猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型二价灭活疫苗及其制备方法
阅读：457发布：2020-05-11
专利汇可以提供猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型二价灭活疫苗及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种猪 圆环病毒 2型与3型二价灭活 疫苗 及其制备方法，含有灭活的 猪圆环病毒 2型和3型以及疫苗佐剂；其中猪圆环病毒2型与3型的含量分别至少为105.5TCID50/头份。本发明的二价灭活疫苗有以下优点，猪圆环病毒2型免疫效果与市场上的商品苗相当或更佳，市场上无猪圆环病毒3型商品苗，两种 抗原 之间无相互干扰；免疫持续期长，效 力 持久；只需一次免疫，降低了成本，也减少了动物的应激反应。本发明的二价灭活疫苗可以用于同时 预防 猪圆环病毒病2型与3型。，下面是猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型二价灭活疫苗及其制备方法专利的具体信息内容。
1. 一种猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的二价灭活疫苗，其特征在于，含有灭活的猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型、疫苗佐剂；其中猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型含量分别≥105.5TCID50/头份；其中所述的猪圆环病毒2型为HEB18株，保藏号为CGMCC No.13854；其中所述的猪圆环病毒3型为BJ23株，保藏号为CGMCC No.13855。
2.根据权利要求1所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型与3型含量分别为106.0TCID50/头份。
3. 根据权利要求1或2所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、Gel 01、蜂胶、ISA206和ISA760VG中的一种或几种。
4. 根据权利要求3所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为Gel 01、ISA206、ISA760VG、。
5.根据权利要求4所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为ISA206。
6. 根据权利要求1所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述的二价灭活疫苗含有猪圆环病毒2型与3型各106.0TCID50/头份，ISA206 50% V/V。
7.一种制备权利要求1-6中任一项所述的猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型的二价灭活疫苗的方法，其特征在于，包含以下步骤：分别培养猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型，将获得的猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型进行灭活、浓缩，获得猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型抗原，将上述两种抗原成分按比例混合，辅以疫苗佐剂制备成二价灭活疫苗。
8.根据权利要求7所述的二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型分别浓缩至含量至少为105.5TCID50/头份。
9.根据权利要求7所述的二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型分别浓缩至含量为106.0TCID50/头份。
10. 根据权利要求7所述的二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的疫苗佐剂为ISA206，含量为疫苗总量的50% V/V。
猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型二价灭活疫苗及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种猪圆环病毒2型与3型二价灭活疫苗及其制备方法，属于兽用疫苗领域。
[0002]
背景技术
[0003] 猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）是迄今发现的最小的动物病毒之一，直径在12-23nm。基于猪圆环病毒的核苷酸序列、致病性以及抗原性的差异，分为三个亚型，分别是PCV-1、PCV-2和PCV-3三个基因型，其中PCV-1被认为无致病性，PCV2基因组大小分1767和1768bp两种，目前报道PCV-2基因型主要分为2a、2b、2c、2d与2e五种亚型，PCV3基因组大小为2000bp，PCV-2与PCV-3则可造成不同日龄猪只的临床感染。PCV-2与PCV-3是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS）、PDNS（猪皮炎与肾病综合征）、PNP（增生性坏死性肺炎）以及PRDC（猪呼吸道疾病综合征）的主要病原。
PMWS最早发现于加拿大（1991），很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行，此外，繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV-2和PCV-3感染有重要关联。PCV-2及相关的猪病，死亡率大约为10%-30%之间，疫情严重的猪场死淘率有时高达40%，给养猪业造成巨大的经济损失。究其原因，PCV-2感染可引起猪的免疫抑制，进而降低了机体对其它各类病原的抵抗力，常见的混合感染病原包括PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒）、PRV(猪伪狂犬病毒)、PPV（猪细小病毒）、猪肺炎支原体等病，其中二重感染或三重感染也较常见，而病猪的病死率也会大大提高至大约25%-40%。
PMWS最早发现于加拿大（1991），很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行，此外，繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV-2和PCV-3感染有重要关联。PCV-2及相关的猪病，死亡率大约为10%-30%之间，疫情严重的猪场死淘率有时高达40%，给养猪业造成巨大的经济损失。究其原因，PCV-2感染可引起猪的免疫抑制，进而降低了机体对其它各类病原的抵抗力，常见的混合感染病原包括PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒）、PRV(猪伪狂犬病毒)、PPV（猪细小病毒）、猪肺炎支原体等病，其中二重感染或三重感染也较常见，而病猪的病死率也会大大提高至大约25%-40%。
[0004] 目前市场上主要有10种商品化的PCV-2疫苗，其中德国勃林格殷格翰动物保健公司的PCV-2疫苗，原理是将PCV-2基因组中编码免疫原性蛋白的ORF2片段插入到杆状病毒载体中，进而转导昆虫细胞获得重组杆状病毒，即可快速大量获得具备免疫原性的PCV-2核衣壳蛋白，再将其制备成疫苗，大量田间试验表明该类疫苗可为仔猪提供良好的免疫保护；另一类是青岛易邦生物工程有限公司的猪圆环病毒II型基因工程亚单位疫苗，原理是应用原核表达系统对PCV-2的核衣壳蛋白进行表达，田间试验表明该类疫苗可为仔猪提供较好的免疫保护；另一类是PCV-2灭活疫苗，目前市场上有7个不同毒株的PCV-2全病毒灭活疫苗。但值得注意的是，上述PCV2疫苗皆为基于PCV2a或PCV2b亚型毒株开发生产，近年来的流行病学调查发现PCV2d逐渐成为中国田间流行的主要优势亚型毒株，而市场上目前尚无针对PCV2d亚型毒株的疫苗。
[0005] 目前还没有国产的或国外注册的PCV-3疫苗以及PCV-2与PCV-3二价疫苗。
[0006]
发明内容
[0007] 有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪圆环病毒2型与3型二价灭活疫苗及其制备方法，用于同时预防猪圆环病毒2型与3型。
[0008] 技术方法一种猪圆环病毒2型与3型二价灭活疫苗，含有灭活的猪圆环病毒2型与3型、疫苗佐剂；
其中，猪圆环病毒2型与3型含量分别至少为105.5TCID50/头份。
其中，猪圆环病毒2型与3型含量分别至少为105.5TCID50/头份。
[0009] 优选地，本发明所述的猪圆环病毒2型与3型含量分别为106.0TCID50/头份。
[0011] 优选地，本发明所述的疫苗佐剂为卡波姆（Carbomer）、Gel 01、ISA206、ISA760VG。
[0012] 优选地，本发明所述的疫苗佐剂为ISA206。
[0013] 最优选地，本发明所述的二价灭活疫苗为含有猪圆环病毒2型与3型各106.0TCID50/头份，ISA206 50% V/V。
[0014] 本发明的另一目的在于提供一种制备猪圆环病毒2型与3型二价灭活疫苗的方法，包含以下步骤：分别培养猪圆环病毒2型与3型，将获得的猪圆环病毒2型与3型进行灭活、浓缩，获得猪圆环病毒2型与3型抗原，将上述两种抗原成分按比例混合，辅以疫苗佐剂制备成二价灭活疫苗。
[0015] 优选地，本发明所述的二价灭活疫苗的制备方法中，所述的猪圆环病毒2型与3型5.5
分别至少10 TCID50/头份。
分别至少10 TCID50/头份。
[0016] 优选地，本发明所述的二价灭活疫苗的制备方法中，所述的猪圆环病毒2型与3型浓缩至含量分别为106.0TCID50/头份。
[0017] 优选地，本发明所述的二价灭活疫苗的制备方法中，所述的疫苗佐剂为ISA206，含量为疫苗总量的50% V/V。
[0018] 有上述技术方案及本发明的后续实施例可以看出，本发明的二价灭活疫苗，无论是从攻毒保护效果上，还是从血清学抗体水平上来看，其免疫效果都较市场上的商品单苗之和更佳，两种抗原之间无相互干扰；
其次，本发明的二价灭活疫苗的免疫持续期长，效力持久，PCV2部分至少为120d，PCV3部分至少为150d，因此，可以获得更长的免疫周期；
最后，本发明的二价灭活疫苗只需一次免疫，即可达到分别免疫单苗的效果，且省去PCV2单苗免疫的复杂程序，耗时少，费力少，既降低了成本，也减少了动物的应激反应。
其次，本发明的二价灭活疫苗的免疫持续期长，效力持久，PCV2部分至少为120d，PCV3部分至少为150d，因此，可以获得更长的免疫周期；
最后，本发明的二价灭活疫苗只需一次免疫，即可达到分别免疫单苗的效果，且省去PCV2单苗免疫的复杂程序，耗时少，费力少，既降低了成本，也减少了动物的应激反应。
[0020] 图1为本发明的二价灭活疫苗制备方法流程图。
[0021] 毒株来源说明本发明所选用的猪圆环病毒2型毒株为PCV-2d毒株HEB18株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2017年6月7日，保藏号为CGMCC No.13854。
[0022] 本发明所选用的猪圆环病毒3型毒株为PCV-3毒株BJ23株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2017年6月7日，保藏号为CGMCC No.13855。
[0023]
具体实施方式
[0024] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
[0025] 实施例1、猪圆环病毒2型与3型二价灭活疫苗的制备1. 毒株的来源
所选用的猪圆环病毒2型毒株为PCV-2d毒株HEB18株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2017年6月7日，保藏号为CGMCC No.13854。
所选用的猪圆环病毒2型毒株为PCV-2d毒株HEB18株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2017年6月7日，保藏号为CGMCC No.13854。
[0026] 所选用的猪圆环病毒3型毒株为PCV-3毒株BJ23株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2017年6月7日，保藏号为CGMCC No.13855。
[0027] 2. 疫苗半成品的制备及检验2.1 生产用种子的制备
2.1.1 猪圆环病毒2型的制备：将毒种用乳化液作适当稀释，按5%接种于PK15细胞（购自中国兽医药品监察所）培养，37℃吸附30分钟，加入含4%体积小牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37℃培养4日，冻融2-3次，收获病毒。
2.1.1 猪圆环病毒2型的制备：将毒种用乳化液作适当稀释，按5%接种于PK15细胞（购自中国兽医药品监察所）培养，37℃吸附30分钟，加入含4%体积小牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37℃培养4日，冻融2-3次，收获病毒。
[0028] 2.1.2 猪圆环病毒3型的制备：将毒种用乳化液作适当稀释，按5%接种于PK15-R细胞（基于PK15细胞改造）培养，37℃吸附30分钟，加入含4%体积小牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37℃培养4日，冻融2-3次，收获病毒。
[0029] 2.2 制苗用病毒液的制备2.2.1 猪圆环病毒2型病毒液的制备：用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15细胞（购自中国兽医药品监察所），倒去细胞培养液，将毒种液按0.1-0.2TCID50/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液，置37℃旋转（10-
12转/小时）培养。每日观察1-2次，细胞生长良好，37℃培养4日收货细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存，应不超过2个月。
12转/小时）培养。每日观察1-2次，细胞生长良好，37℃培养4日收货细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存，应不超过2个月。
[0030] 2.2.2 猪圆环病毒3型病毒液的制备：用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15-R细胞（基于PK15细胞改造），倒去细胞培养液，将毒种液按0.1-0.2TCID50/个细胞的接种量接种于PK15-R细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液，置37℃旋转（10-12转/小时）培养。每日观察1-2次，细胞生长良好，37℃培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存，应不超过2个月。
[0032] 2.4 含量测定2.4.1 猪圆环病毒2型病毒含量测定：将病毒液用MEM维持液做10倍系列稀释，取10﹣5、
10﹣6、10﹣7三个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5%CO2的恒温箱中继续培养24小时，换含2mM的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用简介免疫荧光试验（IFA）测定每个稀释度含有PCV-2阳性细胞（呈绿色）的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID50。每ml病毒含量应≥105.5TCID50。
10﹣6、10﹣7三个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5%CO2的恒温箱中继续培养24小时，换含2mM的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用简介免疫荧光试验（IFA）测定每个稀释度含有PCV-2阳性细胞（呈绿色）的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID50。每ml病毒含量应≥105.5TCID50。
[0033] 2.4.2 猪圆环病毒3型病毒含量测定：将病毒液用MEM维持液做10倍系列稀释，取10﹣5、10﹣6、10﹣7三个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15-R细胞单层4孔，每孔
0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5%CO2的恒温箱中继续培养24小时，换含2mM的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用简介免疫荧光试验（IFA）测定每个稀释度含有PCV-3阳性细胞（呈绿色）的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID50。每
5.5
ml病毒含量应≥10 TCID50。
0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5%CO2的恒温箱中继续培养24小时，换含2mM的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用简介免疫荧光试验（IFA）测定每个稀释度含有PCV-3阳性细胞（呈绿色）的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID50。每
5.5
ml病毒含量应≥10 TCID50。
[0034] 2.5 灭活2.5.1 猪圆环病毒2型病毒液的灭活：将检验合格的步骤2.3处理过的病毒液加入10%甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为0.2%（V/V），随即充分摇匀升温，当温度升至37℃时开始计时，保持18小时灭活完毕，加入0.2%的焦亚硫酸钠终止灭活，取样进行灭活检验。
[0035] 2.5.2 猪圆环病毒3型病毒液的灭活：将检验合格的步骤2.3处理过的病毒液加入10%甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为0.2%（V/V），随即充分摇匀升温，当温度升至37℃时开始计时，保持18小时灭活完毕，加入0.2%的焦亚硫酸钠终止灭活，取样进行灭活检验。
[0036] 2.6 灭活检验2.6.1 猪圆环病毒2型病毒液的灭活检验：取少量灭活的病毒液接种已长成单层的PK15细胞，37℃吸附1小时后弃病毒液，加入新的细胞维持液，37℃培养2日，应无CPE，连续盲传3次，长成细胞单层后换成细胞维持液，37℃培养2日，用IFA法检测，结果无绿色PCV-2阳性细胞产生。
[0037] 2.6.2 猪圆环病毒3型病毒液的灭活检验：取少量灭活的病毒液接种已长成单层的PK15-R细胞，37℃吸附1小时后弃病毒液，加入新的细胞维持液，37℃培养2日，应无CPE，连续盲传3次，长成细胞单层后换成细胞维持液，37℃培养2日，用IFA法检测，结果无绿色PCV-3阳性细胞产生。
[0038] 2.7 无菌检验：取灭活过的病毒液，按《中华人民共和国兽药典》（2015年版）附录42-44页进行，结果无菌生长。
[0039] 2.8 浓缩：将猪圆环病毒2型与3型分别用密理博（Millipore公司）膜包（分子截留量为300Kda道尔顿）作10倍浓缩。浓缩后含量为107.0TCID50/ml。
[0040] 3. 配苗3.1稀释剂的配制
无菌的PBS缓冲溶液，pH为7. 4
3.2将上述成分按下表所示比例进行混合，即通过无菌操作，将含量合格的猪圆环病毒
2型与3型浓缩物与所述佐剂混合加入装备有搅拌器的无菌容器，30℃搅拌30分钟，生产二价灭活疫苗。
无菌的PBS缓冲溶液，pH为7. 4
3.2将上述成分按下表所示比例进行混合，即通过无菌操作，将含量合格的猪圆环病毒
2型与3型浓缩物与所述佐剂混合加入装备有搅拌器的无菌容器，30℃搅拌30分钟，生产二价灭活疫苗。
[0041] 本实施例中猪圆环病毒2型与3型灭活浓缩前含量为106.0TCID50/ml。
[0042]成分 体积百分比％ v/v
猪圆环病毒2型浓缩物 107.0TCID50/ml 10.0%
7.0
猪圆环病毒3型浓缩物 10 TCID50/ml 10.0%
无菌PBS缓冲溶液 30.0%
ISA206 50.0%
总计 100%
4. 分装
无菌条件下以50ml/瓶，或20ml/瓶分装，盖上瓶塞，并压铝盖，获得二价灭活疫苗。猪圆环病毒2型与3型灭活前病毒含量都为106.0TCID50/ml。
猪圆环病毒2型浓缩物 107.0TCID50/ml 10.0%
7.0
猪圆环病毒3型浓缩物 10 TCID50/ml 10.0%
无菌PBS缓冲溶液 30.0%
ISA206 50.0%
总计 100%
4. 分装
无菌条件下以50ml/瓶，或20ml/瓶分装，盖上瓶塞，并压铝盖，获得二价灭活疫苗。猪圆环病毒2型与3型灭活前病毒含量都为106.0TCID50/ml。
[0044] 实施例2、实施例1中试制的二价灭活疫苗产品与两种单价灭活疫苗的免疫保护效果比较以及血清学效果评价1材料实施例1中猪圆环2型与3型病毒二价灭活疫苗试制品；猪圆环病毒2型灭活疫苗（SH株），普莱柯生物工程股份有限公司生产（批号为160616)；猪圆环病毒3型灭活疫苗试制品。
[0045] 2动物试验设计选21〜28日龄断奶仔猪70头，分为7组，每组10头（见下表）；第1、2组每头猪分别颈部肌肉注射猪圆环2型与3型病毒二价灭活疫苗lml；第3组每头猪分别颈部肌肉注射猪圆环病毒
2型灭活疫苗lml，免疫后14d再次接种lml；第4组每头猪分别颈部肌肉注射猪圆环病毒3型灭活疫苗试制品；第5组颈部肌肉注射无菌PBS lml，14d再次接种lml PBS；第6组颈部肌肉注射无菌PBS lml；第7组为空白对照，既不接种，也不攻毒，在单独房间饲养。在首次免疫后
35d，用PCV-2HEB18株（含106.0TCID50/ml)对第3、5组猪滴鼻lml、肌肉注射2ml，攻毒后第4、7日，分别在第1、3、5组每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0. 5mg/ml)，每个点接种lml (4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基，l0ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基， 10ml/头。
攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检，根据体温、相对日增重和临床症状判定保护情况；用猪圆环3型病毒BJ23对第2、4、6组猪攻毒，观察25d，无痛苦处死所有猪，取出肺，由不了解试验组的人员统计肺病变，判断保护情况。第7组为空白对照组，猪在首免后35d、60d称重，在60d剖检。
2型灭活疫苗lml，免疫后14d再次接种lml；第4组每头猪分别颈部肌肉注射猪圆环病毒3型灭活疫苗试制品；第5组颈部肌肉注射无菌PBS lml，14d再次接种lml PBS；第6组颈部肌肉注射无菌PBS lml；第7组为空白对照，既不接种，也不攻毒，在单独房间饲养。在首次免疫后
35d，用PCV-2HEB18株（含106.0TCID50/ml)对第3、5组猪滴鼻lml、肌肉注射2ml，攻毒后第4、7日，分别在第1、3、5组每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0. 5mg/ml)，每个点接种lml (4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基，l0ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基， 10ml/头。
攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检，根据体温、相对日增重和临床症状判定保护情况；用猪圆环3型病毒BJ23对第2、4、6组猪攻毒，观察25d，无痛苦处死所有猪，取出肺，由不了解试验组的人员统计肺病变，判断保护情况。第7组为空白对照组，猪在首免后35d、60d称重，在60d剖检。
[0046] 分别于接种后14d、21d、35d、60d对每头猪采血，收集血清，保存在-20℃直到测试。
[0047]注：
a、疫苗1为实施例1中猪圆环2型与3型病毒二价灭活疫苗试制品；疫苗2为猪圆环病毒2型灭活疫苗（SH株），普莱柯生物工程股份有限公司生产（批号为160616)；疫苗3 为猪圆环病毒3型灭活疫苗试制品。
a、疫苗1为实施例1中猪圆环2型与3型病毒二价灭活疫苗试制品；疫苗2为猪圆环病毒2型灭活疫苗（SH株），普莱柯生物工程股份有限公司生产（批号为160616)；疫苗3 为猪圆环病毒3型灭活疫苗试制品。
[0048] b、KLH/ICFA为弗氏不完全佐剂（ICFA)乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH)(含KLH为 0.5mg/ml)，KLH 及 ICFA 均购自Sigma 公司。
[0049] c、Thio为巯基乙酸培养基，购自Sigma公司。
[0050] 3.结果和讨论3.1 免疫保护效果：
3.1.1猪圆环病毒2型部分：如下表
组别 病变 攻毒后体温 ≥40℃的天数 攻毒后体温≥40℃的头数 发病率 保护率
1 (PCV2+PCV3) 0/10 0〜2 3 0/10 100%
3 (PCV2) 2/10 0〜3 5 2/10 80%
5 (PBS) 10/10 3〜6 10 10/10 /
7 (空白) 0/10 0 0 0/10 /
注：病变包括肺实变、淋巴结肿大、肾有坏死点、脾轻度肿大、肠道鼓气等体重变化：分别在攻毒前及宰杀时对1、3、5、7组猪进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS17.0进行统计分析，结果表明疫苗1免疫组猪相对日增重与空白对照组相似（P = 0.61 > 0.05)，明显高于非免疫攻毒对照组（P = 0. 022 < 0.05)；疫苗2免疫组猪相对日增重与空白对照组相似（P = 0. 54 > 0.05），也明显高于非免疫攻毒对照组（P = 0.022 <0.05)，疫苗1（二价灭活疫苗）增重比疫苗2要高。（注：P值来自于试验组和空白对照组的比较）。
3.1.1猪圆环病毒2型部分：如下表
组别 病变 攻毒后体温 ≥40℃的天数 攻毒后体温≥40℃的头数 发病率 保护率
1 (PCV2+PCV3) 0/10 0〜2 3 0/10 100%
3 (PCV2) 2/10 0〜3 5 2/10 80%
5 (PBS) 10/10 3〜6 10 10/10 /
7 (空白) 0/10 0 0 0/10 /
注：病变包括肺实变、淋巴结肿大、肾有坏死点、脾轻度肿大、肠道鼓气等体重变化：分别在攻毒前及宰杀时对1、3、5、7组猪进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS17.0进行统计分析，结果表明疫苗1免疫组猪相对日增重与空白对照组相似（P = 0.61 > 0.05)，明显高于非免疫攻毒对照组（P = 0. 022 < 0.05)；疫苗2免疫组猪相对日增重与空白对照组相似（P = 0. 54 > 0.05），也明显高于非免疫攻毒对照组（P = 0.022 <0.05)，疫苗1（二价灭活疫苗）增重比疫苗2要高。（注：P值来自于试验组和空白对照组的比较）。
[0051] 病变观察和体重变化证明疫苗1，较疫苗2对PCV2均有更好的免疫保护作用，效力相当或更佳。
[0052] 3.1.2猪圆环3型病毒部分：组别 病变 攻毒后体温 ≥40℃的天数 攻毒后体温≥40℃的头数 发病率 保护率
2 (PCV2+PCV3) 0/10 0〜2 3 0/10 100%
4 (PCV3) 0/10 0〜2 4 3/10 70%
6 (PBS) 10/10 4〜6 10 10/10 /
注：病变包括肺实变、淋巴结肿大、肾有坏死点、脾轻度肿大、肠道鼓气等体重变化：分别在攻毒前及宰杀时对2、4、6、7组猪进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS17.0进行统计分析，结果表明疫苗1免疫组（组别2）猪相对日增重与空白对照组相似（P = 0.59 > 0.05)，明显高于非免疫攻毒对照组（P = 0. 027 <
0.05)；疫苗3免疫组（组别4）猪相对日增重与空白对照组相似（P = 0. 54 > 0.05），也明显高于非免疫攻毒对照组（P = 0.022 <0.05)，疫苗1（二价灭活疫苗）增重比疫苗3要高。（注：
P值来自于试验组和空白对照组的比较）。
2 (PCV2+PCV3) 0/10 0〜2 3 0/10 100%
4 (PCV3) 0/10 0〜2 4 3/10 70%
6 (PBS) 10/10 4〜6 10 10/10 /
注：病变包括肺实变、淋巴结肿大、肾有坏死点、脾轻度肿大、肠道鼓气等体重变化：分别在攻毒前及宰杀时对2、4、6、7组猪进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS17.0进行统计分析，结果表明疫苗1免疫组（组别2）猪相对日增重与空白对照组相似（P = 0.59 > 0.05)，明显高于非免疫攻毒对照组（P = 0. 027 <
0.05)；疫苗3免疫组（组别4）猪相对日增重与空白对照组相似（P = 0. 54 > 0.05），也明显高于非免疫攻毒对照组（P = 0.022 <0.05)，疫苗1（二价灭活疫苗）增重比疫苗3要高。（注：
P值来自于试验组和空白对照组的比较）。
[0053] 3.2 血清学评价：3.2.1猪圆环病毒2型部分：
ELISA抗体检测：用大肠杆菌表达的PCV-2-ORF2蛋白作为抗原，通过方阵滴定试验确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板，100μl/孔，后 4℃包被过夜；洗涤3次，每次3-5min ；每孔加200μl的0.15% BSA封闭液封闭板子，37℃作用2h；洗涤；
将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μl，37℃作用lh；洗涤；然后加入酶标的SPA(1 : 10000倍稀释），100μl/孔，37℃作用lh；洗涤；加底物液 TMB显色，最后用2mol/L的H2SO4终止反应。结果判定：待检血清OD450值/阴性血清OD450值≥2.1为阳性。
ELISA抗体检测：用大肠杆菌表达的PCV-2-ORF2蛋白作为抗原，通过方阵滴定试验确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板，100μl/孔，后 4℃包被过夜；洗涤3次，每次3-5min ；每孔加200μl的0.15% BSA封闭液封闭板子，37℃作用2h；洗涤；
将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μl，37℃作用lh；洗涤；然后加入酶标的SPA(1 : 10000倍稀释），100μl/孔，37℃作用lh；洗涤；加底物液 TMB显色，最后用2mol/L的H2SO4终止反应。结果判定：待检血清OD450值/阴性血清OD450值≥2.1为阳性。
[0054] 血清中和试验：采用固定病毒稀释血清法。待检血清56℃加热30min，10000rpm离心5min，小心吸出上清，做1 : 2稀释后进行倍比稀释；分别与等量100TCID50PCV2病毒液混合，37 ℃ lh，接种于含单层PK15细胞的96孔板内，100μl /孔，每一稀释度接种4孔，同时设细胞对照和病毒对照孔。37℃培养12h，用300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理，37℃继续培养48h，80%丙酮固定细胞，用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数。以能够抑制
50%特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。
50%特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。
[0055] 首免后14d，免疫组均能检测到PCV2抗体，首免后35d，免疫组ELISA抗体效价达到1 : 3200 ；中和抗体效价达到1 : 32以上，两种抗体水平基本一致，并能持续到60d，与攻毒保护水平呈正相关，表明疫苗1，疫苗2免疫动物后能够刺激机体产生PCV2特异性抵抗力，效果确实。
[0056]3.2.2猪圆环病毒3型部分：
ELISA抗体检测：用大肠杆菌表达的PCV-3-ORF2（Cap）蛋白作为抗原，通过方阵滴定试验确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板，100μl/孔，后 4℃包被过夜；洗涤3次，每次3-5min ；每孔加200μl的0.15% BSA封闭液封闭板子，37℃作用2h；
洗涤；将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μl，37℃作用lh；洗涤；然后加入酶标的SPA(1 : 10000倍稀释），100μl/孔，37℃作用lh；洗涤；加底物液 TMB显色，最后用
2mol/L的H2SO4终止反应。结果判定：待检血清OD450值/阴性血清OD450值≥2.1为阳性。
ELISA抗体检测：用大肠杆菌表达的PCV-3-ORF2（Cap）蛋白作为抗原，通过方阵滴定试验确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板，100μl/孔，后 4℃包被过夜；洗涤3次，每次3-5min ；每孔加200μl的0.15% BSA封闭液封闭板子，37℃作用2h；
洗涤；将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μl，37℃作用lh；洗涤；然后加入酶标的SPA(1 : 10000倍稀释），100μl/孔，37℃作用lh；洗涤；加底物液 TMB显色，最后用
2mol/L的H2SO4终止反应。结果判定：待检血清OD450值/阴性血清OD450值≥2.1为阳性。
[0057] 血清中和试验：采用固定病毒稀释血清法。待检血清56℃加热30min，10000rpm离心5min，小心吸出上清，做1 : 2稀释后进行倍比稀释；分别与等量100TCID50PCV3病毒液混合，37 ℃ lh，接种于含单层PK15细胞的96孔板内，100μl /孔，每一稀释度接种4孔，同时设细胞对照和病毒对照孔。37℃培养12h，用300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理，37℃继续培养48h，80%丙酮固定细胞，用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数。以能够抑制
50%特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。
50%特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。
[0058]使用猪圆环病毒3型ELISA检测试验中所有猪体内抗PCV-3的血清杭体，其中所有测定使用1 : 10的血清稀释度。所有猪在接种时都是血清学阴性，这表明所有猪都对PCV-3敏感。对照组的所有猪在攻毒前保持血清学阴性，免疫组在攻毒前70%保持血清学阳性，免疫组内所有的猪和攻击对照组内60%猪在攻击后都转化为对PCV-3呈血清学阳性，而所有未受攻击的猪均保持血清学阴性。
[0059] 这表明疫苗1、疫苗3能刺激动物体产生抗PCV3特异性抗体，与攻毒保护水平呈正相关，效力肯定。
[0060] 实施例3、实施例1中试制产品的免疫持续期研究1材料实施例1中猪圆环2型与3型病毒二价灭活疫苗试制品；猪圆环病毒2型灭活疫苗（SH株），普莱柯生物工程股份有限公司生产（批号为160616)；猪圆环病毒3型灭活疫苗试制品。
[0061] 2动物试验设计选21〜28日龄断奶仔猪70头，分为7组，每组10头，分组处理情况参见下表：
注：
a、疫苗1为实施例1中猪圆环2型与3型病毒二价灭活疫苗试制品；疫苗2为猪圆环病毒2型灭活疫苗（SH株），普莱柯生物工程股份有限公司生产（批号为160616)；疫苗3 为猪圆环病毒3型灭活疫苗试制品。
注：
a、疫苗1为实施例1中猪圆环2型与3型病毒二价灭活疫苗试制品；疫苗2为猪圆环病毒2型灭活疫苗（SH株），普莱柯生物工程股份有限公司生产（批号为160616)；疫苗3 为猪圆环病毒3型灭活疫苗试制品。
[0062] b、KLH/ICFA为弗氏不完全佐剂（ICFA)乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH)(含KLH为 0.5mg/ml)，KLH 及 ICFA 均购自Sigma 公司。
[0063] c、Thio为巯基乙酸培养基，购自Sigma公司。
[0064] 3.结果和讨论3.1 免疫保护效果：
3.1.1猪圆环病毒2型部分：如下表
组别 病变 攻毒后体温≥40 ℃的天数 攻毒后体温≥40 ℃的头数 发病率 保护率
1 1/10 0〜3 4 1/10 90%
3 3/10 1〜4 5 3/10 70%
5 10/10 3〜6 10 10/10 /
7 0/10 0 0 0/10 /
注：病变包括肺实变、淋巴结肿大、肾有坏死点、脾轻度肿大、肠道鼓气等体重变化：分别在攻毒前（免疫后120d）及宰杀时（免疫后150d）对1、3、5、7组猪进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS17. 0进行统计分析，结果表明疫苗1 (组别1)免疫组猪相对日增重与空白对照组（组别7）相似（P = 0.55 > 0.05)，明显高于非免疫攻毒对照组日增重（P = 0.028 < 0.05）；疫苗2免疫组猪相对日增重与空白对照组相似（P = 0.38 > 0.05)，也高于非免疫攻毒对照组（P = 0.028 < 0. 05）（注：P 值来自于试验组和空白对照组的比较）。
3.1.1猪圆环病毒2型部分：如下表
组别 病变 攻毒后体温≥40 ℃的天数 攻毒后体温≥40 ℃的头数 发病率 保护率
1 1/10 0〜3 4 1/10 90%
3 3/10 1〜4 5 3/10 70%
5 10/10 3〜6 10 10/10 /
7 0/10 0 0 0/10 /
注：病变包括肺实变、淋巴结肿大、肾有坏死点、脾轻度肿大、肠道鼓气等体重变化：分别在攻毒前（免疫后120d）及宰杀时（免疫后150d）对1、3、5、7组猪进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS17. 0进行统计分析，结果表明疫苗1 (组别1)免疫组猪相对日增重与空白对照组（组别7）相似（P = 0.55 > 0.05)，明显高于非免疫攻毒对照组日增重（P = 0.028 < 0.05）；疫苗2免疫组猪相对日增重与空白对照组相似（P = 0.38 > 0.05)，也高于非免疫攻毒对照组（P = 0.028 < 0. 05）（注：P 值来自于试验组和空白对照组的比较）。
[0065] 病变观察和体重变化证明实施例1试制二价灭活疫苗（组别1)在免疫120d后对 PCV2的攻击保护率达到90%；疫苗2(组别3)在免疫120d后对PCV2的攻击保护率达到 70%。试制二价灭活疫苗在120d对PCV2的免疫保护强于疫苗2。
[0066] 3.1.2猪圆环病毒3型部分：如下表组别 病变 攻毒后体温≥40 ℃的天数 攻毒后体温≥40 ℃的头数 发病率 保护率
2 1/10 0〜2 3 1/10 90%
4 3/10 1〜4 5 3/10 70%
6 10/10 2〜5 10 10/10 /
7 0/10 0 0 0/10 /
注：病变包括肺实变、淋巴结肿大、肾有坏死点、脾轻度肿大、肠道鼓气等体重变化：分别在攻毒前（免疫后120d）及宰杀时（免疫后150d）对2、4、6、7组猪进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS17.0进行统计分析，结果表明疫苗1 (组别2)免疫组猪相对日增重与空白对照组（组别7）相似（P = 0.63> 0.05)，明显高于非免疫攻毒对照组日增重（P = 0.024< 0.05）；疫苗2免疫组猪相对日增重与空白对照组相似（P = 0.33> 0.05)，也高于非免疫攻毒对照组（P = 0.024< 0.05）（注：P 值来自于试验组和空白对照组的比较）。
2 1/10 0〜2 3 1/10 90%
4 3/10 1〜4 5 3/10 70%
6 10/10 2〜5 10 10/10 /
7 0/10 0 0 0/10 /
注：病变包括肺实变、淋巴结肿大、肾有坏死点、脾轻度肿大、肠道鼓气等体重变化：分别在攻毒前（免疫后120d）及宰杀时（免疫后150d）对2、4、6、7组猪进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS17.0进行统计分析，结果表明疫苗1 (组别2)免疫组猪相对日增重与空白对照组（组别7）相似（P = 0.63> 0.05)，明显高于非免疫攻毒对照组日增重（P = 0.024< 0.05）；疫苗2免疫组猪相对日增重与空白对照组相似（P = 0.33> 0.05)，也高于非免疫攻毒对照组（P = 0.024< 0.05）（注：P 值来自于试验组和空白对照组的比较）。
[0067] 病变观察和体重变化证明实施例1试制二价灭活疫苗（组别2)在免疫120d后对 PCV3的攻击保护率达到90%；疫苗3(组别4)在免疫120d后对PCV3的攻击保护率达到 70%。试制二价灭活疫苗在120d对PCV3的免疫保护强于疫苗2。
[0068] 3.2 血清学评价：3.2.1猪圆环病毒2型部分：
ELISA抗体检测验与血清中和试验按照实施例1进行，结果如下表：
试制二价灭活苗（组别1)免疫后14d，免疫组即能检测到PCV2抗体；免疫后35d，免疫组ELISA抗体效价达到1 : 3200 ；中和抗体效价达到1 : 32以上，两种抗体水平均达到峰值；
免疫120d后抗体水平稍有下降，但仍能达到保护水平；而疫苗2 (组别3)免疫120 天后ELISA抗体效价下降到1 : 2400，中和抗体效价降到1 : 28，抗体水平低于二价灭活苗（组别1)。表明实施例1试制二价灭活疫苗免疫动物120d后仍能够刺激机体产生保护水平的PCV2抵抗力，抗体水平高于疫苗2。
ELISA抗体检测验与血清中和试验按照实施例1进行，结果如下表：
试制二价灭活苗（组别1)免疫后14d，免疫组即能检测到PCV2抗体；免疫后35d，免疫组ELISA抗体效价达到1 : 3200 ；中和抗体效价达到1 : 32以上，两种抗体水平均达到峰值；
免疫120d后抗体水平稍有下降，但仍能达到保护水平；而疫苗2 (组别3)免疫120 天后ELISA抗体效价下降到1 : 2400，中和抗体效价降到1 : 28，抗体水平低于二价灭活苗（组别1)。表明实施例1试制二价灭活疫苗免疫动物120d后仍能够刺激机体产生保护水平的PCV2抵抗力，抗体水平高于疫苗2。
[0069] 3.2.2猪圆环病毒3型部分：ELISA抗体检测验与血清中和试验按照实施例1进行，结果如下表：
试制二价灭活苗（组别2)免疫后14d，免疫组即能检测到PCV3抗体；免疫后35d，免疫组ELISA抗体效价达到1 : 3840；中和抗体效价达到1 : 32以上，两种抗体水平均达到峰值；
免疫120d后抗体水平稍有下降，但仍能达到保护水平；而疫苗3 (组别4)免疫120 天后ELISA抗体效价下降到1 : 2400，中和抗体效价降到1 : 28，抗体水平低于二价灭活苗（组别1)。表明实施例1试制二价灭活疫苗免疫动物120d后仍能够刺激机体产生保护水平的PCV2抵抗力，抗体水平高于疫苗3。
试制二价灭活苗（组别2)免疫后14d，免疫组即能检测到PCV3抗体；免疫后35d，免疫组ELISA抗体效价达到1 : 3840；中和抗体效价达到1 : 32以上，两种抗体水平均达到峰值；
免疫120d后抗体水平稍有下降，但仍能达到保护水平；而疫苗3 (组别4)免疫120 天后ELISA抗体效价下降到1 : 2400，中和抗体效价降到1 : 28，抗体水平低于二价灭活苗（组别1)。表明实施例1试制二价灭活疫苗免疫动物120d后仍能够刺激机体产生保护水平的PCV2抵抗力，抗体水平高于疫苗3。
[0070] 4. 小结与讨论试验结果表明，实施例1中试制二价灭活疫苗无论是从攻毒保护效果上，还是从血清学抗体水平上来看，其免疫效果都与市场上的商品单苗之和相当，两种抗原之间无相互干扰；
其次，该二价灭活疫苗的免疫持续期更长，效力持久，对PCV3的免疫保护至少为150 天，对PCV2的免疫保护至少为120天；最后，本发明的二价灭活疫苗只需一次免疫，即可达到分别免疫单苗的效果，且省去PCV2单苗免疫的复杂程序，耗时少，费力少，即降低了成本，也减少了动物的应激反应。
其次，该二价灭活疫苗的免疫持续期更长，效力持久，对PCV3的免疫保护至少为150 天，对PCV2的免疫保护至少为120天；最后，本发明的二价灭活疫苗只需一次免疫，即可达到分别免疫单苗的效果，且省去PCV2单苗免疫的复杂程序，耗时少，费力少，即降低了成本，也减少了动物的应激反应。
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