 链可变区中种系编码的决定簇。由于TCR链同Ig分子一样往往不突 变，所以动物研究中的试验证据提示属类TCR链有治疗应用。接种在 细菌中制备的分泌型TCR β链(Kumar，J.Immunol.159：5150-56， 1997)、表达TCR β链的痘苗病毒构建体(Chundru，J.Immunol. 156：4940-45，1996)或者编码单一TCR β链的“裸”DNA构建体(Waisman， Nat.Med.2：899-905，1996)，都导致诱发针对所述免疫性TCR β链的调 节性T细胞应答。

已经测试了基于具有已限定化学特性的单一TCR基序的肽疫苗 作为治疗T细胞介导病理的治疗药的应用。某些研究人员已经指明， 如果用在特定疾病环境中过量表达的来源于TCR链的肽来治疗，则 TCR链的构架区/CDR区衍生肽可以预防在动物中发生的自身免疫 病。这证明T细胞加工其自身内源TCR链，并且将它们以一种方式重 新呈递给其它T细胞，使得确保T细胞-T细胞相互作用可以发挥作 用，以调节致病细胞。然而，由于TCR肽的识别要求所述TCR链被 加工为肽片段，所述肽片段与MHC分子结合而呈递到靶T细胞表面， 所以很难预测来自特定TCR的哪种肽在临床环境下有效。显示出对 TCR肽的MHC II类限制性应答的近交啮齿动物研究调查阐明了这一 点(Gold等，Critical Reviews Immunol.，17：507-10，1997，参见上文)。因 此，与大多数蛋白质一样，所述Vβ序列和所述MHC一起决定哪种表 位将会刺激T细胞，没有明显的规律可预测相关TCR肽位于所述Vβ 氨基酸序列中何处。这种挑战又混合有人群中存在广泛的MHC多态 性。

产生TCR独特型以调节T细胞介导免疫应答是困难的，因为TCR 是一种膜内在蛋白，通常不作为可溶性蛋白合成和分泌。因此，从致 病细胞例如肿瘤细胞常规纯化足量的TCR以供治疗应用是不可行 的。

已经尝试用昆虫细胞生产大量的分泌形式的异二聚体TCR。这些 分泌型分子含有完整的VαJαCα/VβDβJβCβ胞外结构域，并且根据用构象 特异性抗TCR Vβ抗体检测，它们进行正确的折叠。然而，分泌型分子 的生产水平可能很低。其它研究人员已经用各种方法产生重组TCR 链，所有这些方法的目的都是制备能够产生识别其关连配偶体MHC+ 肽的功能性TCR的可溶性异二聚体结构。

用几种不同方法产生用于治疗的TCR可溶性部分的工作遇到了 其它重大的问题。这些工作和相关工作包括：(1)在大肠杆菌中生产可 以从包涵体中纯化并且随后可以重折叠的单链Fv构建体(Kurucz等， Proc.Natl.Acad.Sci.，90：3830-34，1994)；(2)在细菌中生产重组TCR分 子(Kumar等，J.Immunol.159：5150-56，1997；Offner等，J.Immunol. 161：2178-86，1998；Novotny等，Proc.Natl.Acad.Sci.，88：8646-50， 1991)，(3)生产通过在TCR可变区加上所有或几乎所有TCR恒定区和 Ig恒定区之间融合制备的、可以从哺乳动物细胞中分泌的嵌合分子 (Gregoire等，Proc.Natl.Acad.Sci.88：8077-81，1991；Weber等，Nature 356：793-96，1992；Eilat，Proc.Natl.Acad.Sci.，89：6871-75，1992)，(4)在 哺乳动物细胞表面表达TCR胞质外结构域，所述胞质外结构域通过磷 脂酰肌醇聚糖键连接，该键随后可以通过磷脂酰肌醇特异性的磷脂酶 C的作用而被切除(Lin等，Science 249：677-79，1990；Chung等，Proc. Natl.Acad.Sci.91：12654-58，1994；Okada等，J.Immunol.，159：5516-27， 1997)，和(5)在昆虫细胞中表达作为分泌型蛋白的单链或完整的异二聚 体TCR链(Kappler等，Proc.Natl.Acad.Sci.，91：8462-66，1994)。与利用 细菌的每种所述方法相关的缺点，包括不确定的溶解性和可能的内毒 素污染问题，这些有损于在细菌中制备的蛋白质的容易性和高产潜 力。对于在哺乳动物细胞中生产的蛋白质，引起了关于病毒负载的担 心。这些担心以及在纯化磷脂相关蛋白方面的困难，使得这种方法对 于临床环境的吸引力更加低。

在大肠杆菌中生产抗体遇到了其它困难，所述抗体一般不能用于 治疗应用，尽管它们可用来鉴定编码所需结合特异性的基因。通常， 仅所述抗体的抗原结合片段Fab或Fv在细菌中被分泌(参见例如 Kurucz等，Proc.Natl.Acad.Sci.，90：3830-34，1994)。用大肠杆菌生产完 整链的四聚体IgG时在非常少的情况下，所述抗体被不当地糖基化。 没有正确的糖基化，抗体就不会触发抗体引导的细胞毒性(ADCC)和补 体激活的溶细胞活性，而这些活性使被动免疫治疗如此有功效。另一 方面，哺乳动物表达系统产生糖基化抗体。然而，最近FDA CBER部 门的“Points to Consider”的修改明确地表明他们对与用哺乳动物细胞 表达系统生产的单克隆抗体相关的病毒负载的担心。此外，预期用哺 乳动物表达系统生产的任何工程抗体都将是相当昂贵的(每剂$1500- $5000)。

杆状病毒表达系统是用大肠杆菌和哺乳动物细胞生产抗体的一 种很好的替代方法。用杆状病毒系统在真核细胞中高产地生产(1-100 mg/L)生物活性蛋白是可能的(Haseman等，Proc.Natl.Acad.Sci. 87：3942-46，1990)。杆状病毒/昆虫细胞系统绕过了当重组蛋白在原核 生物中过量表达时通常遇到的溶解性问题。另外，昆虫细胞含有在真 核细胞中存在的负责正确折叠、二硫键形成、糖基化、β-羟基化、脂 肪酸酰化、异戊烯基化、磷酸化和酰胺化的翻译后修饰机器。最近证 明了用杆状病毒表达系统生产识别人结肠直肠癌细胞的功能性糖基化 单克隆抗体(Nesbit，J.Immunol.Methods 151：201-208，1992)。显示出这 种杆状病毒生产的抗体介导ADCC；相反，在细菌中生产的抗体不被 糖基化，因此没有可检测的ADCC活性。

在某些情况下，应用杆状病毒系统表达生物活性蛋白由于不能在 不过度蛋白酶降解的情况下有效地溶解重组蛋白而受到阻碍。为了绕 开在昆虫细胞中表达重组蛋白所遇到的溶解性和蛋白水解的问题，开 发了可供有效分泌生物活性蛋白的杆状病毒转移载体。通过将功能性 分泌前导序列插入到多角体蛋白启动子的下游，构建了这些促进重组 蛋白从宿主昆虫细胞中分泌的载体。cDNA序列符合读框的插入，导 致合成含有将重组蛋白引向所述分泌途径的异源信号序列的蛋白。测 试了人和昆虫的前导序列，以使得异源蛋白从昆虫细胞的分泌最大 化。证明人胎盘碱性磷酸酶信号序列(MLGPCMLLLLLLLGLRLQLSLG (SEQ ID NO：1)；DNA序列：ATG GTG GGA CCC TGC ATG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTA GGC CTG AGG CTA CAG CTC TCC CTG GGC(SEQ ID NO：2))和蜜蜂蜂毒肽信号序列 (MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(SEQ ID NO：3)；DNA序列：ATG AAA TTC TTA GTC AAC GTT GCA CTA GTT TTT ATG GTC GTG TAC ATT TCT TAC ATC TAT GCG(SEQ ID NO：4))对于许多细菌蛋白 和人蛋白的分泌都是有效的(Mroczkowski等，J.Biol.Chem.269： 13522-28，1994和Tessier等，Gene 98：177-83，1991)。

利用杆状病毒表达系统，McKeever等(J.Exp.Med 184：1755-68， 1996)能够产生由与小鼠IgG1重链的铰链区、CH2和CH3区连接的TCR 链胞外结构域(Vα-Cα和Vβ-Cβ)构成的嵌合蛋白。用所得的来自胰腺β 细胞抗原特异性的T细胞克隆的溶解的TCR-IgG1嵌合蛋白，来免疫非 肥胖性糖尿病性(NOD)雌性小鼠。交配后，分析这些小鼠的后代，以 确定母性转移的抗TCR抗体对致糖尿病活性的效应。这些研究证明， 当以可溶性形式给予时，所述TCRα链或β链的可变区在所来源品系小 鼠中可以具有免疫原性。这些研究也表明，用可溶性TCR-IgG1免疫， 可以刺激识别天然克隆型表位的抗体的产生。McKeever等明确地证 明，使用相对简单的表达和纯化策略，有可能生产含有全部α链和β链 的可溶性TCR-IgG1蛋白，其中所述TCR部分具有免疫原性的、与在 功能活性的细胞表面形式的TCR中发现的那些决定簇交叉反应的克 隆型决定簇。

一些其它研究人员也表达了作为以各种方式与Ig链融合的分子 融合体的TCR分子。然而，所有这些研究都利用完整的TCR结构(即 可变区和恒定区)与Ig骨架的各个部分融合，所有这些研究的目的都是 再现TCR可变区的识别功能。也证明了，各种形式的TCR链在动物 研究中有可能用作预防/治疗自身免疫病的疫苗。例如Okada等(J. Immunol.，159：5516-27，1997)已经指出，由哺乳动物细胞制备的可溶性 TCR链有可能用来治疗小鼠的T细胞肿瘤。然而，如上所述，这些TCR 分子的生产是困难的，并且生产水平低。

另外，预测TCR蛋白的应用在兽医应用中具有治疗价值(参见 1999年7月29日申请的国际专利申请号PCT/US99/17309，WO 00/06733)。

                      发明概述

本发明提供一种改变患者的T细胞介导病理的方法。该方法包括 给予一种含有至少一种嵌合蛋白的组合物，所述嵌合蛋白具有TCR Vβ 或Vα链的至少一部分和免疫球蛋白恒定区的至少一部分。在其它优选 实施方案中，存在的所述嵌合蛋白可以包含TCR Vβ或Vα链的至少一 部分、加上一个接头区、加上免疫球蛋白恒定区的至少一部分。在进 一步优选的实施方案中，所述嵌合蛋白中TCR恒定区的所述部分为约 3-30个相连氨基酸残基。接头区可以包含TCR恒定区的一部分。在再 更优选的实施方案中，嵌合蛋白中恒定区的所述部分包含直到并包括 所述恒定区免疫球蛋白折叠的第一个半胱氨酸残基的氨基酸残基。在 该组合物中使用的Vβ或Vα链与来自具有T细胞介导病理的患者的T 细胞的特定TCR相关。在将这样的组合物给予患者后，该患者的T细 胞介导病理得到改变。

本发明也提供通过给予含有两种不同嵌合蛋白的组合物来改变 患者的T细胞介导病理的方法。每种嵌合蛋白具有与免疫球蛋白恒定 区的至少一部分连接的TCR Vβ或Vα链的至少一部分。在其它优选实 施方案中，存在的嵌合蛋白可以包含TCR Vβ或Vα链的至少一部分、 加上一个接头区、加上免疫球蛋白恒定区的至少一部分。在进一步优 选的实施方案中，所述嵌合蛋白中TCR恒定区的所述部分为约3、4、 5、6、7、8、9、10、14、18、22、26或30个相连氨基酸残基。接头 区可以包含TCR恒定区的一部分。在再更优选的实施方案中，嵌合蛋 白中恒定区的所述部分包含直到所述恒定区的免疫球蛋白折叠的第一 个半胱氨酸残基氨基末端一侧的某些或所有的氨基酸残基。作为所述 嵌合蛋白部分的Vβ和/或Vα链与来自具有T细胞介导病理的患者的T 细胞的特定TCR相关。

含有患者来源的特有Vα和/或Vβ链的特异性TCR蛋白可以被开发 成为治疗组合物。可以用可疑的自身抗原来选择性地刺激和扩充参与 自身免疫性T细胞病理的T细胞，所述自身免疫病例如类风湿性关节 炎(RA)、重症肌无力(MG)、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、 自身免疫性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)、Graves病、炎性肠病、自身免 疫性眼色素层视网膜炎、多肌炎和某些类型的糖尿病。或者，利用T 细胞生长因子即IL-2、IL-4，可以选择性地扩充从组织中分离的、经 历过自身免疫攻击的T细胞。与多发性硬化相关的T细胞已经由 Wilson等以这种方式表征(J.Neuroimmunol.76：15-28，1997)，该文献通 过引用全部结合到本文中，包括任何附图和图表。与其它T细胞介导 病理相关的T细胞可以用Wilson等所述方法的改进方法来表征。在纯 化少量致病性T细胞后，可以采用本发明中所述方法，通过PCR克隆 由这些细胞表达的T细胞受体的可变区部分。一旦克隆出所述部分， 则可以用具体参与所述T细胞病理的受体的Vα和/或Vβ部分，来制备 可以在本文所述的杆状病毒系统中表达的嵌合蛋白。

用于上述组合物和嵌合蛋白中的免疫球蛋白恒定区可以是选自 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重链、κ 和λ轻链的蛋白质的一部分。在某些实施方案中，所述嵌合蛋白仅含有 TCR的或者Vβ链或者Vα链和免疫球蛋白恒定区。嵌合蛋白的实例包 括Vβ-IgGγ1、Vα-κ或Vα-λ、或者Vα-IgGγ1、Vβ-κ或Vβ-λ。在另外的实 施方案中，所述组合物含有两种嵌合蛋白，每种嵌合蛋白分别含有一 个Vβ和Vα链与一个免疫球蛋白恒定区。实例包括Vβ-IgGγ1和Vα-κ、 或者Vβ-IgGγ1和Vα-λ、或者Vα-IgGγ1和Vβ-κ、或者Vα-IgGγ1和Vβ-λ。 在其它优选实施方案中，所述嵌合蛋白可以包含TCR Vβ或Vα链的至 少一部分、加上一个接头链、加上免疫球蛋白恒定区的至少一部分。 在某些优选实施方案中，所述嵌合蛋白中TCR恒定区的所述部分为约 3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26或30个相连氨基酸残基。 在另外的优选实施方案中，所述嵌合蛋白中恒定区的所述部分包含直 到所述免疫球蛋白折叠的第一个半胱氨酸残基氨基末端一侧的某些或 所有的氨基酸残基。实例包括Vβ-Cβ-IgGγ1和Vα-Cα-κ、或者Vβ-Cβ- IgGγ1和Vα-Cα-λ、或者Vα-Cα-IgGγ1和Vβ-Cβ-κ、或者Vα-Cα-IgGγ1和 Vβ-Cβ-λ。

本发明也提供一种用重组DNA技术和一种表达系统生产嵌合蛋 白的方法。该方法包括以下步骤：(a)从具有T细胞介导病理的患者的 T细胞中分离出编码TCR Vβ或Vα链的基因，(b)将编码所述TCR Vβ 或Vα链的基因和编码所述免疫球蛋白恒定区的基因插入到表达载体 中，以允许嵌合蛋白表达，(c)通过将所述表达载体导入昆虫细胞系中 并让其表达，生产所述嵌合蛋白，并且(d)分离所述嵌合蛋白。所述生 产嵌合蛋白的方法还包括下述步骤：将编码所述TCR Vβ或Vα链的基 因和编码第二种免疫球蛋白恒定区的基因插入到所述表达载体中，以 允许所述第二种嵌合蛋白表达。所述分离的编码所述TCR Vβ或Vα链 的基因可以另外包含所述TCR恒定区中约30个或更少氨基酸的一个 部分。

本发明还提供一种用于改变患者的T细胞介导病理的组合物。该 组合物含有至少一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白具有TCR Vβ或Vα链的 至少一部分和免疫球蛋白恒定区的至少一部分。在其它优选实施方案 中，所述嵌合蛋白可以包含TCR Vβ或Vα链的至少一部分、加上所述 TCR链恒定区中约30个或更少氨基酸残基的一个部分和免疫球蛋白 恒定区的至少一部分。在其它优选实施方案中，所述嵌合蛋白中TCR 恒定区的所述部分为约3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26 或30个相连氨基酸残基。在另外的优选实施方案中，所述嵌合蛋白中 TCR恒定区的所述部分包含直到所述恒定区的免疫球蛋白折叠的第一 个半胱氨酸残基氨基末端一侧的某些或所有的氨基酸残基。作为所述 嵌合蛋白部分的Vβ或Vα链与来自具有T细胞介导病理的患者的T细 胞的特定TCR相关。所述组合物还含有第二种嵌合蛋白，所述第二种 嵌合蛋白具有TCR Vβ或Vα链的至少一部分和第二种免疫球蛋白恒定 区的至少一部分。在其它优选实施方案中，所述嵌合蛋白可以包含TCR Vβ或Vα链的至少一部分、加上一个接头区、加上免疫球蛋白恒定区的 至少一部分。在另外的优选实施方案中，所述接头区可以包含所述TCR 恒定区中约3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26或30个相连 氨基酸残基的一个部分。在其它优选实施方案中，所述嵌合蛋白中所 述恒定区的所述部分包含直到所述恒定区的免疫球蛋白折叠的第一个 半胱氨酸残基氨基末端一侧的某些或所有的氨基酸残基。作为所述第 二种嵌合蛋白部分的Vβ或Vα链与来自具有T细胞介导病理的患者的T 细胞的特定TCR相关。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含两种嵌合蛋白，所 述第一种嵌合蛋白包含完整的Vβ区和人免疫球蛋白IgGγ1恒定区(TCR Vβ-IgGγ1)，第二种嵌合蛋白包含完整的Vα和人κ或λ恒定区(TCR Vα-κ 或TCR Vα-λ)。在其它优选实施方案中，所述嵌合蛋白中的任一种或 两种蛋白可以包含TCR Vβ或Vα链的至少一部分、加上一个接头区、 加上免疫球蛋白恒定区的至少一部分。在另外的优选实施方案中，任 一种或两种所述嵌合蛋白中的接头区可以包含TCR恒定区中约3、4、 5、6、7、8、9、10、14、18、22、26或30个相连氨基酸残基的一个 部分。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物含有两种嵌合蛋白，第 一种蛋白包含完整的Vβ区加上所述TCR β链恒定区(Cβ)中30个或更少 的氨基酸残基的一个部分和人免疫球蛋白IgGγ1恒定区(TCR VβCβ(1-30) -IgGγ1)。在优选实施方案中，所用的Cβ的所述部分为约3、4、5、6、 7、8、9、10、14、18、22、26或30个相连氨基酸残基。第二种嵌合 蛋白包含完整的Vα加上所述TCR α链恒定区(Cα)中30个或更少的氨 基酸残基的一个部分和人κ恒定区(TCR VαCα(1-30)-κ)。在优选实施方案 中，所用的Cα的所述部分为约3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、 22、26或30个相连氨基酸残基。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物含有一种嵌合蛋白，所 述嵌合蛋白含有来自患者T细胞的特定TCR的Vβ或Vα链和免疫球蛋 白恒定区。实例包括嵌合蛋白Vβ-IgGγ1、Vα-κ或Vα-λ、或者Vα-IgGγ1、 Vβ-κ或Vβ-λ。在其它优选实施方案中，所述嵌合蛋白可以包含TCR Vβ 或Vα链的至少一部分、加上一个接头区、加上免疫球蛋白恒定区的至 少一部分。在另外的优选实施方案中，任一种或两种所述嵌合蛋白中 的接头区可以包含TCR恒定区中约3、4、5、6、7、8、9、10、14、 18、22、26或30个相连氨基酸残基的一个部分。

在本发明的一个实施方案中，用来表达所述嵌合蛋白的表达载体 是一种杆状病毒载体。所述载体含有两个表达盒，每个表达盒具有启 动子、分泌信号序列和嵌合蛋白。一个表达盒含有与蜜蜂蜂毒肽信号 序列连接的杆状病毒AcNPV p10启动子。另一表达盒具有与人胎盘碱 性磷酸酶信号序列连接的多角体蛋白启动子。除所列的启动子和信号 序列之外，还可以用本领域技术人员已知的其它启动子和信号序列来 替代。在优选实施方案中，使用与来源于特定患者的免疫球蛋白基因 相关的内源分泌序列。将编码所述TCR Vα或Vβ链、所述接头区和所 述免疫球蛋白恒定区的基因分别地和/或一起插入到所述杆状病毒载 体的上述表达盒中，让一种或两种嵌合蛋白表达。在一个优选实施方 案中，免疫球蛋白重链的恒定区例如IgG1与或者Vβ链或者Vα链一起， 由多角体蛋白启动子来控制。

所产生的嵌合蛋白用具有抗免疫球蛋白的抗体或Ig结合蛋白和/ 或与免疫球蛋白结合结构域结合的任何其它蛋白的亲和柱来纯化，所 述Ig结合蛋白例如用于免疫球蛋白重链恒定区的A蛋白和用于免疫球 蛋白κ轻链可变区的L蛋白。

本发明也考虑了将所述嵌合蛋白与载体蛋白例如匙孔血蓝蛋 白(KLH)共价偶联。本发明的组合物也可以与细胞因子例如粒细胞-巨 噬细胞-CSF(GM-CSF)或趋化因子例如单核细胞趋化蛋白3(MCP3)一 起给予患者。因为含有嵌合蛋白的本发明组合物与来自具有T细胞介 导病理的患者T细胞的特定TCR特异性相关，所以给予这种组合物诱 发针对涉及特定Vα或Vβ区段的疾病特异性独特型的免疫应答。同样， 针对涉及使用TCR V区区段(例如Vα或Vβ区段)有限组成部分的T细 胞的自身免疫病相关T细胞的应答。因此，给予本发明组合物改变患 者的T细胞介导病理和/或自身免疫病。本发明组合物的给药途径包括 但不限于口服给药、吸入给药、注射给药、经皮给药等。

本文提及的所有美国专利和申请；外国专利和申请；科学论文； 书籍；和出版物，包括任何附图和图表，都通过引用全部结合到本文 中，如同全文叙述一样。

                         附图简述

图1：用于生产组合物的总流程，所述组合物包含来自具有T细 胞介导病理的患者T细胞的特定TCR Vα或Vβ链的嵌合蛋白。

图2：具有多克隆位点的杆状病毒表达载体p2Bac的质粒图谱。

图3：杆状病毒表达载体p2Bac的DNA序列(SEQ ID NO：5)。该序 列从5’至3’描述。p2Bac载体含有AcNPV多角体蛋白基因启动子 (GenBank登记号X06637的核苷酸1-120(SEQ ID NO：44))和AcMNPV p10启动子(GenBank登记号A28889的核苷酸8-237(SEQ ID NO：45))。

图4：质粒pTRABac/9F12的DNA序列。该质粒含有由稳定的人 细胞系9F12表达的重链和轻链(κ)的基因(SEQ ID NO：41)。9F12细胞 系产生对破伤风类毒素特异性的人IgG1/κ抗体。下划线区分别代表编 码成熟9F12 IgG1(TTTACCC....)和κ(ATCGACA...)链的序列。该序列 从5’至3’描述。

图5a：使用IgGγ1和κ恒定区的重组杆状病毒表达载体 pTRABacHuLCκHCγ1的质粒图谱。

图5b：具有IgGγ1和λ恒定区的重组杆状病毒表达载体 pTRABacHuLCλHCγ1的质粒图谱。

图6A：pTRABacHuLCκHCγ1的DNA序列(SEQ ID NO：6)。该序列 从5’至3’描述。

图6B：pTRABacHuLCλHCγ1的DNA序列(SEQ ID NO：7)。该序列 从5’至3’描述。

图6C：利用κstuff引物修饰后的pTRABacHuLCκHCγ1的DNA序 列(SEQ ID NO：42)。该序列从5’至3’描述。

图6D：利用λstuff引物修饰后的pTRABacHuLCλHCγ1的DNA序 列(SEQ ID NO：43)。该序列从5’至3’描述。

图7：TCR α链和β链的代表性蛋白质序列。两种序列的恒定区以 下划线标注，所述免疫球蛋白折叠的第一个半胱氨酸残基以双下划线 标注(SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25)。

图8a：使用IgGγ1和κ恒定区的重组杆状病毒表达载体 pTRABacHuLCκHCγ1的质粒图谱，显示了Vα和Vβ区的插入位点。

图8b：具有IgGγ1和λ恒定区的重组杆状病毒表达载体 pTRABacHuLCλHCγ1的质粒图谱，显示了Vα和Vβ区的插入位点。

图9：用TCR Vβ-Ig嵌合蛋白制剂治疗带有肿瘤的小鼠。

                 优选实施方案的详细描述

在本发明中，改变了免疫系统的独特特异性，以治疗T细胞恶性 肿瘤和T细胞病理。在本发明中，用来源于每个独特TCR V基因家族 5’端的引物和一种TCR恒定区引物，克隆编码所述T细胞受体可变区 的DNA序列。通常，这种方法采用几种合适的克隆技术之一，例如 PCR。用这些TCR恒定区引物、一种α链引物和一种β链引物，来克隆 所述可变区，以产生由Vα或Vβ加上IgG1恒定区构成的嵌合蛋白。另 外，本领域技术人员能够选择若干可以同等用于该系统以产生同等结 果的不同的引物，来扩增任何一对抗体可变区，以便于亚克隆。另一 方面，可以使用例如5’RACE的技术，来克隆所述TCR链的可变区， 作为生产嵌合蛋白中的一个步骤。

用杆状病毒载体，在昆虫细胞中生产这种嵌合蛋白。所产生的无 全部完整的Cα或Cβ区的这些嵌合蛋白可区别于存在完整α或β链的嵌 合TCR/Ig分子。例如，这些嵌合蛋白不被针对所述TCR可变区的某 些构象特异性抗体例如抗小鼠Vβ6(克隆RR4-7)和抗小鼠Vβ12(克隆 MR 11-1)(PharMingen，San Diego，Ca.)所识别。预测这些独特的嵌合蛋 白是供疫苗接种用的优良抗原，因为可能使治疗复杂的正常决定簇不 被呈递而引发免疫反应。另外，先前在生产可溶性TCR嵌合蛋白方面 的尝试针对采用所述TCR天然构象以便允许与合适的肽/MHC复合体 结合的蛋白质。    

本发明满足了对T细胞介导病理和自身免疫病的有效疗法的迫切 要求。本发明利用参与T细胞病理的T细胞表面存在的特有细胞表面 抗原(独特型)。为此，需要以患者特异性方式制备疫苗。这类疫苗提 供根据在特定患者中发现的致病性T细胞所特有的标记而定制的敏锐 的选择性。

为了使本发明适合于特定的患者，首先需要鉴定和分离所述特有 抗原，然后需要生产那些抗原的方法。可以用本领域技术人员可利用 的多种不同方式来达到生产这些抗原。例如，适合于本发明需要的一 种新开发的方法，利用一种新型杆状病毒/昆虫细胞表达系统，并且最 近开发用于有效地生产供免疫治疗用的功能性抗体(参见美国临时申 请顺序号60/244,722，题为“Expression Vectors for Production of Recombinant Immunoglobulin”)。设计这种杆状病毒表达载体，使得仅 需要两种定制的基因特异性引物来扩增任何一对抗体可变区，以便容 易地亚克隆并作为具有人κ轻链或IgG1重链的嵌合蛋白表达。加入将 重链和轻链引向分泌途径的异源分泌信号序列，以便从昆虫细胞表达 大量活性免疫球蛋白。这种载体应该可用于表达与人κ恒定区符合读框 并且通过人胎盘碱性磷酸酶分泌信号序列分泌的任何κ轻链可变区 (VL)；和与人IgG1恒定区符合读框、前接蜜蜂蜂毒肽分泌信号序列的 任何重链可变区(VH)。得自单克隆细胞系、或者通过噬菌体展示克隆 鉴定的任何小鼠或人单克隆抗体，在两个简单的亚克隆步骤后，可以 容易地作为完整人IgG1/κ或IgG1/λ在该载体中表达。

在本发明中，设计这种杆状病毒表达载体，使得仅需要两种定制 的基因特异性引物来扩增任何一对TCR可变区，以便容易地亚克隆并 作为融合的Vα链、接头和IgG1重链表达。加入将Vα和Vβ链引向分泌 途径的异源分泌信号序列，允许从昆虫细胞表达大量的嵌合蛋白。这 种载体应该可用于表达与Ig κ恒定区符合读框并且通过人胎盘碱性磷 酸酶分泌信号序列分泌的任何TCR α链可变区(Vα)；和与IgG1恒定区 符合读框并且通过蜜蜂蜂毒肽分泌信号序列分泌的任何TCR β链可变 区(Vβ)，或者反之亦然。

使用所述杆状病毒系统表达重组蛋白，允许生产大量的生物活性 蛋白，而没有与在细菌中制备的蛋白相关的许多缺点，也避免了使用 哺乳动物细胞的复杂情况。例如，使用市售的杆状病毒单启动子载体 (pVL1392)或双启动子载体(pAcUW51)(这两种载体在商业上都可以得 自BD-Pharmingen)，用无血清培养基，生产或者作为单体β链，或者作 为异二聚体αβ对的大鼠分泌型TCR链。在ELISA中，用抗Cβ恒定区 捕获抗体(R73，Pharmingen)和抗Vβ检测抗体(R78；抗大鼠Vβ8.2或HIS 42；抗大鼠Vβ16，Pharmingen)，可以检测这些链的存在。生产水平测 定为大约300ng/ml。所述TCR链被制备，并以天然构象分泌，所述α 链和β链形成稳定的二硫键连接的异二聚体(Gold等，1997，参见上 文)。

含有特定V区段的特异性表位的可溶性人TCR片段，可以通过 基因工程在昆虫宿主细胞中生产。含有来源于一位患者的特定Vα和/ 或Vβ链的这些可溶性重组TCR蛋白，可以作为治疗组合物使用。当 将其给予所述患者时，它在体内将特异性地诱发细胞介导免疫应答， 以改变所述T细胞介导病理。

这种技术也已经应用于快速鉴定和克隆由B细胞淋巴瘤表达的患 者特异性VH和VL基因，然后将这些基因作为重组IgG1/κ或λ分子在昆 虫细胞中表达(参见美国临时申请顺序号60/224,723，题为“Method for Producing Idiotype-Vaccine”)。可以配制并且使用以这种方法生产的分 子来以患者特异性方式诱发针对淋巴瘤的抗独特型细胞介导免疫。

术语“改变”是指本发明的化合物调节T细胞介导病理的能力。 改变T细胞病理的化合物可以通过多种可能的机制做到这一点，包括 产生针对所述化合物的抗体应答，所述抗体应答进而破坏所述T细胞 病理的细胞、诱导所述T细胞病理的细胞凋亡、抑制所述T细胞病理 的细胞进一步生长和分裂、诱发针对所述T细胞病理的细胞的细胞介 导免疫或者抑制病理性T细胞的活性。引起所述改变的实际机制尚有 待确定，但是在给予本发明的分子或组合物后，通过某种机制发生所 述T细胞介导病理的改变。

术语“T细胞介导病理”或“T细胞病理”是指由于T细胞的不 当复制或活性而引起的那些疾病和病症。在优选实施方案中，用本发 明来治疗作为由于T细胞不当复制引起的T细胞淋巴瘤的T细胞介导 病理。T细胞淋巴瘤用目前可利用的医学方法难以有效地治疗。涉及T 细胞不当复制的其它类型的T细胞病理包括慢性和急性T细胞白血病 以及蕈样真菌病。其它优选实施方案包括越来越多的被分类为自身免 疫病的人类疾病，在自身免疫病中宿主自身的免疫系统攻击宿主自身 组织，例如类风湿性关节炎(RA)、重症肌无力(MG)、多发性硬化(MS)、 系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)、Graves 病、炎性肠病、自身免疫性眼色素层视网膜炎、多肌炎和某些类型的 糖尿病。本发明对于这些自身免疫病的治疗并不治愈所述疾病，而是 仅治疗症状。

术语“T细胞”是指生物体免疫系统中参与生物体正常功能中的 细胞介导免疫的细胞(即没有经历T细胞介导病理的T细胞)。

术语“病理”是指被医学会会员认为异常的生物体(例如人类)的 一种状态。待用本发明治疗的病理的特征为T细胞功能或复制异常。

术语“患者”是指需要治疗病理、或更具体地讲治疗T细胞病理 的生物体。该术语是指在临床水平上表现出一种或多种特定症状、表 明需要用治疗药治疗的活的受治疗者。所述治疗可以或者被医学会普 遍接受，或者可能是实验性的。在优选实施方案中，所述患者是一种 哺乳动物，包括诸如狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠和小鼠 的动物。在其它优选实施方案中，所述患者是人类。患者的诊断可能 在疾病发展过程中自发改变，或者在治疗方案或治疗过程中改变。

“生物体”可以是单细胞生物体或者是多细胞生物体。该术语包 括哺乳动物，最优选是人类。优选的生物体包括小鼠，因为治疗或诊 断小鼠的能力通常预示着在其它生物体例如人类中发挥作用的能力。 其它优选生物体包括灵长类，因为治疗或诊断灵长类的能力通常预示 着在其它生物体例如人类中发挥作用的能力。

术语“嵌合蛋白”是指包含含有来源于至少两种不同蛋白的区段 的单一多肽链的蛋白。嵌合蛋白的区段一定来源于异种蛋白，亦即嵌 合多肽的所有区段不是来自同一种蛋白。本发明的嵌合蛋白包括包含 TCRα或β链的部分、但不包括所述α或β链的完整恒定区的蛋白质。

术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。

术语“区段”或“部分”用来指来源于用作所述嵌合蛋白来源的 蛋白的氨基酸序列、其长度小于所来源的全长多肽的一种多肽。在优 选实施方案中，所述区段至少长约10、15、20、21、22、30、40、70、 100、150、300或450个氨基酸。人们会理解，这类区段可能保留天 然多肽的一种或多种特征。这类保留的特征的实例包括：与对天然多 肽或其表位特异性的抗体结合。

术语“天然的”是指从自然界分离出的蛋白。因此，天然存在的 蛋白可以指在自然界中发现的蛋白。天然蛋白可以指可能在自然界中 存在或合成的蛋白。这些术语也适用于由生物系统(例如本发明的杆状 病毒系统)或者由患者样品的细胞培养物所生产的蛋白。天然蛋白也可 以指未经变性的分离的蛋白。术语“天然”也可以指单独的或者与其 它多肽结合的多肽或蛋白折叠、使得它类似自然界中存在的相似蛋白 的方式，或者它在翻译后经修饰(“翻译后修饰”)而使得它类似自然 界中存在的相似蛋白的方式。存在的唯一天然存在的蛋白可能仅见于 得自一位患者的病理T细胞，然而，这被认为是天然存在的蛋白。

术语“Vα”和“Vβ”是指所述TCR多肽链的可变区或者编码这 类多肽链的核酸的可变区。本领域技术人员理解这些术语的含义。可 变区的实际序列不可预测，必须通过分离出所述序列来测定。然而， 已经鉴定并表征了来自TCR基因可变区的多个亚家族(参见以下综 述：Arden等，Immunogenetics，1995，42：455-500，Arden等， Immunogenetics，1995，42：501-530，和Clark等，Immunogenetics，1995， 42：531-540)。这些Vα和Vβ区中的任何区都可以用于本发明。α链的实 际序列通过TCRα链基因座的V区、J区和恒定区的克隆重排来测定。 β链的实际序列通过TCR β链基因座的V区、D区、J区和恒定区的克 隆重排来测定。术语“Vα”和“Vβ”也指Vα或Vβ链的部分或区段。 Vα或Vβ链的区段可以包括所述V区的至少约30个氨基酸。Vα或Vβ 链的区段也可以包括全部或基本上全部的所述V区。术语“基本上全 部”可以指完整可变区的大约90％或者完整可变区的大约80％。术语 Vα”和“Vβ”也指如下所述的这类多肽链的功能衍生物。术语“完整 的Vα链”是指α链的所有可变区。术语“完整的Vβ链”是指β链的所 有可变区。

术语“接头区”或“接头”是指连接编码可变区的序列和编码免 疫球蛋白恒定区分子所述部分的序列的DNA区段。接头序列可以是合 成序列，以便于方便地克隆，或者它可以是TCR Cα或Cβ的一部分。 在这两种情况下，接头区都不破坏本发明嵌合蛋白中所述可变区的部 分和所述免疫球蛋白恒定区的部分之间的读框。术语“接头区”也包 括由接头区DNA序列编码的氨基酸序列。术语“合成的接头区”或“合 成接头”是指得自非T细胞受体基因或免疫球蛋白基因来源的接头 区。在优选实施方案中，所述合成接头由研究人员设计并且在体外合 成。合成接头将包含不破坏嵌合蛋白中所述T细胞受体和免疫球蛋白 基因部分的可读框的序列。如果接头区包含TCR Cα或Cβ的一部分， 则它可以包含所恒定区起点和所述免疫球蛋白折叠的第一个半胱氨酸 残基之间的某些或全部的氨基酸。

术语“Cα”和“Cβ”是指所述TCR多肽链的恒定区或者编码这 类多肽链的核酸。本领域技术人员理解这些术语的含义。当在本发明 中涉及恒定区时，术语“区段”或“部分”不包括所述TCR的全部恒 定区，而是可以包括大约3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、 26或30个相连氨基酸残基。在接头区中可以存在任何整数的密码子， 包括1至约30之间且包括1和30的任何整数。在其它优选实施方案 中，可以存在所述TCR恒定区的至多约80％的氨基酸。所述区段可以 包括直到免疫球蛋白折叠的第一个半胱氨酸的Cα链的前22个氨基酸 中的全部或部分氨基酸。在图8中显示了具有所标注的免疫球蛋白折 叠的第一个半胱氨酸的人TCR α链的一种代表性序列。所述区段可以 包括直到免疫球蛋白折叠的第一个半胱氨酸的Cβ链的前30个氨基酸 中的全部或部分氨基酸。在图8中显示了具有所标注的免疫球蛋白折 叠的第一个半胱氨酸的人TCR β链的一种代表性序列。术语“Cα”和 “Cβ”也指如下所述的这类多肽链的功能衍生物。

术语“TCR”或“T细胞受体”是指一种在T细胞表面发现的、 包含两个多肽链-α链和β链的多肽。术语“TCR”或“T细胞受体” 也可以指编码这类多肽链的核酸。由于免疫系统的正常发育，由于 DNA重排操作，TCR显示出相当大的序列多样性，例如Bell等所述 (Bell等，1995，T Cell Receptors，Oxford University Press，Oxford)。特定 TCR的实际序列不可预测，必须通过对所述TCR的编码核酸或蛋白质 测序来测定。TCR的任何可能序列都可以用于本发明中。

术语“免疫球蛋白恒定区”是指免疫球蛋白分子中不由免疫球蛋 白可变区编码的所有部分或其一部分。术语“免疫球蛋白恒定区”也 可以指编码免疫球蛋白恒定区的DNA序列。免疫球蛋白恒定区包括区 段CL、CH1、CH2、CH3和铰链区。免疫球蛋白的类型包括IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重链以及κ或λ轻链或 者它们的区段。在优选实施方案中，重链和轻链恒定区来源于9F12 细胞。任何来源的任何免疫球蛋白恒定区的区段都可以用于本发明 中，条件是所述区段允许例如通过与G蛋白、A蛋白、L蛋白或合适 的抗体结合，来亲和纯化所述嵌合分子。也可以使用如下所述的免疫 球蛋白恒定区区段的功能衍生物。

术语“免疫球蛋白折叠”或“免疫球蛋白结构域”是指免疫球蛋 白超家族的一种结构元件。免疫球蛋白结构域是大约110个氨基酸的 保守的重复结构域。对于每种结构域，一般而言，有7个反平行β链， 分别以4条链和3条链的两个片层排列，并且有一个链内二硫键，形 成一个大约60个氨基酸的环。两个片层一般面对面，使得疏水性氨基 酸面向内，而亲水性氨基酸面向外。

免疫球蛋白结构域存在于许多蛋白分子中，包括抗体、T细胞抗 原受体、细胞因子受体(例如具有5个Ig结构域的血小板衍生生长因子 受体)、细胞粘着分子(例如ICAM-1/CD54)和许多其它蛋白分子。在 TCR的每条链中发现两个免疫球蛋白结构域；一个在可变区中，一个 在恒定区中。在抗体轻链中发现两个免疫球蛋白结构域，而在IgG重 链中发现4个免疫球蛋白结构域。

术语“kappa恒定区”、“lamda恒定区”、“κ恒定区”和“λ 恒定区”是指在免疫系统发育期间保持恒定的kappa(κ)和lambda(λ) 轻链的恒定区。所述术语可以指所述蛋白的DNA序列或氨基酸序列。 在某些实施方案中，免疫球蛋白轻链可以包含在含有来自一种或多种 其它蛋白的氨基酸的嵌合蛋白中。

术语“IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、 IgE”是指人免疫球蛋白的类别和亚类。所述术语可以指所述蛋白的 DNA序列或者氨基酸序列。免疫球蛋白分子的类别和亚类由其重链决 定。例如，IgG和IgD是不同类别的免疫球蛋白；IgG1和IgG2是不同 亚类的免疫球蛋白分子。术语“IgA”可以指任何亚类的IgA分子。在 优选实施方案中，它是指IgA1分子。在其它优选实施方案中，它是指 IgA2分子。在某些实施方案中，所用的免疫球蛋白重链可以是含有来 自第二种蛋白的氨基酸的嵌合蛋白。

术语“IgGγ1”是指与IgG1类免疫球蛋白相关的重链。IgG1代表大 约66％的人IgG免疫球蛋白(Roitt等，Immunology，Mosby，St.Louis， 1993，第4.2页)。

术语“给予”涉及使化合物与生物体的细胞或组织接触的方法。 所述T细胞介导病理可以在所述生物体的细胞或组织存在于所述生物 体内或生物体外时得到预防或治疗。存在于生物体之外的细胞可以在 细胞培养皿中保持或生长。对于在生物体体内含有的细胞，本领域中 有许多技术可给予化合物，包括(但不限于)口服、胃肠外给药、皮肤 应用、注射和气雾剂应用。然后可以监测给予化合物对生物体功能的 效应。所述生物体最好是小鼠、大鼠、兔、豚鼠或山羊，更优选是猴 或猿猴，最优选是人类。

术语“组合物”是指含有感兴趣蛋白的混合物。在优选实施方案 中，所述组合物可以含有额外的组分，例如佐剂、稳定剂、赋形剂等。

涉及可变区与T细胞克隆相关时的术语“与…相关”，是指在由 特定T细胞克隆所产生的免疫球蛋白上发现的可变区。

术语“T细胞克隆”是指单个T细胞的克隆后代。T细胞的克隆 后代在所产生的TCR中表达与亲代细胞相同的独特型。本领域技术人 员会认识到，一个T细胞的克隆后代可能经历了TCR基因内的体细胞 突变，但仍保留所述T细胞克隆的部分。

术语“分离”是指将天然存在的核酸序列从其正常细胞环境中取 出。因此，所述序列可以在无细胞溶液中，或者被置于不同的细胞环 境中。该术语不是暗示所述序列是存在的唯一核苷酸链，而是它基本 上无(纯度至少为大约90-95％)与其天然相连的非核苷酸物质，因此不 同于分离的染色体。此外，在提及核酸时利用术语“分离”是指特定 的DNA或RNA序列在感兴趣的溶液中存在的总DNA或RNA中所占 的比率被增加至显著高于(2-5倍)在从中取出所述序列的细胞中所占的 比率。人们可以通过优先降低所存在的其它DNA或RNA的量，或者 通过优先增加所述特定DNA或RNA序列的量，或者通过这两种方法 的组合，做到这一点。然而，应该注意到，富集的不是暗示不存在其 它DNA或RNA序列，而仅仅是感兴趣序列的相对量被显著增加了。 术语“显著的”用来指对于制造这种增加的人而言，增加的水平是有 效的，一般是指相对于其它核酸而言增加至大约至少2倍，更优选至 少5-10倍或甚至更高。该术语也不是暗示没有来自其它来源的DNA 或RNA。来自其它来源的DNA可能例如包含来自酵母或细菌基因组 的DNA，或者克隆载体例如pUC19。该术语不同于天然发生的事件， 例如病毒感染或肿瘤型生长，在后两者中，一种mRNA的水平可能相 对于其它种类的mRNA被自然地增加。也就是说，该术语是指仅包括 人类干涉从而提高所需核酸比例的那些情况。

分离的DNA序列比自然环境中相对更纯(该水平应该至少2-5倍 于天然水平，例如以mg/ml计)。通过PCR获得的各种序列可以被纯 化至电泳均一性。通过这种PCR反应获得的DNA分子可以得自总 DNA或者得自总RNA。这些DNA序列不是天然存在的，而是优选通 过对部分纯化的天然存在的物质(例如信使RNA(mRNA))的操作而获 得的。例如，从mRNA构建cDNA文库涉及构建合成物质(cDNA)， 可以通过从携带所述cDNA文库的细胞中克隆选择，可以从所述合成 文库中分离出单个纯cDNA克隆。包括从mRNA构建cDNA文库和分 离不同的cDNA克隆的该方法，导致天然信息的大约106倍纯化。因 而，特别考虑了至少一个数量级、优选两个或三个数量级、更优选四 个或五个数量级的纯化。

术语“编码…的基因”是指编码感兴趣蛋白或多肽的核酸序列。 所述核酸序列可以或者是DNA分子或者是RNA分子。在优选实施方 案中，所述分子是一种DNA分子。在其它优选实施方案中，所述分子 是一种RNA分子。当作为RNA分子存在时，它将包括指导宿主细胞 的核糖体开始翻译(例如起始密码子ATG)和指导核糖体结束翻译(例如 终止密码子)的序列。在起始密码子和终止密码子之间是一个可读框 (ORF)。本领域技术人员非常熟悉这些术语的含义。

术语“昆虫细胞系”是指来源于昆虫并且对杆状病毒感染敏感的 细胞系。本领域技术人员熟悉这类细胞系和利用所述细胞系所需的技 术。昆虫细胞系的代表性实例包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda) (sf9)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(Hi-5)细胞系。

术语“粉纹夜蛾(High-5)细胞”和“草地贪夜蛾(sf9)细胞”是指与 杆状病毒表达载体结合使用的昆虫细胞系。本领域技术人员熟悉这些 细胞系和获得它们的方法。

术语“佐剂”是指当人们试图在动物体内产生对所选抗原或免疫 原(例如需要免疫应答针对的蛋白或多肽)的免疫应答时，与所选抗原 或免疫原一起提供、以增强所述免疫应答的物质。本领域技术人员熟 悉合适佐剂的选择和使用。批准用于人类的佐剂包括铝盐和MF59 (Singh和O’Hagan，Nature Biotech 17：1075-81，1999)。其它佐剂正在开 发之中(出处同上)，可以结合本发明使用。

术语“匙孔血蓝蛋白”是指从匙孔(keyhole limpet)分离的、 在免疫方法中通常用作载体蛋白的一种蛋白。本领域技术人员熟悉术 语匙孔血蓝蛋白的含义。

术语“细胞因子”是指主要从白细胞中分泌的生长因子家族，通 常是可溶性(糖)蛋白。细胞因子刺激体液免疫应答和细胞免疫应答以 及激活吞噬细胞。细胞因子不仅由免疫系统内的各种细胞类型合成、 贮存和转运(淋巴因子、白介素、单核因子、肿瘤坏死因子、干扰素)， 而且也由与血液学(产生集落刺激因子)、肿瘤学(产生转化生长因子) 和细胞生物学(产生肽类生长因子、热激蛋白和其它应激蛋白)研究相 关的其它细胞合成、贮存和转运。

从淋巴细胞分泌的细胞因子被称为淋巴因子，而由单核细胞或巨 噬细胞分泌的细胞因子被称为单核因子。许多淋巴因子也被称为白介 素(IL)，因为它们不仅由白细胞分泌，而且它们也能够影响白细胞的细 胞应答。具体地说，白介素作为靶向造血来源细胞的生长因子起作用。

术语“生长因子”是指结合细胞表面上的受体并且随后激活细胞 增殖和/或分化的蛋白质。许多生长因子是相当通用的，可以用来刺激 各种各样细胞类型进行细胞分裂，而其它生长因子对特定的细胞类型 是特异性的。

术语“趋化因子”是指一类小的促炎细胞因子，它们作为白细胞 的化学引诱剂和激活物起作用，代表一个超过30种趋化细胞因子的超 家族。它们使来自血液或骨髓的免疫系统细胞活化和迁移至感染部分 和受伤组织协调进行(orchestrate)。趋化因子在骨髓中存在并且进而发 育为成熟免疫细胞的原始干细胞的生长和增殖中也起重要作用。它们 参与各种各样的急性和炎性疾病，并且主要通过与七跨膜螺旋类受体 结合而发挥其作用。

趋化因子的分子量通常在8-11kDa之间变动，在1-100ng/ml的 浓度范围内有活性，由各种各样的细胞类型产生。趋化因子的产生通 常由外源性刺激物和内源性介质例如IL-1、TNF-α和PDGF诱导。趋 化因子与特定的细胞表面受体结合，可以被认为是看来不如一级促炎 细胞因子多效的二级细胞因子，因为它们不是其它细胞因子的有效诱 导物，并且在炎症和修复方面表现出更加专化的功能。

术语“粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子”或“GM-CSF”是指小的 (小于20 kDa)的分泌型蛋白。它与特定的细胞表面受体结合，起骨髓 细胞的种特异性刺激物的作用。它刺激若干造血细胞谱系(包括树突细 胞、粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和红细胞)的生长和分化。特别 是，这种细胞因子也通过增加T细胞增殖(Santoli等，J.Immunol.1988， 141(2)：519-26)、增加粒细胞和单核细胞上粘着分子的表达(Young等，J. Immunol.1990，145(2)：607-15；Grabstein等，Science 1986，232(4749)： 506-08)和增强抗原呈递(Morrissey等，J.Immunol，1987，139(4)：1113-9； Heufler等，J.Exp.Med.1988，167(2)：700-05；Smith等，J.Immunol.1990， 144(5)：1777-82)，在使细胞免疫定型方面起作用。

术语“单核细胞趋化蛋白-3”或“MCP-3”是指一种主要由单核 细胞产生的趋化因子。MCP-3具有广谱的趋化活性，吸引单核细胞、 树突细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞 和嗜中性粒细胞。Minty等，Eur Cytokine Netw 4(2)：99-110，1993以及 Opdenakker等，Biochem Biophys Res Commun.，191(2)：535-42，1993于 1993年克隆了所述cDNA。最近Proost等，J.Leukoc Biol.59(1)：67-74， 1996综述了其特性。

术语“表达载体”是指一种设计用来在表达载体中正确插入所选 感兴趣基因时表达所述基因(通常为一种蛋白质)的重组DNA构建体。 本领域技术人员了解该术语。表达载体通常在插入感兴趣基因的位点 的5’端包括一个启动子，而在所述位点的3’端包括一个终止子区。通 常，利用所选的限制性酶切位点将感兴趣的基因插入适当的位点。术 语“表达载体”也指已经插入了编码感兴趣产物的感兴趣基因的诸如 上述的DNA构建体。

术语“杆状病毒表达载体”是指在用于所述杆状病毒系统时设计 用来表达所选基因的DNA构建体。设计在所述杆状病毒系统中发挥作 用的任何潜在的杆状病毒或表达载体都可以用于本发明。同样，术语 “表达载体”是一类包括杆状病毒表达载体具体实施方案的表达载 体，但“表达载体”可以除了可以在昆虫细胞系中起作用外，还可以 在昆虫细胞系之外的细胞和细胞系中起作用。

术语“允许…表达”是指将表达载体置于所述感兴趣基因将在其 中表达的环境中。这通常是指将所述表达载体插入到合适的细胞类型 中，其中宿主细胞组分将识别所述启动子和基因表达所必需的其它 区，并且将引起感兴趣基因的表达。所述表达通常包括两个步骤：转 录和翻译。表达也可以用得自细胞的组分而在体外进行。本领域技术 人员熟悉这些技术，这些技术在Sambrook等(Sambrook，Fritsch，和 Maniatis，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)中有叙述。在优选实施方案中，表达产物是一 种蛋白质或多肽。在其它优选实施方案中，表达产物是Vβ/IgGγ1、 Vβ/Cκ、Vβ/Cλ、Vα/Cκ、Vα/Cλ或Vα/IgGγ1。

术语“分泌信号序列”是指一种肽序列。当该序列被符合读框地 翻译为与所选多肽的氨基末端连接的肽时，所述分泌信号序列将通过 与宿主细胞的机器相互作用，而引起所选多肽被分泌。作为分泌过程 的一部分，这种分泌信号序列将被切除，在被输出后仅留下感兴趣的 多肽。在优选实施方案中，使用蜜蜂蜂毒肽分泌信号序列。在其它优 选实施方案中，使用人胎盘碱性磷酸酶分泌信号序列。在另外的优选 实施方案中，使用与来源于特定患者的免疫球蛋白基因相关的内源性 分泌序列。然而，本发明不受这些分泌信号序列的限制，可以用本领 域技术人员熟知的其它分泌信号序列取代这些分泌信号序列，或除此 之外可以使用本领域技术人员熟知的其它分泌信号序列。术语“分泌 信号序列”也指编码所述分泌肽的核酸序列。

术语“ELISA”是指“酶联免疫吸附测定”，其中通过使蛋白与 ELISA板的塑料孔结合、然后用该蛋白特异性的抗体检测进行蛋白定 量或鉴定，来确定蛋白的存在或浓度。

术语“启动子控制”是指表达载体中DNA的布置，其中启动子 被置于感兴趣基因的5’，使得从所述DNA序列转录出mRNA分子。 这种mRNA分子然后由宿主细胞机器进行翻译。本领域技术人员非常 熟悉这一术语的含义。

术语“A蛋白”、“G蛋白”和“L蛋白”是指能够特异性结合 免疫球蛋白分子而不与抗原结合位点相互作用的特定细菌蛋白。A蛋 白是一种从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中分离的、结合免 疫球蛋白分子Fc区的多肽。G蛋白是一种从人G组链球菌菌株(G148) 中分离的对免疫球蛋白G(IgG)具有亲和性的细菌细胞壁蛋白。L蛋白 是一种由厌氧细菌种大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)的某些 菌株表达的免疫球蛋白轻链结合蛋白。

术语“分离”当指蛋白或多肽时，是指将天然存在的多肽或蛋白 质从其正常细胞环境中取出，或者是指将在表达系统(例如本文所述的 杆状病毒系统)中合成的多肽或蛋白质从所述表达系统的其它组分中 取出。因此，所述序列可以在无细胞溶液中，或者被置于不同的细胞 环境中。该术语不是暗示所述序列是存在的唯一氨基酸链，而是它基 本上无(纯度至少大约90-95％)与其天然相连的基于非氨基酸的物质。

当提及多肽时，利用术语“富集的”意指所述特定的氨基酸序列 在感兴趣的细胞或溶液中，在所存在的总氨基酸序列中所占的比率比 在正常细胞或患病细胞或者在所述序列从中取出的细胞中所占的比率 大得多(2-5倍)。人们可以通过优先降低所存在的其它氨基酸序列的 量，或者通过优先增加所述特定感兴趣氨基酸序列的量，或者通过这 两种方法的组合，做到这一点。然而，应该注意到，富集的不是暗示 不存在其它氨基酸序列，而仅仅是感兴趣序列的相对量被显著增加 了。术语显著的在此用来指对于制造这种增加的人而言，增加的水平 是有效的，一般是指相对于其它氨基酸序列而言增加至大约至少2 倍，更优选至少5-10倍或甚至更高。该术语也不是暗示没有来自其它 来源的氨基酸序列。其它来源的氨基酸序列可能例如包含由酵母或细 菌基因组、或者克隆载体例如pUC19编码的氨基酸序列。在优选实施 方案中，所述氨基酸序列是一种上述嵌合蛋白。该术语意指仅包括人 类干涉以增加所需氨基酸序列比例的那些情况。

对于某些目的而言，氨基酸序列为纯化形式也是有利的。术语“纯 化的”当涉及多肽时，并不需要绝对纯(例如均一的制剂)；而是表明 所述序列与在天然环境中相比相对的纯。与天然水平相比，这一水平 应该至少为2-5倍(例如以mg/ml计)。特别考虑了至少一个数量级、优 选两个或三个数量级、更优选四个或五个数量级的纯化。所述物质最 好无功能上显著水平的污染，例如纯度为90％、95％或99％。

术语“在操作上连接的”是指这样的DNA布置，其中控制区(例 如启动子或增强子)与相连的感兴趣DNA基因连接，以便引起所述基 因转录，并因此允许其翻译。术语“在操作上连接的”也可以指编码 加工信号的DNA序列(例如分泌信号序列)与编码多肽的基因相连，形 成一个可读框。在转录和翻译后，分泌信号序列具有使已翻译的多肽 输出的潜力。本领域技术人员熟悉该术语的含义。 有用嵌合蛋白的功能衍生物

本文也提供本发明多肽或核酸的功能衍生物。所谓“功能衍生 物”是指本发明多肽或核酸的“化学衍生物”、“片段”或“变异体”， 下面有这些术语的定义。功能衍生物保留了所述蛋白的至少一部分功 能，例如与所述蛋白特异性的抗体的反应性、酶活性、或者通过非催 化结构域介导的结合活性，这使得可以按照本发明应用所述功能衍生 物。在本领域中众所周知，由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸 序列可以编码同一种氨基酸序列。同样，在本领域中也众所周知，可 以进行氨基酸的保守改变，以得到保留原始功能性的蛋白或多肽。在 这两种情况下，所有的变换都计划包括在本说明书中。

本发明范围内包括本文所述分离的核酸分子的功能等同物。遗传 密码的简并性允许某些密码子被决定同一氨基酸的其它密码子所取 代，并且因此可以得到同一种蛋白质。所述核酸序列可以有相当大的 改变，因为除甲硫氨酸和色氨酸之外，已知的氨基酸都可以由不止一 种密码子编码。因此，可以合成本发明基因的部分或全部，得到与自 然界中发现的序列显著不同的核酸序列。然而，其所编码的氨基酸序 列却将得以保存。

所述复合体的“化学衍生物”含有不是所述蛋白正常部分的额外 的化学部分。所述蛋白或肽的共价修饰包括在本发明范围内。如下所 述，这类修饰可以通过使所述肽的靶氨基酸残基与能够与所选侧链或 末端残基反应的有机衍生化剂反应，而被引入到所述分子中。最常使 半胱氨酰残基与α-卤代乙酸(和相应的胺)例如氯乙酸或氯乙酰胺反 应，得到羧甲基或羧酰氨基甲基衍生物。也通过与溴代三氟丙酮、氯 乙酰磷酸(chloroacetyl phosphate)、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶 基二硫、甲基·2-吡啶基二硫、对氯汞苯甲酸、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯 代-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑反应，使半胱氨酰残基衍生化。

组氨酰残基通过与焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下反应而衍生化， 因为这种试剂对组氨酰侧链具有相对特异性。对溴苯甲酰甲基溴也是 有用的；该反应最好在0.1M二甲基胂酸钠中于pH6.0下进行。

使赖氨酰残基和氨基末端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。用 这些试剂衍生化有逆转赖氨酰残基电荷的作用。用于使含伯胺残基衍 生化的其它合适试剂包括：亚氨酸酯，例如吡啶甲亚氨酸甲酯(methyl picolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代硼氢化物 (chloroborohydride)、三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；和转氨 酶催化的与乙醛酸的反应。

精氨酰残基通过与一种或几种常规试剂反应而加以修饰，所述常 规试剂中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸 残基的衍生化要求反应在碱性条件下进行，因为胍官能团的pKa值 高。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及与精氨酸的α-氨基反应。

酪氨酰残基是用于通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应而 引入波谱标记的众所周知的修饰的靶。最常见的是，用N-乙酰咪唑和 四硝基甲烷来分别生成O-乙酰酪氨酰种类和3-硝基衍生物。

羧基侧链(天冬氨酰或谷氨酰)通过与碳二亚胺(R’-N-C-N-R’)例如 1-环己基-3-(2-吗啉基(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基 戊基)碳二亚胺反应而被选择性修饰。此外，通过与铵离子反应，使天 冬氨酰残基和谷氨酰残基转变为天冬酰胺酰残基和谷氨酰胺酰残基。

通常将谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为相应的 谷氨酰残基和天冬氨酰残基。或者，在温和的酸性条件下将这些残基 脱酰胺。任一种形式的这些残基都落入本发明范围内。

用双官能试剂衍生化是有用的，例如可用于使所述蛋白的组分肽 相互交联，或者与复合体中的其它蛋白交联、与水不溶性支持基质或 者与其它大分子载体交联。常用的交联剂包括例如1，1-双(重氮乙酰)- 2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide esters) 例如与4-叠氮水杨酸形成的酯、同双官能亚氨酸酯包括二琥珀酰亚胺 基酯例如3，3’-二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺基酯)和双官能马来酰亚胺例 如双-N-马来酰亚氨基-1，8-辛烷。衍生化试剂例如甲基-3-[对叠氮苯基] 二硫醇丙亚氨酸酯产生能够在光存在时形成交联的光敏中间体。或 者，用美国专利第3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537 和4,330,440号中所述的反应性水不溶性基质例如溴化氰活化的糖类 和反应性基质进行蛋白质的固定化。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰残基或苏氨酰残 基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化 (Creighton，T.E.，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H. Freeman & Co.，San Francisco，第79-86页，(1983))；N末端胺的乙酰化 以及在某些情况下C末端羧基的酰胺化。

这类衍生化部分可以改进稳定性、溶解性、吸收、生物半寿期等。 另一方面，所述部分可以消除或减弱所述蛋白复合体的任何不想要的 副作用等。能够介导这类效应的部分公开于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA (1990)。

氨基酸残基有缺失、插入和/或取代的蛋白质的功能衍生物可以用 本领域技术人员熟知的标准技术来制备。例如，所述功能衍生物的经 修饰组分可以用定点诱变技术(如Adelman等，1983，DNA 2：183所例举 的)来产生，其中采用例如如上所述的技术，对所述DNA编码序列中 的核苷酸进行修饰，使得经修饰的编码序列被修饰，此后在原核或真 核宿主细胞中表达这种重组DNA。或者，用本领域众所周知的方法， 通过直接化学合成，可以常规制备氨基酸有缺失、插入和/或取代的蛋 白质。所述蛋白质的功能衍生物通常表现出与天然蛋白质相同性质的 生物活性。

术语“片段”用来指来源于蛋白质的氨基酸序列的、其长度小于 其所来源的全长多肽的一种多肽。这样的片段可以例如通过蛋白酶剪 切所述全长蛋白质来产生。最好是，通过适当地修饰编码所述蛋白质 的DNA序列以便在所述天然序列的C末端、N末端和/或所述天然序 列内的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸，来重组获得所述片 段。人们会理解，这类片段可能保留天然蛋白或多肽的一个或多个特 征性部分、功能或特征。这类保留的特征的实例包括：催化活性；底 物专一性；与完整细胞中其它分子的相互作用；调节功能；或者与对 天然复合体或其表位特异性的抗体结合。

计划在本发明范围内的另一种功能衍生物是一种“变异型”多 肽，所述多肽相对于天然多肽而言或者缺乏一个或多个氨基酸，或者 含有额外的或取代的氨基酸。通过适当修饰所述蛋白质的DNA编码序 列以便在所述天然序列的C末端、N末端和/或所述天然序列内的一个 或多个位点加入、去除和/或修饰一个或多个氨基酸的密码子，可以从 天然存在的复合体组分衍生所述变异体。如上所述，人们理解，具有 加入的、取代的和/或额外的氨基酸的这类变异体保留了所述天然蛋白 的一个或多个特征性部分。

本发明的其它方面涉及本发明嵌合蛋白的应用。优选的应用包括 药物应用和兽医应用，其中将有效量的按照本发明的嵌合蛋白(最好以 按照本发明的组合物)给予患者。这样，所述嵌合蛋白接触患者的细 胞，所述接触此后诱发所需的生物应答。使用本发明嵌合蛋白的方法 包括在生物体内诱发免疫应答的方法、在生物体内产生抗体(B细胞免 疫应答)的方法、诱导生物体的T细胞免疫应答的方法以及治疗T细胞 病理的方法。本发明也包括通过给予本发明的嵌合蛋白治疗受治疗者 以便增强能够改变T细胞病理的免疫应答的方法。

通常，这些方法通过给予所述生物体有效量的按照本发明的嵌合 蛋白来完成。“有效量”是指导致诱发所需生物应答的量。这种量的 构成将所有变化，并且取决于各种各样的因素，包括具体的嵌合蛋白、 待诱发的所需生物应答、嵌合蛋白的制剂、待治疗生物体的年龄、体 重、性别和健康状况、给药方案、待治疗或预防的症症或疾病等。可 以给予本发明嵌合蛋白和组合物的生物体包括哺乳动物，最好是选自 牛、犬、马、猫、羊、猪和灵长类动物的哺乳动物。特别优选的生物 体是人类。

可以将本文所述的化合物本身给予人类患者，或者所述化合物可 以以其中与其它有效成分混合的药用组合物给予人类患者，或者以联 合疗法或者在合适的载体或赋形剂中给予人类患者。用于配制和给予 本申请化合物的技术可以在″Remington’s Pharmaceutical Sciences，″ Mack Publishing Co.，Eaton，PA，最新版中找到。 给药途径

合适的给药途径可以例如包括口服、直肠、经粘膜或肠溶给药； 胃肠外给药，包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射以及鞘内、直接室 内、腹膜内、鼻内或眼内注射。本领域技术人员会理解可以作出使组 合物适合于具体给药途径的各种改变。

另一方面，人们可以以局部方式而非系统性方式给予所述化合 物，例如通过将所述化合物通常以缓释制剂的形式直接注射到实体瘤 中。 组合物/制剂

本发明的药用组合物可以以本身已知的方法生产，例如借助常规 混合、溶解、制粒、制糖锭、研磨、乳化、包囊、包藏或冻干法生产。

因此，按照本发明使用的药用组合物可以以常规方式，采用一种 或多种生理上可接受的载体包括赋形剂和有助于将所述活性化合物加 工为可以药用的制剂的辅料来配制。合适的制剂取决于所选的给药途 径。

对于注射而言，本发明的药物可以配制到水溶液中，最好是配制 在生理上相容的缓冲液例如Hank氏溶液、Ringer氏溶液或者生理盐水 缓冲液中。对于经粘膜给药而言，在制剂中使用适于穿透所述屏障的 渗透剂。这类渗透剂是本领域众所周知的。

对于口服给药，可以通过将所述活性化合物与本领域熟知的药学 上可接受的载体混合，可以容易地配制所述化合物。这类载体使本发 明的化合物能够配制为可供待治疗患者口服摄入的片剂、丸剂、锭剂、 胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等。合适的载体包括 赋形剂，例如填充剂，诸如糖包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤 维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、 西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡 咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐例如藻酸钠。

给糖锭核心提供合适的包衣。为此，可以使用浓缩糖溶液，它可 以任选地含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波泊尔胶 (carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或 溶剂混合物。可以加入染料或色素至片剂或糖锭包衣中，以供标识或 鉴定活性化合物剂量的不同组合。

可以口服使用的药用制剂包括用明胶制备的锁口型胶囊以及用 明胶和增塑剂例如甘油或山梨醇制备的软密封胶囊。锁口型胶囊可以 含有与以下物质混合的所述有效成分：填充剂例如乳糖、粘合剂例如 淀粉、和/或润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁、和任选的稳定剂。在软胶 囊中，可以将所述活性化合物溶于或悬浮于合适的液体例如脂肪油、 液体石蜡或液态聚乙二醇中。另外，可以加入稳定剂。用于口服给药 的所有制剂都应该为适合于这类给药的剂量形式。

对于口腔含化给药，所述组合物可以采用以常规方式制备的片剂 或锭剂形式。

对于吸入给药，按照本发明使用的化合物可以以借助于合适的推 进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或 其它合适气体)，从加压包装或雾化器供给的气雾剂喷雾形式方便地给 药。就加压气雾剂而言，可以通过提供一个阀以给予一个计量量，来 确定剂量单位。可以配制含有所述化合物和合适粉剂基质(例如乳糖或 淀粉)的粉末混合物、供吸入器或吹入器用的例如明胶胶囊和药筒。

所述化合物可以配制用于通过注射胃肠外给药，例如通过大剂量 注射或连续输注给药。注射用制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿 或多剂量容器中，并且加入防腐剂。所述组合物可以采用诸如油性或 水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且可以含有配制剂 (formulatory agent)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

用于胃肠外给药的药用制剂包括水溶性形式的活性化合物的水 溶液。另外，所述活性化合物的混悬剂可以配制为适当的油性注射用 混悬剂。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油例如芝麻油、或合成脂 肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯、或者脂质体。含水注射用混悬剂可 以含有提高混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚 糖。混悬剂也可以任选地含有合适的稳定剂或提高所述化合物溶解度 以允许配制高浓缩溶液的药剂。

或者，所述有效成分可以为粉剂形式，以供在使用前用合适的 溶媒例如无菌无热原水重建。

除前述制剂外，所述化合物也可以配制为缓释制剂。这类长效制 剂可以通过植入(皮下植入或肌内植入)或者通过肌内注射给药。因 此，例如所述化合物可以用合适的聚合材料或疏水性材料(例如可接受 的油中的乳剂)或离子交换树脂或者作为微溶性衍生物(例如作为微溶 性盐)来配制。

本发明疏水性化合物的药用载体是一种包含苯甲醇、非极性表面 活性剂、水混溶性有机聚合物和水相的助溶剂体系。所述助溶剂体系 可以是VPD助溶剂体系。VPD是一种3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性 表面活性剂polysorbate 80和65％w/v聚乙二醇300、用无水乙醇定容 的溶液。VPD助溶剂体系(VPD：D5W)包含用5％葡萄糖水溶液以1∶1 稀释的VPD。这种助溶剂体系很好地溶解疏水性化合物，其自身在系 统给药时产生的毒性低。自然，助溶剂体系的比率在不破坏其溶解性 和毒性特征的情况下，可以有相当大的变化。此外，所述助溶剂组分 的身份可以改变：例如，可以使用其它低毒性非极性表面活性剂来代 替polysorbate 80；聚乙二醇的比率大小可以改变；其它生物相容性聚 合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；以及可以用其它糖或 多糖替代葡萄糖。

另一方面，可以使用疏水性药用化合物的其它给药系统。脂质体 和乳剂是众所周知用于疏水性药物的给药溶媒或载体的实例。某些有 机溶剂例如二甲基亚砜也可以使用，尽管通常以更大的毒性为代价。 另外，所述化合物可以用缓释系统来给药，例如含有所述治疗药的固 态疏水性聚合物的半透性基质。各种缓释材料已经很好地确立，并且 是本领域技术人员众所周知的。缓释胶囊可以根据其化学性质，在数 周至100天内释放所述化合物。根据所述治疗药的化学性质和生物稳 定剂，可以使用用于稳定蛋白质的其它策略。

所述药用组合物也可以包含合适的固相或凝胶相载体或赋形 剂。这类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、 淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。

本发明的许多化合物可以作为具有药学上相容的相反离子的盐 来提供。药学上相容的盐可以用许多酸来形成，所述酸包括但不限于 盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐在相应的 游离碱形式的水性溶剂或其它质子溶剂中往往更易溶解。 有效量

适用于本发明的药用组合物包括其中包含足以达到其计划目的 量的有效成分的组合物。更具体地讲，治疗有效量是指化合物有效预 防、减轻或缓解病症或延长所治疗的受治疗者的生存的量。治疗有效 量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供 的详细公开内容。

本文所述化合物的毒性和疗效可以用标准药学方法用细胞培养 物或实验动物来确定，例如确定LD50(使群体的50％致死的剂量)和 ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效的剂量比是治疗 指数，它可以以LD50和ED50之比来表示。优选表现出高治疗指数的 化合物。根据这些细胞培养物测定和动物研究获得的数据可以用来制 订人用的剂量范围。这类化合物的剂量最好在包括ED50但具有很低毒 性或无毒性的循环浓度范围内。所述剂量可以在该范围内变动，这取 决于所用的剂型和使用的给药途径。实际的制剂、给药途径和剂量可 以由各个医师根据患者的病症来选择(参见例如Fingl等，1975，″The Pharmacological Basis of Therapeutics，″第1章第1页)。

给药量和给药间隔可以单独进行调整，以提供足以保持所需效应 或提供最低有效浓度(MEC)的所述活性部分的血浆水平。MEC对于每 种化合物而言会有所变化。达到MEC所必需的剂量将取决于各个特 征和给药途径。然而，可以用HPLC测定或生物测定来测量血浆浓度。

给药间隔也可以用MEC值来确定。应该采用维持血浆水平在所 述时间的10-90％、优选30-90％、更优选50-90％内高于MEC的给药 方案，来给予化合物。

就局部给药或选择性吸收而言，所述药物的有效局部浓度可能与 血浆浓度不相关。

当然，组合物的给药量将取决于所治疗的受治疗者、受治疗者的 体重、疾患的严重程度、给药方式和主治医师的判断。 包装

如果需要，所述组合物可以在可以含有一个或多个单位剂型的包 装或分配装置中提供，所述单位剂型含有所述有效成分。所述包装可 以例如包含金属箔或塑料箔，例如泡罩片。所述包装或分配装置可以 附有给药说明。所述包装或分配器也可以附带与容器相连的、由管理 药物生产、使用或销售的政府机构规定形式的、反映出该机构批准所 述形式的多核苷酸给予人类或动物的通知。这类通知例如可以是美国 食品与药品管理局批准的处方药的标签，或者是批准的产品说明书。 也可以制备包含在相容药用载体中配制的本发明化合物的组合物，将 其置于合适的容器中，并且配有有关治疗所指明病症的标签。标签上 指明的合适病症可以包括治疗肿瘤、治疗类风湿性关节炎、治疗糖尿 病等。

                          实施例

在以下描述中，将参考免疫学、细胞生物学和分子生物学领域技 术人员已知的各种方法。叙述所参考的这类已知方法的出版物和其它 材料通过引用全部结合到本文中，如同全文叙述一样。 实施例1. 组织加工，以便进行T细胞淋巴瘤独特型(Id)的鉴定和克

     隆：

在无菌条件下按照临床指定的方法，对得自外周淋巴结的肿瘤样 品进行活组织检查，用所述样品产生患者独特型特异性重组Vα和Vβ- Ig嵌合蛋白。将剩余的淋巴结活检材料在液氮中贮存于组织细胞库 中，以备将来使用。

细胞分离：通过迫使患者活检淋巴瘤组织通过一次性0.38mm钢 筛网并且同时浸入无菌PBS中，获得患者淋巴结活检样本的单细胞悬 浮液。分散的细胞用PBS洗涤2次，然后重新悬浮和计数。加工10％ 比率的所述细胞，以进行总RNA提取，剩余的细胞在重新悬浮于含有 30％胎牛血清和10％DMSO的RPMI 1640组织培养基中之后，在液氮 中保存。所有临床样品的加工都在生物安全橱中进行。

总RNA制备：用RNeasy Kit(Qiagen)，按照生产商的说明，分离 得自匀浆淋巴结细胞的总RNA。总RNA通过分光光度法定量。

cDNA合成和来自T淋巴瘤细胞的编码TCR Vα和Vβ链的基因的 PCR扩增：T淋巴瘤细胞受体的Vα和Vβ链都用5’RACE系统(Gibco BRL)，完全按照生产商的描述方法来鉴定，具体描述如下：用大约5.0 μg总RNA作为模板，用Cα特异性引物CADS3或Cβ特异性引物CBDS3 (参见表1)引发第一链DNA，进行第一链cDNA的合成。然后按照生 产商的建议进行PolydC加尾。然后用生产商提供的5’引物和第二Cα 特异性反义引物CADS2或Cβ特异性反义引物CBDS2，进行Vα和Vβ 鉴定，每种所述反义引物对于cDNA合成所述的相应引物而言是内部 引物(参见表1)。 表1.引物序列 引物名称 引物序列(5’3’) 1.CADS2 5′CATCAGAATCCTTACTTTGTGACAC3′ SEQ ID NO：10  2.CADS3 5′CCATAGACCTCATGTCTAGCACAG3′ SEQ ID NO：11  3.CBDS2 5′CTGTGCACCTCCTTCCCATTCAC3′ SEQ ID NO：12  4.CBDS3 5′GGCAGTATCTGGAGTCATTGAGG3′ SEQ ID NO：13  5.CB/IgG1 5′GCGACCTCGGGTGGGccCACC/GTTG/TTTCAGG3′ SEQ ID NO：14  6.CA/IgK 5′CAGCTGGTACACcaCttGGTgAGGGTTCTGGAT3′ SEQ ID NO：15 (CB/IgG1：小写字母代表为产生Apa I克隆位点以形成IgG1嵌合蛋白 所作出的改变。指定C/G和G/T的碱基表示由于Cβ1和Cβ2之间的 差异所致的在那两个位置上使用的任一种碱基。) (CA/IgK：小写字母代表为产生Dra III克隆位点以形成具有κ轻链的嵌 合蛋白所作出的改变。)

PCR产物的克隆和测序：按照生产商的建议，将得自多个反应、 经测定含有Vα和Vβ链的肿瘤特异性序列的PCR产物，直接克隆到质 粒pCR2.1-TOPO中，然后导入到Top10感受态大肠杆菌(E.coli)细胞 (Invitrogeh)中。用QIAPrep Spin Miniprep Kit(Qiagen)，从羧苄青霉素 抗性菌落制备24种小量制备的DNA质粒，并通过分光光度法定量。 用Cy5/Cy5.5染料引物循环测序试剂盒(Dye Primer Cycle Sequencing Kit)(Visible Genetics)，对200ng的每种质粒进行测序。在测序反应完 成后，样品在OpenGene DNA自动测序系统(Automated DNA Sequencing System)上电泳，数据用GeneObjects软件包(Visible Genetics) 加工。用SEQUENCHER Version 4.1.2 DNA分析软件(GENE Codes Corp.)，进行另外的分析，包括序列比对。如果一种Vα或Vβ的肿瘤特 异性序列存在于75％的所述样品中，例如所述24种中的18种或更多 种形成一个共有序列组，则将考虑所述肿瘤特异性序列。当可得到时， 比较两个独立的活检样品。 实施例2. 含有免疫球蛋白重链和轻链恒定区的杆状病毒表达载体

     pTRABacVαHCγ1和pTRABacVβHCγ1的构建

将分泌信号序列克隆到p2Bac中：pTRABacHuLCκHCγ1和 pTRABacHuLCλHCγ1构建体的基础载体是p2Bac(图2，SEQ ID NO：5， Invitrogen，Carlsbad，CA)。将两种分泌信号序列克隆到该基础载体中， 构建第一种中间杆状病毒表达载体p2BacM。概括地说，首先利用编 码定位以置于杆状病毒AcNPV P10启动子转录控制下的蜜蜂蜂毒肽 分泌信号序列氨基末端结构域的互补寡核苷酸，修饰载体p2Bac。对 于蜂毒肽序列的克隆，2μgp2Bac用Not I和Spe I于37℃消化4小时。 所述线性载体在通过1％琼脂糖凝胶电泳后用Qiaex II树脂(Qiagen， Chatsworth，CA)纯化。然后，经纯化的DNA用50μl水洗脱，并测定 DNA浓度。将引物MelS/N(SEQ ID NO：16)和MeIN/S(SEQ ID NO：17) 各1μg与10μl消化缓冲液M(Roche Molecular Biochemicals， Indianapolis，IN)混合，加热至70℃达5分钟，然后冷却至室温，以使 互补引物退火。10％的退火引物用Not I和Spe I于37℃，在20μl反 应物中消化4小时，经消化的引物在通过15％聚丙烯酰胺凝胶电泳后 用Qiaex H树脂来纯化，然后测定退火引物的DNA浓度。p2Bac载体 和退火蜂毒肽片段的DNA以1∶10的载体与插入片段比进行连接。用 感受态XLl-Blue大肠杆菌(Stratagene，San Diego，CA)，用连接产物进 行转化，然后平板接种到LB-羧苄青霉素琼脂平板上，于37℃生长过 夜。采用标准方案制备小量制备菌落，对质粒进行测序以检查所述构 建。所得的载体p2BacM含有所述蜂毒肽分泌信号序列。

类似地对p2BacM载体进行进一步修饰，以编码AcNPV多角体 启动子转录控制下的人胎盘碱性磷酸酶分泌信号序列的氨基末端结构 域，构建第二种中间杆状病毒表达载体p2BacMA。用来导入、克隆所 述碱性磷酸酶序列方法一般如下所述：用Bam HI和Eco RI消化2μg p2BacM质粒，线性载体通过琼脂糖凝胶和Qiaex II树脂进行凝胶纯 化，并用50μl水洗脱。测定所述载体的DNA浓度。将引物APB/E(SEQ ID NO：18)和APE/B(SEQ ID NO：19)各1μg在10μl消化缓冲液M中 混合，加热至70℃达5分钟，然后冷却至室温，以使互补引物退火。 10％的退火引物用Bam HI和Eco RI于37℃在20μl反应物中消化4 小时。然后经消化的引物通过15％聚丙烯酰胺凝胶和Qiaex II树脂纯 化。也测定经消化引物的DNA浓度。然后，使线性p2BacM载体和碱 性磷酸酶片段以1∶10的载体与插入片段比进行连接，用感受态XL1- Blue大肠杆菌，用连接产物进行转化，然后平板接种到LB-羧苄青霉 素琼脂平板上，于37℃生长过夜。制备小量制备菌落，对质粒进行测 序以检查所述构建。所得的中间载体p2BacMA将含有人胎盘碱性磷酸 酶的分泌信号序列。再将p2BacMA质粒转化到缺乏dcm甲基化酶活 性的SCS-110大肠杆菌菌株(Stratagene)中，以供随后将κ恒定区克隆到 甲基敏感性Stu I位点中。

IgGγ1和轻链恒定区的扩增和克隆： 从自人细胞系9F12 (ATCC#HB8177)中提取的RNA，经PCR扩增人单克隆抗体9F12的人 κ恒定区和人IgGγ1恒定区。将κ恒定区克隆到所述碱性磷酸酶信号序列 之后。将IgGγ1恒定区插入到所述蜂毒肽分泌信号序列的下游，从而构 建载体(pTRABacHuLCκHCγ1，图5a)。通过用λ轻链恒定区取代κ轻链恒 定区，产生含有人λ轻链恒定区的载体(pTRABacHuLCλHCγ1，图5b)。 从慢性淋巴细胞白血病的细胞RNA制剂中，通过RT-PCR分离出所 述轻链。克隆程序的详细描述如下。

9F12κ恒定区片段和IgGγ1恒定区片段的扩增： 用RNeasy Kit (Qiagen)，按照生产商的说明，从9FI2细胞(ATCC#HB8177)提取总 RNA。用SuperScript反转录酶(GIBCO BRL，Rockville，MD)和oligo(dT) 引物，合成单链cDNA。用1/20的合成单链cDNA，在具有Expand High Fidelty Taq(Roche)的100μlPCR反应物中，使用κ和IgGγ1特异性寡核 苷酸(分别为SEQ ID NO：22加上SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：20加上 SEQ ID NO：21)进行扩增。来自扩增9FI2免疫球蛋白的片段通过1.5％ SeaKem琼脂糖和Qiaex II树脂纯化，并用50μl水洗脱。测定所述片 段的DNA浓度。将纯化的9F12免疫球蛋白片段分别连接到TA-II (Invitrogen)PCR克隆载体中。用感受态XLI-Blue大肠杆菌，用所述连 接产物进行转化，然后平板接种到LB-羧苄青霉素琼脂平板上，于37 ℃生长过夜。制备小量制备的菌落，并对质粒DNA进行测序。

将9F12κ恒定区插入到所述表达载体中：对于κ恒定区，用Stu I 和Hind III消化5μg含有κ恒定区的质粒DNA和2μg从SCS110大肠 杆菌中纯化的载体p2BacMA的DNA。含有κ恒定区的320bp片段和 含有p2BacMA载体的7.1kb片段用Quiex II凝胶纯化，然后用50μl 水洗脱。测定这两种片段的DNA浓度。然后用Rapid Ligation Kit(Roche) 连接纯化的片段。用感受态XL1-Blue大肠杆菌，用所述连接产物进行 转化，然后平板接种到LB-羧苄青霉素琼脂平板上，于37℃生长过夜。 制备小量制备的细菌菌落，并对所述重组DNA进行测序，以证实κ恒 定区的正确插入。所得的质粒载体为pTRABacLCκ。

将IgGγ1恒定区加入到所述载体中： 通过首先用Spe I和Xba I 消化5μg含有IgGγ1恒定区的质粒DNA和2μg载体pTRABacLCκ的 质粒DNA，将IgGγ1恒定区加入到所述载体中。用琼脂糖填料(agarose plugs)和Quiex II凝胶纯化IgGγ1恒定区的1kb片段和pTRABacLCκ载 体的7.4kb片段，并用50μl水洗脱。测定这两种片段的DNA浓度。 然后用Rapid Ligation Kit(Roche)连接纯化的片段。用感受态XL1-Blue 大肠杆菌，用所述连接产物进行转化，然后平板接种到LB-羧苄青霉 素琼脂平板上，于37℃生长过夜。制备小量制备的菌落，通过限制性 分析和对限制位点测序，确定连接和IgGγ1插入的方向。所得的重组载 体为pTRABacHuLCκHCγ1。

进一步精修该质粒-pTRABacHuLCκHCγ1，以便分别在所述蜂毒 肽分泌序列和Cγ1区序列之间以及在所述碱性磷酸酶分泌序列和Cκ区 序列之间加入翻译终止密码子。为了完成这些修饰，采用Spe I+Apa I 消化，使pTRABacHuLCκHCγ1载体线性化。然后将所述线性化载体与 退火的互补引物γ1-stuff1(SEQ ID NO：53)和γ1-stuff 1’(SEQ ID NO：54) 连接，以引入符合读框的终止密码子。随后采用以Stu I(AGGCCT)+ Dra III(CACnnnGTG)消化，使通过这种修饰得到的载体线性化，然后 与退火的互补引物κ-Stuff1(SEQ ID NO：55)和κ-stuff1’(SEQ ID NO：52) 连接，以引入符合读框的终止密码子。这些修饰的净效应分别在图6C 和6D中所示的序列中指出。(加入的序列以双下划线和粗体突出。)

将λ恒定区加入到所述载体中：用RNeasy试剂盒（Qiagen)，从得自 表现出λ轻链独特型的慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的纯化外周血淋 巴细胞(PBL)中获得总RNA。

用大约2.0μg总RNA作为模板，采用SuperScript Preamplification System(Gibco BRL)，按照生产商的建议，进行第一链cDNA合成。用 Oligo(dT)进行引发。用1/20的所述合成单链cDNA，用与Vλ信号序列 的一部分相同的上游引物(TTGCTTACTG CACAGGATCC GTG；SEQ ID NO：47)和与λ恒定区的最后几个密码子以及3’非翻译区的一部分互 补的下游引物(TGCCGTCGGC AGGAGGTATT TCATTATGAC TGTCTCCTTG CTATTATGAA CATTCTGTAG GGGCCA；SEQ ID NO：48)，在PCR反应中进行扩增。将PCR产物克隆到pCRII载体 (Invitrogen)中，测序以证实身份。选择含有正确λ恒定区序列的质粒作 为第二PCR的模板。在该反应中，利用一种含有工程Dra III限制位点、 对应于λ恒定区中紧接Jλ下游的序列的有义寡核苷酸Cλ-5’(SEQ ID NO：49)、和一种跨越紧接λ恒定区的终止密码子的含Hind III反义寡核 苷酸引物Cλ-3’(SEQ ID NO：50)。将所得的PCR产物克隆到pCR2.1- TOPO载体中并测序。用Hind III限制时，从所述质粒的某些质粒中释 放出含所述λ恒定区序列的片段，这取决于所述插入片段的取向。凝胶 分离这一限制性片段，在用Hind III消化线性化后，将其克隆到 pTRABacHuLCκHCγ1(图5A)中，产生一种含有λ恒定区和κ恒定区的中 间质粒。用Stu I和Dra III限制这种质粒，导致除去所述κ序列。然后 将这种线性化质粒与退火的互补引物λ-stuff1(SEQ ID NO：51)和λ-stuff 1’连接，产生最终形式的pTRABacHuLCλHCγ1(图5B)。

在pTRABacHuLCκHCγ1和/或pTRABacHuLCλHCγ1构建中使用的 所有寡核苷酸引物一览表可以在以下表2和表3中找到。

采用或者pTRABacHuLCκHCγ1或pTRABacHuLCλHCγ1，有可能将 含有单一克隆序列Stu I和Dra III的任何Vα或Vβ链的基因插入到κ或λ 恒定区和所述碱性磷酸酶信号序列之间，以及将含有单一克隆序列Spe I和Apa I的任何Vβ或Vα链的基因插入到IgGλ1恒定区和蜂毒肽分泌信 号序列之间。然后用所得的表达载体，转导到草地贪夜蛾(Sf-9)昆虫细 胞中，产生出芽的重组杆状病毒。然后将所述重组的杆状病毒在Sf-9 细胞中连续扩增，产生高滴度的重组杆状病毒原液。然后用这种高滴 度的重组杆状病毒原液感染粉纹夜蛾(High-5)细胞，以供随后生产 TCR/Ig嵌合蛋白。 表2.引物序列 引物名称 引物序列(5’3’) Cλ下游引物 TGCCGTCGGCAGGAGGTATTTCATTATGACTGTCT CCTTGCTATTATGAACATTCTGTAGGGGCCA SEQ ID NO：48 Cλ-5′ GTCAGCCCAAGGCTGCACCCAGTGTCACTCTGTTCC SEQ ID NO：49 Cλ-3′ CGTATCAAGCTTTTACTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC SEQ ID NO：50 λ-stuff1 CCTTTGATAACACCCA SEQ ID NO：51 λ-stuff1′ GTGTTATCAAAGG SEQ ID NO：52 γ1-stuff1 5′-CTAGTTTGATAAGGGCC-3′ SEQ ID NO：53 γ1-stuff1′ 5′-CTTATCAAA-3′ SEQ ID NO：54 κ-stuff1 5′-CCTTTGATAACACCAA-3′ SEQ ID NO：55 κ-stuff1′ 5′-  -3 ′ SEQ ID NO：56 实施例3. 将患者来源的独特型Vα和/或Vβ链的基因插入到表达载体

     中

在如上所述分离Vα和/或Vβ链的肿瘤衍生序列之后，制备含有所 述蜂毒肽前导肽的末端40个核苷酸的寡核苷酸引物(对于Vβ链克隆而 言)(SEQ ID NO：8-ACTAGTTTTT ATGGTCGTGT ACATTTCTTA CATCTATGCG)、含有所述碱性磷酸酶前导肽的末端31个核苷酸的寡 核苷酸引物(对于Vα链克隆而言)(SEQ ID NO：9-AGGCCTGAGG CTACAGCTCT CCCTGGGC)和含有根据如上所述的分析中测定的相 应的Vα或Vβ基因的前20个核苷酸的寡核苷酸引物。使用来自α链或β 链恒定区与CA的碱基对4-36互补的反向寡核苷酸引物(CA/IgK；SEQ ID NO：15)和与CB的碱基对6-35互补的反向寡核苷酸引物(CB/IgG1： SEQ ID NO：14)。如前所述鉴定为具有克隆Vα或Vβ序列的重组质粒用 作第二轮PCR的模板。循环条件如上所述。

将Vα区插入到表达载体中： 用限制性酶Stu I和Dra III消化从 序列已证实的质粒制备物中扩增的PCR衍生DNA片段，然后在琼脂 糖凝胶上分离。将预测的含Vα基因的大约360bp片段洗脱出，然后插 入到合适的杆状病毒免疫球蛋白表达转移载体。概括地将，用Stu I和 Dra III消化PCR衍生Vα产物和2μg对应的pTRABacHuLCκHCγ1或 pTRABacHuLCλHCγ1盒载体。用琼脂糖凝胶填料和Qiaex II树脂纯化 来自患者来源的Vα链的360bpDNA片段和线性pTRABacHuLCκHCγ1 或pTRABacHuLCλHCγ1载体的8.4kb片段，并用50μl水洗脱。测定 这两种片段的DNA浓度，然后用Rapid Ligation试剂盒(Roche)连接所 述片段。用感受态XL1-Blue大肠杆菌，用所述连接产物进行转化，然 后将其平板接种到LB-羧苄青霉素琼脂平板上，于37℃生长过夜。制 备小量制备的菌落，通过限制性分析和测序，证实所述重组DNA质 粒。所得的载体命名为pTRABacVαHuLCκHCγ1或 pTRABacVαHuLCλHCγ1。

将Vβ链插入到表达载体中： 通过限制性酶Spe I和Apa I消化从 序列已证实的质粒制备物中扩增的PCR衍生DNA片段。凝胶纯化切 下的含有Vβ基因的大约360bp片段，将其插入到含有连接的Vα基因 的合适的杆状病毒免疫球蛋白表达转移载体pTRABacVαHuLCκHCγ1 或pTRABacVαHuLCλHCγ1中、或者插入到不含连接的Vα基因的 pTRABacHuLCκHCγ1中。概括地讲，用Spe I和Apa I消化PCR衍生 Vβ产物和2μg pTRABacVαHuLCκHCγ1、pTRABacVαHuLCλHCγ1、 pTRABacHuLCκHCγ1载体的DNA。用琼脂糖凝胶填料和Qiaex II树脂 凝胶纯化Vβ链的360bp片段和pTRABacVαHCγ1、 pTRABacVαHuLCκHCγ1或pTRABacVαHuLCλHCγ1载体的8.8kb片段或 者pTRABacHuLCκHCγ1载体的8.4kb片段，并用50μl水洗脱。测定 这两种片段的DNA浓度，然后用Rapid Ligation试剂盒(Roche)连接所 述片段。用感受态XL1-Blue大肠杆菌，用所述连接产物进行转化，随 后将其平板接种到LB-羧苄青霉素琼脂平板上，于37℃生长过夜。制 备小量制备的菌落，并对所述重组DNA质粒测序。所得的载体命名为 pTRABacVαHuLCκVβHCγ1或pTRABacVαHuLCλVβHCγ1或者 pTRABacHuLCκVβHCγ1。 表3.用于构建pTRABacHulCκHCγ1和pTRABacHulCλHCγ1杆状病毒转     移载体的引物序列。 引物名称 引物序列(5’3’) 1.蜂毒肽N末端引物 (MelS/N和MelN/S) ACTAGTGCAACGTTGACTAAGAATTTCATGCGGCCGC (SEQ ID NO：16) GCGGCCGCATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCACTAGT (SEQ ID NO：17) 2.人胎盘碱性磷酸酶 N末端引物 (APB/E和APE/B) GCGGATCCATGGTGGGACCCTGCATGCTGCTGCTGCTG CTGCTGCTAGGCCTGGAATTCC (SEQ ID NO：18) GGAATTCCAGGCCTAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCATG CAGGGTCCCACCATGGATCCGC SEQ ID NO：19) 3.IgGγ1重链恒定区： 上游引物 TGTGACTAGTATGTATCGGCCCATCGGTCTTCCCCCT (SEQ ID NO：20) 下游引物 TTTCTAGACTATTATTTACCCGGAGACAGGGAGAG (SEQ ID NO：21) 4.κ轻链恒定区： 上游引物 CTAGGCCTATGTATCACCAAGTGTCTTCATCTTCCCGCC ATCT (SEQ ID NO：22) 下游引物 CCCAAGCTTCTATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT (SEQ ID NO：23) 实施例4. 用含Vα和/或Vβ链独特型的杆状病毒表达载体转染昆虫细

     胞系和产生重组嵌合蛋白：

昆虫细胞的生长：用经修饰的杆状病毒载体转染两个已建立的 昆虫细胞系(Sf9和High-5)，以产生重组VH/免疫球蛋白和/或VL/免疫 球蛋白嵌合蛋白。所有的昆虫细胞都于28℃在140-150rpm下、在一 次性无菌通气(vented)摇瓶(Coming)内含有50μg/L庆大霉素的ESF-921 无血清昆虫培养基(表达系统LLP)中生长，液体的体积不超过50％。 每2-3天将细胞传代。将来自每批产物工作细胞库的或每6周的工作 细胞库的冷冻细胞解冻(低温保藏培养基：10％DMSO，40％ESF-921 培养基，50％High-5条件培养基)，以确保有不因杆状病毒感染而取消 (retractile to)的连续的对数生长期细胞原液。

Sf9细胞转染和重组测定：用BacVector-3000转染试剂盒 (Invitrogen)，将含有Vα和/或Vβ区的基因和编码免疫球蛋白重链恒定 区和/或轻链恒定区的基因的经修饰杆状病毒表达载体，共转染到Sf9 细胞中。从琼脂糖上层中挑出10个单独的噬斑。来自分离的噬斑的病 毒用来感染T-25烧瓶内5ml ESF-921培养基中接种的50％融合的Sf9 细胞。用两种引物(SEQ ID NO：37-TTTACTGTTT TCGTAACAGT TTTG)和(SEQ ID NO：38-GGTCGTTAAC AATGGGGAAG CTG)，通 过PCR测试在T-25烧瓶中扩增的克隆病毒分离物，以确保分离的噬 斑的克隆性和没有野生型病毒污染。概括地说，按照Bac Vector手册 (Novagen)中所述，用供应的Eufectin脂质试剂，将200ng重组转移载 体质粒与三重切割的Bac-Vector-3000一起共转染。将该转染混合物连 续5倍稀释。将100微升等份样品接种到含有2.5×106Sf9贴壁细胞的 60mm组织培养皿中。1小时后，在细胞上铺上4ml ESF-921培养基 中的1％琼脂糖溶液。在t＝转染后144小时用中性红(Sigma，St.Louis， MO)使活细胞染色后，从在琼脂糖上层中生长的转染细胞中挑出10个 单独的克隆。将病毒从噬斑塞状物(plug)中过夜洗脱到1ml ESF-921培 养基中。在T-25烧瓶中，接种5ml ESF-921培养基中50％融合的Sf- 9细胞，用0.5ml洗脱的克隆病毒感染。感染后96小时，从T-25烧瓶 中取出0.5ml培养基；离心除去细胞，通过硝化纤维素上的斑点印迹 分析，分析上清液中的免疫球蛋白活性。如下所述，也通过PCR检验 出不存在野生型病毒。

将含有重组杆状病毒的感染性上清液(10μl)加入到90μl含有6μg 蛋白酶K的裂解缓冲液中，所述裂解缓冲液含有10mM Tris pH8.3、 50mM KCl、0.1mg/ml明胶、0.45％ Nonidet P-40和0.45％ Tween-20。 将混合物于60℃加热1小时，通过于95℃保温10分钟使蛋白酶K变 性。取出25μl经加热的混合物，在冷却后加入到新PCR管中，然后 加入另外25μl混合物，所述混合物含有10mM Tris pH8.3、50mM KCl、0.1mg/ml明胶、0.45％NP-40、0.45％Tween-20、每种dNTP各 400μM、5mM MgCl2、每种PCR引物各50pM(终浓度)和2.5U Taq 聚合酶(Roche)。将病毒DNA扩增40个循环：92℃1min，然后58℃1 min和72℃1min。用重组杆状病毒引物PH正向引物(SEQ ID NO：37) 和PH反向引物(SEQ ID NO：38)，扩增表达所述T细胞受体基因部分的 多角体基因座。采用琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物。用这些引物组， 重组杆状病毒将扩增一种1300bp的片段，而野生型杆状病毒将产生 一种大约800bp的片段。污染野生型病毒的重组病毒将扩增出这两种 大小的片段。

在Sf9昆虫细胞中制备高滴度病毒原液：将得自T-25原代培养物 的2ml培养物转移到T-75烧瓶内含有50％融合的Sf9细胞的10ml ESF-921培养基中，让细胞于28℃生长120小时。将5ml第二代T-75 培养物，转移到含有50ml2×106细胞/ml的Sf9细胞的150ml摇瓶中， 让细胞于28℃生长120小时。将来自150ml摇瓶的25ml培养物转移 到1升摇瓶中的500ml 2×106细胞/ml的Sf9细胞中，于28℃生长。 当通过锥虫蓝染色(t＝感染后大约120-144小时)记录到培养物达到 20％活细胞时，以3000×g离心收获病毒培养物，将其分配到50ml 无菌管中，将一半管贮存于4℃，而其余管贮存于-80℃。然后，用这 种所收获的500ml高滴度(＞1×108pfu/ml)病毒原液感染High-5昆虫细 胞，以供嵌合蛋白生产用。用Baculovirus Rapid Titer Kit(杆状病毒快 速滴度试剂盒)(Clontech，Palo Alto，CA)测定病毒滴度(pfu/ml)。

High-5昆虫细胞中TCR/Ig嵌合蛋白的生产：与Sf-9细胞相比， High-5昆虫细胞(BTI-TN-5B1-4)分泌更高水平(2-20×)的重组免疫球蛋 白，是选择用于TCR/Ig嵌合蛋白生产的细胞系。将对数早期的High- 5细胞(1.0-2.0×106细胞/ml)以5×105细胞/ml接种到具有通气封口 (vented closure)的1升一次性培养瓶中的ESF921培养基(Expression Systems LLP)中。培养瓶于28℃以140-150rpm振摇，在规定时间内调 节培养瓶中培养基的体积，使其不超过500ml。当细胞密度在500ml 培养基中达到1.5-2.5细胞/ml时，用高滴度重组杆状病毒原液，以大 约0.5∶1(pfn∶细胞)的感染复数(MOI)感染培养瓶中细胞。然后将培养瓶 于28℃以140-150rpm振摇。每天检查细胞活力，在感染后96小时内 活力未降至＜50％时收获培养物。 实施例5. 包含Vα-免疫球蛋白和Vβ-免疫球蛋白的嵌合蛋白的纯

     化：

通过以大约5,000×g离心60分钟，然后通过0.2μPES无菌过滤 装置过滤，除去细胞和碎片。通过用A蛋白High-Trap柱(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)亲和色谱，从澄清的组织培养基中纯化嵌合 蛋白，然后以50％饱和的硫酸铵沉淀。纯化的嵌合蛋白经过大小分离， 然后通过FPLC色谱法以交换到缓冲液PBS中。蛋白纯化所用的所有 试剂都是USP生物技术级(GenAr，Mallinckrot Baker，Parris，KY)，内毒 素由生产商检验。用无菌USP级水制备所有缓冲液和其它溶液。缓冲 液和其它溶液在生物安全橱中制备，并且通过0.2μm PES过滤装置过 滤除菌。

嵌合蛋白的A蛋白Sepharose亲和纯化：从生长中的培养瓶中取 出组织培养基，以5,000×g离心60分钟以沉淀细胞和碎片。用0.2μ PES 过滤装置，将上清液过滤除菌。加入Tris缓冲液(1M，pH7.4)至经过滤 的含有VH和/或VL-免疫球蛋白嵌合蛋白的培养基中至终浓度为20 mM。将缓冲的组织培养上清液上样至带有一个蠕动泵的5ml HighTrap 重组A蛋白Sepharose亲和柱(Amersham Pharmacia)，流速为1-5 ml/min，在干净的烧瓶中收集流通液(flow-through)。柱子用25ml PBS (pH7.4)以5ml/min洗涤。逆转流向，柱子用另外25ml PBS洗涤。用 0.05M柠檬酸(pH3.5)以1ml/min反向洗脱柱子，收集各1ml的流分。 立即加入大约0.3ml 1M Tris(pH9.0)至洗脱出的1ml流分中调节pH 大约8.0。可以以相同方式使用包括但不限于G蛋白、L蛋白或能够与 免疫球蛋白结合结构域结合的任何蛋白的其它蛋白柱。

嵌合蛋白的硫酸铵沉淀：通过分光光度法鉴定从A蛋白 Sepharose中洗脱出的含有Vα和/或Vβ-Ig的流分。将峰流分合并，并 测定体积。然后滴加等体积的饱和硫酸铵溶液并混合。让沉淀于室温 静置15分钟，然后通过以5000×g离心沉降。将沉淀的Vα和/或Vβ-Ig 嵌合蛋白重新溶于无菌水中。用Hig Trap脱盐柱(Amersham Pharmacia)，将Vα和/或Vβ-Ig嵌合蛋白交换到PBS缓冲液中，最后通 过0.2μ滤器过滤除菌。 实施例6. 嵌合蛋白和匙孔血蓝蛋白(KLh)缀合

当纯化后，如下通过戊二醛交联将Vα和/或Vβ-Ig嵌合蛋白与 GMP级KLH(VACMUNE，Biosyn Corporation)缀合。将至少5mg纯化 的无菌独特型嵌合蛋白与等量的KLH在15ml无菌圆锥形管中混合， 用PBS将终体积调至9ml。滴加1ml 1％戊二醛(25％1级水溶液，Sigma) 至终浓度为0.1％。然后于室温下将管缓慢摇动4小时。缀合物在无菌 DispoDialyzers(Spectrum Labs)中对2升无菌PBS透析，在至少24小 时内在生物安全通风橱中更换3次缓冲液。从透析室中无菌取出最终 Vα和/或Vβ-Ig嵌合蛋白-KLH缀合物，将其转移至一个无菌管中，混 合，然后等份分装到管形瓶中。给终产物的每个管形瓶标上批号、患 者标识号、瓶号和装瓶日期。用最后一批管形瓶中的10％检验无菌情 况，选择一个小瓶，测试内毒素。 实施例7. 产品检验

含杆状病毒DNA序列的生产批料上清液：收获1ml等份的被感 染昆虫细胞生产培养物上清液样品，通过在台式离心机中以3000 rpm 离心5分钟除去细胞碎片。将至少0.1ml这种含有杆状病毒颗粒的澄 清上清液以1∶9的体积比与裂解缓冲液(10mM Tris pH8.3，50mM KCl， 0.1mg/ml明胶，0.45％Nonidet P-40和0.45％Tween-20)混合，用蛋白酶 K(终浓度60μg/ml)于60℃蛋白水解1小时，然后于95℃15分钟使蛋 白酶K变性。然后将25μl这种裂解液与另外25μl含有每种dNTP各 400μM、5mM MgCl2、25pmol寡核苷酸(SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35；或SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37)(参见表4)和2.5U Taq聚 合酶(Roche)的上述裂解缓冲液混合，以便进行PCR反应。循环条件 是：(i)最初于92℃变性2分钟，(ii)后接92℃、58℃和72℃各1分钟 的40个循环，和(iii)于72℃7分钟的最后延伸。对PCR产物根据预期 大小进行评价，并通过琼脂糖凝胶电泳进行定量。随后，用两种或更 多种嵌套引物对PCR产物直接测序。用OpenGene Automated DNA Sequencing System(自动DNA测序系统)(Visible Genetics)和序列分析 软件，如上所述测定完整的Vα和/或Vβ核苷酸序列，并且与 pTRABac(NHL-FV-8786-XXX)载体中对应于患者独特型的V基因序列 进行比较。

采用抗人IgG ELISA的免疫球蛋白测定分析所述嵌合蛋白：微量 滴定板的各孔用100μl 3μg/ml山羊抗人IgG重链特异性抗体(Fischer， Pittsburg，PA)在碳酸盐缓冲液中的稀释液于4℃包被过夜，用100μl TBS(50mM Tris，150mM NaCl，pH7.5)洗涤2次。然后各孔用200μl TBSB(TBS+1％BSA)于22℃封闭1小时。将100μl稀释的样品以2 倍连续稀释液以双份重复加入到各孔中，于22℃保温1小时。用纯化 的人IgG1/κ或IgG1/λ标准(Sigma，St.Louis，MO)重复所述分析。各孔用 200μlTBST(TBS+0.1％Tween20)洗涤4次。检测抗体山羊抗人H和 L-HRP(Chemicon，Temecula，CA)在TSBS中以1∶2000稀释，加入100μl 至各孔中并于22℃保温1小时。各孔用200μl TBST洗涤6次。加入 100μl底物(TMB1组分，KPL Inc.，Gaithersburg，MD)至各孔中，显色 30分钟，然后根据OD650色谱图测定样品。从Hi Trap脱盐柱洗脱的 主峰蛋白必须对应于人IgG ELISA活性。 实施例8. 嵌合蛋白的浓度和纯度

生产上清液中杆状病毒中Vα和/或Vβ基因的DNA序列必须等同 于所述生产载体中的所述DNA序列。所述嵌合蛋白的浓度基于OD280 必须超过0.5mg/ml，并且必须对应于人IgG ELISA活性。

 表4显示了用于确立终产物身份的引物序列的概述。 表4.用于确立终产物身份的引物序列。 引物名称 引物序列(5’3’) 1.人胎盘碱性磷酸酶内部引物 AAATGATAACCATCTCGC (SEQ ID NO：26) 2.人胎盘碱性磷酸酶外部引物 TTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTG (SEQ ID NO：27) 3.κ轻链恒定区反义引物 TTGGAGGGCGTTATCCACCTTC (SEQ ID NO：28) 4.κ轻链恒定区下游内部引物 CTGTAAATCAACAACGCACAG (SEQ ID NO：29) 5.κ轻链恒定区下游外部引物 CAACAACGCACAGAATCTAG (SEQ ID NO：30) 6.蜂毒肽内部引物 GGGACCTTTAATTCAACCCAACAC (SEQ ID NO：31) 7.蜂毒肽外部引物 AAACGCGTTGGAGTCTTGTGTGC (SEQ ID NO：32) 8.IgGγ1重链恒定区反义内部引物 GGAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG (SEQ ID NO：33) 9.IgGγ1重链恒定区反义中部引物 CTGAGTTCCACGACACCGTCAC (SEQ ID NO：34) 10.IgGγ1重链恒定区反义外部引物 TAGAGTCCTGAGGACTGTAGGAC (SEQ ID NO：35) 11.κ和λ下游引物： 5′-GGTCGTTAACAATGGGGAAGCTG-3′ (SEQ ID NO：36) 12.PH正向引物 5’TTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTG3’ (SEQ ID NO：37) 13.PH反向引物 5’GGTCGTTAACAATGGGGAAGCTG3’ (SEQ ID NO：38) 14.λ恒定区内部引物 5′GAAGTCACTTATGAGACACACCAG3′ (SEQ ID NO：39) 实施例9. Vα和/或Vβ-Ig嵌合蛋白和/或其与细胞因子的缀合物的

     共同给予：

用含有所述蜂毒肽前导肽末端40个核苷酸和鼠Vβ12的前20个 核苷酸的5’寡核苷酸(SEQ.ID.NO：56：TTACTAGTTT TTATGGTCGT GTACATTTCT TACATCTATG CTGACGCTGG AGTTACCCAG A)和 与鼠Cb5’端和人IgG1互补的3’寡核苷酸(SEQ.ID.NO：57： AGGAGACCTT GGGTGGAGTC GGGCCCTTCA GATCCTC)，如上所 述克隆由鼠T细胞淋巴瘤系RMA所表达的TCR Vβ12基因(如下述文 献所述：Van Hall等，Identification of a Novel Tumor-Specific CTL Epitope Presented by RMA，EL-4，and MBL-2 Lymphomas Reveals Their Common Origin.J.Immunol.，165：869-877；2000)。将所得的PCR产物(图 X，参见最后一页)克隆到pTRABacHuLCκHCγ1的Spe I/ApaI位点中， 产生载体pTRABacHuLCκVβ-RMAHCγ1。如上所述在昆虫细胞中生产 TCR Vβ-RMAHCγ1嵌合蛋白并将其纯化。作为这类蛋白质应用的一个实 例(图9)，给C57/B16小鼠接种10,000RMAT细胞淋巴瘤细胞，随后 在36小时后用一种组合物治疗，所述组合物包含浓度为500μg/ml的 RMA特异性Vβ-Ig嵌合蛋白和浓度为100,000IU/ml的细胞因子GM- CSF。每日给予这种疫苗1次，并且每日给予GM-CSF3次。在14天 的间隔后，重复完全相同的治疗方案。以这种方式注射的小鼠中的60％ 在肿瘤植入后40天仍存活，而超过90％的对照小鼠死于肿瘤攻击。

RMA Vb PCR产物的序列如下(包括所述蜜蜂蜂毒肽信号序列)： ACTAGTTTTT ATGGTCGTGT ACATTTCTTA CATCTATGCG GACGCTGGAG TTACCCAGAC ACCCAGACAT GAGGTGGCAG AGAAAGGACA AACAATAATC CTGAAGTGTG AGCCAGTTTC AGGCCACAAT GACCTTTTCT GGTACAGACA GACCAAGATA CAGGGACTAG AGTTGCTGAG CTACTTCCGC AGCAAGTCTC TTATGGAAGA TGGTGGGGCT TTCAAGGATC GATTCAAAGC TGAGATGCTA AATTCATCCT TCTCCACTCT GAAGATTCAA CCTACAGAAC CCAAGGACTC AGCTGTGTAT CTGTGTGCCA GCAGTACCGG GACAGAAACG CTGTATTTTG GCTCAGGAAC CAGACTGACT GTTCTCGAGG ATCTGAAGGG CCC(SEQ ID NO：58).

现在已经全面地描述了本发明，本领域技术人员会认识到，在不 偏离本发明精神和范围和无需过度实验的情况下，可以在等同参数、 浓度和条件的宽范围内实施本发明。

尽管已经在本发明的具体实施方案方面描述了本发明，但应该理 解，本发明能够进行进一步的修改。这种应用计划包括一般而言按照 本发明的原理并且包括在本说明书之外的、在本发明所属领域已知或 常规的实践范围内的、适用于前文所述的在所附权利要求书范围内的 基本特征的本发明的任何变化、应用或修改。

                 相关申请

本申请要求题为“Method for producing an Idiotypic Vaccine(生产 独特型疫苗的方法)”的美国临时申请第60/224,723号、题为“Expression Vectors for Production of Recombinant Immumoglobulin(用于生产重组免 疫球蛋白的表达载体)”的美国临时申请第60/224,722号和题为 “Method and Composition for Altering a T Cell Mediated Pathology(用 于改变T细胞介导病理的方法和组合物)”的美国临时申请第 60/266,133号的优先权。

                      序列表 <110>法弗里尔公司(FAVRILLE，INC.) <120>用于改变T细胞介导病理的方法和组合物 <130>032077.002.WO <140>PCT/US01/25203 <141>2001-08-10 <150>60/266,133 <151>2001-02-01 <150>60/224,722 <151>2000-08-11 <150>60/224,723 <151>2000-08-11 <160>58 <170>PatentIn Ver.2.1 <210>1 <211>22 <212>PRT <213>人(Homo sapiens) <400>1 Met Leu Gly Pro Cys Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg   1               5                  10                  15 Leu Gln Leu Ser Leu Gly

         20 <210>2 <211>66 <212>DNA <213>人(Homo sapiens) <400>2 atggtgggac cctgcatgct gctgctgctg ctgctgctag gcctgaggct acagctctcc 60 ctgggc                                                            66 <210>3 <211>21 <212>PRT <213>意大利蜜蜂(Apis mellifera) <400>3 Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile   1               5                  10                  15 Ser Tyr Ile Tyr Ala

         20 <210>4 <211>63 <212>DNA <213>意大利蜜蜂(Apis mellifera) <400>4 atgaaattct tagtcaacgt tgcactagtt tttatggtcg tgtacatttc ttacatctat 60 gcg                                                               63 <210>5 <211>7125 <212>DNA <213>苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒 <220> <223>表达载体 <400>5 gcagttcgtt gacgccttcc tccgtgtggc cgaacacgtc gagcgggtgg tcgatgacca 60 gcggcgtgcc gcacgcgacg cacaagtatc tgtacaccga atgatcgtcg ggcgaaggca 120 cgtcggcctc caagtggcaa tattggcaaa ttcgaaaata tatacagttg ggttgtttgc 180 gcatatctat cgtggcgttg ggcatgtacg tccgaacgtt gatttgcatg caagccgaaa 240 ttaaatcatt gcgattagtg cgattaaaac gttgtacatc ctcgctttta atcatgccgt 300 cgattaaatc gcgcaatcga gtcaagtgat caaagtgtgg aataatgttt tctttgtatt 360 cccgagtcaa gcgcagcgcg tattttaaca aactagccat cttgtaagtt agtttcattt 420 aatgcaactt tatccaataa tatattatgt atcgcacgtc aagaattaac aatgcgcccg 480 ttgtcgcatc tcaacacgac tatgatagag atcaaataaa gcgcgaatta aatagcttgc 540 gacgcaacgt gcacgatctg tgcacgcgtt ccggcacgag ctttgattgt aataagtttt 600 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<211>8415 <212>DNA <213>未知生物 <220> <223>未知生物的描述：pTRABacHuLCH1 DNA序列 <400>7 gcagttcgtt gacgccttcc tccgtgtggc cgaacacgtc gagcgggtgg tcgatgacca 60 gcggcgtgcc gcacgcgacg cacaagtatc tgtacaccga atgatcgtcg ggcgaaggca 120 cgtcggcctc caagtggcaa tattggcaaa ttcgaaaata tatacagttg ggttgtttgc 180 gcatatctat cgtggcgttg ggcatgtacg tccgaacgtt gatttgcatg caagccgaaa 240 ttaaatcatt gcgattagtg cgattaaaac gttgtacatc ctcgctttta atcatgccgt 300 cgattaaatc gcgcaatcga gtcaagtgat caaagtgtgg aataatgttt tctttgtatt 360 cccgagtcaa gcgcagcgcg tattttaaca aactagccat cttgtaagtt agtttcattt 420 aatgcaactt tatccaataa tatattatgt atcgcacgtc aagaattaac aatgcgcccg 480 ttgtcgcatc tcaacacgac tatgatagag atcaaataaa gcgcgaatta aatagcttgc 540 gacgcaacgt gcacgatctg tgcacgcgtt ccggcacgag ctttgattgt aataagtttt 600 tacgaagcga tgacatgacc cccgtagtga caacgatcac gcccaaaaga actgccgact 660 acaaaattac cgagtatgtc ggtgacgtta aaactattaa gccatccaat cgaccgttag 720 tcgaatcagg accgctggtg cgagaagccg cgaagtatgg cgaatgcatc gtataacgtg 780 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ttttctcctc ataaaaatta acatagttat tatcgtatcc atatatgtat ctatcgtata 1680 gagtaaattt tttgttgtca taaatatata tgtctttttt aatggggtgt atagtaccgc 1740 tgcgcatagt ttttctgtaa tttacaacag tgctattttc tggtagttct tcggagtgtg 1800 ttgctttaat tattaaattt atataatcaa tgaatttggg atcgtcggtt ttgtacaata 1860 tgttgccggc atagtacgca gcttcttcta gttcaattac accatttttt agcagcaccg 1920 gattaacata actttccaaa atgttgtacg aaccgttaaa caaaaacagt tcacctccct 1980 tttctatact attgtctgcg agcagttgtt tgttgttaaa aataacagcc attgtaatga 2040 gacgcacaaa ctaatatcac aaactggaaa tgtctatcaa tatatagttg ctgatatctc 2100 cccagcatgc ctgctattgt cttcccaatc ctcccccttg ctgtcctgcc ccaccccacc 2160 ccccagaata gaatgacacc tactcagaca atgcgatgca atttcctcat tttattagga 2220 aaggacagtg ggagtggcac cttccagggt caaggaaggc acgggggagg ggcaaacaac 2280 agatggctgg caactagaag gcacagtcga ggctgatcag cgagctctag tctagactat 2340 tatttacccg gagacaggga gaggctcttc tgcgtgtagt ggttgtgcag agcctcatgc 2400 atcacggagc atgagaagac gttcccctgc tgccacctgc tcttgtccac ggtgagcttg 2460 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agggggaaga ccgatgggcc cactagtgca acgttgacta agaatttcat gcggccgcgt 3360 acgattgtaa ataaaatgta atttacagta tagtatttta attaatatac aaatgatttg 3420 ataataattc ttatttaact ataatatatt gtgttgggtt gaattaaagg tcccggcatc 3480 ctcaaatgca taatatcata gtcccccttg ttgtaagtga tgcgtatttc tgaatctttg 3540 taaaatagca cacaggactc caacgcgttt ggcgttttat tttcttgctc gaggatatca 3600 tggagataat taaaatgata accatctcgc aaataaataa gtattttact gttttcgtaa 3660 cagttttgta ataaaaaaac ctataaatat tccggattat tcataccgtc ccaccatcgg 3720 gcgtgctagc ggatccatgg tgggaccctg catgctgctg ctgctgctgc tgctaggcct 3780 cacccagtgt cactctgttc ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac 3840 tggtgtgtct cataagtgac ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata 3900 gcagccccgt caaggcggga gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt 3960 acgcggccag cagctacctg agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac aaaagctaca 4020 gctgccaggt cacgcatgaa gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt 4080 catagtaaaa gcttgtcgtt ggatggaaag gaaaagagtt ctacagggaa acttggaccc 4140 gcttcatgga agacagcttc cccattgtta acgaccaaga agtgatggat gttttccttg 4200 ttgtcaacat gcgtcccact agacccaacc gttgttacaa attcctggcc caacacgctc 4260 tgcgttgcga ccccgactat gtacctcatg acgtgattag gatcgtcgag ccttcatggg 4320 tgggcagcaa caacgagtac cgcatcagcc tggctaagaa gggcggcggc tgcccaataa 4380 tgaaccttca ctctgagtac accaactcgt tcgaacagtt catcgatcgt gtcatctggg 4440 agaacttcta caagcccatc gtttacatcg gtaccgactc tgctgaagag gaggaaattc 4500 tccttgaagt ttccctggtg ttcaaagtaa aggagtttgc accagacgca cctctgttca 4560 ctggtccggc gtattaaaac acgatacatt gttattagta catttattaa gcgctagatt 4620 ctgtgcgttg ttgatttaca gacaattgtt gtacgtattt taataattca ttaaatttat 4680 aatctttagg gtggtatgtt agagcgaaaa tcaaatgatt ttcagcgtct ttatatctga 4740 atttaaatat taaatcctca atagatttgt aaaataggtt tcgattagtt tcaaacaagg 4800 gttgtttttc cgaaccgatg gctggactat ctaatggatt ttcgctcaac gccacaaaac 4860 ttgccaaatc ttgtagcagc aatctagctt tgtcgatatt cgtttgtgtt ttgttttgta 4920 ataaaggttc gacgtcgttc aaaatattat gcgcttttgt atttctttca tcactgtcgt 4980 tagtgtacaa ttgactcgac gtaaacacgt taaataaagc tagcttggac atatttaaca 5040 tcgggcgtgt tagctttatt aggccgatta tcgtcgtcgt cccaaccctc gtcgttagaa 5100 gttgcttccg aagacgattt tgccatagcc acacgacgcc tattaattgt gtcggctaac 5160 acgtccgcga tcaaatttgt agttgagctt tttggaatta tttctgattg cgggcgtttt 5220 tgggcgggtt tcaatctaac tgtgcccgat tttaattcag acaacacgtt agaaagcgat 5280 ggtgcaggcg gtggtaacat ttcagacggc aaatctacta atggcggcgg tggtggagct 5340 gatgataaat ctaccatcgg tggaggcgca ggcggggctg gcggcggagg cggaggcgga 5400 ggtggtggcg gtgatgcaga cggcggttta ggctcaaatg tctctttagg caacacagtc 5460 ggcacctcaa ctattgtact ggtttcgggc gccgtttttg gtttgaccgg tctgagacga 5520 gtgcgatttt tttcgtttct aatagcttcc aacaattgtt gtctgtcgtc taaaggtgca 5580 gcgggttgag gttccgtcgg cattggtgga gcgggcggca attcagacat cgatggtggt 5640 ggtggtggtg gaggcgctgg aatgttaggc acgggagaag gtggtggcgg cggtgccgcc 5700 ggtataattt gttctggttt agtttgttcg cgcacgattg tgggcaccgg cgcaggcgcc 5760 gctggctgca caacggaagg tcgtctgctt cgaggcagcg cttggggtgg tggcaattca 5820 atattataat tggaatacaa atcgtaaaaa tctgctataa gcattgtaat ttcgctatcg 5880 tttaccgtgc cgatatttaa caaccgctca atgtaagcaa ttgtattgta aagagattgt 5940 ctcaagctcc gcacgccgat aacaagcctt ttcattttta ctacagcatt gtagtggcga 6000 gacacttcgc tgtcgtcgac tcgagttcta tagtgtcacc taaatcgtat gtgtatgata 6060 cataaggtta tgtattaatt gtagccgcgt tctaacgaca atatgtccat atggtgcact 6120 ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 6180 gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 6240 gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagagga 6300 aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 6360 acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 6420 atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 6480 tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 6540 gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 6600 gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 6660 gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 6720 ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 6780 tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 6840 acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 6900 cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 6960 catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 7020 cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 7080 ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 7140 ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 7200 ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 7260 atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 7320 gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat 7380 atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 7440 tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 7500 cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 7560 ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 7620 actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta 7680 gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 7740 ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 7800 gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 7860 acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcat 7920 tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 7980 gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 8040 cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 8100 cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 8160 ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc 8220 gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg 8280 agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt 8340 cattaatgca ggttaacctg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagaccggc 8400 agatcgatct gtcga                                                  8415 <210>8 <211>40 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>8 actagttttt atggtcgtgt acatttctta catctatgcg                       40 <210>9 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>9 aggcctgagg ctacagctct ccctgggc                                   28 <210>10 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>10 catcagaatc cttactttgt gacac                                            25 <210>11 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>11 ccatagacct catgtctagc acag                                             24 <210>12 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>12 ctgtgcacct ccttcccatt cac                                              23 <210>13 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>13 ggcagtatct ggagtcattg agg                                              23 <210>14 <211>32 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>14 gcgacctcgg gtgggcccac cgttgtttca gg                               32 <210>15 <211>33 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>15 cagctggtac accacttggt gagggttctg gat                              33 <210>16 <211>37 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>16 actagtgcaa cgttgactaa gaatttcatg cggccgc                          37 <210>17 <211>37 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>17 gcggccgcat gaaattctta gtcaacgttg cactagt                          37 <210>18 <211>60 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>18 gcggatccat ggtgggaccc tgcatgctgc tgctgctgct gctgctaggc ctggaattcc 60 <210>19 <211>60 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>19 ggaattccag gcctagcagc agcagcagca gcagcatgca gggtcccacc atggatccgc 60 <210>20 <211>37 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>20 tgtgactagt atgtatcggc ccatcggtct tccccct                          37 <210>21 <211>35 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>21 tttctagact attatttacc cggagacagg gagag                            35 <210>22 <211>43 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>22 ctaggcctat gtatcaccaa gtgtcttcat cttcccgcca tct                     43 <210>23 <211>36 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>23 cccaagcttc tattaacact ctcccctgtt gaagct                             36  <210>24 <211>279 <212>PRT <213>未知生物 <220> <223>未知生物的描述：TCRα链 <400>24 Met Ala Cys Pro Gly Phe Leu Trp Ala Leu Val Ile Ser Thr Cys Leu   1               5                  10                  15 Glu Phe Ser Met Ala Gln Thr Val Thr Gln Ser Gln Pro Glu Met Ser

         20                  25                  30 Val Gln Glu Ala Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Thr Tyr Asp Thr Ser

     35                  40                  45 Glu Ser Asp Tyr Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Arg Gln

 50                  55                  60 Met Ile Leu Val Ile Arg Gln Glu Ala Tyr Lys Gln Gln Asn Ala Thr  65                  70                  75                  80 Glu Asn Arg Phe Ser Val Asn Phe Gln Lys Ala Ala Lys Ser Phe Ser

             85                  90                  95 Leu Lys Ile Ser Asp Ser Gln Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Phe Cys

        100                 105                 110 Ala Tyr Arg Ser Ala Tyr Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe

    115                 120                 125 Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp

130                 135                 140 Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val 145                 150                 155                 160 Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys

            165                 170                 175 Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser

        180                 185                 190 Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp

    195                 200                 205 Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr

210                 215             220 Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys 225                 230                 235                 240 Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile

            245                 250                 255 Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met

        260                 265                 270 Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

    275 <210>25 <211>311 <212>PRT <213>未知生物 <220> <223>未知生物的描述：TCR β链 <400>25 Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala   1               5                  10                  15 Asp His Ala Asp Thr Gly Val Ser Gln Asn Pro Arg His Lys Ile Thr

         20                  25                  30 Lys Arg Gly Gln Asn Val Thr Phe Arg Cys Asp Pro Ile Ser Glu His

     35                  40                  45 Asn Arg Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe

 50                  55                  60 Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln Leu Glu Lys Ser Arg Leu Leu  65                  70                  75                  80 Ser Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Lys Gly Ser Phe Ser Thr Leu

             85                  90                  95 Glu Ile Gln Arg Thr Glu Gln Gly Asp Ser Ala Met Tyr Leu Cys Ala

        100                 105                 110 Ser Ser Pro Gly Thr Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg

    115                 120                 125 Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala

130                 135                 140 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 145                 150                 155                 160 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser

            165                 170                 175 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro

        180                 185                 190 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu

        195             200                 205 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn

210                 215                 220 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 225                 230                 235                 240 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu

            245                 250                 255 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln

        260                 265                 270 Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala

    275                 280             285 Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val

290                 295                 300 Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly 305                 310 <210>26  <211>18 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>26 aaatgataac catctcgc                                           18 <210>27 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>27 tttactgttt tcgtaacagt tttg                                    24 <210>28 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>28 ttggagggcg ttatccacct tc                                        22 <210>29 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>29 ctgtaaatca acaacgcaca g                                         21 <210>30 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>30 caacaacgca cagaatctag                                           20 <210>31 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>31 gggaccttta attcaaccca acac                                      24 <210>32 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>32 aaacgcgttg gagtcttgtg tgc                                        23 <210>33 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>33 ggaagtagtc cttgaccagg cag                                        23 <210>34 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>34 ctgagttcca cgacaccgtc ac                                         22 <210>35 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>35 tagagtcctg aggactgtag gac                                        23 <210>36 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>36 ggtcgttaac aatggggaag ctg                                    23 <210>37 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>37 tttactgttt tcgtaacagt tttg                                   24 <210>38 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>38 ggtcgttaac aatggggaag ctg                                    23 <210>39 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：引物 <400>39 gaagtcactt atgagacaca ccag                                   24 <210>40 <400>40 000 <210>41 <211>9182 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：质粒pTRABac/9F12 DNA序列 <400>41 gcagttcgtt gacgccttcc tccgtgtggc cgaacacgtc gagcgggtgg tcgatgacca 60 gcggcgtgcc gcacgcgacg cacaagtatc tgtacaccga atgatcgtcg ggcgaaggca 120 cgtcggcctc caagtggcaa tattggcaaa ttcgaaaata tatacagttg ggttgtttgc 180 gcatatctat cgtggcgttg ggcatgtacg tccgaacgtt gatttgcatg caagccgaaa 240 ttaaatcatt gcgattagtg cgattaaaac gttgtacatc ctcgctttta atcatgccgt 300 cgattaaatc gcgcaatcga gtcaagtgat caaagtgtgg aataatgttt tctttgtatt 360 cccgagtcaa gcgcagcgcg tattttaaca aactagccat cttgtaagtt agtttcattt 420 aatgcaactt tatccaataa tatattatgt atcgcacgtc aagaattaac aatgcgcccg 480 ttgtcgcatc tcaacacgac tatgatagag atcaaataaa gcgcgaatta aatagcttgc 540 gacgcaacgt gcacgatctg tgcacgcgtt ccggcacgag ctttgattgt aataagtttt 600 tacgaagcga tgacatgacc cccgtagtga caacgatcac gcccaaaaga actgccgact 660 acaaaattac cgagtatgtc ggtgacgtta aaactattaa gccatccaat cgaccgttag 720 tcgaatcagg accgctggtg cgagaagccg cgaagtatgg cgaatgcatc gtataacgtg 780 tggagtccgc tcattagagc gtcatgttta gacaagaaag ctacatattt aattgatccc 840 gatgatttta ttgataaatt gaccctaact ccatacacgg tattctacaa tggcggggtt 900 ttggtcaaaa tttccggact gcgattgtac atgctgttaa cggctccgcc cactattaat 960 gaaattaaaa attccaattt taaaaaacgc agcaagagaa acatttgtat gaaagaatgc 1020 gtagaaggaa agaaaaatgt cgtcgacatg ctgaacaaca agattaatat gcctccgtgt 1080 ataaaaaaaa tattgaacga tttgaaagaa aacaatgtac cgcgcggcgg tatgtacagg 1140 aagaggttta tactaaactg ttacattgca aacgtggttt cgtgtgccaa gtgtgaaaac 1200 cgatgtttaa tcaaggctct gacgcatttc tacaaccacg actccaagtg tgtgggtgaa 1260 gtcatgcatc ttttaatcaa atcccaagat gtgtataaac caccaaactg ccaaaaaatg 1320 aaaactgtcg acaagctctg tccgtttgct ggcaactgca agggtctcaa tcctatttgt 1380 aattattgaa taataaaaca attataaatg ctaaatttgt tttttattaa cgatacaaac 1440 caaacgcaac aagaacattt gtagtattat ctataattga aaacgcgtag ttataatcgc 1500 tgaggtaata tttaaaatca ttttcaaatg attcacagtt aatttgcgac aatataattt 1560 tattttcaca taaactagac gccttgtcgt cttcttcttc gtattccttc tctttttcat 1620 ttttctcctc ataaaaatta acatagttat tatcgtatcc atatatgtat ctatcgtata 1680 gagtaaattt tttgttgtca taaatatata tgtctttttt aatggggtgt atagtaccgc 1740 tgcgcatagt ttttctgtaa tttacaacag tgctattttc tggtagttct tcggagtgtg 1800 ttgctttaat tattaaattt atataatcaa tgaatttggg atcgtcggtt ttgtacaata 1860 tgttgccggc atagtacgca gcttcttcta gttcaattac accatttttt agcagcaccg 1920 gattaacata actttccaaa atgttgtacg aaccgttaaa caaaaacagt tcacctccct 1980 tttctatact attgtctgcg agcagttgtt tgttgttaaa aataacagcc attgtaatga 2040 gacgcacaaa ctaatatcac aaactggaaa tgtctatcaa tatatagttg ctgatatctc 2100 cccagcatgc ctgctattgt cttcccaatc ctcccccttg ctgtcctgcc ccaccccacc 2160 ccccagaata gaatgacacc tactcagaca atgcgatgca atttcctcat tttattagga 2220 aaggacagtg ggagtggcac cttccagggt caaggaaggc acgggggagg ggcaaacaac 2280 agatggctgg caactagaag gcacagtcga ggctgatcag cgagctctag tctagactat 2340 tatttacccg gagacaggga gaggctcttc tgcgtgtagt ggttgtgcag agcctcatgc 2400 atcacggagc atgagaagac gttcccctgc tgccacctgc tcttgtccac ggtgagcttg 2460 ctgtagagga agaaggagcc gtcggagtcc agcacgggag gcgtggtctt gtagttgttc 2520 tccggctgcc cattgctctc ccactccacg gcgatgtcgc tgggatagaa gcctttgacc 2580 aggcaggtca ggctgacctg gttcttggtc agctcatccc gggatggggg cagggtgtac 2640 acctgtggtt ctcggggctg ccctttggct ttggagatgg ttttctcgat gggggctggg 2700 agggctttgt tggagacctt gcacttgtac tccttgccat tcagccagtc ctggtgcagg 2760 acggtgagga cgctgaccac acggtacgtg ctgttgtact gctcctcccg cggctttgtc 2820 ttggcattat gcacctccac gccgtccacg taccagttga acttgacctc agggtcttcg 2880 tggctcacgt ccaccaccac gcatgtgacc tcaggggtcc gggagatcat gagggtgtcc 2940 ttgggttttg gggggaagag gaagactgac ggtcccccca ggagttcagg tgccggtggg 3000 catgtgtgag ttttgtcaca agatttgggc tcaactttct tgtccacctt ggtgttgctg 3060 ggcttgtgat tcacgttgca gatgtaggtc tgggtgccca agctgctgga gggcacggtc 3120 accacgctgc tgagggagta gagtcctgag gactgtagga cagccgggaa ggtgtgcacg 3180 ccgctggtca gggcgcctga gttccacgac accgtcaccg gttcggggaa gtagtccttg 3240 accaggcagc ccagggccgc tgtgccccca gaggtgctct tggaggaggg tgccaggggg 3300 aagaccgatg ggcccttggt ggaggctgag gagacggtga ccagggttcc ctggccccag 3360 gagtcaaagt agtagtgggc cagccactgt tttcccgctt tcgcacagta ataaacggcc 3420 gtgtcctcgg ctctcaggct gttcaagtgc agatatagcg tgttcatgga attgtctctg 3480 gagatggtca atcggcccgt cacggagtct gcataatatg tggtagttcc tctagcacta 3540 atagccgcga cccactccag ccccatccct ggagcctggc ggacccagct catggcatag 3600 ctgctaaagc tgaatccaga ggctgcacag gagagtctca cggacccccc aggctgtacc 3660 aagcctcccc cagactgcac cagctgcacc tcgtccgcat agatgtaaga aatgtacacg 3720 accataaaaa ctagtgcaac gttgactaag aatttcatgc ggccgcgtac gattgtaaat 3780 aaaatgtaat ttacagtata gtattttaat taatatacaa atgatttgat aataattctt 3840 atttaactat aatatattgt gttgggttga attaaaggtc ccggcatcct caaatgcata 3900 atatcatagt cccccttgtt gtaagtgatg cgtatttctg aatctttgta aaatagcaca 3960 caggactcca acgcgtttgg cgttttattt tcttgctcga ggatatcatg gagataatta 4020 aaatgataac catctcgcaa ataaataagt attttactgt tttcgtaaca gttttgtaat 4080 aaaaaaacct ataaatattc cggattattc ataccgtccc accatcgggc gtgctagcgg 4140 atccatggtg ggaccctgca tgctgctgct gctgctgctg ctaggcctga ggctacagct 4200 ctccctgggc atcgacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg 4260 agacagagtc atcatcactt gccgggcaag tcagagtatt agcacctatt taaattggta 4320 tcagcagaaa ccagggaaag cccctaaact cctgatctat tatgcaacca atttgcaaag 4380 tggggtccca tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag 4440 cagtctgcaa cctgaagatt ttgcgactta ttattgtcaa cagagttcca acaccgtcac 4500 tttcggccct gggaccaaag tggatatgaa gactgtggct gcaccaagtg tcttcatctt 4560 cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa 4620 cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa 4680 ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac 4740 cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca 4800 tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt aatagaagct 4860 tgtcgttgga tggaaaggaa aagagttcta cagggaaact tggacccgct tcatggaaga 4920 cagcttcccc attgttaacg accaagaagt gatggatgtt ttccttgttg tcaacatgcg 4980 tcccactaga cccaaccgtt gttacaaatt cctggcccaa cacgctctgc gttgcgaccc 5040 cgactatgta cctcatgacg tgattaggat cgtcgagcct tcatgggtgg gcagcaacaa 5100 cgagtaccgc atcagcctgg ctaagaaggg cggcggctgc ccaataatga accttcactc 5160 tgagtacacc aactcgttcg aacagttcat cgatcgtgtc atctgggaga acttctacaa 5220 gcccatcgtt tacatcggta ccgactctgc tgaagaggag gaaattctcc ttgaagtttc 5280 cctggtgttc aaagtaaagg agtttgcacc agacgcacct ctgttcactg gtccggcgta 5340 ttaaaacacg atacattgtt attagtacat ttattaagcg ctagattctg tgcgttgttg 5400 atttacagac aattgttgta cgtattttaa taattcatta aatttataat ctttagggtg 5460 gtatgttaga gcgaaaatca aatgattttc agcgtcttta tatctgaatt taaatattaa 5520 atcctcaata gatttgtaaa ataggtttcg attagtttca aacaagggtt gtttttccga 5580 accgatggct ggactatcta atggattttc gctcaacgcc acaaaacttg ccaaatcttg 5640 tagcagcaat ctagctttgt cgatattcgt ttgtgttttg ttttgtaata aaggttcgac 5700 gtcgttcaaa atattatgcg cttttgtatt tctttcatca ctgtcgttag tgtacaattg 5760 actcgacgta aacacgttaa ataaagctag cttggacata tttaacatcg ggcgtgttag 5820 ctttattagg ccgattatcg tcgtcgtccc aaccctcgtc gttagaagtt gcttccgaag 5880 acgattttgc catagccaca cgacgcctat taattgtgtc ggctaacacg tccgcgatca 5940 aatttgtagt tgagcttttt ggaattattt ctgattgcgg gcgtttttgg gcgggtttca 6000 atctaactgt gcccgatttt aattcagaca acacgttaga aagcgatggt gcaggcggtg 6060 gtaacatttc agacggcaaa tctactaatg gcggcggtgg tggagctgat gataaatcta 6120 ccatcggtgg aggcgcaggc ggggctggcg gcggaggcgg aggcggaggt ggtggcggtg 6180 atgcagacgg cggtttaggc tcaaatgtct ctttaggcaa cacagtcggc acctcaacta 6240 ttgtactggt ttcgggcgcc gtttttggtt tgaccggtct gagacgagtg cgattttttt 6300 cgtttctaat agcttccaac aattgttgtc tgtcgtctaa aggtgcagcg ggttgaggtt 6360 ccgtcggcat tggtggagcg ggcggcaatt cagacatcga tggtggtggt ggtggtggag 6420 gcgctggaat gttaggcacg ggagaaggtg gtggcggcgg tgccgccggt ataatttgtt 6480 ctggtttagt ttgttcgcgc acgattgtgg gcaccggcgc aggcgccgct ggctgcacaa 6540 cggaaggtcg tctgcttcga ggcagcgctt ggggtggtgg caattcaata ttataattgg 6600 aatacaaatc gtaaaaatct gctataagca ttgtaatttc gctatcgttt accgtgccga 6660 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cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact 7560 tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat 7620 tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga 7680 tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc 7740 ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga 7800 tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag 7860 cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc 7920 gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt 7980 ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct 8040 acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg 8100 cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg 8160 atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 8220 tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 8280 tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 8340 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ga                                                                9182 <210>42 <211>8435 <212>DNA <213>未知生物 <220> <223>未知生物的描述：pTRABacHuLCHC1 DNA序列 <400>42 gcagttcgtt gacgccttcc tccgtgtggc cgaacacgtc gagcgggtgg tcgatgacca 60 gcggcgtgcc gcacgcgacg cacaagtatc tgtacaccga atgatcgtcg ggcgaaggca 120 cgtcggcctc caagtggcaa tattggcaaa ttcgaaaata tatacagttg ggttgtttgc 180 gcatatctat cgtggcgttg ggcatgtacg tccgaacgtt gatttgcatg caagccgaaa 240 ttaaatcatt gcgattagtg cgattaaaac gttgtacatc ctcgctttta atcatgccgt 300 cgattaaatc gcgcaatcga gtcaagtgat caaagtgtgg aataatgttt tctttgtatt 360 cccgagtcaa gcgcagcgcg tattttaaca aactagccat cttgtaagtt agtttcattt 420 aatgcaactt tatccaataa tatattatgt atcgcacgtc aagaattaac aatgcgcccg 480 ttgtcgcatc tcaacacgac tatgatagag atcaaataaa gcgcgaatta aatagcttgc 540 gacgcaacgt gcacgatctg tgcacgcgtt ccggcacgag ctttgattgt aataagtttt 600 tacgaagcga tgacatgacc cccgtagtga caacgatcac gcccaaaaga actgccgact 660 acaaaattac cgagtatgtc ggtgacgtta aaactattaa gccatccaat cgaccgttag 720 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