技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物纳米医药技术领域，具体涉及一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法及其应用。
背景技术
[0002] 肿瘤免疫
治疗是应用免疫学方法，激发与诱导体内的免疫应答反应，产生杀伤肿瘤细胞的特异性因子杀伤肿瘤细胞、从而抑制肿瘤生长的治疗方式。因为恶性黑色素瘤免疫原性强、对免疫治疗敏感，在所有的
恶性肿瘤治疗中，免疫治疗在转移型黑色素瘤中应用最为广泛。在免疫治疗中，肿瘤细胞疫苗是近年来研究的热点之一。肿瘤细胞疫苗是通过物理、化学或者生物学的方法(加热、
辐射等)处理肿瘤细胞制备得到的，此种疫苗保留了原有的免疫原性而且没有致瘤作用，其主要通过启动以肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞反应为主的抗肿瘤效应。全肿瘤细胞疫苗不仅可以提供肿瘤全部
抗原，诱导
机体产生针对肿瘤抗原的免疫应答，而且不引发机体的排斥反应，是一种理想的疫苗方案。但肿瘤抗原疫苗易降解、难以有效递送至淋巴结中，且免疫原性低，即使递送到免疫细胞中，也会很快降解，免疫反应激活效率低下。因此，急需建立有效方法和手段克服肿瘤细胞疫苗的上述
缺陷。
[0003] CpG基序是指一类以非甲基化的胞嘧啶和
鸟嘌呤二核苷酸为核心的寡聚脱
氧核糖核苷酸序列(CpG-ODN)。这种序列可激活多种免疫效应细胞，促进树突状细胞、巨噬细胞等专职抗原提呈细胞以及B细胞的成熟和活化，刺激细胞因子的分泌，为T细胞、NK细胞的活化提供共刺激
信号。在动物模型中，CpG-ODN可以增强各种类型的抗原(例如：
全细胞疫苗)特异的体液和细胞免疫应答，是一种高效低毒的免疫佐剂。但是，未经修饰的CpG-ODN通常易被核酸酶降解，细胞摄取率低。
纳米技术的发展为解决核酸药物的递送问题提供了新的工具，已有大量研究报道显示，
纳米材料负载的CpG核酸药物表现出高活性、低毒性、
生物相容性好等特点，有望作为新型免疫治疗制剂应用于
疾病的治疗之中。
[0004] 多肽
水凝胶是以多肽分子为凝胶因子，通过自组装作用束缚住水分子形成的半固体透明状凝胶，其生物相容性好，无毒
副作用，近年来被广泛作为新型药物载体来研究。多肽水凝胶作为药物载体，能够装载各种药物及疫苗，且药物包封率可达百分之百。同时，凝胶体系由于其良好的结构可控性，是一类重要的药物缓
控释载体，其释药缓慢，药物浓度平稳，在延长药物作用时间，减少副作用方面有明显的优势。但目前的多肽水凝胶均无免疫激活功效。
[0005] 因此，开发一种既能够增加细胞对其摄取、实现胞浆
定位，又能高效率的激活机体的固有免疫及适应性免疫反应的疫苗，成为亟待解决的问题。
发明内容
[0006] 针对
现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法及其应用，该方法可增加肿瘤细胞疫苗的细胞摄取和胞浆定位，更大程度的激活机体的固有免疫和适应性免疫，增加抗肿瘤免疫效应，解决普通肿瘤抗原疫苗易降解，免疫原性低，免疫反应激活效率低下等问题。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] 本发明的第一个目的在于提出一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法，步骤为：充分混合肿瘤细胞裂解液、多肽水凝胶水溶液和CpG-ODN水溶液，向
混合液中滴加
氯化钠水溶液，直到混合液中氯化钠的浓度为0.9wt％；静置混合液获得稳定装载肿瘤杀伤性多肽/CpG/lysis的杂交纳米肿瘤疫苗。
[0009] 进一步地，所述肿瘤细胞裂解液的制备方法为：肿瘤细胞经预冷的PBS重悬后进行5个
冰融循环，冰融循环后获得的裂解液经离心分离后弃掉离心管底部的细胞碎片，得到的上层细胞液
冷冻干燥为粉末储存备用；待配置时，将粉末溶解于水中最终得到肿瘤细胞裂解液；1个冰融循环为：置液氮内冷冻5min后置于37°水浴锅中融化5min。
[0010] 进一步地，所述多肽水凝胶包括C端的自组装结构域RAD32和N端的杀伤结构域
蜂毒肽，所述自组装结构域和所述杀伤结构域通过柔性结构域GG连接形成Melittin-RADA32。
[0011] 更进一步地，所述杂交纳米肿瘤疫苗中，肿瘤细胞裂解物的终浓度为10μg/ml，Melittin-RADA32的终浓度为5-20mg/ml，CpG-ODN的终浓度为1-2mg/ml。
[0012] 进一步地，配制肿瘤细胞裂解液、多肽水凝胶水溶液和CpG-ODN水溶液时，采用的
溶剂均为去离子水。
[0013] 进一步地，所述稳定装载肿瘤杀伤性多肽/CpG/lysis的杂交纳米肿瘤疫苗是通过静置时
氨基酸分子间的氢键作用自组装形成的，反应条件为在4℃下静置2-12小时。
[0014] 进一步地，所述氯化钠水溶液的初始
质量浓度为10％。
[0015] 本发明的第二个目的在于提出上述任一项所述的制备方法获得的杂交纳米肿瘤疫苗。
[0016] 本发明的第三个目的在于提出上述的杂交纳米肿瘤疫苗在制备肿瘤疫苗药物中的用途。
[0017] 与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：
[0018] (1)本发明提供的一种用于肿瘤免疫治疗的纳米肿瘤疫苗的制备方法，利用多肽水凝胶纳米载体作为
桥梁，装载肿瘤细胞抗原和免疫激活剂，提供了更高的免疫激活效率，且包封率可达百分之百。
[0019] (2)本发明选用的多肽水凝胶载体具有缓释作用，可以延长作用时间，持续激活机体的免疫反应。
[0020] (3)通过本发明的方法制备的肿瘤疫苗具有合适的粒径(20-50nm)，能够高效地聚集到淋巴结并停留，增加肿瘤抗原被专职APC摄取并递呈的效率。克服了因粒径太大导致的纳米粒生理性停留在
注射部位、与细胞外基质相互作用、抗原难以释放的问题，也克服了因粒径太小导致的进出淋巴结速率过快、减少APC对肿瘤抗原的识别、不利于递呈等问题。
[0021] (4)本发明选用的多肽水凝胶纳米载体，在体内经过生物化学反应后，反应降解产物为氨基酸，不产生免疫反应和
炎症反应，毒副作用低。
[0022] (5)实验证明，本发明制备的杂交纳米肿瘤疫苗无论是在黑色素瘤小鼠
预防模型还是治疗模型中，均表现出很好的抗肿瘤作用。
[0023] (6)本发明提供的杂交纳米肿瘤疫苗制备方法工艺简单，便于规模化生产。
附图说明
[0025] 图2为实施例1中MCL透射电镜图。
[0026] 图3为实施例2中对MCL安全性评价时，不同处理方式的小鼠血液中的AST、ALT、BUN、Cr、UA指标的变化情况。
[0027] 图4为实施例3中MCL对DC细胞的激活能
力评估结果。
[0028] 图5为实施例4中MCL预防治疗抗肿瘤能力评估结果。
[0029] 图6为实施例5中MCL原位皮下治疗抗肿瘤能力评估结果，其中图6A为MCL原位皮下治疗的抗肿瘤作用，小鼠的瘤体变化结果；其中6B为MCL原位皮下治疗的抗肿瘤作用，小鼠的生存期变化情况；C和D为原位皮下治疗的抗肿瘤作用，小鼠的肿瘤生长曲线。
具体实施方式
[0030] 下面
申请人结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为本发明
请求保护范围的限定。本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道获得。
[0031] 实施例1：杂交纳米肿瘤疫苗的制备
[0032] 具体制备方法如下：
[0033] (1)取20mg无菌Melittin-RADA32粉末溶解于1ml无菌去离子水中，获得浓度为20mg/ml的Melittin-RADA32溶液备用。
[0034] (2)配置8mg/ml的CpG-ODN和40μg/ml的lysis水溶液等比混合。
[0035] (3)将步骤(1)中的Melittin-RADA32溶液与步骤(2)中的溶液充分混合，并在混合液中加入氯化钠水溶液(终浓度为0.9wt％)，获得Melittin-RADA32/CpG/lysis纳米疫苗，其中Melittin-RADA32、CpG-ODN的终浓度、lysis的终浓度分别为10mg/ml、2mg/ml和10μg/ml。将该混合液置于4℃下放置2小时即可形成凝胶，如图1所示，制备的纳米疫苗肉眼下为乳白色凝胶状物。
[0036] 对本实施例MLC自组装杂交纳米疫苗进行理化性质考察，其中粒径通过英国
马尔文仪器公司生产的纳米粒度仪测定，形态通过JEM-100CXII透射(日本Jeol公司)。透射电镜观察结果如图2所示，纳米粒度仪结果显示本实施例的肿瘤疫苗粒径范围为20-50nm。多肽水凝胶对肿瘤细胞抗原和免疫激活剂包封率接近100％。
[0037] 实施例2：评估MLC的安全性
[0038] 取对数生长期的B16-luc10细胞，调整细胞浓度为1x10*7/ml，接种至C57小鼠右侧3
后肢皮下，接种量为50μl，待肿瘤生长至40-50mm ，将小鼠随机分为PBS组、Melittin-RADA32组(MR组)、CpG+Lysis组(CL组)、MCL组(实施例1MLC自组装杂交纳米疫苗)，每组5-6只鼠。采用尾根部+足垫皮下注射的方法进行注射，每次注射的剂量为50μl。隔天
给药1次，共给药3次。当PBS对照组瘤体体积达到1000mm3后分别取小鼠的心、肝、脾、
肺、肾进行HE
染色，同时取各组小鼠的血液进行生化检测，如图3所示，AST、ALT、BUN、Cr、UA均在正常范围。
实验结果证明，新型杂交疫苗MCL对小鼠的各脏器未造成损伤。
[0039] 实施例3：MCL对DC细胞的激活能力评估
[0040] 从6-8周龄雄性C57小鼠股骨及胫骨获取骨髓干细胞，用含有M-CSF的1640培养基培育5天获得未成熟的DC细胞后种植在24孔板中，分为PBS组、Melittin-RADA32组(MR组)、CpG+Lysis组(CL组)、MCL组(实施例1MLC自组装杂交纳米疫苗)和脂多糖LPS(阳性对照)，各组取40μl对应的溶液与未成熟的DC细胞共孵育，刺激DC细胞成熟，24小时后利用流式细胞术检测CD11c、CD80、CD86细胞激活情况(如图4所示)，实验结果表明，具有稳定装载的新型杂交纳米疫苗MCL可以促进DC的成熟。
[0041] 实施例4：MCL预防治疗
抗肿瘤效果研究
[0042] 构建荷瘤小鼠模型并随机分成4组，第一组小鼠尾根部+足垫注射50μl PBS、第二组尾根部+足垫注射50μl MR、第三组尾根部+足垫注射50μl CL、第四组尾根部+足垫注射50μl MCL，此时记录为第1天，隔天给药1次，共给药3次，第7天皮下种植恶性黑色素瘤细胞B16-Luc10(2*105/100μl/只)，定期监测瘤体的变化。结果如图5所示。实验显示，新型杂交疫苗MCL可以显著抑制肿瘤生长。
[0043] 实施例5：MCL原位皮下治疗抗肿瘤效果研究
[0044] 构建荷瘤小鼠模型并随机分成4组，建模当天记录为第1天。皮下移植瘤直径达到3mm时开始给药，第一组小鼠尾根部+足垫注射50μl PBS、第二组小鼠尾根部+足垫注射50μl MR、第三组小鼠尾根部+足垫注射50μl CL、第四组小鼠尾根部+足垫注射50μl MCL，隔天给药1次，共给药3次，当各组小鼠瘤体体积达到1000mm3时记录小鼠死亡情况，进行生存分析。
结果如图6所示，结果表明，新型杂交疫苗MCL具有显著的抑制肿瘤生长的能力，可以延长小鼠的生存期。
[0045] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉
本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
