技术领域
[0001] 本
发明属于
疫苗检测技术领域，具体涉及一种
猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒。
背景技术
[0002] 猪圆环病毒病2型可引起免疫抑制性
疾病。该病毒可诱发多种病毒、细菌的混合感染和继发感染，给养猪业造成巨大的经济损失，对此病的研究特别是对其疫苗的研究正日益受到关注。疫苗作为防控PCV2的主要手段，国内外研究者正在研究和开发各种疫苗，到目前为止，部分疫苗已在临床试验中取得成功，有的已投入应用，其他候选疫苗也正在积极研究中。
[0003] 但是，由于疫苗在制备批次上的差别，导致不同批次的疫苗在效果上存在差别。目前在疫苗的评价方面，除了对疫苗解离后进行琼扩效价测定，最直接的方面就是对疫苗进行免疫后抗体检测，但由于SPF猪或是PCV2
抗原抗体阴性猪比较难获得，有必要提供一种有效的替代动物来提高检测的灵敏性。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，本发明采用间接法ELISA，包被板所包被的抗原为原核表达的Cap蛋白，抗原纯度高，由此抗原包被的包被板所建立的ELISA检测试剂盒，具有较高的灵敏性、特异性、重复性。
[0005] 本发明的猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，包含有大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白纯化后作为抗原包被的ELISA板、阳性对照血清、阴性对照血清、样品稀释液、酶标记结合物、洗涤液、底物溶液A、底物溶液B和终止液。
[0006] 其中阳性对照血清，是用猪圆环病毒2型灭活疫苗SH株接种健康豚鼠制成的琼扩抗体效价不低于1:32的血清；
[0007] 阴性对照血清为健康豚鼠的血清；
[0008] 所述的样品稀释液为用0.01M pH7.2的PBS溶液稀释的大肠埃希氏杆菌BL21(E.coli BL21)的菌体溶液，其总蛋白含量为1.2mg/ml。
[0009] 酶标记结合物是辣根过
氧化物酶标记的羊抗豚鼠抗体用酶标抗体稀释液稀释8000倍制成的(例：取10μl酶标抗体，加酶标抗体稀释液80ml)。
[0010] 所述的洗涤液，是将14.9g KH2PO4，79.1g K2HPO4·3H2O，50.0ml Tritonx-100，1.0g NaN3，8.0g NaCl溶于500ml
水中，调pH 7.3，最终定容至1L。
[0011] 所述的底物溶液A，是将4.2g
柠檬酸，13.6g
醋酸钠，0.5g过氧过脲溶解在100ml去离子水中，定容至1L，调pH值到5.0制成的；
[0012] 底物溶液B，是将1g TMB溶解于50ml二甲基亚砜中，溶解后再加入100ml甲
醛，16.0g聚乙烯吡咯烷
酮，溶解后用去离子水定容至1L完成制备。
[0013] 所述的终止液为2mol/L的
硫酸溶液。
[0014] 其中ELISA板的制备方法，是将纯化的Cap蛋白抗原用pH 9.5、0.05mol/L的
碳酸盐缓冲液稀释至25μg/ml，加入至96孔包被板中，100μl/孔，置4℃过夜，用洗涤液洗涤3次后，加入1％BSA 0.01mol/L pH 7.2PBS封闭过夜，甩去封闭液，室温、湿度40％之下，自然干燥24-48小时完成制备。
具体实施方式
[0015]
实施例1猪圆环病毒2型豚鼠抗体检测ELISA试剂盒的制备和使用方法[0016] 1.猪圆环病毒2型豚鼠抗体检测试剂盒的制备方法：
[0017] PCV2抗原的制备及纯化：将表达重组猪圆环病毒2型Cap蛋白的埃希氏大肠杆菌工程菌按1％～2％接种量接种2000毫升摇瓶培养，按容积35％配制培养基，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～7.2。按总体积0.1％的比例加入10％的硫酸卡那霉素注射液，35～36℃培养，待菌液的OD600nm值达到0.8-1.0之间时，加入灭菌的0.5mol/Lα-乳糖溶液，使其终浓度达到0.03mol/L，诱导表达5小时。离心收集菌体。将收集的菌体用生理盐水重悬，
超声波破菌，先进行硫酸铵分级沉淀，然后进行脱盐柱层析，将复溶的PCV2蛋白液上样于Sephadex G25层析柱，用0.05mol/L
磷酸缓冲液洗脱，收集漏出蛋白峰，最后进行离子交换层析分离，收集抗原蛋白的洗脱峰。
[0018] 包被板的制备：将纯化的PCV2 Cap蛋白抗原用pH 9.50.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释至25μg/ml，加入至96孔包被板中，100μl/孔，置4℃过夜，用洗涤液洗涤3次后，加入1％BSA 0.01mol/L pH 7.2PBS封闭过夜，甩去封闭液，室温、湿度40％之下，自然干燥24-48小时，
包装。
[0019] 工作浓度的酶标抗体(1号液)的制备：取BETHYL公司生产的辣根过氧化物酶标记的羊抗豚鼠抗体用酶标抗体稀释液稀释8000倍(例：取10μl酶标抗体，加酶标抗体稀释液80ml)。
[0020] 洗 涤 液 (2号 液)的 制 备：是 将 14.9g KH2PO4，79.1g K2HPO4·3H2O，50.0ml Tritonx-100，1.0g NaN3，8.0g NaCl溶于500ml水中，调pH 7.3，最终定容至1L。
[0021] 底物显色液的制备：将4.2g柠檬酸，13.6g醋酸钠，0.5g过氧过脲溶解在100ml去离子水中，定容至1L，调pH值到5.0，即为底物A液(3号液)；将1g TMB溶解于50ml二甲基亚砜中，溶解后再加入100ml甲醛，16.0g聚乙烯吡咯烷酮，溶解后用去离子水定容至1L，即为底物B液(4号液)
[0022] 样品稀释液(5号液)的制备：从LB培养平板上挑取大肠埃希氏杆菌BL21(E.coli BL21)单菌落,转接于含LB培养液的试管中，37℃培养过夜，制备饱和菌液。将饱和菌液转接到250ml的LB培养基中，接种量约5％，培养8小时。6000转/分离心15分钟。将菌体溶于15mlPBS。将溶解的菌液解冻，
超声波裂解。置6000转/分，离心15分钟，收集上清。用BCA蛋白含量检测试剂盒测定蛋白含量(检测方法见附件1)。然后将破菌液用0.01M pH7.2PBS稀释至总蛋白含量为1.2mg/ml。
[0023] 终止液(6号液)的制备：配制2mol/L硫
酸溶液。
[0024] 阳性对照血清和阴性对照血清的制备：
[0025] 阳性对照血清：用猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)接种250g左右的健康豚鼠，每只腿部肌肉注射疫苗0.2ml。一免后14日，用同种疫苗相同剂量进行二免，二免后21日
采血，测定PCV2Cap蛋白的琼扩抗体效价。当琼扩抗体效价不低于1:32时采血，分离血清。
[0026] 阴性对照血清：用250g左右的健康豚鼠(PCV2-ELISA抗体和PCV2-AGP抗体阴性)，采血，分离血清。
[0027] 2.猪圆环病毒2型豚鼠抗体检测ELISA试剂盒的使用方法：
[0028] (1)从
冰箱中取出各试剂，恢复至室温(20～25℃)。
[0029] (2)用血清稀释液将待检血清做1:400稀释(取血清5μl+95.0μl样品稀释液，混匀后取6μl+114μl样品稀释液)。
[0030] (3)加100μl不需稀释的阴性血清至A1和A2孔中。
[0031] (4)加100μl不需稀释的阳性血清至A3和A4孔中。
[0032] (5)加100μl血清稀释液至A5、A6孔中，为空白对照。
[0033] (6)加100μl稀释好的血清样品至包被板孔中。
[0034] (7)将酶标板架置37℃温育30分钟。
[0035] (8)洗涤：向包被板孔中加入洗涤液2滴，用蒸馏水反复洗涤5次，在吸水纸上拍干。
[0036] (9)向包被板孔中加入酶标记结合物2滴，37℃放置30分钟。
[0037] (10)洗涤：重复步骤(8)
[0038] (11)显色：加入底物溶液A 2滴，底物溶液B 2滴，轻轻摇匀，37℃反应10分钟。
[0039] (12)每孔加止终液2滴终止反应。
[0040] (13)将酶标板置于酶标仪上，读取450nm
波长下的光吸收值。
[0041] 1、计算方法
[0042]
[0043] 2、待测样品阳性判断标准
[0044] 判定标准阳性对照血清OD450＞0.5，阴性对照血清OD450＜0.15，空白孔OD450＜0.08，实验成立，否则无效。
[0045] 计算公式：S/N值＝待检样本OD450nm/阴性对照OD450nm均值判定标准：
[0046] S/N≥2.5 为阳性；
[0047] 2.0＜S/N＜2.5 为可疑；
[0048] S/N≤2.0 为阴性。
[0049] 实施例2猪圆环病毒豚鼠抗体检测ELISA试剂盒的特异性、敏感性以及与琼扩方法进行对比试验
[0050] 1.特异性试验：本研究研制的PCV2 ELISA抗体检测试剂盒，为检测试剂盒对圆环病毒的特异检测，用3批试剂盒分别检测猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、
猪瘟、猪伪狂犬等10种单因子阳性血清(将疫苗免疫豚鼠后制得)进行检测，结果除PCV2阳性血清外其他阳性血清均为阴性，详见表1，表明试剂盒具有良好的特异性。
[0051] 表1：3批试剂盒检测特异性试验结果
[0052]
[0053] 注：1＝猪繁殖与呼吸综合征阳性血清；2＝猪瘟阳性血清；3＝猪伪狂犬阳性血清；4＝猪
口蹄疫阳性血清；5＝猪水泡性口炎阳性血清；6＝猪萎缩性鼻炎阳性血清；7＝猪胸膜
肺炎阳性血清；8＝副猪嗜血杆菌阳性血清；9＝猪弓形虫阳性血清；10＝猪衣原体阳性血清；11、12＝PCV2阳性血清；13、14＝PCV2阴性血清。
[0054] 2.灵敏性试验：本研究研制的PCV2 ELISA抗体检测试剂盒对3份PCV2阳性血清(琼扩效价为1:32)的检出滴度为1:12800～1:25600，试验结果表明，研制的的PCV2 ELISA试剂盒比琼扩的灵敏性高400～800倍，具有较高的敏感性。结果详见表2。
[0055] 表2：试剂盒敏感性试验结果
[0056]
