一.技术领域

本发明猪II型圆环病毒(PCV-2)重组腺病毒及疫苗属于生物技术高科技领域， 目的用于加强猪对猪II型圆环病毒的免疫保护作用及减少猪场的经济损失。

二、技术背景

重组腺病毒基因工程技术在人类的基因治疗方面已经得到了较为广泛的应用，很 多应用于人类基因治疗的重组腺病毒已经进入临床实验三期阶段。重组腺病毒具有宿 主范围广，感染细胞种类多，可以表达人源和非人源蛋白，而且不会插入宿主染色体， 回复突变率低，可以复制到很高的滴度等特点。ORF2编码的核衣壳蛋白(Cap蛋白)， 是PCV-2的主要结构蛋白，分子量28-36KD。PCV-2不同分离株Cap蛋白基因变异 性较大，同源性仅为65％，这说明病毒的基因型是由Cap蛋白决定的。多肽扫描 (Pepscan)显示，PCV-1与PCV-2的Cap蛋白上存在共同的抗原决定簇，但血清学 却显示它们的Cap蛋白没有抗原交叉性，即PCV-2的Cap蛋白的抗体(或抗原)不 能与PCV-1的Cap蛋白抗原(或抗体)发生反应。通过多肽扫描分析在Cap蛋白中 已经鉴定出了几个型特异的表位。研究表明ORF2编码蛋白的免疫原性优于ORF1编 码蛋白，能诱导产生较强的抗体反应，ORF2编码蛋白亚单位疫苗的免疫效果也优于 该基因疫苗。因此把ORF2基因引入到重组腺病毒中，构建重组腺病毒基因工程疫苗。

三、发明内容

技术问题  本发明的目的是研制一种能够有效控制猪II型圆环病毒(PCV-2)的重 组腺病毒及疫苗，使在当前PCV-2难以防治和大面积发生的情况下对该病的防制有新 的突破。

技术方案  本发明的实施方案如下：

猪II型圆环病毒重组腺病毒，其特征在于，重组腺病毒rAd-Cap在分类上属于： 腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病毒种(Human adenovirus)，该重组腺病毒可以对目的蛋白进行有效的表达，用该重组腺病毒感染动 物后不出现临床症状，因此可以用来在细胞和动物体内表达抗原蛋白。该重组腺病毒 已在中国科学院武汉病毒研究所进行保藏，保藏日期：2004年12月8日，保藏号为 IVCAS6.0199。

上述猪II型圆环病毒重组腺病毒，是通过以下方法构建而成的：

(1)Cap的蛋白基因的扩增、克隆以GenBank中PCV2-TJ(序号AY181946)毒 株基因序列为模板，用软件Primer Premier 5.0设计一对引物，在两条引物的5’ 端分别加入KpnI和HindIII酶切位点。引物1：5’TTC  ggT ACC AgC TAT gAC gTA TCC AAg 3’引物2：5’gCC AAg CTT TCA CTT CgT CCT ggT TTT 3’。该引物 扩增基因片段大小为751bp。基因序列见附件1

以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增 出了PCV-2的Cap蛋白全基因。通过这两个设计的酶切位点，把Cap基因克隆入穿梭 载体pShuttle-CMV中，然后通过酶切和PCR鉴定，获得含有Cap基因的穿梭载体 pSH-ORF2；

(2)含有ORF2基因的穿梭载体pSH-ORF2与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同 源重组  鉴定好的含有ORF2基因的穿梭载体pSH-ORF2经酶切线性化后与腺病毒骨架 载体pAdEasy-1通过电转化方法转化入大肠杆菌菌株BJ5183中，在大肠杆菌重组酶的 作用下，在穿梭载体和骨架载体之间发生同源重组，实现了把外源基因转入腺病毒骨 架载体，经卡那霉素筛选和酶切鉴定获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒；

(3)重组腺病毒的获得  鉴定好的重组腺病毒质粒通过阳离子脂质体法转染 HEK293-A细胞(从Invitrogen公司购买)，重组腺病毒质粒在293细胞内包装成完整 的重组病毒rAd-Cap。

用上述猪II型圆环病毒重组腺病毒制成的疫苗：

将纯化的重组腺病毒在HEK293-A细胞上连续传代20代，检测其猪II型圆环病毒 Cap蛋白基因的转录与表达情况，证明PCV-2 Cap蛋白表达稳定。重组腺病毒的毒 价稳定在1010TCID50/1.0ml以上。

在扩大培养过程中取用保存rAd-Cap重组腺病毒按104TCID50接种长成单层的 HEK293-A细胞。当细胞病变达70-90％时收毒，经反复冻融一次即可获得PCV-2重组 腺病毒疫苗。

有益效果

本发明首次提出了用腺病毒载体构建PCV-2重组腺病毒，该重组腺病毒将改变 PCV-2没有疫苗可以预防的尴尬处境，为PCV-2的基因工程疫苗的研究进行了大胆和 有益的尝试。该重组疫苗具有在动物机体细胞中一过性复制的特点，因此具有灭活疫 苗的安全性，而且使PCV-2Cap蛋白获得了正确表达，将会改变PCV-2感染猪后中和 抗体产生量少而且慢的特点。因为该重组腺病毒疫苗采用的是人腺病毒血清5型载 体，对人、猪等动物没有致病性，容易通过安全性评价。

试验证明，本发明构建的PCV-2重组腺病毒对外源蛋白表达稳定，病毒效价稳定， 种毒的毒价稳定在1010TCID50/1.0ml以上。其疫苗通过小鼠免疫试验证明了该重组腺 病毒产生了针对PCV-2的中和抗体，其中和抗体效价为1∶16。

重组腺病毒对哺乳动物不致病，其可以通过多种途径对动物进行感染，能够改变 常规免疫中耗费大量的人力、物力和对动物造成应激等情况，这在重组苗中是非常重 要的。利用该重组腺病毒免疫小鼠获得了针对PCV-2的特异性中和抗体，该抗体在体 外可以中和PCV-2。

重组腺病毒能够对猪II型圆环病毒Cap蛋白进行正确的表达，而且其表达量有所 提高，因此用该重组腺病毒进行免疫，可以促进猪体尽早产生针对Cap蛋白的抗体， 因为该抗体具有中和活性，所以可以有效的抵抗外源猪II型圆环病毒的侵袭，改变猪 II型圆环病毒目前防疫的局面。

四、附图说明

图1PCV-2 ORF2基因克隆入穿梭载体示意图

图2含ORF2基因的穿梭载体与腺病毒的骨架载体的同源重组和获得重组腺病毒的示意图

图3PCV2的PCR扩增产物电泳图。

M：标准分子量100bp DNA Ladder；泳道1：PCV-2的PCR产物

图4重组质粒pSH-ORF2的PCR及KpnI/HindIII双酶切鉴定电泳图

M：标准分子量100bp DNA Ladder；泳道1：质粒pShuttle-CMV的PCR产物 泳道2：重组质粒pSH-ORF2的PCR产物；泳道3：PCV-2的PCR产物 泳道4：重组质粒pSH-ORF2的KpnI/HindIII双酶切产物

图5重组质粒pAd-Cap的PCR及Pac I酶切鉴定1％琼脂糖凝胶电泳图

M：标准分子量100bp DNA Ladder；泳道1：质粒pAd的PCR产物；泳道2：重组质粒pAd-Cap 的PCR产物；泳道3：PCV-2的PCR产物；泳道4：重组质粒pAd-Cap的Pac I酶切产物

图6重组腺病毒RT-PCR电泳图

M：标准分子量100bp DNA Ladder；泳道1：正常HEK-293A细胞的RT-PCR产物 泳道2：接种病毒的HEK-293A细胞RT-PCR产物；泳道3：PCV-2的PCR产物

图7重组腺病毒的Western-blot鉴定

1正常的HEK-293细胞；2接种重组腺病毒的HEK-293细胞

图8IPMA的鉴定结果(200×)

A正常的HEK-293细胞；B接种重组腺病毒的HEK-293细胞

五、具体实施方式：

1基因工程体—PCV-2重组腺病毒(rAd-Cap)的构建

1.1Cap蛋白基因的扩增：以GenBank中PCV2-TJ(序号AY181946)毒株基因序列 为模板，用软件Primer Premier 5.0设计一对引物，在两条引物的5’端分别加入Kpn I和HindIII酶切位点。引物1：5’TTC  ggT ACC AgC TAT gAC gTA TCC AAg 3’引物 2：5’gCC  AAg CTT TCA CTT CgT CCT ggT TTT 3’。该引物预期扩增基因片段大小 为751bp。

1.2DNA的提取：将PCV2-PK15细胞培养物反复冻融三次后移入1.5ml的离心管中， 12000转离心5min，取上清；加入等体积的氯仿，混匀，12000rpm离心10min，取 上清，反复抽提三次；加入终浓度为50mg/ml的蛋白酶K和终浓度为1％的SDS，55 ℃作用至澄清；然后分别用等体积的酚、酚∶氯仿(1∶1)、氯仿抽提，取上清；加 入1％体积的3M的乙酸钠(PH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃过夜或-70℃冷冻 两小时；12000rpm离心20min，弃上清，干燥沉淀约5min，加入20-30ul的灭菌双蒸 水溶解沉淀，获得病毒DNA模板，-20℃冻存备用。

1.3PCR：反应体系为：上下游引物各1.0μl(浓度50pmol/l)MgCl2(25mM)3.0μl； dNTP(2.5mM)4.0μl；10×buffer 5.0μl；病毒DNA模板6.0μl；Taq酶(5u/μl) 0.3μl；加灭菌双蒸水至50μl。循环参数：95℃，预变性12min；再以95℃，40s、 58℃，40s、72℃，1min、35次循环；最后72℃作用10min，取PCR产物进行1％琼脂 糖凝胶电泳，获得目的基因条带，见图3。

1.4重组质粒pSH-ORF2的构建与鉴定：利用双酶切位点(KpnI/HindIII)将外源片段 克隆至转移载体pShuttle-CMV(从Invitrogen公司购买)中，构建好的重组质粒用 PCR、KpnI/HindIII双酶切及测序分析进行鉴定，见图4，构建成功的重组质粒命名 为pSH-ORF2。

1.5大肠杆菌BJ5183电转化感受态细菌的制备  在链霉素(30μg/ml)抗性平板上挑 取一个新鲜的BJ5183(从Invitrogen购买)菌落接种于含30μg/ml链霉素的10ml LB 培养基中，37℃ 200rpm过夜振荡培养；第二天按1/1000体积接种于一新的含链霉 素的LB培养基中，振荡培养，使其A550≈0.8，培养物置冰浴上1.0h；4℃ 3000rpm 离心10min；用初始菌液体积的无菌冰冷的WB液重悬细胞；(WB＝10％超纯甘油，90％ 蒸馏水v/v)；3000rpm离心30min；再一次用初始体积的WB液重悬菌体后离心； 3000rpm离心30min后倾去多余的上清，剩余1/500体积的WB液重悬菌体，分装40μl 每管，-70℃保存。

1.6 pSH-ORF2与pAdEasy-1共转化BJ5183细菌  取出-70℃保存的BJ5183电转化 感受态细菌两管，在冰浴上缓慢融化；取纯化的pAdEasy-1载体和线性化的pSH-ORF2 质粒在一灭菌500μl的离心管中混合；在两管BJ5183电转化感受态细菌分别加入线 性化的pSH-ORF2质粒和pAdEasy-1载体的混合物及线性化pSH-ORF2作为对照；把加 入质粒后的BJ5183细菌转入冰冷的电极杯中，使液滴悬浮在电极杯金属板中央；立 即进行电转化，电转化仪的参数设置为：2.5kV，25μF，200Ω；每转化完一管立即加 入1.0ml的室温LB溶液，并把细菌充分重悬；重悬后的细菌37℃振荡培养1.0h；分 别取重组菌涂布于三块卡那霉素抗性平板，对照菌体涂布一块平板，过夜培养，挑取 阳性菌落进行过夜培养，提取质粒，获得重组质粒。

1.7重组质粒的鉴定

1.7.1重组质粒的PCR  25.0μl的反应总体积，以提取的质粒作为模板。重组质粒 0.25μl，引物10.5μl，引物20.5μl，2.5mM dNTPs 2.0μl，25mM Mg++ 1.0μl，10×Mg++free buffer 2.5μl，rTaq酶0.25μl，加水至终体积25.0μl。PCR循环参数同ORF2基因 片段的扩增参数，见图5。

1.7.2重组质粒的单酶切  10×NE Buffer1 2.0μl，100×BSA 0.2μl，PacI 0.2μl， 重组质粒10.0μl，用无菌双蒸水补至总体积20.0μl，37℃酶切10.0h，然后进行0.8％ (g/ml)的琼脂糖凝胶电泳，可以见到正确重组的DNA条带，见图5。鉴定好的重组 质粒命名为pAd-ORF2。

1.8重组质粒的纯化  鉴定好的重组质粒pAd-ORF2转化DH5α后涂布于卡那霉素抗 性平板；挑取卡那霉素平板上的菌落接种于3.0ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基 中，振荡过夜培养；把过夜培养物按2％的体积接种于5.0ml的LB培养基中，振荡培 养，使OD600≌1.0-1.5；把5.0ml的培养物全部沉淀在1.5ml的灭菌离心管中，完 全弃去上清。质粒纯化方法按Qiagen公司质粒纯化试剂盒说明书进行，获得纯化的 重组质粒pAd-ORF2。

1.9 pAd-ORF2重组质粒的线性化  10×NE buffer1 20.0μl，100×BSA 2.0μl，PacI 1.0μl，重组质粒150.0μl，然后用双蒸水补加至总体积200.0μl。在37℃作用12.0h， 然后进行0.8％(g/ml)的琼脂糖凝胶电泳。酶切后的产物经酚：氯仿抽提，乙醇沉 淀，然后在无菌条件下用无菌双蒸水溶解，使质粒浓度达到0.1-1.0μg/μl。

1.10转染：按照脂质体转染试剂操作方法(试剂盒购自Promega公司，按试剂盒说 明书操作)，转染在24孔板上进行，在转染的前一天，在24孔板上的每一孔接种5.0 ×104个HEK293-A(人胚胎肾细胞)细胞，每一孔用营养液1.0ml，营养液含10％的新 生牛血清和1％的青霉素和链霉素；在转染的前一天，取出一管新订的TransFastTM Transfection Reagent(购自Promega公司)使之达到室温，然后加入400.0μl的室温 无核酸酶的纯水，涡漩10s重悬脂质体膜，贮存于-20℃；在转染前4h，把24孔板的 营养液更换为新的营养液；取出-20℃保存的转染试剂，使之达到室温并涡漩，如果溶 液在管的上部，可以通过离心把它沉到管底；在一个灭菌的玻璃瓶中先加入OPTI-MEM 无血清培养基1979μl，线性化重组腺病毒质粒15.0μl(约5μg)，然后加入6.0μl的 TransFastTM Transfectionreagent后立即涡漩；在室温温育混合物10-15min；从二 氧化碳温箱中取出细胞板，弃去上清；再一次快速涡漩混合物，把2.0ml的混合物加 入24孔板的12个孔中，振荡混匀，然后立即把细胞板放入二氧化碳温箱中；温育1.0h 后，轻轻加入1.0ml室温的完全生长液，把细胞放入二氧化碳温箱，每天观察细胞病 变，出现病变的细胞进行冻融，即可获得重组腺病毒。

1.11重组腺病毒的噬斑纯化：在长满单层的HEK-293A细胞的六孔细胞板上，每孔 加入600ul分别按1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀释的重组病毒和2.4ml含2％血 清的DMEM过夜；弃去上清，用预热的无菌PBS洗涤两次；每孔加入3.0ml含2％血 清、1％青链霉素和1％琼脂的预热(37℃)的DMEM营养液，使其覆盖整个细胞面，5％CO2， 37℃静置培养；挑取包含噬斑的琼脂糖块放入无菌离心管中，加入200.0μl的无菌 PBS，将琼脂块捣碎后反复冻融三次，12000rpm离心5min，收获的病毒接种于一新 的24孔细胞板中，如此反复纯化三次，即获得完整的重组病毒rAd-Cap。

1.12重组病毒的TCID50的测定：用DMEM培养基维持液将纯化后的第5、10、15和 20代rAd-Cap作10倍梯度稀释，然后分别接种于长满HEK293-A细胞单层的96孔 细胞培养板，每个稀释度接种5个孔，每孔接种100μl。同时设定两排孔加入维持液 做对照。5％CO2，37℃静置培养4天，观察病变，按Read-Muenels法，计算病毒TCID50. 结果，结果分别为1013.7/ml、1010.7/ml、1012.5/ml和1012.5/ml。

2重组腺病毒Cap蛋白表达的鉴定：

2.1RT-PCR：取出同步接种重组腺病毒的HEK-293A和正常的HEK-293A细胞各一 瓶，反复冻融三次后取适量，按TRIZOL试剂说明书提取总RNA，然后按下列方法 进行反转录：Oligo(dT)(500ug/ml)0.5μl；5×buffer 4.0μl；dNTP(10Mm)0.5μl； mRNA 14.5μl；65℃水浴10分钟后，加入0.5μl M-MLV反转录酶(200u/μl)，37℃ 水浴60分钟。PCR反应同ORF2片段的扩增，可见感染重组腺病毒的细胞出现目的条 带，见图6。

2.2间接ELISA：用8％PEG6000浓缩重组腺病毒HEK-293A细胞培养物，同时设定 正常HEK-293A细胞培养物为对照，用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至4ug/ul，每孔 100ul，37℃包被3h；PBST洗涤后，加入2％明胶37℃封闭过夜，洗涤3次；每孔加 入100ul 1∶100稀释的PCV2抗血清，37℃作用2h，洗涤3次；每孔加入100ul 1∶10000 稀释的SPA-HRP(武汉博士德公司)，37℃作用1h，洗涤5次；每孔加入100ul OPD 底物，37℃，20min；加入50μl 2M H2SO4终止反应，测定OD490值，并计算检测孔 OD490/对照孔OD490比值。重复三次，三次间接ELISA的检测孔与对照孔平均OD490 比值分别为2.715、3.686、2.368。三次的比值均大于2.1，说明接种重组腺病毒的 HEK-293A细胞中表达了Cap蛋白。。

2.3蛋白印迹  将上述提取蛋白进行SDS-PAGE电泳，转印到硝纤膜上后，10％脱脂 乳封闭过夜；加入1∶100 PCV-2抗血清室温作用2h；洗涤3次，加入1∶2000的 SPA-HRP，室温作用1.5h；充分洗涤后，加入化学发光显色液，并进行x光显影，观察 特异蛋白条带。接种重组腺病毒的HEK-293A细胞有一条明显的条带，而对照正常的 HEK-293A细胞没有，说明接毒的HEK-293A细胞中表达了Cap蛋白，见图7。

2.4免疫过氧化物酶单层细胞分析：将第5代重组腺病毒做100和1000倍稀释后接 种于长满单层的HEK-293A细胞，5％CO2、37℃培养，约24小时，弃去上清，用PBS 洗涤一次，37℃干燥45min，-20℃冷冻45min，再以冷的无水乙醇4℃固定 45min，PBS洗涤3次；加入50ul用0.5M NaCl和0.5％Tween-80 1∶20稀释的PCV-2 抗血清，37℃作用1h，0.15M NaCl和0.5％Tween-80洗涤3次；加入1∶100 SPA-HRP， 37℃作用1h，洗涤3次；加入50μl AEC底物溶液，室温作用20-30min；弃去AEC， 加入50μl的pH5.0的0.05M醋酸钠；显微镜观察，表达Cap蛋白的细胞的胞浆都 被染色，见图8。

用猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒制备疫苗，将纯化的重组腺病毒rAd-Cap在 HEK293-A细胞上连续传代20代，每5代检查重组腺病毒对Cap蛋白基因的转录与 表达情况，同时测定其TCID50，5、10、15和20代重组病毒TCID50分别为1013.7/ml、 1010.7/ml、1012.5/ml和1012.5/ml。证明PCV-2Cap蛋白表达稳定，接毒后细胞病变出 现规律。重组腺病毒的毒价稳定在1010TCID50/1.0ml左右。

在扩大培养过程中取用纯化保存的PCV-2重组腺病毒按104TCID50接种长成单层 的HEK293-A细胞。当细胞病变达70-90％时收毒，经反复冻融一次即可获得PCV-2重 组腺病毒rAd-Cap疫苗。通过小鼠免疫试验和中和试验证明了该重组腺病毒疫苗产 生了针对PCV-2的中和抗体，其中和抗体效价为1∶16。

                              序列表

<110>南京农业大学

<120>猪II型圆环病毒重组腺病毒和疫苗

<130>说明书

<140>200510038694.9

<141>2005-04-07

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>696

<212>DNA

<213>Porcine circovirus(猪圆环病毒)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(696)

<223>

<400>1

atgacgtatc caaggaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc      60

cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg     120

aaaaatggca tcttcaacac gcgcctctcc cgcaccatcg gttatactgt caaggctacc     180

acagtcagaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat ttaatattaa tgattttctt     240

cccccaggag ggggctcaaa ccccctcact gtgccctttg aatactacag aataagaaag     300

gttaaggttg aattctggcc ctgctccccg atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc     360

actgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca cagccctaac ctatgacccc     420

tatgtaaact actectcccg ccataccata ccccagccct tctcctacca ctcccgctat     480

ttcaccccca aacctgtcct tgataggaca atcgattact tccaacccaa taacaaaaga     540

aatcaactct ggctgagact acaaactact ggaaatgtag accatgtagg cctcggcact     600

gcattcgaaa acagtatata cgaccaggac tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa     660

ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaac                               696