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一种生产 蜂毒肽的方法

阅读：552发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种生产蜂毒肽的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种生产蜂毒肽的方法，具体利用发根农杆菌K599介导的大豆转基因技术生产蜂毒肽蛋白的方法，能够高效地表达蜂毒肽蛋白。同时，在目的蛋白中间使用蛋白酶切位点，保证了蜂毒肽不会杀死植物细胞，纯化后加入肠激酶后，蜂毒肽能够被切下来。此发明首次在大豆发根里面成功表达出蜂毒肽蛋白，较之前原核表达的蜂毒肽来说，其活性更强，可溶性更高，而且植物体内表达的蜂毒肽蛋白粗提取就可以用来做药，因为植物体内没有对人体有害的物质。，下面是一种生产蜂毒肽的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种生产蜂毒肽的方法，其特征在于：所述方法包括载体设计以及构建、电击转化K599农杆菌感受态、大豆的培养与侵染、蛋白纯化。
2.根据权利要求1所述的一种生产蜂毒肽的方法，其特征在于：所述的载体设计以及构建为：设计引物Egfp F：5’-3’ cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg，Egfp R：5’-3’ CTTGTCGTCGTCGTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC，
millitin F：5’-3’ ggacgacgacgacaagggaattggagcagttctgaa，
millitin R：5’-3’ GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC，
首先各自以Pci Egfp载体和合成的PCI millitin为模板扩增出来egfp和millitin，然后利用Egfp F：5’-3’ cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg和millitin R：5’-3’GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC引物进行重叠 pcr，将egfp和millitin扩增到一起，回收后和限制性内切酶BamHI线性化的Pcambia 3301载体连接，转化DH5a，菌落pcr验证大小正确的克隆送测序，测序正确的单菌落提取Pcambia 3301 nanoluc gfp millitin质粒并保菌。
3.根据权利要求1所述的一种生产蜂毒肽的方法，其特征在于：所述的电击转化K599农杆菌感受态为将1微克Pcambia 3301 nanoluc gfp millitin质粒和100微升K599感受态细胞混匀，然后1800V电击转化6ms，加入600微升LB液体培养基，220rpm 28℃孵育1h，4000rpm离心5min后，涂50ug/ml卡那霉素抗性的LB固体培养基平板，两天后挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的菌落保菌。
4.根据权利要求1所述的一种生产蜂毒肽的方法，其特征在于：所述的大豆的培养与侵染为：将培养好的大豆子叶剪下来，用70%酒精表面消毒，并在子叶背部用刀片切掉1-2cm长的棱，将其平铺到培养皿里面，培养皿里面垫一层灭过的滤纸，并且加入5ml的双蒸水；与此同时，将前一步骤中获得的K599农杆菌提前一晚上摇起来，至OD600为1.2，然后用10mM的MgSO4溶液调至OD600为0.35，吸取20微升用枪头打到子叶切口处，然后盖上培养皿盖子，封口膜封住，置于75 mmol*m−2*s−1 光强16h光照/8h黑暗培养，15d后，看到伤口处有明显的根长出来，此时将培养皿转入全日照下，长大7d后，将根剪下来，进行蛋白检测。
5.根据权利要求1所述的一种生产蜂毒肽的方法，其特征在于：蛋白纯化为：将剪下来的发根冻入液氮，并在研钵内研磨，随后加入植物裂解液，1克样品需要1ml裂解；4℃垂直混匀20min，然后14000g 4℃高速离心10min，吸取上清液，加入30μLGFP beas，垂直混匀4h，
800g离心5min，然后加入1ml wash buffer，垂直混匀5min，反复洗5次，然后加入50μLPBS和
15μL肠激酶，37℃过夜孵育，800g离心5min，吸取上清液后，超滤，得到蜂毒肽蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种生产蜂毒肽的方法，其特征在于：所述的植物裂解液含20 mM pH 7.5 HEPES，40mM KCl，1mM EDTA，1% Triton X-100，1mM PMSF；所述wash buffer含
20 mM pH 7.5 HEPES，40mM KCl，1mM EDTA， 0.1% Triton X-100。

说明书全文

一种生产蜂毒肽的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物试剂发明领域，具体涉及一种生产蜂毒肽的方法。

背景技术

[0002] 上世纪70年代，国外开始对蜂毒肽分子生物学研究，Kindas．Mugge等将从蜂王毒腺中提取的mRNA注入青蛙卵中，合成了蜂毒肽前体蛋白promeliain)。Vlasak等用质粒pBR322构建了蜂王毒腺cDNA文库，并以蜂王毒腺总mRNA制作探针进行杂交，获得了蜂毒肽的cDNA，而王关林等通过RT-PCR方法扩增得到了蜂毒肽前体蛋白的cDNA，测得序列长度为155bp，与Vlasak等发表的序列完全相同；另外再通过在蜂毒肽序列前引入羟胺裂解位点，以定点诱变的方式构建了诱变蛋白表达载体，该载体与β-半乳糖苷酶部分序列相融合，结果在大肠杆菌中成功地表达了诱变蛋白，为基因工程生产蜂毒肽提供了新途径。

[0003] 但是，原核表达蜂毒肽有以下缺陷：（1）原核系统表达的真核生物蛋白质缺乏很多翻译后修饰，使得蜂毒肽的活性不如真核表达系统表达得多。（2）原核表达蜂毒肽为了避免蜂毒对细胞的毒害，通常会在其N端连入GST等标签蛋白从而表达为融合蛋白，这些融合蛋白的可溶性较差，也就是说具有生物活性的蜂毒肽的量非常少。（3）原核表达及真核酵母表达，在发酵的过程中，大肠杆菌及酵母体内会产生大量的内毒素，在纯化蜂毒肽的过程中，需要花费大量的成本去除对人体有害的细胞内毒素。

[0004] 目前植物表达蜂毒肽的瓶颈在于蜂毒肽会使得细胞膜受到破坏，直接表达会造成工程菌、转基因植物的的细胞膜遭到破坏导致死亡。

[0005] 密码子的选择和融合蛋白的选择也会对植物的表达蜂毒肽造成影响。因此我们根据植物的表达偏好，在保持蜂毒肽氨基酸序列保持不变的条件下，更改了一些氨基酸的密码子，使得蜂毒肽能够在植物当中正常表达。

[0006] 另外我们在构建表达载体的过程中选择了保留蜂毒肽的内含子，这样可以保证蜂毒肽在克隆所用的工程大肠杆菌（DH5α）中不会导致工程菌的死亡。我们选择了截短的萤火虫荧光素酶（Nano Firefly Luciferase）作为与蜂毒肽融合表达的报告蛋白，该蛋白只有在有底物作用下发出荧光的特性，不仅能够抑制蜂毒肽的活性，并且能够方便地检测到蜂毒肽融合蛋白的表达。接着我们用羟胺裂解酶识别位点作为蛋白linker连接萤火虫荧光素酶与蜂毒肽。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种生产蜂毒肽的方法。

[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种生产蜂毒肽的方法，包括载体设计以及构建、电击转化K599农杆菌感受态、大豆的培养与侵染、蛋白纯化。

[0009] 所述的载体设计以及构建为：设计引物 E g f p F ：5’- 3’ cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg ，Egf p R：5’-3’ CTTGTCGTCGTCGTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC，millitin F：5’-3’
ggacgacgacgacaagggaattggagcagttctgaa，millitin R：5’-3’
GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC，首先各自以Pci Egfp载体和在公司合成的PCI millitin 为模板扩增出来egfp和millitin，然后利用Egfp F：5’-3’ cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg和millitin R：5’-3’
GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC引物进行重叠 pcr，将egfp和millitin扩增到一起，回收后和限制性内切酶BamHI线性化的Pcambia 3301载体连接，转化DH5a，菌落pcr验证大小正确的克隆送测序，测序正确的单菌落提取Pcambia 3301 nanoluc gfp millitin质粒并保菌。

[0010] Pci Egfp载体：设计Egfp引物如下：Egfp F‘ cagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagga
Egfp R‘：TACCACGCGTGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG
pcr扩增出egfp产物，然后和EcoRI线性化的PCI（neo）载体连接构建成pci egfp载体。

[0011] PCI millitin 为millitin（蜂毒肽）合成到pci neo上。Millitin序列：ggaattggagcagttctgaaggtattaaccacaggattgcccgccctcataagttggattaaacgtaagaggcaacagggt。

[0012] 所述的电击转化K599农杆菌感受态为将1微克Pcambia 3301 nanoluc gfp millitin质粒和100微升K599感受态细胞混匀，然后1800V电击转化6ms，加入600微升LB液体培养基，220rpm 28℃孵育1h，4000rpm离心5min后，涂50ug/ml卡那霉素抗性的LB固体培养基平板，两天后挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的菌落保菌。

[0013] 所述的大豆的培养与侵染为：将培养好的大豆子叶剪下来，用70%酒精表面消毒，并在子叶背部用刀片切掉1-2cm长的棱，将其平铺到培养皿里面，培养皿里面垫一层灭过的滤纸，并且加入5ml的双蒸水；与此同时，将前一步获得的K599农杆菌提前一晚上摇起来，至OD600为1.2，然后用10mM的MgSO4溶液调至OD600为0.35，吸取20微升用枪头打到子叶切口处，然后盖上培养皿盖子，封口膜封住，置于75 mmol*m−2*s−1光强16h光照/8h黑暗培养，15d后，看到伤口处有明显的根长出来，此时将培养皿转入全日照下，长大7d后，将根剪下来，进行蛋白检测。

[0014] 蛋白纯化为：将剪下来的发根冻入液氮，并在研钵内研磨，随后加入植物裂解液，1克样品需要1ml裂解；4℃垂直混匀20min，然后14000g 4℃高速离心10min，吸取上清液，加入30μLGFP beas，垂直混匀4h，800g离心5min，然后加入1ml wash buffer，垂直混匀5min，反复洗5次，然后加入50μLPBS和15μL肠激酶，37℃过夜孵育，800g离心5min，吸取上清液后，超滤，得到蜂毒肽蛋白。

[0015] 所述的植物裂解液含20 mM pH 7.5 HEPES，40mM KCl，1mM EDTA，1% Triton X-100，1mM PMSF；所述wash buffer含20 mM pH 7.5 HEPES，40mM KCl，1mM EDTA， 0.1% Triton X-100。

[0016] 本发明的优点在于：本发明在构建表达载体的过程中选择了保留蜂毒肽的内含子，这样可以保证蜂毒肽在克隆所用的工程大肠杆菌（DH5α）中不会导致工程菌的死亡。我们选择了截短的萤火虫荧光素酶（Nano Firefly Luciferase）作为与蜂毒肽融合表达的报告蛋白，该蛋白只有在有底物作用下发出荧光的特性，不仅能够抑制蜂毒肽的活性，并且能够方便地检测到蜂毒肽融合蛋白的表达。接着我们用羟胺裂解酶识别位点作为蛋白linker连接萤火虫荧光素酶与蜂毒肽。

[0017] 此发明首次在大豆发根里面成功表达出蜂毒肽蛋白，较之前原核表达的蜂毒肽来说，其活性更强，可溶性更高，而且植物体内表达的蜂毒肽蛋白粗提取就可以用来做药，因为植物体内没有对人体有害的物质。100g大豆发根大约能提纯出1mg蜂毒肽蛋白。附图说明

[0018] 图1 为载体设计图；其中将egfp 和蜂毒肽melittin融合表达，然后将其构建到Pcambia 3301 nanoluc 载体上面，一方面融合蛋白明显减小了蜂毒肽对宿主细胞的伤害，另一方面便于融合表达蛋白的检测。

[0019] 图2 为大豆子叶在侵染蜂毒肽质粒之前（左）和侵染15d以后的图（右）。

[0020] 图3 为蜂毒肽蛋白在大豆体内的表达结果；其中剪下1cm-2cm长的大豆发根，加入100微升1mM的nanoluc底物，然后进行检测，A行是进行侵染并且含有蜂毒肽质粒的大豆发根，能够看到明显发光，说明蜂毒肽蛋白能够在大豆体内成功表达，B行是注射空的K599的发根，不会表达nanoluc，也就不会有明显的发光。

[0021] 图4 为蜂毒肽在大豆中表达的电泳图，其中将发根研磨后，裂解，IP，然后加入肠激酶酶切，最后western鉴定，加入GFP抗体检测，可以明显看到左边是flag-nanoluc-gfp-millitin融合蛋白，右边加了肠激酶后，蜂毒肽millitin蛋白被切下来，比之前的融合蛋白明显变小，说明蜂毒肽在大豆中成功表达。

[0022] 图5 为蜂毒肽的二级图谱；其中将表达了蜂毒肽蛋白的大豆发根收集，研磨，裂解，然后用GFP beads IP下来，跑western胶后，切胶，酶解，然后上机用质谱仪鉴定蛋白，可以看到明显鉴定到蜂毒肽milittin的二级图谱，说明蜂毒肽蛋白确实能够在大豆体内成功表达。

具体实施方式

[0023] 实施例11．载体设计以及构建：设计引物Egfp F：5’-3’cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg， Egfp R： 5’-3’CTTGTCGTCGTCGTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC，millitin F：5’-3’ ggacgacgacgacaagggaattggagcagttctgaa ， millitin R：5’-3’
GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC，首先各自以Pci Egfp载体和在公司合成的PCI millitin 为模板扩增出来egfp和millitin，然后利用Egfp F：5’-3’ cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg和millitin R：5’-3’
GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC引物进行overlap pcr，将egfp和millitin扩增到一起，回收后和限制性内切酶BamHI线性化的Pcambia 3301载体连接，转化DH5a，菌落pcr验证大小正确的克隆送测序，测序正确的单菌落提取质粒并保菌。

[0024] Pci Egfp载体：设计Egfp引物如下：Egfp F‘ cagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagga；
Egfp R‘：TACCACGCGTGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG；
pcr扩增出egfp产物，然后和EcoRI线性化的PCI（neo）载体连接构建成pci egfp载体。

[0025] PCI millitin 为millitin（蜂毒肽）是合成到pci neo上。Millitin序列：ggaattggagcagttctgaaggtattaaccacaggattgcccgccctcataagttggattaaacgtaagaggcaacagggt。

[0026] 2．电击转化K599农杆菌感受态：将1微克Pcambia 3301 nanoluc gfp millitin质粒和100微升K599感受态细胞混匀，然后1800V电击转化6ms，加入600微升LB液体培养基220rpm，28℃孵育1h，4000rpm离心5min后，涂卡那霉素抗性的LB板子，两天后挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的菌落保菌。

[0027] 3．大豆的培养与侵染将草炭土和蛭石1:1混匀后，加入一定量的水，至可用手捏成一团为止，然后将大豆种子播种并覆膜，放在26℃条件下培养，期间保证其湿度，大约培养一个礼拜后，大豆会发芽并破土而出，可以看到其子叶肥厚，此时将大豆子叶剪下来，用70%酒精表面消毒，并在子叶背部用刀片切掉1-2cm长的棱，将其平铺到培养皿里面，培养皿里面垫一层灭过的滤纸，并且加入5ml左右的双蒸水。与此同时，将K599农杆菌提前一晚上摇起来，至OD600为1.2左右，然后用10mM的MgSO4溶液调至OD600为0.35左右，吸取20微升左右用枪头打到子叶切口处，然后盖上培养皿盖子，封口膜封住，置于75 mmol m−2 s−1光强16h光照/8h黑暗培养，大约
15d后，可以看到伤口处有明显的根长出来，此时将培养皿转入全日照下，长大约7d后，将根剪下来，可以进行蛋白检测。

[0028] 4.蛋白纯化将剪下来的发根冻入液氮，并在研钵内研磨，随后加入植物裂解液（20 mM HEPES [pH
7.5]， 40mM KCl，1mM EDTA，1% Triton X-100，1mM PMSF），一般1克样品需要1ml裂解。加入裂解液，4℃垂直混匀20min，然后14000g 4℃高速离心10min，吸取上清液，加入30微升GFP beas，垂直混匀4h，800g离心5min，然后加入1ml wash buffer (20 mM HEPES [pH 7.5]，
40mM KCl，1mM EDTA，0.1% Triton X-100)，垂直混匀5min，反复洗5次，然后加入50微升PBS和15微升肠激酶，37℃过夜孵育，800g离心5min，吸取上清液后，超滤，就得到蜂毒肽蛋白。

[0029] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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