技术领域
[0001] 本
发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种利用基于全内反射荧光倒置显微镜检测单个生物标识物的方法。
背景技术
[0002] 许多由病原
微生物引发的
疾病在当今世界范围内广泛发生与传播，严重危害到人类和动
植物的健康，影响人类的生活品质。了解病原微生物的属性，对于疾病的
预防和
治疗是必不可少的环节。目前检测病原的方法有很多，如酶联
免疫吸附试验(ELISA)，免疫印迹试验(Western Blot)以及聚合酶链式反应(PCR)等，但这些方法或多或少都存在一些问题，例如操作复杂、成本高、灵敏度低等缺点。生物体组织或者细胞内微量的病原使用常规方法难以检测出来，这就造成了对患病动物无法确定最佳的治疗手段，甚至会错过最佳治疗时机，导致病症加重。因此，高效灵敏地检测病原对于疾病防控与治疗至关重要。
[0003] 全内反射(total internal reflection)是一种光学现象。光线从折射率较高的光密介质(如玻璃，折射率1.52)进入折射率较低的光疏介质(如液体溶液，折射率1.33～1.38)，入射
角为θ1，折射角为θ2，当存在n1sinθ1＝n2sinθ2时，部分入射光线发生折射，部分发生反射。当入射角θ1大于或者等于临界角θc时，θ1≥θc，此时光线不再透射进介质2，发生了全反射。
[0004] 全内反射发生时，会产生一种具有特殊性质的隐失波，这种隐失波的强度在样品界面
水相中沿垂直界面的Z轴呈指数衰减，因而利用这种荧
光激发方式只能够激发固定在盖玻片表面100nm范围内的荧光分子，游离于溶液中的荧光分子不会被激发光激发，所以采集到光
信号背景噪音比较低。使用全内反射激发方式得到的图像背景很低，具有足够高的
信噪比，可以分辨出单个分子的荧
光信号。因此，使用全内反射荧光显微镜可以对病原的单个生物标识物进行观察，具有极高的检测灵敏度。本发明中，我们公开了一种使用基于全内反射的荧光倒置显微镜检测生物标识物的方法，此方法操作简单，成本低，而且具有很高的检测灵敏度，对于病原检测和疾病诊疗具有重要意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种固定生物标识物的方法。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种利用基于全内反射荧光倒置显微镜检测单个生物标识物的方法。该方法采用荧
光标记的检测分子与生物标识物间
接地连接，通过全内反射荧光显微镜采集荧光标记的检测分子的荧光点数目，达到检测生物标识物的目的。
[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0008] 一种固定生物标识物的方法,包括如下步骤：
[0009] (1)将载体的表面先用生物素化PEG修饰；
[0010] (2)向所述的载体上加入亲和素，生物素与亲和素之间会发生连接；
[0011] (3)再向所述的载体上加入生物素标记的连接物1，生物素与亲和素之间发生连接，所述的连接物1被固定到所述的载体上；
[0012] (4)再加入连接物2，与所述的连接物1结合；
[0013] (5)加入生物标识物，生物标识物会与所述的连接物2发生连接，所述的连接物2作为诱饵捕获生物标识物；
[0014] (6)再加入与生物标识物反应的连接物3，最后加入荧光标记的检测分子与所述的连接物3连接，依靠生物标识物与连接物间特异性反应将生物标识物固定在所述在载体上，形成一种“夹心”的单个生物标识物检测模式。
[0015] 所述生物标识物为DNA、RNA、
蛋白质、生物小分子、细胞、细菌和病毒中的一种；所述连接物1为探针或二抗；所述的连接物2为探针或单抗；所述的连接物3为探针或多抗；所述荧光标记的检测分子为荧光标记的探针或荧光标记的二抗。
[0016] 所述的生物标识物为DNA、RNA时，所述连接物1为探针，所述的连接物2为探针，所述的连接物3为探针，所述荧光标记的检测分子为荧光标记的探针；所述的生物标识物为蛋白质、细胞、细菌或病毒时，所述连接物1为二抗，所述的连接物2为单抗，所述的连接物3为多抗，所述荧光标记的检测分子为荧光标记的二抗。
[0017] 所述的亲和素为链霉亲和素。
[0018] 所述的生物标识物可以为蛋白，例如猪
圆环病毒的PCV2cap蛋白(即
抗原PCV2)。作为一种技术方案，所述的生物标识物为
猪圆环病毒的PCV2cap蛋白时，所述的连接物1为羊抗鼠二抗，所述的连接物2为鼠源单抗，所述的连接物3为兔源多抗，所述荧光标记的检测分子为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔二抗。
[0019] 所述的载体为透明载体，作为一种优选技术方案，所述的载体为由
石英玻片制成的样品小皿，所述的样品小皿内设有封闭的加样通道和用于向加样通道加样的加样孔。
[0020] 上述样品小皿的详细制备过程为：
[0021] a、在
载玻片上钻多个孔作为加样孔并用去离子水反复清洗；
[0022] b、用体积比1:1的丙
酮/酒精溶液超声清洗载玻片和盖玻片后再用去离子水漂洗干净；
[0023] c、用1mol/L的氢
氧化
钾溶液超声清洗载玻片和盖玻片后再用去离子水漂洗干净并烘干；
[0024] d、将所述的载玻片和盖玻片置于体积比为125:5:1的甲醇/无水乙酸/
氨基
硅烷
偶联剂混合液中超声后静置反应；然后置于甲醇中超声后静置反应；再用去离子水漂洗干净并烘干；
[0025] e、取biotin-PEG和mPEG溶于0.1mol/L的
碳酸氢钠水溶液中并去除气泡得到PEG化
试剂；所述biotin-PEG、mPEG与0.1mol/L
碳酸氢钠水溶液的用量比(mg:mg:ul)为1:40:320。
[0026] f、将盖玻片架平放置后，在其上中间
位置滴加PEG化试剂液滴，将载玻片对正靠近液滴，载玻片和盖玻片会在液体张
力的作用下自动吸引在一起；
[0027] g、将吸附在一起的载玻片和盖玻片孵育过夜后在去离子水流中将载玻片和盖玻片冲洗干净并烘干；
[0028] h、间隔并列粘贴多段双面
胶带于载玻片上，在载玻片上垂直分成多个通道凹槽，将盖玻片正对通道凹槽黏在双面胶带上并压紧胶带，使得相邻通道凹槽之间互不贯通；用环氧
树脂密封所述通道凹槽的两端形成封闭的加样通道，所述的孔作为加样孔分别设在所述加样通道的两端用于向加样通道内加样。
[0029] 采用上述的方法制备的固定有生物标识物的载体。
[0030] 上述的固定有生物标识物的载体在利用全内反射荧光显微镜检测单个生物标识物中的应用，利用全内反射荧光显微镜观察所述载体表面的荧光分子，通过采集荧光分子信号准确检测固定在所述载体上的生物标识物数目。
[0031] 一种利用全内反射荧光显微镜检测单个生物标识物的方法，采用上述的方法将生物标识物固定到所述的载体上，利用全内反射荧光显微镜观察载体表面的荧光分子，通过采集荧光分子信号准确检测固定在载体上的生物标识物数目。
[0032] 本发明利用全内反射荧光显微镜检测单个生物标识物的方法，将生物素化连接物1固定到链霉亲和素包被的载体表面，间接捕获待检生物标识物(例如，核酸分子，抗原PCV2等)，生物标识物又会间接与荧光标记的检测分子连接，通过基于全内反射的模式激发荧光基团，使用荧光倒置显微镜采集荧光分子信号，得到与生物标识物反应的荧光标记的检测分子数目，去掉背景值后所得荧光分子数目可得生物标识物数目，此生物标识物即是各种疾病中的待检病原。
[0033] 检测所需的各种试剂与待检生物标识物分步骤加入到透明载体上，基于全内反射的荧光倒置显微镜只能激发透明载体表面100nm范围的荧光标记
抗体，采集荧光分子信号可以准确检测生物标识物数目。本发明方法能够有效的排除更多干扰的背景，也使得悬浮于溶液中的荧光供体分子不会被激发而发出荧光。
[0034] 本发明所述的固定生物标识物的方法是将生物标识物固定到载体(例如石英玻片)上的方法。本发明中的载体为由石英玻片制成的样品小皿，所述的样品小皿内设有封闭的加样通道和用于向加样通道加样的加样孔。所述的样品小皿是由一
块载玻片和一块盖玻片制成，通过亲和素与生物素之间的链接，以及抗原抗体反应或核酸分子与探针的反应，可以将特定的生物标识物捕获后固定到载体表面。
[0035] 本发明的特点在于1、检测步骤方便易行，只需要使用移液枪分步将试剂和待检生物标识物加入载体上，然后使用全内反射荧光显微镜观察；2、检测时间短，从加样到得出检测浓度不足1个小时即可完成；3、检测成本低，检测使用的载体由两块石英玻片即可制备，检测所用的抗体量很少；4、灵敏度高，全内反射荧光显微镜可以观察到单个生物标识物，需要待检的样品浓度低。
[0036] 本发明的有益效果：
[0037] 本发明方法利用生物素-亲和素连接以及抗原抗体反应或核酸分子与探针的反应，依靠全内反射的荧光激发方式激发固定在载体表面100nm范围内的荧光标记的检测分子，通过荧光显微镜采集到荧光分子信号，可以得到待检测生物标识物数目。由于游离于溶液中的荧光分子不被激发，所以采集到的荧光信号背景噪音比较低，具有非常高的信噪比，可以分辨出单个分子的荧光信号，从而该方法具有高检测灵敏性。此检测方法可以用于检测各种生物标识物，对于疾病中病原的发现和疾病的防治具有重大意义。
附图说明
[0038] 图1样品小皿组装图。
[0039] 图2利用全内反射荧光显微镜检测单个生物标识物原理图：
[0040] 其中，生物素化抗体是生物素标记的羊抗鼠二抗，待检测的生物标志物是猪圆环病毒2型(PCV2cap)蛋白，荧光标记的抗体是异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔二抗。
[0041] 图3为利用全内反射荧光显微镜检测单个抗原PCV2检测结果
[0042] 其中，A为显微镜成像图片 B为结果直方图
[0043] 图4为抗原PCV2稀释倍数取对数后，拟合的折线图(图C)以及线性回归分析结果(图D)
具体实施方式
[0044] 下述
实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
[0047] 以下实施例中的试验，均设置三次以上重复实验，结果取平均值。
[0048] 实施例1制作用于加样的样品小皿
[0049] 1、使用普通
钻头在厚度1mm的载玻片钻10个直径0.8mm的孔，此孔洞非常适合200ul黄色枪头加样；
[0050] 2、用去离子水将载玻片反复冲洗干净；
[0051] 3、用体积比1:1的丙酮/酒精溶液超声清洗载玻片和盖玻片20min；
[0052] 4、用去离子水漂洗三次；
[0053] 5、用1mol/L的氢氧化钾溶液超声清洗20min；
[0054] 6、用去离子水漂洗三次；
[0055] 7、在烘箱中将载玻片和盖玻片烘干；
[0056] 8、将载玻片和盖玻片置于含250ml甲醇、10ml无水乙酸、2ml氨基硅烷偶联剂的混合液超声1min，然后静置反应20min；
[0057] 9、将载玻片和盖玻片置于甲醇中超声1min，然后静置反应10min；
[0058] 10、用去离子水漂洗三次；
[0059] 11、在烘箱中将载玻片和盖玻片烘干；
[0060] 12、取1mg biotin-PEG和40mg mPEG溶于320ul 0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液中，7200g离心1min去除气泡；
[0061] 13、在超净台内将盖玻片架平放置，在其上中间位置滴加66ul PEG化试剂液滴，将载玻片对正靠近液滴，载玻片和盖玻片会在液体
张力的作用下自动吸引在一起；
[0062] 14、将吸附在一起的载玻片和盖玻片架于
支架上，置于底部有水的金属
铝盒中孵育过夜；
[0063] 15、在去离子水流中将载玻片和盖玻片冲洗干净，在烘箱中烘干；
[0064] 16、粘贴6段双面胶带于载玻片上，将载玻片的10个孔洞垂直并列分成5个通道凹槽；然后将盖玻片正对凹槽黏在双面胶带上，用黄色枪头压紧胶带，使得相邻通道之间互不贯通；用
环氧树脂密封通道凹槽的两端形成封闭的加样通道，使得每个加样通道的两端分别对应两个孔洞，所述的孔洞作为加样孔用于加样。
[0065] 实施例2抗体与待检测抗原的分步加样对病原分子进行固定，并使用基于全内反射的荧光倒置显微镜获取病原分子数目
[0066] 1、取溶解在T50(10mmol/L Tris-HCl，(pH 8.0)和50mmol/L NaCl)溶液中的0.2mg/mL链霉亲和素10ul加入样品小皿的加样通道中，室温孵育5min；生物素与亲和素之间就会发生连接；
[0067] 2、取20ul的T50溶液加入加样通道，洗去未结合的链霉亲和素；
[0068] 3、加入10ul的40nM生物素标记的羊抗鼠二抗到加样通道，室温孵育15min；生物素与亲和素之间就会发生连接，二抗就被固定到通道表面；
[0069] 4、用20ul的T50-BSA(溶解在T50溶液中的0.1mg/ml
牛血清
白蛋白(BSA)，BSA可以防止蛋白非特异性吸附在玻片上)加入通道清洗两次，洗去未结合的二抗；
[0070] 5、取10ul的20nM鼠源单抗加入加样通道，室温孵育15min；鼠源单抗与二抗结合，鼠源单抗作为诱饵捕获抗原PCV2；
[0071] 6、用20ul的T50-BSA加入加样通道清洗两次，洗去未结合的单抗；
[0072] 7、取10ul的抗原PCV2加入加样通道，室温孵育15min；抗原PCV2就会与捕获抗体发生连接；
[0073] 8、用20ul的T50-BSA加入加样通道清洗两次，洗去未结合的蛋白
[0074] 9、取10ul的10nM兔源多抗加入加样通道，室温孵育15min；使之与抗原PCV2反应；
[0075] 10、用20ul的T50-BSA加入加样通道清洗两次，洗去未结合的多抗；
[0076] 11、取10ul的2nM荧光标记的羊抗兔二抗(异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔二抗)加入加样通道，室温孵育15min；使之与兔源多抗连接。依靠抗原PCV2与抗体间特异性反应将抗原PCV2固定在所述样品小皿的加样通道内，形成一种“夹心”的抗原分子检测模式；
[0077] 12、用20ul的T50-BSA加入加样通道清洗两次，洗掉未结合的兔二抗。
[0078] 13、采用488nm
波长的激发光激发FITC，通过全内反射荧光倒置显微镜采集荧光分子信号；
[0079] 14、在另外一个样品小皿通道中不加抗原作为平行对照，得到背景值。通过全内反射荧光显微镜观测到的荧光分子信号，减去对照中背景值，最终所得的荧光分子数目就是检测到的生物标识物数目。
[0080] 本发明方法具有高检测灵敏性，实验结果显示(见表1)，随着抗原PCV2稀释倍数的增大方差值不断减小，说明数据趋于稳定，实验的重复性效果也更好，当抗原PCV2稀释浓度为10倍的时候，方差值较大，数据偏于离散，是由于抗原PCV2的浓度过高，抗原PCV2完全和鼠源单抗相结合，过多的抗原PCV2可能会和荧光抗体产生微弱的非特异性结合，导致计数结果有偏差。不过，这里我们关注的是其是否还能被稀释，以及在高倍稀释条件下荧光点计数的
稳定性以及可重复性。
[0081] 表1不同抗原PCV2稀释倍数下的检测结果
[0082]抗原PCV2稀释倍数 背景荧光点数 荧光点平均个数 方差
10 149 537 11.08107
20 152 394 8.90034
40 147 249 4.77842
80 150 190 7.01277
100 152 152 2.15022
200 148 150 1.86173
[0083] 采用分步加样的方式单独加入四种抗体来验证实验通道的背景值，对背景信号图像进行
图像处理，计算其荧光点的个数，得到均值为150个。发现均值的个数介于抗原PCV2稀释80倍之后，经过多次重复实验，当稀释浓度大于100，达到200倍的时候，荧光点的个数变化不大(如图3、图4所示)。因此，可以估计检测的极限介于稀释80倍和100倍之间，在80倍和100倍之间取浓度梯度进行稀释，当浓度梯度取95倍的时候，荧光点的平均个数为160个。初步估计检测极限范围，当抗原PCV2的终浓度取20nM稀释到90到100倍之间的时候为检测极限范围，为了验证实验的稳定性，我们对90倍，95倍，100倍稀释浓度进行了多次重复性的实验，每次实验取20幅图像进行荧光点的计数，得到平均值。
[0084] 实施例中抗原PCV2的初始浓度是2.8×10-4mg/mL，以此作为稀释的起点，当稀释95倍的时候，浓度为2.9×10-6mg/mL。拷贝数就是指某基因(可以是质粒)在某一生物的基因组中的个数。单拷贝就是该基因在该生物基因组中只有一个，多则指有多个。拷贝数计算公式：copy/ml＝6.02×1023(阿伏伽德罗常数)拷贝数/摩尔×(浓度g/mL)/(MW g/mol)，我们已知PCV2的DNA分子量为28000g/mol。带入到公式中进行换算，可得当稀释浓度为2.9×10-6mg/mL的时候，换算成拷贝单位约为6.24×1010拷贝/mL。我们单分子下拉方法检测极限值越小，代表着在相同量猪的血液样品中，更加小的病毒量能够被检测到，这说明了单分子下拉技术精确，因此，我们可以以此方法作为商业开发的新方法，从而为了检测猪圆环病毒提供更加可靠的技术支持。未解决农业领域的问题提供强有力的支持。
