一、技术领域
[0001] 本
发明涉及一种蜂毒的分离纯化方法，具体地说是一种蜂毒的精制方法。二、背景技术
[0002] 蜂毒是工蜂腺体分泌出来的一种具有芳香气味的毒液，储存于
毒囊中，当工蜂攻击其它物种时由尾部蛰针排出，它是一种复杂的混合物，其化学组成复杂，主要分为多肽，大分子量的酶类，小分子量的胺类等物质，肽类主要包括蜂毒素(约占蜂毒干重的50％)，蜂毒明肽，MCD肽，心脏肽，安度肽，组胺肽等，酶类包括55种以上的酶类物质，其中磷脂酶A2(简称PLA2，平均分子量14500)是受蜂蜇之后产生过敏反应的主要物质，胺类包括组织胺、儿茶酚胺等其它活性胺类物质，胺类与受蜂蜇产生
疼痛有关。
[0003] 蜂毒在民间用于医疗保健历史悠久，现代研究证实，蜂毒具有抗炎和
镇痛作用，用于
治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎，强直性脊椎炎等风湿性
疾病，周围神经炎肌神经痛等疾病有确切的疗效，然而蜂毒中大分子量的酶类物质容易造成过敏，小分子量的胺类物质容易造成疼痛，极大地影响了蜂毒制剂在临床上的推广使用。
[0004] CN101088514A公开了一种蜂毒的精制方法，是将粗蜂毒溶于
乙醇溶液中去除蜂毒中的蜂胶、蜂蜜等杂质，再采用溶媒萃取方法，得到精制蜂毒。先将粗蜂毒加入95％乙醇制成悬浊液，过滤去除杂质，滤液离心后去除液相，沉淀物加入无
水乙醇脱水，再将提出的沉淀物加入水于10±2℃下浸提12-15HR；浸提液用乙醇沉淀，去除乙醇水溶液，沉淀物加入0.15-0.2摩尔的氢
氧化铵与正丁醇溶液中萃取，弃除沉淀物，蒸馏萃取液，浓缩物进行
冷冻干燥即得到精制蜂毒。
[0005] CN1416827A公开了一种蜂毒的提取方法。该发明所述的方法如下：将活体大胡蜂剪去羽翅置于有密封盖的容器内，加入40％以上浓度的乙醇水溶液或者40℃以上的食用酒，使活体大胡蜂完全浸泡于其中，将容器加盖密封，静置至少3天，取其容器内下部的乳白色液体，过滤。
[0006] CN101455287A公开了一种
蜂毒肽的分离提纯方法，是将粗蜂毒用水浸洗，滤液用乙醇沉淀，沉淀物用
氢氧化铵和正丁醇萃取，萃取液以丙
酮沉淀，使沉淀物溶于脲的
醋酸盐缓冲液A中，在离子交换柱上作洗脱层析，柱下收集溶血活性最强吸收峰V的层析馏分浓缩，浓缩液经葡聚糖凝胶G-10柱脱盐，丙酮沉淀，再溶解、脱盐沉淀处理，沉淀物溶于醋酸盐缓冲液B中，在葡聚糖凝胶G-25柱上以缓冲B液作梯度洗脱，柱下收集吸收峰时层析馏分浓缩、脱盐冷冻干燥即得到
电泳级蜂毒肽。
[0007] CN1088215A公开了一种快速从粗蜂毒中分离蜂肽的方法，将粗蜂毒溶解在蒸馏水中，使用
超滤膜和
透析袋对蜂毒进行分离、纯化。三、发明内容
[0008] 本发明旨在提供临床注射用的精制蜂毒，所要解决的技术问题是尽可能多地除去蜂毒中的酶和
生物胺类。
[0009] 本精制方法包括蜂毒粗品的制备和蜂毒粗品的纯化，具体步骤如下：
[0010] 1、溶解：取蜂毒加5-10倍重量的去离子水溶解后高速离心(3000rpm)10-15分钟，倾出上清液，包括棕灰色残渣内的残留物再加去离子水溶解、高速离心后过滤分离，合并水相，备用。高速离心的作用是使油脂状杂质与残渣分离，转移并漂浮在水相的表面。
[0011] 2、沉淀：向上述水相中加入1-3倍体积的丙酮，于
温度≤-8℃条件下静置至沉淀完全(实验表明不少于10小时)，倾出上清液，向沉淀物中再加入丙酮并捣碎，过滤分离，沉淀物挥去丙酮便得到蜂毒粗品。
[0012] 实验表明，要使以蜂毒素为主的肽类沉淀完全(≥99％)，丙酮与水溶液的体积比要≥1，取1∶1为佳，这样可节省丙酮用量。
[0013] 3、纯化：用浓度0.08-0.12mol/L醋
酸溶液溶解蜂毒粗品，上葡聚糖凝胶G50层析柱，以0.08-0.12mol/L醋酸溶液洗脱，并用UV-3000紫外检测器在280nm
波长下进行在线检测，当第三峰出现时开始收集，至第三峰下降到100mV停止收集。向洗脱液中加入
活性炭，缓慢搅拌0.5-1小时，过滤分离，滤液冷冻干燥，得精制蜂毒。
[0014] 实验表明葡聚糖凝胶G50可有效去除大分子量的PLA2和HAase(透明质酸酶，分子量45000)等酶类
蛋白质，又可去除小分子量的胺类物质。活性炭的作用不仅是脱色，同时可有效去除内毒素，活性炭的加入量为洗脱液
质量的0.02-0.05％。
[0015] 蜂毒中大分子量物质约占蜂毒干重的16％左右，通过柱色谱分离，大分子量物质含量＜1.5％，蜂毒素含量≥76％(粗品中蜂毒素含量45％左右)，本精制蜂毒可直接加工供临床注射用的
冻干制剂。四、
附图说明
[0016] 图1是柱层析时紫外在线检测图谱。五、具体实施方式
[0018] (一)蜂毒粗品的制备
[0019] 1、溶解
[0020] 取蜂毒加入8倍重量的去离子水溶解，高速离心(3000rpm)12分钟，倾出上清液，向残留物中再加去离子水(同第一次加水量)同法操作，，高速离心后过滤分离，合并水相，备用。
[0021] 2、沉淀：
[0022] 向上述水相中加入1倍体积的丙酮，于温度-10℃下静置12小时，倾去上清液，向沉淀物中再加入丙酮并捣碎沉淀物，过滤，沉淀物低温挥去丙酮，得蜂毒粗品。
[0023] (二)粗品的精制
[0024] 3、用0.1mol/L醋酸 溶液溶解 蜂毒粗品，上葡聚糖 凝胶G50层析 柱[(2.0-10.0cm)×100cm]，以0.1mol/L醋酸溶液洗脱，流速5-30mL/min，并用UV-3000紫外检测器在280nm波长下进行在线检测，当第三峰出现时开始收集，至第三峰下降到100mV停止收集，向洗脱液中加入适量活性炭，缓慢搅拌1h，过滤，滤液冷冻干燥，得精制蜂毒。经测定，蜂毒素含量79.56％，大分子物质含量1.29％。
[0025] 蜂毒素的含量按《中国药典》2010年版一部附录VID规定的高效液相色谱法测定。
[0026] 大分子物质含量用高效液相色谱法测定，测定条件如下：
[0027] 对照品：核糖核酸酶A(分子量13700)。由中国药品生物制品检定所提供。
[0028] 色谱柱：TSK gel G3000pw凝胶色谱柱(7.5mm×300mm)。日本TOSOH。
[0029] 流动相：三氟醋酸-乙腈-水
混合液，混合重量比为0.025∶30∶70，理论板数按核糖核酸酶A峰计不低于1500。
[0030] 柱温：30℃。
[0031] 流速：0.7mL/min。
[0032] 检测波长：214nm。
[0033] (三)冻干制剂
[0034] 取甘露醇40g，加入注射用水使溶解，加活性炭适量，加热至沸15分钟，滤过，滤液冷至室温，加入精制蜂毒0.35g(以蜂毒素计)，搅拌，无菌滤过，定量罐装制成1000瓶(规格0.35mg/瓶)或500瓶(规格0.7mg/瓶)，冷冻干燥，即得。
