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一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组及 试剂盒

阅读：356发布：2021-01-29

专利汇可以提供一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组及试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组及试剂盒，属于动物病学和分子生物学技术领域。该试剂盒包括SEQ ID1-6所示的引物序列，还包括10×Multi HoeStart Buffer、Super Pure dNTPs、Multi HoeStart DNA Polymerase、模板和灭菌水。本发明提供的PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒采用多重PCR扩增，为三种猪呼吸道疾病的一次检测，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。，下面是一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组及试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述多重PCR检测引物组由PCV2 PCR检测引物对、PCV3 PCR检测引物对和Mhp PCR检测引物对组成；
所述PCV2 PCR检测引物对由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成；
所述PCV3 PCR检测引物对由具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:4 所示核苷酸序列的下游引物组成；
所述Mhp PCR检测引物对由具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:6 所示核苷酸序列的下游引物组成。
2.根据权利要求1所述快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述PCV2 PCR检测引物对是依据PCV2的全基因进行设计，扩增目的片段大小为1152 bp；所述PCV3 PCR检测引物对是依据PCV3的全基因进行设计，扩增目的片段大小为395bp；所述Mhp PCR检测引物对是Mhp的全基因进行设计，扩增目的片段大小为649 bp。
3.根据权利要求1所述快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述多重PCR检测引物组在制备猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪支原体肺炎鉴别检测试剂盒的应用。
4.一种如权利要求1所述快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重PCR检测试剂盒包括具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的下游引物。
5.根据权利要求4所述快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR检测试剂盒还包括10×Multi HoeStart Buffer、Super Pure dNTPs 、Multi HoeStart DNA Polymerase 、模板和灭菌水。
6.根据权利要求4或5所述快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR检测试剂盒中， PCR反应体系为：PCR反应体系50 µL，灭菌水28 µL，10×Multi HoeStart Buffer 5 µL，Super Pure dNTPs 4 µL，25 µmol/L PCV2、PCV3和Mhp上下游引物各1 µL，Multi HoeStart DNA Polymerase 1 µL，模板6.0 µL。
7.根据权利要求6所述快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR检测试剂盒中PCR反应条件为：95℃ 预变性15 min；94℃ 变性30 s，60℃ 复性90 s，72℃ 延伸90 s，40个循环；最后72℃ 延伸10 min。
8.根据权利要求6所述快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重PCR检测试剂盒的最佳退火温度为60℃。
9.根据权利要求6所述快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:
5和SEQ ID NO: 6所示引物使用浓度为25 μmol/L。

说明书全文

一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组及试

剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于动物病学和分子生物学技术领域，具体为针对PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR的检测引物组、检测试剂盒及应用。

背景技术

[0002] 猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）为一种共价闭合、单股环状DNA病毒，是迄今发现最小动物病毒。2015年前，全球范围内仅发现PCV1和PCV2两个基因型。其中，PCV1被认为是猪肾细胞PK-15污染物，但不产生细胞病变效应，对猪无致病性。PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）主要病原，与猪皮炎和肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、增生性坏死性肺炎（PNP）和肠炎等疾病密切相关，均为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）。临床上PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪肺炎支原体(MHp)等病原体混合感染。同时，感染PCV2后还容易继发细菌感染，给养猪业造成巨大经济损失。

[0003] 猪圆环病毒3型 (Porcine circovirus type 3，PCV3)，分类上属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），根据国际病毒分类委员会(ICTV)的分类标准 PCV3为猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）的新成员。2016 年，美国首次报道从发生繁殖障碍和呼吸道疾病的3 周龄的病猪中分离到了该病毒。随后相继被波兰、韩国和中国等国家报道，并在世界范围内迅速蔓延，引起了各国的高度重视和密切关注。PCV3感染可引起猪的皮炎、肾病综合征、呼吸系统疾病、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应等，给全世界的生猪养殖造成了极大的经济损失。

[0004] 猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine, MPS)是以哮喘和气喘为主要症状的慢性呼吸道传染病，具有高度接触性、高传染性及高发病率等特征。该病主要是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的。猪肺炎支原体可以明显降低感染动物的生长率和饲料转化率，造成大量的经济损失。同时损伤被感染动物的机体免疫力，形成系统性免疫抑制，从而使被感染动物更容易感染其它病原体，大大增加了目前猪病防控及诊断的工作难度。

[0005] PCV2、PCV3和Mhp的都能引起感染猪猪呼吸道疾病，同时三者也均为免疫抑制性疾病，感染后能继发感染多种病毒或细菌性疾病，使疫情更加严重和难以诊断，给养猪业带来更加巨大的经济损失。因此，有必要建立一种能够同时快速检测PCV2、PCV3和Mhp多重PCR检测方法，为临床上及时准确地对猪呼吸道疾病进行调查和监测提供技术支持，从而有效地防控猪呼吸道疾病的发生与流行。

发明内容

[0006] 本发明的目的是解决上述技术问题，提供一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组及试剂盒，该试剂盒能够快速区分PCV2、PCV3和Mhp，灵敏感高、特异性强，从而为有效防控PCV2、PCV3和Mhp三种猪呼吸道疾病的发生和流行提供技术支持。为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测引物组，所述多重PCR检测引物组由PCV2 PCR检测引物对、PCV3 PCR检测引物对和Mhp PCR检测引物对组成；
所述PCV2 PCR检测引物对由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成；
所述PCV3 PCR检测引物对由具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:4 所示核苷酸序列的下游引物组成；
所述Mhp PCR检测引物对由具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:6 所示核苷酸序列的下游引物组成。

[0007] 优选地，所述PCV2 PCR检测引物对是依据PCV2的全基因进行设计，扩增目的片段大小为1152 bp；所述PCV3 PCR检测引物对是依据PCV3的全基因进行设计，扩增目的片段大小为395bp；所述Mhp PCR检测引物对是Mhp的全基因进行设计，扩增目的片段大小为649 bp。

[0008] 优选地，所述多重PCR检测引物组在制备猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型和猪支原体肺炎鉴别检测试剂盒的应用。

[0009] 一种如以上所述快速区分PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒，所述多重PCR检测试剂盒包括具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的下游引物。

[0010] 优选地，所述的多重PCR检测试剂盒还包括10×Multi HoeStart Buffer、Super Pure dNTPs 、Multi HoeStart DNA Polymerase 、模板和灭菌水。

[0011] 优选地，所述的多重PCR检测试剂盒中， PCR反应体系为：PCR反应体系50 µL，灭菌水28 µL，10×Multi HoeStart Buffer 5 µL，Super Pure dNTPs 4 µL，25 µmol/L PCV2、PCV3和Mhp上下游引物各1 µL，Multi HoeStart DNA Polymerase 1 µL，模板6.0 µL。

[0012] 优选地，所述的多重PCR检测试剂盒中PCR反应条件为：95℃ 预变性15 min；94℃ 变性30 s，60℃ 复性90 s，72℃ 延伸90 s，40个循环；最后72℃ 延伸10 min。

[0013] 优选地，所述多重PCR检测试剂盒的最佳退火温度为60℃。

[0014] 优选地，所述PCR检测试剂盒的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO: 6所示引物使用浓度为25 μmol/L。

[0015] 本发明的有益效果为：本发明提供的PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒采用多重PCR扩增，为三种猪呼吸道疾病的一次检测，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本发明能彻底解决PCV2、PCV3和Mhp引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场快速检测，亦适用于流行病学调查。

[0016] 本发明提供了三对针对PCV2、PCV3和Mhp的特异性引物，PCV2-P1/ PCV2-P2为PCV2特异性扩增引物组，PCV3-P1/ PCV3-P2为PCV3 特异性扩增引物组，Mhp-P1/ Mhp-P2为Mhp特异性扩增引物组，利用其制成的多重PCR检测试剂盒能快速、特异的检测出PCV2、PCV3和Mhp中的单一病毒或细菌以及三者的混合病毒和细菌，PCV2出现1152bp一个条带，PCV3出现395bp一个条带，Mhp出现649bp一个条带，PCV2、PCV3、Mhp三阳性样品出现1152bp、395bp、
649bp三个条带。

[0017] 本发明的PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒对PCV2的检测极限为1.03×10-6 µg/µL，对PCV3的检测极限为0.62×10-6 µg/µL，对Mhp的检测极限为0.7×10-6 µg/µL，表明本发明的PCV2、PCV3和Mhp的多重PCR检测试剂盒在检测PCV2、PCV3和Mhp时具有较高的灵敏度。本发明的PCV2、PCV3和Mhp PCR鉴别检测试剂盒既能缩短诊断时间、节约诊断试剂，又能降低使用成本。

[0018] 本发明提供的PCV2、PCV3和Mhp PCR鉴别检测试剂盒在6个月内检测结果一致，表明本发明PCV2、PCV3和Mhp PCR鉴别检测试剂盒具有很高的稳定性。田间试验证明本发明所得的PCV2、PCV3和Mhp PCR鉴别检测试剂盒实用性和适用性良好。附图说明

[0019] 图1是实施例目的基因的PCR扩增结果，其中M：DNA分子质量标准；1：PCV3 阳性组织样本；2：Mhp 阳性组织样本；3：PCV2 阳性组织样本；4：PCV2/PCV3/Mhp 三阳性组织样本；5：阴性对照。

[0020] 图2是实施例多重PCR检测试剂盒不同退火温度结果，其中M：DNA分子质量标准；1：50.0℃；2：50.7℃；3：51.9℃；4：53.2℃；5：54.4℃；6：55.6℃；7：56.8℃；8：58.0℃；9：59.2℃；10：60.0℃。

[0021] 图3是本发明多重PCR检测试剂盒特异性试验结果，其中M：DNA分子质量标准；1：PCV2/PCV3/Mhp三阳性组织样本；2：PPV；3：PRV；4：PBoV；5：TTV；6：大肠杆菌；7：金黄色葡萄球菌；8：副猪嗜血杆菌；9：胸膜肺炎放线杆菌；10：阴性对照。

[0022] 图4是本发明多重PCR检测试剂盒敏感性试验结果，其中M：DNA分子质量标准；1-7：pMD18-T-PCV2质粒的浓度分别为1.03×10-1µg/µL、1.03×10-2 µg/µL、1.03×10-3 µg/µL、1.03×10-4 µg/µL、1.03×10-5 µg/µL、1.03×10-6 µg/µL、1.03×10-7 µg/µL；
1-7：pMD18-T-PCV3质粒的浓度分别为0.62×10-1µg/µL、0.62×10-2µg/µL、0.62×10-3µg/µL、0.62×10-4µg/µL、0.62×10-5µg/µL、0.62×10-6µg/µL、0.62×10-7µg/µL；
1-7：pMD18-T-Mhp质粒的浓度分别为0.7×10-1 µg/µL、0.7×10-2 µg/µL、0.7×10-3 µg/µL、0.7×10-4 µg/µL、0.7×10-5 µg/µL、0.7×10-6 µg/µL、0.7×10-7 µg/µL；
8：阴性对照。

具体实施方式

[0023] 下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。实施例

[0024] 1 材料与方法1.1 病毒及临床样品
猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪博卡病毒（PBoV）、猪细环病毒（TTV）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌毒株或菌株均由本实验室保存提供。临床样品采自广西各地养猪场疑似感染猪圆环病毒和猪肺炎支原体的濒死猪、病死猪或剖杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏和肾脏等），剪取组织样品约0.5-1.0g，置于灭菌研钵中，充分研磨成匀浆，加入灭菌的1mol/LPBS溶液配成1：5乳悬液，反复冻融3次。10 000 r/min离心5min，收集上清液，转入1.5mL离心管中编号供DNA抽提或者-20℃保存备用。

[0025] 1.2 主要试剂pMD18-T Vector、BamHⅠ、HindⅢ、DL600 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、DNA凝胶回收试剂盒（DNA Gel Extraction Kit）均为大连宝生物工程有限公司产品；病毒基因组RNA/DNA快速抽提试剂盒为Axygen生物科技有限公司产品；Multi PCR Kit和质粒小量抽提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；E.coli DH5α菌种，由本实验室保存。

[0026] 1.3 引物的设计与合成根据GenBank上登录的PCV2、PCV3和Mhp的全基因组序列，利用Meg Align(DNA Star)，Primer Premier 7.0 软件针对PCV2、PCV3和Mhp的保守区域分别设计一对特异性引物PCV2-P1/ PCV2-P2、PCV3-P1/ PCV3-P2和Mhp-P1/Mhp-P2。PCV2上游引物PCV2-P1：5’-GCTGGCTGAACTTTTGAAA-3’，PCV2下游引物PCV2-P2：5’-TCGTCCACCCCCGCCACC-3’，PCR扩增目的片段大小为1152bp。PCV3上游引物PCV3-P1：5’-TCCGGAGGGAAAGCCCGA-3’，PCV3下游引物PCV3-P2：5’-TCTTCTCCGCAACTTC-3’，PCR扩增目的片段大小为395bp。Mhp上游引物Mhp-P1：
5’-TCAAAGAAGGAGCCTTCAAGCT-3’；Mhp下游引物Mhp-P2：5’-AGTGACTTTTGCCACCAACTAA-3’，PCR扩增目的片段大小为649bp。引物由大连宝生物工程有限公司合成。

[0027] 1.4病毒/细菌DNA的提取将PRV、PPV 病毒液、PBoV和TTV阳性组织病料、大肠杆菌菌液、金黄色葡萄球菌菌液、副猪嗜血杆菌菌液、胸膜肺炎放线杆菌菌液及处理好的组织病料，按照AxyPrep Body Fluid Viral RNA/DNA Miniprep Kit使用说明书进行DNA提取，所获得的DNA 用于下一步的PCR反应。

[0028] 1.5聚合酶链式反应（PCR）PCR反应体系50 µL，灭菌水28 µL，10×Multi HoeStart Buffer 5 µL，Super Pure dNTPs 4 µL，25 µmol/L PCV2、PCV3和Mhp上下游引物各1 µL，Multi HoeStart DNA Polymerase 1 µL，模板6.0 µL。按照下列条件进行扩增：95℃ 预变性15 min；94℃ 变性30 s，60℃ 复性90 s，72℃ 延伸90 s，40个循环；最后72℃ 延伸10 min。取扩增产物10 µL于
10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，并观察结果。

[0029] 1.6 特异性试验以提取的PRV、PPV、PBoV、TTV、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌DNA以及PCV2/PCV3/Mhp混合阳性材料DNA为模板，用所建立的方法进行扩增，以验证该方法的特异性。

[0030] 1.7 敏感性试验1.7.1 PCV2、PCV3、Mhp阳性模板的制备
将PCV2、PCV3和Mhp PCR产物进行胶回收纯化后，克隆至pMD18-T vector中，转化DH5a感受态细胞中，取100 µL菌液均匀的涂布于LA平板上，12-18 h后挑阳性菌落进LA液体培养基进行扩大培养，抽提质粒并酶切鉴定正确后，将阳性菌液送往上海生物工程有限公司测序，将测序结果放在NCBI上进行Blast确定为PCV2、PCV3和Mhp特异性片段。最后，测定阳性质粒浓度，按照1：1：1将三种质粒混合。

[0031] 1.7.2多重PCR敏感性试验将经测定并混合后的三种质粒做连续10倍系列稀释后，将各稀释后的不同浓度的混合质粒作为PCR反应模板，在相同条件下进行PCR反应，测定所建立的多重 PCR检测方法的敏感性。

[0032] 1.8 多重PCR重复性试验以建立的多重PCR检测方法，对PCV2/PCV3/Mhp三阳性样品重复检测3次，以验证结果的可靠性。

[0033] 2 结果2.1 PCR扩增
以PCV2阳性DNA、PCV3阳性DNA、Mhp阳性DNA及PCV2/PCV3/Mhp三阳性混合DNA为模板，按照1.5中的反应体系和反应程序进行多重PCR反应。电泳结果显示（见图1），所建立的多重PCR方法能够检测出PCV2阳性、PCV3阳性、Mhp阳性及PCV2/PCV3/Mhp三阳性材料，扩增出PCV2目的基因约1152 bp，扩增出PCV3目的基因约395 bp，扩增出Mhp目的基因约649 bp，均与预期目的片段大小相符。

[0034] 2.2 最佳退火温度为获得该反应最佳扩增效果，在50-60℃的温度范围内设10个温度梯度进行多重PCR扩增，发现60℃ 时三个条带均最明显，确定了最佳退火温度为60℃（见图2）。

[0035] 2.3特异性试验结果试验结果显示（见图3），本研究建立的PCR鉴别检测方法能特异地检测出PCV2、PCV3、Mhp或者同时检测出PCV2/PCV3/Mhp，而对PPV、PRV、PBoV、TTV、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的检测结果均无条带，表明所建立的方法具有较好的特异性。

[0036] 2.4 敏感性试验经测定pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-Mhp质粒的浓度分别为3.1×100µg/µL、1.86×100µg/µL和2.1×100µg/µL，将三种质粒按照1：1：1进行混匀，混匀后三种质粒的浓度分别为1.03×100 µg/µL、0.62×100µg/µL和0.7×100 µg/µL。将混合后的质粒作为起始浓度进行连续10倍稀释至10-7，然后按照建立的PCR方法进行检测。结果显示，该多重PCR检测方法对PCV2、PCV3和Mhp的检测极限分别为1.03×10-6 µg/µL、0.62×10-6 µg/µL和0.7×
10-6 µg/µL。（见图4）。

[0037] 2.5多重PCR重复性试验结果以建立的多重PCR检测方法，重复3次，结果在1152bp、395 bp和649bp处，均得到了清晰可见的目的条带，说明建立的多重PCR检测方法具有很好的稳定性。

[0038] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

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