用作免疫调节剂的藻类提取物
阅读：762发布：2021-02-09
专利汇可以提供用作免疫调节剂的藻类提取物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种来源于石莼目的藻类提取物，特别是一种石莼类绿藻的提取物，用于其在调节人或动物的免疫应答中的应用，特别是用于刺激针对感染的免疫应答。本发明还涉及石莼类绿藻提取物调节免疫应答的非 治疗 性用途。，下面是用作免疫调节剂的藻类提取物专利的具体信息内容。
1.一种来源于石莼目的藻类提取物，特别是石莼类绿藻提取物，所述提取物包含分子量小于或等于50kDa的、硫酸化和非硫酸化的聚阴离子多糖，用于其在调节人或动物的免疫应答中的应用。
2.一种来源于石莼目的藻类提取物，特别是石莼类绿藻提取物的非治疗性用途，所述提取物包括分子量小于或等于50kDa的、硫酸化和非硫酸化的聚阴离子多糖，用于调节人或动物的免疫应答。
3.用于权利要求1所述用途或权利要求2所述非治疗性用途的藻类提取物，其中，所述多糖包括甘露糖和/或阿拉伯糖，特别是甘露糖。
4.用于权利要求3所述用途或权利要求3所述非治疗性用途的藻类提取物，其中，所述多糖包括至少0.005％的甘露糖和/或至少0.005％的阿拉伯糖，按基于所述藻类提取物干物质的总重量的重量计。
5.用于权利要求4所述用途或权利要求4所述非治疗性用途的藻类提取物，其中，所述多糖包括0.01-0.50％的甘露糖和/或0.01-0.5％的阿拉伯糖，按基于所述藻类提取物干物质的总重量的重量计。
6.用于权利要求1和权利要求3-5中任一项所述用途或权利要求2-5中任一项所述非治疗性用途的藻类提取物，其中，所述多糖进一步包括：
-半乳糖；
-葡萄糖；
-鼠李糖；
-木糖；和
-葡萄糖醛酸。
7.用于权利要求6所述用途或权利要求6所述非治疗性用途的藻类提取物，其中，所述多糖包括：
-0.05-0.5％的半乳糖；
-0.005-0.5％的葡萄糖；
-2-15％的鼠李糖；
-0.1-1％的木糖；
-1-7％的葡萄糖醛酸；
按基于所述藻类提取物干物质的总重量的重量计。
8.一种来源于石莼目的藻类提取物，特别是石莼类绿藻提取物，其中，所述提取物可通过下述制备方法获得：
a)清洗藻类并清除泥沙；
b)研磨所述藻类；
c)从液相中分离研磨材料中的固相；
d)澄清所述液相；
e)以50KDa或更小的滤膜，对步骤d)中得到的汁液进行超滤；和
f)浓缩随后干燥步骤e)得到的过滤汁液；
用于其在调节人或动物的免疫应答中的应用。
9.来源于石莼目的藻类提取物，特别是石莼类绿藻提取物的非治疗性用途，所述提取物可通过下述制备方法获得：
a)清洗藻类并清除泥沙；
b)研磨所述藻类；
c)从液相中分离研磨材料中的固相；
d)澄清所述液相；
e)以50KDa或更小的滤膜，对步骤d)中得到的汁液进行超滤；和
f)浓缩随后干燥步骤e)中得到的过滤汁液；
用于调节人或动物的免疫应答。
10.用于权利要求1和权利要求3-8中任一项所述用途或权利要求2-7和权利要求9中任一项所述非治疗性用途的藻类提取物，所述提取物用于激活人或动物的免疫应答，特别是对肠道免疫系统。
11.用于权利要求1、权利要求3-8和权利要求10中任一项所述用途或权利要求2-7和权利要求9-10中任一项所述非治疗性用途的藻类提取物，其中所述藻类提取物诱导粘附分子和趋化因子的表达，特别是IL-8和/或IL-1α和/或IL1-β和/或IL-6和/或TNF-α和/或CCL20的表达。
12.用于权利要求1、权利要求3-8和权利要求10-11中任一项所述用途或权利要求2-7和权利要求9-11中任一项所述非治疗性用途的藻类提取物，所述提取物用作接种疫苗的补充剂。
13.用于权利要求1、权利要求3-8和权利要求10-12中任一项所述用途的藻类提取物，所述提取物用于治疗和/或预防传染性疾病，尤其是选自下组的猪传染性疾病：细小病毒病、丹毒、传染性鼻炎、流感、猪圆环病毒病、支原体和大肠杆菌病；选自下组的禽传染性疾病：马立克氏病、新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病、传染性上皮瘤、支原体、禽传染性贫血、传染性喉气管炎、EDS和禽流感；选自下组的牛传染性疾病：BVD(牛病毒性腹泻)、地方性支气管肺炎、IBR、疱疹病毒病、梭菌病、大肠杆菌病、蓝舌病、冠状病毒病、轮状病毒病和鼻气管炎；和选自下组的水产养殖传染性疾病：造血组织坏死、弧菌病、疖病、传染性胰腺坏死病和传染性贫血病。
14.用于权利要求1、权利要求3-8和权利要求10-13中任一项所述用途的藻类提取物，其中，所述藻类提取物包含于药物组合物。
15.权利要求2-7和权利要求9-12中任一项所述藻类提取物的非治疗性用途，其中，所述藻类提取物包含于食品组合物。
16.用于权利要求14所述用途或权利要求15所述非治疗性用途的藻类提取物，其中，所述藻类提取物对人的施用剂量为0.1-100mg/kg，对动物的施用剂量为1-200mg/kg。
17.用于权利要求1、权利要求3-8、权利要求10-14和权利要求16中任一项所述用途或权利要求2-7、权利要求9-12和权利要求15-16中任一项所述非治疗性用途的藻类提取物，其中，所述的硫酸化和非硫酸化的聚阴离子多糖的分子量小于等于15kDa。
18.用于权利要求1和权利要求3-7中任一项所述用途或权利要求2-7中任一项所述非治疗性用途的藻类提取物，其中，所述藻类提取物可以通过下述制备方法获得：
a)清洗藻类并清除泥沙；
b)研磨所述藻类；
c)从液相中分离研磨材料中的固相；
d)澄清所述液相；
e)以50kDa或更小的滤膜，对步骤d)中得到的汁液进行超滤；和
f)浓缩随后干燥步骤e)中得到的过滤汁液。
19.用于权利要求8或18所述用途或权利要求9或18所述非治疗性用途的藻类提取物，其中，对制备方法的步骤d)中获得的汁液以15kDa或更小的滤膜进行超滤。
20.用于权利要求8、18或19所述用途或权利要求9、18或19所述非治疗性用途的藻类提取物，其中，对制备方法的步骤f)中获得的所述藻类提取物进行纯化，特别是进行超滤。
用作免疫调节剂的藻类提取物
[0001] 本发明涉及一种来源于石莼目的藻类提取物，特别是一种石莼类(Ulva type)绿藻的提取物，其用于调节人或动物的免疫应答，特别是用于激活针对感染的免疫应答。本发明还涉及石莼类绿藻提取物调节人或动物的免疫应答的非治疗性用途。
[0002] 免疫应答的调节是许多疾病的重要治疗轴心。实际上，例如，对于患有感染的患者，改善免疫应答是重要的。
[0003] 在很多方面，免疫应答的激活是更为重要的机制。例如，众所周知，母乳中富含IgAs抗体，其能够给予新生儿保护，以抵抗一定程度的感染。肠细胞，特别是其暴露于各种病原体的上皮细胞，会产生抗体以抵抗病原体。随后，这些抗体迁移至乳腺，并存在于母乳中，从而为婴儿提供保护。识别新的、能够激活这类免疫反应的物质总是有必要的。肠上皮细胞是特别优选的位点，口服的免疫激活物质能够发挥作用。此外，还需要识别新的、通过激活免疫应答能够增强疫苗接种响应的物质，特别是经由除疫苗接种的额外给药。物种石莼(ulvae)(石莼目，绿藻门)是广泛存在于潮间带或前滩的藻类。石莼拓植于硬质基质，通过附属圆盘固定，但某些物种也可以漂流形式自由生活。就空间和营养成分的吸收而言，石莼是快速生长的机会型藻类。在水层中，石莼的生长主要在富营养化的沿海水域和泻湖中被观察到，石莼属(Ulva sp.)在此大量繁殖形成“绿潮”(Fletcher,1996)。这样的结果往往是产生团块和大量搁浅，并在其积累过程中产生有害气体(Morand和Briand,1996)。到目前为止，这类生物质的附加值非常低,其利用方式除了堆肥(Mazé等1993,Cuomo等1995),产沼气(Briand和Morand,1997)，人的食物消耗(Pérez,1997)或作为纸张的基础(Nicolucci和Monegato 1993),还有可能可以利用其特殊的性能。
[0004] 本发明的发明人出人意料的发现,石莼目藻类提取物，特别是石莼类绿藻提取物，具有免疫调节的性能。
[0006] 本发明还涉及一种石莼目藻类提取物，特别是石莼类绿藻提取物的非治疗性用途，其包含分子量小于或等于50kDa的、硫酸化和非硫酸化的聚阴离子多糖，可用于调节人或动物的免疫应答。
[0007] 具体地，本发明涉及用于上述用途的藻类提取物，或上述藻类提取物的非治疗性用途，其中所述多糖包括甘露糖和/或阿拉伯糖，优选甘露糖。更具体地，所述多糖包括至少0.005％的甘露糖和/或至少0.005％的阿拉伯糖，按藻类提取物干物质的总重量计，优选至少0.005％的甘露糖。更具体地，所述多糖包括0.005％至0.5％，例如0.005％至0.20％或
0.15％至0.5％的量的甘露糖，和/或0.005％至0.5％的量的阿拉伯糖，按藻类提取物干物质的总重量计，优选0.005％至0.5％，例如0.005％至0.20％或0.15％至0.5％的量的甘露糖，按藻类提取物干物质的总重量计。
0.15％至0.5％的量的甘露糖，和/或0.005％至0.5％的量的阿拉伯糖，按藻类提取物干物质的总重量计，优选0.005％至0.5％，例如0.005％至0.20％或0.15％至0.5％的量的甘露糖，按藻类提取物干物质的总重量计。
[0008] 本发明更具体地进一步涉及用于上述用途的藻类提取物，或上述藻类提取物的非治疗性用途，其中所述的多糖进一步包括：
[0009] -半乳糖；和/或
[0010] -葡萄糖；和/或
[0011] -鼠李糖；和/或
[0012] -木糖；和/或
[0013] -葡萄糖醛酸。
[0014] 更具体地，所述多糖包括:
[0015] -0.05-0.5％的半乳糖；和/或
[0016] -0.005-0.5％，特别是0.005-0.05％或0.05-0.5％的葡萄糖；和/或
[0017] -2-15％的鼠李糖；和/或
[0018] -0.1-1％的木糖；和/或
[0019] -1-7％的葡萄糖醛酸；
[0020] 按藻类提取物干物质的总重量计。本发明还涉及一种来源于石莼目的藻类提取物，特别是石莼类绿藻提取物，其可通过下述制备方法获得：
[0021] a)清洗藻类并清除泥沙；
[0022] b)磨碎所述藻类；
[0024] d)澄清所述液相；
[0025] e)以50KDa或更小的滤膜，对步骤d)中得到的汁液进行超滤；和
[0026] f)浓缩随后干燥步骤e)中得到的过滤汁液；
[0027] 用于其在调节人或动物的免疫应答中的应用。
[0028] 本发明还涉及来源于石莼目的藻类提取物，特别是石莼类绿藻提取物的非治疗性用途，其可通过下述制备方法获得：
[0029] a)清洗藻类并清除泥沙；
[0030] b)研磨所述藻类；
[0031] c)从液相中分离研磨材料中的固相；
[0032] d)澄清所述液相；
[0033] e)以50KDa或更小的滤膜，对步骤d)中得到的汁液进行超滤；和
[0034] f)浓缩随后干燥步骤e)中得到的过滤汁液；
[0035] 以便调节人或动物的免疫应答。
[0036] 具体地，本发明涉及用于上述用途的藻类提取物，或上述藻类提取物的非治疗性用途，用于激活人或动物的免疫应答，特别是对于肠道免疫系统。在本发明的范围内，通过“免疫调节”性能或允许“免疫应答调节”应理解为这些术语的应有之意，，并且是本领域技术人员众所周知的，特别是任何有可能激活或阻碍人体或动物体免疫反应的性能。
[0037] 具体地，用于本发明用途的藻类提取物，或本发明藻类提取物的非治疗性用途，有可能介导粘附分子和趋化因子的表达，尤其是IL8和/或IL1α和/或IL1β和/或IL6和/或TNF-α和/或CCL20。
[0038] 因此，本发明定义范围内的藻类提取物，可用于治疗和/或预防传染性疾病，特别是选自下组的猪传染性疾病：细小病毒病、丹毒(rouget)、传染性鼻炎、流感、猪圆环病毒病、支原体和大肠杆菌病；选自下组的禽传染性疾病：马立克氏病、新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病、传染性上皮瘤、支原体、禽传染性贫血、传染性喉气管炎、EDS和禽流感；选自下组的牛传染性疾病：BVD(牛病毒性腹泻)、地方性支气管肺炎、IBR、疱疹病毒病、梭菌病、大肠杆菌病、蓝舌病、冠状病毒病、轮状病毒病和鼻气管炎；和选自下组的水产养殖传染性疾病：造血组织坏死、弧菌病、疖病、传染性胰腺坏死病和传染性贫血病。
[0039] 本发明因此还涉及本发明所述范围内所描述的藻类提取物在治疗和/或预防上述任一传染性疾病中的用途。
[0040] 具体地，本发明定义范围内的藻类提取物，可用于疫苗预防范围，作为接种疫苗的补充剂。
[0041] 更具体地，本发明涉及用于上述用途的藻类提取物，其中,所述藻类提取物以口服给药的药物组合物形式应用。
[0042] 根据本发明的另一实施方式，用于上述用途的藻类提取物，以非经肠途径的药物组合物形式应用。
[0043] 本发明还涉及上述藻类提取物的非治疗性用途，其中藻类提取物以口服给药食品补充剂形式应用。
[0045] 如上文所述，本发明所述范围内的藻类提取物，涉及石莼目藻类提取物，特别是石莼类绿藻提取物，包括分子量小于或等于50kDa的、硫酸化和非硫酸化的聚阴离子多糖。更具体地，所述藻类提取物包括硫酸化和非硫酸化的聚阴离子多糖，其分子量小于40、30、20或15kDa。更具体地，所述藻类提取物中的硫酸化和非硫酸化的聚阴离子多糖的分子量为小于或等于15kDa。
[0046] 根据本发明的一实施方式，本发明所述范围内的藻类提取物，包括分子量小于或等于50kDa的、硫酸化和非硫酸化的聚阴离子多糖，不包括分子量大于50kDa的、硫酸化和非硫酸化的聚阴离子多糖。
[0047] 根据本发明的另一实施方式，本发明所述范围内的藻类提取物，包括分子量小于或等于15kDa的、硫酸化和非硫酸化的聚阴离子多糖，不包括分子量大于15kDa的、硫酸化和非硫酸化的聚阴离子多糖。
[0048] 道尔顿(Da)是一种质量单位，定义为等于碳原子12重量的十二分之一，随后发现这一重量是根据多个同位素(主要是碳12和碳13，除6个质子外，分别有6和7中子的任意碳原子)的混合物估算所得。道尔顿具有较高的精度，是一个氢原子的质量，确切的值为1.00794amu(原子质量单位)。千道尔顿(kDa)等于1,000Da。
[0049] 在本发明的范围内，所述的kDa质量以本领域技术人员常用的任意方法测定；特别是所述的藻类提取物中硫酸化和非硫酸化的聚阴离子多糖的质量，可以利用超滤进行鉴别，所述超滤在只允许预定义大小分子滤过的超滤膜上进行。
[0050] 具体地，如前所述，本发明的描述范围内的藻类提取物中的多糖包括甘露糖和/或阿拉伯糖，优选甘露糖。更具体地，所述多糖包括至少0.005％的甘露糖和/或至少0.005％的阿拉伯糖，按藻类提取物干物质的总重量计，尤其是至少0.01％的甘露糖和/或至少0.01％的阿拉伯糖。更具体地，所述多糖包括0.01-0.50％，例如0.01-0.20％或0.20％-
0.5％的量的甘露糖，和/或0.01-0.5％的量的阿拉伯糖，按藻类提取物干物质的总重量计，尤其是0.03-0.45％，例如0.03-0.15％或0.15-0.45％的量的甘露糖，和/或0.01-0.2％的量的阿拉伯糖。
0.5％的量的甘露糖，和/或0.01-0.5％的量的阿拉伯糖，按藻类提取物干物质的总重量计，尤其是0.03-0.45％，例如0.03-0.15％或0.15-0.45％的量的甘露糖，和/或0.01-0.2％的量的阿拉伯糖。
[0051] 优选的，所述多糖包括0.01-0.50％，例如0.01-0.20％或0.20-0.5％的量的甘露糖，尤其0.03-0.45％，例如0.03-0.15％或0.15％-0.45％的量的甘露糖。
[0052] 具体地，如前所述，所述多糖进一步包括：
[0053] -半乳糖；和/或
[0054] -葡萄糖；和/或
[0055] -鼠李糖；和/或
[0056] -木糖；和/或
[0057] -葡萄糖醛酸。
[0058] 更具体地，所述多糖包括:
[0059] -0.05-0.5％，尤其是0.1-0.4％的半乳糖；和/或
[0060] -0.005-0.5％，特别是0.005-0.05％，尤其是0.01-0.03％，或0.05-0.5％的葡萄糖；按％计；和/或
[0061] -2-15％，尤其是5-10％的鼠李糖；和/或
[0062] -0.1-1％，尤其是0.3-0.7％的木糖；和/或
[0063] -1-7％，尤其是1-5％的葡萄糖醛酸；和/或
[0064] 按藻类提取物干物质的总重量计。
[0065] 因此，举例来说，用于本发明所述用途的藻类提取物有可以包含:
[0066] -甘露糖；和/或
[0067] -阿拉伯糖；和/或
[0068] -半乳糖；和/或
[0069] -葡萄糖；和/或
[0070] -鼠李糖；和/或
[0071] -木糖；和/或
[0072] -葡萄糖醛酸。
[0073] 更具体地，举例来说，用于本发明所述用途的藻类提取物有可以包含:
[0074] -0.01-0.50％，例如0.01-0.20％，尤其是0.03-0.15％，或0.20-0.5％的甘露糖；
[0075] 和/或
[0076] -0.01-0.5％，尤其是0.01-0.2％的阿拉伯糖；和/或
[0077] -0.05-0.5％，尤其是0.1-0.4％的半乳糖；和/或
[0078] -0.005-0.5％，特别是0.005-0.05％，尤其是0.01-0.03％，或0.05-0.5％的葡萄[0079] 糖；和/或
[0080] -2-15％，尤其是5-10％的鼠李糖；和/或
[0081] -0.1-1％，尤其是0.3-0.7％的木糖；和/或
[0082] -1-7％，尤其是1-5％的葡萄糖醛酸；和/或
[0083] 按藻类提取物干物质的总重量计。
[0084] 更具体地，举例来说，用于本发明所述用途的藻类提取物有可以包含:
[0085] -0.09％的甘露糖；和/或
[0086] -0.1％的阿拉伯糖；和/或
[0087] -0.3％的半乳糖；和/或
[0088] -0.02％的葡萄糖；和/或
[0089] -8.1％的鼠李糖；和/或
[0090] -0.5％的木糖；和/或
[0091] -2.6％的葡萄糖醛酸；
[0092] 按藻类提取物干物质的总重量计。
[0093] 举例来说，用于本发明所述用途的藻类提取物有可以包含:
[0094] -0.3％的甘露糖；和/或
[0095] -0.2％的半乳糖；和/或
[0096] -0.4％的葡萄糖；和/或
[0097] -7.9％的鼠李糖；和/或
[0098] -0.5％的木糖；和/或
[0099] -4.9％的葡萄糖醛酸；
[0100] 按藻类提取物干物质的总重量计。
[0101] 本发明还涉及根据本发明的藻类提取物的非治疗性用途，其中，所述的藻类提取物包含：
[0102] -甘露糖；和/或
[0103] -阿拉伯糖；和(或)
[0104] -半乳糖；和/或
[0105] -葡萄糖；和/或
[0106] -鼠李糖；和/或
[0107] -木糖；和/或
[0108] -葡萄糖醛酸，
[0109] 更具体地为：
[0110] -0.01-0.50％，例如0.01-0.20％，尤其是0.03-0.15％，或0.20-0.5％的甘露糖；
[0111] 和/或
[0112] -0.01-0.5％，尤其是0.01-0.2％的阿拉伯糖；和/或
[0113] -0.05-0.5％，尤其是0.1-0.4％的半乳糖；和/或
[0114] -0.005-0.5％，特别是0.005-0.05％，尤其是0.01-0.03％，或0.05-0.5％的葡萄[0115] 糖；和/或
[0116] -2-15％，尤其是5-10％的鼠李糖；和/或
[0117] -0.1-1％，尤其是0.3-0.7％的木糖；和/或
[0118] -1-7％，尤其是1-5％的葡萄糖醛酸；
[0119] 按藻类提取物干物质的总重量计，
[0120] 更具体地包含：
[0121] -0.09％的甘露糖；和/或
[0122] -0.1％的阿拉伯糖；和/或
[0123] -0.3％的半乳糖；和/或
[0124] -0.02％的葡萄糖；和/或
[0125] -8.1％的鼠李糖；和/或
[0126] -0.5％的木糖；和/或
[0127] -2.6％的葡萄糖醛酸；
[0128] 按藻类提取物干物质的总重量计，或包含：
[0129] -0.3％的甘露糖；和/或
[0130] -0.2％的半乳糖；和/或
[0131] -0.4％的葡萄糖；和/或
[0132] -7.9％的鼠李糖；和/或
[0133] -0.5％的木糖；和/或
[0134] -4.9％的葡萄糖醛酸；
[0135] 按藻类提取物干物质的总重量计。
[0136] 如前所述，本发明所述范围内的藻类提取物为石莼目藻类提取物，特别是石莼类绿藻提取物，其可通过下述制备方法获得：
[0137] a)清洗藻类并清除泥沙；
[0138] b)研磨所述藻类；
[0139] c)从液相中分离研磨材料中的固相；
[0140] d)澄清所述液相；
[0141] e)以50KDa或更小的滤膜，对步骤d)中得到的汁液进行超滤；和
[0142] 对步骤e)中得到的过滤汁液进行浓缩，随后进行干燥。
[0143] 根据本发明一种实施方式，所述的藻类提取物包含：
[0144] -10-50％的碳；
[0145] -1-10％的氢；
[0146] -1-5％的氮；
[0148] -1-15％的硫；
[0149] 按占藻类提取物干物质总质量的百分比计，
[0150] 更具体地，所述藻类提取物包含：
[0151] -15-30％的碳；
[0152] -3-6％的氢；
[0153] -1-3％的氮；
[0154] -25-40％的氧；和
[0155] -2.5-10％的硫；
[0156] 按藻类提取物干物质的总质量的百分比计，
[0157] 根据本发明的另一实施方式，所述的藻类提取物包含：
[0158] -10-50％的碳；
[0159] -1-10％的氢；
[0160] -0.5-5％的氮；
[0161] -20-60％的氧；和
[0162] -1-15％的硫；
[0163] 按占藻类提取物干物质总质量的百分比计，
[0164] 提取物干物质中存在的其他化学成分特别地以矿物质为代表(Ca、K、Na、Mg、Al、Cl、I、P、Fe等)。
[0165] 更具体地，本发明所述范围内的藻类提取物具有图1所示的1H NMR光谱的特征。
[0166] 该1H NMR光谱以装备有TCI 1H/13C/15N倒置低温探针的Bruker Avance 500光谱仪，在298K下记录。在分析之前，将样品溶解于99.97％的D2O中。基于外标(三甲基硅基丙酸)的化学位移以ppm表示。无HOD信号抑制。
[0167] 根据本发明的一种实施方式，所述藻类提取物特别含有分子量小于或等于50kDa的硫酸化和非硫酸化的聚阴离子多糖，其可通过下述方法获得：
[0168] a)清洗藻类并清除泥沙；
[0169] b)研磨所述藻类；
[0170] c)从液相中分离研磨材料中的固相；
[0171] d)澄清所述液相；
[0172] e)以50KDa或更小的滤膜，对步骤d)中得到的汁液进行超滤；和
[0173] f)对步骤e)中得到的过滤汁液进行浓缩，随后进行干燥。
[0174] 特别地，为了应用本发明所示范围内的方法，在步骤a)或其后步骤中，所述藻类以淡水进行清洗。
[0175] 可以以本领域技术人员可获得的任何方法清除藻类中的泥沙。
[0176] 随后,所述藻类被研磨，特别是通过磨机，例如精磨机或切割机。
[0178] 所述“汁液”的是含有藻类细胞双层结构的壁结构的细胞质汁液。
[0179] 得到的液相随后被澄清，例如通过带板的澄清器，或通过离心、倾析或过滤(如通过口袋或板)。
[0180] 随后对获得的汁液进行超滤。
[0181] 根据应用本发明所示范围内的方法的一种实施方式，该超滤在50kDa或更小的，尤其是40、30、20或15kDa的滤膜上进行。更具体地，该滤膜为15kDa或更小的滤膜。
[0182] 例如，该滤膜为陶瓷膜或有机膜。更具体地，该滤膜是陶瓷膜。
[0184] 任选地，将获得的提取物再次进行研磨以产生在粒度水平方面同质的粉末。
[0185] 根据这些方面之一，该方法部分在室温下进行。所示室温是指温度5-25℃之间。
[0186] 根据本发明的另一方面，该方法部分在4-10℃的温度下进行，这为了避免微生物的繁殖。
[0187] 根据应用本发明所示范围内的方法的一种实施方式，上述方法中步骤f)得到的藻类提取物被精制，例如通过超滤，特别是盒式超滤装置，尤其是为了消除矿物部分。
[0188] 根据本发明的另一方面，用于本发明所述用途的藻类提取物利用前述方法获得。
[0190] 所述“石莼类绿藻”是指属于石莼目石莼科石莼属(Ulva)的绿藻。需要特别注意以下提到的种和亚种：鱼栖台石莼(Ulva acanthophora)、阿南德氏石莼(Ulva anandii)、窄叶石莼(Ulva angusta)、阿氏石莼(Ulva arasakii)、阿莫里加石莼(Ulva armoricana)、绿石莼(Ulva atroviridis)，薄叶石莼(Ulva attenuata)，贝特石莼(Ulva beytensis)，双面石莼(Ulva bifrons)，短柄石莼(Ulva brevistipitata)，球石莼(Ulva bulbosa)，缅甸石莼(Ulva burmanica)，柔石莼(Ulva byssoides)，加州石莼(Ulva californica)，蝶形石莼(Ulva chaetomorphoides)，格石莼(Ulva clathrata)，猩红石莼(Ulva coccinea)，扁石莼(Ulva compressa)，簇石莼(Ulva conglobata)，羊角石莼(Ulva cornucopiae)，角石莼(Ulva cornuta)，科夫龙石莼(Ulva covelongensis)，厚石莼(Ulva crassa)，厚膜石莼(Ulva crassimembrana)，拱石莼(Ulva curvata)，常石莼(Ulva dactylifera)，锯齿石莼(Ulva denticulata)，秀丽石莼(Ulva elegans)，艾米氏石莼(Ulva elminthoides)，肠形石莼(Ulva enteromorpha)，直石莼(Ulva erecta)，宽石莼(Ulva expansa)，带石莼(Ulva fasciata)，窗石莼(Ulva fenestrata)，曲石莼(Ulva flexuosa)，胶石莼(Ulva gelatinosa)，双生石莼(Ulva geminoidea)，巨石莼(Ulva gigantea)，大石莼(Ulva grandis)，亨德石莼(Ulva hendayensis)，勾石莼(Ulva hookeriana)，霍克石莼(Ulva hopkirkii)，印氏石莼(Ulva indica)，细长石莼(Ulva intestinalis)，类细长石莼(Ulva intestinaloides)，绞石莼(Ulva intricata)，管状石莼(Ulva intybacea)，加哇石莼(Ulva javanica)，科林石莼(Ulva kylinii)，莴石莼(Ulva lactuca)，莴叶石莼(Ulva lactucaefolia)，亮绿石莼(Ulva laetevirens)，朗吉石莼(Ulva laingii)，线石莼(Ulva linearis)，舌石莼(Ulva lingulata)，链石莼(Ulva linkiana)，林氏石莼(Ulva linza)，里皮石莼(Ulva lippii)，滨海石莼(Ulva litoralis)，海岸石莼(Ulva littorea)，裂石莼(Ulva lobata)，滑石莼(Ulva lubrica)，镶边石莼(Ulva marginata)，微球石莼(Ulva micrococca)，米亚塔石莼(Ulva myriotrema)，那不勒斯石莼(Ulva neapolitana)，线虫石莼(Ulva nematoidea)，欧尼石莼(Ulva ohnoi)，橄石莼(Ulva olivacea)，橄榄石莼(Ulva olivaceum)，太平洋石莼(Ulva pacifica)，匙形石莼(Ulva papenfussii)，奇形石莼(Ulva paradoxa)，小石莼(Ulva parva)，微小石莼(Ulva parvula)，潘腾石莼(Ulva patengensis)，狭带石莼(Ulva percursa)，孔石莼(Ulva pertusa)，菲氏石莼(Ulva phyllosa)，珀石莼(Ulva popenguinensis)，韭叶石莼(Ulva porrifolia)，阔石莼(Ulva procera)，深石莼(Ulva profunda)，浒石莼(Ulva prolifera)，假曲石莼(Ulva pseudocurvata)，假林氏石莼(Ulva pseudolinza)，丽石莼(Ulva pulchra)，紫丝石莼(Ulva purpurascens)，奎隆石莼(Ulva quilonensis)，辐状石莼(Ulva radiata)，拉尔夫石莼(Ulva ralfsii)，毛茛石莼(Ulva ranunculata)，网纹石莼(Ulva reticulata)，拉科石莼(Ulva rhacodes)，硬石莼(Ulva rigida)，切叶石莼(Ulva rotundata)，鲁本斯石莼(Ulva rubens)，塞弗拉石莼(Ulva saifullahii)，斯凯戈尔石莼(Ulva scagelii)，斯堪的纳维亚石莼(Ulva scandinavica)，赛瑞石莼(Ulva sericea)，齿叶石莼(Ulva serrata)，单叶石莼(Ulva simplex)，索伦森石莼(Ulva sorensenii)，纺石莼(Ulva spinulosa)，狭叶石莼(Ulva stenophylla)，柄石莼(Ulva stipitata)，海边石莼(Ulva sublittoralis)，针叶石莼(Ulva subulata)，带状石莼(Ulva taeniata)，细叶石莼(Ulva tenera)，四角石莼(Ulva tetragona)，绞线石莼(Ulva torta)，荸荠石莼(Ulva tuberosa)，脐状石莼(Ulva umbilicata)，芒石莼(Ulva uncialis)，钩刺石莼(Ulva uncinata)，松萝石莼(Ulva usneoides)，囊状石莼(Ulva utricularis)，革质石莼(Ulva utriculosa)，卵形石莼(Ulva uvoides)，紫萼石莼(Ulva ventricosa)。
[0191] 因此，用于本发明所述用途的藻类提取物可用于兽医学用途，包含于药物或药物组合物中，用于调节人或动物的免疫应答，特别是用于刺激人或动物免疫应答；更特别地，用于预防和/或治疗如上述的传染性疾病；更为特别地，其属于疫苗预防范围内，作为疫苗接种的补充剂。
[0192] 因此，本发明还涉及用于前述用途的藻类提取物，其中,所述藻类提取物包含于药物组合物或药物中。
[0194] 因此，本发明还涉及前述藻类提取物的非治疗性用途，其中藻类提取物包含于食品组合物中。
[0195] 特别地，食物组合物可用作接种疫苗的补充剂。
[0196] 用于制备药物或药物组合物(包含用于本发明所述用途的藻类提取物)的药学上可接受的赋形剂，可以根据药物的剂型和施用方法的需要，从本领域技术人员已知的常用赋形剂中进行选择。
[0197] 在本发明中，以包含常规药用赋形剂的混合物形式，经口服、舌下、皮下、肌肉注射、静脉注射、外用、局部、气管内、鼻内、经皮或直肠施用于动物和人，以调节免疫应答，特别是预防和/或治疗上文所述的传染性疾病。
[0198] 适合的施用剂型包括口服剂型，如片剂、软的和硬的胶囊、粉剂、颗粒剂以及口服溶液或悬浮液，经舌下、口腔内、气管内、眼内、鼻内吸入的施用剂型，局部的，非经肠施用剂型，如经皮、皮下、肌内注射、静脉注射施用剂型，经直肠的施用剂型，和埋植剂。对于局部的方式，用于本发明所述用途的藻类提取物的应用形式可以是乳霜、凝胶剂、润发油或洗剂。
[0201] 胶囊的制备可以通过，如将活性成分与稀释剂混合，并将得到的混合物灌入软的或硬的胶囊中实现。
[0202] 在一具体实施方式中，用于本发明所述用途的藻类提取物、药物或药物组合物最好为口服施用。在另一实施方式中，用于本发明所述用途的藻类提取物、药物或药物组合物最好为非经肠施用。
[0203] 包含用于本发明所述用途的藻类提取物的药物或药物组合物，还可以是液体剂型，如溶液剂、乳剂、悬浮剂或糖浆剂，特别是，如适于口服或鼻内施用的剂型。合适的液体载体可以是，如水、有机溶剂，如甘油或乙二醇，及其与水的不同比例的混合物。
[0205] 例如，分散于水中的粉末或颗粒可以包含同分散剂或润湿剂、或混悬剂，如聚乙烯吡咯烷酮，和甜味剂或味道调和剂混合的活性成分。
[0206] 一般情况下，在本发明的范围内，藻类提取物的日剂量是能够产生免疫刺激效果的藻类提取物的最低有效量。
[0207] 所述“有效量”是指能够观察到需要的效果,此处是免疫刺激效果的任意剂量的组合物。
[0208] 根据本发明的一个方面，用于本发明所述用途的藻类提取物以上述的组合物形式应用，其对人的施用剂量为0.1-100mg/kg，更具体地为0.5-60mg/kg，例如1-20mg/kg或5-30mg/kg，其对动物的施用剂量为1-200mg/kg，更具体地为1-100mg/kg，更加具体地是2-
45mg/kg或10-60mg/kg。
45mg/kg或10-60mg/kg。
[0209] 根据本发明的另一个方面，在本发明所述藻类提取物的非治疗性用途的范围内，后者可用于食品组合物中。
[0210] 所述“食品组合物”是指用于人或动物的，如任何类型的营养食品、食品产品，如酸奶或饮料，特别是牛奶饮料、任何类型的原料、添加剂或技术性辅料、以预混料的形式，药用或非药用的、打算掺入食品的、任何类型的完整或补充食品。
[0211] 根据本发明的一个方面，包含于食品组合物中的海藻提取物的非治疗性用途的范围内，后者对人的施用剂量为0.1-100mg/kg，更具体地为0.5-60mg/kg，例如1-20mg/kg或5-30mg/kg，其对动物的施用剂量为1-200mg/kg，更具体地为1-100mg/kg，更加具体地是2-
45mg/kg或10-60mg/kg。
45mg/kg或10-60mg/kg。
[0212] 在另一个方面，本发明还涉及调节人或动物免疫应答的方法，特别是刺激人或动物的免疫应答，包括向人或动物施用有效量的根据本发明的藻类提取物。
[0213] 更具体地，根据本发明的所述的方法激活人或动物的免疫应答，特别对于肠道免疫系统。
[0214] 更加具体地，本发明所述的方法诱导粘附分子和趋化因子的表达，尤其是IL8和/或IL-1α和/或IL1-β和/或IL6和/或TNF-α和/或CCL20的表达。
[0215] 在根据本发明所述方法范围内的藻类提取物的施用，可以包含于如上文所述的药物、药物组合物或食品组合物中。
[0216] 其可以根据上述的施用办法施用。
[0217] 根据应用本发明所述方法的一种实施方式，本发明所述的藻类提取物在药物组合物中施用。
[0218] 具体地，所述方法有助于预防和/或治疗如上文所述的传染性疾病。
[0219] 根据应用本发明所述方法的另一种实施方式，本发明所述的藻类提取物在食品组合物中施用。
[0220] 具体地，本发明还涉及一种如上所述的方法，该方法包括向人或动物施用有效量的本发明所述的藻类提取物，施用周期为3-30天，特别是10-20天或3-10天，对人的剂量为0.1-100mg/kg，更加具体地为0.5-60mg/kg，更具体地为1-20mg/kg或5-30mg/kg，对动物的剂量为1-200mg/kg，更具体地为1-100mg/kg，更加具体地是2-45mg/kg或10-60mg/kg。
[0221] 根据应用本发明所述方法的一种实施方式，在上述施用周期结束时，藻类提取物的施用可继续一个相同的周期。
[0222] 根据本发明的一个方面，本发明还涉及一种上述的方法，其包括：
[0223] a)通过下述方法制备本发明所述的藻类提取物：
[0224] -清洗并清除藻类中的泥沙；
[0225] -研磨所述藻类；
[0226] -从研磨材料的液相中分离固相；
[0227] -澄清所述液相；
[0228] -以50kDa或更小，如15kDa或更小的滤膜，对上一步骤获得的汁液进行超滤处理；和
[0229] -浓缩、随后干燥上一步骤获得的过滤汁液；任选地跟随一个超滤步骤，如利用盒式超滤装置进行；和
[0230] b)向人或动物施用有效量的根据本发明所述的藻类提取物，具体为持续3-30天的周期，更具体地是10-20天或3-10天，对人的剂量为0.1-100mg/kg，更加具体地为0.5-60mg/kg，如1-20mg/kg或5-30mg/kg，或者对动物的剂量为1-200mg/kg，更具体地为1-100mg/kg，更加具体地是2-45mg/kg或10-60mg/kg。
[0231] 接下来，通过图和实施例更详细地阐述本发明而不限制本发明的范围。
[0233] 图1：本发明所述的藻类提取物的1H NMR光谱。
[0234] 图2：通过Shodex 802和803柱分离获得的本发明所述的藻类提取物的色谱图。
[0235] 图3：气相色谱法分析本发明所述的藻类提取物样品的三甲基硅醚衍生物的色谱图。其中Ara:阿拉伯糖；Gal：半乳糖；Glc：葡萄糖；Xyl：木糖；Man：甘露糖；Rha：鼠李糖，GlcA:葡萄糖醛酸。
[0236] 图4：本发明所述的藻类提取物EA1的最大无毒性剂量的评估。
[0237] 图5：本发明所述的藻类提取物EA2的最大无毒性剂量的评估。
[0238] 图6：本发明所述的藻类提取物EA3的最大无毒性剂量的评估。
[0239] 图7：本发明所述的藻类提取物EA1、EA2和EA3对IL8表达的影响(qPCR测定)。
[0240] 图8：本发明所述的藻类提取物EA1、EA2和EA3对TNF-α表达的影响(qPCR测定)。
[0241] 图9：本发明所述的藻类提取物EA1、EA2和EA3对CCL20表达的影响(qPCR测定)。
[0242] 图10：本发明所述的藻类提取物EA1对IL6表达的影响(qPCR测定)。
[0243] 图11：本发明所述的藻类提取物EA1对IL1α表达的影响(qPCR测定)。
[0244] 图12：本发明所述的藻类提取物EA1对IL1β表达的影响(qPCR测定)。
[0245] 图13：本发明所述的藻类提取物EA1对PPARγ表达的影响(qPCR测定)。
[0246] 图14：本发明所述的藻类提取物EA1对IL12p35表达的影响(qPCR测定)。
[0247] 图15：ELISA法测定本发明所述的藻类提取物EA1和EA3对TNF-α表达的影响。
[0248] 图16：ELISA法测定本发明所述的藻类提取物EA1和EA3对IL-8表达的影响。实施例
[0249] 实施例1：本发明所述藻类提取物的制备
[0250] 利用一藻类清洗设备，以淡水清洗1吨重新鲜、天然的石莼类绿藻并清除泥沙。
[0251] 除非另有说明，本方法中的各步骤在室温下进行。
[0252] 将藻类(1吨沥干的藻类中含有8％的干物质)磨成细微颗粒，利用工业精磨机(品牌：依诺泰克(Inotec)，型号：“175CDI-75D”)将藻类(排水藻类8％干物质1吨)研磨成的，“细微颗粒”是指颗粒大小在50-1000nm之间的微粒，包括两类，一类的大小在50和200nm之间，第二类的大小在600-1000nm之间。
[0253] 研磨后的材料随后被工业压带机(品牌：福乐伟(Flottweg)，型号：“BFRU 800HK”)以1吨/小时的流量压榨。
[0254] 该步骤使固相(浆状物)从液相(汁液)中分离出来。汁液的产率为75％。
[0255] 随后，用带板的澄清器(品牌：福乐伟，型号：“AC 2000”)澄清获得的750kg天然汁液。
[0256] 从而获得710kg含有3.10％干物质的透明汁液(质量产率为95-98％)以及一种膏状物(占质量的2-5％)。
[0257] 随后，利用15kDa的陶瓷滤膜(Tami实业，Tami Industries)对透明汁液进行超滤。
[0258] 从而获得渗透物和滞留物。保持渗透直至获得640kg含有2.2％的干物质的过滤汁液(产量为91％，以体积计)。
[0259] 随后，在蒸发干燥后，利用冷冻干燥法干燥该过滤汁液(渗透物)。
[0261] 以8L/h的蒸发水流速完成第一次浓缩，白利度从5.5(相当于干物质浓度为4.5％)上升至14.7。
[0262] 随后以5-6L/h的蒸发水流速对溶液进行第二次浓缩，白利度上升至34。溶液的干物质浓度测定为38.4％。
[0263] 随后以Bioblock科学仪器(Bioblock sc ientific a pparatus)(型号：CHRIST alpha 1-4LSC)进行冷冻干燥，冷冻温度为-80℃，这也是该步骤中的最低温度。
[0264] 随后通过飞利浦公司的行星式研磨机MiniMi ll，对获得的粉末进行研磨。随后将产品加至研磨碗(每个研磨碗10g产品和4个氧化锆球)。整体设置旋转15分钟，速度为10。
[0265] 从而获得14kg藻类提取物粉末。
[0266] 实施例2:GPC法(凝胶渗透色谱法)测定本发明所述藻类提取物中硫酸化和非硫酸化的阴离子多糖的大小
[0267] 利用1000Da的滤膜，对根据实施例1制备的本发明所述的藻类提取物进行超滤，并将其以0.5g/L的浓度溶解于水中。随后将其注入到串联的两个Shodex 802和803柱中(8023 5
柱的操作域为：4.10 Da，803柱的操作域为：1.7.10 Da)。使用的洗脱液为0.1M硝酸钠与
0.2％叠氮化钠，流速为0.5ml/min。通过Wyatt折射计和Wyatt18角光散射检测器进行检测。
dn/dc在等于0.150ml/g时取值。
柱的操作域为：4.10 Da，803柱的操作域为：1.7.10 Da)。使用的洗脱液为0.1M硝酸钠与
0.2％叠氮化钠，流速为0.5ml/min。通过Wyatt折射计和Wyatt18角光散射检测器进行检测。
dn/dc在等于0.150ml/g时取值。
[0268] 折射计测得的色谱图如图2所示。
[0269] 获得的本发明所述的藻类提取物中多糖的平均大小为4.4kDa。
[0270] 实施例3:本发明所述藻类提去物的组分测定
[0271] 根据实施例1制备的本发明所述的藻类提取物在超滤单元(amicon cells)中，在搅拌操作下前流超滤纯化。使用拦截阈值为1000Da的再生纤维素膜。将572.1mg本发明所述的藻类提取物的样本溶解于超纯150mL milli-Q水中。用五公升水来清除所有分子质量小于1,000Da的成分。滞留物被冷冻干燥。称重，得到117mg样品。因此，超滤产量是20.5％(w/w)。对超滤样品进行以下分析。
[0272] 根据由Montreuil(Montreuil等，1986)改进的Kamerling法(Kamerling等，1975)对构成本发明藻类提取物聚多糖的单糖比例进行测定。为了只得到单体，单糖的定性定量需要对聚合物进行甲醇水解。然后对糖苷残基进行三甲基硅烷化，以使其挥发。随后，以O-三甲基硅烷化的甲基糖苷的形式，利用气相色谱法对其进行鉴定和分析。
[0273] 使用的试剂如下：
[0274] -甲醇溶液/HCl 3N(Supelco)；
[0275] -碳酸银；
[0276] -肌醇；
[0277] -吡啶；
[0278] -Sylon BFT试剂(BSTFA+TMCS 99:1)(Supelco)；和
[0279] -二氯甲烷。
[0280] 操作程序如下：在500μL 3N盐酸/甲醇混合物(Supelco)存在下，将400μg按上述方法制备的本发明所述的藻类提取物以及50μg肌醇置于100℃，干浴4小时。降至室温后，用碳酸银对醇解物进行进行中和。对样品进行3000rmp，15min的离心，并利用氮气喷射蒸发上清液。随后用80μL吡啶溶解该混合物，并与80μL sylon(BSTFA:TMCS,99:1,Supelco)一起在80℃孵育25分钟。利用氮气喷射适度蒸发过量的试剂之后，将三甲基硅烷化的甲基糖苷溶入500μL二氯甲烷，随后注入气相色谱仪(柱内注入，FID检测器：火焰离子化)。载气是氮气。柱型号为HP-5MS(30m，内径为0.25毫米)，为非极性柱。温度上升程序如下：120℃保持1分钟，随后以1.5℃/min的梯度上升至180℃，其次以2℃/min的梯度上升至200℃。
[0281] 通过相对于内参标准的相对保留时间，将每种单糖与在相同条件下处理的纯单糖进行比较从而对其进行鉴定。计算各单糖相对于内标的响应系数，以确定本发明所述的藻类提取物的多糖中各单糖的比例。
[0282] 所获结果如下表1和图3所示。
[0283] 表1：在气相色谱法分析三甲基硅烷衍生物之后，得到本发明所述的藻类提取物的组成，由基于藻类提取物总重量的重量表示；其中Ara：阿拉伯糖；Gal：半乳糖；Glc：葡萄糖；Xyl：木糖；Man：甘露糖；Rha：鼠李糖，GlcA:葡萄糖醛酸。
[0284]样品 超滤液的重量％ 超滤收率 粗提取物的重量％
Ara 0.6 20.50％ 0.123
Gal 1.3 20.50％ 0.267
Glc 0.1 20.50％ 0.021
Xyl 2.45 20.50％ 0.502
Man 0.45 20.50％ 0.092
Rha 39.6 20.50％ 8.118
GlcA 12.9 20.50％ 2.645
Ara 0.6 20.50％ 0.123
Gal 1.3 20.50％ 0.267
Glc 0.1 20.50％ 0.021
Xyl 2.45 20.50％ 0.502
Man 0.45 20.50％ 0.092
Rha 39.6 20.50％ 8.118
GlcA 12.9 20.50％ 2.645
[0285] 实施例4:本发明所述的藻类提取物的免疫调节活性的评估
[0286] 检测本发明所述藻类提取物对IPEC-1猪上皮细胞分化的影响。
[0287] 猪肠上皮细胞(Intestinal Porcine Epithel ial Cell-1,IPEC-1)是自发转化的小猪空肠细胞。
[0288] 首先，测定能够在3天内实现融合的、存储于P6板的孔(well)内的IPEC-1细胞的最佳数量。保留的最佳剂量为0.2×105细胞/cm2。
[0289] 研究本发明所述藻类提取物的最大无毒性剂量，以确定不会抑制IPEC-1细胞增殖的最大剂量。
[0291] 同样根据实施例1，制备第三种藻类提取物EA3，但其制备包括一个随后的纯化步骤。
[0292] 为提纯，用拦截阈值为1KDa的最小PALL盒对提取物EA3进行超滤。该提取物随后被冻干。
[0293] 将三种提取物溶解于28mL DMEM/F12完全培养基中。随后制备50mL 1％溶液，即将0.5g提取物溶于50mL中。然后进行0.2μm的过滤除菌。
[0294] 随后，为测试各浓度的藻类提取物，在50mL Falcon管中进行如下表2所示的稀释。
[0295] 表2：
[0296]
[0297] 随后按如下的后续步骤制备细胞：
[0298] 1.为每个待测试剂量制备28mL细胞悬浮液，其浓度为0.07×106细胞/mL，即1.966
×10细胞/剂，
×10细胞/剂，
[0299] 2.胰蛋白酶消化，
[0300] 3.用无Ca-Mg的PBS漂洗细胞，
[0301] 4.为游离和分离细胞，沉积ATV胰蛋白酶(2mL/F175，或0.4mL/P6孔)，[0302] 5.37℃孵育5分钟，
[0303] 6.加入培养基中,
[0304] 7.台盼蓝计数,
[0305] 8.以2.23mL准备6个15mL Falcon管，
[0306] 9.离心，和
[0307] 10.从每个管中取出细胞颗粒，加至28mL的各待测提取物溶液，并将其转移到一个50mL Falcon管内。
[0308] 通过在板上以3mL/孔的量沉积各悬浮液，随后37℃，孵育24、48和72小时，进行培养。
[0309] 表3总结了不同孔包含的内容。
[0310] 表3：
[0311]
[0312] 随后观察培养并选择性地拍摄照片。
[0313] 按如下步骤收获小细胞并计数：
[0314] 1.取一个6孔板，
[0315] 2.除去上清，
[0316] 3.用1mL无Ca-Mg的PBS漂洗，
[0317] 4.以0.4mL/孔，沉积ATV胰蛋白酶，
[0318] 5.37℃孵育5min，直至细胞分离，
[0319] 6.添加0.6mL培养基，
[0320] 7.搅拌均匀，和
[0321] 8.用0.4％的台盼蓝染色(50μL细胞+50μL 0.4％台盼蓝)，然后在血球计数板(来自Malassez，共100小格)对细胞进行计数。
[0322] 结果如图4-6所示，EA1和EA2的最大无毒性剂量为0.1％，EA3的为0.5％。
[0323] 在D15检测本发明所述的藻类提取物EA1、EA2和EA3对IPEC-1细胞分化的刺激，37℃持续4h(融合后10天左右)。
[0324] 通过与细菌LPS(阳性对照)和分化培养基(阴性对照)比较，检测三种剂量(MD(最大剂量)，MD/10，MD/100)。
[0325] 按实施例1所示方法所得的本发明所述的藻类提取物EA1，EA2和EA3的溶液，通过0.1％完全DMEM/F12制备。为此，将0.02g溶入20mL并进行0.2μm的过滤除菌。随后按下表4所示进行连续稀释。
[0326] 表4：
[0327]
[0328]
[0329] 每孔藻类提取物的量如下表5所示。
[0330] 表5
[0331]
[0332] 随后制备LPS溶液(SIGMA O111:B4)(剂量：50ng/105细胞)。
[0333] 200ng LPS/孔，沉积的体积小于2mL。下表6显示了制备的不同浓度。
[0334] 表6
[0335]
[0336] 在板上，将2mL待测培养基沉积于各过滤器上，且在3mL以下。随后，在37℃和5％CO2的条件下，整体孵育4h。
[0337] 随后，收获处理的IPEC-1细胞，并按下述步骤进行分析：
[0338] 1.用1mL生理盐水缓冲液洗涤孔两到三次，
[0339] 2.将细胞加入350μL RA1缓冲液(Macherey-Nagel试剂盒)，和
[0340] 3.转入离心管中，从1-15进行编号。
[0341] 随后，根据Macherey-Nagel NucleoSpin RNA II,Ref 740955.250,Batch 1211/004试剂盒的供应商的使用说明，提取RNA。
[0342] 随后，将获得的RNA转录成DNA，逆转录按下述步骤进行：
[0343] 1.对于每个样品，用于处理的量计算为1μg，
[0344] 2.在板的每个孔中沉积这样的量，并将其置于冷却模块，
[0345] 3.添加需要量的水QSP 9μL，
[0346] 4.100μM样品3154325Eurogentec，添加1.3μL寡糖dT_anchored，
[0347] 5.利用GeneAmp PCR System 9700(USER Khal id)，65℃孵育10min，[0348] 6.孵育时，在冰上，在一锥形管内准备1.5mL的混合物(对应一个样本)：
[0349] i.4μL 5×缓冲液
[0350] ii.2μL dNTP 20mM(Eurogentec)
[0351] iii.1.9μL超纯水
[0352] iv.在最后，添加0.8μL 25U/μL的MuMLV酶(ME-0125-400)(Eurogentec)[0353] 7.每个样品加8.7μL混合物，最终体积为20μL，
[0354] 8.将板置于冷却模块，
[0355] 9.利用GeneAmp PCR System 9700，37℃孵育90min以实现聚合，并在93℃孵育5min，以在反应结束时将酶灭活，以及
[0356] 10.在一个DNA(1)MO盒内，-20℃冷冻，
[0357] 随后，借助qPCR，对样品进行分析(单向方差分析测试，利用非参数Dunnet测试的差异测试)。
[0358] 测试提取物EA1对IL8、TNF-α、CCL20、IL6、IL1α、IL1β、PPARγ和IL12p35表达的影响。
[0359] 测试提取物EA2和EA3对IL8、TNF-α和CCL20表达的影响。结果如图7-14所示。
[0360] 结果显示，测试的不同细胞因子的mRNA的表达增加。
[0361] 此外，通过对已分化的IPEC-1细胞的ELISA分析，研究免疫因子的激活情况，评估本发明的藻类提取物的免疫刺激活性。
[0362] 使用的两种商业试剂盒为R&D Systems生产的猪试剂盒Duo set CXCL8/IL8(货号:DY535)和猪试剂盒Duo set TNF-α(货号:DY690B)。
[0363] 两种试剂盒遵循相同的程序，使用捕捉抗体，抗体，检测系统和对各个白介素特异的标准蛋白。
[0364] 用提取物EA1和EA3进行细胞培养和孵化以产生细胞因子
[0365] 在细胞培养小室内，培养IPEC-1细胞(0.25×105细胞/cm2)3天，直到获得细胞融合。接下来，用10-7M的地塞米松替换胎牛血清,以便细胞分化，在10-14天之间。在提取物EA1和EA3存在的条件下，将三个培养孔在37℃下孵育24h。对照为不含任何藻类提取物的细胞培养。收集上室和下室的培养液上清，并在分析前于离心管内–80℃存储。
[0366] ELISA测定IL8和TNF-α的量
[0367] 用PBS将捕捉抗体(鼠抗IL-8或鼠抗TNF-α)稀释至1/180，以100μL/孔的量进行固定，室温下过夜。为去除未固定的抗体进行三次洗涤操作，以400μL/孔的量，用含0.05％Tween的PBS(洗涤缓冲液)进行洗涤。接下来，为了封闭非特异性结合位点，从而避免待测蛋白的适应性结合，进行了饱和步骤。为此，以300μL/孔的量，添加含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液。将板在室温下孵育1h，随后用400μL/孔的洗涤缓冲液洗涤三次。用含有1％BSA的PBS缓冲液将标准蛋白(重组IL8和TNF-α)半倍稀释，以使浓度约等于4000、2000、
1000、500、250、125pg/mL。将100μL的量的纯上清液和标准蛋白样品沉积于各孔内，然后室温孵育2h。以400μL/孔的缓冲液进行三次洗涤后，在100μL/孔检测抗体以及用稀释缓冲液(包含2％的去补体山羊血清)稀释至1/180的生物素存在的条件下，对板进行孵育。室温孵育2h后，将板用洗涤缓冲液洗涤三次，随后与100μL Streptavidin-HRP偶联物，室温下避光孵育20分钟。将孔用洗涤缓冲液洗涤三次，之后与100μL基质(v/v试剂A和B)，室温黑暗条件下孵育20分钟。用50μL/孔的终止液终止HRP-基质反应，并用ELISA读取仪Labsystems Multi skan RC，在450nm下，读取OD值(光密度)。
1000、500、250、125pg/mL。将100μL的量的纯上清液和标准蛋白样品沉积于各孔内，然后室温孵育2h。以400μL/孔的缓冲液进行三次洗涤后，在100μL/孔检测抗体以及用稀释缓冲液(包含2％的去补体山羊血清)稀释至1/180的生物素存在的条件下，对板进行孵育。室温孵育2h后，将板用洗涤缓冲液洗涤三次，随后与100μL Streptavidin-HRP偶联物，室温下避光孵育20分钟。将孔用洗涤缓冲液洗涤三次，之后与100μL基质(v/v试剂A和B)，室温黑暗条件下孵育20分钟。用50μL/孔的终止液终止HRP-基质反应，并用ELISA读取仪Labsystems Multi skan RC，在450nm下，读取OD值(光密度)。
[0368] 结果如图15和图16所示。
[0369] 结果显示，测试的不同细胞因子的蛋白表达增加。
[0370] 结论
[0371] 本发明所述的藻类提取物的施用表明该产品具有免疫刺激作用。
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