快速筛选好氧微生物最适pH调节剂及确定最适生长pH值的方法
阅读：676发布：2021-03-15
专利汇可以提供快速筛选好氧微生物最适pH调节剂及确定最适生长pH值的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 微 生物 领域，具体涉及快速筛选好 氧 微生物最适pH调节剂以及确定上述的好氧微生物最适生长pH值的方法。本发明的方法包括下述的步骤：（1）选择好氧微生物培养所适宜的 碱 性及酸性pH调节剂；（2）验证最适pH调节剂和确定好氧微生物的生长稳定期；（3）筛选最适生长pH值；（4）验证该微生物的最适生长pH值。通过本发明的方法筛选及确定，得到了好氧微生物最适pH调节剂和以及确定了好氧微生物生长最适的pH值，采用本发明的方法具有操作简单、快速，且准确度高的特点。，下面是快速筛选好氧微生物最适pH调节剂及确定最适生长pH值的方法专利的具体信息内容。
1.快速筛选好氧微生物最适pH调节剂及确定最适生长pH值的方法，包括下述的步骤：
（1）培养好氧微生物，向培养基中添加不同浓度的含有pH调节剂离子的无机盐，根据微生物生长情况筛选出好氧微生物的最适pH调节剂；
（2）利用步骤（1）中最适pH调节剂调节好氧微生物的pH值，根据好氧微生物生长稳定期内溶氧值随着pH水平的变化情况，得出溶氧值最低时的pH值为好氧微生物的最适生长pH值。
2.如权利要求1所述的快速筛选好氧微生物最适pH调节剂及确定最适生长pH值的方法，其特征在于，在微生物全自动生长分析仪或者三角瓶中培养好氧微生物。
3.如权利要求1所述的快速筛选好氧微生物最适pH调节剂及确定最适生长pH值的方法，包括下述的步骤：
（1）选择好氧微生物培养适宜的碱性pH调节剂及酸性pH调节剂：
在微生物全自动生长分析仪或者三角瓶中，通过向培养基中添加含有碱性pH调节剂阳离子或含有酸性pH调节剂阴离子的无机盐，根据不同无机盐浓度对好氧微生物生长的影响，得出促进好氧微生物显著生长的最适生长碱性pH调节剂A类液、对其生长无显著影响的碱性pH调节剂B类液，对其生长无显著影响的酸性pH调节剂C类液；
（2）验证最适pH调节剂和确定好氧微生物的生长稳定期：
以不同碱性溶液作为pH调节剂进行好氧微生物培养，根据生长情况进一步验证A液为最适pH调节剂；维持恒定的培养温度和溶氧水平，利用A液调节pH值，进行微生物培养，绘制其生长曲线，确定该微生物在此培养条件下的生长稳定期；上述的碱性溶液中包括最适pH调节剂A类液；
（3）筛选最适生长pH值：
在步骤（2）的条件下进行培养，在微生物进入生长稳定期前，利用A液调节pH值；当进入稳定期后，利用C液将pH降至该微生物生长pH范围的最低值，维持8-12 min后，流加B液提高pH值，直至达到该微生物生长pH范围的最高值，该pH升高过程在该微生物的生长稳定期内完成，根据pH变化过程中溶氧值的变化情况，得出溶氧值最低时的pH值，为该微生物的最适生长pH值；
（4）验证该微生物的最适生长pH值：
在步骤（2）的条件下，设置不同的pH值，所述的pH值包括好氧微生物的最适生长pH值，利用A液调节pH值进行培养，根据不同pH水平对微生物生长的影响，进一步确定该微生物的最适生长pH值。
4.如权利要求1所述的快速筛选好氧微生物最适pH调节剂及确定最适生长pH值的方法，其特征在于，pH调节剂包括常用的碱性pH调节剂和酸性pH调节剂；
碱性pH调节剂为：氨水，氢氧化钠、氢氧化钾中的任一种；
酸性pH调节剂为：盐酸、硫酸、硝酸中的任一种。
5.如权利要求1所述的快速筛选好氧微生物最适pH调节剂及确定最适生长pH值的方法，其特征在于，好氧微生物经过种子培养，采用微生物全自动生长分析仪或者三角瓶发酵培养，根据含有pH调节剂离子无机盐的添加浓度对微生物生长的影响，筛选最适pH调节剂；
采用发酵罐培养，根据稳定期内溶氧值随pH水平的变化情况，确定微生物的最适生长pH值。
6.如权利要求4所述的快速筛选好氧微生物最适pH调节剂及确定最适生长pH值的方法，其特征在于，根据好氧微生物的生长特性，选择适宜的种子培养条件和发酵培养条件，其中：种子培养条件为三角瓶培养，发酵培养条件包括微生物全自动生长分析仪或者三角瓶、以及发酵罐的培养条件。
7.如权利要求1所述的快速筛选好氧微生物最适pH调节剂及确定最适生长pH值的方法，其特征在于，好氧微生物菌种为牛源大肠杆菌BXDC-N03、猪圆环病毒Cap蛋白表达菌株E. coli BZCP、猪败血性链球菌ST171株、副猪嗜血杆菌BZXM-F05、禽巴氏杆菌BZXM-Q03、L-色氨酸生产菌株E. coli BZTRP中的任一种。
快速筛选好氧微生物最适pH调节剂及确定最适生长pH值的
方法
技术领域
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及快速筛选好氧微生物最适pH调节剂，还涉及上述的好氧微生物最适生长pH值的方法。
背景技术
[0002] pH是微生物培养中的关键参数，pH水平会影响细胞内酶的活性、反应速率，以及细胞生长速率等，进而影响细胞浓度和目的产物产率。同时，pH调节剂中的离子水平会影响细胞的生理状态、反应速率。选用合适的pH调节剂和维持适宜的pH水平，可促进细胞的生长，实现微生物的高密度发酵。
[0003] 目前，一般采用三角瓶或者发酵罐中培养，通过采用不同pH调节剂维持一定的pH水平，根据不同pH调节剂对微生物生长的影响，确定微生物的最适pH调节剂；通过采用三角瓶或者发酵罐中培养，采用pH调节剂维持不同的pH水平，根据不同pH控制水平对微生物生长的影响，筛选微生物的最适生长pH值。该微生物最适pH调节剂和pH水平的筛选方法操作复杂、工作量大、费时费力、且准确性低。
发明内容
[0004] 为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种操作简单、快速，且准确度高的筛选出好氧微生物菌种的最适pH调节剂及最适生长pH值的方法。
[0005] 本发明的方法是通过下述的技术方案来解决以上的技术问题的：
[0006] 快速筛选好氧微生物最适pH调节剂及确定最适生长pH值的方法，包括下述的步骤：
[0007] (1)培养好氧微生物，向培养基中添加不同浓度的含有pH调节剂离子的无机盐，根据微生物生长情况筛选出好氧微生物的最适pH调节剂；
[0008] (2)利用步骤(1)中最适pH调节剂调节好氧微生物的pH值，根据好氧微生物生长稳定期内溶氧值随着pH水平的变化情况，得出溶氧值最低时的pH值为好氧微生物的最适生长pH值。
[0009] 在微生物全自动生长分析仪或者三角瓶中培养好氧微生物。
[0010] 优选的，上述快速筛选好氧微生物最适pH调节剂及确定最适生长pH值的方法，包括以下的步骤：
[0011] (1)选择好氧微生物培养适宜的碱性pH调节剂及酸性pH调节剂：
[0012] 在微生物全自动生长分析仪或者三角瓶中，通过向培养基中添加含有碱性pH调节剂阳离子或含有酸性pH调节剂阴离子的无机盐，根据不同无机盐浓度对好氧微生物生长的影响，得出促进好氧微生物显著生长的最适生长碱性pH调节剂A类液、对其生长无显著影响的碱性pH调节剂B类液，对其生长无显著影响的酸性pH调节剂C类液；
[0013] (2)验证最适pH调节剂和确定好氧微生物的生长稳定期：
[0014] 以不同碱性溶液作为pH调节剂进行好氧微生物培养，根据生长情况进一步验证A液为最适pH调节剂；维持恒定的培养温度和溶氧水平，利用A液调节pH值，进行微生物培养，绘制其生长曲线，确定该微生物在此培养条件下的生长稳定期；上述的碱性溶液中包括最适pH调节剂A类液；
[0015] (3)筛选最适生长pH值：
[0016] 在步骤(2)的条件下进行培养，在微生物进入生长稳定期前，利用A液调节pH值；当进入稳定期后，利用C液将pH降至该微生物生长pH范围的最低值，维持8-12min后，流加B液提高pH值，直至达到该微生物生长pH范围的最高值，该pH升高过程在该微生物的生长稳定期内完成，根据pH变化过程中溶氧值的变化情况，得出溶氧值最低时的pH值，为该微生物的最适生长pH值；
[0017] (4)验证该微生物的最适生长pH值：
[0018] 在步骤(2)的条件下，设置不同的pH值，所述的pH值包括好氧微生物的最适生长pH值，利用A液调节pH值进行培养，根据不同pH水平对微生物生长的影响，进一步确定该微生物的最适生长pH值。
[0019] pH调节剂包括常用的碱性pH调节剂和酸性pH调节剂；
[0022] 好氧微生物经过种子培养，采用微生物全自动生长分析仪或者三角瓶发酵培养，根据含有pH调节剂离子无机盐的添加浓度对微生物生长的影响，筛选最适pH调节剂；采用发酵罐培养，根据稳定期内溶氧值随pH水平的变化情况，确定微生物的最适生长pH值。
[0023] 根据好氧微生物的生长特性，选择适宜的种子培养条件和发酵培养条件，其中：种子培养条件为三角瓶培养，发酵培养条件包括微生物全自动生长分析仪或者三角瓶、以及发酵罐的培养条件。
[0024] 好氧微生物菌种为牛源大肠杆菌BXDC-N03、猪圆环病毒Cap蛋白表达菌株E.coliBZCP、猪败血性链球菌ST171株、副猪嗜血杆菌BZXM-F05、禽巴氏杆菌BZXM-Q03、L-色氨酸生产菌株E.coli BZTRP中的任一种。
[0025] 本发明的发明构思是，通过种子培养，在微生物全自动生长分析仪或者三角瓶中添加不同浓度含有pH调节剂离子的无机盐进行发酵培养，根据不同浓度的离子对好氧微生物生长的影响，合理推断含有不同离子pH调节剂对该微生物生长的影响，得出最佳的pH调节剂，并且通过采用不同pH调节剂来调节该微生物培养过程中的pH值来验证该最适pH调节剂及其筛选方法的准确性。在发酵罐上发酵培养，确定利用最适pH调节剂进行好氧微生物培养的稳定期，利用对该微生物生长无显著影响的碱性pH调节剂和酸性pH调节剂来提高或者降低稳定期内pH值，根据稳定期内溶氧值随pH水平的变化情况，确定溶氧值最低时的pH值为该微生物的最适生长pH值，并且通过设定不同的pH值进行该微生物培养来验证该最适生长pH值及其筛选方法的准确性；所述应用对该微生物生长无显著影响的碱性pH调节剂和酸性pH调节剂来提高或者降低稳定期内pH值，可排除在pH值变化过程中pH调节剂本身对溶氧值的影响，保障pH值变化是引起稳定期内溶氧值变化的唯一因素。
[0026] 本发明的有益效果在于，对好氧微生物菌种先种子培养，然后分别采用微生物全自动生长分析仪或者三角瓶发酵培养筛选该好氧微生物的最适pH调节剂；发酵罐发酵培养筛选该好氧微生物的最适pH值。本发明的发酵过程中，在微生物全自动生长分析仪或者三角瓶中，向培养基中添加不同浓度含有常用碱性pH调节剂阳离子或者酸性pH调节剂阴离子的无机盐，通过无机盐添加对该微生物生长的影响，得出碱性pH调节剂阳离子和酸性pH调节剂阴离子对该微生物生长的影响，则合理推断含有不同离子的pH调节剂对该微生物生长的影响，从而准确的筛选了该微生物的最适pH调节剂；
[0027] 在发酵罐发酵培养中，基于好氧微生物生长稳定期耗氧水平为一定值，通过利用对溶氧值无影响的碱性pH调节剂和酸性pH调节剂提高或者降低稳定期内pH水平，根据溶氧值随pH水平的变化，得出溶氧值最低时的pH水平，则快速确定该微生物的最适生长pH值。克服了普通方法中利用不同pH调节剂调节pH和设定不同pH水平的发酵实验来筛选最适pH调节剂和生长pH值方法存在的工作量大、费时费力、准确性低的缺陷。通过本发明的方法筛选，得到了好氧微生物最适pH调节剂和以及确定了好氧微生物生长最适的pH值，操作简单、快速，且准确度高。附图说明
[0028] 图1为实施例1中无机盐添加量对牛源大肠杆菌培养的影响图；
[0029] 图2为实施例1中pH调节剂对牛源大肠杆菌生长的影响图；
[0030] 图3为实施例1中牛源大肠杆菌稳定期内溶氧值随pH水平的变化图；
[0031] 图4为实施例1中pH水平对牛源大肠杆菌生长的影响图；
[0032] 图5为实施例2中无机盐添加量对E.coli BZCP培养的影响图；
[0033] 图6为实施例2中pH调节剂对E.coli BZCP生长的影响图；
[0034] 图7为实施例2中E.coli BZCP稳定期内溶氧值随pH水平的变化图；
[0035] 图8为实施例2中pH水平对E.coli BZCP生长的影响图；
[0036] 图9为实施例3中无机盐添加量对猪败血性链球菌ST171培养的影响图；
[0037] 图10为实施例3中pH调节剂对猪败血性链球菌ST171生长的影响图；
[0038] 图11为实施例3中猪败血性链球菌ST171稳定期内溶氧值随pH水平的变化图；
[0039] 图12为实施例3中pH水平对猪败血性链球菌ST171生长的影响图；
[0040] 图13为实施例4中无机盐添加量对副猪嗜血杆菌培养的影响图；
[0041] 图14为实施例4中pH调节剂对副猪嗜血杆菌生长的影响图；
[0042] 图15为实施例4中副猪嗜血杆菌稳定期内溶氧值随pH水平的变化图；
[0043] 图16为实施例4中pH水平对副猪嗜血杆菌生长的影响图；
[0044] 图17为实施例5中无机盐添加量对禽巴氏杆菌培养的影响图；
[0045] 图18为实施例5中pH调节剂对禽巴氏杆菌生长的影响图；
[0046] 图19为实施例5中禽巴氏杆菌稳定期内溶氧值随pH水平的变化图；
[0047] 图20为实施例5中pH水平对禽巴氏杆菌生长的影响图；
[0048] 图21为实施例6中无机盐添加量对E.coli BZTRP培养的影响图；
[0049] 图22为实施例6中pH调节剂对E.coli BZTRP生长的影响图；
[0050] 图23为实施例6中E.coli BZTRP稳定期内溶氧值随pH水平的变化图；
[0051] 图24为实施例6中pH水平对E.coli BZTRP生长的影响图。
具体实施方式
[0052] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作更进一步的限定，以便本领域技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。
[0053] 实施例1
[0054] 名称：快速筛选牛源大肠杆菌的最适pH调节剂和生长pH值
[0055] 菌株：牛源大肠杆菌BXDC-N03，由山东省滨州畜牧兽医研究院提供。
[0056] 培养基：种子培养基与发酵培养基均为微生物培养基(山东阳谷润鑫生物制品有限公司)。培养条件：
[0057] 种子培养：挑取单菌落，接种至装有60mL培养基的250mL三角瓶中，pH 7.0，温度37℃。转速180rpm，培养时间12h。
[0058] 发酵培养：
[0059] 微生物全自动生长分析仪：接种量2％，培养基初始pH 7.0，温度37℃，振幅中度，频率中度，培养18h。
[0060] 发酵罐：接种量5％，pH维持在7.0，温度37℃，溶氧水平维持在30％，培养20h。
[0061] 操作步骤
[0062] (1)pH调节剂的筛选
[0063] 在微生物全自动生长分析仪中，向培养基中添加不同浓度的NaCl、KCl、NH4Cl、NaNO3及Na2SO4来考察Na+、K+、NH4+、Cl-、NO3-及SO42-对牛源大肠杆菌生长的影响(图1)。由图1(a、b、c)得知，添加NaCl对牛源大肠杆菌生长无显著影响，则Na+离子对牛源大肠杆菌生长无显著影响，故推断NaOH对牛源大肠杆菌生长无显著影响和选用NaOH为B液；添加KCl和NH4Cl均可提高牛源大肠杆菌细胞浓度，且添加NH4Cl的细胞浓度高于添加KCl时，则NH4+离子最利于牛源大肠杆菌生长，故推断NH3·H2O最利于牛源大肠杆菌生长和选用NH3·H2O为A液。由图1(a、d、e)得知，添加NaCl对牛源大肠杆菌生长无显著影响，则Cl-离子对牛源大肠杆菌生长无显著影响，故推断HCl对牛源大肠杆菌生长无显著影响和选用HCl为B液；NaNO3和Na2SO4的添加会提高牛源大肠杆菌的细胞浓度，则HNO3和H2SO4会促进牛源大肠杆菌的生长。
[0064] (2)最适pH调节剂验证和牛源大肠杆菌稳定期确定
[0065] 在发酵罐中培养牛源大肠杆菌，分别以NH3·H2O、KOH及NaOH溶液调节pH值(图2)。由图2得知，以NH3·H2O、KOH作为pH调节剂时的细胞浓度均高于以NaOH作为pH调节剂的，且以NH3·H2O作为pH调节剂时的细胞浓度最高，则证明A液NH3·H2O为牛源大肠杆菌的最适pH调节剂和步骤(1)中筛选pH调节剂的准确性，进而证明NaOH和HCl作为B液和C液的准确性；
确定以NH3·H2O溶液作为pH调节剂时，牛源大肠杆菌的稳定期为12～17h。
确定以NH3·H2O溶液作为pH调节剂时，牛源大肠杆菌的稳定期为12～17h。
[0066] (3)最适生长pH值的筛选
[0067] 在发酵罐中培养牛源大肠杆菌，培养前13h时，以A液调节pH值；当在13h时，流加C液将pH降至6.0(该过程耗时10min)，稳定10min，待溶氧值稳定后，开始流加B液，将pH值由6.0升至9.0(该过程耗时30min)。pH值由6.0升至9.0过程中，溶氧值发生相应变化(图3)，在pH值为7.2时，溶氧值最低，则表明此时牛源大肠杆菌的耗氧水平最高，说明牛源大肠杆菌在pH值7.2时的生长最旺盛，因此确定牛源大肠杆菌的最适生长pH值为7.2。
[0068] (4)最适生长pH值的验证
[0069] 在发酵罐中培养牛源大肠杆菌，利用A液将pH值分别维持在6.8、7.0、7.2、7.4及7.6，培养17h，观察试验结果(图4)。pH维持在7.2时，菌体浓度最高，则表明牛源大肠杆菌的最适生长pH值为7.2，从而证明步骤(3)筛选最适生长pH值方法的准确性。
[0070] 实施例2
[0071] 名称：快速筛选重组大肠杆菌的最适pH调节剂和生长pH值
[0072] 菌株：猪圆环病毒Cap蛋白表达菌株E.coli BZCP，由山东省滨州畜牧兽医研究院提供。
[0073] 培养基：种子培养基和发酵培养基均为工程菌专用培养基(山东阳谷润鑫生物制品有限公司)。
[0074] 培养条件：
[0075] 种子培养：挑取单菌落，接种至装有60mL培养基的250mL三角瓶中，pH 7.0，温度37℃。转速180rpm，培养时间12h。
[0076] 发酵培养：
[0077] 三角瓶：接种量2％，培养基初始pH 7.0，温度37℃，转速150rpm，培养18h。发酵罐：接种量2％，pH维持在7.0，温度37℃，溶氧水平维持在30％，培养18h。
[0078] 操作步骤
[0079] (1)pH调节剂的筛选
[0080] 在三角瓶中培养，向培养基中添加不同浓度的NaCl、KCl、NH4Cl、NaNO3及Na2SO4来考察Na+、K+、NH4+、Cl-、NO3-及SO42-对E.coli BZCP生长的影响(图5)。由图5(a、b、c)得知，NaCl的添加对E.coli BZCP生长无显著影响，则Na+离子对E.coli BZCP的生长无显著影响，故推断NaOH对E.coli BZCP生长无显著影响和选用NaOH为B液；KCl和NH4Cl的添加均可提高E.coli BZCP细胞浓度，且添加NH4Cl的细胞浓度高于添加KCl时，则NH4+离子最利于E.coli BZCP生长，故推断NH3·H2O最利于E.coliBZCP生长和选用NH3·H2O为A液。由图1(a、d、e)得知，NaCl的添加对E.coli BZCP生长无显著影响，则Cl-离子对E.coli BZCP生长无显著影响，故推断HCl对E.coli BZCP生长无显著影响和选用HCl为B液；NaNO3和Na2SO4的添加会提高E.coli BZCP的细胞浓度，则HNO3和H2SO4会促进E.coli BZCP的生长。
[0081] (2)最适pH调节剂验证和E.coli BZCP稳定期确定
[0082] 在发酵罐中培养E.coli BZCP，分别以NH3·H2O、KOH及NaOH溶液调节pH值(图6)。由图6得知，以NH3·H2O、KOH作为pH调节剂时的细胞浓度均高于以NaOH作为pH调节剂的，且以NH3·H2O作为pH调节剂时的细胞浓度最高，则证明A液NH3·H2O为E.coli BZCP的最适pH调节剂和步骤(1)中筛选pH调节剂的准确性，进而证明NaOH和HCl作为B液和C液的准确性；确定以NH3·H2O溶液作为pH调节剂时，E.coliBZCP的稳定期为12～17h。
[0083] (3)最适生长pH值的筛选
[0084] 在发酵罐中培养E.coli BZCP，培养前13h时，以A液调节pH值；当在13h时，流加C液将pH降至6.0(该过程耗时10min)，稳定10min，溶氧值稳定后，开始流加B液，将pH值由6.0升至9.0(该过程耗时30min)。pH值由6.0升至9.0过程中，溶氧值发生相应变化(图7)，在pH值为7.1时，溶氧值最低，则表明此时E.coli BZCP的耗氧水平最高，说明E.coli BZCP在pH值7.1时的生长最旺盛，因此确定E.coliBZCP的最适生长pH值为7.1。
[0085] (4)最适生长pH值的验证
[0086] 在发酵罐中培养E.coli BZCP，利用A液将pH值分别维持在6.7、6.9、7.1、7.3及7.5，培养16h，观察试验结果(图8)。pH维持在7.1时，菌体浓度最高，则表明E.coli BZCP的最适生长pH值为7.1，从而证明步骤(3)筛选最适生长pH值方法的准确性。
[0087] 实施例3
[0088] 名称：快速筛选猪败血性链球菌ST171株的最适pH调节剂及生长pH值
[0089] 菌株：猪败血性链球菌ST171株，由山东省滨州畜牧兽医研究院提供。
[0090] 培养基：种子培养基和发酵培养基均为微生物培养基(山东阳谷润鑫生物制品有限公司)。
[0091] 培养条件：
[0092] 种子培养：挑取单菌落，接种至装有60mL培养基的250mL三角瓶中，pH 7.0，温度37℃。转速150rpm，培养时间8h。
[0093] 发酵培养：
[0094] 微生物全自动生长分析仪：接种量2％，培养基初始pH 7.0，温度37℃，振幅中度，频率中度，培养12h。
[0095] 发酵罐：接种量2％，pH维持在7.2，温度37℃，溶氧水平维持在30％，培养12h。
[0096] 操作步骤：
[0097] (1)pH调节剂的筛选
[0098] 在微生物全自动生长分析仪中，向培养基中添加不同浓度的NaCl、KCl、NH4Cl、NaNO3及Na2SO4来考察Na+、K+、NH4+、Cl-、NO3-及SO42-对猪败血性链球菌ST171株生长的影响(图9)。由图9(a、b、c)得知，NaCl的添加对猪败血性链球菌ST171株生长无显著影响，则Na+离子对猪败血性链球菌ST171株的生长无显著影响，故推断NaOH对猪败血性链球菌ST171株生长无显著影响和选用NaOH为B液；NH4Cl的添加降低猪败血性链球菌ST171株细胞浓度，则NH4+离子不利于猪败血性链球菌ST171株生长，故NH3·H2O不能作为猪败血性链球菌ST171株培养的pH调节剂；KCl的添加提高猪败血性链球菌ST171株细胞浓度，则K+离子利于猪败血性链球菌ST171株生长，故KOH可促进猪败血性链球菌ST171株生长和选用KOH为A液。由图1(a、d、e)得知，NaCl的添加对猪败血性链球菌ST171株生长无显著影响，则Cl-离子对猪败血性链球菌ST171株生长无显著影响，故推断HCl对猪败血性链球菌ST171株生长无显著影响和选用HCl为B液；NaNO3和Na2SO4的添加会提高猪败血性链球菌ST171株的细胞浓度，则HNO3和H2SO4作为pH调节剂会促进猪败血性链球菌ST171株的生长。
[0099] (2)最适pH调节剂验证和猪败血性链球菌ST171株稳定期确定
[0100] 在发酵罐中培养猪败血性链球菌ST171，分别以KOH、NaOH以及NH3·H2O溶液调节pH值(图10)。由图10得知，以KOH作为pH调节剂时的细胞浓度最高，且以NH3·H2O作为pH调节剂时的细胞浓度最低，则证明A液KOH为猪败血性链球菌ST171株的最适pH调节剂和步骤(1)中筛选pH调节剂的准确性，进而证明NaOH和HCl作为B液和C液的准确性；确定以KOH溶液作为pH调节剂时，猪败血性链球菌ST171株的稳定期为8～10h。
[0101] (3)最适生长pH值的筛选
[0102] 在发酵罐中培养猪败血性链球菌ST171，培养前9h时，以A液调节pH值；当在9h时，流加C液将pH降至6.0(该过程耗时10min)，稳定10min，溶氧值稳定后，开始流加B液，将pH值由6.0升至9.0(该过程耗时30min)。pH值由6.0升至9.0过程中，溶氧值发生相应变化(图11)，在pH值为7.5时，溶氧值最低，则表明此时猪败血性链球菌ST171株的耗氧水平最高，说明猪败血性链球菌ST171株在pH值7.5时的生长最旺盛，因此确定猪败血性链球菌ST171株的最适生长pH值为7.5。(4)最适生长pH值的验证
[0103] 在发酵罐中培养猪败血性链球菌ST171，利用A液将pH值分别维持在7.1、7.3、7.5及7.7，培养10h，观察试验结果(图12)。在pH维持在7.5时，菌体浓度最高，则表明猪败血性链球菌ST171株的最适生长pH值为7.5，从而证明步骤(3)筛选最适生长pH值方法的准确性。
[0104] 实施例4
[0105] 名称：快速筛选副猪嗜血杆菌的最适pH调节剂和生长pH值
[0106] 菌株：副猪嗜血杆菌BZXM-F05，由山东省滨州畜牧兽医研究院提供。
[0107] 培养基：种子培养基和发酵培养基均为TSB培养基(北京双旋微生物培养基制品厂)。
[0108] 培养条件：
[0109] 种子培养：挑取单菌落，接种至装有60mL培养基的250mL三角瓶中，pH 7.0，温度37℃。转速100rpm，培养时间16h。
[0110] 发酵培养：
[0111] 三角瓶：接种量2％，培养基初始pH 7.0，温度37℃，转速120rpm，培养24h。发酵罐：接种量2％，pH维持在7.0，温度37℃，溶氧水平维持在10％，培养24h。
[0112] 操作步骤：
[0113] (1)pH调节剂的筛选
[0114] 在三角瓶培养中，向培养基中添加不同浓度的NaCl、KCl、NH4Cl、NaNO3及Na2SO4来考察Na+、K+、NH4+、Cl-、NO3-及SO42-对副猪嗜血杆菌生长的影响(图13)。由图13(a、b、c)得知，NaCl的添加对副猪嗜血杆菌生长无显著影响，则Na+离子对副猪嗜血杆菌的生长无显著影响，故推断NaOH对副猪嗜血杆菌生长无显著影响和选用NaOH为B液；NH4Cl的添加降低副猪嗜血杆菌的细胞浓度，则NH4+离子不利于副猪嗜血杆菌生长，故NH3·H2O不能作为副猪嗜血杆菌培养的pH调节剂；KCl的添加提高副猪嗜血杆菌细胞浓度，则K+离子有利于副猪嗜血杆菌生长，故KOH可促进副猪嗜血杆菌生长和选用KOH为A液。由图1(a、d、e)得知，NaCl的添加对副猪嗜血杆菌生长无显著影响，则Cl-离子对副猪嗜血杆菌生长无显著影响，故推断HCl对副猪嗜血杆菌生长无显著影响和选用HCl为B液；NaNO3和Na2SO4的添加会提高副猪嗜血杆菌的细胞浓度，则HNO3和H2SO4作为pH调节剂会促进副猪嗜血杆菌的生长。
[0115] (2)最适pH调节剂验证和副猪嗜血杆菌稳定期确定
[0116] 在发酵罐中培养副猪嗜血杆菌，以KOH、NaOH以及NH3·H2O溶液调节pH值(图14)。由图14得知，以KOH作为pH调节剂时的细胞浓度最高，且以NH3·H2O作为pH调节剂时的细胞浓度最低，则证明A液KOH为副猪嗜血杆菌的最适pH调节剂和步骤(1)中筛选pH调节剂的准确性，进而证明NaOH和HCl作为B液和C液的准确性；确定以KOH溶液作为pH调节剂时，副猪嗜血杆菌的稳定期为16～20h。
[0117] (3)最适生长pH值的筛选
[0118] 在发酵罐中培养副猪嗜血杆菌，培养前17h时，以A液调节pH值；当在17h时，流加C液将pH降至6.0(该过程耗时10min)，稳定10min，溶氧值稳定后，开始流加B液，将pH值由6.0升至9.0(该过程耗时30min)。pH值由6.0升至9.0过程中，溶氧值发生相应变化(图15)，在pH值为7.2时，溶氧值最低，则表明此时副猪嗜血杆菌的耗氧水平最高，说明副猪嗜血杆菌在pH值7.2时的生长最旺盛，因此确定副猪嗜血杆菌的最适生长pH值为7.2。
[0119] (4)最适生长pH值的验
[0120] 在发酵罐中培养副猪嗜血杆菌，利用A液将pH值分别维持在6.8、7.0、7.2、7.4及7.6，培养20h，观察试验结果(图16)。在pH维持在7.2时，菌体浓度最高，则表明副猪嗜血杆菌的最适生长pH值为7.2，从而证明步骤(3)筛选最适生长pH值方法的准确性。
[0121] 实施例5
[0122] 名称：快速筛选禽巴氏杆菌的最适pH调节剂和生长pH值
[0123] 菌株：禽巴氏杆菌BZXM-Q03，由山东省滨州畜牧兽医研究院提供。
[0124] 培养基：种子培养基和发酵培养基均为微生物培养基(山东阳谷润鑫生物制品有限公司)。
[0125] 培养条件：
[0126] 种子培养：挑取单菌落，接种至装有60mL培养基的250mL三角瓶中，pH 7.0，温度37℃。转速100rpm，培养时间10h。
[0127] 发酵培养：
[0128] 微生物全自动生长分析仪：接种量2％，培养基初始pH 7.0，温度37℃，振幅中度，频率中度，培养12h。
[0129] 发酵罐：接种量2％，pH维持在7.0，温度37℃，溶氧水平维持在20％，培养12h。
[0130] 操作步骤：
[0131] (1)pH调节剂的筛选
[0132] 在微生物全自动生长分析仪中，向培养基中添加不同浓度的NaCl、KCl、NH4Cl、NaNO3及Na2SO4来考察Na+、K+、NH4+、Cl-、NO3-及SO42-对禽巴氏杆菌生长的影响(图17)。由图17(a、b、c)得知，NaCl的添加对禽巴氏杆菌生长无显著影响，则Na+离子对禽巴氏杆菌的生长无显著影响，故推断NaOH对禽巴氏杆菌生长无显著影响和选用NaOH为B液；NH4Cl的添加降低禽巴氏杆菌的细胞浓度，则NH4+离子不利于禽巴氏杆菌生长，故NH3·H2O不能作为禽巴氏杆菌培养的pH调节剂；KCl的添加提高禽巴氏杆菌细胞浓度，则K+离子有利于禽巴氏杆菌生长，故KOH可促进禽巴氏杆菌生长和选用KOH为A液。由图1(a、d、e)得知，NaCl的添加对禽巴氏杆菌生长无显著影响，则Cl-离子对禽巴氏杆菌生长无显著影响，故推断HCl对禽巴氏杆菌生长无显著影响和选用HCl为B液；NaNO3和Na2SO4的添加会提高禽巴氏杆菌的细胞浓度，则HNO3和H2SO4作为pH调节剂会促进禽巴氏杆菌的生长。
[0133] (2)最适pH调节剂验证和禽巴氏杆菌稳定期确定
[0134] 在发酵罐中培养禽巴氏杆菌，分别以KOH、NaOH以及NH3·H2O溶液调节pH值(图18)。由图18得知，以KOH作为pH调节剂时的细胞浓度最高，且以NH3·H2O作为pH调节剂时的细胞浓度最低，则证明A液KOH禽巴氏杆菌的最适pH调节剂和步骤(1)中筛选pH调节剂的准确性，进而证明NaOH和HCl作为B液和C液的准确性；确定以KOH溶液作为pH调节剂时，禽巴氏杆菌的稳定期为8～10h。
[0135] (3)最适生长pH值的筛选
[0136] 在发酵罐中培养禽巴氏杆菌，培养前8.5h时，以A液调节pH值；当在8.5h时，流加C液将pH降至6.0(该过程耗时10min)，稳定10min，溶氧值稳定后，开始流加B液，将pH值由6.0升至9.0(该过程耗时30min)。pH值由6.0升至9.0过程中，溶氧值发生相应变化(图19)，在pH值为7.2时，溶氧值最低，则表明此时禽巴氏杆菌的耗氧水平最高，说明禽巴氏杆菌在pH值7.2时的生长最旺盛，因此确定禽巴氏杆菌的最适生长pH值为7.2。
[0137] 则禽巴氏杆菌的最适生长pH值为7.2。
[0138] (4)最适生长pH值的验证
[0139] 在发酵罐中培养禽巴氏杆菌，利用A液将pH值分别维持在6.8、7.0、7.2、7.4及7.6，培养20h，观察试验结果(图20)。在pH维持在7.2时，菌体浓度最高，则表明禽巴氏杆菌的最适生长pH值为7.2，从而证明步骤(3)筛选最适生长pH值方法的准确性。
[0140] 实施例6
[0141] 名称：快速筛选L-色氨酸生产菌株的最适pH调节剂和生长pH值
[0142] 菌株：L-色氨酸生产菌株E.coli BZTRP，由山东省滨州畜牧兽医研究院提供。
[0144] 培养条件：
[0145] 种子培养：挑取单菌落，接种至装有60mL培养基的250mL三角瓶中，pH 7.0，温度37℃，转速180rpm，培养时间12h。
[0146] 发酵培养：
[0147] 三角瓶培养：接种量10％，培养基初始pH 7.0，温度37℃，转速180rpm，培养40h。
[0148] 发酵罐：接种量10％；pH维持在7.0；温度37℃；溶氧水平维持在20％；初始葡萄糖耗尽时，采用溶氧反馈补料策略补加葡萄糖溶液；培养40h。
[0149] 操作步骤：
[0150] (1)pH调节剂的筛选
[0151] 在微生物全自动生长分析仪中，向培养基中添加不同浓度的NaCl、KCl、NH4Cl、NaNO3及Na2SO4来考察Na+、K+、NH4+、Cl-、NO3-及SO42-对E.coli BZTRP生长的影响(图21)。由图21(a、b、c)得知，NaCl的添加对E.coli BZTRP生长无显著影响，则Na+离子对E.coli BZTRP的生长无显著影响，故推断NaOH对E.coli BZTRP生长无显著影响和选用NaOH为B液；KCl和NH4Cl的添加均可提高E.coli BZTRP细胞浓度，且添加NH4Cl的细胞浓度高于添加KCl时，则NH4+离子最利于E.coli BZTRP生长，故推断NH3·H2O最利于E.coli BZTRP生长和选用NH3·H2O为A液。由图1(a、d、e)得知，NaCl的添加对E.coli BZTRP生长无显著影响，则Cl-离子对E.coli BZTRP生长无显著影响，故推断HCl对E.coli BZTRP生长无显著影响和选用HCl为B液；NaNO3和Na2SO4的添加会提高E.coli BZTRP的细胞浓度，则HNO3和H2SO4会促进E.coli BZTRP的生长。
[0152] (2)最适pH调节剂验证和E.coli BZTRP稳定期确定
[0153] 在发酵罐中培养E.coli BZTRP，分别以NH3·H2O、KOH以及NaOH溶液调节pH值(图22)。由图22得知，以NH3·H2O、KOH作为pH调节剂时的细胞浓度均高于以NaOH作为pH调节剂的，且以NH3·H2O作为pH调节剂时的细胞浓度最高，则证明A液NH3·H2O为E.coli BZTRP的最适pH调节剂和步骤(1)中筛选pH调节剂的准确性，进而证明NaOH和HCl作为B液和C液的准确性；确定以NH3·H2O溶液作为pH调节剂时，E.coli BZTRP稳定期为26～36h。
[0154] (3)最适生长pH值的筛选
[0155] 在发酵罐中培养E.coli BZTRP，培养前28h时，以A液调节pH值；当在28h时，流加C液将pH降至5.5(该过程耗时15min)，稳定10min，溶氧值稳定后，开始流加B液，将pH值由5.5升至8.5(该过程耗时30min)。pH值由5.5升至8.5过程中，溶氧值发生相应变化(图23)，在pH值为7.0时，溶氧值最低，则表明此时E.coli BZTRP的耗氧水平最高，说明E.coli BZTRP在pH值7.0时的生长最旺盛，因此确定E.coli BZTRP的最适生长值pH为7.0。
[0156] (4)最适生长pH值的验证
[0157] 在发酵罐中培养E.coli BZTRP，利用A液将pH值分别维持在6.4、6.8、7.0、7.2、及7.4，培养36h，观察试验结果(图24)。在pH维持在7.0时，菌体浓度最高，则表明E.coli BZTRP的最适生长pH值为7.0，从而证明步骤(3)筛选最适生长pH值方法的准确性。
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