发明领域

本发明提供用于体外、局部和全身的核酸递送的组合物和方法。

相关现有技术的描述

成功的基因治疗的关键性要求是将治疗性目的核酸递送到靶组织和 细胞且不大量分布到非靶组织中的能力。已经测定了许多合成分子将核酸 递送到细胞的能力，即合成载体。合成载体递送的常规方法倾向于主要使 用阳离子脂质或基于阳离子聚合物的体系。见例如Barron等人，Hum. Gene Ther.9：315-323(1998)，；Gao等人，Gene Therapy 2：710(1995)； Zelphati等人，J.Controlled Release 41：99(1996))或阳离子聚合物 (Boussif等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：7297(1995)；Goula等人， Gene Therapy 5：1291(1995)；Chemin，等人，J Viral Hepat 5：369(1995)； Kwoh等人，Biochim.Biophys.Acta 1444：171(1999)；Wagner，J. Controlled Release 53：155(1998)；以及Plank等人，Hum.Gene.Ther. 10：319(1999))。

通常当复合物上的净电荷是正的时(电荷比(+/-)大于1)，编码蛋白质 的质粒DNA与阳离子脂或阳离子聚合物的复合物(分别称为“lipoplexes”’ 和“polyplexes”)转染细胞得到最有效的蛋白质表达。类似地，通常当复 合物上的净电荷是正的时，将带有特异针对编码蛋白质的mRNA的序列的 反义或核酶寡核苷酸与类似的或相同的试剂复合，它们可以被递送至培养 的细胞中以得到最有效的对特定蛋白的抑制。研制的一些其它的用于核酸 的制剂包括多聚阳离子例如聚赖氨酸与导向配体例如FGF2蛋白的缀合 物，将核酸包封在内部俘获的水相中的脂质体、与包封核酸的脂质体融合 的有包膜病毒例如所谓的HVJ-脂质体、以及各种乳剂制剂(其中核酸被 隔绝在乳剂或微粒的无水相中)。尽管存在各种制剂，但在大多数情况下， 核酸是通过复合或被囊化的方法结合到胶体复合物中的。人们为了获得所 需要的药理学效益已经进行了许多努力以制备可以为质粒、寡核苷酸及其 它核酸形式提供递送载体的组合物，但至今这些制剂仍然缺乏体内稳定性、 针对靶组织和细胞的专一性、以及可在靶组织和细胞中提供适当水平的核 酸活性的能力。使这些胶体复合物内在化的机理仍不清楚，但认为取决于 复合物中的净电荷，且假设复合物的表面正电荷和细胞的表面负电荷在复 合物的细胞吸收以及复合物与生物学体系的许多其它相互作用中起举足轻 重的作用。

Lipoplex和polyplex的主要缺点是它们倾向于与多种细胞发生非专一 的相互作用，这将导致一些不希望有的作用。另外，这些复合物可以与血 清中带负电荷的蛋白质及其它组分发生静电相互作用，导致复合物的表面 改性或不稳定及其它不利的作用或细胞干扰。

常规复合物的另外的问题是它们缺乏胶体稳定性。这种不稳定性导致 复合物聚集为大的颗粒，特别是在或接近中性电荷比的情况下，因而导致 长期保存的困难。人们已经尝试用许多方法来克服这种问题。例如，一种 最简单的方法是通过立体聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG)进行表面改性。 (Scaria等人，1999，Program of the American Society of Gene Therapy meeting held at Washington D.C.on June 9-13，p221a，abs# 878， Meyer等人，1998，J.Biol.Chem.273，15621-15627；Choi等人，1998， Bioconjug.Chem.9，708-718；Choi等人，1998，J.Controlled Release 54，39-48；Kwoh等人，1999，Biochim.Biophys.Acta 1444，171-190； Vinogradov等人，1998，Bioconjug Chem 9：805-12；Zelphati等人， 1998，Gene.Ther.5，1272-1282；Phillips，1997，International Business Communications meeting held at Annapolis，Maryland on June 23-24， 1997；以及Woodle等人，1992，Biophys.J.61，902-10；E.Schacht等人， WO 9819710)。复合物表面上的立体包被物可以提高胶体稳定性。

这种立体包被物还可最小化与靶和非靶组织及细胞以及血清组分的相 互作用，就靶组织和细胞来说这是不被希望的作用。然而，用PEG修饰 lipoplex和polyplex(PEG化(PEGylation))对复合物的生物活性具有显著的 不利影响。除了具有所希望的抑制与细胞表面的非特异性的和不希望有的 结合的作用外，使用立体表面可以不利地影响与靶组织和细胞的结合。此 外，它可以不利地影响一旦与靶细胞的结合发生后DNA递送过程中的随 后步骤。例如PEG化导致由复合物的DNA组分编码的蛋白的总表达水平 很差(Scaria和Philips同上)。

Schacht等人(WO 9819710)指出了一种特别有利的构建方法，包括逐 步的构建，首先构建核酸与阳离子聚合物分子的复合物，而后在第二步中 阳离子聚合物分子与亲水聚合物嵌段或一个或多个导向部分和/或其它生 物活性分子共价结合在一起。自组装的亲水聚合物包被物是用A-B型线 性嵌段共聚物构建的，而这种包被物可以提供稳定化，尽管由此形成的复 合物仍然经常相当迅速地不稳定化。因此，Schacht描述了用于组装复合 物的2-步骤方法，其中亲水聚合物和导向部分或其它生物活性分子与先前 存在的胶体即颗粒共价地连接。另外，还使用具有多价的共价连接物的聚 合物进行亲水聚合物的共价连接以便交联发生在复合物的表面包被物中。 这种复合物具有许多局限性。重要地，这种构建不可避免地导致许多在它 们的活性上具有显著差别的不同化学结构，这些活性包括所需要的和不希 望的那些。此外，即使可能，控制所制备的每个结构的量也是困难的。重 要地，第一个亲水聚合物偶联事件形成了基本的立体包被物，其减少了另 外的偶联反应的发生，以使该过程受到自我限制。当需要的表面结合聚合 物的量比自我限制的偶联所允许的量大时，形成的包被物是不充分的。此 外，当在先前存在的颗粒表面上形成缀合物时，即使可能的话，按照形成 何种化学种类对偶联反应进行完全控制是很难的。另外的困难是需要防止 不希望有的与核酸组分的反应或缀合，但这不是容易完成的。进行2-步法 复合物的制备仍然存在其它的困难，即需要在表面正电荷下制备核心复合 物。

最后，当复合物顺利地达到靶组织和细胞，它必须能够与靶组织和细 胞膜有效地结合，并有效地将核酸内容物递送到可以发挥其活性的细胞内 区室。常规的复合物倾向于仅仅不充分地进行这些步骤，导致基因表达的 效率低和/或水平不充分。

因此显而易见的是，非常需要具有改进的靶专一性和体内稳定性以及 虽然由化学定义的种类组成但相对均质的基因递送载体。特别地，具有可 提供提高的靶专一性、体内胶体稳定性、以及提高的靶专一性的改进了的 外部立体层的稳定基因递送载体是需要的。此外，需要载体显示出改善的 细胞进入和细胞内运输，以许可提高核酸的治疗活性，例如基因表达。

发明概述

因此本发明的一个目的是提供一种用于基因治疗的非天然存在的载 体，其由化学定义的试剂组成，其中载体是自组装的，且其中载体包含(1) 包括核酸的核心复合物和(2)至少一种复合物形成试剂，其中载体具有融合 活性。载体任选地可以含有允许与细胞膜融合和允许核吸收的试剂。载体 还可以含有锚定在核心复合物上的外壳部分，借此外壳稳定复合物，保护 它不受不希望有的干扰并提高向靶组织或细胞的核酸递送。外壳任选地可 以是可脱落的，即可以将其如此设计以致于它可在进入靶细胞或组织时与 载体分离。

本发明的另一个目的是提供制造这些载体的方法，包含载体的药物组 合物，以及使用该载体和药物组合物治疗患者的方法。

根据这些目的，本发明提供了一种包含内壳的非天然存在的基因治疗 载体，所述内壳包含(1)包括核酸的核心复合物和(2)至少一种复合物形成试 剂，其中载体具有融合活性。载体可以进一步包含融合部分。融合部分可 以包含一个固定在核心复合物上的壳，或融合部分可以直接掺入核心复合 物中。

在另一实施方案中，载体包含一个稳定载体和减少与蛋白质和细胞的 非特异性结合的外壳部分。外壳部分可以包含一种亲水聚合物。

在另一实施方案中，载体包含融合部分。可以将外壳部分固定到融合 部分上，或可以将其固定到核心复合物上。

在另一实施方案中，载体可以包含至少两种外壳试剂的混合物。这些 外壳试剂每个都可以包含一种可减少与蛋白质和细胞的非特异性结合的亲 水聚合物，且其中这些聚合物具有实质上不同的尺寸。

在另一实施方案中，载体可以含有一种提高载体与靶组织和细胞群体 结合的靶向部分。靶向部分可以包含在外壳部分中。

在另一实施方案中，复合物形成试剂选自脂、聚合物、和精胺类似物 复合物。复合物形成试剂可以是选自示于图2.1和2.2中的脂的脂。特别地， 构成复合物的脂剂可以选自磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，二油酰 基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)，胆固醇及其它甾 醇，N-1-(2，3-二油基氧基)丙基-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)， 1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)，磷脂酸，磷脂酰甘油， 磷脂酰肌醇，包含两个含有约14-22个碳原子的任选不饱和的烃链的糖脂， 鞘磷脂，鞘氨醇，N-脂酰鞘氨醇，萜烯，胆固醇半琥珀酸酯，胆固醇硫酸 酯，二酰甘油，1，2-二油酰基-3-二甲基丙二醇铵(DODAP)，双十八基二 甲基溴化铵(DODAB)，双十八基二甲基氯化铵(DODAC)，双十八基酰 氨基甘氨酰精胺(DOGS)，1，3-二油酰基氧基-2-(6-羧基精胺基(spermyl)) 丙酰胺(DOSPER)，2，3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二 甲基-1-丙铵三氟醋酸盐(DOSPA或lipofectamine 7)，十六烷基三甲基 溴化铵(CTAB)，二甲基双十八基溴化铵(DDAB)，1，2-双十四烷基氧基 丙基3-二甲基羟基乙基溴化铵(DMRIE)，二棕榈酰磷脂酰基乙醇戊基精 胺(DPPES)，二辛基胺甘氨酸精胺(C8Gly-Sper)，双十六烷基胺-精胺 (C18-2-Sper)，氨基胆固醇-精胺(Sper-Chol)，1-[2-(9(Z)-十八烯酰 基氧基)乙基]-2(8(Z)-十七烯基)-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物 (DOTIM)，双十四酰基-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP)，1，2-双十四酰-sn- 甘油基-3-乙基磷脂酰胆碱(EDMPC或DMEPC)，赖氨酰磷脂酰乙醇胺 (Lys-PE)，胆甾烯基-4-氨基丙酸酯(AE-Chol)，亚精胺(spermadine) 胆甾烯基氨基甲酸酯(Genzyme-67)，2-(双棕榈酰-1，2-丙二醇)-4-甲基 咪唑(DPIm)，2-(二油酰基-1，2-丙二醇)-4-甲基咪唑(DOIm)，2-(胆甾 烯基-1-丙胺氨基甲酸酯)咪唑(ChIm)，N-(4-吡啶基)-双棕榈酰-1，2-丙 二醇-3-胺(DPAPy)，3β-[ N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆 固醇(DC-Chol)，3β-[N-(N′，N′，N′-三甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固 醇(TC-CHOL-γ-d3)，1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-琥珀酸酯，1，2-二油 酰基-sn-甘油基-3-琥珀酰-2-羟乙基二硫化物鸟氨酸缀合物 (DOGSDSO)，1，2-二油酰基-sn-甘油基3-琥珀酰-2-羟乙基己基鸟氨酸 缀合物(DOGSHDO)，N，NI，NII，NIII-四甲基-N，NI，NII，NIII-四棕榈酰基精胺 (TM-TPS)，3-十四烷基氨基-N-叔丁基-N’-十四烷基丙脒(vectamidine 或双C14-脒)，N-[3-[2-(1，3-二油酰氧基)丙氧基羰基]丙基]-N，N，N- 三甲基碘化铵(YKS-220)，和O，O′-双十四酰-N-(α-三甲基胺基乙酰基) 二乙醇胺氯化物(DC-6-14)。

复合物形成试剂还可以是式I的化合物；和它们的药学可接受的盐。

其中m是3或4；

Y表示-(CH2)n-基团，其中n是3或4，或还可以表示-(CH2)n- 基团，其中n是5到16的整数，或如果R2是基团-(CH2)3-NR4R5，且m 是3，还可以表示-CH2-CH＝CH-CH2-基团；

R2是氢或低级烷基，或如果m是3，R2还可以表示-(CH2)3-NR4R5基团；

R3是氢或烷基，或如果R2是-(CH2)3-NR4R5且m是3，R3还可以 表示-CH2-CH(-X’)-OH基团；

X和X′，各自独立地表示氢或烷基；

基团R，R1，R4和R5，各自独立地是氢或低级烷基；条件是如果m 是3且Y表示-(CH2)3-，则基团R，R1，R2，R3和X不能同时表示氢或 甲基。

在进一步的实施方案中，复合物形成试剂包含至少两种复合物形成试 剂的混合物。

在更进一步的实施方案中，复合物形成试剂具有一或多种选自细胞结 合、生物膜融合、内体破裂、和核靶向的附加活性。

在其它实施方案中，核酸选自重组质粒，复制缺陷型质粒，小质粒， 重组病毒基因组，线性核酸片段，反义剂，线性多核苷酸，环状多核苷酸， 核酶，细胞启动子，和病毒基因组。

核心复合物还可以进一步包含可提高核的结合和/或吸收的核靶向 部分。核靶向部分可以选自核定位信号肽，核膜转运肽，和类固醇受体结 合部分。可以将核靶向部分固定到核心复合物中的核酸上。

在更进一步的实施方案中，融合部分包含至少一个选自以下的部分： 病毒肽、两亲性肽、融合聚合物，融合聚合物-脂缀合物，可生物降解的融 合聚合物，和可生物降解的融合聚合物-脂缀合物。融合部分可以是选自 MLV env肽、HA env肽、病毒包膜蛋白的胞外结构域、病毒包膜蛋白近 膜域的膜去稳定化肽、病毒融合蛋白的疏水域肽片段的病毒肽，及含有两 亲性域的肽，其中含有两亲性域的肽选自蜂毒肽、爪蟾抗菌肽、来自流感 嗜血菌(H.influenza)血凝素(HA)蛋白的融合片段、HIV 1 gp41的胞质 尾区的HIV片段I、和病毒env膜蛋白质的两亲片段。

在更进一步的实施方案中，其中复合物形成试剂是具有以下结构的聚 合物：

其中R1和R3独立地是烃或被胺，胍盐，或咪唑部分取代的烃，其 中R1和R3可以相同或不同；且

R2是低级烷基。复合物形成试剂还可以是具有以下结构的聚合物：

其中R1和R3独立地是烃或被胺，胍盐，或咪唑部分取代的烃，其 中R1和R3可以相同或不同；且 R2和R4独立地是低级烷基。 在其它的的实施方案中，融合部分是具有以下结构的聚合物：

其中R1是烃或被胺，胍盐，或咪唑部分取代的烃；

R2是低级烷基；

且R3是烃或被羧基，羟基，硫酸盐，或磷酸盐部分取代的烃。融合 部分还可以是具有以下结构的聚合物：

其中R1是烃或被胺，胍盐，或咪唑部分取代的烃；

R2和R4独立地是低级烷基，且R3是烃或被羧基，羟基，硫酸盐， 或磷酸盐部分取代的烃。融合部分还可以是膜表面活性剂聚合物-脂缀合 物。表面活性剂聚合物-脂缀合物可以选自ThesitTM，Brij58TM，Brij78TM， Tween80TM，Tween20TM，C12E8，C14E8，C16E8(CnEn＝烃聚(乙二醇)醚， 其中C代表碳长度N的烃，而E代表聚合度为N的聚(乙二醇))，Chol- PEG900，含有聚噁唑啉或其它亲水聚合物替代PEG的类似物，和具有碳 氟化合物替代烃的类似物。

在更进一步的实施方案中，内壳是通过化学还原或巯基处理可降解的 共价键固定到外壳部分的。内壳是可以通过pH值6.5或以下可降解的共价 键固定到外壳部分的。共价键可以选自： 和

在其它的实施方案中，外壳包含保护性聚合物缀合物，其中聚合物显 示在极性和非极性的溶剂中都可溶解。在保护性立体聚合物缀合物中的聚 合物可以选自PEG，聚缩醛聚合物，聚噁唑啉，带有端基缀合物的聚噁 唑啉聚合物嵌段，水解的葡聚糖聚缩醛聚合物，聚噁唑啉，聚乙二醇，聚 乙烯吡咯烷酮，聚乳酸，聚乙二醇酸，聚甲基丙烯酰胺，聚乙基噁唑啉， 聚甲基噁唑啉，聚二甲基丙烯酰胺，聚乙烯基甲基醚，聚羟丙基甲基丙烯 酸酯，聚羟丙基甲基丙烯酰胺，聚羟乙基丙烯酸脂，聚羟乙基噁唑啉，聚 羟丙基噁唑啉和聚天冬酰胺，及聚乙烯醇。

在更进一步的实施方案中，载体含有选自受体配体，抗体或抗体片段， 靶向肽，靶向碳水化合物分子或凝集素的靶向元件。靶向元件可以选自血 管内皮细胞生长因子，FGF2，促生长素抑制素和促生长素抑制素类似物， 铁传递蛋白，促黑激素，ApoE和ApoE肽，冯·维勒布兰德氏因子(von Willebrand’s factor)和冯·维勒布兰德氏因子肽；腺病毒尾丝蛋白和腺病 毒尾丝蛋白肽；PD1和PD1肽，EGF和EGF肽，RGD肽，叶酸，吡哆 酰基和唾液酸-LewisX和化学类似物。

根据本发明的另一个目的，提供了式I的化合物和它们的药学可接受 的盐：

其中m是3或4；Y表示-(CH2)n-基团，其中n是3或4，或还可 以表示-(CH2)n-基团，其中n是5到16的整数，或如果R2是基团-(CH2) 3-NR4R5，且m是3，可以还表示-CH2-CH＝CH-CH2-基团；R2是氢 或低级烷基，或如果m是3，还可以表示-(CH2)3-NR4R5基团；R3是氢 或烷基，或如果R2是-(CH2)3-NR4R5基团且m是3，还可以表示 -CH2-CH(-X′)-OH基团；X和X′，各自独立地表示氢或烷基；且基团R， R1，R4和R5，各自独立地是氢或低级烷基；条件是如果m是3且Y表示 -(CH2)3-，基团R，R1，R2，R3和X不能同时表示氢或甲基。

在本发明的另外的方面中提供了一种包含如上所述的载体和药学可 接受的稀释剂或赋形剂的药物组合物。

根据本发明的另一方面提供了用于构成如上所述类型的自组装核心 复合物的方法，其中该方法包含以下步骤：在静态混合器中加入核酸的溶 液流和构成核心复合物的部分的溶液流，其中将液流分成内部的和外部的 螺旋流，它们在若干不同的点相交以形成湍流，并由此促进混合导致物理 化学组装相互作用。

根据本发明的另一方面，提供了治疗患者的疾病的方法，包括给予患 者治疗有效量的上述载体。

根据本发明的另一方面提供了一种非天然存在的包含内壳的基因治 疗载体，其包含：(1)核心复合物，包括核酸和至少一种复合物形成试剂； (2)核靶向部分；(3)融合部分；和(4)外壳，包含(i)稳定载体和减少与蛋 白质和细胞的非特异性结合的亲水聚合物，和(ii)提供与靶组织和细胞结合 的靶向部分，其中外壳是通过可断裂的键连接的，这使外壳能够脱落。

从下面的详述本发明的其它目的，特征和优点将是明显的。然而应该 理解，这些详细说明和具体实施例，尽管指出了本发明的优选实施方案， 但仅仅是以举例说明的方式给出的，因为从这些详细的说明来说在本发明 的精神和范围内的各种改变和修饰对于本领域技术人员都是显而易见的。

附图的简要说明

图1显示非天然存在的载体的简图，其包括(1)核心复合物(包含核酸 和至少一种复合物形成试剂和可选地提供与细胞膜融合和核吸收的试剂)， 和(2)可选的固定到核心复合物上的可选地带有可断裂的片段的外壳，及(3) 可选的固定到核心复合物或外壳上的暴露的配体(结构E)。

图2.1-2.2显示阳离子脂的化学结构。

图3.1-3.5显示由取代的氨基乙醇及核酸形成的结构的图解。

图4表示由取代的氨基乙醇和核酸形成的复合物的粒径分布和均一 性。

图5表示对小鼠静脉内给予如下核心复合物后由体内组织的转染导 致的萤光素酶表达，所述核心复合物由商业上得到的阳离子脂形成、由取 代的氨基乙醇形成，以及由商业上得到的(ExGen)或合成的(Lp500)线性 PEI阳离子聚合物形成。

图6表示对小鼠静脉内给予由商业上得到的阳离子脂形成的核心复 合物后由体内组织转染导致的GM-CSF表达。

图7表示对小鼠静脉内给予如下核心复合物后由体内组织转染导致 的萤光素酶表达，所述核心复合物由商业上得到的阳离子脂形成并带有通 过包含融合表面活性剂(含有低分子量的-小于2000道尔顿的亲水PEG聚 合物)或立体表面活性剂(含有高分子量-等于或大于2000道尔顿的亲水 PEG聚合物)而形成的壳。

图8表示通过向聚赖氨酸核心复合物添加来源于HA蛋白的融合肽 (K14-Fuso)而得到的提高的表达。

图9表示在酸性pH值下腙键的断裂。

图10A表示用于在有效负载核酸中结合NLS的一些方法的图解，图 10B表示其上结合了PNA连接的NLS的线性DNA与单独的线性DNA相 比较的提高的表达。

图11表示粒径分布对PEI/DNA和PEI-PEG5000/DNA复合物的 电荷比的依赖性。误差线代表粒径分布的标准差。DNA(鲑鱼精子)浓度： 100μg/ml；复合物中的PEGMol％：5.0

图12表示含有100μg/ml鲑精DNA的PEI-PEG5000/DNA复合物 的粒径稳定性；电荷比1(+/-)，复合物中5Mol％PEG：5.0。误差线代表 粒径分布的标准差。

图13表示在血清存在下PEG对PEI/DNA复合物聚集的影响。在用 10％血清孵育前后的PEI或含有不同mole％PEG的PEI-PEG/DNA复合 物的粒径。在测定粒径之前，将与血清在37℃孵育30分钟的样品用1,000， 000 MW截断值的透析袋作大量透析。误差线是分布的标准差。

图14示意性表示不同分子量的PEG对蛋白介导的带正电荷的PEI/ DNA复合物的聚集的作用。

图15A表示具有固定的PEG或聚噁唑啉聚合物的I125-DNA复合物 在小鼠中的血液清除率的延长，图15B表示具有固定的I125-PEG或聚噁唑 啉聚合物的DNA复合物在小鼠中的肺吸收的减少。

图16表示PEI-ss-PEG5000/DNA复合物的粒径。柱1表示由PEI -ss-PEG5000(含有11mol％PEG的PEI-ss-PEG5000)以1∶1的电荷 比与250μg/ml DNA(鲑鱼精子)复合得到的颗粒的平均尺寸。柱2表示除 了将PEI-ss-PEG5000在复合之前用10mM DTT处理外同样制备的样 品。

图17表示与鲑精DNA在电荷比3(+/-)复合的PEI和PEI-ss- PEG5000的ζ电位。

图18表示一种含有250μg/毫升鲑精DNA的可断裂的PEI- ss-PEG5000/DNA复合物的粒径稳定性；电荷比1(+/-)，复合物中的PEG Mol％：10.0。误差线代表粒径分布的标准差。

图19表示PEI/DNA和PEI-PEG和PEI-ss-PEG/DNA复合物 的萤光素酶活性。将细胞(BL6)在无血清培养基中用0.5μg/孔(96孔板)与 PEI，PEI-PEG和PEI-ss-PEG以电荷比5复合的质粒DNA转染3小时。 转染24小时后测定萤光素酶活性。

图20表示PEI/DNA和PEI-PEG/DNA复合物的萤光素酶活性。 将细胞(BL6)在无血清培养基中用0.5μg/孔(96孔板)与PEI或PEI-PEG 以电荷比5复合的质粒DNA转染3小时。转染24小时后测定萤光素酶活 性。

图21表示PEG对复合物表面性质的影响。

图22表示PMOZ对复合物表面性质的影响。以电荷比4∶1配制复 合物，并在10mM盐水中测定ξ电势。

图23表示PMOZ对血清稳定性的影响(用0到3.2％(以0.8为一级) 的不同量的PMOZ制备4∶1电荷比复合物，并在含有10％FBS的PBS 中在37℃孵育2h之前和之后用于粒径的研究)。

图24表示PMOZ对PEI核心复合物的表达的影响。

图25表示通过向lipofeetin核心复合物添加肽配体(K14RGD)而得到 的提高的表达。

图26表示通过向核心复合物添加肽配体(SMT或促生长素抑制素)而 得到的提高的表达。

图27A表示用位阻二硫化物与聚乙基噁唑啉(PEOZ)一端(PEOZ另 一端缀合有肽配体RGD)缀合的线型PEI的合成。

图27B表示用位阻二硫化物与聚乙基噁唑啉(PEOZ)的一端(PEOZ 另一端缀合有肽配体SMT)缀合的线型PEI的合成。

图28表示通过向与PEI缀合的PEG的远端添加肽配体(RGD)以电 荷比6与PEI复合的Rh-寡核苷酸在Hela细胞中的细胞吸收提高。

图29萤光素酶质粒通过新胶体载体向RA 1191细胞的递送和在其中 的表达与剂量和电荷比的相关性。在DNA剂量为0.1，0.2，0.4，0.6和0.8 μg/20,000细胞下相对电荷比4，6和8表示萤光素酶的表达水平(pg/20, 000细胞)。

图30.萤光素酶质粒通过新胶体载体向RA 1191细胞的递送和在其 中的表达与配体和电荷化的相关性。萤光素酶表达水平(pg/20,000细胞) 相对电荷比0.4，1，2，4和8来表示。

发明详述

本发明提供了递送治疗性核酸的改善的组合物和方法。改善的复合物 包含具有1)内部基因核心复合物和2)固定到内核复合物上的外壳部分的稳 定基因递送载体。外壳部分提供改善的核酸递送，靶专一性，体内生物学 稳定性，和胶体的或物理的稳定性。基因核心复合物含有“有效负载”核 酸部分，至少一种核心复合物形成试剂，且有利地含有便于细胞进入，核 靶向和进入靶组织和细胞后核酸部分的核进入的附加功能元件。核心复合 物为其中核酸定位在很大程度上无“大块水”的区室中的核心复合物。因 此，核心复合物与例如脂质体的组合物不同，脂质体俘获相对稀释的核酸 溶液并且其中核酸在内部四处“漂浮”。核心复合物确实含有许多与核酸 水合的水分子，但没有象在脂质体中发现的大“俘获”体积的水分子。

基因核心复合物可以包含作为核心复合物的一个整体部分的融合部 分，或融合部分可以包含载体的一个单独的层或壳。在此较后的实施方案 中，融合部分是固定到核心复合物上的，其中锚包含共价键，静电键，疏 水键，或这些力的组合。核心复合物和融合层之间的锚定键的性质是一旦 载体进入靶细胞的细胞质，该锚可以与核酸分离，由此提高有效负载核酸 的生物活性。同样地，核心复合物形成试剂是如此的以致核酸可被释放并 能够在细胞核中或在它可显示出其所需要的活性的其它细胞区室中自由发 挥其生物活性。

有效负载核酸部分含有一或多种DNA或RNA分子或化学类似物。在 一个实施方案中，该部分可编码治疗性肽，多肽或蛋白。该有效负载还可 以直接或间接地抑制靶组织和细胞中的内源性基因的表达。例如，该有效 负载可以为编码治疗性RNA分子或反义RNA的DNA分子，或可以为反 义寡核苷酸，核酶，抑制基因表达的双链RNA，双链RNA/DNA杂合分 子，病毒基因组，或其它核酸形式。

有利地，便于核酸进入靶组织和细胞后的核靶向的功能元件是核定位 信号。然而，本领域技术人员将认识到，可以使用可提高核心复合物向靶 组织和细胞的细胞核递送的其它部分。例如，功能元件还可以是提高核递 送的病毒核心肽，多肽，或蛋白，或可以是核膜转运肽(又名核定位信号 (NLS))，或类固醇或类固醇类似物部分(参见Ceppi等人，Program of the American Society of Gene Therapy meeting held at Washington D.C. on June 9-13，第217a页，abs#860(1999))。

在一个实施方案中，基因递送载体具有立体隔离外层或壳，可为复合 物提供改变的表面特征，由此减少非特异性的相互作用，该相互作用为使 用常规的载体系统所引起的显著问题。立体层还具有抑制在对宿体给药后 宿主对载体的免疫应答的优点。有利地，外层仅仅在复合物附着和进入靶 组织和细胞之前保护复合物。在一个实施方案中，外层然后脱落，提供有 效负载核酸的最佳生物活性。为实现这个目的，在复合物的表面上提供了 立体包被物，这种立体包被物还可最小化与血清组分和非靶组织和细胞的 相互作用。以一定的形式将包被物固定到核心复合物上以致立体包被物可 在有益于细胞相互作用的点从复合物上脱落或裂开。例如，一个这种点可 以在复合物附着到靶组织和细胞之后，但在核心复合物释放到细胞质中之 前出现。另一个这种点在靶组织的细胞外间隙内。还有另一个这种点在预 先确定的时间后。还有另外的这种点在曝露于外部信号或影响力例如热或 声能的靶组织中。细胞进入之后事件的序列可保证有效负载的递送不被阻 碍，或否则被立体层抑制。在另外的实施方案中，可对立体层进行设计和 固定以使其可抑制非特异性的相互作用，但允许实现与靶组织和细胞结合、 细胞进入、以及在不切除锚的情况下核酸的功能递送。

外层有益地含有可提高载体与靶组织和细胞之间相互作用的亲合性的 靶向部分。当靶向部分的存在可使与非靶组织和细胞相比在靶组织和细胞 的表面载体的结合增加时，该靶向部分被认为提高了载体对靶细胞群的亲 合性。靶向部分的实例包括，但不局限于蛋白质，肽，凝集素(碳水化合物)， 和小分子配体，其中每个靶向部分都与细胞上的互补分子或结构，例如受 体分子结合。

本发明的具体特征在以下详细地描述。

有效负载核酸部分

本发明的载体可以用来递送实质上任何具有治疗或诊断价值的核酸。 核酸可以是DNA，RNA，核酸同系物例如形成三股螺旋的寡核苷酸或肽核 酸(PNA)，或可以是这些的结合。适宜的核酸可以包括，但不局限于，重 组质粒，复制缺陷型质粒，缺乏细菌序列的小质粒，重组病毒基因组，编 码治疗性肽或蛋白的线型核酸片段，杂种DNA/RNA双链，双链RNA， 反义DNA或化学类似物，反义RNA或化学类似物，转录为反义RNA或 核酶的线型多核苷酸，核酶，和病毒基因组。很清楚，在以下使用的术语 “治疗性蛋白”，除非另有陈述，包括肽，多肽和蛋白质。

当人们希望核酸在宿主细胞的基因组的特异位点整合时，编码治疗性 蛋白质的核酸序列的侧翼可以是和宿主基因组中的序列同源的序列段。这 些序列便于通过同源重组的方法向宿主基因组中的整合。用于实现同源重 组的载体是本领域已知的。当核酸以此位点特异性方式整合到宿主基因组 中时，核酸的表达可能能够处于内源性表达控制系统的功能控制之下。然 而更可能的是，需要提供驱动核酸表达的外源性控制元件。有利地，控制 元件为细胞特异的，由此可提高核酸表达的细胞特异性质，尽管这不是必 要的。适宜的表达控制元件，例如启动子和增强子序列(细胞特异的和非特 异性的)是本领域所熟知的。见例如，Gazit等人，Can.Res.59，3100-3106 (1991)；Walton等人，Anticancer Res，18(3A)：1357-60(1998)；Clary等 人，Surg-Oncol-Clin-N-Am.7：565-74(1998)；Rossi等人Curr-Opin Biotechnol.9：451-6(1998)；Miller等人，Hum-Gene-Ther.8：803(1997)； Clackson，Curr.Opin.Chem.Biol.1：210-218(1997)。适宜的启动子包括， 但不局限于，组成型启动子例如EF-la，CMV，RSV，和SV40大T抗原 启动子；组织特异性启动子例如白蛋白，肺表面活性剂蛋白(surfactant protein)，组织特异性生长因子受体；病理组织特异性启动子例如甲胎蛋白 肿瘤特异性启动子，肿瘤特异性蛋白质，炎症级联蛋白质(inflammatory cascade protein)，坏死应答蛋白质(necrosis response protein)；可调节的启 动子和例如四环素活化启动子和类固醇受体活化启动子；或工程化启动 子，和染色质元件例如支架结构相关区域或基质附着部位(SAR或MAR)， 核小体元件，隔离物(insulator)和增强子。

用于本发明的适宜的表达质粒和小质粒为本领域所熟知。(Prazeres 等人，Trends-Biotechnol.17：169(1999)；Kowalczyk等人， Cell-Mol-Life-Sci. 55：751(1999)；Mahfoudi，Gene Ther.Mol.Biol.2： 431(1998))。质粒可以包含与启动子元件内含子序列和聚腺苷酸化信号序 列可操作地连接的可译框序列。当核酸部分为质粒时，它将有利地缺乏那 些允许在细菌中复制的核酸元件。因此，例如，质粒将缺乏细菌的复制起 点。最有利地，质粒将相对地没有细菌来源的序列。用于制备这些质粒的 方法是本领域所熟知的(Prazeres同上)。

当核酸来源于病毒时，适宜的病毒部分包括，但不局限于，重组腺病 毒基因组DNA(有和没有末端蛋白)，和来源于例如MLV或HIV env-病毒 粒的逆转录病毒核心。还可以使用重组甲病毒RNA进行细胞质表达和复 制。其它病毒基因组包括疱疹病毒，SV-40，痘苗病毒和腺伴随病毒。可 以使用编码病毒基因组的质粒DNA或PCR产生的DNA。可以使用其它 病毒来源的核酸。

当核酸是合成来源的时，适宜的部分包括，但不局限于，PCR片段 DNA，带有端基化学修饰或缀合的DNA，反义和核酶寡核苷酸，线性RNA， 线性RNA-DNA杂合体。可以使用其它来源的合成核酸或核酸类似物。

复合物形成试剂

适用于本发明中的复合物形成试剂必须能够与核心核酸以允许核酸 核心复合物组装的方式结合。复合物形成试剂可以是，例如，脂，合成聚 合物，天然聚合物，半合成聚合物，脂的混合物，聚合物的混合物，脂和 聚合物的组合，或精胺类似物复合物，但技术人员将认识到可以使用其它 试剂。复合物形成试剂优选具有足够的亲合性，以足以在用于制备的条件 下使复合物能够形成，并足以在贮存期间和在给药后的条件下维持复合物， 但该亲合性不足以在靶细胞的细胞质或细胞核中的条件下保持复合物。常 用复合物形成试剂的例子包括允许与核心核酸部分在适宜的混合条件下自 发复合的阳离子脂和聚合物，但也可以使用中性的和带负电的脂和聚合物。 其它例子包括组合的脂和聚合物，其中一些为本质上阳离子的，而其它的 在该组合中为本质上是中性的或阴离子的，以致联合在一起可获得具有期 望的稳定性平衡的复合物。在其它例子中，可以使用具有非静电的相互作 用但仍然能使具有所需要的稳定性平衡的复合物形成的脂和聚合物。例如， 所需要的稳定性平衡可以通过与核酸碱基和主链部份相互作用(如结合形 成三股螺旋的寡核苷酸或“肽核酸”)来实现。在其它的例子中可以单独 和以组合方式使用缀合的脂和聚合物。

用于本发明的适宜的阳离子脂在例如美国专利U.S.5,854,224和5, 877,220中描述，它们在此完全并入作为参考。适宜的脂典型地含有至少 一个疏水性的部分和一个亲水的部分。其它适宜的脂包括小泡构成脂或小 泡相容的脂，例如磷脂，糖脂，甾醇或脂肪酸。包括在此类中的有磷脂， 例如磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酸(PA)，磷脂酰甘油(PG)， 磷脂酰肌醇(PI)，和糖脂，例如鞘磷脂(SM)，其中这些化合物典型地含有 两个特征性地约14-22个碳原子长的烃链，且该烃链可以含有不饱和的碳 -碳键。一类优选的疏水性部分包括烃链和甾醇。其它种类的疏水性部分包 括鞘氨醇，神经酰胺，和萜烯(聚异戊二烯)例如法尼醇，苎烯，植醇，角 鲨烯和视黄醇。适合于本发明的脂的具体实例包括阴离子的，中性的或两 性离子的脂，例如磷脂酰乙醇胺，二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，或胆 固醇(Chol)，胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)，胆固醇硫酸酯，和甘油二酯。 阳离子脂的具体实例包括N-1-(2，3-二油基氧基)丙基-N，N，N-三甲基 氯化铵(DOTMA)，1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)，1，2 -双油酰基-3-二甲基丙二醇铵(DODAP)，双十八基二甲基溴化铵 (DODAB)，双十八基二甲基氯化铵(DODAC)，双十八基酰氨基甘氨酰 精胺(DOGS)，1，3-二油酰基氧基2-(6-羧基精胺基(spermyl))丙酰胺 (DOSPER)，2，3-二油基氧基-N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1 -丙铵三氟醋酸盐(DOSPA或Lipfectamine TM)，十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)，二甲基-双十八基溴化铵(DDAB)，1，2-双十四烷基氧基丙基3 -二甲基羟基乙基溴化铵(DMRIE)，二棕榈酰磷脂酰基乙醇戊基精胺 (DPPES)，二辛基胺甘氨酸精胺(C8Gly-Sper)，双十六烷基胺-精胺(C18 -2-Sper)，氨基胆固醇-精胺(Sper-胆固醇)，1-[2-(9(Z)-十八烯酰基 氧基)乙基]-2(8(Z)-十七烯基)-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物 (DOTIM)，双十四酰基-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP)，1，2-双十四酰-sn- 甘油基-3-乙基磷脂酰胆碱(EDMPC或DMEPC)，赖氨酰磷脂酰乙醇胺 (Lys-PE)，胆甾烯基-4-氨基丙酸酯(AE-Chol)，亚精胺(spermadine) 胆甾烯基氨基甲酸酯(Genzyme-67)，2-(双棕榈酰-1，2-丙二醇)-4-甲基 咪唑(DPIm)，2-(二油酰基-1，2-丙二醇)-4-甲基咪唑(DOIm)，2-(胆甾 烯基-1-丙胺氨基甲酸酯)咪唑(ChIm)，N-(4-吡啶基)-双棕榈酰-1，2-丙 二醇-3-胺(DPAPy)，3β-[ N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固 醇(DC-Chol)，3β-[N-(N′，N′，N′-三甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇 (TC-CHOL-γ-d3)，DOTMA和DOPE的1∶1混合物(Lipofectin 7)， 1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-琥珀酸酯，1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-琥珀酰- 2-羟乙基二硫化物鸟氨酸缀合物(DOGSDSO)，1，2-二油酰基-sn-甘油基 3-琥珀酰-2-羟乙基己基鸟氨酸缀合物(DOGSHDO)，N，NI，NII，NIII-四甲基 -N，NI，NII，NIII-四棕榈酰基精胺(TM-TPS)，3-十四烷基氨基-N-叔丁基- N’-十四烷基丙脒(vectamidine或双C14-脒)，N-[3-[2-(1，3-二油酰氧 基)丙氧基羰基]丙基]-N，N，N-三甲基碘化铵(YKS-220)，和O，O ′-双十四 酰-N-(α-三甲基胺基乙酰基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)。(见Lasic， Liposomes in Gene Delivery，1997，CRC Press，Boca Raton FL.，Tang等 人，Biochem.Biophys.Res.Comm.242：141(1998)；Obika等人， Biol-Pharm-Bull.22：187(1999)。

注意可以使用一种阳离子脂与一种中性脂的混合物，以及多种阳离子 脂加中性脂的混合物包括3∶1wt/wt DOSPA∶DOPE(lipofectamine7)， 1∶1wt/wt DOTMA∶DOPE(lipofectin7)，1∶1摩尔/摩尔DMRIE∶胆固醇 (DMRIE-CTM)，1∶1.5摩尔/摩尔TM-TPS∶DOPE(CellfectinTM)，1∶ 2.5wt/wt DDAB∶DOPE(LipofectACE7)，1∶1wt/wt DOTAP∶Chol， 和这些的许多变体。

还要注意这些阳离子脂试剂，以及缺乏疏水性部分的其它阳离子试 剂，可以用以下方式与核酸结合起来，该方式使得核酸掺入低极性环境中， 所述环境包括由甘油三酯和/或甾醇形成的油，由油与两亲性稳定剂例如 脂肪酸和溶血磷脂相结合形成的乳剂、微乳，立体相脂(Cubic phase lipid)。 一个具体的实施方案使用了多价阳离子脂例如DOGS与甘油三酯和磷脂酰 胆碱∶溶血卵磷脂(2∶1或控制粒径所需的其它比值)的组合。这些组合物 可用于构成核心颗粒，其中固定是通过加入大的疏水性部分(具有极低的水 溶性)例如十八烷基(C18)和更长的烃、植烷酰基(phytanoyl)烃，或多个 部分，或其它这样的部分产生的。另一具体的实施方案使用了多价阳离子 脂例如DOGS与烃-氟烃“榫钉(dowel)”(C16F17H17)，碳氟化合物“油” (例如C16F34)和磷脂酰胆碱∶溶血卵磷脂(2∶1或控制粒径所需的其它 比值)的组合。这些组合物可用于构成核心颗粒，其中通过加入可以插入氟 烃“油”的碳氟化合物或烃-碳氟化合物片段进行固定。

有许多其它阳离子脂适合于构成核心复合物，它们在下面的专利或专 利申请中描述：US 5,264,618，US 5,334,761，US 5,459,127，US 5, 705,693，US 5,777,153，US 5,830,430，US 5,877,220，US 5,958,901，US 5,980,935，WO 09640725，WO 09640726，WO 09640963，WO 09703939， WO 09731934，WO 09834648，WO 9856423，WO 09934835。例如，专利或 专利申请US 5,877,220，US 5,958,901，WO 96/40725，WO 96/40726，和 WO 97/03939中描述的十四种试剂是可从Promega Biosciences[以前为 JBL Scientific Subsidiary of Genta Inc.](San Louis Obisbo，CA)商购的， 它们的结构示于图2.1-2.2。疏水性部分在甾醇(胆固醇)到两个或四个长度 17或18个碳的烃链的范围变化。带正电荷的部分(亲水的头部基团)变化极 大，但通常含有可离子化的氮(胺)。每个分子上正电荷的数目在1到13间 变化，分子量在650到4212间变化。

有益地，核心复合物可以用GC-030或GC-034制备，该制备既可以 不使用任何附加的组分，也可以使用附加的组分例如胆固醇或含有亲水聚 合物部分的表面活性剂。或者，也可以使用GC-029，GC-039，GC-016， GC-038，它们既可以单独使用，也可以与例如胆固醇或表面活性剂等成 分形成混合物的形式使用。众多的其它脂的结构在US 5,877,220，US 5, 958,901，WO 96/40725，WO 96/40726，和WO 97/03939中加以描述， 它们可以用于本发明。最有用的具体脂可以使用四种检定法来确定：1) 具有将核酸构成小的，胶体稳定的颗粒的能力，2)具有提高核酸内化为组 织培养细胞中的内体的能力，3)具有提高核酸在组织培养细胞中的细胞质 释放的能力，以及4)当局部或全身给药时具有通过体内组织引起质粒表 达的能力。

适宜的阳离子化合物还包括取代的氨基乙醇和它们的盐，其具有通式 I：

其中m是3或4；Y表示基团-(CH2)n-，其中n是3或4，或还可 以表示基团-(CH2)n-，其中n是5到16的整数，或如果R2是-(CH2)3-NR4R5基团且m是3，还可以表示-CH2-CH＝CH-CH2-基团；R2是氢 或低级烷基，或如果m是3，还可以表示-(CH2)3-NR4R5基团；R3是氢 或烷基，或如果R2是-(CH2)3-NR4R5基团且m是3，还可以表示 -CH2-CH(-X’)-OH基团；X和X′，各自独立地表示氢或烷基；且基团R， R1，R4和R5，各自独立地是氢或低级烷基；条件是如果m是3且Y表示 -(CH2)3-，基团R，R1，R2，R3和X不能同时表示氢或甲基。

以上和以下使用的一般术语在本申请的上下文中具有下面的意义：

前缀“低级”表示具有至多且包括7，和优选至多且包括3个碳原子 的基团。

低级烷基是，例如，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔 丁基，正戊基，新戊基，正己基或正庚基。在一个实施方案中，低级烷基 优选是乙基且尤其是甲基。在另外的实施方案中，低级烷基是烃部分的碳 氟化合物类似物。在另一个实施方案中，低级烷基是氟烃和烃的组合。

烷基是例如C1-C30-烷基，优选C1-C16-烷基；烷基优选是直链的 烷基，但也可以是支链的，且是例如，如以上所定义的低级烷基，正辛基， 正壬基，正癸基，正十二烷基，正十四烷基，正十六烷基或2，7-二甲基 辛基。在另外的实施方案中，烷基是烃部分的碳氟化合物类似物。在另一 个实施方案中，烷基是氟烃和烃的组合。

卤素表示例如氟或碘，特别是溴且尤其是氯。

根据本发明的化合物的盐基本上是药学可接受的，无毒的盐。例如含 有3或4个碱性中心的式I化合物可以构成酸加成盐，例如与无机酸，例 如氢卤酸例如盐酸和氢碘酸，与硫酸或磷酸成的盐，或与适当的有机羧酸 或磺酸，例如乙酸，三氟乙酸，富马酸，草酸，甲磺酸或对甲苯磺酸成的 盐；或例如与酸性氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸成的盐。当与式I的化 合物相联系时，术语”盐”包括单盐和聚合盐两者。

对于分离或提纯，也可以使用药学不适合的盐，例如苦味酸盐或高氯 酸盐。对于治疗用途，只可以使用药学可接受的盐，且因此它们是优选的。

根据结构的数据，本发明的化合物可以以异构体混合物或以纯的异构 体的形式存在。

式I的化合物可以按照已知的方法制备，由此例如：

(a)将式II的化合物：

其中m，Y，R，R1，R2和R3如式I的定义，其中氨基-NRR1，-NR2R3和可选地在基团R2＝-(CH2)3-NR4R5中的-NR4R5是可选地被适当的保 护基保护的；与式III的化合物反应：

其中X为式I的定义，且如有必要，将氨基保护基再次断裂，或

(b)为了制备式I的化合物，其中m是3，R2是-(CH2)3-NR4R5基 团，R3是-CH2-CH(-X′)-OH基团，将式IV的化合物：

其中Y，R，R1，R4和R5如式I的定义，且其中氨基-NRR1和-NR4R5是可选地被适当的保护基保护的；与式III的化合物反应，其中X为式I 的定义，且如有必要，将氨基保护基再次断裂，或

(c)为了制备式I的化合物，其中R，R1，R2和R3表示氢且Y是基 团-(CH2)n-，其中n是3或4，将式V的化合物还原：

其中m和X如式I所定义且n是3或4，或

(d)为了制备式I的化合物，其中m是3，R2表示基团-(CH2)3-NH2 且R和R1表示氢，将式VI的化合物还原：

其中X，Y和R3如式I的定义；和/或如果需要，可以将得到的式I 化合物转变为其它的式I化合物，和/或如果需要，可以将得到的盐转变 为游离的化合物或其它的盐，和/或如果需要，可以将得到的具有构成盐 的性质的游离式I化合物转变为盐，和/或可以将得到的式I的异构体化合 物的混合物分离成单独的异构体。

在随后的对a)到d)方法更详细的说明中，除非另有说明，符号m，n， X，X′，Y，R和R1到R5具有式I中所给出的意义。

方法(a)：氨基-NRR1，-NR2R3和可选地-NR4R5优选被保护基保 护。保护基，例如氨基保护基起作用的方式，其引入和裂解是本身已知的 并在如下文献中描述：J.F.W.McOmie，“有机化学中的保护基”， Plenum出版，London and New York 1973，以及T.W.Greene，“有机合 成中的保护基”，Wiley，New York 1984。氨基保护基，特别是适合于聚 胺例如精胺、亚精胺等等的氨基保护基，在例如Acc.Chem.Res.19：105 (1986)以及Z.Naturforsch.41b，122(1986)中描述。

优选的一价氨基保护基是酯基，例如低级烷基酯并尤其是叔丁氧羰基 (BOC)，或苯基低级烷基酯例如苄氧基羰基(苄氧羰基，Cbz)；或酰基，例 如低级烷酰基或卤代低级烷酰基，例如特别是乙酰基，氯乙酰基或三氟乙 酰基；或磺酰基团，例如甲基磺酰基，苯磺酰或甲苯-4-磺酰基。优选的 二价氨基保护基是二酰基，例如酞酸的二酰基(邻苯二甲酰)，它们与待保 护的氮原子一起形成苯二酰亚氨基。

氨基保护基的裂解可以通过例如，或许在酸性介质中例如与盐酸，或 以碱性的方式例如与氢氧化钠溶液发生水解，或也可以通过加氢进行。

叔丁氧羰基特别优选作为该氨基保护基，并可以例如通过使游离的胺 与2-(叔丁氧羰基氧亚氨基)-2-(苯基乙腈[叔丁基-O-C(＝O)-O-N＝ C(苯基)-CN]或与二(叔丁基)碳酸氢盐反应来引入。叔丁氧羰基的裂解是 例如在酸性介质，特别是草酸或草酸二水合物，盐酸或甲苯-4-磺酸或甲 苯-4-磺酸一水合物中实现的。

同样地优选作为氨基保护基的是苄氧羰基，它们可以通过使游离的胺 与氯甲酸苄基酯反应引入。苄氧羰基的裂解优选通过加氢实现，例如在活 性碳上的钯存在下加氢。

作为氨基保护基，甲苯-4-磺酰基也是优选的，它可以通过游离的胺 与甲苯-4-磺酰氯反应，并可选地使用辅助碱例如三乙胺加以引入。甲苯-4 -磺酰基的裂解优选在酸性介质中例如与浓硫酸或在冰醋酸和苯酚中的 30％氢溴酸反应，或也可以在碱性条件下例如与LiAIH4反应实现。

也可以优选邻苯二甲酰作为末端伯氨基的保护基，它优选通过与N- 乙氧羰基邻苯二酰亚胺反应引入。这种保护基的裂解可通过例如与肼反应 进行。

式II和III的原料化合物是已知的，或可以用类似于已知化合物的方 法制备。所讨论的式II化合物特别是，亚精胺，高亚精胺，降亚精胺，精 胺，脱氢精胺或N，N’-双(3-氨基丙基)-α，ω-亚烷基二胺[见例如，J.Med. Chem.7，710(1964)](它们以游离的形式或被保护的形式存在)，及其衍 生物。

式III的化合物，其中X表示烷基，可以以外消旋或旋光的形式存在。 如果它们以纯的对映体用于根据方法(A)[或(B)]的反应，将得到相应的具 有旋光性的式I化合物。类似地，如果它们与式VII或VIII的化合物反应 [见下文方法(c)和(d)]，将得到具有旋光性的式V或VI的化合物。

根据方法(a)的反应可以在有或没有溶剂的存在下进行。

方法(b)：方法(b)相当于方法(a)，两者区别在于方法(b)在式IV 的原料化合物中双重引入基团-CH2-CH(-X或-X’)-OH。而且这里 -NRR1，-NR4R5优选是被保护基保护的。

式IV的原料化合物是已知的，或可以用类似于已知化合物的方法制 备。所讨论的式IV化合物特别是，精胺，脱氢精胺或N，N′-双(3-氨基丙 基)-α，ω-亚烷基二胺(它们以游离的形式或被保护的形式存在)，及其 衍生物。

方法(c)：根据方法(c)的还原可以例如在适宜的催化剂，例如阮内 镍的存在下与氢气反应实现。另外，还原也可以用络合的金属氢化物，例 如LiAlH4或NaBH4进行。一种优选的还原式V化合物的体系是在乙醇和 氨水或乙醇和氢氧化钠的存在下H2/阮内镍。

可以通过例如将式VII的化合物与式III的化合物反应，得到式V的 原料化合物：

NC-(CH2)m-1-NH-(CH2)n-1-CN            (VII)

式VII的化合物又可以通过例如氨水与式Hal-(CH2)2或3-CN(Hal＝ 卤素)的化合物反应获得  [见C.A.63，2642b(1963)或J.Med.Chem.15， 65(1972)]。式VII的不对称化合物可以例如根据C.A.63，2642b(1963)， 通过NC-(CH2)3-NH2与丙烯腈反应得到。

方法(d)：根据方法(d)的还原是以与方法(c)同样的方式进行的。使 用与(c)中相同的还原剂。

可以通过例如将式VII的化合物与式III的化合物反应，得到式VI 的原料化合物：

反过来，通过例如二胺H2N-Y-NHR3与丙烯腈的反应可获得式VIII 的化合物。

可以按照已知的方法将式I的化合物转变为其它的式I化合物。例如， 式I的化合物(其中R，R1和R2和R3(或R4和R5)表示氢)，可以通过 与醛或酮例如甲醛，在还原性条件下例如在碳载钯存在下与氢气反应进行 低级烷基化，由此得到例如式I的化合物，其中R，R1和R2和R3(或R4 和R5)表示低级烷基。此外，举例来说，式I的化合物，其中m是3，R3 表示氢，R2是基团-(CH2)3-NR4R5且氨基-NRR1和-NR4R5是被保护基 保护的，可以与烷化剂例如卤代烷或二烃基硫酸盐起反应形成类似的式I 化合物，其中R3表示烷基。

根据这种方法获得的具有盐形成性质的游离式I化合物，可以以已知 的方式转化为其盐。因为游离的式I化合物含有碱性基团，因此可以通过 用酸处理将它们转变为其酸加成盐。

由于游离形式与盐形式的式I化合物之间的密切关系，因此在上文中 和在下文中游离的化合物或它们的盐可以理解为是也指其相应的盐或游离 化合物。

化合物，包括它们的盐，也可以以它们的水合物的形式得到，或它们 的晶体可以包括例如被用来结晶的溶剂。

根据本发明可获得的异构体混合物可以以已知的方式分离成单独的 异构体，外消旋物例如通过与旋光纯的成盐试剂形成盐并例如通过分级结 晶分离由此获得的非对映异构体混合物。

上述反应可以在已知的反应条件下，在没有或通常有溶剂或稀释剂 (优选对所使用的试剂是惰性的且可溶解它们的那些)存在下，在没有或 有催化剂、缩合剂或中和剂的情况下，根据反应的类型和/或反应组分在 降温，常温或升温下(例如在大约-70℃到190℃的温度范围，优选-20℃ 到150℃，例如在所使用的溶剂的沸点温度下)，在大气压或在密闭容器 中，可选地在压力下和/或在惰性气体中(例如在氮气下)进行。

在有些情况下，取代的氨基乙醇呈现具有通过一个疏水体连接的两个 亲水的极性头(图3)，且被称为双头脂。因为位于两边的两个亲水的头部可 以面向水溶液，所以这些化合物可以在水中形成单层，而不是由带着一头 基团的脂形成的双层(图3)。

在取代的氨基乙醇的另外的实施方案中，可以使用不同于如上所述的 双头脂，其中取代的氨基乙醇具有带有不同静电荷的极性头，例如一个正 的和另一个负的或中性的，且它们可用于与核酸复合形成带有阳离子电荷 净过量的核心复合物，但形成的该复合物具有中性或负的表面电荷。这种 不同的极性双头脂可以用正的一头与DNA结合，用负的或中性的一头围 绕DNA在外部形成单层外壳，且因此具有优选的负或中性的表面电荷。 而且，负的或中性头部为固定载体其它组分提供了优选的部分。这些图解 表示在图3.1-3.4中。

两个头部可以具有相同的或不同的电荷状态、或pK值基本上不同的 形式，例如伯胺和咪唑。头部具有不同的电荷状态的双头脂制剂具有独特 的性质。具有一个正性头部和另一个负的或中性头部的双头脂可使正性头 部与核酸结合，而负的或中性的头部形成复合物面向水溶液的外表面(图 3)。使用核酸作为复合物形成的模板，正性的头部结合并环绕它形成单层， 导致形成带有阴离子或中性表面的单层脂质体/核酸复合物。这种双头脂可 以将质粒DNA，其它核酸，或任何带负电荷的物质高效地密闭在内，得到 负的或中性表面电荷，这可避免不利的生物学相互作用例如导致毒性的那 些。

双头脂可以以其它方法修饰以便每个头部基团具有不同的性质。例 如，一头可以与立体聚合物、与靶向配体、与融合部分，或与部分的组合 例如在远端带有靶配体的立体聚合物缀合。图3).

第三类双头脂的两头都是负性的或都是中性的。这些可围绕物质形成 对于控制药物动力学和生物分布有用的脂单层，如同使用例如脂质体和乳 剂一样。

适宜的阳离子化合物也包括精胺类似物。与精胺类似物形成的核心复 合物优选包含膜破裂剂。在另外的实施方案中，与精胺类似物形成的核心 复合物包含阴离子剂，以便使核心复合物具有负表面电荷。

用于本发明的适宜的聚合物包括聚乙烯亚胺(PEI)，且有利地为线型 的PEI，聚赖氨酸，聚酰胺型胺类(PAMAM树枝状物(dendrimer)聚合 物，US专利5,661,025)，线型聚酰胺型胺类(Hill等人，线型聚(酰胺 型胺类)：与DNA的物理化学相互作用和生物学特性，公开在Vector Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery(Abstracts form Cold Spring Harbor Laboratory 1999 meeting)，1999，第27页))，硫酸鱼精蛋 白，多盐(polybrine)，脱乙酰壳多糖(Leong等人J Controlled Release 1998 Apr；53(1-3)：183-93)，聚甲基丙烯酸酯，聚胺(US专利5,880,161) 和精胺类似物(US专利5,783,178)，聚丙烯酸甲酯及其衍生物例如聚[甲 基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯](PDEAMA)(Asayama等人，proc.Int. Symp.Control. Rel. Bioact.Mater.26，#6236(1999)和Cherng等人， Eur J Pharm Biopharm 47(3)：215-24(1999))和聚(甲基丙烯酸2-(二甲基 氨基)乙酯)(PDMAEMA)(van de Wetering等人，J Controlled Release 53： 145-53(1998))，聚(有机)磷腈(US专利5,914,231)，在此将它们全部并 入作为参考。其它可以用于复合物的聚合物包括聚赖氨酸，(聚(L)，聚(D)， 和聚(D/L))，含有两亲性氨基酸序列的合成肽例如“GALA”和“KALA”肽 (Wyman TB，Nicol F，Zelphati O，Scaria PV，Plank C，Szoka FC Jr， Biochemistry 1997，36：3008-3017；Subbarao NK，Parente RA，Szoka FC Jr，Nadasdi L，Pongracz K，Biochemistry 1987 26：2964-2972)和含有非天 然的氨基酸包括D氨基酸和化学类似物例如peptoid的形式，含有咪唑的 聚合物，以及完全合成的聚合物，它们可以结合和凝聚核酸。对于显示这 些性质的聚合物的分析包括使用物理测定方法例如DLS(动态光散射)和电 子显微镜进行的对质粒DNA凝聚为微粒的测定。

在本发明中用作核心形成试剂的其它试剂包括具有以下通式结构的 聚合物：

其中R1和R3独立地是烃或被胺，胍盐，或咪唑部分取代的烃，且 R2是低级烷基；或通式结构：

其中R1和R3独立地是烃或被胺，胍盐，或咪唑部分取代的烃，且 R2和R4独立地是低级烷基。

在本发明中用作核心形成试剂的另外的试剂包括具有混合的阳离子 和阴离子基团，以及在有些情况下负电荷过量的试剂，以致形成的复合物 具有净负电荷。这些试剂的实例是具有以下通式结构的那些：

其中R1是烃或被胺，胍盐，或咪唑部分取代的烃，R2是低级烷基， 且R3是烃或被羧基，羟基，硫酸盐，或磷酸盐部分取代的烃；或具有以 下结构的试剂：

其中R1是烃或被胺，胍盐，或咪唑部分取代的烃，R2和R4独立地 是低级烷基，且R3是烃或被羧基，羟基，硫酸盐，或磷酸盐部分取代的 烃。

核靶向部分

外源性的核酸部分进行有效的转录和随后的表达的主要障碍是需要 核酸进入靶细胞的细胞核。有利地，当核酸有效负载的预定生物活性是在 细胞核内时，本发明的核酸是“核靶向的”，即，它含有便于核酸通过核 膜进入宿主细胞的细胞核的一个或多个分子，即核定位信号(“NLS”)。这 种核靶向可以通过在核心复合物中引入核膜转运肽，或核定位信号(“NLS”) 肽，或提供相同NLS功能的小分子来实现。适宜的肽在以下文献中描述， 例如，US专利5,795,587和5,670,347和专利申请WO 9858955，它们 在此全部引入作为参考，以及Aronsohn等人，J.Drug Targeting 1：163 (1997)；Zanta等人，Proc.Nat＇l Acad.Sci. USA 96：91-96(1999)； Ciolina等人，通过与核定位信号肽化学偶联使质粒DNA靶向α-importin， in Vector Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery(Abstracts from Cold Spring Harbor Laboratory 1999 meeting)，1999，第20页； Saphire等人，J Biol Chem；273：29764(1999)。核靶向肽可以是核定位 信号肽或核膜转运肽，且它可以由天然氨基酸或非天然的氨基酸包括D氨 基酸和化学类似物例如peptoid组成。NLS可以由氨基酸或它们的类似物 以天然序列或反向序列组成。其它实施方案由结合类固醇受体的NLS部分 组成，该部分激活受体从细胞质向核运输，其中此运输携带带有受体的核 酸进入细胞核(Ceppi同上)。

在另外的实施方案中，NLS是用使核心复合物指向细胞核的方式固定 在核心复合物上的，其中NLS允许核酸进入细胞核。

在一个实施方案中，NLS通过与核酸结合并入载体中，且此结合在细 胞质内得以保留。这使由于与核酸的分离造成的NLS功能的损失最小，且 可确保将高水平的核酸递送到细胞核。此外，当递送核酸后，与核酸的这 种结合并不抑制核酸在核内的预定生物活性。

在另一实施方案中，核酸有效负载的生物活性的预定靶是细胞质或细 胞质中的细胞器，例如核糖体，高尔基体或内质网。在这种实施方案中， 定位信号包括在核心复合物中或固定在核心复合物上，以致它可指导核酸 进入到核酸能发挥其活性的预定位置。可以实现这种靶向的信号肽是本领 域已知的。

融合部分

融合层可促进载体与靶细胞的细胞膜融合，便于核酸有效负载进入细 胞。如上所述，融合部分可以直接地并入在核心复合物本身中，或可以被 固定到核心复合物上。在一种实施方案中，融合层包含促进融合的元件。 这种元件以允许大分子或颗粒跨膜运动的方式，或以允许膜破裂以致通过 膜隔离的含水相可以自由地混合的方式与细胞膜或内体膜相互作用。适宜 的融合部分的实例包括膜表面活性剂肽例如病毒融合蛋白质例如流感病 毒的血凝素(HA)，或来源于毒素例如PE和篦麻毒素的肽。其它实例包括 允许细胞运输的序列例如HIV TAT蛋白和触角足(cantennapedia)或来 源于众多其它物种的序列，或显示pH值敏感性质的合成聚合物例如聚(乙 基丙烯酸)(Lackey等人，Proc.Int.Symp.Control. Rel. Bioact.Mater. 1999，26，#6245)，N-异丙基丙烯酰胺甲基丙烯酸共聚物(Meyer等人， FEBS Lett.421：61(1999))，或聚(酰胺型胺类)，(Richardson等人，Proc. Int.Symp.Control. Rel.Bioact.Mater.1999，26，#251)，和当与靶细胞或内 体结合时被释放在水相中的脂类试剂。适宜的膜表面活性剂肽包括流感病 毒血凝素或病毒融合肽例如Moloney鼠白血病病毒(“MoMuLV”或MLV) 包膜(env)蛋白或水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白。

有利地，可以使用MoMuLV env蛋白的邻近膜的细胞质域。该域在 多种病毒中是保守的且含有膜诱导的α-螺旋。

对于本发明适宜的病毒融合肽包括来自病毒包膜蛋白胞外结构域的 融合肽，病毒包膜蛋白近膜域的使膜去稳定的肽，所谓的病毒“融合”蛋 白的疏水域肽片段，和含有两亲性区域的肽。适宜的含有两亲性区域的肽 包括：蜂毒肽，爪蟾抗菌肽，来自流感嗜血菌血凝素(HA)蛋白的融合片段， 来自HIV1 gp41的胞质尾区的HIV片段，和来自于病毒env膜蛋白质的两 亲性片段，包括来自禽白血病病毒(ALV)，牛白血病病毒(BLV)，马传染 性贫血病病毒(EIA)，猫免疫缺陷病毒(FIV)，肝炎病毒，单纯疱疹病毒 (HSV)糖蛋白H，人呼吸道合胞体毒(hRSV)，Mason-pfizen猴病毒 (MPMV)，劳氏肉瘤病毒(RSV)，副流感病毒(PINF)，脾坏死病毒(SNV) 和水泡性口膜炎病毒(VSV)的两亲性片段。其它适宜的肽包括微生物的和 爬行动物的细胞毒素肽。最有用的具体肽或其它分子可以使用以下四种分 析确定：1)破坏由细胞膜脂或细胞膜碎片组成的脂质体和诱导水性标记 物从其中渗漏的能力，2)诱导由细胞膜脂或细胞膜碎片组成的脂质体融合 的能力，3)具有诱导被加入到组织培养细胞中的颗粒的细胞质释放的能 力，以及4)当局部或全身给药时具有通过体内组织提高质粒表达的能力。

融合部分还可以由聚合物组成，包括肽和合成聚合物。在一种实施方 案中，肽聚合物包括含有两亲性氨基酸序列的合成肽例如“GALA”和 “KALA”肽(Wyman TB，Nicol F，Zelphati O，Scaria PV，Plank C， Szoka FC Jr，Biochemistry 1997，36：3008-3017；Subbarao NK，Parente RA，Szoka FC Jr，Nadasdi L，Pongracz K，Biochemistry 1987 26： 2964-2972或Wyman同上，Subbarao同上)。其它肽包括非天然的氨基酸， 包括D氨基酸和化学类似物例如peptoid，含有咪唑的聚合物。适宜的聚 合物包括带有间歇的羧酸官能团的有氨基或咪唑部分的分子，例如在内或 外部形成“盐-桥”的那些，包括其中的桥是pH值敏感的形式。可以使用 的其它聚合物包括或者在聚合物内或者在聚合物间具有二硫桥键的那些聚 合物，由此二硫桥阻断融合，然后该桥在组织或细胞内区室内断裂以使在 所需要的位置表达融合的性质。例如，与带正电荷的融合聚合物形成弱静 电相互作用中和了正电荷的聚合物，可以通过这两个分子之间的二硫桥固 定在适当位置，而这些二硫化物在内体内断裂以致这两个分子分离释放出 正电荷和融合活性。这类融合剂的其它形式具有定位在同一分子的不同片 段上的两种性质，因此桥是分子内的以致使其裂解会导致分子中的结构改 变。这类融合剂的另一个形式具有pH值敏感的桥。

其它可以使用的聚合物包括带有间歇的羧酸官能团含有氨基或咪唑部 分的分子，例如在内或外部形成“盐-桥”的那些，包括其中的桥是pH值 敏感的形式。在一种实施方案中，聚合物具有如下所示的化学结构。

其中R1是烃或被胺，胍盐，或咪唑部分取代的烃，R2是如上所述的 低级烷基，且R3是烃或被羧基，羟基，硫酸盐，或磷酸盐部分取代的烃。 在一种实施方案中聚合物被设计成带有过量的正电荷，例如当R1含有胺 或胍盐且R3含有羧基、其中X与Y大约相等或大于Y时，或当R1含有 咪唑且R3含有羧基、其中X大于Y时。在另外的种实施方案中聚合物被 设计成带有过量的负电荷，所以典型地Y大于X。在又一个实施方案中聚 合物被设计成带有接近中性的净电荷，且相应地调节X与Y的比值。

在另外的实施方案中，聚合物具有如下所述的化学结构。

其中R1是烃或被胺，胍盐，或咪唑部分取代的烃，R2和R4独立地 是如上所述的低级烷基，且R3是烃或被羧基，羟基，硫酸盐，或磷酸盐 部分取代的烃。在一种实施方案中聚合物被设计成带有过量的正电荷，例 如当R1含有胺或胍盐且R3含有羧基、其中X与Y约相等或大于Y时， 或当R1含有咪唑且R3含有羧基、其中X大于Y时。在另外的种实施方 案中聚合物被设计成带有过量的负电荷，所以典型地Y大于X。在又一个 实施方案中聚合物被设计成带有接近中性的净电荷，且相应地调节X与Y 的比值。

融合部分还可以包含膜表面活性剂聚合物-脂缀合物。适宜的缀合物 包括ThesitTM，Brij58TM，Brij78TM，Tween80TM，Tween20TM，C12E8， C14E8，C16E8(CnEn＝烃聚(乙二醇)醚，其中C代表碳长度N的烃，而E 代表聚合度为N的聚(乙二醇))，Chol-PEG900，含有聚噁唑啉或其它亲 水聚合物替代PEG的类似物，和具有碳氟化合物替代烃的类似物。有利地， 聚合物将或是可生物降解的或是具有足够小的分子量，以致它可以不用新 陈代谢进行排泄。技术人员将认识到在没有偏离本发明的精神的情况下也 可以使用其它融合部分。

核心复合物的组装

有利地，当在适当的条件下混合组分时，核心复合物将是自组装的。 制备核心复合物的适宜条件通常允许在混合结束时以电荷摩尔过量出现的 带电荷成分在混合中一直过量。例如，如果最终的制剂是净负电荷过量的， 那么将阳离子试剂混合到阴离子试剂中以使形成的复合物决不具有净过量 的阳离子试剂。制备核心复合物的其它适宜条件使用连续混合方法，包括 在静态混合器中混合核心组分。静态混合器在流入和流过固定装置的两股 或多股液流中产生湍流以及优选地低剪切力混合，导致存在于装置中的液 体混合。对于核心复合物，当核酸易受剪切力破坏时，低剪切力混合是格 外重要的。具体地，将核酸的水溶液和核心复合物形成部分(例如阳离子脂) 一起加进静态混合器中(例如，可以从American Scientific Instruments， Richmond，CA获得)，在混合器中液流被分成内部和外部螺旋液流，它们 在若干不同的点相交形成湍流且由此促进混合。使用可商购的静态混合器 可保证得到的结果是与操作者无关的，且是可按比例放大的(scalable)， 可重复的和可控制的。这样产生的核心复合物颗粒是均匀的，稳定的和可 以无菌过滤的。当希望核心复合物包含核靶向部分和/或融合部分时，这 些组分可以直接地加入到进入静态混合器的液流中，以便在核心复合物形 成时它们自动地结合进核心复合物中。

组分的液流在混合器中相交，由此引起DNA和聚合物的剪切和混合， 由此形成DNA和聚合物的复合物颗粒。可以使用例如Coulter N4 Plus Submicron Particle Sizer(Coulter公司，Miami，Florida)通过动态光散射 对得到的制剂的纳米级平均粒径和分布加以测定。平均粒径和标准差可以 通过单众数(unimodal)和粒径分布方法(SDP)或“强度”方法测定。

在上述方法中，激光对准通过颗粒制剂。动态光散射是以颗粒的布朗 运动的结果进行测量的。然后使测定的动态光散射与粒径建立相关性。在 单众数方法中，粒径分布通过将粒径置于高斯曲线上测定。在SDP方法中， 粒径分布通过叫做CONTIN的FORTRAN程序确定。这些方法在Coulter N4 Plus Submicron Particle Sizer参考手册(1995年十一月)中还有进一步 描述。

当融合部分不是直接地引入到核心部分时，它典型地以一种围绕或包 围核心复合物的壳的状态呈现。在此情况中，融合壳是通过静电、共价或 疏水相互作用、或通过这些力的组合被固定到核心复合物上的。当融合部 分是通过静电固定的时，它通过电荷-电荷相互作用或与核酸，或与复合物 形成试剂，或与两者的电荷基团相互作用。多价静电相互作用的存在提供 了结合稳定性，并且适应于在靶组织和细胞内的适当释放。一种具体的形 式是融合肽序列与阳离子肽序列偶联在一起，其中阳离子序列可确保肽在 核心复合物形成时结合进入核心复合物中，或在核心复合物形成之后使它 结合到带负电荷的核心复合物的表面上。这类部分及其并入的实例是将由 14个赖氨酸残基的线性序列组成的肽包括在内，且该序列与来自流感嗜血 菌HA蛋白的融合域的短疏水性氨基酸序列偶联，如实施例46所示。其 它实例包括合成的阳离子聚合物的使用，例如与融合片段聚合物偶联的 PEI，例如聚[甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯](PDEAMA)或N-异丙基 丙烯酰胺甲基丙烯酸共聚物。

当融合部分是用疏水性相互作用固定的时，它包含与核心复合物以一 定的方式相连接的片段或部分，以致该连接可减少与水溶液的接触并由此 减少固定复合物的能量。在一种实施方案中，固定疏水性相互作用是在融 合部分的烃部分和核心复合物的烃部分之间发生的。一种使用疏水性固定 的具体形式是二酰基脂与融合部分缀合，其中脂部分与使用阳离子脂形成 的核心复合物产生强烈相互作用。在另外实施方案中，固定疏水相互作用 是在融合部分的碳氟化合物部分和核心复合物的碳氟化合物部分之间发生 的。使得能进行适合固定的其它形式疏水相互作用力是可以的。

当融合部分与核心复合物共价连接时，发生与以下物质的共价偶联： (1)复合物形成试剂；(2)在复合物形成的时候可结合进复合物的化合物；(3) 预先形成的复合物的表面；或(4)与预先形成的复合物的表面相连的化合 物。在一种实施方案中优选在载体进入靶组织或细胞时使该键断裂。可以 通过使用可断裂的键来锚定融合层，实现该断裂。实例包括：(1)对酸敏感 的键，例如席夫碱或腙或乙烯醚；(2)可还原的键例如二硫键；或(3)如下所 述用于连接外部立体层的衔接物的一种。对酸敏感的衔接物在靶组织或细 胞内区室，例如内体结构(在通过大多数机制进行细胞吸收后载体将首先 被运输至其中)中常占优势的酸性条件下断裂。在一种实施方案中，融合 层具有疏水性质，因此它形成了其中水被大量地排除的一层。当在核心复 合物上形成这种层时，它可以通过众多可能的方法产生，例如与复合物形 成试剂一起加入，其中该层通过自组装形成，或在核心复合物已经形成后 在第二步中加入。在一种实施方案中，该层是在核心复合物形成的同时形 成的，如实施例38-43的举例说明。在另外的实施方案中，该层是通过第 二混合步骤形成的，其中核心复合物在第一混合步骤中形成，然后该层通 过随后核心复合物和在预存在的复合物上形成该层的试剂之间的混合步骤 加入。

在本发明的一种实施方案中，优选使用表面电荷是负性的或中性的核 心复合物。在此实施方案中，外壳赋予被靶组织和细胞结合和吸收的性质， 这与阳离子复合物-阴离子细胞静电结合机理不同，一般认为静电结合机理 提供了通过正电荷核心复合物的结合和吸收。通过允许使用具有中性或负 性表面电荷的核心复合物，可以实现很多好处。与正表面电荷载体胶体的 静电相互作用的减少或消除可以减少或除去导致吞噬细胞清除、非靶组织 和器官中的毒性和靶组织和器官中的细胞毒性的非特异性相互作用。

应该理解本发明不限于治疗任何特定的疾病或病症。

可以体内给予动物包括编码治疗剂的核酸序列的颗粒，作为基因治疗 法的有效性研究的动物模型的一部分。可以以不同的剂量对同样物种的不 同动物给予颗粒，由此该颗粒将在动物中转染细胞。然后对动物进行关于 所需治疗剂在动物体内的表达的评价。人们可以从这些评价中获得的数据 确定给予人类患者的颗粒的量。

在另一实施方案中，可以使用颗粒体外转染细胞。现已包括了编码治 疗剂的核酸序列的细胞，可以给予例如在上文描述的宿主，以便在宿主中 表达治疗剂和/或提供治疗效果。可以被转染的细胞和给药的方法可以选 自在上文中描述的那些。

也可以使用本发明的颗粒来体外转染器官的细胞。现已包括了包含编 码治疗剂的核酸序列的动物细胞的器官，可以被移植到动物中，借此移植 器官在动物中表达治疗剂和/或在动物中提供治疗效果。动物可以是哺乳 动物，包括人和非人类的灵长类。

也可以使用本发明的颗粒来体外转染细胞，所述细胞包含在含有细胞 混合物的细胞培养物中。在体外转导细胞后，细胞在体外产生治疗剂或蛋 白。然后可以通过为本领域技术人员所知的方法从细胞培养物中获得治疗 剂或蛋白。

也可以使用该颗粒来体外转染细胞，以便研究体外细胞遗传工程的机 理。

外壳部分

人们知道聚乙二醇(PEG)，一种不带电的亲水聚合物，可以为寡核苷 酸/阳离子脂复合物提供立体屏障(Meyer等人，J.Biol.Chem.273：15621 (1998)；Scaria同上，Philips同上)。本发明通过提供固定到核心复合物 上的屏障，对常规使用的立体屏障加以改进。该屏障也可以可选地包含提 高载体与靶组织和细胞结合的靶向部分，该靶向部份还可以可选地经由一 种连接固定，该连接在靶组织或当细胞吸收后载体典型地首先被运输到其 中的细胞内区室中断裂。

在将核心复合物固定到融合壳部分的实施方案中，外部立体层又被固 定到核心复合物、融合壳、或两者上，如下所述。在融合部分直接地结合 在核心复合物中的实施方案中，立体层是被直接固定到核心复合物上的。

外部立体层优选包含亲水的可生物降解的聚合物。如果聚合物不是可 生物降解的，那么使用相对低分子量的(＜30k道尔顿)聚合物。聚合物也 可以在极性和非极性的溶剂两者中显示出溶解性。适合聚合物包括为本领 域所熟知的PEG(各种分子量的)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，和聚乙烯醇， 聚乙烯基甲基醚，聚甲基丙烯酸羟丙基酯，聚羟丙基甲基丙烯酰胺，聚丙 烯酸羟乙基酯，聚甲基丙烯酰胺，聚二甲基丙烯酰胺，聚乳酸，聚乙二醇， 聚甲基噁唑啉，聚乙基噁唑啉，聚羟乙基噁唑啉，聚羟丙基噁唑啉，或聚 天冬酰胺(US专利5,631,018)。

其它适宜的聚合物包括可在胶体颗粒上形成至少5纳米“厚”或更厚 的(通过ζ电位降低(Woodle等人，Biophys.J.61：902(1992))或其它此类分 析确定的)立体屏障的那些聚合物。另外适宜的聚合物包括包含支链的聚合 物。在一种实施方案中，将葡萄糖部分的羟基官能团用于缀合多个立体聚 合物，其中一个立体聚合物被固定到核心复合物上。在另外的实施方案中， 将赖氨酸的胺官能团用于缀合两个立体聚合物，且羧基官能团与立体聚合 物衔接物一起用于缀合在核心复合物上。

当用PEG作为亲水聚合物缀合物时，PEG优选具有约1,000到约 50,000道尔顿的分子量。典型地，PEG链具有约2,000到约20,000道尔 顿的分子量。还可以使用混合分子量，这对于将发现在聚合物中最好的立 体性质(例如阻断细胞相互作用)与发现在小聚合物中最好的立体性质(例 如阻断小蛋白质相互作用)加以结合具有特定的优点。当使用在末端没有 配体的PEG偶联时，PEG在其游离端包含惰性甲氧基，并通过反应性的 化学基团与连接的片段偶联在一起。制备这种连接物的方法是为本领域所 熟知的，如在有关缀合的最近的教科书中所概括的(Greg T.Hermanson， Biconjugate techniques，Academic Press Inc.，San Diego，1996)。

可供选择的聚合物包括，但不局限于，聚乳酸，聚乙二醇酸，聚乙烯 吡咯烷酮，聚甲基丙烯酰胺，聚乙基噁唑啉，聚甲基噁唑啉，聚二甲基丙 烯酰胺，聚乙烯基甲基醚，聚甲基丙烯酸羟丙基酯，聚羟丙基甲基丙烯酰 胺，聚丙烯酸羟乙基酯，聚羟乙基噁唑啉，聚羟丙基噁唑啉，或聚天冬酰 胺。如以上对于PEG所述的，当在末端没有配体时用于偶联时，这些亲水 聚合物每个都优选在其游离端的具有不起反应的基团或羟基，且通过反应 性的化学基团与连接的片段偶联在一起。

固定是通过静电的，共价的或疏水性的相互作用提供的，或是通过这 些力的组合提供的。当外壳是通过静电固定的时，它通过电荷-电荷相互作 用与位于核酸或复合物形成试剂上的电荷基团相互作用，或与两者都发生 相互作用。多价静电相互作用的存在不但提供了结合稳定性，并且可允许 在靶组织和细胞内的适当的释放。当外壳是通过疏水性相互作用固定的时， 它包含与核心复合物以可减少与水溶液的接触并由此减少固定复合物的能 量的方式相连接的片段或部分。在一种实施方案中，固定用疏水性相互作 用是在外壳的烃部分和核心复合物的烃部分之间发生的。在另外的实施方 案中，固定用疏水性相互作用是在外壳的碳氟化合物部分和核心复合物的 碳氟化合物部分之间发生的。使得能进行适当固定的其它形式疏水相互作 用力是可以的。在一种实施方案中，这种疏水性的锚由可结合和插入脂双 层的肽序列组成例如包括来自膜蛋白质例如细胞色素b5的序列 (Thr-Asn-Trp-Val-Ile-Pro-Ala-Ile-Ser-Ala-Val-Val-Val-Ala-Leu-Met-Tyr- Arg-Ile-Tyr-Thr-Ala)或跨膜序列的膜锚定域。

当外壳是与核心复合物以共价键联系的时，这是通过与复合物形成试 剂的共价偶联，或者通过与在复合物形成的时候可结合进复合物的化合物 的共价偶联，或者通过与预先形成的复合物的表面的共价偶联，或者通过 与和预先形成的复合物的表面相连接的化合物的共价偶联来实现的。在一 种实施方案中优选该键在载体进入靶组织或细胞时断裂。这种断裂可以通 过将外壳经由可裂的键固定来实现，这些键的例子有酸不稳定键，例如席 夫碱或腙、乙烯醚，或可还原的键例如二硫键，或如下所述用于连接外部 立体层的衔接物的一种。对酸敏感的衔接物在靶组织或细胞内区室，例如 通过大多数机制被细胞吸收后载体首先被运输进其中的内体结构中占优势 的酸性条件下断裂。在一种实施方案中，融合层具有疏水性，因此它形成 了其中水被大量排除的一层。当这种层在核心复合物上形成时，它可以通 过众多可能的方法产生，例如与复合物形成试剂一起加入且该层通过自组 装形成，或在核心复合物已经形成后在第二步中加入。

在另一实施方案中，聚合物和配体一起使用。配体由用于与靶组织和 细胞结合以致核酸有效负载可发挥其生物活性的分子组成。适宜的配体包 括蛋白质，肽，和它们的化学类似物，碳水化合物，和小分子。在一种实 施方案中，配体是以类似于融合部分或立体聚合物的方式与核心复合物连 接的。在另外的实施方案中，配体与末端和核心复合物偶联的立体聚合物 连接。配体的适宜连接包括稳定的共价键，可断裂的键，和可在所需要的 结合事件发生以前保留配体的非共价连接。

靶向部分

为提高载体与靶组织或细胞的结合，外壳层有利地包括至少一种可使 载体与靶组织或细胞发生高度专一的相互作用的靶向部分。更具体地说， 在一种实施方案中，载体优选将包括附着于外层的未屏蔽的配体，该配体 可有效地使配体专一性地与在靶组织和细胞表面上的受体分子结合。 (Woodle等人，Small molecule ligands for targeting long circulating liposomes，in Long Circulating Liposomes：Old drugs，new therapeutics， Woodle and Stormed.，Springer，1998，第287-295页)在另外的实施方案 中，载体优选将包括连接在外层内或核心复合物的表面的屏蔽的配体，当 外层在确定的组织或靶条件下失去时，露出配体以使它可以与靶组织或细 胞结合。根据作为靶的细胞类型，载体可以包括两个或多个靶向部分。使 用多个(两个或多个)靶向部分可以为细胞靶向提供额外的选择性，以及可 以有助于载体与靶细胞以较高的亲合性和/或亲合力结合。当在载体上存 在一个以上靶向部分时，靶向部分的相对摩尔比可以进行改变以提供最佳 的靶向效率。用这种方式最佳化细胞结合和选择性的方法是本领域已知的。 技术人员也将意识到，测定细胞选择性和结合的亲合性及效率的方法是本 领域已知的，且可使用这些方法最佳化靶向配体的性质和数量。

适宜的配体包括，但不局限于：用于靶向内皮细胞的血管内皮细胞生 长因子；用于靶向血管损伤和肿瘤的FGF2；用于靶向肿瘤的促生长素抑 制素肽；用于靶向肿瘤的铁传递蛋白；用于肿瘤靶向的促黑激素(αMSH) 肽；用于低密度脂蛋白受体靶向的ApoE和肽；用于靶向暴露的胶原的 冯·维勒布兰德氏因子和肽；用于靶向柯萨奇-腺病毒受体(CAR)表达细胞 的腺病毒尾丝蛋白和肽；用于靶向Neuropilin 1的PD1和肽；用于靶向 EGF受体表达细胞的EGF和肽；以及用于靶向整联蛋白表达细胞的RGD 肽。

其它实例包括(i)叶酸，其中该组合物旨在治疗具有细胞表面叶酸受 体的肿瘤细胞，(ii)吡哆酰基，其中该组合物旨在治疗病毒感染的CD4+淋 巴细胞，或(iii)唾液酸-Lewis°，其中该组合物旨在治疗炎症区域。其它肽 配体可以使用例如噬菌体展示(F.Bartoli等人，分离针对组织特异性细 胞表面受体的肽配体，in Vector Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery(Abstracts form Cold Spring Harbor Laboratory 1999 meeting)， 1999，p4)和微生物展示(Georgiou等人，从展示在微生物表面的文库通过 FACS筛选出的超强亲合性抗体，in Vector Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery(Abstracts form Cold Spring Harbor Laboratory 1999 meeting)，1999，p3.)的方法鉴定。用这样的方式确定的配 体适合于在本发明中使用。

在特定的实施方案中，靶向配体可以是促生长素抑制素或促生长素抑 制素类似物。促生长素抑制素具有序列AGCLNFFWKTFTSC，且在半胱 氨酸残基之间包含二硫桥。许多与促生长素抑制素受体结合的促生长素抑 制素类似物是本领域已知的，且适合于在本发明中使用。见例如US专利 5,776,894，其在此全部作为参考引入。可用于本发明的具体促生长素抑制 素类似物是具有以下通式结构的类似物： F*CY-(DW)KTCT，其中DW 是D-色氨酸，F*表示可能具有D-或L-绝对构型的苯丙氨酸残基。作为 促生长素抑制素本身，这些化合物由于在半胱氨酸残基之间的二硫键而是 环状的。有利地，这些类似物可以在苯丙氨酸残基的游离氨基处衍生，例 如用多阳离子部分例如赖氨酸残基链进行衍生。熟练的技术人员将承认本 领域已知的其它促生长素抑制素类似物可以有利地用于本发明。

此外，已经研制了形成可引起强的和选择性的与靶组织和细胞的结合 的新肽序列的方法，例如“DNA改组”(W.P.C.Stremmer，通过DNA 改组定向进化酶和途径，in Vector Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery(Abstracts form Cold Spring Harbor Laboratory 1999 meeting)，1999，p.5.)且这些新序列肽是本发明适宜的配体。配体的其它化 学形式是适合于本发明的，例如以许多形式存在而且是细胞通常使用的配 体的天然碳水化合物(Kraling等人，Am.J.Path.150：1307(1997)以及 新的化学物种，其中一些可以是天然的配体的类似物例如D-氨基酸和拟肽 (peptidomimetics)，其它是通过药物化学技术例如组合化学确定的(P.D. Kassner等人，通过表达鉴定配体(LIVEV)：从组合文库中直接筛选靶 向配体，in Vector Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery (Abstracts form Cold Spring Harbor Laboratory 1999 meeting)，1999， p8.)。

靶向层是由暴露在复合物表面、或者核心复合物表面、融合层的表面 或保护性立体层的表面的可提供对所需要的组织和细胞进行专一性结合的 配体组成的。配体是共价地附着于胶体的，以致它们的暴露对于组织和细 胞结合是足够的。固定是通过与复合物形成试剂的共价偶联，或者通过与 在复合物形成的时候可结合进复合物中的化合物的共价偶联，或者通过与 预先形成的复合物的表面的共价偶联，或者通过与预先形成的复合物的表 面的相连结化合物的共价偶联来实现的。

例如肽配体可以被共价地偶联到立体聚合物例如聚噁唑啉上，该聚合 物在其远端与多聚阳离子例如线型的PEI共价偶联。PEI将与核酸有效负 载形成分层的胶体复合物，形成一种肽配体暴露在表面上的立体聚合物表 面壳。做为选择，该相同的肽缀合物可以与多聚阳离子例如线型的PEI或 阳离子脂在含水溶液中结合，然后用于将核酸有效负载凝聚到分层的胶体 中，配体暴露在表面立体聚合物壳上。

做为选择，该相同的肽缀合物可以与核酸有效负载的带负电荷的复合 物复合，该核酸有效负载使用多聚阳离子或阳离子脂至少部分凝聚，得到 分层的胶体，配体暴露在表面立体聚合物壳上。类似地，肽配体可以与立 体聚合物例如聚噁唑啉共价偶联，该聚合物是与脂在其远端共价偶联的， 且该缀合物可以按以上所述与包含核酸有效负载的多聚阳离子和/或阳离 子脂和/或中性或负性脂胶体一起使用。

在外层上存在的靶分子的数目将根据以下因素而不同，例如配体-受 体相互作用的亲合力，受体在靶组织和细胞表面的相对丰度，以及靶组织 和细胞的相对丰度。然而，在每个载体的表面上有25-100个靶向分子通 常可提供适宜的对细胞靶向的增强作用。

靶向部分的存在导致与靶组织和细胞的结合获得所需要的增强。用于 这种结合的适当的分析法可以是ELISA平板分析法，细胞培养物表达分析 法，或任何其它的结合分析法。结合的一个实例见实施例48以及图25和 26。

外壳部分的固定

如上所述，外壳部分的外部立体层可以被固定到内部的融合层，或核 心复合物，或两者上。这种固定可以是通过静电的，共价的或疏水性的相 互作用，或这些力的组合实现的。当外壳是通过静电固定的时，它通过电 荷-电荷相互作用或与核酸，或与复合物形成试剂，或与两者的电荷基团发 生相互作用。多价静电相互作用的存在提供了结合稳定性，并且可允许在 靶组织和细胞内的适当的释放。当外壳是用疏水性相互作用固定的时，它 包含与核心复合物以可减少与水溶液的接触并由此减少固定复合物的能量 的方式相连结的片段或部分。

在一种实施方案中，这些锚由连结并插入脂双层的肽序列组成，例如 包括来自膜蛋白质例如细胞色素b5的序列(Thr-Asn Trp-Val-Ile-Pro-Ala-Ile-Ser-Ala-Val-Val-Val-Ala-Leu-Met-Tyr-Arg-Ee-Ty r-Thr-Ala)或跨膜序列的膜锚定域。在一种实施方案中，固定用疏水性相 互作用是在外壳的烃部分和核心复合物的烃部分之间发生的。在另外的种 实施方案中，固定用疏水性相互作用是在外壳的碳氟化合物部分和核心复 合物的碳氟化合物部分之间发生的。使得能进行适当固定的其它形式疏水 相互作用力是可以的。

当外壳是与核心复合物以共价键连接的时，发生以下共价偶联：(1) 与复合物形成试剂；(2)与在复合物形成的时候可结合进复合物的化合物； (3)与预先形成的复合物的表面；或(4)与预先形成的复合物的表面的相连接 化合物进行的共价偶联。

当外壳通过共价键固定到融合层上时，该键可以是稳定的，且在这种 实施方案中，外层将与融合层一起在细胞进入时脱落。稳定的键的一个实 例是氨基甲酸酯键。在另外的实施方案中，优选键在载体进入靶组织或细 胞时断裂。在一种实施方案中，融合层具有疏水性，因此它形成了其中水 被大量排除的一层。当这种层在核心复合物上形成时，它可以通过众多可 能的方法产生，例如与复合物形成试剂一起加入，其中该层通过自组装形 成或在核心复合物已经形成后在第二步中加入。

当外层直接地固定到核心复合物上时，优选它在内体中占优势的条件 下是可断裂的。该断裂可以通过借助于可断裂的键例如对酸敏感的键或可 还原的键例如二硫键固定外壳来实现。对酸敏感的衔接物在靶组织或细胞 内区室，例如细胞吸收后载体首先被运输进其中的内体结构中占优势的酸 性条件下断裂。适宜的可断裂的键包括二硫键，以及对酸敏感的键例如席 夫碱、或腙、或乙烯醚。例如，核心复合物可以包含游离的胺基，且立体 层可以包含侧醛基。将核心复合物与立体层组分混合将导致在核心复合物 和立体层之间希夫碱的形成。做为选择，例如，二硫键可以在分别存在于 核心复合物和立体层上的游离的巯基之间形成。在优选的实施方案中，可 断裂的键层包含pH值敏感的共价键。更优选，该pH值敏感的共价键选 自  ： 和

载体的给药方法

载体是通过全身和局部注射途径胃肠外给药的，它们也可以离体给 药。

载体的体外和体内试验

本发明载体的体外试验方法是为本领域所熟知的。例如，可以如实施 例35和44中所述的测定它们向培养物中细胞和组织进行递送的能力，或 可以如实施例40和42中所描述的测定它们的胶体和物理化学性质。

本发明载体的体内效果的测定方法是为本领域所熟知的。例如，当载 体用于治疗哺乳动物的疾病时，载体的效果可以通过研究该疾病的一或多 种症状的改善确定。有利地，体内效果可以使用对疾病的进程或程度特征 性的规定临床终点(clinical end poit)进行的测定。

在本发明的意义内如果基因递送载体能够将核酸转移到体外或体内的 细胞或组织中，则它表现出体外或体内的“融合活性”。然而，融合活性 也可以通过不依赖于对通过载体转移的核酸的测定的本领域已知方法评 价。例如，在下面文献中使用的方法：Lackey等人，Proc.Int.Symp. Control.Rel.Bioact.Mater.1999，26，#6245；Meyer等人，FEBS Lett. 421：61(1999)以及Richardson等人，Proc.Int.Symp.Control. Rel. Bioact.Mater.1999，26，#251，可以用来评价本发明载体的融合活性。作为 本领域技术人员的一般参考书，当考虑与膜融合有关的期刊时，将会考虑 以下文献：H.Hilderson和S.Fuller编，系列编辑J.Robin Harris，生物 膜的融合和相关问题 SubcellularBiochemistry Vol.34.， KluwerAcademic/Plenum Publishers，New York 2000。在该卷中特别参考： H.Kubista，S.Sacre，和S.E.Moss，膜联蛋白和膜融合，p73-131；P. Collas和D.Poccia，核膜组装过程中的膜融合事件，第273-302页；Y. Gaudin，融合蛋白构象改变的可逆性：弹状病毒诱导的膜融合中的有趣事件， 379-408页。此外，P.Collas和D.Poccia，Dev Biol.1995 May；169(1)： 123-35以及P.Collas和D.Poccia，Methods Cell BioL 1998；53： 417-52描述了融合活性的测定。使用共振能量转移来监测膜融合进一步地 在下面文献中描述：Pecheur EI，Martin I，Ruysschaert JM，Bienvenue A，Hoekstra D.Biochemistry 37，2361-2371(1998)  以及Struck DK， Hoekstra D，Pagano RE.Biochemistry 20，4093-4099(1981)。如果用 FRET技术来评价本发明载体的融合活性，优选与非融合的对照载体相比， 测到的输出信号增加至少2倍、更优选至少3倍，以及更优选至少4倍。

如果将细胞与载体接触能够导致转移的核酸在所述细胞或组织中体外 或体内表达，则基因递送载体显示了体外或体内的“生物活性”。本发明 载体的融合活性和/或生物学活性的测定方法是为本领域所熟知的，且进一 步在下文的实施例中描述。特别地，依赖于对载体递送的标志基因所编码 的基因产物进行直接或间接鉴定的方法适于评价本发明的载体是否显示出 了生物学活性。优选至少5％与本发明的载体在体外接触的细胞表达标志 基因。更优选表达率为与本发明的载体体外接触的细胞的至少20％，50％ 和80％。如果用本发明的载体体外或体内处理组织，优选至少5％的细胞， 优选至少20％，50％和80％所述组织的实质细胞表达标志基因。任何编码 可检测的基因产物的基因均可以充当适宜的标志基因。适宜的标志基因的 选择被认为是在本领域技术人员常规能力范围之内。

本发明的这些及其它特征和优点将通过下面的实施例得到更全面的 地了解，实施例仅仅是为了举例说明性的目的而提供的，没有意图限制本 发明的范围。

下面的实施例举例说明本发明；温度以摄氏温度给出。使用下面的缩 写：

BOC＝叔丁氧羰基；

THF＝四氢呋喃；

己烷＝正己烷；

醚＝乙醚。

关于命名法：当给不同的氮原子编号时，末端氨基氮被当做末端碳原 子的取代基，而非末端氮原子被解释为CH2基团的氮杂取代且被相应地编 号。因此例如在精胺中的4个氮原子被指定为N1，N4，N9和N12：

           1             4            9           12

     H2N-CH2-(CH2)2-NH-(CH2)4-NH-(CH2)2-CH2-NH2

     (1，12-二氨基-4，9-二氮杂十二烷) 实施例1：N4-[(2-羟基)-正十四基]-亚精胺三盐酸盐

将6克(0.1646摩尔)氯化氢的50毫升乙酸乙酯溶液在搅拌下，在室温 下，加入到8.8克(0.0158摩尔)N1，N8-二-BOC-N4-[(2-羟基)-正-十四基] -亚精胺的50毫升乙酸乙酯溶液中。搅拌1.25小时后，过滤从反应混合物中 沉淀出的晶体。将吸湿的粗产物溶于水，然后在装有Amberlite XAD 1180 吸附剂树脂的柱上层析(水中)，由此首先以水洗脱然后以水与异丙醇(9∶1 或3∶1)的混合物洗脱。将包含产品的组份合并，在水喷真空(water jet vacuum)下浓缩，然后在高真空下冷冻干燥。以含水量4.25％的冷冻干燥 物形式获得标题化合物，Rf：0.25[薄层色谱板硅胶60 F254；溶剂：二氯甲烷/ 甲醇/30％氨水溶液(10∶3.5∶1)]。 如下制造原料化合物：

a)N1 ，N8 -二BOC-N4 -[(2-羟基)-正-十四基]-亚精胺

将12.49克(0.05摩尔)的1，2-十四烯氧化物(85％)加入到17.27克 (0.05摩尔)N1，N8-二BOC-亚精胺的200毫升乙醇溶液中。将反应混合物 在回流下加热2小时，然后进一步地加入3.44克(0.01377摩尔)1，2-十四烯 氧化物。在回流下加热16.5小时之后，将反应混合物通过蒸发浓缩。通过快 速层析在粒径0.04-0.063毫米的硅胶上提纯油状的粗产物。将已经用二氯 甲烷/甲醇混合物(19∶1)洗脱的包含产品的组份合并通过在真空下蒸发浓 缩。以油的形式获得标题化合物，Rf：0.80[溶剂：二氯甲烷/甲醇/30％氨水 溶液(40∶10∶1)]。 b) N1 ，N8 -二BOC-亚精胺

在0-5℃氮气下于2小时内在搅拌下将221.67克(0.90摩尔)2-(BOC -氧亚氨基)-2-苯基乙腈的630毫升四氢呋喃溶液滴加到65.34克(0.45摩 尔)亚精胺的630毫升四氢呋喃溶液中。将反应混合物在室温下搅拌16小 时，然后通过真空蒸发浓缩，然后将油状的残余物在乙醚与稀盐酸(pH值3) 之间分配。用30％氢氧化钠溶液(pH值10)将包含盐酸的相处理为碱性， 将想要的产品用乙醚提取，用饱和氯化钠溶液洗涤乙醚提取物，用硫酸钠干 燥有机相，并通过在真空下蒸发浓缩。从乙醚-己烷将残余物重结晶之后， 得到标题化合物，熔点85-86℃。通过浓缩母液，得到第二批标题化合物，熔点 78-82℃。 实施例2：N4-[(2-羟基)-正-十四基]-亚精胺三草酸盐

将10.17克(0.08067摩尔)的草酸二水合物在90毫升水中的溶液搅拌 下加入到15克(0.02689摩尔)的N1，N8-二BOC-N4-[(2-羟基)-正-十四 基]]-亚精胺(实施例1a)的30毫升乙醇溶液中。在90℃下搅拌反应混合物 5小时，然后在真空下浓缩。冷却到0℃后，标题化合物从与乙醇混合的浓缩 物中以结晶形态沉淀出来，熔点180℃(分解)。 实施例3：N5-[(2-羟基)-正癸基]-高亚精胺三盐酸盐

将1.276克(0.035摩尔)氯化氢的10毫升乙酸乙酯溶液在室温搅拌下加 入到2.89克(0.0056摩尔)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羟基)-正癸基]-高亚精 胺的10毫升乙酸乙酯溶液中。在室温下搅拌20分钟，然后在0℃搅拌20 分钟。将沉淀的产品过滤，用冷的乙酸乙酯洗后溶于水并用水在装有 Amberlite XAD 1180吸附剂树脂的柱上层析。将合并的包含产品的组份 冷冻干燥后，得到含水量4.5％的标题化合物，Rf：0.28(溶剂同实施例1)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N9 -二BOC-N5 -[(2-羟基)-正-癸基]-高亚精胺

将2.63克(0.0168摩尔)的1，2-癸烯氧化物加入到5.03克(0.014摩 尔)N1，N9-二BOC-高亚精胺的50毫升乙醇溶液中。将反应混合物在回流 下沸腾22小时，然后进一步地加入0.52克(0.00333摩尔)1，2-癸烯氧化物， 继续在回流下加热18小时，然后通过真空蒸发浓缩混合物。在硅胶上通过 快速层析提纯油状的粗产物。用二氯甲烷和甲醇含量1％、或2.5％、或5％、 或10％的二氯甲烷/甲醇混合物进行洗脱。以油的形式获得标题化合物，Rf： 0.39[溶剂：二氯甲烷/甲醇(9∶1)]。

b) N1 ，N9 -二BOC-高亚精胺

将17克活性碳上的钯(10％Pd)加入167.7克(0.373摩尔)N5-苄基-N1， N9-二BOC-高亚精胺(Bergerone等人，Synthesis 1982：689)在1200毫升 甲醇和31.9毫升浓盐酸的混合物中的溶液，然后在30℃下进行氢化，直到 氢的吸收结束。过滤和将滤液蒸发至干后，将晶状的残余物(标题化合物的盐 酸盐)溶于2升水，然后将水溶液(pH值4)通过增添4N盐酸调节为pH值 3。用乙醚洗产品，通过加入30％氢氧化钠溶液调节水相pH值为10，然后用 三份乙醚，每份500毫升提取油产品。用浓氯化钠水溶液洗涤合并的乙醚相 后，用硫酸钠干燥并真空蒸发，以油形式得到标题化合物，其逐步结晶，熔点 42-46℃。 实施例4：N5-[(2-羟基)-正-癸基]-高亚精胺三草酸盐

将4.54克(0.036摩尔)的草酸二水合物在30毫升水中的溶液搅拌下加 入到6.19克(0.012摩尔)的N1，N9-二BOC-N5-[(2-羟基)-正-癸基]]-高 亚精胺(实施例3a)的30毫升乙醇溶液中。将反应混合物在回流下加热23 小时，而后通过真空蒸发浓缩。粗产品用类似于实施例1的方法在Amberlite XAD 1180吸附剂树脂上提纯[洗脱液：H2O和H2O/异丙醇(19∶1或4∶ 1)]。冷冻干燥后，得到含水量3.8％的标题化合物，Rf：0.28(溶剂同实施例 1)。 实施例5：N5-[(2-羟基)-正十六烷基]-高亚精胺-三(甲苯-4-磺酸盐)

将21.48克(0.0358摩尔)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羟基)-正十六烷 基]-高亚精胺和20.43克(0.1074摩尔)甲苯-4-磺酸一水合物在120毫升水 中的混合物在70℃搅拌加热11.5小时，随后浓缩到大约30毫升的体积。 将浓缩液用类似于实施例1的方法在Amberlite XAD 1180吸附剂树脂上提 纯[洗脱液：H2O和H2O/异丙醇(4∶1或3∶2)]。以冷冻干燥物的形式 得到含水量2.8％的标题化合物，Rf：0.32(溶剂同实施例1)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N9 -二BOC-N5 -[(2-羟基)-正十六烷基]-高亚精胺

将15.91克(0.0562摩尔)1，2-十六碳烯氧化物(85％)加入到13.48克 (0.0375摩尔)N1，N9-二BOC-高亚精胺(实施例3b)的150毫升乙醇溶液中， 将反应混合物在回流下沸腾20小时，而后将其通过真空蒸发浓缩。将油状 的粗产品用快速层析在硅胶上提纯，由此使用乙酸乙酯/己烷混合物(1∶3 或1∶2或1∶1)和乙酸乙酯作为洗脱液。得到油形式的标题化合物，Rf： 0.45(溶剂同实施例3a)。 实施例6：N5-[(2-羟基)-正己基]-高亚精胺三草酸盐

将4.6克(0.0365摩尔)草酸二水合物的40毫升水溶液加入到5.6克 (0.01218摩尔)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羟基)-正己基]-高亚精胺的20 毫升乙醇溶液中，将反应混合物在回流下加热4.5小时，而后通过真空蒸 发浓缩。将得到的粗产品溶于甲醇并通过滴加乙醚将其沉淀出来。进行过 滤，并从乙醇/水中重结晶标题化合物，熔点85-90℃。

如下制造原料化合物：

a)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羟基)-正己基]-高亚精胺

将1.80克(0.018摩尔)1，2-己烯氧化物加入到4.31克(0.012摩尔)N1， N9-二BOC-高亚精胺(实施例3b)的40毫升乙醇溶液中，将反应混合物回 流下沸腾22小时，而后将其通过真空蒸发浓缩。将油状残余物用二氯甲烷 /甲醇混合物(99∶1或19∶1或9∶1)在硅胶上通过快速层析纯化。得到油 形式的标题化合物，Rf：0.32(溶剂同实施例3a)。 实施例7：N5-[(2-羟基)-正丁基]-高亚精胺-三(甲苯-4-磺酸盐)

将6.39克(0.0148摩尔)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羟基)-正丁基]-高 亚精胺和8.45克(0.0444摩尔)甲苯-4-磺酸一水合物在30毫升水中的混合 物在75℃下搅拌加热3.5小时，随后将其冷却后用1N氢氧化钠溶液调节 pH值至6，然后真空浓缩。将浓缩液用类似于实施例1的方法在Amberlite XAD 1180吸附剂树脂上提纯[洗脱液：水和水/异丙醇(9∶1)]。以冷冻干 燥物的形式得到含水量1.4％的标题化合物，Rf：0.14(溶剂同实施例1)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N9 -二BOC-N5 -[(2-羟基)-正丁基]-高亚精胺

将1.51克(0.021摩尔)1，2-丁烯氧化物加入到5.39克(0.015摩尔)N1， N9-二BOC-高亚精胺(实施例3b)的50毫升乙醇溶液中。将反应混合物在 80℃下加热5小时，然后进一步地加入0.36克(0.005摩尔)1，2-丁烯氧化物， 继续在80℃下加热15小时，然后将混合物通过真空蒸发浓缩。将粗产品 用二氯甲烷/甲醇混合物(50∶1或20∶1或10∶1)在硅胶上通过快速层析 提纯。得到油形式的标题化合物，Rf：0.20(溶剂同实施例3a)。 实施例8：N5-[(2-羟基)-正辛基]-高亚精胺三草酸盐

将3.64克(0.0289摩尔)草酸二水合物的36毫升水溶液在搅拌下加入到 4.7克(0.00963摩尔)N1，N9-二BOC-N5-[(2-羟基)-正辛基]-高亚精胺的 12毫升乙醇溶液中，将反应混合物在90℃下加热4.5小时，而后通过真空 蒸发浓缩。从乙醇中将残余物重结晶之后，得到水含量2.2％的标题化合物， 熔点83-85℃。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N9 -二BOC-N5 -[(2-羟基)-正辛基]-高亚精胺

将2.31克(0.018摩尔)1，2-辛烯氧化物加入到5.39g(0.015摩尔)N1，N9 -二BOC-高亚精胺(实施例3b)的50毫升乙醇溶液中。将反应混合物在80 ℃下加热15小时，然后进一步地加入0.39克(0.00304摩尔)1，2-辛烯氧化 物，继续在80℃下加热8小时，然后将混合物通过真空蒸发浓缩。用与实 施例7a类似的方法提纯粗产物。得到油形式的标题化合物，Rf：0.35(溶剂 同实施例3a)。 实施例9：N5-[(2-羟基)-正十六烷基]-N1，N1，N9，N9-四甲基高亚精 胺-三(甲苯-4-磺酸盐)

将11.8ml(0.15摩尔)35％甲醛水溶液和0.75克活性碳上的钯(10％Pd) 加入2.83克(0.003摩尔)N5-[(2-羟基)-正十六烷基]-高亚精胺-三(甲苯-4 -磺酸盐)(实施例5)的20毫升水溶液中。在室温下进行氢化，直到氢气的 吸收结束。实施过滤，将滤液通过真空蒸发浓缩，然后将残余物在2N氢氧 化钠溶液和乙酸乙酯之间分配。将用浓氯化钠水溶液洗涤和用硫酸钠干燥 的有机相通过蒸发浓缩，将残余物溶于甲醇，然后通过加入2N盐酸调节 该甲醇溶液pH值至3。真空蒸发后，从甲醇/乙醚中将残余物重结晶，得到 标题化合物，熔点236-239℃。 实施例10：N4-[(2-羟基)-正癸基]-N1，N1，N8，N8-四甲基亚精 胺三草酸盐

将1.6克(0.002745摩尔)N4-[(2-羟基)-正癸基]-亚精胺三草酸盐(实 施例27)按照类似于实施例9的方法与11.8毫升(0.15摩尔)35％甲醛水溶 液反应。通过蒸发浓缩后，将残余物从乙腈中结晶。从甲醇/乙腈中重结晶 之后，得到含水量1.69％的标题化合物，熔点118-121℃。 实施例11：N1，N4-双(3-氨基丙基)-N1，N4-双[(2-羟基)-正十六烷基]-1， 4-二氨基-反式-2-丁烯-三草酸盐

将2.7克(0.00306摩尔)N1，N4-双[3-BOC-氨基丙基]-N1，N4-双[(2- 羟基)-正十六烷基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯，1.16克(0.0092摩尔)草酸二 水合物和30毫升水的混合物按照类似于实施例13的方法反应(反应持续时 间：18小时)。从水/乙腈中再次重结晶的标题化合物含有2.3％的水，熔点 165℃(分解)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N4 -双[3-BOC-氨基丙基]-N1 ，N4 -双[(2-羟基)-正十六烷基]-1，4 -二氨基-反式-2-丁烯

将2克(0.005摩尔)N1，N4-双[3-BOC-氨基丙基]-1，4-二氨基-反式 -2-丁烯，3.54克(0.0125摩尔)1，2-十六碳烯氧化物(85％)和40毫升乙醇的 混合物在回流下沸腾24小时，随后通过真空蒸发浓缩。将残余物用二氯甲 烷/甲醇混合物(100∶1或25∶1)在硅胶上通过快速层析纯化后，得到油 形式的标题化合物，其在短时间后固化为晶体形式，熔点85-87℃。 b) N1 ，N4 -双[ 3-BOC-氨基丙基]-N1 -BOC-1，4-二氨基-反式-2-丁烯和 N1 ，N4 -双[3-BOC-氨基丙基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯

在氮气下，在3小时过程内将46.18克(0.1875摩尔)2-(BOC-氧亚氨 基)-2-苯基乙腈的150毫升THF溶液在搅拌下滴加入冷却到0-5℃的 15.02克(0.075摩尔)N1，N4-双(3-氨基丙基)-1，4-二氨基-反式-2-丁烯的 100毫升THF溶液中。将反应混合物在室温下再搅拌3.5天，而后通过真空 蒸发浓缩，然后将残余物用二氯甲烷/甲醇混合物(39∶1或9∶1)和二氯 甲烷/甲醇/30％氨水溶液(90∶10∶0.25或10∶5∶1)的混合物在硅胶上通 过快速层析分离。由此得到油形式的第一个标题化合物，N1，N4-双[3- BOC-氨基丙基]-N1-BOC-1，4-二氨基-反式-2-丁烯，Rf：0.87(溶剂如 实施例1a)，还得到油形式的第二个标题化合物，N1，N4-双[3-BOC- 氨基丙基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯，Rf：0.26(溶剂如实施例1a)。 实施例12：N1，N4-双(3-氨基丙基)-N1-[(2-羟基)-正十六烷基]-1，4- 二氨基-反式-2-丁烯-四草酸盐

由1.58克(0.00213摩尔)N1，N4-双[3-BOC-氨基丙基]-N1-BOC- N4-[(2-羟基)-正十六烷基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯，1.075克(0.00853 摩尔)草酸二水合物和20毫升水，按照类似于实施例11的方法得到标题化 合物。熔点185℃(分解)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N4 -双[3-BOC-氨基丙基]-N1 -BOC-N4 -[(2-羟基)-正十六烷 基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯

由2.5克(0.005摩尔)N1，N4-双[3-BOC-氨基丙基]-N1-BOC-1，4 -二氨基-反式-2-丁烯，和1.77克(0.00626摩尔)1，2-十六碳烯氧化物 (85％)，按照类似于实施例11a的方法得到油形式的标题化合物。Rf：0.59 (溶剂如实施例3a)。 实施例13：N4-[(2-羟基)-正十六烷基]-N9-辛基-精胺四草酸盐

将1.08克(0.00143摩尔)N1，N12-二BOC-N4-[(2-羟基)-正十六烷 基]-N9-正辛基-精胺，0.721克(0.00577摩尔)草酸二水合物和20毫升水的 混合物在回流下加热16小时，随后与乙腈混合(直到出现轻微的混浊)。过 滤在冷却下沉淀的产物，用乙腈洗涤并在高真空下在100℃干燥。得到含 有1.6％水的标题化合物，熔点170-180℃(分解)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N12 -二BOC-N4 -[(2-羟基)-正十六烷基]-N9 -正辛基-精胺

将1.3克(0.00202摩尔)N1，N12-二BOC-N4-[(2-羟基)-正十六烷基]- 精胺，0.444克(0.0023摩尔)1-溴辛烷，1.1克(0.00796摩尔)碳酸钾和20 毫升乙腈的混合物回流下加热16小时。将0.089克(0.00046摩尔)1-溴辛 烷进一步加入到反应混合物中，并在回流下继续再加热6小时。进一步加 入0.089克(0.00046摩尔)1-溴辛烷并回流下加热14小时后，将反应混合 物通过真空蒸发浓缩。将残余物用二氯甲烷/甲醇混合物(50∶1或9∶1)和 二氯甲烷/甲醇/30％氨水溶液(90∶10∶0.25)的混合物在硅胶上通过快速 层析进行提纯。得到油形式的标题化合物，Rf：0.76[溶剂：甲苯/异丙醇/ 30％氨水溶液(70∶29∶1)]。

b) N1 ，N12 -二BOC-N4 -[(2-羟基)-正十六烷基]-精胺和N1 ，N12 -二 BOC-N4 ，N9 -双[(2-羟基)-正十六烷基]-精胺

将3.21克(0.01136摩尔)1，2-十六碳烯氧化物(85％)加入到3.98克 (0.00989摩尔)N1，N12-二BOC-精胺的40毫升乙醇溶液中，将反应混合 物在回流下沸腾20小时，而后通过真空蒸发浓缩。将粗混合物在硅胶上层 析，使用二氯甲烷/甲醇混合物(100∶1或9∶1)洗脱，首先洗脱出N1，N12 -二BOC-N4，N9-双[(2-羟基)-正十六烷基]-精胺，Rf：0.31(溶剂如实施 例3a)，而后使用二氯甲烷/甲醇/30％氨水溶液(90∶10∶0.25或40∶10∶ 0.5)的混合物，洗脱出N1，N12-二BOC-N4-[(2-羟基)-正十六烷基]-精 胺，Rf：0.07(溶剂如实施例13a)。

c) N1 ，N9 ，N12 -三BOC-精胺和N1 ，N12 -二BOC-精胺

在氮气下搅拌将50克(0.2471摩尔)精胺溶于300毫升THF中，而后 在0-5℃于一小时过程内滴加134g(0.544摩尔)2-(BOC-氧亚氨基)-2- 苯基乙腈的500毫升THF溶液。将反应混合物在室温下再搅拌16小时， 通过真空蒸发浓缩。用二氯甲烷，二氯甲烷/甲醇混合物(97.5∶2.5或9∶1) 和二氯甲烷/甲醇/30％氨水溶液(90∶10∶0.5或20∶10∶1)的混合物在硅 胶上通过快速层析分离反应混合物，得到下面的化合物：油状的N1，N9， N12-三BOC-精胺[见J.Org.Chem.50，5735(1985)]，Rf：0.78(溶剂如实施 例1a)，略不纯的N1，N12-二BOC-精胺，熔点86-88℃和纯的N1，N12 -二BOC-精胺，熔点91-92℃。

d) N1 ，N12 -二BOC-精胺，还可以按下面方法制备：

将18.4克(0.0196摩尔)N1，N4，N9，N12-四(苄氧羰基)-N1，N12-二BOC- 精胺溶于200毫升甲醇。在加入1.8克活性碳上的钯(10％Pd)之后，在室 温下进行氢化直到氢气的吸收结束。过滤溶液，然后将滤液通过真空蒸发浓 缩。该油状标题化合物，Rf：0.09(溶剂如在实施例1a)，逐渐变成结晶状 态，与根据实施例13C得到的N1，N12-二BOC-精胺相同。

e) N1 ，N4 ，N9 ，N12 -四(苄氧羰基)-N1 ，N12 -二BOC-精胺

将0.57克(0.00466摩尔)4-二甲基氨基吡啶和11.24克(0.0515摩尔) 的二-(叔丁基)-碳酸氢盐的25毫升乙腈溶液在搅拌下加入到17.3克 (0.0234摩尔)N1，N4，N9，N12-四(苄氧羰基)-精胺的40毫升乙腈溶液中。 将反应混合物在室温下搅拌18小时，随后通过蒸发浓缩。然后将残余物用 己烷/乙酸乙酯混合物(4∶1或3∶1或2∶1或1∶1)在硅胶上通过快速层 析纯化。得到油形式的标题化合物，Rf：0.38[溶剂：乙酸乙酯/己烷(1∶1)]。

f) N1 ，N4 ，N9 ，N12 -四(苄氧羰基)-精胺

在室温下，用一小时的时间将82.82毫升(0.25摩尔)氯甲酸苄基酯 (50％甲苯溶液)滴加加入到搅拌好的10.12克(0.05摩尔)精胺和39.75克 (0.375摩尔)碳酸钠的200毫升水溶液中。将反应混合物搅拌4小时，过滤 并分离有机相。将有机相用水和用浓氯化钠水溶液洗涤，用硫酸钠干燥， 并通过真空蒸发浓缩。将残余物用乙酸乙酯/己烷混合物(1∶3或1∶2或 1∶1)在硅胶上通过快速层析提纯。得到油形式的标题化合物，Rf：0.37[溶 剂：乙酸乙酯/己烷(2∶1)]。 实施例14：N5-(2-羟乙基)-高亚精胺三草酸盐

按照类似于实施例8的方法，由2.6克(0.00644摩尔)N1，N9-二BOC -N5-(2-羟乙基)-高亚精胺和2.435克(0.0193摩尔)草酸二水合物得到标 题化合物。熔点127-130℃。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N9 -二BOC-N5 -(2-羟乙基)-高亚精胺

用大约20分钟的时间将3.2克(0.0726摩尔)环氧乙烷通入冷却到5℃ 的7.19克(0.02摩尔)N1，N9-二BOC-高亚精胺的25毫升甲醇溶液中。将 反应混合物在室温下搅拌21小时，随后通过真空蒸发浓缩。将残余物用二 氯甲烷/甲醇混合物(30∶1或10∶1或5∶1)在硅胶上通过快速层析提纯。 得到油形式的标题化合物，Rf：0.07(溶剂同实施例3a)。 实施例15：N4，N9-双[(2-羟基)-正辛基]-精胺四草酸盐

将1.26克(0.01摩尔)草酸二水合物的10毫升水溶液加入到1.65克 (0.0025摩尔)N1，N12-二BOC-N4，N9-双[(2-羟基)-正辛基]-精胺的5 毫升乙醇溶液中。将反应混合物在90℃下搅拌9小时，然后通过真空蒸发浓 缩，然后将残余物从甲醇/乙醚中结晶。得到熔点126-129℃的标题化合物。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N12 -二BOC-N4 ，N9 -双[2-羟基]-正辛基]-精胺

将1.01克(0.0025摩尔)N1，N12-二BOC-精胺、0.96克(0.0075摩尔)1，2 -辛烯氧化物和15毫升乙醇的混合物在85℃下搅拌21小时，随后通过真空 蒸发浓缩。将残余物用二氯甲烷/甲醇混合物(19∶1或9∶1)在硅胶上通过 快速层析提纯。得到油形式的标题化合物，Rf：0.23(溶剂同实施例3a)。 实施例16：N4，N9-双[(2-羟基)-正癸基]-精胺四草酸盐

将3.73克(0.0296摩尔)草酸二水合物的10毫升水溶液加入5.3克 (0.00741摩尔)N1，N12-二BOC-N4，N9-双[(2-羟基)-正癸基]-精胺的10 毫升乙醇溶液中。将反应混合物在90℃下搅拌10小时，然后通过蒸发浓缩， 并将残余物从甲醇/乙醚中结晶。得到175-177℃熔解的标题化合物。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N12 -二BOC-N4 ，N9 -双[(2-羟基)-正癸基]-精胺

将3.22克(0.008摩尔)N1，N12-二BOC-精胺，3.75克(0.024摩尔)1，2 -癸烯氧化物和32毫升乙醇的混合物在80℃下搅拌19小时，随后通过真空 蒸发浓缩。将残余物用二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇混合物(50∶1或19∶1或 9∶1)在硅胶上通过快速层析提纯。得到油形式的标题化合物，Rf：0.25(溶 剂同实施例3a)。 实施例17：N4，N9 -双[(2-羟基)-正十二烷基]-精胺-四草酸盐

按照类似实施例15的方法，但维持反应10小时，由1.7克(0.0022 摩尔)N1，N12-二BOC-N4，N9-双[(2-羟基)-N-十二烷基]-精胺和1.11 克(0.0088摩尔)草酸二水合物得到标题化合物。熔点187℃(分解)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N12 -二BOC-N4 ，N9 -双[(2-羟基)-正十二烷基]-精胺

将1.01克(0.0025摩尔)N1，N12-二BOC-精胺和1.38克(0.0075摩 尔)1，2-十二烯氧化物按照类似于实施例15a的方法反应(反应持续时间： 22小时)。在硅胶上通过快速层析纯化[洗脱液：二氯甲烷/甲醇(99∶1或 19∶1)]，以油的形式获得标题化合物，Rf：0.27(溶剂如实施例3a)。 实施例18：N4，N9-双[(2-羟基)-正十四烷基]-精胺四草酸盐

按照类似实施例15的方法，但保持反应11.5小时，使1.82克(0.0022 摩尔)N1，N12-二BOC-N4，N9-双[(2-羟基)-正十四烷基]-精胺和1.11 克(0.0088摩尔)草酸二水合物反应。从甲醇/水中结晶后，标题化合物在170 ℃分解。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N12 -二BOC-N4 ，N9 -双[(2-羟基)-正十四烷基]-精胺 将1.01克(0.0025摩尔)N1，N12-二BOC-精胺和1.874克(0.0075摩 尔)1，2-十二烯氧化物(85％)按照类似于实施例15a的方法反应(反应时 间：18.5小时)。在硅胶上通过快速层析纯化[洗脱液：二氯甲烷/甲醇(99∶ 1或49∶1或19∶1或9∶1)]，以油的形式获得标题化合物，Rf：0.30 (溶 剂如实施例3a)。 实施例19：N4，N9-双[(2-羟基)-正十六烷基]-精胺四草酸盐

将3.53克(0.004摩尔)N1，N12-二BOC-N4，N9-双[(2-羟基)-正十 六烷基]-精胺，3.04克(0.016摩尔)甲苯-4-磺酸一水合物和20毫升水的混 合物在70℃下搅拌19小时，随后通过真空蒸发浓缩，然后将残余物在2N 氢氧化钠溶液和氯仿之间分配。将有机相用浓氯化钠溶液洗涤后，用硫酸 钠干燥然后通过真空蒸发浓缩，得到粗的N4，N9-双[(2-羟基)-正十六烷 基]-精胺，将其溶于32毫升乙醇，并在搅拌下与2.0克(0.016摩尔)草酸二 水合物的32毫升乙醇溶液混合，由此使标题化合物以晶体形式沉淀出来。 将晶体用乙醇洗涤并在高真空下干燥，其在140℃熔化分解。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N12 -二BOC-N4 ，N9 -双[(2-羟基)-正十六烷基]-精胺

将2.02克(0.005摩尔)N1，N12-二BOC-精胺和4.24克(0.015摩尔)1，2 -十六碳烯氧化物(85％)按照类似于实施例15a的方法反应(反应持续时 间：8小时)。用乙酸乙酯/己烷混合物(1∶3或1∶2或1∶1)，用乙酸乙酯 和用乙酸乙酯/甲醇混合物(19∶1)在硅胶上通过快速层析纯化，得到以油 形式存在的标题化合物，Rf：0.31(溶剂如实施例3a)。 实施例20：N4-[(2-羟基)-正十六烷基]-精胺-四(甲苯-4-磺酸盐)

将5.94克(0.008摩尔)N1，N9，N12-三BOC-N4-[(2-羟基)-正十六烷 基]-精胺，6.09克(0.032摩尔)甲苯-4-磺酸一水合物和35毫升水的混合物 按照类似于实施例5的方法反应(反应持续时间：2.5小时)。在Amberlite XAD 1180吸附剂树脂上使用水和水/异丙醇混合物(9∶1或4∶1或3∶2) 提纯后，得到水含量2.24％的冷冻干燥物形式的标题化合物，

Rf：0.07(溶剂如实施例1)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N9 ，N12 -三BOC-N4 -[(2-羟基)-正十六烷基]-精胺N4-[(2- 羟基-正癸基)-精胺四草酸盐

将5.02克(0.01摩尔)N1，N9，N12-三BOC-精胺和4.24克(0.015摩 尔)1，2-十六碳烯氧化物(85％)按照类似于实施例15a的方法反应(反应持 续时间：10.5小时)。使用乙酸乙酯/己烷混合物(1∶3或1∶1)和使用乙酸 乙酯在硅胶上通过快速层析纯化，以油的形式获得标题化合物，Rf：0.52(溶 剂如实施例3a)。

将4.05克(0.00615摩尔)N1，N9，N12-三BOC-N4-[(2-羟基)-正癸基]- 精胺，3.1克(0.0246摩尔)草酸二水合物，8毫升乙醇和8毫升水的混合物 按照类似于实施例15的方法反应(反应持续时间：12.5小时)。从乙醇/乙醚 中结晶后，得到在135-155℃分解的标题化合物。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N9 ，N12 -三BOC-N4 -[(2-羟基)-正癸基]-精胺

将4.02克(0.008摩尔)N1，N9，N12-三BOC-精胺，1.875克(0.012 摩尔)1，2-癸烯氧化物和40毫升乙醇的混合物在80℃下搅拌20小时，随后 通过真空蒸发浓缩。使用二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇混合物(50∶1或19∶1 或9∶1)将残余物在硅胶上通过快速层析纯化后，以油的形式得到标题化 合物，Rf：0.40(溶剂如实施例3a)。 实施例22：N4-[(R)-(2-羟基)-正十六烷基]-精胺四草酸盐

将5.6克(0.00754摩尔)N1，N9，N12-三BOC-N4-[(R)-(2-羟基)- 正十六烷基]-精胺，3.8克(0.03016摩尔)草酸二水合物和50毫升水的混合 物按照类似于实施例13的方法反应(反应持续时间：18小时)。得到的标题 化合物在200-205℃分解，[α]D20＝-7.4±1.7°(c＝0.5％，在H2O中)。

如下制造原料化合物：

a)N1，N9，N12-三BOC-N4-[R-(2-羟基)-正十六烷基]-精胺

将7.04克(0.014摩尔)N1，N9，N12-三BOC-精胺，4.06克(0.0169摩 尔)(R)-1，2-十六碳烯氧化物(Nippon Mining Company，Ltd.)和30毫升 乙醇的混合物在80℃下搅拌15小时，随后通过真空蒸发浓缩。使用二氯 甲烷和二氯甲烷/甲醇混合物(19∶1)将残余物在硅胶上通过快速层析纯化 后，以油的形式得到标题化合物，Rf：0.52(溶剂如实施例3a)。 实施例23：N4-(2-羟乙基)-亚精胺三草酸盐

将2.73克(0.007摩尔)N1，N8-二BOC-N4-(2-羟乙基)-亚精胺，2.65 克(0.021摩尔)草酸二水合物，10毫升乙醇和30毫升水的混合物在90℃下 搅拌4.5小时。将仍然温热的反应混合物与乙醇混合(直到轻微的混浊出 现)，然后将其冷却到0℃，由此得到结晶形态的标题化合物，熔点153-156 ℃(分解)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N8 -二BOC-N4 -(2-羟乙基)-亚精胺

按照类似于实施例14a的方法，在将粗产品在硅胶上使用二氯甲烷/甲 醇混合物(19∶1或9∶1或4∶1)纯化之后，由6.91克(0.02摩尔)N1，N8- 二BOC-亚精胺和3.2克(0.0726摩尔)环氧乙烷，得到以油的形式存在的 标题化合物。Rf：0.76(溶剂如实施例1a)。 实施例24：N4-[(2-羟基)-正十六烷基]-亚精胺-三(甲苯-4-磺酸盐)

将6.21克(0.0106摩尔)N1，N8-二BOC-N4-[(2-羟乙基)-正十六烷 基]-亚精胺，6.05克(0.0318摩尔)甲苯-4-磺酸一水合物，和30毫升水的 混合物在75℃下搅拌2小时。将反应混合物在Amberlite XAD 1180吸收 剂树脂上通过层析[洗脱液：水和水/异丙醇(4∶1或3∶2)]纯化后，随后 冷冻干燥含有产物的组分，得到以冷冻干燥物形式存在的水含量2.2％的标 题化合物，Rf：0.26(溶剂如实施例1)。

如下制造原料化合物：

a)N1，N8-二BOC-N4-[(2-羟基)-正十六烷基]-亚精胺

将10.61克(0.0375摩尔)1，2-十六碳烯氧化物(85％)加入到8.64克 (0.025摩尔)N1，N8-二BOC-亚精胺的100毫升乙醇溶液中。将反应混合 物在回流下沸腾15小时，然后再加入1.7克(0.006摩尔)1，2-十六碳烯氧 化物，将混合物在回流下再沸腾7小时，然后通过真空蒸发浓缩。将粗产 品用乙酸乙酯/己烷混合物(1∶2或1∶1)和用乙酸乙酯在硅胶上通过快速 层析提纯。得到油形式的标题化合物，Rf：0.85(溶剂同实施例1a)。 实施例25：N4-[(2-羟基)-正十六烷基]-降亚精胺-三(甲苯-4-磺酸盐)

按照类似实施例24的方法，由5.72克(0.01摩尔)N1，N7-二BOC- N4-[(2-羟基)-正十六烷基]-降亚精胺和5.71克(0.03摩尔)甲苯-4-磺酸 一水合物得到以冷冻干燥物形式的水含量1.4％的标题化合物。Rf：0.24 (洗脱液如实施例1)。

如下制造原料化合物：

a)N1，N7-二BOC-N4-[(2-羟基)-正十六烷基]-降亚精胺

将6.56克(0.0232摩尔)1，2-十六碳烯氧化物(85％)加入到6.4克 (0.0193摩尔)N1，N7-二BOC-降亚精胺(Hansen等人，Synthesis 1982：404) 的75毫升乙醇溶液中，将反应混合物在回流下沸腾17.5小时。再加入2.55 克(0.009摩尔)1，2-十六碳烯氧化物(85％)后，将反应混合物再次回流下沸 腾22小时，而后按照类似于实施例24a的方法操作。得到油形式的标题化 合物，Rf：0.79(溶剂同实施例1a)。 实施例26：N4-[(2-羟基)-正癸基]-降亚精胺三草酸盐

按照类似实施例13的方法，由3.2克(0.00656摩尔)N1，N7-二BOC- N4-[(2-羟基)-正癸基]-降亚精胺，2.48克(0.0197摩尔)草酸二水合物和 25毫升水得到标题化合物。熔点174-179℃(分解.)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N7 -二BOC-N4 -[[(2-羟基)-正癸基]-降亚精胺

按照类似于实施例22a的方法，由2.49克(0.0075摩尔)N1，N7-二BOC -降亚精胺，1.47克(0.0094摩尔)1，2-癸烯氧化物和25毫升乙醇得到油形 式的标题化合物。在短时间后该化合物固化为结晶形态，熔点52-54℃。 实施例27：N4-[(2-羟基)-正癸基]-亚精胺-三草酸盐

将3.19克(0.00636摩尔)N1，N8-二BOC-N4-[(2-羟基)-正癸基]- 亚精胺，2.405克(0.01908摩尔)草酸二水合物和25毫升水的混合物在回流 下沸腾15小时，随后通过真空蒸发浓缩。将残余物从丙酮中重结晶之后， 得到水含量1.9％的标题化合物。熔点170-173℃(分解)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N8 -二BOC-N4 -[(2-羟基)-正癸基]-亚精胺

按照类似于实施例22a的方法，由2.59克(0.0075摩尔)N1，N8-二BOC -亚精胺，1.47克(0.0094摩尔)1，2-癸烯氧化物和25毫升乙醇得到油形式 的标题化合物。Rf：0.50(溶剂如实施例3a)。 实施例28：N4，N9-双[(S)-(2-羟基)-正癸基]-精胺四草酸盐

将2.72克(0.0038摩尔)N1，N12-二BOC-N4，N9-双[(S)-(2-羟基)- 正癸基]-精胺，1.916克(0.0152摩尔)草酸二水合物和30毫升水的混合物 在回流下沸腾15小时。将丙酮加入到还是热的反应混合物中(直到轻微的 混浊出现)，然后将混合物慢慢地冷却到0℃，由此沉淀出结晶形态的标题 化合物。过滤后，用丙酮洗涤结晶，然后在高真空下干燥，得到标题化合 物，熔点175-177℃(分解)，[α]D20＝+13.1°±0.7°(c＝1.47％，H2O)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N12 -二BOC-N4 ，N9 -双[(S)-(2-羟基)-正癸基]-精胺

将2.013克(0.005摩尔)N1，N12-二BOC-精胺，2.34克(0.015摩尔)(S) -1，2-癸烯氧化物和20毫升乙醇的混合物在回流下沸腾15小时，随后通过 真空蒸发浓缩。使用二氯甲烷/甲醇混合物(99∶1或49∶1或19∶1或9∶ 1)将残余物在硅胶上通过快速层析纯化后，以油的形式得到标题化合物，

Rf：0.25(溶剂如实施例3a)，[α]D20＝+52.84°(c＝1.552％，己烷)。 实施例29：N4，N9-双[(R)-(2-羟基)-正癸基]-精胺四草酸盐

按照类似于实施例28的方法，由2.72克(0.0038摩尔)N1，N12-二BOC -N4，N9-双[(R)-(2-羟基)-正癸基]-精胺和1.916克(0.0152摩尔)草酸二 水合物得到标题化合物。熔点175-177℃(分解)，[α]D20＝-14.1°±0.7° (c＝1.43％，H2O)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N12 -二BOC-N4 ，N9 -双[(R)-(2-羟基)正癸基]-精胺

按照类似于实施例28a的方法，由2.013克(0.005摩尔)N1，N12-二BOC -精胺和2.34克(0.015摩尔)(R)-1，2-癸烯氧化物得到油形式的标题化合 物，Rf：0.25(溶剂如实施例3a)，[α]D20＝-52.84°(c＝1.268％，己烷)。 实施例30：N1，N8-双(3-氨基丙基)-N1-[(2-羟基)-正十六烷基]-1，8- 二氨基-辛烷四草酸盐

按照类似于实施例13的方法，但反应时间为20小时，由2.84克 (0.00355摩尔)N1，N8-双[3-BOC-氨基丙基]-N1-BOC-N8-[(2-羟基) -正十六烷基]-1，8-二氨基-辛烷，1.79克(0.0142摩尔)草酸二水合物和30 毫升水，得到标题化合物。熔点165-170℃(分解)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N8 -双(3-BOC-氨基丙基)-N1 -BOC-N8 -[(2-羟基)-正十六 烷基]-1，8-二氨基-辛烷

将4.8克(0.00859摩尔)N1，N8-双(3-BOC-氨基丙基)-N1-BOC-1， 8-二氨基-辛烷和2.91克(0.0103摩尔)1，2-十六碳烯氧化物(85％)在30毫 升乙醇中按照类似于实施例21a的方法反应(反应持续时间16小时)。使 用二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇混合物(20∶1)在硅胶上通过快速层析纯化 后，以油的形式得到标题化合物，Rf：0.60(溶剂如实施例3a)。

b) N1 ，N8 -双(3-BOC-氨基丙基)-N1 -BOC-1，8-二氨基-辛烷和N1 ， N8 -双(3-BOC-氨基丙基)-1，8-二氨基-辛烷

在氮气下，在1.5小时过程内将36.94克(0.15摩尔)2-(BOC-氧亚氨 基)-2-苯基乙腈的120毫升THF溶液在搅拌下滴加入冷却到0-5℃的 15.51克(0.06摩尔)N1，N8-双(3-氨基丙基)-1，8-二氨基-辛烷[见 Pestic.Sci.，485-490(1973)]的100毫升的THF溶液中。将反应混合物在室 温下再搅拌16小时，而后通过真空蒸发浓缩，将残余物用二氯甲烷/甲醇混 合物(100∶1或50∶1或20∶1或10∶1)和二氯甲烷/甲醇/30％氨水溶液 (90∶10∶0.5或90∶15∶0.5或40∶10∶1)的混合物在硅胶上通过快速层 析分离。由此得到下面的化合物：第一个标题化合物，N1，N8-双(3-BOC -氨基丙基)-N1-BOC-1，8-二氨基-辛烷，以油的形式，Rf：0.81(溶剂如 实施例1a)；以及第二个化合物，N1，N8-双(3-BOC-氨基丙基)-1，8-二氨 基-辛烷，熔点：67-70℃，Rf：0.26(溶剂如实施例1a)。 实施例31：N1，N8-双(3-氨基丙基)-N1-[(R)-(2-羟基)-正十六烷基]- 1，8-二氨基-辛烷四草酸盐

按照类似于实施例13的方法，但维持反应21小时，由3.71克(0.00464 摩尔)N1，N8-双(3-BOC-氨基丙基)-N1-BOC-N8-[(R)-(2-羟基) -正十六烷基]-1，8-二氨基-辛烷，2.34克(0.01856摩尔)草酸二水合物和 35毫升水，得到标题化合物。熔点165-170℃(分解)，[α]D20＝-7.2°±1.6 °(c＝0.5％，H2O)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N8 -双( 3-BOC-氨基丙基)-N1 -BOC-N8 -[(R)-(2-羟基)- 正十六烷基]-1，8-二氨基-辛烷

由5克(0.00895摩尔)N1，N8-双[3-BOC-氨基丙基]-N1-BOC-1，8- 二氨基-辛烷(实施例30b)，2.58克(0.01073摩尔)(R)-1，2-十六碳烯氧化 物和30毫升乙醇，按照类似于实施例30a的方法得到油形式的标题化合物。 Rf：0.60(溶剂如实施例3a)。 实施例32：N1，N12-双(3-氨基丙基)-N1，N12-双([2-羟基)-正十六烷基]- 1，12-二氨基-十二烷四草酸盐

按照类似于实施例13的方法，但维持反应40小时，由1.3克(0.001305 摩尔)N1，N12-双(3-BOC-氨基丙基)-N1，N12-双[(2-羟基)-正十六 烷基]-1，12-二氨基-十二烷，0.66克(0.00523摩尔)草酸二水合物和20毫 升水，得到标题化合物。熔点115-118℃。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N12 -双(3-BOC-氨基丙基)-N1 ，N12 -双[(2-羟基)-正十六烷基] -1，12-二氨基-十二烷

将1.1g(0.002137摩尔)N1，N12-双(3-BOC-氨基丙基)-1，12-二氨 基-十二烷和1.45克(0.00513摩尔)1，2-十六碳烯氧化物(85％)在25毫升 乙醇中按照类似于实施例15a的方法反应(反应持续时间：18小时)。使 用二氯甲烷/甲醇混合物(50∶1或25∶1或10∶1)在硅胶上通过快速层析 纯化，以油的形式获得标题化合物，Rf：0.91(溶剂如实施例1a)。

b)  N1 ，N12 -双(3-BOC-氨基丙基)-N1 -BOC-1，12-二氨基-十二烷 和N1 ，N12 -双(3-BOC-氨基丙基)-1，12-二氨基-十二烷

在室温和氮气下搅拌下将36.1毫升(0.195摩尔)5.4摩尔甲醇钠的甲醇 溶液加入到23.9克(0.0519摩尔)1，12-双(3-氨基丙基)-1，12-二氨基-十二 烷-四盐酸盐[J.Med.Chem.7，710(1964)]的130毫升THF悬浮液中。搅 拌20分钟后，将反应混合物冷却到0℃，然后用1小时的时间，与38.39 克(0.1559摩尔)2-(BOC-氧亚氨基)-2-苯基乙腈的130毫升THF溶液混 合。在室温下继续搅拌15小时，过滤溶液并通过真空蒸发浓缩滤液。将残 余物用二氯甲烷/甲醇的混合物(50∶1或25∶1或16∶1或10∶1)和二氯 甲烷/甲醇/30％氨水溶液(90∶10∶0.5或90∶15∶0.5或40∶10∶1)的混 合物在硅胶上通过快速层析分离。由此得到下面的化合物：第一个标题化 合物，N1，N12-双(3-BOC-氨基丙基)-N1-BOC-1，12-二氨基-十二烷， 以油的形式，Rf：0.85(溶剂如实施例1a)；以及第二个标题化合物N1，N12- 双(3-BOC-氨基丙基)-1，12-二氨基-十二烷，熔点：77-80℃，Rf：0.48(溶 剂如实施例1a)。 实施例33：N1，N4-双(3-氨基丙基)-N1，N4-双[(2-羟基)-正癸基]-1，4- 二氨基-反式-2-丁烯-三草酸盐

将1.65克(0.002314摩尔)N1，N4-双(3-BOC-氨基丙基)-N1，N4-双 [(2-羟基)-正癸基]-1，4-二氨基-反式-2-丁烯，0.875克(0.00694摩尔)草酸 二水合物和15毫升水的混合物在回流下沸腾16小时，随后通过真空蒸发 浓缩。从甲醇中将残余物结晶之后，得到水含量3.5％的标题化合物，熔点163 -165℃(分解)。

如下制造原料化合物：

a) N1 ，N4 -双(3-BOC-氨基丙基)-N1 ，N4 -双[(2-羟基)-正癸基]-1，4- 二氨基-反式-2-丁烯

按照类似于实施例11a的方法，用二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇混合物 (19∶1)进行快速层析，由2克(0.005摩尔)N1，N4-双(3-BOC-氨基丙基)- 1，4-二氨基-反式-2-丁烯(实施例11b)，2.34克(0.015摩尔)1，2-癸烯氧化物 和20毫升乙醇(时间的反应：15小时)，得到油形式的标题化合物。Rf：0.49 (溶剂如实施例3a)。 实施例34：N1，N12-双(3-氨基丙基)-N1，N12-双[(2-羟基)-正十四烷基]- 1，12-二氨基-十二烷四草酸盐

将0.45克(0.00357摩尔)草酸二水合物的20毫升乙腈溶液在搅拌下加 入到0.66克(0.000893摩尔)N1，N12-双(3-氨基丙基)-N1，N12-双[(2-羟基) -正十四烷基]-1，12-二氨基-十二烷的20毫升甲醇溶液中。将混合物冷却 到0℃，过滤，用乙腈洗涤残余物然后在高真空下干燥。由此得到标题化 合物，熔点87-89℃。

如下制造原料化合物：

a)N1，N12-双(3-氨基丙基)-N1，N12-双[(2-羟基)-正十四烷基]-1，12- 二氨基-十二烷

将0.81克(0.0011摩尔)N1，N12-双(2-氰乙基)-N1，N12-双[(2-羟基)- 正十四烷基]-1，12-二氨基-十二烷溶于10毫升11％氨的乙醇溶液，与0.4 克阮内镍混合并氢化，直到氢气的吸收结束。过滤后，通过真空蒸发浓缩 滤液，然后将残余物用二氯甲烷/甲醇混合物(40∶1或10∶1)和二氯甲烷/ 甲醇/30％氨水溶液(90∶10∶0.5或40∶10∶1.5)的混合物在硅胶上通过 快速层析纯化，得到油形式的标题化合物，Rf：0.34(溶剂同实施例1a)， 该化合物逐渐固化为结晶形态。

b) N1 ，N12 -双(2-氰乙基)-N1 ，N12 -双[(2-羟基)-正十四烷基]-1，12- 二氨基-十二烷

将11.99克(0.048摩尔)1，2-十四烯氧化物(85％)加入到6.13克(0.02 摩尔)N1，N12-双(2-氰乙基)-1，12-二氨基-十二烷[J.Med.Chem.7，710 (1964)]的60毫升乙醇溶液中。将反应混合物在回流下加热40小时，再加 入2.54克(0.01016摩尔)十四烯氧化物(85％)，将反应混合物在回流下再沸 腾6小时，然后通过真空蒸发浓缩。将粗产品用二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇 混合物(40∶1或20∶1)在硅胶上通过快速层析提纯。将含有产物的组分通 过真空蒸发浓缩后，从乙腈中将残余物结晶，得到标题化合物，熔点37-38 ℃。 实施例35：带有取代的氨基乙醇的质粒核酸核心复合物的制备和它们的 生物活性。

可以用有或者没有长链烃(脂肪族)取代基的取代的氨基乙醇进行核酸 核心复合物的制备。

将缺乏长链烃(脂肪族)取代基的取代的氨基乙醇用于把质粒DNA压缩 在水中的胶态分散体中。对于加入的阳离子(胺)与阴离子(DNA磷酸盐)的 不同电荷比，测定所制备的胶态分散体的尺寸和ζ电位，且它们在表1和 图4中显示。制备的胶态分散体可使DNA压缩在适合于本发明的核心复 合物中。

我们还用带有长链烃(脂肪族)取代基的取代的氨基乙醇将质粒DNA压 缩在水中的胶态分散体中。在一些情况下，在细胞培养中或当给动物用药 后，单独这些核心复合物就足以进行基因递送。该作用在以下的结果中举 例说明(表2和3)。

表1.取代的氨基-乙醇-DNA复合物的粒径和ζ电位 带有长链烃(脂肪族)取代基的取代的氨基乙醇的基因送递能力通过培 养细胞的转染而后通过静脉注射在体内加以研究(表2和3)。取代的氨基乙 醇具有两个与一个疏水体相连的亲水极性头，取名为双头脂。推荐使用双 头脂构成单层膜。

取代的氨基乙醇(阳离子化合物)是按照实施例1-34中所描述的方法 制备的。它们的基因送递能力用标准方法通过静脉注射在体内研究(表1和 2)。将制剂通过尾部静脉注射给小鼠，然后在5小时后测定基因表达。雌 性CD-1小鼠，13-15克，由Charles River公司购买。将四十微克的 pCILuc与GC脂或GC脂∶Chol分散体按指出的重量比复合。5小时后 处死小鼠，收集器官。将器官在0.5毫升裂解缓冲液中匀浆，然后将20μl 上清液用于萤光素酶测定。萤光素酶活性以四只小鼠的相对光单位(RLU) 的平均数表示。脂即可以单独使用，也可以与胆固醇组合，并与萤光素酶 报道基因质粒通过标准程序在重量和电荷比的范围内复合。对于在体内的 筛选，将40μg pCILuc与制剂复合并注射到小鼠中。

还进行了结构和基因送递功能的关系的研究。我们发现脂肪酸链的数 量和长度影响它们的基因送递能力。如果脂仅仅具有一个链，无论酸链的 长度如何都观测不到转染活性。如果两个链的长度短于C14，也观测不到 转染活性。如果脂具有一个短链(＜C14)和一个长链(＞C14)，它不能递送 基因。然而，带有较长的链如C14和C16的脂显示体外以及体内转染活性。 体外转染活性甚至比可商购脂制剂例如Lipofectamine 7的更高。

当在两个亲水极性头中的铵基之间的碳链长度由C4提高到C12，脂在 水中的构象可以从典型的带有单头的脂变为在分子的两个末端带有两个头 的形式。相应地，这些脂在此是指双头脂，且这示于图3中。

取代的氨基乙醇CGP44015和CGP47204(其化学结构示于图3.4)， 分散在水中形成直径约10-20nm的非常小同质微团。它们与质粒DNA 结合，形成具有依赖于阳离子化合物与DNA电荷比的粒径的核心复合物。 在此方面它们是与核酸形成小的，相对同质和稳定的复合物的取代的氨基 乙醇类化合物的代表，如图4中用不同的化合物作的举例说明。当电荷比 大于1时，颗粒是同质的，直径小于100纳米。它们的转染活性随着电荷 比提高而提高，直到电荷比达到4。体外最佳的电荷比是4。转染活性随电 荷比的进一步增加而减少。体内转染活性和电荷比的关系与体外的相似， 但最佳的电荷比是4-10(表1和2)。总的说来，具有相同带电荷的头基团 的化合物显示良好地与质粒DNA的复合和体外以及体内基因送递。

这里检验的取代的氨基乙醇表现出具有两个通过一个疏水体(图3)相 连的亲水的极性头，被称为双头脂。因为各在一边的两个亲水的头可以面 对水溶液，这些化合物可以在水中形成一单层而非由具有单头基团的脂形 成的双层(图3.1)。

这些结果显示良好的基因转移能力。在优选的脂中，CGP44015A和 CGP47204A形成显示出体内表达的核心复合物。CGP44015和CGP47204 在两头具有相同的正电荷。双头脂不但在体外而且在体内都显示出具有高 的基因转移能力。 表2 表3

表3续     RLU/20ul裂解物 化合物编号     CR     脾     肝     肾     心     肺 CGP047204A     0.5     80     45     39     38     44     1     467     53     38     41     51     4     5,594     4,583     386     129     5,009     10     6,378     3,270     156     983     38,115     20     779     429     113     96     3,258  CGP044015A     0.5     80     86     72     74     82     1     168     219     71     73     95     4     4,778     3,817     528     379     19,717     10     4,108     1,283     281     103     4,470     20     69     243     70     75     84  DOTAP/chol     4     239     144     104     468     63,609 实施例36：带有阳离子脂的质粒核酸核心复合物的制备

阳离子脂GC-001，GC-003，GC-016，GC-021，GC-025，GC-026， GC-029，GC-030，GC-033，GC-034，GC-035，GC-38，GC-039，and GC-071 是从Promega Biosciences，San Luis Obispo，CA[原来为JBL Scientific， Inc/Genta]购买的。其它材料和方法按照实施例35中所描述的进行。在表 3中概括了在所选的器官中的萤光素酶表达的测定值。

对所有化合物进行体内活性的评价。检验了两个关键因素，有或者没 有胆固醇的制剂和阳离子脂与DNA的比值。在脂∶胆固醇的摩尔比1∶1 下检验胆固醇。用与阳离子脂或脂∶胆固醇(1∶1摩尔比)复合的pCILuc， 在40μg的剂量下对CD-1小鼠静脉内注射以进行这些研究，而后在5小 时以后测定不同的器官中的萤光素酶活性。第一个评价包括重量比为2和 10(GC脂与DNA的比)的全部14个GC脂。通过四个单独的实验进行。 每次用阳离子脂质体DOTAP∶Chol作为标准对照。结果见表4。许多GC 脂制剂显示出在脾和肝中有大于2000 RLU/20μl裂解物的萤光素酶活 性。

用脂GC-030，GC-034和GC-029在比第一个实验宽的重量比下重 复测定。转染方法与获得表3中所示结果的方法相同。萤光素酶活性以四 只小鼠的相对光单位(RLU)的平均数表示。WR是指GC脂与DNA的重 量比。结果见表5。转染活性由萤光素酶活性RLU/器官代表。GC-030 在重量比20下显示出高的转染活性。转染活性随重量比(GC脂与DNA) 的增加而增加。包含胆固醇可以改变基因表达在所检验的不同器官中的生 物分布。例如，GC-030单独可在脾中产生高的萤光素酶活性，而GC- 030∶胆固醇可在肺中产生高的萤光素酶活性。然而对于GC-034没有看 到胆固醇的这种功能。GC-030在重量比为20时在脾中显示出高的萤光素 酶活性，事实上比DOTAP∶胆固醇标准物的高36倍。同样地，GC-030∶ 胆固醇在肺中显示出高的萤光素酶活性，比DOTAP∶胆固醇的高约5倍。 这些结果表明GC脂形成了对于基因送递载体良好的核心复合物。

表4.小鼠中通过静脉内注射对GC脂的评价

                            RLU/20μl裂解物

          WR      脾    肝    肾    心    肺 GC-001         2      38    35    39    36    51 GC-001         10     329   38    36    39    101 GC-001/chol    2      46    39    33    36    57 GC-001/chol    10     40    34    34    34    40 GC-003         2      36    33    38    37    37 GC-003         10     65    73    40    39    69 GC-003/chol    2      323   39    36    34    90 GC-003/chol    10     46    37    34    40    54 GC-021         2      43    36    34    34    54 GC-021         10     37    32    35    39    40 GC-021/chol    2      78    81    46    44    64 GC-021/chol    10     62    60    57    58    120 DOTAP/chol     8.5    2,756 2,721 360   2,134 150,682

                            RLU/20ul裂解物

          WR      脾    肝    肾    心    肺 GC-016         2      40    38    41    44    45 GC-016         10     230   95    40    40    67 GC-016/chol    2      38    39    40    45    44 GC-016/chol    10     111   1,007 52    43    449 GC-026         2      40    39    41    42    40 GC-026         10     0     0     0     0     0 GC-026/chol    2      47    46    50    54    49 GC-026/chol    10     57    52    88    1,315 50 GC-030         2      3,692 70    51    48    88 GC-030         10     5,305 1,093 105   67    1,396 GC-030/chol    2      61    51    51    47    48 GC-030/chol    10     1,330 3,065 246   60    574 GC-039         2      288   48    45    50    52 GC-039         10     845   212   54    45    753 GC-039/chol    2      49    47    48    46    49 GC-039/chol    10     84    376   4,503 78    173 DOTAP/chol     8.5    549   153   93    9,725 8,163

表4续

                              RLU/20ul裂解物

          WR     脾      肝      肾     心    肺 GC-025         2     46      38      25     33    40 GC-025         10    32      27      28     27    30 GC-025/chol    2     26      26      28     27    26 GC-025/chol    10    65      66      26     28    33 GC-033         2     27      29      27     31    36 GC-033         10    50      46      41     40    42 GC-033/chol    2     45      46      49     46    45 GC-033/chol    10    50      86      47     46    47 GC-035         2     70      57      46     54    57 GC-035         10    54      50      54     51    54 GC-035/chol    2     82      72      47     52    51 GC-035/chol    10    91      84      46     43    329 DOTAP/chol     8.5   1011    331     78     1412  45457

                              RLU/20ul裂解物

          WR     脾      肝      肾     心    肺 GC-029         2     31      31      34     42    41 GC-029         10    196     65      42     34    72 GC-029/chol    2     31      29      31     39    34 GC-029/chol    10    1,512   104     33     33    53 GC-034         2     7,769   480     36     45    137 GC-034         10    2,386   597     53     103   90 GC-034/chol    2     63      80      59     62    63 GC-034/chol    10    1,645   1,597   58     70    267 GC-038         2     61      59      60     101   142 GC-038         10    160     93      58     57    63 GC-038/chol    2     56      55      75     69    268 GC-038/chol    10    783     132     130    140   1,210 GC-071         2     61      59      58     60    56 GC-071         10    286     531     67     61    73 GC-071/chol    2     95      60      59     60    63 GC-071/chol    10    263     476     64     60    187 DOTAP/chol     8.5   909     1,084   281    603   101,852

表5.小鼠中评价所选的GC脂 脂质体        WR     脾      肝      肾     心    肺 GC-030         1     23,308  3,642   1,392  1,675 3,308 GC-030         2     73,442  3,417   1,458  1,367 1,600 GC-030         6     38,058  1,550   792    817   8,808 GC-030         10    446,650 114,425 1,367  3,450 35,117 GC-030         20   2,479,217 1,003,125 17,583  4,783   689,475 GC-030/chol    2    202,158   5,283     1,167   1,058   3,983 GC-030/chol    10   593,158   141,383   5,808   7,058   1,965,650 GC-030/chol    15   581,875   452,575   10,892  54,642  4,353,292 GC-030/chol    20   820,250   894,608   38,233  428,575 17,411,233 GC-034         0.5  8,750     1,792     1,300   1,425   3,567 GC-034         1    10,458    2,758     1,283   1,333   4,492 GC-034         2    29,167    3,317     1,175   1,158   2,367 GC-034         6    449,583   10,533    1,567   1,467   6,233 GC-034         10   505,975   63,942    1,750   1,642   9,775 GC-034/chol    2    7,392     4,017     1,500   1,425   2,575 GC-034/chol    10   58,933    4,975     1,558   1,483   13,592 GC-034/chol    15   39,208    4,775     1,383   1,450   5,958 GC-034/chol    20   37,542    7,475     1,492   1,317   9,892 DOTAP/chol     8.5  68,908    68,025    9,000   53,342  3,767,050 脂质体        WR    脾        肝        肾      心      肺 GC-029         2    908       825       1,000   933     967 GC-029         10   1,992     1,408     808     858     1,017 GC-029/chol    2    842       817       842     908     875 GC-029/chol    6    942       942       908     950     1,125 GC-029/chol    10   867       958       933     950     3,308 GC-029/chol    18   4,250     3,875     950     858     2,392 DOTAP/chol     8.5  9,267     11,350    3,650   8,042   1,114,275 实施例37：线形PEI的制备

由聚乙基噁唑啉聚合物(PEOZ)通过酸水解为聚胺制备分子量22kDa 的线形PEI。通过用甲苯磺酸甲基酯和500当量的2-乙基-2-噁唑啉按照 该基本上与先前报道的方法相同的方法聚合制备PEOZ，所述方法见 Zalipsky等人J.Pharm.Sci.；85：133-137(1996)。有必要使用2-乙基2-噁 唑啉代替2-甲基-2-噁唑啉，因为后者以分子量16,200在乙腈中沉淀。 而且需要较长的反应时间。

分子量49,500kDa的聚(2-乙基-2-噁唑啉)的制备

在螺旋帽管中进行聚合反应，所用的管在使用之前在真空下加热干燥。 向管中装上刚对KOH蒸馏过的5.05毫升2-乙基-2-噁唑啉和5毫升无水 乙腈。将491毫克刚蒸馏过的甲苯磺酸甲基酯溶于10.55ml无水乙腈，然 后将0.4毫升此溶液转入含有该单体的管中。转移后将管用氩气吹扫，密 封并在油浴中在80℃下搅拌112小时。冷却到室温后，将2毫升 KOH(0.5M)的甲醇溶液加入到聚合混合物中，而后在25℃下搅拌5小时。 加入0.2毫升冰醋酸，然后将混合物浓缩为固体，将其在50毫升水中再溶 解，然后放入截断值3500分子量的Spectral/Por透析膜中(Spectrum，Los Angeles，CA)。用50mM NaCl(1×4L)和水(3×4L)透析。将透析袋的内 容物冷冻干燥，再在真空下干燥，得到4.51g白色固体(91％)。质谱分析 (MALDI-TOF)显示在m/z45,000-65,000处的峰簇，并集中在m/z52, 395(预期m/z49,500)。

1H NMR(400MHz CDCl3)δ1.11-1.12(m，CH3CH2C＝O)， 2.31-2.41(m，CH3CH2C＝O)，3.46(m，CH2N)

13C NMR(100MHz CDCl3)δ9.2(bs，CH3CH2C＝O)，25.82(s， CH3CH2C＝O)，43.54-47.27(m，CH2N)，173.79-174.40(m，C＝O)

分子量22kDa的线形聚乙烯亚胺的制备

在螺旋帽管中进行酸水解。向管中装上0.1克MW 49,500kDa的聚(2 -乙基-2-噁唑啉)和10毫升3.3M HCl水溶液。将溶液脱气，用氩气吹扫， 密封并在油浴中在100℃下搅拌65小时。较高酸浓度会导致在100℃的水 解期间产生沉淀。冷却后将混合物浓缩成固体，在水中再溶解并再次浓缩 成固体。在1毫升水中再溶解，然后加入2.5M NaOH水溶液调节pH值 至12-13。将线形的聚乙烯亚胺的沉淀通过离心收集，再用水(2×1ml)洗 涤，得到43毫克白色固体(100％)。1H NMR(360MHz，CD3OD)δ2.73(br， CH2N) 实施例38

将50μg/ml浓度鲑精DNA的液流和聚乙烯亚胺的液流加入HPLC 静态混合器中，静态混合器包括三个50μl串接的柱体。在制作每种颗粒 制剂中，以相同的流速将每个液流装入混合器中，且当得到的合并的DNA 和聚合物的液流流过柱体时也保持该流速。流速在250μl/分钟到5,000μ l/分钟之间。在所设定的流速下所制备的每种制剂的颗粒大小在以下的表6 中给出。

表6

                                      粒径     流速 (μl/分钟)    单众数    平均值   单众数   标准差 ％标准差     SDP    平均值     SDP   标准差  ％标准差     250     193.9     55.7     29    208.5    53.1     25     500     166     52.5     32    193.9    44.4     23     1,000     144.2     47.7     33    184.6    108.6     59     1,500     132.3     42     32    163.9    64.4     39     2,000     121.5     41.4     34    131.1    32.9     25     2,500     112.4     37.6     33    125.7    32.1     26     3,000     107.1     35     33    153.6    124.2     81     4,000     110.8     35.7     32    119.4    48     40     5,000     129.5     43.5     34    131.2    34.4     26 实施例39

除了将DNA和聚乙烯亚胺的液流装入到含有三个150μl串接的柱体 的HPLC混合器中，且流速在500μl/分钟到7,000μl/分钟变化外，重复 实施例38的程序。在所设定的流速下所制备的每种制剂的颗粒大小在以下 的表7中给出。

                                            表7

                                            粒径     流速   (μl/min.)    单众数    平均值    单众数    标准差   ％标准差      SDP     平均值     SDP    标准差  ％标准差     500     200.6     59.6     30     218.9     57.8     26     1,000     165.4     45.2     27     181     42.3     23     1,500     146.2     40.4     28     165.5     53.4     32     2,000     134.7     41.2     31     135.9     40     29     2,500     131.4     43     33     138.2     33.8     24     3,000     130.6     41.4     32     136.4     45.7     34     5,000     126.4     42.2     33     138.3     38.3     28     6,000     134     41.7     31     173.2     67.4     39     7,000     140.9     43.4     31     141.2     31.5     22 实施例38和39的结果表明粒径可以通过改变混合柱体的尺寸和通过改变 流速加以调节。由此人们可以选择能提供颗粒所需大小和均一性的条件。 实施例40

除了在DNA和聚合物混合后将不同浓度氯化钠加入到DNA和聚合物 中外，重复实施例38的程序。在所给定的盐浓度下所制备的每种制剂的平 均颗粒大小在以下的表8中给出。

                                         表8

                                          粒径    NaCl    浓度    (mM)     单众数     平均值    单众数    标准差   ％标准差      SDP     平均值     SDP   标准差  ％标准差     0     108.3     27     25     129.2     71.1     55     5     202.8     46.4     23     213.5     44.1     21     20     200.4     32.8     16     206.6     16.2     8     100     372.9     85.9     23     360.1     28.3     8

以上结果表明粒径可以用加入盐控制，而且这些颗粒保持大小一致。 实施例41

除了DNA浓度为100μg/ml，且流速在500μl/分钟到4,000μl/分钟 之间变化外，重复实施例38的方法。在所设定的流速下所制备的每种制剂 的颗粒大小在以下的表9中给出。

                                       表9

                                       粒径    流速 (μl/min.)    单众数    平均值    单众数    标准差  ％标准差     SDP   平均值     SDP   标准差  ％标准差     500     215.2     14.9     7     213     20     9     1,000     191.8     38.8     20     196.4     25.7     13     1,500     199     47.8     24     198.6     23     12     2,000     163.6     12.6     8     163.9     17.2     10     2,500     172     29     17     174.4     27.1     16     3,000     192.7     20.5     11     198     23.6     12     4,000     166.7     14.7     9     162.7     14.9     9

当将以上结果与实施例38的相比较时，表明粒径可以通过改变DNA 的浓度而改变。 实施例42

重复实施例38的程序，不同的是：混合器含有一个250μl柱体，且 将Tween80去污剂以按体积0.25％的量在与聚乙烯亚胺液流混合之前加 入到DNA液流中，且对于DNA和Tween80液流流速在210μl/分钟到 8,400μl/分钟间变化。当将DNA和Tween80液流和聚合物液流最初注入 到混合器中时，DNA和Tween80液流的流速是聚合物液流的1.4倍。当将 DNA和Tween80及聚合物的合并液流通过柱体时，合并液流的流速是 DNA和Tween80液流和聚合物液流初始流速的平均值。例如，如果DNA 和Tween80液流具有初始流速4,900μl/分钟而聚合物液流具有流速3, 500μl/分钟，通过柱体的合并液流的流速是4,200μl/分钟。在所设定的 流速下所制备的每种制剂的颗粒大小在以下的表10中给出。

                                    表10

                                    粒径  流速* (μl/min.)  单众数  平均值  单众数  标准差   ％标准差   SDP 平均值    SDP   标准差 ％标准差  210  172  69.8      41  196.5   35.4    18  420  194.4  75.9      39  209   39.2    19  700  192.5  77.2      40  233.5   91.7    39  1,400  165.6  66.1      40  187.2   40.5    22  2,100  114.5  48.7      43  157   98.6    63  2,800  66.8  29.6      44  105.3   111.4    106  3,500  63.5  28.4      45  104.6   76    73  4,200  56.1  25.2      45  77.5   28.6    37  4,900  44.9  20.4      45  77.4   47.1    61  5,600  45  20.3      45  77.1   45.3    59  7,000  38.3  17.3      45  61.9   26.7    43  8,400  39.1  17.8      46  91.7   101.1    110

*DNA和Tween80液流的初始流速

以上制剂包括通常具有约10纳米到约20纳米尺寸的微团。微团的尺 寸以上面给出的测定的平均粒径计算。这些微团是从Tween80去污剂形成 的，可以在其使用或贮存之前通过超滤作用从制剂中除去。

由此，在另外的实验中，如在上文中描述制备的具有颗粒和微团的制 剂(其中DNA/Tween液流的初始流速为4,900μl/分钟，聚合物液流的 初始流速是3,500μl/分钟，且具有20.8μg/毫升的DNA浓度)，具有 下面的平均颗粒大小和粒径分布。

单众数平均值  -    42.6nm

单众数标准差  -    19.6

标准差％      -    46

SDP平均值     -    75.5

SDP标准差    -    32.6

标准差％     -    43

通过0.2μ滤器过滤制剂，而后通过带有同质异能结构的Amicon聚砜 (分子量500Kda)膜(Millipore公司，Bedford，MA)在300μl/分钟的流 速下超滤浓缩。在为了除去微团而进行的浓缩和过滤后，制剂具有450μg /毫升的DNA浓度。将制剂存储7天，并在贮存的开始时，12小时，2天， 3天，7天16天，和43天测定平均颗粒大小和分布。颗粒大小在以下的表 11中给出。

表11

                                      粒径   时间   单众数   平均值   单众数   标准差 ％标准   差    SDP  平均值     SDP   标准差   ％标准     差   起始    113.4    42.9   38   121.3     22.6     19   12小时    116.9    40.3   34   120     17.8     15   2天    111.9    40.4   36   122.2     29.5     24   3天    110.4    39.1   35   117.7     19     16   7天    112.4    41   36   118     24     20   16天    113.6    41.1   36   121.5     16.4     13   43天    110.5    38.3   35   117.8     26.5     22

以上结果表明根据该实施例所述方法制备的颗粒制剂随着时间流逝是 保持稳定的，因为其粒径基本上保持恒定。 实施例43

重复实施例42的程序，不同的是：使DNA和Tween80和聚乙烯亚胺 流过50μl柱体，而后流过两个包含在混合器中的150μl柱体，且DNA 和Tween80液流的初始流速在250μl/分钟到3,500μl/分钟之间变化。在 所设定的流速下所制备的每种制剂的颗粒大小在以下的表12中给出。

                                          表12

                                          粒径     *流速   μl/Min.     单众数     平均值    >单众数    标准差 ％标准差     强度    平均值     强度    标准差 ％标准差     250     192.8     74.7     39     215     50.8     24     500     168.8     66.6     39     190     36.6     19     1,000     115.4     48.1     42     142.3     47.8     34     1,500     93.2     40.2     43     113.2     26.4     23     2,000     78.9     34.4     44     115.7     32.1     28     2,500     76     33.2     44     112.3     78.9     70     3,000     73     32.3     44     106.2     41.7     39     3,500     66.6     29.4     44     109.9     68.9     63

*DNA和Tween80液流的初始流速，该流速为聚合物液流流速的1.4 倍。

从上表可知，选择可提供均匀的制剂的最理想的条件。用这些条件制 备了独立的三批。

然后将以上程序重复两次，DNA和Tween80液流的初始流速是1,500 μl/分钟。以1,500μl/分钟流速进行的最初实验(实验38)和重复实验(实 验39和40)的结果在以下的表13中给出。

                                      表13

                                      粒径    实验     单众数     平均值   单众数   标准差   ％标准     差     强度    平均值    强度   标准差   ％标准   差     38     93.2     40.2     43     113.2     26.4     23     39     110.2     46.3     42     133.6     39.2     29     40     111.5     47.4     43     126.6     32.1     25

以上结果表明该方法具有可重复性，因为在将DNA和聚合物的水溶液 以恒定流速不断地按恒定的聚合物与DNA的电荷比混合时，可一致地得 到DNA和聚合物的同质颗粒制剂，其中每种制剂包括具有相似的平均粒 径的颗粒。因此，本发明的方法与操作者无关。其它方法，例如手工混合 和移液，依赖于操作者的技术。

以流速1,500μl/分钟重复以上程序，不同的是将这种方法按比例放大 以便注入各20毫升的每种液流通过混合器。通过单众数平均值和强度平均 值测定的平均颗粒大小如下：

单众数平均值    88.3nm

单众数标准差    38.2

％标准差        43

SDP平均         117nm

SDP标准差       37.3

％标准差        32

通过0.2μ滤器过滤此制剂，而后如实施例42中的描述通过Amicon 聚砜(分子量500Kda)膜在300μl/分钟的流速下超滤浓缩，其中不同的是 在浓缩和过滤后，制剂具有250μg/μl的DNA浓度。通过单众数平均和 强度平均测定的平均颗粒大小如下：

单众数平均      102.9nm

单众数标准差    37.6

％标准差        37

SDP平均         115.5nm

SDP标准差       23.9

％标准差        21

通过0.2μ滤器再次过滤制剂，而后用Amicon聚砜(分子量500kda Kda)膜在300μl/分钟的流速下浓缩，此后制剂具有870μg/μl的DNA浓 度。通过单众数平均和强度平均测定的平均颗粒大小如下：

单众数平均值    108.6nm

单众数标准差    37.6

％标准差        35

SDP平均值       117.5nm

SDP标准差       25.2

％标准差        21

这样，以上结果表明颗粒制剂的超滤可提供均匀的DNA和聚合物颗 粒分散体。另外，制造这种同质颗粒制剂的能力与批的大小无关。 实施例44：带有线形PEI的核心复合物的制备及其生物活性

将线形PEI溶于去离子水中以得到最终浓度为100mM的胺，最终浓 度是通过溴化乙锭替换检定法测定的。在此检定法中1mmol被定义为完 全中和1mmol DNA磷酸盐所需要的PEI胺的量。由2.72毫克/毫升储备 溶液中取质粒DNA(pCIluc)221μl，与110μl45.46％的葡萄糖溶液和597 μl水结合。将72μl PEI溶液加入到该混合物中，然后充分地涡旋20秒， 以制备具有4∶1+/-比的复合物。将二百微升复合物通过尾静脉对CD-1 小鼠注射。由5个动物组成的每组接受相同的剂量。5小时后将小鼠安乐 死，采集它们的器官，磨碎，裂解和按先前描述的对萤光素酶表达进行分 析。

结果见图5。它们表明核心复合物显示出具有提供体内基因转移的活 性，但对于一些治疗应用此活性可以通过添加多层胶体载体的其它特征而 加以改善。 实施例45：用阳离子脂和基于PEG的融合剂表面活性剂及基于PEG的立 体表面活性剂制备具有外壳的核心复合物和它们的生物活性

阳离子脂分散体的制备：

将包括表面活性剂的制剂的全部脂溶于有机溶剂例如环己烷中，且以 所需要的比值混合在一起，而后冷冻至干燥。例如，对于DOTAP∶胆固 醇和GC030∶胆固醇分别使用45毫克DOTAP和25毫克胆固醇，或10 毫克GC-030和4.74毫克胆固醇。将重蒸水加入到脂饼中以得到最后浓度 为10毫克/毫升的阳离子脂(胆固醇是一种中性脂，其不用于脂分散体浓度 或以后与DNA的电荷比的计算)，然后使之在70℃下水合1小时。将脂分 散体挤压通过100纳米孔的碳酸盐膜(Avanti Polar Lipids公司)或在室温 下涡旋1分钟。

脂复合物的制备：

将四十微克pCILuc溶于100μl 10％葡萄糖中并手工与溶于100μl 蒸馏水的不同量的脂分散体混合。葡萄糖的最后浓度为5％。通过向脂溶 液中加入DNA溶液进行混合。在此混合物中脂与DNA的电荷比在本文中 有指明。将200ul DNA/脂复合物溶液注射到小鼠尾部静脉。每组有3-5 只小鼠。五小时后处死小鼠。切除脾，肝，肾，心脏和肺，然后将它们放 入2毫升离心管中(从Bio 101购买)。加入0.5毫升裂解缓冲液后，通过在 Fasprep FP120(从Bio 101购买)中摇动40秒压碎组织。将匀浆物在14, 000rpm下在台式离心机中离心5分钟。将20μl上清液用于萤光素酶分 析。萤光素酶活性通过Promega的萤光素酶分析体系试剂盒测定。

体内转染：

体内试验通过在小鼠或初生大鼠(3-10天大)的尾部静脉注射200ul DNA/脂复合物溶液进行。每组有5只动物。五或8小时后，通过心脏穿 刺收集血液，处死动物，然后将其它器官(例如，肺，肝，脾，肾，心脏) 手术切除。通过离心凝固的血制备血清样品。通过加入1毫升裂解缓冲液， 并用Bio 101 Fasprep FP120均质化40秒制备器官样品。直接分析匀浆物 的报道基因活性，或在微型管中在14000rpm下离心匀浆物10分钟，将上 清液用于蛋白活性分析。

结果见图7。它们表明核心复合物显示出具有提供体内基因转移的活 性(该结果是由不带添加剂的DOTAP∶胆固醇得到的)；可以通过融合添 加剂而改善该活性(该结果是加入Brij，Thesit和Tween得到的)；以及 活性可以通过添加立体包被物添加剂而被抑制(该结果是使用Chol- PEG5000得到的)。这样说明了多层胶体载体的一些特征。 实施例46：用融合剂肽包被的核心复合物的制备及它们的生物活性 材料：

全部肽是从商业的肽合成公司处获得(Genemed Synthesis公司，South San Francisco，CA)，纯度至少85％。肽K14含有氨基酸序列KKK KKK KKK KKK KK。肽k14 Fuso含有来源于流感病毒血凝素的融合肽，具有 氨基酸序列GLF GAI EGF IEN GWE GWI DGW YGC KCK KKK KKK KKK KKK K。Lipofectamine和lipofectin从BRL(Gaithersburg，MD)购 买。 方法：

转染：在一天前将BL-6细胞以10000细胞/孔接种到96孔板的每个孔 中。将0.5ug pCIluc2 DNA和所示的不同量的肽(ug)或Lipofectin试剂(ul) 独立地加入到50ul无血清培养基中。然后将肽或含有Lipofectin试剂的培 养基加入到含有DNA的培养基中。将混合物在室温下孵育30分钟，而后 将其加到细胞中。孵育3小时后，除去转染溶液并将培养基更换为含有血 清的培养基。

于转染后24小时，用Promega生产的萤光素酶分析试剂盒根据推荐 的方法测量萤光素酶活性。

结果见图8。它们表明核心复合物显示出具有提供体外基因转移的活 性，该活性随核心而变化。由K14和两种商用的脂试剂得到的结果表明， 由两种脂形成的核心比由K14形成的核心得到实质上更大的表达。结果同 样表明由K14形成的核心的活性可以通过加入融合肽序列而改善，以得到 表达的实质增加，相应于由两种脂所得到的表达水平。这样说明了多层胶 体载体的某些特征。 实施例47：腙键的制备和酸性pH值诱导的断裂

(合成，断裂测定法，结果)

1-乙酰基-2-对甲氧基苯腙的制备

向搅拌的0.108g乙酰肼的0.2ml甲醇溶液中慢慢地加入0.33ml茴香 醛。加入后将反应进一步搅拌48小时。取0.1ml反应混合物并将其加到 0.4ml水中。然后用C8反相高压液相色谱法纯化0.085ml等分样品(Vydac 300A，10u，250mm×10mm)，其中用0.025M pH值7.5的磷酸钠水溶液 作为溶剂A，用甲醇作为溶剂B。以1ml每分钟的流速使用55％到95％ 的溶剂B梯度洗脱35分钟。由梯度洗脱在15分钟的波峰处收集产物1- 乙酰基-2-对甲氧基苯腙，得到0.020g白色固体。

1H NMR(400MHz，DMSO-d6)显示存在产物的两种异构体，反式与 顺式几何异构体的比值为1∶1.69。

主要的异构体：δ2.17(s，CH3C＝O)，3.79(s，CH3O)，6.98(d，J＝8.8， Ar)，7.59(d，J＝8.6，Ar)，7.92(s，ArCH＝N)，11.105(s，NHAc)

次要的异构体：δ1.92(s，CH3C＝O)，3.795(s，CH3O)，6.99(d，J＝8.8， Ar)，7.61(d，J＝8.4，Ar)，8.08(s，ArCH＝N)，11.22(s，NHAc)

对于酸水解的研究，将0.35mg 1-乙酰基-2-对甲氧基苯腙的反式/顺式 混合物溶于2ml含有pH值为5的0.05M柠檬酸钠/磷酸钾的10％甲醇中。 将混合物迅即用NaOH调节pH值至5，且保持反应在370C进行。以一定 的时间间隔，抽出0.1ml，将0.3ml pH值为7.5的0.25M磷酸钾加入到其 中将pH值升至7.5。注入C8反相高压液相色谱柱(Vydac 300A，10u， 250mm×10mm)，用0.025M pH值7.5的磷酸钠水溶液作为溶剂A，用甲 醇作为溶剂B。以1ml每分钟的流速使用55％到95％的溶剂B梯度洗脱 35分钟。水解的速度由4-甲氧苯甲醛和1-乙酰基2-对甲氧基苯腙波峰的 峰面积测定。

以同样方式用pH值5.5和6.1的缓冲液进行上述的酸水解研究。

结果见图9。它们表明腙键可以在酸性pH值下水解，断裂的速度取决 于键的化学结构。由此说明了多层胶体载体的某些特征，其中由于暴露到 酸性条件而使载体改变了物理状态。由酸性条件引起的改变的一些用途包 括立体保护层的失去和融合活性的诱导。 实施例48：包被有配体肽的核心复合物的制备及它们的生物活性

K14-RGD和K14-SST的合成

包括肽配体缀合物的复合物的制备及配体介导的细胞结合和吸收 材料：

K14RGD肽含有氨基酸序列：KKK KKK KKK KKK KKS CRG DC，纯度至少为90％，由Alpha Diagnostic International(San Antonio，TX) 合成。K14SMT肽含有氨基酸序列：KKK KKK KKK KKK KKA d-FCY d-WKT CT，且K14MST肽含有氨基酸序列  KKK KKK KKK KKK KKA TDC RGE CF。SMT和MST肽都是由Genemed Synthesis公司， (CA，South San Francisco)合成的，并被氧化以制成环形肽。这些肽是由 供给者纯化到90％纯度的。从Novartis Oncology(Dr.Friedrich Raulf)处 获得CHO(Sst+)细胞系。选择细胞系以便可稳定表示人促生长素抑制素受 体Sst2。

方法：

在转染之前将20000 HUVEC细胞接种到96孔板的每个孔中，并培养 12小时。将0或2ug K14RGD肽与含0.1ul到4ul的指示量的Lipofectin 的50ul无血清培养基混合15分钟。将混合物加入到50ul含有0.5ug pCIluc2 DNA的无血清的培养基中。将聚lipoplex孵育30分钟，而后将其加到细 胞中。3小时后，除去转染溶液并将含有血清的培养基加入到细胞中。

在转染之前将10000 CHO(Sst2)细胞在96孔板的每个孔中在含有血 清和0.4mg/ml G418的培养基中培养12小时。在转染之前将培养基转换 为无血清的培养基。将肽以指示量由1ug到10ug/孔加入到此细胞中，并 在将0.5ug pCIluc2加入到相同的培养基中以转染细胞之前孵育30分钟。 用4ul的Lipofectin作为对照物。

于24小时，用Promega萤光素酶分析试剂盒根据推荐的方法测量萤 光素酶活性。 结果：

结果见图25和26。图25表示通过向Lipofectin核心复合物添加肽配 体(K14RGD)的提高的表达。图26表示通过向聚赖氨酸核心复合物添加肽 配体(促生长素抑制素或SMT)的提高的表达，当使用突变的促生长素抑制 素序列(MST)时则观测不到。这些图表示核心复合物可以在这样或那样程 度上显示出活性，但不管怎样核心的活性可以通过加入靶向配体以得到改 善，使表达显著增长。因此说明了多层胶体载体的某些特征。 实施例49：与核酸偶联的NLS部分的制备

可使用若干方法将NLS部分偶联到核酸上，其中一些在图10A中举例 说明，包括直接与核酸缀合和通过另外的试剂间接的偶联，该试剂以序列 特异的或序列无关的方式与核酸结合。这些将NLS与核酸偶联的方法所需 要的试剂包括三链体寡肽(triplex oligopeptide)的合成，PNA-肽，PCR片 段，质粒DNA，限制性内切酶片段，加帽试剂例如四股螺旋，以及间隔物 例如PEG和聚噁唑啉。

与DNA结合的PNA-NLS肽：

含有来自pCIluc的编码区的线型DNA片段通过PCR制备和扩大。反 应的引物是如此设计的：线形片段在其5′和3′端分别含有序列 AAAGAGGG和GAGAGGAA。肽核酸(PNA)序列，X-O-O- TTTCTCCC-O-O-O-CCCTCTTT和Y-O-O-TTCCTCTC-O-O -O-CTCTCCTT是通过固相合成在Research Genetics(Hunstville，AL) 合成的。这里C和T是胞嘧啶和胸腺嘧啶PNA类似物，而O是8-氨基-3，6 -二氧杂辛酸衔接物。X代表SV40大T-抗原NLS序列PKKKRKVEDPY， 而Y是罗丹明。用HPLC纯化这两个化合物并通过质谱分析。

将两个PNA分子设计成与线型DNA片段的互补的5′和3′端形成一 种“夹子”，如图10A所举例说明。DNA-PNA复合物是由20倍摩尔过 量的两个PNA分子与线型DNA混合，并在37℃下孵育1小时形成的。 然后将复合物在Centricon分离器(MWCO＝10,000D)中与非结合的物质 分离，然后通过1％琼脂糖凝胶上电泳，而后通过紫外线照射显现罗丹明 标记以进行观察。然后将凝胶在溴化乙锭中孵育，而后紫外线照射。可以 看到罗丹明和DNA带是重叠的，说明了它们的密切结合。随后将该物质 与PEI复合，如以前所描述，并将其用于以各种剂量转染培养的SM1和 HUVEC细胞。将细胞裂解然后在24小时后通过以前描述的方法评价萤光 素酶表达。

转染的结果清楚地表明含有PNA-NLS的线型DNA片段在转染所检 验的两种细胞型时都远为有效(图10B)。在最高剂量下，在由PNA-NLS 缀合的DNA和对照物片段获得的表达水平之间没有显著差异，但当剂量 由200ng减少到50ng时，含有NLS的DNA转染细胞是更有效的。此结 构对所检验的两种细胞类型在此整个范围内都维持其高转染率，而对照物 片段却下降到仅仅高于背景水平。可能的一种解释是在最高剂量时核酸的 输入机器被饱和，由此在两个结构之间没有显著差异。当剂量降低，含有 NLS片段的DNA被远远更积极地运载入细胞核中，因此能够维持其转染 的高水平。

然而注意到这种缺乏PNA-NLS的结构含有游离的未加保护的末端且 可能对外切核酸酶降解敏感是重要的。对于这种结构，不能排除观测到较 低的转染水平的一种理由是在细胞内的DNA降解，特别在较低的剂量时， 此时DNA的相当大部分可能是无用的。

线型DNA-NLS肽缀合物的合成：

策略：

通过PCR扩增由质粒DNA合成线型DNA片段，以致得到的线型DNA 具有位于一末端的缀合物和可折叠成防止外切核酸酶作用的结构的序列。

5′XCAT GGC TCG ACA GAT CTT CAA TA3′(FB1)(X：带有胺的 C6衔接物)

5′X1X2X2 TGG GTT TTG GGT TTT GGG TTT TGG GTT TGG ATCCGC TGT GGA ATG TG3′(PB)(X1：吖啶，X2，X3：C9衔接物)

PCR操作：PCR扩增用标准操作方案进行。

反应混合物具有下面的试剂：

1.PCR母液混合物            50μl

2.无菌蒸馏水               32μl

3.引物1(100ng/μl)         8μl

4.引物2(100ng/μl)         8μl

5.模板(1ng/μl，106拷贝)  2μl

PCR母液混合物含有PCR缓冲液1X，2.5U TaqPolym在Brij 35， 0.005％(v/v)中，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mM，10mM Tris-HCl， 50mM KCl，1.5mM MgCl2

PCR条件：

1.94℃      1分钟

2.94℃(变性)1分钟

3.60℃(退火)1分钟

4.72℃(蔓延)1分钟

将步骤2-4重复38次

5.72℃  2小时

将NLS肽通过PEG2000与DNA缀合：

带有氨基酸序列，PKK KRK VED PYC的NLS肽是从Genemed Synthesis公司获得的，并用固相方法用Fmoc化学合成。此肽是利用反相 HPLC纯化到＞90％纯度的。在与DNA反应之前，将肽用20mM DTT处 理。在G25凝胶过滤柱上用0.1％乙酸作为溶剂纯化DTT处理的肽，以便 除去游离的DTT。将肽保存在0.1％乙酸中直到其与PEG缀合的DNA反 应。

用50,000 MWCO透析管在4℃下在含有50mM NaCl的10mM HEPES中通过大规模的透析纯化由PCR扩增得到的线形PCR DNA。将 300μg PCR DNA容于2毫升含有1.5M NaCl，pH值7.5的10mM HEPES 中。将溶于0.1毫升DMSO(二甲亚砜)的1.5毫克N-羟基琥珀酰亚胺PEG 乙烯砜(NHS-PEG2000-VS)(从Shearwater P0lymers处获得)，加入到 DNA中，并在4℃下搅拌16小时。将反应混合物转移到50,000 MWCO透 析管中，在4℃下对含有1M NaCl的10mM HEPES透析，频繁的更换缓 冲液，以便除去未反应的PEG衍生物。

DNA溶液中的盐浓度升至2M。将溶于10mM HEPES的1mg NLS 肽加入到DNA溶液中并用稀释的NaOH将此溶液的pH值调节到8.0。将 反应混合物保持在4℃下搅拌16小时。然后将反应混合物对含有2M继之 以1M NaCl的10mM HEPES大规模地透析。将样品保存在含有1M NaCl的10mM HEPES中。 实施例50：PEI-PEG缀合物的合成和PEG化(PEGylation)对PEI/DNA 复合物的大小及稳定性的影响

材料和方法

PEI(25kD)从Aldrich化学公司(Milwaukee，WI)处获得，甲氧基聚(乙 二醇)-硝基苯基碳酸酯(分子量5000)从Shearwater Polymers(Birmingham AL)处获得。PEI溶液的浓度用TNBS检定法对于伯胺含量进行检定来测 定，如下所述。DNA浓度通过分光光度法在260纳米处用13,200mol-1cm -1每碱基对的摩尔消光系数测定(1OD＝50μg DNA)。胶体制剂的粒径通 过光散射测量法在Coulter N4颗粒筛上在90°角测定。要么通过假定颗粒 单群体的单众数分析(unimodal analysis)，或用假定多群体的SDP分析 用厂家提供的软件分析自相关函数。

TNBS检定法：

试剂：TNBS：10mM水溶液，甘氨酸HCl或任何其它伯胺标准物： 10mM水溶液，碳酸钠或碳酸氢钠缓冲液，pH值9.0，*TNBS可以是以甲 醇溶液(5％w/v)购买的。

方法：

以伯胺计算浓度范围5μM到0.1mM的一组标准溶液如下制备(对于 此目的可以使用甘氨酸HCl)。在100mM缓冲液中获得300μl0.1mM甘 氨酸HCl。通过样品的连续稀释获得若干样品。(例如将200μl上述样品 加入100μl缓冲液中获得浓度66.66M的样品，将200μl上述样品转移到 100μl缓冲液中得到44.44μM样品等等。在获得最后的样品后从其中移 去200μl以使全部样品具有相等体积，即100μl)。在相同的缓冲液中制 备100μl未知浓度的伯胺样品一式两份或三份。样品的浓度应该在标准曲 线的范围内。在每个样品中加入10μl TNBS，然后涡旋。在室温下孵育 30分钟然后在420nm处读出吸光度。从每个样品的吸光度中减去空白(即 在100μl缓冲液中稀释的10μl TNBS)的吸光度。获得甘氨酸浓度与420 nm处吸光度的标准曲线。从此曲线图的斜率和截距以及样品的吸光度， 可以计算伯胺的浓度。

PEI与PEG5000的缀合：

将10毫克PEI溶于100mM pH值9的NaHCO3，然后加入61mg甲 氧基PEG5000-硝基苯基碳酸酯(足够修饰5％的PEI残余物)并在4℃反应 16小时。然后将反应混合物用截断值10,000MW的透析袋对250mM NaCl而后对水进行大量透析。PEG350的PEI缀合物的合成是用与 PEG5000所述相似的方法，使用PEG350的硝基苯基碳酸酯(从Fluka， Milwaukee，WI处获得)进行的。PEG缀合的程度用复合物的重量和伯 胺的浓度估计。

固定的DNA/PEI-PEG复合物的形成：

通过人工混合相等体积的DNA和PEI/PEI-PEG混合物，而后涡旋 30到60秒，制备含有各种克分子浓度的PEG的DNA/PEI-PEG复合物。

细胞结合：共聚焦显微镜

PEG对PEI/DNA复合物的细胞吸收的影响通过荧光显微镜评价。用 从Oligos Etc.，Wilsonville，Oregon获得的3′-罗丹明标记的硫代磷酸寡核 苷酸(5′-AAG GAA GGA AGG-3 ′-罗丹明)作为荧光标示物。将标记的 寡核苷酸与PEI或PEI-PEG以4∶1(+/-)的电荷比复合，与六孔板中在 显微镜盖玻片上生长的HUVEC细胞，在无血清的培养基中孵育三小时。 孵育三小时后，用无血清的培养基洗涤细胞，然后在生长培养基的存在下 使其生长另外的20小时。然后将这些细胞用PBS洗涤，用4％多聚甲醛固 定15分钟，并放在悬滴显微载玻片上，孔中含有PBS，细胞面对孔并与 PBS接触。在激光扫描共聚焦显微镜下观察载玻片。将10毫克PEI溶于 100mM pH值9的NaHCO3，然后加入61mg甲氧基PEG5000-硝基苯基 碳酸酯(足够修饰5％的PEI残余物)并在4℃反应16小时。然后将反应混 合物用截断值10,000MW的透析袋对250mM NaCl而后对水大量地透 析。PEG2000，PEG750和PEG350的PEI缀合物的合成是用与PEG5000 所述相似的方法，使用相应的PEGs的硝基苯基碳酸酯(从Fluka获得) 进行的。PEG缀合的量通过比较复合物的重量和伯胺的浓度评价。

DNA/PEI-PEG复合物的形成：

用60x油浸物镜显微镜(MRC 1000，Bio-Rad)。将用于罗丹明激发 和发射的Ar/Kr激光源与滤光片装置结合用于荧光影像的获得。

生物活性：转染

用含有通过CMV启动子调节的萤光素酶报道基因的质粒DNA pCI -Luc研究PEI和PEI-PEG复合物的转染效率。将细胞(BL6)以20000细 胞/孔接种在96孔板中，并允许生长到80-90％汇合。然后将它们每孔与 以电荷比5(+/-)和剂量0.5μg DNA的DNA制备的PEI或PEI- PEG/DNA复合物一起在无血清的培养基中在37℃下孵育3小时。在测定 萤光素酶活性之前将细胞在生长培养基中生长另外的20小时。用可商购的 试剂盒(Promega)测定依据相对光单位的萤光素酶活性，然后用96孔形式 在发光计上读数。

结果

胶体稳定性

图11表示以各种电荷比制备的PEI/DNA复合物的粒径分布受到的 PEG缀合物(PEG化)的影响。未PEG化时，PEI/DNA复合物具有取决 于电荷比的粒径分布。在净负电荷下，形成的颗粒是相当小的(约100纳米)。 然而在接近中性电荷比下，PEI/DNA复合物形成或聚集成大的颗粒。当 电荷比升至净正电荷时，粒径降低，或许是由于表面电荷的相斥减少了结 合。

使用PEG化的PEI时，甚至在比较高的DNA浓度下，并且甚至不用 专用的混合技术DNA复合物也是小的，且尺寸都与电荷比无关。对于这 些实验，DNA是与PEG化的PEI复合的，其中约5％的PEI氨基残基是 与PEG5000缀合的。这看起来导致PEG在这些颗粒的表面上，从而有效 地减少结合现象，甚至对于电荷中性的复合物也是这样。在没有任何理论 束缚的情况下，可以认为这些效果可归因于PEG在复合物表面上提供了立 体屏障。

人们知道PEI/DNA复合物于几小时和几天内趋向聚集成大的颗粒。 这种不稳定性是常规复合物的不希望有的性质。图12表明可以通过PEI 的PEG化使用1∶1电荷比制备的PEG-PEI/DNA复合物获得在若干天 内胶体的稳定性。平均颗粒大小甚至在若干天的期间仍保持是小的。这些 数据表明PEG化提供了基因治疗应用中成功地使用这些胶体制剂所需的 长期稳定性。总而言之，PEI的少量PEG(5mol％)衍生化便于小微粒的 形成且可提供复合物实质上的稳定性。

血清的影响

普遍认为在血清存在下大多数的带正电荷的DNA复合物将失去它们 转染细胞的能力。这种灭活作用可能涉及与带负电荷的血清相互作用导致 这些颗粒的聚集和/或复合物的去稳定。将PEG固定到DNA复合物上可 用于解决此问题。图13表示血清对于PEI/DNA和PEI-PEG/DNA复 合物的粒径分布的影响。

在与血清孵育时，常规的带正电荷的PEI/DNA复合物基本上聚集， 可以通过平均粒径分布从约100纳米增加到大于500纳米(0mol％PEG) 证明。此可能归因于血清蛋白在这些复合物表面上的结合介导了聚集作用。 使用含有PEG5000 PEG化的PEI的固定复合物时，在大于1mol％的水 平出现对聚集的防止。该效果到3mol％时似乎达到饱合。该效果取决于聚 合物的分子量。PEG350对于防止血清介导的聚集作用(甚至直到检验的 mol％极限)也是无效的，如图13b所示。在没有任何理论束缚的情况下， 可能是聚合物的长度太短以致于不能对蛋白质结合提供任何显著的立体屏 障，或者此聚合物可能没有形成一个表面层。

对固定的复合物的结构观察可能见到延伸达到颗粒表面所吸附的蛋白 壳之上的聚合物链，它为颗粒-颗粒结合提供了立体屏障(图14A)。这样， 蛋白质吸收可以被减少，无变化，或者甚至被提高，且此额外的蛋白可以 帮助形成防止聚集作用的屏障或者在此表面上增加的特异的蛋白质可能是 有益的。

这些数据表明亲水聚合物，例如PEG，可影响由PEI和DNA形成的 阳离子颗粒的胶体和生物学性质。当通过与PEI的共价键将PEG固定在 DNA复合物上时，在PEI/DNA复合物的表面上似乎形成了一种立体PEG 包被物。这种包被物导致粒径分布的减少，提高了胶体稳定性，并提高了 血清稳定性，所有这些都是基因送递系统所希望的性质。

生物学活性

已知PEI/DNA复合物的生物活性依赖于复合物的电荷比(+/-)。在净 阳离子电荷比值下，PEI/DNA复合物，在没有任何受体介导的相互作用 的情况下，可以与细胞表面简单地通过静电相互作用结合。在较低的电荷 比(+/-＜1)下，其中复合物是净带负电荷的且预计与细胞表面的静电结合 是最小的，这时这些复合物转染细胞是十分无效的。在高电荷比(+/-＞1) 下，其中复合物是净带正电荷的，与带负电荷的细胞表面的静电结合可能 对于结合和随后的通过胞吞作用或者相似的机理的细胞吸收是足够的。

在颗粒表面上的PEG包被物可以调节复合物的相互作用。表面PEG 的作用是减少静电相互作用和形成一种立体隔层。对于体外转染，得到的 与细胞结合的降低可减少或消除吸收并抑制表达。对于体内体系的应用， 降低的蛋白和细胞相互作用将增加血循环时间和最小化非特异性的相互作 用，由此增加复合物达到靶组织的概率。

图20表示在0到5摩尔百分数PEG化的PEI范围内及对于不同分 子量的PEG在电荷比为5时PEG化对PEI/DNA复合物的体外转染效率 的影响。以报道基因萤光素酶的质粒表达测定活性。在此电荷比下PEI/ DNA复合物相当好地转染细胞，如由高的萤光素酶表达所显示的。在复合 物中PEG的存在在某种意义上抑制了表达，这高度取决于PEG的分子量 和mol％。此抑制归因于对结合和/或随后的复合物的胞内加工的抑制。 分子量等于或者大于2000的PEG表现出当复合物中的PEG mol％增加时 使表达减少。2000分子量的PEG的效果似乎在3mol％下达到饱和，而 5000分子量PEG的效果在4m0l％下达到饱和。不超过5％的PEG350或 PEG750似乎对复合物的活性没有显著的影响。

PEG包被物的存在，如上所述，可以通过若干途径影响复合物的生物 活性。带正电荷的颗粒上的聚合物包被物可以基本上起到屏蔽表面电荷的 作用，由此减少通过静电相互作用介导的结合。它还可以在表面上作为干 涉结合过程的立体隔层。而且存在立体聚合物对内体逃离机制起作用的可 能性。小分子量(短链长)聚合物看起来在不超过5mol％下没有效果。这很 可能是这些小聚合物提供了不充分的屏蔽。然而不知道是屏蔽或是立体隔 层，还是两者都是不充分的。因此，理解PEG调节复合物的活性的机理是 重要的。 实施例51：在PEI/DNA复合物上可脱落的PEG包被物的制备

除了其对DNA复合物的稳定作用外，固定的保护层的存在可以在DNA 送递过程中影响后面的步骤。特别地，立体层的存在可能对复合物从内体 中的逃离是不利的，该过程可能需要在复合物和内体膜之间有紧密的相互 作用。克服所有这些潜在的问题的一种方法是提供从复合物上用化学的或 酶催的过程断裂固定的立体包被物的方法。

本实施例表明可用可裂的二硫键使PEG和PEI缀合来产生在颗粒表 面上的可脱落的包被物。实施例44表明立体PEG包被物可以在PEI/DNA 复合物的表面上形成，对于制剂提供了改善的胶体稳定性。此实施例表明 该立体包被物是可以裂开的，例如，在还原条件下裂开。

材料和方法

PEI(25kD)是从Aldrich化学公司获得的，甲氧基聚(乙二醇)-硝基苯 基碳酸酯(MW 5000)和巯基聚乙二醇5000一甲基醚是分别从Shearwater Polymers和Fluka获得的。从用Coulter公司的Delsa 440SX测量的这些 颗粒的电泳迁移率确定胶体颗粒上的表面电荷。其它实验条件如实施例1 中描述。

PEI与PEG5000的缀合：

将10毫克PEI溶于100mM pH值9的NaHCO3，然后加入61mg 甲氧基PEG5000-硝基苯基碳酸酯并在4℃反应16小时。然后将反应混合 物用10,000MWCO的透析袋对250mM NaCl而后对水大量地透析。PEG 的量从伯胺浓度和烘干样品的重量来评价。

与PEG通过二硫键连接的PEI(PEI-ss-PEG)通过下面的方法合成。 将20毫克PEI溶于250μl DMSO。将8mg SPDP加入到此溶液中并允许 在4℃下反应16小时，在此期间反应混合物变成胶状。将溶于2ml 10mM Tris/pH8.0的100毫克巯基聚乙二醇5000一甲基醚加入到上述溶液中， 然后反应两天，在此期间凝胶溶解。将样品用截断值10,000MW的透析 柱对水大量地透析3天，期间频繁的换水。用两种不同的方法评价缀合的 百分率，其中或者：(i)从伯胺浓度和烘干样品的重量评价PEG的量；或 (ii)将缀合物用DTT处理。用截断值10,000MW的透析膜通过透析除去 DTT后，伯胺与巯基的比值用TNBS(RDS#)和Ellman分析法测定。两 种方法得到十分相似的值。

DNA/PEI-PEG复合物的形成：

通过人工混合相等体积的DNA和PEI/PEI-PEG混合物，而后涡旋 30到60秒，制备含有各种克分子浓度的PEG的DNA/PEI-PEG复合物。

细胞结合：共聚焦显微镜

通过荧光显微镜评价PEG对PEI/DNA复合物的细胞吸收的影响。 用从Oligos Etc.，Wilsonville，Oregon获得的3′-罗丹明标记的硫代磷酸寡 核苷酸(5′-AAG GAA GGA AGG-3′-罗丹明)作为荧光标示物。将标记 的寡核苷酸与PEI或PEI-PEG以4∶1(+/-)的电荷比复合，与六孔板中 在显微镜盖玻片上生长的HUVEC细胞，在无血清的培养基中孵育三小时。 孵育三小时后，用无血清的培养基洗涤细胞，然后在生长培养基存在下使 细胞生长另外的20小时。然后将这些细胞用PBS洗涤，用4％多聚甲醛固 定15分钟，并置于悬滴显微载玻片上，在孔中含有PBS，细胞面对孔并与 PBS接触。用60x油浸物镜在激光扫描共聚焦显微镜(MRC 1024，Bio-Rad) 下观察载玻片。将用于罗丹明激发和发射的Ar/Kr激光源与滤光片装置 结合用于荧光影像的获得。

生物活性：转染

用含有通过CMV启动子调节的萤光素酶报道基因的质粒DNA pCI -Luc研究PEI和PEI-PEG复合物的转染效率。将细胞(BL6)以20,000细 胞/孔接种在96孔板中，并允许生长到80-90％汇合。然后将它们每孔与 以电荷比5(+/-)和剂量0.5μg DNA的DNA制备的PEI或PEI- PEG/DNA复合物一起在无血清的培养基中在37℃下孵育3小时。将这些 细胞在生长培养基中生长另外的20小时。将细胞裂解，然后用可商购的试 剂盒(Promega，Madison，WI)以发光计用96孔形式分析(以相对光单位测 定)萤光素酶活性。

结果

实施例44表明将PEG固定到PEI给PEI/DNA复合物提供了长期 的胶体稳定性并有助于获得小颗粒。它还表明在复合物中立体保护层的存 在，例如PEG，可减少与血清蛋白以及细胞表面的非特异性相互作用。如 下所述的结果表明使用可断裂的立体层对PEI/DNA复合物的物理化学的 和生物学特性的影响。图16表示PEI/DNA复合物的粒径，其中PEI含有 与PEG通过二硫键缀合的11％的PEI残基。这些复合物是在电荷比(+/-) 1下获得的，其中常规颗粒的粒径可能是十分大的(实施例44和图11)。与 十分大的尺寸相反，发现复合物是相对小的，具有平均150纳米的尺寸。 当在与DNA混合之前用10mM DTT预处理PEI-ss-PEG时，形成的颗 粒是十分大的且在几分钟之内从溶液中沉淀出。这些数据表明了固定的立 体表面(PEG)的稳定作用，以及通过还原断裂PEG二硫化物衔接物可以除 去表面PEG及其稳定作用。

为了使固定的立体隔层影响颗粒的聚集作用及减少非特异性的相互 作用，它必须在颗粒的表面存在。当PEG化的PEI与DNA混合形成颗粒 时，一些PEG分子可能被截留在复合物的疏水核内，且可能是不易化学或 酶促断裂的。然而，因为PEG是亲水性聚合物，可以预期它的大部分是在 表面上的。这种表面聚合物的切除可以显著地影响颗粒的性质。在带正电 荷的颗粒的表面具有立体聚合物的后果之一是它可屏蔽表面电荷。可使用 ζ电位测量法探测表面上的聚合物层的存在。这种层将减少有效表面电荷， 且减少的程度可能取决于聚合物的长度。

图17表示与鲑精DNA以电荷比3(+/-)复合的PEI和PEI-ss- PEG5000的ζ电位。在此电荷比下PEI/DNA具有约24毫伏的正ζ电位。 与PEI-ss-PEG以相同的电荷比复合的DNA显示低得多的ζ电位(12毫 伏)，表明了PEG遮蔽了表面电荷。这种复合物含有5mol％(相对于PEI 上的总氨基)PEG。这种ζ电位与含有5mol％PEG的PEI/DNA复合物 所得到的ζ电位十分相似，其中将PEG通过稳定的键连接到PEI上。用 10mM DTT处理这种复合物导致ζ电位的增加(21毫伏)，指示从表面上 除去了固定的立体PEG层。在与DNA复合之前用DTT处理PEI-ss-PEG 得到的值类似于PEI/DNA复合物(22毫伏)的值。这些结果清楚地表明在 复合物表面上PEG的存在以及其在还原条件下(当通过二硫化物连接时) 的可裂解性。

胶体稳定性

如下所示的结果表明可断裂的锚的存在不会对PEG化的复合物的胶 体稳定性有不利影响。

图18表示以电荷比1制备的PEI-ss-PEG/DNA的长期稳定性。 这种制剂的平均粒径分布在长时间保持恒定。这与实施例44中针对PEI- PEG/DNA得到的结果一致。为了了解从复合物的表面上除去二硫化物连 接的PEG的效果，将10mM DTT加入到样品中。平均粒径从88纳米增 加到104纳米，并随时间保持近乎无变化。

生物活性

对于PEI/DNA，在没有连接到复合物的配体的情况下，在DNA运 输过程中最初的细胞结合步骤是通过静电相互作用介导的。复合物表面上 的立体隔层(PEG)的存在，以至少两种不同的方式影响其物理性能：1)聚 合物包被物可以物理地阻断与细胞表面的相互作用以及2)它可以屏蔽表面 电荷以使通过静电相互作用介导的结合减少。这样立体层可以被用于抑制 非特异性的相互作用。使用立体表面(例如通过PEI/DNA复合物的PEG 化)，可用于抑制不希望有的生物活性。这是很重要的，因为它提供了控 制可导致毒性的非特异性相互作用的方法。

使用荧光标记的共聚焦显微摄影表明，这种活性抑制的可能的原因是 减少与细胞的结合。结合活性可以通过将细胞或组织特异的配体连在立体 聚合物的远端和/或通过化学的或酶催化的方式使立体聚合物从复合物表 面裂开而得到恢复。后面的方法可以通过将PEG与PEI通过可裂的二硫 键缀合来实现。

图19表示在复合物中存在各种mol％PEG下PEI-ss-PEG/DNA 和PEI-PEG/DNA的生物活性。在正电荷比下PEI/DNA可有效地转染 BL-6细胞。用PEI-PEG/DNA复合物转染的细胞随着复合物中PEG量 的增加显著地减少了活性。对于含有＞3mol％PEG的复合物，活性基本 上消除。在这种情况下PEG与PEI通过稳定的键缀合。然而，用PEI-ss -PEG/DNA转染的细胞在甚至多达5mol％PEG下仍显示高活性。尽管 通过缀合的PEG提供了立体覆盖物，但这些颗粒仍保留了它们的活性。通 过稳定的或不稳定的键连接在复合物表面上的PEG的存在将预期会抑制 细胞的结合和吸收。然而，PEI-ss-PEG/DNA复合物的高生物活性说明 在PEI-ss-PEG/DNA中通过二硫键连接的PEG在孵育期间或在以后的 DNA运输过程中的步骤中裂解。

用与PEI或PEI-ss-PEG复合的荧光标记的寡核苷酸孵育的 HUVEC细胞的共聚焦影像表明PEI/寡核苷酸复合物是十分有效地内在化 的，正如通过细胞内的大量荧光所显示的。相反，用PEI-ss-PEG/寡核 苷酸复合物孵育的细胞显示相当低的内部荧光。与在PEI-PEG/寡核苷酸 复合物的情况下观测到的一样，结合和吸收大大地减低。 实施例52：PEI-PMOZ缀合物的合成和缀合对表面性质和转染活性的影 响。

材料和方法

4-硝基酚，碳酸双(4-硝基苯基)酯，三乙胺，双环己基碳二亚胺，无 水乙腈和无水二氯甲烷是从Aldrich(St.Louis，MO)购买的。

PMOZ和PEOZ的合成

带有端基丙酸的聚(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOZ丙酸)和带有甲基端 基的聚(2-乙基2-噁唑啉)(PEOZ)是如S.Zalipksy等人(J.Pharm Sci. 85：133(1996))的方法制备的。使用装有顺序安装的G-3000 PW和G- 2500 PW柱(Schimadzu)的Hewlett Packard 1100 HPLC进行凝胶渗透色 谱(GPC)的测定，并通过PEG标准品的水溶液校正。

在D2O中在360MHz下测定H-NMR谱(Spectral Data Services Inc，Champaign，IL)。

PMOZ的活化-PMOZ-丙酸4-硝基苯基酯的制备

将PMOZ-丙酸(分子量：9100，0.129mmol的丙酸盐端基)在10毫升 无水乙腈中共沸干燥两次。然后将聚合物溶于3毫升无水二氯甲烷中，然 后加入4-硝基苯酚(2.87mmol)。将混合物冷却到0℃，然后加入2.62mmol 二环己基碳二亚胺(DCCI)的2毫升无水二氯甲烷溶液。30分钟后，将混 合物升温至室温，然后孵育16小时。然后将反应混合物在搅拌下滴加到 300毫升无水乙醚中。丢弃上清液，将沉淀溶于无水乙腈，然后在乙醚中 重复沉淀3次，得到PMOZ-丙酸的4-硝基苯基酯(0.545g)白色粉末。

PEOZ的活化-制备PEOZ的4-硝基苯基碳酸酯

将PEOZ(M.W.8850，0.1mmol的羟基端基)和三乙胺(0.25mmol) 溶于10毫升无水乙腈中。维持温度在0℃，在搅拌下加入碳酸双(4-硝基 苯基)酯(2.5mmol)的10毫升无水乙腈溶液。然后将混合物升温至室温， 然后继续反应20小时。然后浓缩反应混合物，再溶于5毫升无水乙腈中， 然后搅拌滴加加入到500毫升乙醚和10毫升二氯甲烷的无水混合物中。除 去上清液，将沉淀溶于5毫升乙腈，然后在乙酸乙酯-二氯甲烷中再沉淀。 收集PEOZ的4-硝基苯基碳酸酯(0.59克)的沉淀，为白色固体。在硅胶板 上进行TLC检验(洗脱液：乙酸乙酯)，显示没有碳酸双(4-硝基苯基)酯。

PMOZ与PEI的缀合：

将43毫克PEI溶于0.1M pH值9.0的碳酸氢盐缓冲液。加入545毫 克活化的PMOZ，并在室温下反应过夜。反应之后，通过加入浓HCl将 pH值降低到5。通过氯仿抽提释放出的硝基苯酚，处理5次。简要地，将 反应混合物与100毫升氯仿在分液漏斗中混合，用力摇动，然后静置分成 两相。硝基苯酚优先地被携带进入氯仿相，将其除去，而后加入新鲜的氯 仿，重复此过程。然后干燥此物质，并将其再溶于10毫升去离子水，而后 对150mM NaCl透析，换2次缓冲液，而后对去离子水透析2天，换4 次水。然后冷冻干燥产物，通过NMR测定PMOZ负载和氨基含量。

PEOZ与PEI的缀合：

将32.035毫克PEI溶于5毫升0.1M pH值8.0的硼酸盐缓冲液。将 590毫克活化的PEOZ溶于4毫升乙腈，然后搅拌将其加到PEI溶液中。 5分钟后观察到沉淀，该沉淀在加入15毫升硼酸盐缓冲液后消失。将反应 混合物在室温下反应过夜。反应之后，在旋转蒸发器中干燥该物质，除去 全部乙腈。然后通过加入浓乙酸将pH值降到5。如上所述，通过氯仿抽提 释放出的硝基苯酚。然后进一步地用乙酸乙酯萃取除去大部分残余的硝基 苯酚。然后干燥该物质，并将其再溶于10毫升去离子水，而后对0.1M乙 酸透析，换2次缓冲液，而后对去离子水透析2天，换4次水。然后冷冻 干燥产物，通过NMR测定PEOZ负载和氨基含量。

固定的DNA/PEI-PMOZ复合物的制剂：

复合物如先前所述形成。

生物活性：转染

如实施例45中描述的在BL-6细胞中测定生物活性。

结果

表面性质和胶体稳定性

图22表示PMOZ对复合物的表面性质的影响。以电荷比4∶1配制复 合物，并在10mM盐水中测定ζ电位。没有PMOZ存在时，颗粒显示高 度正电荷的表面，如通过ζ电位为+30毫伏显示的。仅在复合物中有1.6％ 负载的PMOZ时，就可将ζ电位减少到6.46毫伏。增加负载到3.2％导致 进一步地降低到5.35毫伏。这些数据说明，在自组装过程期间，亲水的 PMOZ分子优选出现在复合物的表面上而不是在疏水性的内部，由此起到 立体隔层的作用，以减少表面上存在的表观电荷。此亲水的和不带电的表 面可预计能减少与大的血清组分例如蛋白质的相互作用。实际上观测到这 种现象，如图23所示，其中用从0到3.2％(以0.8为一级)不同量的PMOZ 制备电荷比4∶1的复合物，在37℃下在含有10％FBS的PBS中孵育2h 之前和之后对其粒径加以研究。复合物在血清中的稳定性(通过测定它们维 持尺寸的能力)正比于存在于复合物中的PMOZ的量。这显示了复合物在 血清中是稳定的，这是靶向特异组织的决定性的要素。

非特异性转染的阻断

图24表示使用如上所述的复合物转染培养的BL-6细胞得到的结果。 在存在于复合物中的PMOZ的量和其转染细胞的能力之间存在明确的关 系。增加表面PMOZ的量减低这些细胞中萤光素酶的表达水平。正如以上 的讨论，PMOZ的存在通过起立体和静电隔层的作用阻碍了复合物与细胞 表面的非特异性的相互作用。相互作用的减低可降低核酸被吸收到细胞中， 导致转染水平降低。这使人们可设计出一种通过将配体连接到PMOZ的远 端对任何靶有选择性的复合物。在此设计中，可向远离颗粒表面的立体聚 合物添加最佳数量的配体分子，实现与靶受体有效的相互作用。 实施例53带有外部立体包被物的通过配体靶向的多层胶体复合物的制备

PEI-PEG-RGD的制备：

合成和提纯：

通过Cys侧链环化，并用反相HPLC(C18柱)纯化到＞90％的具有序 列ACR GDM FGC A的RGD肽是从Genemed Synthesis，S.San Francisco 处获得的。将16.8毫克RGD肽溶于100mM pH值8.0的HEPES缓冲液。 在搅拌下使用注射器泵慢慢地(于30分钟内)向此溶液中加入溶于无水 DMSO(100微升)的41毫克VS-PEG3400-NHS(Shearwater Polymers)。 将反应混合物保持在室温下搅拌另外的7小时。调节pH值到8.0后将5mg PEI溶液加入到上述反应混合物中。反应混合物的pH值升至9.5，然后在 室温下搅拌4天。在反应结束，将反应混合物冷冻干燥。

将样品再溶解在pH值7.0的含有150mM NaCl的5mM HEPES中， 并用含有5mM HEPES和150mM NaCl的洗脱缓冲液通过G-50凝胶过 滤柱。将空体积部分用25,000 MWCO的透析管对含有150mM NaCl的 5mM HEPES大量透析。随后将样品用3500 MWCO袋对水透析脱盐。

肽缀合的评价：

在缀合物中肽的量用从Cys侧链估计的巯基浓度来测定。将小部分的 缀合物用20mM DTT处理以还原肽二硫键。然后将此样品用25000 MWCO渗析管对含有1mM EDTA的0.1M乙酸透析，以便除去过量的 DTT。大量透析后，用Ellmen试剂测定巯基浓度，而用针对伯胺的TNBS 分析测定由PEI导致的氨基浓度。根据这些分析，估计与PEI缀合的肽为 10％。

DNA结合：

PEI-PEG-RGD2C与DNA复合的能力用凝胶电泳实验证实。在或 高于电荷比1下形成的复合物不能在凝胶中移动，显示由于缀合物的结合 完全中和了DNA的电荷。

粒径和ζ电位：

为了促进DNA/多聚阳离子复合物的吸收，需要将DNA压缩成可被 细胞内吞的小颗粒。PEI-PEG-RGD2C将DNA压缩成小颗粒的能力通 过粒径测量法研究。以下的表14表示在各种电荷比下的DNA/PEI-PEG -RGD2C的粒径。表14还表示在各种电荷比下的DNA/PEI-PEG- RGD2C复合物的ζ电位值。在这些电荷比下保持低的ζ电位，表明形成 了屏蔽复合物的表面电荷的立体包被物。

表14  电荷比   粒径(nm)    标准差    ζ电位    标准差  1.0∶1     405.6     186.6     -13.3     3.65  1.2∶1     579.1     267.5     -4.92     2.27  2.0∶1     58.1     24.8     6.89     6.67  4.0∶1     34.9     14.8     8.98     7.81  10.0∶1     23.3     10.5     9.72     10.5

细胞结合和吸收：

用荧光标记的寡核苷酸用共聚焦显微镜研究PEI-PEG-RGD2C将 核酸递送到细胞的能力。共聚焦显微镜实验如以前描述的进行(实施例51)。 图28显示，在Hela细胞中通过向PEG缀合的PEI的远端添加肽配体(RGD) 使得Rh标记的寡核苷酸在电荷比6与PEI的复合物的细胞吸收增加。此 图表示了用PEI或PEI-PEG-RGD2C将荧光标记的寡核苷酸送递到 Hela和HUVC细胞。在带有整联蛋白受体的Hela细胞中，当通过PEI- PEG-RGD2C介导送递时，与单独用PEI相比较，内在化的寡核苷酸的 量明显增加。分布模式也是十分不同的。对于PEI，寡核苷酸被分配到细 胞质的泡状区室中，而对于PEI-PEG-RGD2C，大部分寡核苷酸位于细 胞核中。 实施例54 带有可脱落的外部立体包被物、通过配体靶向的多层胶体复 合物的制备

使用位阻的二硫化物与聚乙基噁唑啉(PEOZ)一端(PEOZ的另一端 与肽配体RGD缀合)的线形PEI的合成如图27所图解。如图27A所示， PEI-SS-PEOZ-RGD的制备包括2-乙基-2-噁唑啉单体与碘乙酸乙酯 的聚合，随后的甲醇KOH的水解，得到亚甲基羧化的PEOZ中间体I。 将羧化的基团与1-氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]缩合，而后用 戊二酐将末端羟基基团衍生化，然后将得到的羧化的端基与RGD肽的N- 末端氨基缩合，得到2-吡啶基保护的-SS-PEOZ-RGD中间体IV。用25 当量的二硫苏糖醇在pH值5还原8小时，制备硫醇HS-PEOZ-RGD V， 其可与2-吡啶基二硫代丙酸酯衍生的线形聚乙烯亚胺起反应得到PEI-SS -PEOZ-RGD。可改变此最后一步，用25当量的二硫苏糖醇在pH值5 下将2-吡啶基二硫代丙酸酯衍生的线形聚乙烯亚胺还原8小时，而后将得 到线形聚乙烯亚胺上的硫醇与2-吡啶基保护的-SS-PEOZ-RGD中间体 IV起反应得到相同的最终产物PEI-SS-PEOZ-RGD。

亚甲基羧化的PEOZ中间体(I，图27A)的制备：

在螺旋帽管中进行聚合反应，所用的管在使用之前在真空下加热干 燥。向管中装上刚对KOH蒸馏过的4毫升2-乙基-2-噁唑啉和4毫升无 水乙腈。将0.85克刚蒸馏过的碘乙酸乙酯溶于8ml无水乙腈，然后将0.80 毫升此溶液转入含有单体的管中。转移后将管用氩气吹扫，密封并在油浴 中在80℃下搅拌45小时。冷却到室温后，将2毫升KOH(0.5M)的甲醇溶 液加入到聚合混合物中，而后在25℃下搅拌4小时。加入0.15毫升冰醋酸， 然后将混合物浓缩为固体，将其在50毫升水中再溶解，然后放入截断值 3500分子量的Spetral/Por透析膜中(Spectrum，Los Angeles，CA)。用 100mM NaCl(1×3.5L)和水(3×3.5L)透析。将透析袋的内容物冷冻干燥， 再在真空下干燥，得到3.84g白色固体(98％)。

1H NMR(360MHz D2O)d0.87-0.94(m，CH3CH2C＝O)，2.13-2.27(m， CH3CH2C＝O)，3.37-3.46(m，CH2N)

样品产生阳离子MALDI-TOF质谱，显示在约m/z8,000至13,000 间有弱的，宽分布的可能的假分子离子，并集中在大约m/z10,331(预期 m/z10,075)。

1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]-亚甲基羧化的-PEOZ 中间体(II，图27A)的制备：

将2g亚甲基羧化的PEOZ中间体(I，图27)溶于100毫升水并用HCl水溶液调节pH值到6。将溶液在真空浓缩得到固体，然后将固体溶于6 毫升无水二氯甲烷。加入0.273克1-羟基苯并三唑一水合物，0.208克二环 己基碳二亚胺和0.253g1-氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]，然后 搅拌48小时。将反应混合物过滤然后将滤液搅拌下滴加加入到1升的乙醚 中。倾析后，将沉淀溶于5毫升二氯甲烷，并搅拌下再次被加到1L乙醚 中。倾析后，将沉淀在50毫升水中溶解，然后放入截断值3500分子量 Spectral/Por透析膜中(Spectrum，Los Angeles，CA)。用100mM NaCl(1 ×3.5L)和水(2×3.5L)透析。将透析袋的内容物冷冻干燥，再在真空下干燥， 得到1.77g白色固体(86％)。

将得到的固体用C18反相高压液相色谱法(Jupiter 300A，10u， 250mm×l0mm)纯化，其中用0.1％三氟乙酸水溶液作为溶剂A，用乙腈作 为溶剂B。以5ml每分钟的流速使用30％到45％的溶剂B梯度洗脱45分 钟。产物，1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]-亚甲基羧化的- PEOZ中间体(II，图27A)，通过收集在梯度洗脱20分钟时的峰的洗脱 物，得到0.88克白色固体(43％)。

1H NMR(400MHz D2O)δ0.87-0.94(多三重峰，J＝7.2，CH3CH2C＝O)， 1.16(bs，[CH3]2C)，2.13-2.28(多四重峰，J＝7.3，CH3CH2C＝O)，3.37-3.46 (m，CH2N和CH2OH)，3.92(bs，NCH2C＝O)，7.67(bdd，J1/2+J2/2＝6.8， 4-H吡啶基)，8.16(bd，J＝8.3，2-H吡啶基)，8.27(bdd，J1＝J2＝8.10，3-H吡 啶基)，8.51(bd，J＝5.9，5-H吡啶基)

1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]-亚甲基羧化的-PEOZ -O-戊二酸单酯一元酸中间体(III，图27A)的制备：

将0.05g1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]-亚甲基羧化的- PEOZ中间体(II，图27A)溶于1毫升无水乙腈和2毫升无水甲苯中。将 溶液在真空中浓缩得到固体。加入0.014克戊二酐的0.5毫升无水乙腈溶液， 而后加入0.025毫升无水吡啶。将搅拌的混合物在80℃的油浴中放置24 小时。冷却后，将混合物在真空浓缩得到固体，再溶解在3毫升pH 6.5的 0.2M乙酸钠水溶液中，然后应用于精细SephadexTM G-25(柱直径1.6厘 米，高度65厘米)。用水从凝胶柱中洗脱产物，并收集在第一种馏份中， 得到0.04克白色固体(80％)。 1H NMR(400MHz CD3OD)δ1.07-1.12(多三重峰，J＝7.3， CH3CH2C＝O)，1.31(bs，[CH3]2C)，1.85-1.89(m，OC＝OCH2CH2CH2CO2H)， 2.18-2.25(m，OC＝OCH2CH2CH2CO2H)，2.36-2.47(多四重峰，J＝7.3， CH3CH2C＝O)，3.5-3.57(m，CH2N和CH2OH)，4.09(bs，NCH2C＝O)， 4.23-4.26(m，CH2OC＝O)，7.21-7.23(m，4-H吡啶基)，7.76-7.81(m，2-H 和3-H吡啶基)，8.42(m，5-H吡啶基)。

1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]-亚甲基羧化的-PEOZ- O-戊二酸单酯肽基RGD中间体(IV，图27A)的制备：

将0.03克1-酰氨基2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]-亚甲基羧化 的-PEOZ-O-戊二酸单酯一元酸中间体(III，图27A)溶于0.25毫升无水氯 仿中，并用0.002克N-羟基琥珀酰亚胺和0.003克二环己基碳二亚胺处理。 将溶液在25℃下搅拌48小时而后过滤。将收集的滤液滴加到搅拌的100 毫升无水乙醚中。倾析后，将沉淀溶于0.5毫升无水乙腈中，然后将其加 到0.008克双环化的GACDCRGDCWCG羧基封闭的酰胺肽中(Genmed Synthesis，South San Francisco)。加入0.003克1-甲基咪唑，然后将反应 在25℃下搅拌48小时。加入pH值6.5的3毫升0.2M乙酸钠水溶液，然 后放入截断值3500分子量Spectrol/Por透析膜中(Spectrum，Los Angeles， CA)。用100mM NaCl(2×3.5L)和水(3×3.5L)透析。将透析袋的内容物冷 冻干燥，然后进一步地真空干燥，得到1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷[2-吡啶 基二硫代]-亚甲基羧化的-PEOZ-O-戊二酸单酯肽基RGD中间体(IV， 图27A)。

1-酰氨基-2-甲基-2-丙硫醇亚甲基羧化的-PEOZ-O-戊二酸单酯 肽基RGD中间体(V，图27A)的制备：

将0.02克1-酰氨基2-甲基-2-丙烷[2-吡啶基二硫代]亚甲基羧化的 -PEOZ-O-戊二酸单酯肽基RGD中间体(IV，图27A)溶于0.5毫升含有 5mM EDTA，pH值5的0.2M乙酸钠水溶液中。将溶液用氮气吹扫，加 入0.008克二硫苏糖醇。搅拌8小时，然后施加到精细SephadexTMG-25(柱 直径1.6厘米，高65厘米)。将产物用0.10M乙酸水溶液从凝胶柱中洗脱 下来，收集第一种馏份得到1-酰氨基-2-甲基-2-丙硫醇亚甲基羧化的- PEOZ-O-戊二酸单酯肽基RGD中间体(V，图27A)。

2-吡啶基二硫代丙酸酯衍生的线型聚乙烯亚胺(VI，图27A)的制备

将来源于Pierce，Rockford IL的0.013克N-琥珀酰亚胺基-3-( 2- 吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)的0.5毫升无水甲醇溶液加入到0.022克分子 量22kDa的游离碱线型聚乙烯亚胺的0.25毫升无水甲醇溶液中。将反应 在黑暗中搅拌16小时。加入pH值6.5的10毫升0.5M乙酸钠水溶液，然 后将得到的混合物放入截断值3500分子量Spectral/Por透析膜中 (Spectrum，Los Angeles，CA)。用0.5M NaCl(2×2L)和水(3×2L)透析。 将透析袋的内容物冷冻干燥，再在真空下干燥，得到2-吡啶基二硫代丙酸 酯衍生的线型聚乙烯亚胺(VI，图27A)。

1-酰氨基-2-甲基-2-丙烷二硫代(聚乙烯亚胺)亚甲基羧化的-PEOZ- O-戊二酸单酯肽基RGD中间体(VII，图27A)的制备

将0.01克2-吡啶基二硫代丙酸酯衍生的线型聚乙烯亚胺(VI，图27A) 溶于0.1毫升含有0.1M氯化钠和25mM EDTA、pH值5的0.2M乙酸 钠缓冲液。将溶液用氮气吹扫。然后加入0.125克1-酰氨基2-甲基-2- 丙硫醇亚甲基羧化的PEOZ-O-戊二酸单酯肽基RGD中间体(V，图27A) 在0.5毫升含有0.1M氯化钠和25mM EDTA的pH值5的0.2M乙酸钠 缓冲液中的溶液。将反应混合物搅拌8小时。偶联的程度通过在343纳米 处测定所释放出的吡啶-2-硫酮的吸光度来确定。在343纳米下的摩尔消 光系数＝8.08×103M-3cm-1。通过加入0.01克巯基乙醇将反应终止。继续 搅拌，直到释放出全部的吡啶-2-硫酮。加入pH值4的10毫升0.5M乙 酸钠水溶液，然后将得到的混合物放入截断值25,000分子量Spectral/Por 透析膜中(Spectrum，Los Angeles，CA)。用0.5M NaCl(2×2L)和水(3× 2L)透析。将透析袋的内容物冷冻干燥，然后进一步地真空干燥，得到1- 酰氨基-2-甲基-2-丙烷二硫代(聚乙烯亚胺)亚甲基羧化的-PEOZ-O-戊 二酸单酯肽基RGD中间体(VII，图27A)。

将PEI-SS-PEOZ-RGD和PEI-SS-PEOZ以不同比例混合，得到 含有不同克分子浓度的配体的分子。然后将这些混合物与如上所述的质粒 DNA(pCIluc)相结合，以制备4∶1+/-比的复合物。将复合物在10mM NaCl，1mM EDTA溶液中稀释，然后在DELSA440(Coulter Corp.Miami， FL)中测定ζ-电位以估算“表面层”的厚度。然后转染HUVEC细胞，在 转染后24h，48h和72h分析萤光素酶活性以确定最佳的配体量以及表达- 动力学的差异(如果有的话)。本实验的对照物是缺乏靶向层的带正电荷复 合物。在与游离配体的竞争分析中以及在无受体的细胞中检验配体特异性。 将这些复合物通过CD-1小鼠的尾部静脉注射，分离各种器官和血管，然 后检验萤光素酶表达以了解与对照物制剂的差异。 实施例55.向人滑膜细胞送递基因以及通过其进行的表达。

将本发明中描述的阳离子脂，具体地为CGP 44015A，与质粒DNA(编 码GFP或表达萤光素酶)复合。在带阳离子电荷的脂与带阴离子电荷的质 粒的比例不同的情况下制备复合物。将如此制备的复合物对培养中的分离 的人滑膜细胞RA 1191在剂量范围给药。在孵育期后，洗涤细胞，并将细 胞用新鲜的培养基维持。24小时后，通过流式细胞仪和荧光显微镜分析细 胞的GFP表达。结果在表15和图29中概括。这些结果表明新的胶体载体 提供了向人滑膜细胞的基因送递和在该细胞中的高水平表达。高效是指被 转染的细胞的高百分数和蛋白表达的高水平。载体引起蛋白表达的功能可 通过调整电荷比和剂量最佳化。

表15         条件     转染效率 (阈值以上计数)     表达水平   (平均FI强度)     阴性对照(背景)     2％       300   新的胶体-GFP质粒-孔1     75％       1800   新的胶体-GFP质粒-孔2     82％       2100

据认为滑膜细胞与类风湿性关节炎的发病机理有关  (见例如，Pap T， Gay RE，Gay S.2000.Curr Opin Rheumatol 2000 May；12(3)：205-10； Haidi Zhang，Yiping Yang，Jennifer L. Horton，Elena B.Samoilova， Thomas A.Judge，Laurence A.Turka，James M.Wilson，和Youhai Chen.1997.J.Clin.Invest.Volume 100，Number 8，October 1951-1957； Yao Q，Glorioso JC，Evans CH，Robbins PD，等人2000.J Gene Med 2000 May-Jun；2(3)：210-9；Evans CH，Rediske JJ，Abramson SB，Robbins PD.1999.关于关节炎和相关疾病的基因治疗的第一次国际会议Bethesda， MD，USA，2-3 December 1998.Mol Med Today Apr；5(4)：148-51；Nita I，Ghivizzani SC，Galea-Lauri J，Bandara G，Georgescu HI，Robbins PD， Evans CH.1996.Arthritis Rheum May；39(5)：820-8.Firestein GS，Yeo M， Zvaifler NJ.1995.J Clin Invest.1995 Sep；96(3)：1631-8)。这样，在本发 明的优选实施方案中，将滑膜细胞作为用基因治疗方法治疗类风湿性关节 炎的靶。因此地，本发明考虑用基因疗法治疗类风湿性关节炎的方法，其 中将包括治疗基因的本发明载体以有效量对患者给药，且其中所述治疗性 基因被优先地递送到滑膜细胞。可以通过研究该疾病的一或多种症状的改 善确定效果。有益地，体内效果可以使用对规定的临床终点的测定，该终 点是类风湿性关节炎的进程或程度所特征性。给药的确切剂量依赖于多种 因素，包括患者的年龄，体重和性别的，以及要治疗的病症的严重程度。 这种给药可以是全身性给药或通过将载体直接注射到受类风湿性关节炎影 响的组织或体腔中进行。也可以将载体与可接受的药物载体(Carrier)结 合给药。适宜的药物载体的选择对本领域技术人员来说是显而易见的。 实施例56.带有RGD肽的胶体载体-向人滑膜细胞的基因送递以及通过 该细胞的表达。

从研究说明使用暴露于表面的配体可得到进一步的改进，由此将RGD 肽结合进新的胶体载体中。在不同的电荷比下制备具有和没有RGD肽的 复合物，并如实施例55中的描述测定对RA 1911细胞的转染。结果见图 30。结果表示配体的加入降低了基因表达对阳离子表面电荷的依赖性。在 电荷比0.4下表面电荷源自于复合物中负电荷的过量，而当此电荷比的胶 体载体含有RGD配体时，载体与没有配体的载体保持同样的活性，且具 有供给正电荷的电荷比。使用根据本发明制备的缀合到PEG修饰的多聚阳 离子试剂上的RGD肽配体制备的新胶体，得到相似的结果。当胶体制剂 是用或不用RGD肽配体制备的时，表达依赖于配体的存在。

通过如上所述的代表性的实施方案已经将本发明广泛地公开和说明。 本领域技术人员将认识到在没有离开本发明的精神和范围的情况下，可对 本发明进行各种改变。

                     发明背景