猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒
阅读：782发布：2020-05-17
专利汇可以提供猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供猪 圆环病毒 2型 抗原 定量检测 试剂 盒 ，属于 生物 技术检测领域。分泌抗 猪圆环病毒 2型单克隆 抗体 的杂交瘤细胞株1G9，保藏号为：CCTCC NO:C2016105。猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒，包括:检测抗体和包被有所述抗猪圆环2型单克隆抗体的酶标板，所述检测抗体为酶标记的抗猪圆环2型单克隆抗体。本发明猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒，仅采用一种抗体作为包被和检测抗体，制备方法简单、成本低、抗原广谱性好、灵敏度高、特异性高。，下面是猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒，该检测试剂盒包括:检测抗体和包被有抗猪圆环2型单克隆抗体的酶标板，所述抗猪圆环2型单克隆抗体和检测抗体均由保藏号为：
CCTCC NO:C2016105的杂交瘤细胞株1G9所分泌。
2.根据权利要求1所述猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒，其特征在于所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的权利要求1所述抗猪圆环2型单克隆抗体。
3.根据权利要求1或2所述猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒，其特征在于所述酶标板是采用0.5-1.5μg/mL抗猪圆环2型单克隆抗体包被的；所述检测抗体的浓度为400-
600ng/mL。
4.根据权利要求3所述猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括标准品母液、阴性对照、样本稀释液、终止液、洗涤液、辣根过氧化物酶催化底物A液和底物B液；所述标准品母液是病毒含量为105.5TCID50/mL的PCV2-NJ株病毒培养液；所述阴性对照为PK15细胞裂解液；所述样本稀释液为MEM培养液；所述辣根过氧化物酶催化底物A液为体积浓度为3%的H2O2的水溶液；所述辣根过氧化物酶催化底物B液为含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺的溶液；所述终止液为2M的硫酸水溶液；所述洗涤液是添加有终浓度为0.05%的Tween 20的pH 7.4、10mM的PBS缓冲液。
5.权利要求4所述试剂盒在定量检测猪圆环病毒2型抗原中的应用。
猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒
技术领域
背景技术
[0002] 猪圆环病毒2型(Porcine circovirustype2，PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属，为无囊膜的单股负链环状DNA病毒，直径在17-20nm，是已知的最小的动物病毒之一。依据猪圆环病毒2型结构蛋白Cap的编码基因，可细分为多种基因型，如PCV2a、PCV2b、PCV2c等，其中起主要致病作用的PCV2b又存在多个毒株。PCV2感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、怀孕母猪繁殖障碍、断奶猪和育肥猪呼吸道疾病、猪皮炎和肾炎综合征、幼龄仔猪先天性震颤等疾病。PCV2感染于20世纪90年代相继在加拿大、美国、欧洲、东南亚猪群中被发现。我国自2000年出现首例猪圆环病毒感染的报道以来，PCV2感染猪群状况严重，表现为流行范围广，阳性率高，混合感染，种猪感染率高，严重阻碍养猪业的发展。
[0003] 目前，猪圆环病毒相关疾病的预防主要依赖免疫PCV2病毒灭活疫苗和表达PCV2Cap蛋白的基因工程疫苗。国内各厂家生产的灭活疫苗所用毒株有a基因型的PCV2-SH株和多个b基因型的PCV2毒株。由于我国流行圆环病毒为PCV2b型，因此采用PCV2b毒株制备的疫苗在疫病防控中效果更佳。
[0004] 灭活疫苗质量控制的重点之一是抗原的含量，检测方法均是基于抗体技术的免疫学方法。生产中采用的是间接免疫荧光法(IFA方法)测定发酵病毒滴度。该方法操作周期长(一周)、设备要求高(荧光显微镜)。目前也有采用夹心ELISA技术开发的PCV2抗原检测试剂盒。文献报道的试剂盒均采用单克隆抗体与多克隆抗体或者两种不同的单克隆抗体配对方式构建。前者存在批次间的稳定性较差、结果一致性较差的问题；在成本上，由于制备试剂盒需要生产多种抗体，生产方法较为复杂、成本较高。后一种方式构建的试剂盒在检测灵敏度上无法满足需求。
[0005] 此外，实际应用中发现，市售单克隆抗体往往对各厂家所用的不同PCV2毒株的广谱识别性差，检测工作依赖价格昂贵的进口PCV2单抗或多抗检测血清。因此，克服现有试剂盒存在的问题，开发一种能够用于多个PCV2毒株检测的猪圆环病毒2型抗原检测试剂盒，对试剂盒的主要材料-单克隆抗体提出了更高的要求。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒，该试剂盒的检测抗体是将包被抗体进行酶标记后获得的，制备方法简单、成本低、抗原广谱性好、灵敏度高、特异性高、重复性好。
[0007] 本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0008] 本发明提供一种分泌抗猪圆环病毒2型单克隆抗体的杂交瘤细胞株1G9，保藏号为：CCTCC NO:C2016105。
[0009] 本还发明提供所述杂交瘤细胞株分泌的抗猪圆环病毒2型单克隆抗体。
[0012] 优选的技术方案中，在于所述酶标板是采用0.5-1.5μg/mL抗猪圆环2型单克隆抗体包被的；所述检测抗体的浓度为400-600ng/mL。
[0013] 优选的技术方案中，所述试剂盒还包括标准品母液、阴性对照、样本稀释液、终止液、洗涤液、辣根过氧化物酶催化底物A液和底物B液；所述标准品母液是病毒含量为105.5TCID50/mL的PCV2-NJ株病毒培养液；所述阴性对照为PK15细胞裂解液；所述样本稀释液为MEM培养液；所述辣根过氧化物酶催化底物A液为体积浓度为3％的H2O2的水溶液；所述辣根过氧化物酶催化底物B液为含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺的溶液；所述终止液为2M的硫酸水溶液；所述洗涤液是添加有终浓度为0.05％的Tween 20的pH 7.4、10mM的PBS缓冲液。
[0014] 本发明还提供所述试剂盒在定量检测猪圆环病毒2型抗原中的应用。
[0015] 本发明试剂盒与现有技术相比，有益效果如下：
[0016] (1)本发明试剂盒适用于多个基因型的PCV2毒株的检测：本发明采用天然PCV2病毒作为免疫原和筛选抗原，获得的抗PCV2单克隆抗体1G9’与天然的PCV2病毒反应性良好。该抗体识别PCV2种类包括：PCV2-NJ株、PCV2-ZJ/C株、PCV2-WH株、PCV2-DBN-SX07株及PCV2-SH株。解决了不同厂商PCV2毒种来源不同导致的检测用抗体不通用的问题。
[0017] (2)本发明试剂盒适用于基因工程疫苗的检测：利用大肠杆菌或杆状病毒表达的PCV2Cap蛋白能够模拟天然病毒结构，组装成病毒样粒子(VLP)。本发明试剂盒中1G9’单克隆抗体与基因工程方法生产的PCV2VLP抗原仍然保持良好的反应性。因此，本发明试剂盒也适用于PCV2基因工程疫苗的检测。
[0018] (3)本发明试剂盒特异性好，可以作为鉴别诊断用途：本发明试剂盒与PPV、PEDV、CSFV、PRRSV、PRV、FMDV、JEV等猪常见病毒无交叉反应。因此可以作为鉴别诊断用途。
[0019] (4)本发明试剂盒与IFA方法符合率高：本发明试剂盒检测PCV2病毒毒价的结果与传统的免疫荧光法(IFA方法)测定毒价结果高度相关，并且操作周期更短，设备要求低，结果判定无主观因素干扰，可替代现有PCV2毒价测定方法。
[0020] (5)本发明试剂盒的成本低、批间重复性好：本发明试剂盒中的捕获抗体为单克隆抗体1G9’，检测抗体为辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体1G9’，因此本发明试剂盒生产中不需要制备两种或两种以上的单克隆抗体或多克隆抗体，仅需生产一种抗体并对其进行标记即可，显著降低了生产成本、避免试剂污染。与现有专利中多抗与单抗组合形式生产的PCV2抗原检测试剂盒相比，本发明试剂盒在批间重复性上更好。原因在于：含有多克隆抗体的血清中能够特异性结合目标蛋白的抗体仅占0.5％-5％(BradburyA,PlückthunA.Reproducibility:Standardize antibodies used in research[J].Nature,
2015,518:27-29.)，并且每次免疫产生的抗体组合受到免疫动物个体差异、免疫、抗体纯化操作等因素的影响而绝不相同。
2015,518:27-29.)，并且每次免疫产生的抗体组合受到免疫动物个体差异、免疫、抗体纯化操作等因素的影响而绝不相同。
[0021] (6)本发明试剂盒克服两株不同的单克隆抗体配对造成的灵敏度不足：名称为“猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒及其制备方法和其应用”、专利号为CN201210356552.7中尝试以同一株单克隆抗体作为捕获抗体与检测抗体，出现性能严重降低，无法满足检测的问题。本发明提供的单克隆抗体1G9’性能较好，配对效果也较好，检测性能达到了多抗与单抗组合的试剂盒水平。
[0022] (7)本发明试剂盒检测准确，操作简便快捷：与目前常用的IFA和RT-PCR方法检测PCV2抗原方法相比，本发明建立的PCV2抗原定量检测试剂盒的检测法成本低、操作简便、检测周期由一周缩短至2小时、重复性好，为PCV2疫苗生产中抗原定量提供了实用、快速、有效的检测工具。附图说明
[0023] 图1SDS-PAGE电泳检测纯化的His-VHH，其中M：蛋白标准样；4:纯化前的His-VHH；1-3：纯化后的His-VHH。
[0024] 图2SDS-PAGE方法检测亲和纯化获得的PCV2-NJ株病毒的纯度，其中M：蛋白标准样；1:亲和纯化后获得的PCV2-NJ株病毒；2：PCV2病毒培养液。
[0025] 图3免疫荧光方法检测抗PCV2单克隆抗体与PCV2-NJ的反应性，图左侧标注了实验采用的单克隆抗体，下方标注了实验采用的毒株。
[0026] 图4杂交瘤细胞株1G9腹水纯化后的SDS-PAGE分析图，M：蛋白标准样；1-9：纯化后的单克隆抗体1G9’；10：含有单克隆抗体1G9’的腹水上清稀释液(稀释30倍)。
[0027] 图5本发明试剂盒的标准曲线。
[0028] 图6本发明试剂盒的特异性。
[0029] 图7本发明试剂盒在检测PCV2亚单位疫苗抗原中的应用，阳性对照为PCV2-NJ株病毒液；阴性对照为PK15细胞裂解液。
具体实施方式
[0030] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0031] 实例一 免疫抗原的制备
[0032] 为了保持免疫抗原(PCV2-NJ株)的天然结构，提高纯化效率，缩短纯化周期，采用镍柱挂载重组蛋白His-VHH，对PCV2-NJ株病毒进行特异性亲和纯化。
[0033] His-VHH是带His标签蛋白的抗PCV2纳米抗体。该重组蛋白制备方法如下：将专利号为ZL201210249621.4、名称为“抗猪圆环病毒2型的双峰驼重链单域抗体及其制备方法和用途”中抗PCV2纳米抗体VHH的核苷酸序列(见该专利序列表中SEQ ID No.4)上下游分别添加NdeⅠ和HindⅢ酶切位点，人工合成该DNA片段。将该合成片段插入表达载体pET32a(+)(载体含有His标签序列)的NdeⅠ和HindⅢ酶切位点之间，然后导入大肠杆菌诱导表达。表达蛋白采用镍柱亲和纯化，即获得重组蛋白His-VHH。该重组蛋白可用于PCV2-NJ株的纯化以及杂交瘤细胞克隆上清抗体效价检测中的捕获抗体。重组蛋白His-VHH的纯化效果见图1。从图1可以看到，分子量约为15Kd的重组蛋白His-VHH被成功纯化。
[0034] 采用重组蛋白His-VHH纯化PCV2-NJ株抗原，具体方法如下：(1)取10mg His-VHH蛋白，以上样缓冲液(pH7.2、20mM的PB缓冲液)溶液稀释20倍后，以1mL/min流速对镍柱上样；(2)以上样缓冲液(pH7.2、20mM的PB缓冲液)洗涤镍柱5个柱体积；(3)取500mL PCV2-NJ株病毒培养液(采用PK15细胞增殖后，裂解，离心，取上清液后获得)以1mL/min对镍柱上样，从而与挂在镍柱上的His-VHH蛋白相结合；(4)以上样缓冲液(pH7.2、20mM的PB缓冲液)洗涤镍柱
5个柱体积；(5)以含500mM咪唑的上样缓冲液洗脱样品，与His-VHH蛋白相结合的PCV2-NJ株病毒被一起洗脱下来，收集洗脱液；(6)以截留分子量为5kD的超滤管将洗脱液中的缓冲液置换为PBS缓冲液，得到了纯化后的PCV2-NJ株抗原。(7)电泳分析纯化产物。电泳结果见图
2。由图2可知，该方法能够高效富集病毒并去除绝大多数的杂质蛋白。纯化后的PCV2-NJ株抗原，由于纯度较高，作为免疫抗原使用时，可以获得较好的免疫效果。
5个柱体积；(5)以含500mM咪唑的上样缓冲液洗脱样品，与His-VHH蛋白相结合的PCV2-NJ株病毒被一起洗脱下来，收集洗脱液；(6)以截留分子量为5kD的超滤管将洗脱液中的缓冲液置换为PBS缓冲液，得到了纯化后的PCV2-NJ株抗原。(7)电泳分析纯化产物。电泳结果见图
2。由图2可知，该方法能够高效富集病毒并去除绝大多数的杂质蛋白。纯化后的PCV2-NJ株抗原，由于纯度较高，作为免疫抗原使用时，可以获得较好的免疫效果。
[0035] 实例二 单克隆抗体的筛选、鉴定、制备与纯化
[0036] 1.小鼠免疫
[0037] 将实例一获得的PCV2-NJ株抗原作为免疫抗原，采用BCA蛋白定量试剂盒(购自Pierce公司)检测蛋白含量，调整浓度至0.5μg/μL，通过颈背部皮下多点注射方式免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，首次免疫剂量100μg/只，三周后以50μg/只剂量加强免疫，此后间隔2周再次进行加强免疫。最后一次免疫后一周采血，以未免疫小鼠血清作为对照，采用间接ELISA方法检测免疫小鼠的血清效价。
[0038] 间接ELISA方法具体如下：小鼠血清采用PBST缓冲液作10倍比梯度稀释，稀释度为103～107；向猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒(购自武汉科前生物股份有限公司)的检测酶标板中加入稀释后的小鼠血清，100μL/孔；37℃孵育1h，洗涤3次后，加入酶标二抗工作液(用含有1％BSA的PBST缓冲液稀释将HRP标记的羊抗鼠二抗作1:5000稀释，HRP标记的羊抗鼠二抗购自Jackson ImmunoResearch，货号为115-065-146)37℃孵育1h；洗涤后加入辣根过氧化物酶催化底物A液和B液等体积混合溶液(同实施例五)100μL/孔，37℃显色10min后，加入终止液(2M的H2SO4溶液)100μL/孔。采用酶标仪检测每孔在450nm处的吸光值。选择PCV2抗体效价在105以上的小鼠进行融合，在进行细胞融合前3天，每只小鼠腹腔注射50μg免疫抗原。
[0039] 2.细胞融合
[0040] 无菌摘取免疫小鼠脾脏，与SP2/0细胞(小鼠骨髓瘤细胞)按照1:5比例混匀后，采用聚乙二醇PEG1450进行常规化学融合。融合细胞采用HAT培养基(购自sigma)进行选择性培养。
[0041] 3.克隆筛选检测方法的建立
[0042] 检测杂交瘤细胞株分泌抗体效价的方法：采用双抗夹心ELISA方法检测抗体效价，以实施例一中制备的重组蛋白His-VHH作为捕获抗体，PCV2-NJ株病毒(采用PK15细胞增殖后，裂解，离心，取上清液后获得)作为夹心抗原，杂交瘤细胞培养上清作为检测一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)(购自Jackson ImmunoResearch)作为二抗，阴性对照中以离心后的PK15细胞裂解液上清代替PCV2-NJ株病毒作为夹心抗原，检测450nm下的吸光值。结果判定：同一份杂交瘤培养上清，采用PCV2-NJ株病毒作为夹心抗原的检测结果高于采用PK15细胞裂解液上清作为夹心抗原(阴性对照)的检测结果，即可进行亚克隆。亚克隆中挑选单克隆重复上述的检测。直至获得的单克隆化的杂交瘤细胞株培养上清与PK15细胞不反应，与PCV2-NJ株病毒液反应强。
[0043] 4.杂交瘤细胞单克隆化
[0044] 对步骤3获得的杂交瘤细胞采用有限稀释法，进行亚克隆，获得全阳性单克隆化的杂交瘤细胞株后，进行扩大培养及冻存。最终获得7株稳定分泌抗PCV2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1G9、1B2、1E7、6H2、4C2、23F5、1F3，分泌的抗PCV2单克隆抗体依次命名为1G9’、1B2’、1E7’、6H2’、4C2’、23F5’和1F3’。
[0045] 5.单克隆抗体的鉴定
[0046] (1)单克隆抗体的亚类鉴定：将7株杂交瘤细胞株的培养上清液(含有其分泌的单克隆抗体)按Sigma公司的免疫球蛋白标准亚类快速鉴定试剂盒操作说明书进行亚型鉴定。亚类鉴定结果显示单克隆抗体1G9’、1B2’、1E7’、6H2’为IgG2a型；单克隆抗体4C2’为IgG3型；单克隆抗体23F5’、1F3’为IgG2b型。
[0047] (2)单克隆抗体反应性：经试验发现，单克隆抗体1G9’不适用于SDS-PAGE中检测PCV2-NJ株，而适用于IFA及ELISA。由于SDS-PAGE涉及样品变性处理暴露蛋白线性结构，由此可以推测单克隆抗体1G9’是识别病毒蛋白折叠形成的空间构象。
[0048] (3)单克隆抗体在免疫荧光检测中的应用
[0049] 采用间接免疫荧光法检测上述7株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体对PCV2-NJ株的识别情况。具体操作步骤：将PK15细胞铺在96孔板中，待细胞生长至80％融合度时，分为两组：一组细胞不加入PCV2病毒液作为阴性对照，另一组细胞分别加入PCV2的不同毒株病毒液孵育24小时，然后更换两组细胞的培养液为含2％小牛血清的DMEM培养液继续培养72h。免疫荧光实验步骤：-20℃预冷的80％丙酮溶液在4℃固定细胞30min，PBST洗涤三次拍干，对每种毒株分别加入单克隆抗体1G9’、1B2’、1E7’、6H2’、4C2’、23F5’和1F3’，37℃孵育
1h，同时设SP2/0细胞培养上清液作为阴性对照。PBST洗涤3次后，加入FITC标记羊抗鼠IgG抗体(购自武汉博士德生物工程有限公司)，37℃孵育1h，PBST洗涤3次后用荧光显微镜观察。结果显示，单克隆抗体1B2’、1G9’、4C2’和23F5’能够识别PCV2-NJ株(图3)。因此，选择单克隆抗体1B2’、1G9’、4C2’、23F5’作为研究对象，进行下面的实验。
1h，同时设SP2/0细胞培养上清液作为阴性对照。PBST洗涤3次后，加入FITC标记羊抗鼠IgG抗体(购自武汉博士德生物工程有限公司)，37℃孵育1h，PBST洗涤3次后用荧光显微镜观察。结果显示，单克隆抗体1B2’、1G9’、4C2’和23F5’能够识别PCV2-NJ株(图3)。因此，选择单克隆抗体1B2’、1G9’、4C2’、23F5’作为研究对象，进行下面的实验。
[0050] 6.杂交瘤细胞株稳定性检测
[0051] 在杂交瘤细胞株冻存12个月后，从液氮中取出冻存的杂交瘤细胞株复苏，采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养24h后本实施例标题3中双抗夹心ELISA方法检测杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体效价，以评价杂交瘤细胞株的稳定性。结果见表1，杂交瘤细胞株培养上清的效价与冻存时相同，抗体分泌稳定。对传代50代次后的杂交瘤细胞株培养上清检测抗体效价，仍然与冻存前相同，因此这些细胞株分泌的单克隆抗体性能稳定。
[0052] 表1显示了杂交瘤细胞株1B2、1G9、4C2、23F5培养上清的抗体效价
[0053]
[0054]
[0055] 7.单克隆抗体的制备与纯化：
[0056] 分别采用杂交瘤细胞株1B2、1G9、4C2和23F5制备相应的单克隆抗体1B2’、1G9’、4C2’和23F5’。
[0057] (1)按照常规方法制备含单克隆抗体的腹水上清：取8～10周龄雌性Balb/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL/只，7天后将状态良好的杂交瘤细胞株以PBS缓冲液重悬浮，以5×105个细胞/只腹腔注射小鼠。约10天后采集腹水，离心去除不溶杂质，取腹水上清冻存于-70℃备用。
[0058] (2)单克隆抗体纯化：按上述方法制备含单克隆抗体1B2’、1G9’、4C2’、23F5’的腹水上清，采用GE Hitrap rProteinA FastFlow亲和纯化柱(购自GE生命科学)对各单克隆抗体进行纯化。纯化后的单克隆抗体经过10％SDS-PAGE电泳分析纯度(纯度>95％)，用截留分子量为50kD的超滤管进行浓缩，并将缓冲液置换为PBS缓冲液。从图4中可以看出，单克隆抗体IG9’纯度达到了95％以上。
[0059] (3)纯化后的单克隆抗体效价测定：将纯化后的单克隆抗体稀释到1mg/mL，从1:1000开始2倍比稀释。采用本实施例标题3中双抗夹心ELISA方法测定抗体效价，结果见表2。
[0060] 表2纯化后的单克隆抗体的效价
[0061]单克隆抗体编号 效价
1B2’ 1.02×106
1G9’ 1.02×106
4C2’ 2.04×106
23F5’ 1.02×106
1B2’ 1.02×106
1G9’ 1.02×106
4C2’ 2.04×106
23F5’ 1.02×106
[0062] 实例三 酶标抗体的制备
[0063] 1.制备辣根过氧化物酶标记的抗PCV2单克隆抗体
[0064] 采用辣根过氧化物酶分别对抗PCV2单克隆抗体1B2’、1G9’、4C2’、23F5’进行标记，具体方法如下：
[0065] (1)将5mg HRP(辣根过氧化物酶)溶于1mL去离子水中，加0.2ml、0.1M的NaIO4溶液，混匀，密闭，室温避光反应20分钟。
[0068] (4)取步骤(2)透析结束后透析袋内溶液，加入40ul pH9.5、0.2M的碳酸盐缓冲液调节pH到9.0～9.5，然后加入经过(3)处理后的单克隆抗体，混匀，室温避光反应2小时。
[0069] (5)加入0.1mL新配制的4mg/mL硼氢化钠溶液，混匀，4℃放置2小时。
[0070] (6)用截留分子量为100kD的超滤管对反应产物进行超滤，去除游离的HRP，并将辣根过氧化物酶标记的抗PCV2单克隆抗体1B2’、1G9’、4C2’和23F5’的缓冲液置换成pH7.4、10mM的PBS缓冲液，加入防腐剂和等体积的甘油，置于-20℃冻存。
[0071] (7)用BCA蛋白定量试剂盒测定辣根过氧化物酶标记的抗PCV2单克隆抗体1B2’、1G9’、4C2’和23F5’的浓度，调整浓度至4mg/mL。
[0072] 2.辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体效价
[0073] 辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体1B2’、1G9’、4C2’和23F5’稀释至1mg/mL，分别记为1B2’E、1G9’E、4C2’E、23F5’E。利用实施例二标题3中双抗夹心ELISA方法对各酶标抗体效价进行检测。结果见表3，上述4种辣根过氧化物酶标记抗体的效价均达到5.12×105及以上。
[0074] 表3酶标抗体效价测定
[0075]酶标抗体 1G9’E 1B2’E 4C2’E 23F5’E
抗体效价 5.12×105 1.02×106 2.05×106 5.12×105
抗体效价 5.12×105 1.02×106 2.05×106 5.12×105
[0076] 实例四PCV2抗原定量检测方法的建立
[0077] 1.双抗体夹心配对中抗体的选择
[0078] 将单克隆抗体1B2’、1G9’、4C2’和23F5’作为包被抗体，1B2’E、1G9’E、4C2’E和23F5’E作为检测抗体，样品检测孔中以PCV2-NJ株为夹心抗原，阴性对照孔中以PK15细胞裂解液上清替代PCV2-NJ株，进行夹心配对性实验，计算P/N值，其中P是样品检测孔的OD450值，N是阴性对照孔的的OD450值，选择P/N值最高的配对为最佳的抗体组合。结果见表4，单克隆抗体1G9’作为包被抗体，1G9’E作为检测抗体，效果最好。
[0079] 表4夹心配对抗体的选择
[0080]
[0081]
[0082] 杂交瘤细胞株1G9保藏信息如下：
[0083] 分类命名：杂交瘤细胞株1G9，保藏日期为2016年5月23日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址：武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：C2016105。
[0084] 2.单克隆抗体包被浓度及酶标抗体工作浓度的确定
[0085] 采用方阵滴定法来测定单克隆抗体1G9’的包被浓度和1G9’E的工作浓度。具体方法如下：用包被液(0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液)将单克隆抗体1G9’梯度稀释，在4μg/mL到0.5μg/mL中取4个浓度，每个浓度在4℃条件下包被16-18h；采用PBST缓冲液(含0.05％(体积百分浓度)Tween 20的PBS缓冲液(pH 7.4、浓度为10mM))洗涤，拍干；用含1％(质量百分浓度)BSA的PBST缓冲液在37℃条件下封闭1h，洗涤，拍干；样品孔中加入100μL的PCV2-NJ株病毒液(获得P值)，在37℃条件下作用1h时间，阴性孔中以PK15细胞裂解液替代PCV2病毒(获得N值)；采用PBST缓冲液洗涤，拍干；用含1％BSA的PBST缓冲液将浓度为4mg/mL的1G9’E稀释为2000、1000、500、250ng/mL四个浓度，向每个浓度单克隆抗体1G9’的孔中分别加入100μL不同浓度的酶标抗体1G9’E，在37℃条件下作用1h；每孔加入辣根过氧化物酶催化底物A液和B液等体积混合溶液(同实施例五)100μL，37℃显色15min；最后加入100μL 2M的硫酸溶液终止反应，在450nm波长下检测OD值。选定P/N值最大，阳性孔OD450值大于1.0所对应的捕获抗体(即包被抗体)包被浓度和酶标抗体的浓度为最佳条件。由表5中数据可以看出，单克隆抗体1G9’最佳包被浓度为1μg/mL，酶标抗体的最佳作用浓度为500ng/mL。
[0086] 表5包被抗体浓度与酶标抗体工作浓度确定
[0087]
[0088]
[0089] 3.抗原作用时间的确定
[0090] 用已知的阴阳性对照进行ELISA抗原检测，按已经确定的程序反应，抗原与包被抗体在37℃分别反应30min、60min、90min、120min，在其它条件和反应程序相同的情况下，进行ELISA抗原检测，取P/N最大、阳性值在2.0左右的作用时间为最佳反应时间。由表6中数据，确定抗原与包被抗体在37℃的最佳作用时间为60min。
[0091] 表6抗原与包被抗体作用时间确定
[0092]抗原作用时间 30min 60min 90min 120min
PCV2(P) 1.135 2.073 2.254 2.536
PK15(N) 0.045 0.079 0.103 0.126
P/N 25.2 26.2 21.9 20.1
PCV2(P) 1.135 2.073 2.254 2.536
PK15(N) 0.045 0.079 0.103 0.126
P/N 25.2 26.2 21.9 20.1
[0093] 4.酶标抗体1G9’E作用时间的确定
[0094] 按已确定好的反应条件，用已知的阴阳性对照进行ELISA抗原检测，酶标抗体1G9’E在37℃时的反应时间分别为30min、45min、60min、90min。选择P/N最大时的反应时间为酶标抗体的最佳工作时间。依据表7中数据，确定酶标抗体1G9’E的最佳工作时间为60min。
[0095] 表7酶标抗体1G9’E作用时间确定
[0096]作用时间 30min 45min 60min 90min
PCV2(P) 1.135 1.637 2.054 2.136
PK15(N) 0.045 0.069 0.081 0.126
P/N 25.2 23.7 25.4 17.0
PCV2(P) 1.135 1.637 2.054 2.136
PK15(N) 0.045 0.069 0.081 0.126
P/N 25.2 23.7 25.4 17.0
[0097] 5.显色时间的确定
[0098] 按已确定好的反应条件，用已知的阴阳性对照进行ELISA抗原检测，显色时间分别为10min、15min、20min。选择P/N最大时的时间为显色时间。由表8中数据，确定显色液最佳作用时间为15min。
[0099] 表8显色时间的确定
[0100]显色时间 10min 15min 20min
PCV2(P) 1.305 1.932 2.154
PK15(N) 0.055 0.079 0.121
P/N 23.7 24.5 17.8
PCV2(P) 1.305 1.932 2.154
PK15(N) 0.055 0.079 0.121
P/N 23.7 24.5 17.8
[0101] 6.标准曲线线范围
[0102] 将标准品母液(病毒含量为105.5TCID50/mL的PCV2-NJ株病毒培养液，制备方法见实施例五)进行倍比稀释，使其PCV2含量为100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200、102400TCID50/mL，按照既定ELISA进行反应，制备标准曲线，选择R2大于0.99的PCV2含量范围为标准曲线范围。标准曲线对应的PCV2含量为200-3200TCID50/mL。见表9及图5。
[0103] 表9标准曲线范围
[0104]
[0105] 实例五 试剂盒的组装及使用方法
[0106] 1.本发明猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒包括：
[0107] (1)检测板：采用0.05M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗PCV2单克隆抗体1G9’(实施例二中标题7方法制备)至1μg/mL，以100μL/孔加入酶标板，在4℃条件下包被16-18h，采用洗涤液(同本实施例标题1中(9))洗涤，拍干；用含1％(质量百分浓度)BSA的洗涤液(同本实施例标题1中(9))在37℃条件下封闭1h，洗涤、干燥、真空封装，得到检测板；
[0108] (2)辣根过氧化物酶标记的抗PCV2单克隆抗体1G9’(缩写为1G9’E)：1G9’E(实施例三中方法制备)的浓度为500ng/mL。
[0109] (3)标准品母液：病毒含量为105.5TCID50/mL的PCV2-NJ株病毒培养液。PCV2-NJ株病毒培养液制备方法：用含有10％(v/v)小牛血清的MEM培养基培养PK15细胞，待细胞融合度达到90％时，接种PCV2-NJ株，在37℃培养72小时，将病毒培养物反复冻融3次，4℃、12000r/min离心20min，去除细胞碎片，取上清液作为PCV2-NJ株病毒培养液。
[0110] (4)阴性对照：PK15细胞裂解液。用含有10％(v/v)小牛血清的MEM培养基培养PK15细胞，待细胞融合度达到90％时，将细胞培养液置于-20℃和室温条件下反复冻融3次，随后收集冻融液体，12000g/min离心10min，取上清作为PK15细胞裂解液。
[0111] (5)样本稀释液：MEM培养基(购自GIBCO)。
[0112] (6)辣根过氧化物酶催化底物A液：体积浓度为3％的H2O2水溶液。
[0113] (7)辣根过氧化物酶催化底物B液：将1mL浓度为10mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液加入到100mL浓度为0.1mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液中配成。浓度为0.1mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液的配制方法：0.1mol/L磷酸二氢钠水溶液87.7mL和0.1mol/L磷酸氢二钠水溶液12.3mL混合即成。
[0114] (8)终止液：2M的硫酸水溶液。
[0115] (9)洗涤液：pH 7.4、10mM的PBS缓冲液中添加有终浓度为0.05％(体积百分浓度)的Tween 20。pH 7.4、10mM的PBS缓冲液配方：NaCl 8g、KCl 0.2g、KH2PO40.27g、Na2HPO4·12H2O 3.54g溶于水，然后定容至1L。
[0116] 2.本发明猪圆环病毒2型抗原定量检测试剂盒的使用方法：
[0117] (1)加标准品/样本：将标准品母液采用样本稀释液稀释至标准曲线范围。将样品采用样本稀释液稀释适当的倍数。以100μL/孔向检测板中加入标准品母液或样品的稀释液，37℃恒温箱中孵育1h；阴性对照孔中加入阴性对照(PK15细胞裂解液)。用洗涤液洗涤酶标板3次。
[0118] (2)加入1G9’E：以100μL/孔向酶标板中加入1G9’E，37℃孵育1h；用洗涤液洗涤酶标板3次。
[0119] (3)显色：将辣根过氧化物酶催化底物液A液和底物液B液等体积混合，以100μL/孔加入酶标板中，37℃避光显色10-15min；以100μL/孔加入终止液。
[0120] (4)测定：酶标板轻轻振荡混匀后立即读数，在波长450nm下测定每孔吸光值。根据标准曲线，计算样品中PCV2抗原的浓度。
[0121] 实施例六 本发明试剂盒的灵敏度、特异性、广谱性及重复性
[0122] 考察实施例五制备的试剂盒(本发明试剂盒)的灵敏度、特异性、广谱性及重复性。
[0123] 1.试剂盒灵敏度
[0124] 将标准品母液采用样本稀释液倍比稀释为100、200、400、800、1600、3200、6400、12800TCID50/mL，阴性对照孔中加入阴性对照(PK15细胞裂解液)，采用实施例五中方法进行检测。检测样品孔(标准品母液稀释液)和阴性对照孔在450nm波长处的吸光值。将P/N>2.1时的最低PCV2含量定为试剂盒灵敏度。结果显示试剂盒的灵敏度为200TCID50/mL，见表10。
[0125] 表10试剂盒灵敏度
[0126]
[0127] 2.试剂盒特异性
[0128] 采用实施例五中试剂盒及检测方法，对猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪腹泻病毒(PEDV)、猪乙脑病毒(JEV)的细胞培养液进行检测。根据P/N值是否大于2.1，来判断试剂盒与样本是否有交叉。从图6可见，除PCV2外的其他猪病病毒与本发明试剂盒无交叉反应，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。
[0129] 3.本发明试剂盒对PCV2不同基因亚型的广谱性检测
[0130] 考察实施例五中试剂盒(标记为试剂盒甲)和商品化试剂盒 PCV2Ag Capture(购自Synbiotics，标记为试剂盒乙)对6种不同PCV2毒株的广谱性。除PCV2-NJ株外，其余病毒通过对市售疫苗破乳后得到。表11为本发明试剂盒对6种不同毒株检测获得的OD450值，结果显示：本发明试剂盒能对6种PCV2毒株进行检测，具有较好的广谱性。
[0131] 表11本发明试剂盒对6种毒株的检测结果
[0132]
[0133] 4.试剂盒批间重复性
[0134] 按照腹水制备→抗体纯化→单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记→试剂盒制造的顺序独立生产三批次试剂盒，并进行批间差异测定。采用三批次试剂盒同时检测不同病毒含量的PCV2病毒液(6400TCID50/mL、3200TCID50/mL、1600TCID50/mL、800TCID50/mL、400TCID50/mL、0TCID50/mL)，比较三批次试剂盒的差异。从表12可见，本发明试剂盒的批间差异不超过4.04％，说明本发明试剂盒重复性非常好。
[0135] 表12试剂盒批间重复性(OD450值)
[0136]
[0137] 5.本发明试剂盒与IFA方法(免疫荧光法)的相关性
[0138] 为了验证本发明试剂盒与IFA方法检测结果的一致性，选取了10份PCV2病毒液同时采用IFA方法和本发明试剂盒进行检测，并计算两种方法检测结果的变异系数CV。结果见表13，可以看到两种方法对同一份样本检测结果差异不超过8.13％，说明本发明试剂盒的检测值与IFA的检测值无明显差异。
[0139] 表13本发明试剂盒与IFA方法检测结果的相关性
[0140]
[0141] 6.本发明试剂盒在检测PCV2亚单位疫苗抗原中的应用
[0142] 采用本发明试剂盒及其使用方法，分别对大肠杆菌以及杆状病毒表达的PCV2Cap组装而成的病毒样粒子(制备方法见：1、赵晓云,乔绪稳,陈瑾,李鹏成,于晓明,朱国强,郑其升,侯继波.利用E.coli表达猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病毒样颗粒疫苗[J].中国农业科学,2015,(05):976-986；2、表达2型猪圆环病毒核衣壳蛋白Cap基因的重组病毒样粒子，专利号CN200810024644.9)进行检测。对照样本为大肠杆菌空菌破碎液和杆状病毒破碎液。检测结果见图7。从图7可见本发明试剂盒与大肠杆菌以及杆状病毒表达的PCV2Cap组装而成的病毒样粒子反应性能好，而与相应宿主细胞不反应，因此可以用于检测PCV2亚单位疫苗抗原。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种猪圆环病毒抗体快速金标检测卡 | 2020-05-13 | 41 |
| 一种猪圆环病毒感染的饲料预混药料 | 2020-05-13 | 277 |
| 猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒 | 2020-05-14 | 205 |
| 一种猪圆环病毒2型毒株及其应用 | 2020-05-16 | 448 |
| 抗猪圆环病病毒的转移因子 | 2020-05-16 | 881 |
| 一种防治圆环病毒病的中药制剂 | 2020-05-17 | 66 |
| 一种猪圆环病毒的培养方法及其应用 | 2020-05-18 | 910 |
| 一种预防猪圆环病毒病的饲料 | 2020-05-19 | 456 |
| 新的猪圆环病毒及其共培养细胞株 | 2020-05-13 | 579 |
| 一种预防猪圆环病毒病的饲料添加剂 | 2020-05-14 | 338 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈