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一种猪圆环病毒2型毒株及其应用

阅读：448发布：2020-05-16

专利汇可以提供一种猪圆环病毒2型毒株及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明的目的是提供一种猪圆环病毒 2型毒株及其应用，即一种新型的猪圆环病毒 2型毒株，该毒株增殖力高、免疫原性好，其灭活制备的疫苗能够有效预防猪圆环病毒病。其中猪圆环病毒2型毒株，其保藏编号为CGMCC NO.7707。本发明的PCV2SD病毒株免疫效力好，用于毒株增殖的MPR细胞以常规方法即可很好的增殖，可以同步接毒也可常规方法接毒，接种培养后收获的病毒滴度高达105.25TCID/0.1ml以上。用PCV2SD病毒株制备的疫苗能够很好地预防圆环病毒病的发生或流行，免疫后进行ELISA检测，保护率可达90%以上；与国内上市销售的其他同类疫苗进行免疫效力比较发现，本发明的疫苗具有抗体产生快，保护期较长，可以明显缩短免疫空白区，降低免疫次数，提高经济效益。，下面是一种猪圆环病毒2型毒株及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种猪圆环病毒2型毒株，其保藏编号为CGMCC N0.7707。
2.权利要求1所述的毒株在制备疫苗中的应用。
3.一种疫苗，所述的疫苗包括有抗原和疫苗佐剂，其中抗原为灭活的权利要求1所述的毒株。
4.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的毒株是用甲醛来灭活的。
5.权利要求3所述的疫苗.用于预防猪圆环病毒病。

说明书全文

—种猪圆环病毒2型毒株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于畜禽致病菌筛选技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型毒株及其应用。

背景技术

[0002] 1991年加拿大John Harding报道了断奶仔猪多系统衰竭综合征(PostweaningMultisystemic Wasting Syndrome, PMWS),后经广泛深入的调查和研究，于1998年证实猪圆环病毒(Porcine Circovirus, PCV)为主要病原。现已证实，猪圆环病毒病(PorcineCircovirus Disease, PCVD)是由猪圆环病毒 2 型(Porcine Circovirus2, PCV2)感染而弓丨起的一种临床症状为渐进性消瘦、呼吸困难、急促、贫血、腹泻、黄疸、间质性肺炎、淋巴腺炎及肾炎的病毒性疾病，主要侵害5〜12周龄断奶仔猪，与近年来发生的PMWS、猪皮炎与肾炎综合征(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome, FONS)、猪呼吸道综合征(Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC)、A2 型先天性振颤(Congenital Tremor,CT)、猪增生性和坏死性肺炎(Porcine Proliferative and Necrotizing Pneumonia,PNP)、繁殖障碍(Reproductive Failure)等疾病都有密切相关。PCV2的危害在于能够使感染猪只的免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，同时，该病易继发其它细菌、病毒感染，使猪只发病率，死亡率提高，给养殖户带来较大的经济损失。经病原学和血清学调查证实，PCV2呈世界性分布，给世界养猪业带来了巨大经济损失。对此，国内外开展了 PCV2疫苗研究，部分已经获得批准和生产，并已发挥了一定的免疫预防效果，但各地仍时有本病发生，并能在健康猪群中检测到病原存在，说明现有的PCV2疫苗预防效果并不理想，究其原因，除养殖、疾病因素外，还可能与疫苗的抗原含量较低(生产细胞株为PK15，PCV2不能致其产生CPE，无法准确测定病毒效价)、疫苗制备工艺粗糙、毒株发生变异等因素有关。因此，筛选出新的变异毒株，对于制备PCV2疫苗就具有重要的作用。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型毒株及其应用，即一种新型的猪圆环病毒2型毒株，该毒株增殖力高、免疫原性好，其灭活制备的疫苗能够有效预防猪圆环病毒病。

[0004] 本发明中制苗用的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus2)毒株PCV2SD株，已于2013年5月31日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7707。

[0005] 本发明的PCV2SD株用于制备疫苗；

[0006] 本发明还提供一种疫苗，所述的疫苗包括有抗原和疫苗佐剂，其中抗原为灭活的PCV2SD病毒株。

[0007] 其中灭活的PCV2SD病毒株是用甲醛灭活病毒液制备的。

[0008] 本发明制备的疫苗用于预防猪圆环病毒病。[0009] 本发明的PCV2SD病毒株免疫效力好，用于毒株增殖的MPR细胞以常规方法即可很好的增殖，可以同步接毒也可常规方法接毒，接种培养后收获的病毒滴度高达105 25TCID/0.1ml以上，高于常规用PK15等细胞培养的滴度。用PCV2SD病毒株制备的疫苗能够很好地预防圆环病毒病的发生或流行，免疫后进行ELISA检测，保护率可达90%以上；与国内上市销售的其他同类疫苗进行免疫效力比较发现，本发明的疫苗具有抗体产生快，保护期较长(长达5个月以上)，可以明显缩短免疫空白区，降低免疫次数，提高经济效益。

具体实施方式

[0010] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

[0011] 一、猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus2)毒株PCV2SD株的筛选

[0012] 1.毒株的筛选

[0013] 于2005年从山东省某患有疑似PMWS猪场的发病仔猪的淋巴结、脾脏、肺脏等组织中分离到的一个病毒株。将发病猪的新鲜组织样品经充分研磨、双抗(青、链霉素)处理、12000rpm/min4°C离心10min、0.22 μ m微孔滤膜滤过除菌后，经PCV2、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)等PCR/RT-PCR检测，证实为PCV2单纯阳性，将处理后的样品上清接种MPR细胞进行分离培养，最终获得了一株高增殖力的PCV2毒株，命名为PCV2SD株，该病毒毒株已于2013年5月31日送北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMMCC N0.7707。在对该毒株的理化特性及生物学特性进行系列研究、鉴定基础上，制备了猪圆环病毒2型灭活疫苗。

[0014] (I)动物回归试验结果表明，攻毒组有4/5的猪出现明显的PCV2病毒血症、皮肤发红以及一过性体温升高；攻毒21日后迫杀、解剖，可见多处淋巴结、脾脏出现肿大和充血，肺脏出现不同程度的水肿和肉变，肾脏发黄且表面有出血点甚至坏死灶等；

[0015] (2)PCV2SD毒株可致MPR细胞产生明显的特征性细胞病变，增殖性能较好，按常规方法培养，其病毒滴度可达105_ 25TCID/0.1ml ；

[0016] (3)具有较广的抗原谱，随机抽取来自国内20余个生猪主产区的猪血清与该毒株进行中和试验，可很好地中和，MPR细胞未产生特征性病变。

[0017] 具体如下:

[0018] I)致细胞病变作用将PCV2SD病毒株(效价不低于105 25TCID5(l/0.1ml)的种毒按5%(V/V)的量接种于刚铺满单层的MPR细胞，置37°C、5%C02的细胞培养箱中进行培养，约在接种后36后开始出现细胞病变，表现为:细胞聚集、破碎、脱落，继而出现大面积空洞、拉网等特异性病变，大约在60〜72h时即可收获。

[0019] 2)病毒效价将PCV2SD病毒株用细胞维持液(2%新生牛血清的MEM液，购自GIBC0)进行10倍系列稀释，取10 —4、10 — 5、10 —6、10 — 74个稀释度，分别接种于长势良好的MPR细胞(96孔细胞板)，每个稀释度接种4孔，每孔0.1ml0同时设病毒阳性对照孔和细胞阴性对照孔，37°C培养和观察7日，出现CPE者判为感染，以Reed-Muench法测定其病毒滴度(TCID50/0.lml)，每 0.1ml 病毒含量不低于 IO5-25TCID500

[0020] 3)动物回归试验取21日龄健康易感仔猪(PCV2ELISA抗体和PCV2抗原PCR检测均为阴性)10头，随机分成2组，每组5头。其中，I组攻击PCV2SD F5代病毒培养物，每头滴鼻lmL，肌肉注射2mL;2组仅相同途径接种细胞培养液；接种后临床观察21日。期间，可以发现，攻毒组有4/5的猪可出现明显的PCV2病毒血症、皮肤发红以及一过性体温升高；攻毒21日后迫杀、解剖，可见多处淋巴结、脾脏出现肿大和充血，肺脏出现不同程度的水肿和肉变，肾脏发黄且表面有出血点甚至坏死灶等。

[0021] 4)抗原谱用PCV2SD病毒株与采自国内20个主要养猪省份的猪PCV2阳性血清在MPR细胞上进行中和试验，均能被这些阳性血清有效中和。

[0022] 5)纯净无菌生长，无支原体和外源病毒污染。

[0023] 序列测定对PCV2SD株进行全基因测定，发现该毒株的基因组DNA全长为1767bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1，翻译出的蛋白的氨基酸序列为SEQID N0:2。与已知国内PCV2流行株的同源性在96.5%左右，为新的一种pcv2病毒株。

[0024] 2:本发明PCV2SD株作为抗原制备单因子血清抗体(一抗)

[0025] 将测序结果正确的单个克隆重组质粒PET-0RF2转化的表达性BL21宿主菌，接种于5ml含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB细菌培养基，37°C振摇培养过夜，次日取出Iml培养物接种于120ml的LB培养基中，37°C振摇培养2.5h后，菌液摇至半透明半浑浊状态，吸光光度法测得OD6tltl=0.6〜0.8，在诱导前先取IOml作为诱导前对照，并将振摇温度变为30°C加IPTG (终浓度为1.0mmol/L)诱导，诱导4h收集IOml菌液，以诱导未转化PET载体的菌液作为空白对照，以诱导转化PET载体的菌液作为空载体对照。将诱导表达的菌液取出，离心弃上清，再用0.5mllXPBS重悬菌体，超声波裂解破碎细菌后，按1:1加2 X上样Buffer煮沸lOmin，离心取上清，上清用12%SDS-PAGE电泳鉴定分析获得约27〜28kDa的目的蛋白，利用His标签纯化试剂盒按规定操作对目的蛋白进行纯化。将纯化好的His-Cap目的蛋白用分光光度法定量(1.05mg/ml)加等量的弗氏完全佐剂，颈部皮下注射10只BALB/C小鼠，每只0.2ml (约105 μ g/只),2周后用含弗氏不完全佐剂的Cap蛋白抗原背部皮下免疫第二次，0.2ml/只，再经2周后第三次免疫(方法同第二次)，其中4只未免疫抗原的BALB/C小鼠作为阴性对照组。第三次免疫后10d，心脏采血致死，析出的免疫血清置-20°C保存。

[0026] 2)针对PCV2SD株制备的单因子血清的敏感性和特异性鉴定

[0027] 将PCV2SD分离株病毒液(106 25TCID5(l/ml)与刚消化好的PK15细胞悬液按1:9体积比混合接种至24孔细胞培养板中(lml/孔)，维持72h后取出细胞培养板，弃去上清液，用I XPBS洗一遍，丙酮:甲醇(1:1)固定液于_20°C固定30min，I XPBS洗3遍，将小鼠血清分别用I XPBS按1:50、1:100、1:200、1:500作四个稀释度加到固定好的PK15细胞上，37。。孵育90min，lXPBS洗3遍，再加1:200稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG(Sigma公司)37°C孵育60min, I XPBS洗3次，弃去洗涤液，再将24孔板中每个孔加一滴50%的甘油，在荧光显微镜下观察实验结果，鉴定结果在1:100稀释度时效果较好。利用针对PCV2SD株(阳性对照株)Cap蛋白制备的单因子血清通过间接免疫荧光技术(IFA)对实验室保存的其它4株PCV2:SDIdOl 株(HM535640)、AH05 株(FJ644556)、GXWM 株(EF675241)及 SH03733 株(GQ358998)进行区分鉴定，结果与该4株PCV2均反应出现特异性绿色荧光。与以报道的PCV2制备的Cap蛋白制备的单因子血清相比，本发明PCV2SD株Cap蛋白制备的单因子血清抗体(一抗)敏感性和特异性高都有明显提高(P < 0.05)，这可能有本发明的PCV2SD株的氨基酸序列与已报道的蛋白的差异造成的。

[0028] 二、猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产及应用效果[0029] 1.疫苗制备

[0030] 1.1细胞制备从液氮罐中取出结冻保存的MPR 种子细胞管置37°C恒温水浴中快速融化，将细胞移入无菌的IOml离心管中，1000r/min常温离心5min，弃去上清液留下细胞沉淀，用含8%新生牛血清的MEM细胞培养液(购自GIBC0)重悬细胞，移入一个新的细胞培样瓶中置含5%C02的37°C培养箱中进行贴壁培养，当细胞长成良好单层后48h，用胰酶-EDTA消化细胞进行传代培养。

[0031] 1.2生产用毒种制备将保藏编号为:CGMMCC N0.7707的毒株毒种按5%的量接种于传代后12h、正处于生长过程中的MPR细胞，37°C吸附I小时，加入含2%新生牛血清的细胞维持液，继续培养60〜72h，当细胞病变达75%以上时收获全部细胞培养物，反复冻融3次，分装于灭菌容器内。

[0032] 1.3抗原制备

[0033] 1.3.1单层细胞培养将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中，37°C培养。

[0034] 1.3.2接毒弃去培养液，按5%的量接种长势良好的MPR细胞，置37°C吸附lh，加维持液继续培养。

[0035] 1.3.3观察与收获接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况。当细胞病变达75%以上时收获，反复冻融3次。-20°C保存。

[0036] 1.4病毒灭活将检验合格的病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，使甲醛的最终浓度为0.1%。经37°C搅拌灭活16小时。灭活后的病毒液置2〜8°C保存。

[0037] 1.5疫苗制备

[0038] 1.5.1油相制备取注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80°C后，再加入司本-806份，至温度达到125°C时维持30min，冷却后，导入贮油罐中备用。

[0039] 1.5.2水相制备将检验合格的猪圆环病毒2型抗原液96份与灭菌的吐温_804份导入水相制备罐中，搅拌电机搅拌20〜30min,使吐温-80完全溶解。

[0040] 1.5.3乳化取油相2份导入乳化罐中，开动电机低速搅拌，同时徐徐加入水相I份后，再以4000rpm/min搅拌40分钟。乳化后，取疫苗IOml加入离心管中，3000rpm/min离心15min,析出后,水相不超过0.5ml。

[0041] 1.5.4分装定量分装，加盖密封。

[0042] 二、疫苗安全试验

[0043] 1.猪圆环病毒2型灭活疫苗对靶动物非使用日龄的安全性试验

[0044] 用本发明制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗01、02批分别对9日龄健康仔猪(PCV2抗原、抗体阴性)15头(随机分为3组)、处于产前两周的怀孕母猪8头(随机分为3组)进行免疫，免疫组2ml/头，对照组注射用样剂量的生理盐水。观察试验猪接种疫苗后的安全性(采食、精神、饮水、并测量体温)，仔猪连续观察14日，母猪观察至分娩，统计母猪产仔情况。仔猪免后14日每组剖杀2头，观察注射部位疫苗吸收情况。结果表明，免疫组和对照组仔猪、妊娠母猪采食、精神、粪便均正常，注射部位未见肿胀、结节、发炎；免疫组母猪正常分娩，未见早产、流产、死胎、弱仔等现象发生。说明试制的疫苗对非使用日龄接种仔猪和妊娠母猪是安全的。见表1、表2。[0045] 表1:猪圆环病毒2型灭活疫苗(SD株)接种仔猪的安全性试验

[0046]

[0047] 注:体温升高不超过1°C，稽留不超过2日；或减食不超过I日，判定为合格。如有I头猪体温超过1°C以上，但不超过1.5°C，且稽留不超过2日，也可判为合格。

[0048] 表2猪圆环病毒2型灭活疫苗(SD株)接种妊娠母猪的安全性试验

[0049]

[0050] 2.对最小使用日龄靶动物一次单剂量肌肉接种的安全性试验

[0051] 用本发明制备的2批(01、02)猪圆环病毒2型疫苗对14日龄易感仔猪12头、6月龄后备母猪12头分别肌肉注射疫苗，2ml/头，各对照组注射同样剂量的生理盐水，于免疫后4〜6周对试验母猪进行配种。观察试验猪接种疫苗后的安全性(采食、精神、饮水、并测量体温)，仔猪连续观察21日，母猪观察至分娩，统计母猪产仔情况。结果表明，免疫的8头仔猪和8头后备母猪，其采食、饮水、精神均未见异常，体温变化不明显，免疫母猪共产79头健仔，I头弱仔，I头弱仔PCV2PCR检测和病毒分离结果均为阴性，说明本发明人采用本发明技术方案试制的疫苗一次单剂量肌肉接种仔猪和母猪是安全的。详见表3、表4。

[0052] 表3:—次单剂量肌肉接种最小使用日龄仔猪的安全性试验结果

[0053]

[0054] 注:体温升高不超过1°C，稽留不超过2日；或减食不超过I日，判定为合格。如有I头猪体温超过1°C以上，但不超过1.5°C，且稽留不超过2日，也可判为合格。

[0055] 表4:试验母猪产仔情况

[0056]

[0057] 3.对靶动物一次超剂量接种的安全性试验

[0058] 用本发明制备的疫苗2批(01、02批)对32头21日龄健康易感仔猪、15头经产母猪和9头种公猪各分别进行超剂量免疫注射，各自随机分成3组(具体见下表)，试验组免疫剂量为4ml/头，对照组注射同等剂量的生理盐水。仔猪和种公猪免后观察21天，母猪于免疫后4〜6周配种观察至产仔，每日观察试验猪的采食、精神状况，注射部位有无不良反应发生。结果表明，该疫苗对接种的仔猪、母猪和种公猪均无不良影响，注射部位未见肿胀、结节、发炎，试验猪体温变化不明显，接种的母猪正常产仔，共产105头健仔，I头弱仔，与对照5头母猪相比，产仔未见差异。说明本发明人采用本发明技术方案试制的疫苗对仔猪、经产母猪和种公猪一次性超剂量接种安全。见表5、表6。

[0059] 表5:—次性超剂量接种的安全试验结果

[0060]

[0062] 注:体温升高不超过1°C，稽留不超过2日；或减食不超过I日，判定为合格。如有I头猪体温超过1°C以上，但不超过1.5°C，且稽留不超过2日，也可判为合格。

[0063] 表6:试验种母猪产仔情况

[0064]

[0065] 4.对母猪免疫学功能的影响

[0066] 取28日龄健康仔猪(PCV2、猪瘟抗原、抗体均为阴性)16头随机分成4组，每组4头。用本发明制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗01批肌肉免疫第I组，2ml/头；猪瘟脾苗肌肉免疫第2组，I头份/头；猪圆环病毒2型灭活疫苗2ml/头和猪瘟脾苗I头份/头同时肌肉免疫第3组；第4组注射生理盐水作对照，2ml/头，四组猪均单独饲养。每日观察并记录每头猪的体温、采食。接种后第2、4、8、12周采血，分离血清，检测？(^2和03?¥ ELISA抗体。结果表明，各免疫组仔猪免疫后14日内的体温、采食、饮水、精神状态均正常，猪圆环病毒2型灭活疫苗与猪瘟脾苗同时免疫，对CSFV抗体的产生影响不大，由此可见，猪圆环病毒2型灭活疫苗(SD株)对猪瘟脾苗的免疫效果无影响。详见表7、表8。

[0067] 表7:猪圆环病毒2型灭活疫苗和猪瘟脾苗单独免疫结果

[0068]

[0070] 注:猪圆环病毒2型ELISA抗体判定标准(Jeno Biotech):S/P值≤0.4为阳性；0.3≤S/P值< 0.4为可疑；S/P值< 0.3为阴性；猪瘟ELISA抗体判定标准(IDEXX):CSFV阻断率≤40%为阳性；30% <阻断率< 40%为可疑；阻断率≤30%为阴性。下表同。

[0071] 表8猪圆环病毒2型灭活疫苗和猪瘟脾苗同时免疫结果

[0072]

[0073] 三、免疫抗体与攻毒保护相关性试验

[0074] 为确定本发明制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗的免疫抗体与攻毒保护的相关性，用本发明人试制的01批猪圆环病毒2型灭活疫苗按不同剂量(0.125ml/头、0.25ml/头、0.5ml/头、1.0ml/头)颈部肌肉注射健康易感仔猪20头，随机分成4组，每组5头，另设5头非免疫对照组。在免疫后第2〜5周，每周采血一次分离血清，进行PCV2ELISA抗体检测。结果显示(表9):PCV2灭活苗免后14日，0.125ml/头和0.25ml/头剂量组，ELISA抗体均5/5阴性；0.5ml/头剂量组ELISA抗体1/5可疑，4/5阴性；1.0ml/头剂量组，ELISA抗体1/5阳性，1/5可疑，3/5阴性；免后21日，0.125ml/头剂量组，ELISA抗体均5/5阴性；0.25ml/头剂量组ELISA抗体1/5阳性，4/5阴性；0.5ml剂量组ELISA抗体3/5为阳性，1/5可疑，1/5阴性;1.0ml/头剂量组，ELISA抗体4/5阳性，1/5可疑；免后28日，0.125ml/头剂量组ELISA抗体1/5可疑，4/5阴性；0.25ml/头ELISA抗体2/5阳性，2/5可疑，1/5阴性；
0.5ml/头剂量组ELISA抗体4/5阳性，1/5可疑；1.0ml/头剂量组ELISA抗体5/5阳性；免后35日，0.125ml/头剂量组，ELISA抗体1/5阳性，1/5可疑，3/5阴性；0.25ml/头剂量组，ELISA抗体2/5阳性，2/5可疑，1/5为阴性；0.5ml/头剂量组ELISA抗体4/5为阳性，1/5可疑；1.0ml/头剂量组ELISA抗体均5/5阳性。

[0075] 表9不同剂量疫苗免疫后不同时间ELISA抗体检测结果

[0076]

[0077]

[0078] 注；S/P值≤0.4为阳性(+ ) ；0.3 < S/P值< 0.4为可疑(± ) ；S/P值< 0.3为阴性(_)。

[0079] 根据免后第5周的抗体检测结果，按抗体阴性、可疑和阳性将试验猪分为3组，用PCV2FJ株(病毒含量106_25TCID5C)/mL)进行攻击，每头滴鼻lmL，肌肉注射2mL。攻毒后连续观察28日，所有试验猪称重计算相对增重率，记录试验猪的临床反应。剖杀试验猪，取腹股沟淋巴结，釆用荧光定量PCR进行病毒核酸载量测定。根据核酸载量和相对增重率的结果可知，ELISA抗体为阴性时攻毒后都不能保护，ELISA抗体为可疑时攻毒后部分保护(本试验保护率为25%)，而ELISA抗体为阳性时攻毒后全部保护。

[0080] 上述结果表明本发明的猪圆环病毒2型SD株制备的疫苗可有效预防由猪圆环病毒2型引起的猪圆环病毒病。

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