技术领域
[0001] 本
发明涉及疫苗佐剂原料的制备及疫苗制备领域，具体涉及一种低聚糖酯及其在制备疫苗佐剂中的应用。
背景技术
[0002] 联合国粮农组织和国际兽疫局将
口蹄疫
疾病列为其成员国共同防范的A类传染病中的第一位传染病。“国家中长期科学与技术发展规划纲要”将“畜禽健康养殖与疫病防控”列为农业重点领域中的急需关键技术。我国每年仅兽用口蹄疫疫苗用量猪84.15亿头份，
牛羊22.02亿头份，而且每年在以10%的速度递增。因此疫苗的市场需求量很大。
[0003] 疫苗佐剂可以提高疫苗的免疫作用效果，其在免疫中的主要作用是提升
机体免疫系统对
抗原或免疫原的免疫应答反应，增强免疫反应强度和反应的持久性，从而提高机体对病毒或细菌的抵抗
力。常见佐剂主要包括
铝盐佐剂、油乳佐剂、
表面活性剂类佐剂、细菌
微生物类佐剂、蜂胶佐剂、细胞因子类佐剂等。
[0004] 目前国内W/O/W（
水包油包水）型油乳佐剂，全部依赖于法国SEPPIC公司生产的206佐剂，进口额高达3亿元/年。由于法国一直实行严格的技术封
锁，不转让不合作新型佐剂技术，因此我国迫切需要研发能与法国206技术水平相当的新型疫苗佐剂。
[0005] 206佐剂为W/O/W型佐剂，目前国内此类佐剂开发的技术
瓶颈在于，该类佐剂中需含有一种亲油性表面活性剂，这种表面活性剂与其他表面活性剂复配使用，可以形成一种稳定的自乳化体系，制备W/O/W乳剂，目前国内还没有找到这样一种合适的表面活性剂。
[0006] 此外，从国际上表面活性剂品种发展趋势来看，表面活性剂开始倾向于生态安全、无环境污染、完全
生物降解、功能性强、化学
稳定性及
热稳定性好、成本低的方向发展。
[0007] 糖基表面活性剂，是以糖类制成的表面活性剂，原料来自天然可再生资源，环境相容性好，有很好的
皮肤兼容性和极佳的
生物可降解性，在制药、生物化学和生物医学方面有着潜在的应用前景。因此，糖基表面活性剂正是符合国际表面活性剂发展需求的产品。
[0008] 糖基表面活性剂可以与其它表面活性剂复配，不但可以改进自身的性能，而且可以开发出新的应用领域或产品，极大的拓宽了糖基表面活性剂的应用领域。因此，利用糖类资源制备一种亲油性的糖基表面活性剂并将其应用于制备W/O/W型疫苗佐剂中，以替代206佐剂，进而利用W/O/W型疫苗佐剂制成疫苗便成为了有待解决的难题。
发明内容
[0009] 针对以上技术现状，本发明的目的是提供一种低聚糖酯的制备方法，并提供低聚糖酯作为亲油性表面活性剂在制备安全、稳定的W/O/W型疫苗佐剂以替代206佐剂并最终制备成动物疫苗中的应用。
[0010] 为此，本发明采用的技术方案如下：
[0011] 一种低聚糖酯，其制备方法如下：
[0012] （1） 聚合反应：在氮气惰性氛围的保护下，将天然单糖于搅拌下加热至熔融状态，反应1-6 h，生成天然单糖
聚合物；
[0013] （2） 酯化反应：将分别将油酸和催化剂于搅拌下逐滴加入到天然单糖聚合物中，于180℃-280℃下反应1-6 h，自然冷却，生成低聚糖酯粗品；
[0014] （3）将所述低聚糖酯粗品经纯化和干燥即可。
[0015] 优选地，所述的天然单糖为
葡萄糖、果糖、甘露糖、核糖或木糖中的任何一种；所述的催化剂为
磷酸、
亚磷酸、
碳酸钠、磷酸二氢
钾中的一种或几种的混合物。
[0016] 具体地，步骤（3）中纯化的具体步骤为：将所述低聚糖酯粗品用甲醇萃取，萃取液用NaOH溶液中和、水洗除去未反应的磷酸和单糖，最后用正己烷洗除残留的油酸，蒸去
溶剂，干燥备用。
[0017] 优选地，所述油酸和天然单糖的
质量比为1:0.5-10，质量比催化剂：（单糖+油酸）=1-10:1000。
[0018] 本发明还提供了上述的低聚糖酯在制备疫苗佐剂中的应用。
[0019] 本发明还提供了包含上述低聚糖酯的疫苗佐剂，其包括如下质量百分比的组分：50-90%兽用注射级轻质矿物油，2.5-15%低聚糖酯，7-30%亲水性表面活性剂，0.5-5%助剂。
[0020] 其中，所述的亲水性表面活性剂选自聚
氧乙烯失水山梨醇
脂肪酸酯（优选聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯T-20、T-40、T-60、T-80）、聚氧乙烯
蓖麻油（优选EL20、EL30、EL40）、 聚氧乙烯氢化蓖麻油（优选HEL20、HEL40）、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯
蔗糖脂肪酸酯中的一种或两种以上；所述助剂选自聚丙二醇PPG200、PPG400、PPG600、PPG800，维生素E，BHA(丁基羟基茴香醚)，BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基
苯酚)，
角鲨烯，角鲨烷中的一种或两种以上。
[0021] 上述疫苗佐剂的制备方法为：按比例将所述兽用注射级轻质矿物油、低聚糖酯、亲水性表面活性剂和助剂在转速800rpm下进行搅拌混合，即获得W/O/W型疫苗佐剂。
[0022] 本发明还进一步提供了由上述疫苗佐剂制备疫苗的方法，其特征在于其步骤如下：将所述疫苗佐剂于121℃
蒸汽灭菌30 min，自然冷却，放入乳化罐中，控制乳化罐内
温度为30±2℃；将温度与乳化罐内温度相同的水相抗原加入到乳化罐中，水相抗原添加量为所述疫苗佐剂质量的100-400%；将所述疫苗佐剂与水相抗原的混合物在400-1000rpm下进行乳化，乳化温度为30±2℃，乳化时间为5-30 min，乳化完成后即得疫苗。
[0023] 具体地，所述的水相抗原为口蹄疫抗原、猪
圆环病毒抗原或其他病毒抗原和细菌抗原。
[0024] 本发明制备的低聚糖酯作为亲油性表面活性剂可制备得到安全、稳定的W/O/W型疫苗佐剂，最终制备得到的W/O/W型疫苗佐剂可制备成稳定性强、安全性好，
抗体效价高的动物疫苗。本发明解决了亲油性表面活性剂的制备难题，打破了法国在W/O/W型油乳佐剂技术领域的垄断。
附图说明
[0025] 图1为
实施例9中各组别
猪圆环病毒疫苗ELISA抗体水平OD值走向图。
具体实施方式
[0026] 以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用的原料或
试剂除特别说明之外，均市售可得。
[0027] 一、低聚糖酯的制备实施例
[0028] 实施例1
[0029] （1）在氮气惰性氛围保护下，将450g木糖于120℃加热使木糖处于熔融状态，于400rpm下搅拌反应6h，生成木糖聚合物；
[0030] （2）将木糖聚合物升温至180℃，逐滴加入13.5 g亚磷酸和900 g油酸，于180℃下进行搅拌，转速400rpm，搅拌反应1h，冷却，生成低聚木糖酯粗产品；
[0031] （3）将低聚木糖酯粗产品进行甲醇萃取，得到的萃取液用NaOH溶液除去未反应的亚磷酸和木糖，然后用正己烷洗涤除去残留的油酸，干燥，得到低聚木糖酯。
[0032] 实施例2
[0033] （1）在氮气惰性氛围保护下，将700g甘露糖于200℃加热，使甘露糖处于熔融状态，400rpm下搅拌1h，生成甘露糖聚合物；
[0034] （2）将甘露糖聚合物升温至280℃，逐滴加入1.2 g亚磷酸、0.6g碳酸钠、0.6g磷酸二氢钾和700 g油酸，于280℃下进行搅拌，转速400rpm，搅拌反应2h，冷却，生成低聚甘露糖酯粗产品；
[0035] （3）将低聚甘露糖酯粗产品进行甲醇萃取，得到的萃取液用NaOH溶液中和、水洗除去未反应的亚磷酸、碳酸钠、磷酸二氢钾和甘露糖，然后用正己烷洗涤除残留的油酸，干燥，得到低聚甘露糖酯。
[0036] 实施例3
[0037] （1）在氮气惰性氛围保护下，将1000 g果糖于160 ℃加热至熔融状态，400rpm搅拌3h，生成果糖聚合物；
[0038] （2）将果糖聚合物升温至220℃，逐滴加入1.2 g磷酸和100 g油酸于220℃下进行搅拌，转速400rpm，6 h，冷却，生成低聚果糖酯粗产品；
[0039] （3）将低聚果糖酯粗产品进行甲醇萃取，得到的萃取液用NaOH溶液中和、水洗除去未反应的磷酸和果糖，然后用正己烷洗涤除残留的油酸，干燥，得到低聚果糖酯。
[0040] 二、疫苗佐剂制备的实施例
[0041] 实施例4
[0042] 将80.42 g兽用注射级轻质矿物油，7.0 g实施例1制备的低聚木糖酯，8 g T-80，4 g PPG400，0.04 g BHA,0.04 g BHT,0.5 g角鲨烯进行搅拌混合，转速为800rpm搅拌，获得W/O/W型疫苗佐剂。
[0043] 实施例5
[0044] 将50 g兽用注射级轻质矿物油，15 g实施例2制备的低聚甘露糖酯，30 g HEL，4.5 g PPG400，0.5 g 维生素E进行搅拌混合，转速为800rpm搅拌，获得W/O/W型疫苗佐剂。
[0045] 实施例6
[0046] 将90 g兽用注射级轻质矿物油，2.5 g实施例3制备的低聚果糖酯，7 g T-80，0.5 g EL进行搅拌混合，转速为800rpm搅拌，获得W/O/W型疫苗佐剂。
[0047] 三、疫苗制备的实施例
[0048] 实施例7
[0049] 将500 g实施例4制备的疫苗佐剂于121℃高压蒸汽灭菌30 min，自然冷却，放入乳化罐中，控制乳化罐内温度为30±2℃；将500 g口蹄疫抗原（灭活，抗原含量4.69μg/mL）加热至30±2℃后加入到乳化罐中；将疫苗佐剂与水相抗原的混合物进行乳化，乳化转速为400 rpm，乳化温度为30±2℃，乳化时间为30 min，乳化完成后即得口蹄疫疫苗。
[0050] 口蹄疫疫苗物理性状检测：口蹄疫疫苗为W/O/W型；黏度1.9s；3000rpm离心15min不分层无析出；4℃放置12个月未破乳，25℃放置1个月未破乳，37℃放置10天未见破乳；无菌检验合格；
[0051] 口蹄疫疫苗效力评价：将30只18-22 g小鼠（昆明小鼠，雌性，洁净级）随机分为3组：实验组、对照组、空白组。疫苗组和对照组每组10只小鼠，空白组10只小鼠。将三组小鼠进行皮下注射，方案如下：
[0052] 实验组：接种本实施例制备的口蹄疫疫苗，接种剂量0.5 mL/只；
[0053] 对照组：接种206佐剂按照本实施例相同的方法制备的口蹄疫疫苗，接种剂量0.5 mL/只；
[0054] 空白组：不接种疫苗，单纯注射生理盐水0.5 mL/只。
[0055] 接种疫苗或生理盐水后，三组小鼠均无异常反应。免后21天，三组小鼠断尾
采血，分离血清，检测血清中口蹄疫抗体效价。
[0056] 表1 疫苗免疫后不同组小鼠血清抗体效价的检测结果
[0057]
[0058] 实施例8
[0059] 将300 g疫苗佐剂于121℃高压蒸汽灭菌30 min，自然冷却，放入乳化罐中，控制乳化罐内温度为30±2℃；将900 g猪圆环病毒抗原（灭活病毒液，效价107.3TCID50/mL）加热至30±2℃后加入到乳化罐中；将疫苗佐剂与水相抗原的混合物进行乳化，乳化转速为600 rpm，乳化温度为30±2℃，乳化时间为15 min，乳化完成后即得猪圆环病毒疫苗。
[0060] 猪圆环病毒疫苗物理性状检测：疫苗为W/O/W型；黏度1.5s；3000rpm离心15min底部析出0.5%水相；4℃放置12个月未破乳，25℃放置1个月未破乳，37℃放置10天未见破乳；无菌检验合格；
[0061] 猪圆环病毒疫苗效力评价：将30只18-22 g小鼠（昆明小鼠，雌性，洁净级）随机分为3组：实验组、对照组、空白组。疫苗组和对照组每组10只小鼠，空白组10只小鼠。将三组小鼠进行皮下注射，方案如下：
[0062] 实验组：接种本实施例制备的猪圆环病毒疫疫苗，接种剂量0.5 mL/只；
[0063] 对照组：接种206佐剂按照本实施例相同的方法制备的猪圆环病毒疫疫苗，接种剂量0.5 mL/只；
[0064] 空白组：不接种疫苗，单纯注射生理盐水0.5 mL/只。
[0065] 接种疫苗或生理盐水后，三组小鼠均无异常反应。免后21天，三组小鼠断尾采血，分离血清，检测血清中猪圆环病毒疫抗体效价。
[0066] 表2：小鼠抗体效价检测结果
[0067]
[0068] 实施例9
[0069] 将200 g疫苗佐剂于121℃高压蒸汽灭菌30 min，自然冷却，放入乳化罐中，控制乳化罐内温度为30±2℃；将800 g猪圆环病毒疫抗原（灭活病毒液，效价107.3TCID50/mL）加热至30±2℃后加入到乳化罐中；将疫苗佐剂与水相抗原的混合物进行乳化，乳化转速为1000 rpm，乳化温度为30±2℃，乳化时间为5 min，乳化完成后即得猪圆环病毒疫疫苗。
[0070] 猪圆环病毒疫疫苗物理性状检测：疫苗为W/O/W型；黏度1.0s；3000rpm离心15min底部析出1%水相；4℃放置12个月未破乳，25℃放置1个月未破乳，37℃放置10天未见破乳；无菌检验合格；
[0071] 猪圆环病毒疫疫苗效力评价：将15头14-21日龄健康仔猪（液相阻断ELISA抗体效价≤1:8）随机分为3组：实验组、对照组、空白组，每组5头。将三组仔猪进行颈部肌肉注射，方案如下：
[0072] 实验组：接种本实施例制备的猪圆环病毒疫疫苗，接种剂量2 mL/只；
[0073] 对照组：接种206佐剂制备的猪圆环病毒疫疫苗，接种剂量2 mL/只；
[0074] 空白组：不接种疫苗，单纯注射生理盐水2 mL/只。
[0075] 接种疫苗或生理盐水后，三组仔猪均无异常反应。免后每7d采血，共采血10周，检测各周ELISA抗体水平，检测结果见图1和表3。
[0076] 表3：仔猪免疫各组别疫苗ELISA抗体水平平均值
[0077]
[0078] 由图1和表3中猪圆环病毒疫苗仔猪效力检验结果可见：（1）随着空白组母源抗体逐渐下降，对照组和实验组抗体水平均呈现升高的趋势；（2）对照组于免后3周左右抗体迅速上升，在免后4周后每周呈现小幅上升，抗体水平较平稳，个体差异较大；（3）实验组项目佐剂于免后2周左右抗体有大幅度上升，免后3-6周上升较平稳，之后两周呈现直线上升的趋势，到第8周后抗体再次呈现小幅上升。
